Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella Pneumoniae tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Hoài An

KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH

CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE

TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Hoài An

KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH

CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE

TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. CAO HỮU NGHĨA

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết

quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công

trình nào khác.

Tác giả

Phạm Thị Hoài An

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ

trợ, giúp đỡ rất tận tình của các thầy cô, anh chị, gia đình và các bạn. Xin gửi lời cảm

ơn chân thành đến

Ban giám hiệu cùng thầy cô Khoa Sinh – Trường Đại học Sư Phạm Thành phố

Hồ Chí Minh đã giúp em có cơ sở lí luận và kỹ năng nghiên cứu khoa học vững chắc.

Ban Giám đốc Viện Pasteur và đặc biệt là TS. Cao Hữu Nghĩa, Trưởng khoa Xét

nghiệm Sinh học Lâm sàng - Viện Pasteur Tp. HCM đã tạo điều kiện cơ sở vật chất tốt

nhất, tận tâm hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

ThS. Vũ Lê Ngọc Lan, ThS. Uông Nguyễn Đức Ninh cùng các Cô, Anh và Chị

trong Phòng Vi sinh Bệnh Phẩm, khoa Xét nghiệm Sinh học Lâm sàng - Viện Pasteur

Tp. HCM đã hết lòng chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và cùng đồng hành, tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho em học tập, làm việc cũng như thu thập số liệu tại phòng để em có thể

thực hiện khóa luận này.

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả những người thân trong gia đình,

những người đã luôn bên cạnh ủng hộ em.

Mong cho điều tốt đẹp nhất sẽ đến với mọi người.

Em xin hết lòng cảm ơn.

Tác giả

Phạm Thị Hoài An

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình - sơ đồ - biểu đồ

MỞ ĐẦU .............................................................................................................................................. 1

Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................................. 4

1.1. Klebsiella pneumoniae ............................................................................................. 4

1.1.1. Đặc điểm vi sinh học ...................................................................................... 4

1.1.1.1. Hình thái và cấu trúc ................................................................................ 4

1.1.1.2. Cấu trúc kháng nguyên ............................................................................. 4

1.1.1.3. Cấu trúc bộ gen......................................................................................... 5

1.1.1.4. Tính chất nuôi cấy .................................................................................... 5

1.1.1.5. Tính chất hóa sinh .................................................................................... 6

1.1.2. Khả năng gây bệnh ......................................................................................... 6

1.1.2.1. Cơ chế gây bệnh ....................................................................................... 6

1.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng ................................................................................... 6

1.1.3. Chẩn đoán vi sinh vật ..................................................................................... 6

1.1.4. Phòng bệnh và điều trị .................................................................................... 6

1.2. Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh ........................................................ 7

1.2.1. Định nghĩa kháng sinh .................................................................................... 7

1.2.2. Phân loại kháng sinh ....................................................................................... 7

1.2.2.1. Dựa vào khả năng tác dụng ...................................................................... 7

1.2.2.2. Dựa vào phổ tác dụng ............................................................................... 8

1.2.2.3. Dựa vào nguồn gốc ................................................................................... 8

1.2.2.4. Dựa trên cấu trúc hóa học ......................................................................... 9

1.2.2.5. Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh ............................................... 11

1.3. Cơ chế tác động của kháng kháng sinh .................................................................. 11

1.4. Cơ chế kháng kháng sinh ........................................................................................ 14

1.4.1. Bản chất di truyền của tính đề kháng và các phương thức chuyển tải gen... 14

1.4.1.1. Đề kháng tự nhiên .................................................................................. 15

1.4.1.2. Đề kháng mắc phải ................................................................................. 15

1.4.2. Cơ chế kháng kháng sinh .............................................................................. 16

1.4.2.1. Tạo enzyme phân hủy kháng sinh làm bất hoạt kháng sinh ................... 17

1.4.2.2. Thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn ................................................. 20

1.4.2.3. Thay đổi cấu trúc receptor của kháng sinh làm giảm gắn kết của kháng

sinh với điểm tiếp nhận ......................................................................... 21

1.4.2.4. Bơm đẩy ................................................................................................. 22

1.4.3. Cơ chế kháng một số nhóm kháng sinh của vi khuẩn Gram âm .................. 22

1.4.3.1. Kháng Penicillin và Cephalosporin ........................................................ 22

1.4.3.2. Kháng Carbapenemes ............................................................................. 23

1.4.3.3. Kháng Aminoglycoside .......................................................................... 23

1.4.3.4. Kháng Fuoroquinolones ......................................................................... 24

1.4.3.5. Kháng Tetracyclin .................................................................................. 24

1.4.3.6. Kháng Sulfonamid .................................................................................. 24

1.5. Tình hình kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae trên thế giới và trong

nước ...................................................................................................................... 25

1.5.1. Trên thế giới .................................................................................................. 25

1.5.1. Tại Việt Nam ................................................................................................ 29

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 32

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 32

2.1.1. Đối tượng ...................................................................................................... 32

2.1.2. Cỡ mẫu ......................................................................................................... 32

2.1.3. Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 32

2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài .............................................................................. 33

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 33

2.2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 33

2.2.2. Phương pháp thực hiện ................................................................................. 36

2.2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu ............................................................................................................... 39

2.2.2.2. Nhuộm Gram: xác định vi khuẩn Gram âm ........................................... 42

2.2.2.3. Dùng các thử nghiệm sinh hóa để định danh Klebsiella pneumoniae ... 43

2.2.2.4. Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer ............................. 47

2.2.2.5. Thử nghiệm đĩa đôi ................................................................................ 50

2.2.2.6 Thử nghiệm Hodge test ........................................................................... 51

2.2.2.7. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng kháng sinh .............................. 52

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................... 57

3.1. Đặc tính mẫu ........................................................................................................... 57

3.1.1. Đặc tính về giới tính của bệnh nhân ............................................................. 57

3.1.2. Đặc tính về tuổi bệnh nhân ........................................................................... 57

3.2. Sự phân bố vi khuẩn Klebsiella pneumoniae trong các loại bệnh phẩm ................ 58

3.3. Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae ........................... 59

3.4. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng ........................................ 63

3.5. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase .................................................. 67

3.6. Kết quả PCR ........................................................................................................... 68

3.6.1. Gen CMY-2 .................................................................................................. 69

3.6.2. Gen blaOXA -1 ................................................................................................. 72

3.6.3. Gen blaNDM-1 ................................................................................................. 75

3.6.4. Gen blaIMP ..................................................................................................... 78

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 82

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AM Ampicilline

AMC Amoxiclline/clavalanic acid

AN Amikacine

BHI Brain Heart Infusion

CA Chocolate Agar + Polyvitex

CAZ Caftazidime

CDC Centers for Disease Control and Prevention - Trung tâm kiểm soát và

phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kì

CFU Colony Forming Unit - Đơn vị tạo khuẩn lạc

CIP Ciprofloxacine

CN Cephalexine

CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute - Viện tiêu chuẩn Lâm sàng và

Xét nghiệm

CS Colistin

CO Columbia Agar + 5% máu cừu

ADN Acid đeoxyribonucleic

DNT Dịch não tủy

EPM Etapenem ESBL Extended Spectrum Beta Lactamase -β- lactamase phổ rộng EP Nước muối sinh lý vô trùng

FT Nitrofurantoin

I Intermediate - Trung tâm

ISO International Organization for Standardiazation - Tổ chức tiêu chuẩn hóa

quốc tế

IPM Imipenem

KPC Klebsiella pneumoniae Carbapenemase

LPS Lipopolysaccharide

MHA Mueller Hinton Agar

MBL Metallo-β-lactamase

MPM Meropenem

MEC Mecillinam

mARN messenger RNA

NET Netilmicine

PBP Penicillin-binding protein

PIP Piperacilline

R Resistant - Đề kháng

ARN Acid ribonucleic

S Susceptibility - nhạy cảm

SXT Trimethoprim+Sulfamethoxazole

TE Tetracyline

TSA Tryptic Soy Agar

UDP Uridindiphosphat

WHO World Health Organization - Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Lớp, phân lớp kháng sinh beta lactam……………………………………....9

Bảng 1.2. Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler…………………………....18

Bảng 1.3. Phân loại enzyme β-lactamase theo Karen Bush………………………......18

Bảng 2.1. Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm……………………………....39

Bảng 2.2. Các đoạn mồi dùng trong PCR phát hiện gen kháng kháng sinh………......53

Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR…………………………………........54

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt cho từng gen mục tiêu…………………………………......55

Bảng 3.1. Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo giới tính………………………....57

Bảng 3.2. Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo độ tuổi………………………......58

Bảng 3.3. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae phân lập từ các loại bệnh phẩm……………..59

Bảng 3.4. Tính nhạy cảm kháng sinh của Klebsiella pneumoniae…………………....60

Bảng 3.5. So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh với các nghiên cứu trước……………….....61

Bảng 3.6. Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae…............................63

Bảng 3.7. Kết quả của một số nghiên cứu về Klebsiella pneumoniae sinh ESBL……64

Bảng 3.8. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL theo mẫu bệnh phẩm………….....64

Bảng 3.9. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL kháng với các kháng sinh……….65

Bảng 3.10. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase………………………..67

Bảng 3.11. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase theo mẫu bệnh phẩm…67

Bảng 3.12. Kết quả PCR phát hiện 4 gen kháng kháng sinh……………………….....68

Bảng 3.13. Kết quả điện di gen CMY-2……………………………………………....70

Bảng 3.14. Kết quả điện di gen blaOXA-1………………………………………………71

Bảng 3.15. Kết quả điện di gen blaNDM-1………………………………………….......74

DANH MỤC CÁC HÌNH - SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ

Trang

Hình 1.1. Klebsiella pneumoniae………………………………………………………4

Hình 1.2. Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae trên môi trường CA…………………….5

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 4 nhóm β-lactam……………………………………...9

Hình 1.4. Cơ chế tác động của kháng sinh…………………………………………....12

Hình 1.5. Các phương thức lan truyền gen đề kháng………………………………....16

Hình 1.6. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn………………………………….....17

Hình 2.1. Klebsiella pneumoniae bắt màu hồng trên phết nhuộm Gram…………......42

Hình 2.2. API định danh vi khuẩn của BIOMERIEUX – Pháp………………………46

Hình 2.3. Kết quả định danh API 20E của Klebsiella pneumoniae………………......47

Hình 2.4. Kháng sinh đồ của Klebsiella pneumoniae………………………………...50

Hình 2.5. Thử nghiệm đĩa đôi………………………………………………………...51

Hình 2.6. Thử nghiệm Hodge test……………………………………………….........52 Hình 3.1. Kết quả PCR gen CMY-2 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…….69 Hình 3.2. Kết quả PCR gen blaOXA-1đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…….72 Hình 3.3. Kết quả PCR gen blaNDM-1đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…....76 Hình 3.4. Kết quả PCR gen blaIMP đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 –

Mỹ)….......79

Sơ đồ 2.1. Phương pháp nghiên cứu sự kháng kháng sinh của K. pneumoniae………37

Sơ đồ 2.2. Quy trình nuôi cấy Klebsiella pneumoniae từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu,

dịch não tủy, nước tiểu………………………………………………………………..38

Sơ đồ 2.3. Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy

khuếch tán kháng sinh trên mặt thạch………………………………………………...48

Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae………………….61

Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng………………..63

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Klebsiella là một loại vi khuẩn Gram âm thường được tìm thấy trong ruột của

người (mà không gây bệnh), phân người hoặc ở đường hô hấp. Chúng xâm nhập vào

đường hô hấp (hít thở) và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi,

hoặc xâm nhập vào đường máu gây nhiễm trùng máu hoặc nhiễm trùng vết thương,

nhiễm khuẩn đường tiết niệu, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang...

Ngày nay, có nhiều vi khuẩn Klebsiella đã kháng thuốc, nhất là với loại thuốc

kháng sinh carbapenem, điển hình là ổ dịch hoành hành khắp các bệnh viện ở Israel

khiến 120-200 người tử vong bắt đầu khoảng năm 2006 [65], cùng thời điểm đó tại các

bệnh viện Hàn Quốc cho thấy Klebsiella pneumoniae kháng cephalosporin thế hệ 3 là

29%. (Theo số liệu nghiên cứu KONSAR từ 2005-2007).

Tình hình kháng thuốc của Klebsiella pneumoniae không chỉ xuất hiện ở Israel

và Hàn Quốc mà còn diễn ra tại một đất nước có nền y học phát triển đó là Hoa Kì,

“dịch kháng thuốc” của Klebsiella pneumoniae do sản xuất carbapenemase (KPC)

được mô tả lần đầu tiên vào năm 1996 gây chết người liên tiếp. Kể từ đó lan rộng ra 41

tiểu bang, thường xuyên xảy ra trong một số bệnh viện ở New York và New Jersey

[63].

Riêng Việt Nam, theo kết quả tìm hiểu thực trạng sử dụng kháng sinh trong

nhiễm khuẩn bệnh viện tại các đơn vị điều trị tích cực ở một số cơ sở khám, chữa bệnh

cho thấy 4 chủng vi khuẩn phân lập được nhiều nhất là Acinetobacter spp.,

Pseudomonas spp., E.coli, Klebsiella spp. 4 chủng này đều là vi khuẩn đa kháng kháng

sinh.

Hiện nay, sự kháng thuốc của chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae cực kì nguy

hiểm bởi vì bản thân loại vi khuẩn này có khả năng sinh được hai loại enzyme: β

lactamase phổ rộng và carbapenemase [15]. Các enzyme này làm biến đổi, phá hủy

cấu trúc hóa học của kháng sinh [27]. β lactamase phổ rộng có khả năng phân giải hầu

hết các loại kháng sinh thuộc nhóm β lactam đặc biệt đối với penicillins và

cephalosporins thế hệ thứ 3 [47]. Quan trọng hơn nữa là Klebsiella pneumoniae còn có

khả năng sản sinh được carbapenemase phân giải carbapenem như imipenem,

meropenem..., trong khi carbapenem được xem như là cứu cánh cuối cùng trong việc

lựa chọn kháng sinh để điều trị [69]. Để tránh tình trạng đa kháng trên lâm sàng, điều

cấp thiết nhất đặt ra cho chúng ta là làm thế nào để phát hiện nhanh, chính xác được vi

khuẩn Klebsiella pneumoniae sinh β lactamase phổ rộng và carbapenemase càng sớm

càng tốt giúp các bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp nhất để điều trị cho bệnh nhân.

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella

pneumoniae tại viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh”

2. Mục đích nghiên cứu

Xác định đặc tính kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae tại Viện Pasteur

Tp. Hồ Chí Minh.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được từ các bệnh phẩm tại Viện

Pasteur Tp. Hồ Chí Minh từ 01-06/2014.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nuôi cấy, phân lập và định danh chủng Klebsiella pneumoniae.

- Khảo sát tỷ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae ở giới tính, các lứa tuổi, bệnh

phẩm khác nhau.

- Khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae phân lập được.

- Sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi,

sinh carbapenemase bằng Hodge test.

- Xác định một số gen mã hóa cho tính kháng kháng sinh của Klebsiella

pneumoniae.

5. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thu mẫu, nuôi cấy, phân lập, định danh, làm kháng sinh đồ, sàng

lọc chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase, β-lactamases phổ

rộng, phát hiện gen kháng thuốc được thực hiện theo quy trình chuẩn của Viện Pasteur

Tp. HCM đạt chuẩn ISO 15189:2007.

- Thu mẫu bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu.

- Phân lập và định danh các chủng Klebsiella pneumoniae bằng các thử nghiệm

hóa sinh hoặc API 20E.

- Thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer.

- Thử nghiệm đĩa đôi, thử nghiệm Hodge test sàng lọc các chủng Klebsiella

pneumoniae sinh β-lactamases phổ rộng, carbapenemase.

- Phát hiện các gen kháng kháng sinh bằng phương pháp PCR.

6. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài

- Dự kiến thời gian : từ 01/2014 đến tháng 06/2014.

- Địa điểm thực hiện đề tài: Khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur

Tp. Hồ Chí Minh.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Klebsiella pneumoniae

Năm 1882, Fridlander C.Uber đầu tiên phát hiện ra Klebsiella là tác nhân gây

bệnh viêm phổi [45].

Vào năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853-

1938) phát triển kỹ thuật nhuộm Gram để phân biệt các Pneumococcus với Klebsiella

pneumoniae [17].

1.1.1. Đặc điểm vi sinh học

1.1.1.1. Hình thái và cấu trúc

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria

Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Chi: Klebsiella

Hình 1.1. Klebsiella pneumoniae

Loài: Klebsiella pneumoniae [90]

Klebsiella pneumoniae là thành viên quan trọng nhất của chi Klebsiella trong họ

Enterobacteriaceae. Klebsiella pneumoniae là một loại trực khuẩn Gram âm, bắt màu

đậm ở hai cực, kích thước 0,5-2 µm, hình que, không có lông, không di động, có vỏ,

không sinh nha bào [75] [85].

1.1.1.2. Cấu trúc kháng nguyên

Gồm hai loại kháng nguyên trên bề mặt tế bào

+ Kháng nguyên O

Đây là kháng nguyên của vách tế bào. Kháng nguyên O bản chất là

lipopolysaccharide (LPS) một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó protein làm

cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên,

còn lipid quyết định các đặc tính sinh học và độc tính (nội độc tố). Kháng nguyên O

bao gồm 20 đến 40 đơn vị oligosaccharide, mỗi đơn vị oligosaccharide lại bao gồm 2

đến 8 monosaccharid khác nhau. Dựa trên sự có mặt hay thiếu hụt của kháng nguyên

O mà khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ biểu hiện là dạng S (dạng S - Smooth: nhẵn, khuẩn lạc

thường nhỏ, màu trong, mặt lồi, bờ đều, bóng) hoặc R (dạng R - Rough: xù xì, khuẩn

lạc thường dẹt, bờ đều hoặc nhăn nheo, mặt xù xì, khô) khi vi khuẩn được nuôi cấy

trên đĩa thạch Agar. Kháng nguyên O không bị huỷ ở 100°C trong hai giờ hoặc trong

cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%. Người ta đã

biết có 9 serotypes khác nhau của Klebsiella pneumoniae. Kháng nguyên O có tính đặc

hiệu cao và thường được sử dụng để phân loại vi khuẩn.

+ Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccharide, mang

tính chất đặc hiệu type với hơn 80 serotypes khác nhau. Trong đó type 1 và type 2 hay

gặp nhất trong nhiễm khuẩn đường hô hấp.

Cả hai góp phần vào khả năng gây bệnh và cơ sở hình thành serogrouping [4][6]

[72] [76].

1.1.1.3. Cấu trúc bộ gen

Bộ gen hoàn chỉnh đã được xác định vào năm 2006 tại trung tâm giải trình tự gen

tại Đại học Washington ở St Louis. Bộ gen được đặt tên là Klebsiella pneumoniae

subsp. pneumoniae MGH 78.578. Nó bao gồm một nhiễm sắc thể là 5,3 Mbp. Có năm

plasmid, pKPN3, pKPN4, pKPN5, pKPN6, và pKPN7. Tương ứng, mỗi chiều dài

plasmid là 0,18 Mbp, 0.11 Mbp, 0,089 Mbp, 0,0043 Mbp, và 0,0035 Mbp. ADN là

dạng vòng [62].

1.1.1.4. Tính chất nuôi cấy

Klebsiella pneumoniae là loài sống hiếu kỵ khí tùy nghi. Phát triển dễ dàng trên

môi trường nuôi cấy thông thường [6] [17].

- Trên thạch dinh dưỡng hay thạch máu, khuẩn lạc lầy nhầy có màu xám, kích

thước 3-4mm, dạng M, tuy nhiên vẫn có thể gặp một số khuẩn lạc dạng R.

- Trong canh thang, vi khuẩn mọc nhanh và đục đều, ở đáy ống có lắng cặn.

Hình 1.2. Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae trên môi trường CA

1.1.1.5. Tính chất hóa sinh

Lên men nhiều loại đường: glucose, lactose, saccarose. Phản ứng indol âm tính.

Phản ứng citrat dương tính. Urease dương tính. Phản ứng Red Methyl âm tính. Phản

ứng Voges-Proskauer dương tính. H2S âm tính [6] [17].

1.1.2. Khả năng gây bệnh

1.1.2.1. Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn Gram âm thường nguy hiểm hơn vì màng ngoài của chúng được bọc

bởi một nang. Nang này che các kháng nguyên làm cơ thể phát hiện tác nhân xâm lấn

khó khăn hơn. Ngoài ra, màng ngoài vi khuẩn Gram âm có chứa lipopolysaccharide,

đóng vai trò là nội độc tố và làm tăng độ nặng của phản ứng viêm, có thể gây sốc

nhiễm khuẩn [4] [6].

1.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng

Trong những năm gần đây, Klebsiella pneumoniae đã trở thành tác nhân quan

trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện, gây nhiễm trùng cơ hội ở những bệnh nhân bị suy

giảm miễm dịch hoặc ở các bệnh nhân đang hồi sức hô hấp (đang dùng máy hô hấp

nhân tạo), gây nhiễm trùng đường hô hấp dưới như viêm phổi, viêm phế quản thứ

phát, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu, đường mật, đường sinh dục, viêm

màng não, viêm xoang, viêm nội tâm mạc [4] [6].

1.1.3. Chẩn đoán vi sinh vật

Chủ yếu dựa vào chẩn đoán trực tiếp từ các bệnh phẩm khác nhau: đàm, mủ,

máu, dịch não tủy... bằng cách nuôi cấy lên các môi trường thích hợp để phân lập và

xác định vi khuẩn dựa vào hình thể, tính chất nuôi cấy đặc biệt (khuẩn lạc nhầy, dính),

tính chất sinh hóa, khả năng gây bệnh. Xác định type bằng phản ứng ngưng kết hoặc

phản ứng phình vỏ với kháng huyết thanh đặc hiệu type [4] [6].

1.1.4. Phòng bệnh và điều trị

+ Phòng bệnh

Hiện nay chưa có phương pháp phòng bệnh đặc hiệu. Thực hiện các biện pháp

phòng bệnh chung. Chủ yếu là tránh những điều kiện thuận lợi cho nhiễm trùng cơ hội

xuất hiện bằng cách nâng cao sức đề kháng của người bệnh và dự phòng tốt các nhiễm

trùng bệnh viện [4] [6].

+ Điều trị

Sử dụng kháng sinh để điều trị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên Klebsiella pneumoniae

thường có sức đề kháng cao với kháng sinh. Nên cần cẩn thận, cân nhắc để lựa chọn

kháng sinh công hiệu [4] [6].

1.2. Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh

1.2.1. Định nghĩa kháng sinh

- Năm 1928, nhà khoa học Alexander Flemming người Scotland lần đầu tiên thấy

trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm Penicilium thì khuẩn lạc gần

nấm này sẽ không phát triển được, sau đó chất peniciline đã được chiết xuất từ nấm để

dùng trong điều trị.

- Vào năm 1941, peniciline trở thành kháng sinh đầu tiên được tìm ra và được

sản xuất để dùng trong lâm sàng. Khi đó, kháng sinh được coi là những chất do vi sinh

vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật khác,

từ gốc Hy Lạp là antibiotic, nghĩa là chống lại sự sống.

- Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể tổng hợp, bán tổng

hợp các kháng sinh tự nhiên và nhân tạo, do đó định nghĩa kháng sinh đã thay

đổi: kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng

hợp, tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc

diệt được vi khuẩn. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí

quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn [3]

[14].

1.2.2. Phân loại kháng sinh

- Ngày nay con người biết được khoảng 8000 chất kháng sinh, trong đó có

khoảng 100 loại dùng trong y khoa và thú y [38].

- Có nhiều cách để phân loại kháng sinh [1] [10] [38] [73] [83].

1.2.2.1. Dựa vào khả năng tác dụng

Gồm kháng sinh diệt khuẩn, kháng sinh hãm khuẩn.

 Kháng sinh diệt khuẩn

ß-lactams: Penicillin, Ampicillin, Amoxcillin, Cephalosporin

Aminosid: Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Spectinomycin

Quinolon: Flumequin, Norfloxacin, Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Marbofloxacin

Polypeptid: Colistin, Bacitracin, Polymycin

 Kháng sinh hãm khuẩn

Tetracyclin: Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlotetracyclin, Doxycyclin

Macrolid: Erythromycin, Spiramycin, Tylosin, Tiamulin, Josamycin

Lincomycin, Phenicol: Chloramphenicol, Thiamphenicol, Florfenicol

Sulfamid, Diaminopyrimidin: Trimethoprim, Diaveridin, Ormethoprim,

Pyrimethamin

1.2.2.2. Dựa vào phổ tác dụng

Tùy thuộc vào phạm vi của các loại vi khuẩn mà nó ảnh hưởng người ta chia:

kháng sinh đặc hiệu, kháng sinh phổ rộng, kháng sinh phổ hẹp.

 Kháng sinh đặc hiệu là các loại kháng sinh có khả năng tác động lên một loại vi

khuẩn hay một nhóm vi khuẩn nhất định (Spectinomycin tác động lên vi khuẩn lậu).

 Các loại kháng sinh phổ rộng có hoạt tính đối với nhiều loại vi khuẩn khác

nhau, được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh truyền nhiễm. Nhóm này gồm:

Amoxicillin; Carbapenems: Imipenem, Meropenem, Ertapenem;

Piperacillin/tazobactam; Levofloxacin, Gatifloxacin, Moxifloxacin, Ciprofloxacin;

Streptomycin; Tetracycline; Chloramphenicol; Ticarcillin...

 Kháng sinh phổ hẹp là các loại kháng sinh chỉ tác động lên một loại vi khuẩn

gồm: Azithromycin, Clarithromycin, Clindamycin, Erythromycin, Vancomycin...

1.2.2.3. Dựa vào nguồn gốc

Gồm kháng sinh tổng hợp tự nhiên, bán tổng hợp, tổng hợp.

 Tổng hợp tự nhiên: được sản xuất và phân lập từ các sinh vật sống.

Benzylpenicilin là một penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi cấy nấm

Penicillium chrysogenum. Aztreonam (Azactam): là chất duy nhất của nhóm

Monobactam được phân lập từ Chromobacterium violacerum.

 Tổng hợp: tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh như sulfonamides,

quinolones, oxazolidinones...

 Bán tổng hợp: biến đổi về mặt hóa học từ các hợp chất ban đầu được tìm thấy

trong tự nhiên như là beta-lactams (trong đó bao gồm penicillins được sản suất bởi

nấm trong chi Penicillium, cephalosporins, carbapenems)

1.2.2.4. Dựa trên cấu trúc hóa học

 Nhóm beta lactam:

Các kháng sinh β-lactam được chia thành 4 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học:

- Các penam: vòng A có 5 cạnh bão hòa, gồm các penicilin và các chất ức chế β-

lactamase.

- Các cephem: vòng A có 6 cạnh không bão hòa, gồm các cephalosporin.

- Các penem: vòng A có 5 cạnh không bão hòa, gồm các imipenem, ertapenem.

- Các monobactam: không có vòng A, là kháng sinh có thể tổng hợp như

aztreonam.

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 4 nhóm β-lactam

Phân loại kháng sinh nhóm beta lactam [17] [38]

Bảng 1.1. Lớp, phân lớp kháng sinh beta lactam

Lớp kháng sinh Phân nhóm kháng sinh Kháng sinh tiêu biểu

Penicillins Penicillin Penicillin

Amino- penicillin Ampicillin, Amoxicillin

Ureido- penicillin Azlocillin, Mezlocillin, Piperacillin

Carboxy- penicillin Carpenicillin, Ticarcillin

Penicillinase-stable Cloxacillin, Dicloxacillin, Methicillin,

penicillins Nafcillin, Oxacillin

Amidino penicillin Mecillinam

Amoxicillin-clavulanic acid β-lactam/yếu Ampicillin-sulbactam, tố kết hợp ức Ceftaroline-avibactam, chế β- Piperacillin-tazobactam, lactamase Ticarcillin- clavulanic acid

Cephems(tiêm cephalexin, cefradin, cefadroxil, Cephalosporin thế hệ I ) cephalophin, cephapirin…

cefaclor, cefuroxim, cetotetan,

Cephalosporin thế hệ II cefonicid, caforanid, cefamandol,

cefprozil, cefoxitin, cefmetazol…

cefotaxim, cefixim, cefoperazon,

Cephalosporin thế hệ III ceftazidim, ceftizoxim, ceftriaxon…

Cephalosporin thế hệ IV cefepim, cefpirom

Cephalosporins kháng Ceftaronline, Ceftopiprole sự hoạt động của MRSA

Cephamycin Cefmetazole, Cefotetan, Cefoxitin

Oxacepem Moxalactam

Cefaclor, Cefadroxil, Cefdinir,

Cephems Cefditoren, Cefetamet, Cefixime, Cephalosporin (uống) Cefpodoxime, Cefprozil, Ceftibuten,

Cefuroxime, Cephalexin, Cephradine

Carbacepem Loracarbef

Monobactams Aztreonam

Penems Carbapenem Doripenem, Ertapenem, Imipenem,

Meropenem, Razupenem

Penem Faropenem, Sulopenem

 Non-beta lactams

Nhóm aminoglycosid (aminosid): streptomycin, gentamicin, tombramycin,…

Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromycin, spiramycin,…

Nhóm lincosamid: lincomycin, clidamycin,…

Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol

Nhóm tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin

Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin, ofloxacin,…

Nhóm co-trimoxazol: co trimoxazol.

Nhóm peptid: glucopeptid: vancomycin, polypeptid: polymyxin, bacitracin.

1.2.2.5. Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh

- Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn: bao gồm các

kháng sinh như: bacitracin, cephalosporin, cycloserine, penicillin, rostocetin,

vancomycin.

- Ức chế chức năng của màng tế bào: các nhóm kháng sinh gồm có colistin,

polymyxin, gentamicin...

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: là những kháng sinh như:

chloramphenical, erythromycins, lincomycins, tetracylines, aminoglycoside,...

- Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bao gồm có actinomycin, mitomycin,

nalidixic acid, novobiocin, pyrimethamine, rifampin, sulfonamides, trimethoprim.

- Thuốc ức chế chuyển hoá: cotrimoxazole.

1.3. Cơ chế tác động của kháng kháng sinh

Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động sẽ phát huy tác dụng

bằng cách:

Hình 1.4. Cơ chế tác động của kháng sinh

1.3.1. Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn

Khác với tế bào động vật, vi khuẩn có một lớp vỏ cứng bên ngoài gọi là vách tế

bào có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở

bên trong tế bào. Vách chiếm 20% trọng lượng khô của tế bào vi khuẩn Gram dương

lớn hơn Gram âm từ 3 đến 5 lần. Dưới tác dụng của thuốc kháng sinh thì sự tổng hợp

vách tế bào bị ức chế. Các vi khuẩn Gram dương biến thành dạng hình cầu không có

vách (Protoplast) còn các vi khuẩn Gram âm có vách không hoàn chỉnh (spheroplast).

Những hình thức này làm cho tế bào dễ vỡ ở môi trường có trường lực bình thường.

- Giai đoạn đầu tiên của thuốc là gắn vào các thụ thể PBPs (penicilin – binding

protein) của tế bào. Có khoảng 3 – 6 thụ thể PBP (lượng phân tử 40000 – 120000)

trong đó có một số thụ thể là những enzyme tranpeptidase. Những thụ thể khác nhau

có những áp lực khác nhau đối với một loại thuốc.

- Sau khi gắn vào một hay nhiều thụ thể thuốc sẽ phong bế enzyme tranpeptidase,

làm ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan, một thành phần quan trọng của các tế bào.

Cơ chế của việc phong bế tranpeptidase tương tự với acyl – alanyl – D – alanyl, một

phân tử mà enzyme vẫn thường tác động [1] [10].

- Giai đoạn tiếp theo có liên quan đến việc hoạt hóa men tự tiêu (autolytic

enzyme) gây ra sự ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương (isotonic). Trong môi

trường ưu trương, những tế bào bị biến đổi thành protoplast hay spherolast chỉ được

bao bọc bởi một màng tế bào nên dễ vỡ.

1.3.2. Ức chế chức năng của màng tế bào

Màng sinh chất là nơi trao đổi các chất giữa tế bào vi khuẩn với môi trường bên

ngoài. Màng có tính thấm chọn lọc để kiểm soát các thành phần bên trong tế bào.

Nhưng nếu màng này bị tổn thương, các phân tử lớn và ion sẽ thoát ra ngoài nên vi

khuẩn chết. Các nhóm kháng sinh trên làm mất chức năng của màng làm cho các phân

tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài. Polymyxin và các kháng sinh thuộc

loại polyen tác dụng như một chất tẩy loại cation làm xáo trộn tính thẩm thấu của

màng sinh chất khiến các ion Mg, K, Ca thoát ra khỏi tế bào [1] [10].

1.3.3. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

- Cloramphenicol: Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức

chế peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.

Có tác dụng ức chế tạo cầu peptide.

- Erythromycin giúp ngăn cản chuyển động chuyển đoạn của ribosome theo

mRNA

- Tetracyclin làm ngăn cản sự gắn kết của tARN vào phức hợp ribosome mARN

- Streptomycin làm thay đổi hình dạng 30S mã hóa trên mARN nên đọc nhầm.

- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm

ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.

- Aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá

trình dịch mã không chính xác.

Vi khuẩn có những ribosome 70S, còn tế bào nhân thực lại có ribosome 80S.

Những tiểu đơn vị của mỗi loại ribosome khác nhau về chức năng và thành phần hóa

học nên kháng sinh có thể ức chế sự tổng hợp protein ở ribosome của vi khuẩn mà

không có ảnh hưởng lớn lên ribosome của tế bào chủ [1] [10].

1.3.4. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic

Phần lớn những kháng sinh thuộc nhóm này ức chế hiệu quả sự tổng hợp ADN

của vi khuẩn, một số còn ngăn chặn việc tổng hợp ARN của vi khuẩn [1] [10].

- Actinomycin: ức chế hiệu quả sự tổng hợp ADN. Thuốc gắn vào ADN tạo nên

một phức hợp, các phức hợp này ức chế các ARN tương ứng đặc biệt là mARN.

Mitomycin gắn vào 2 chuỗi ADN ngăn cản chuỗi tách rời làm ADN không được chép.

Cả Actinomycin và Mitomycin đều ức chế vách tế bào vi khuẩn lẫn tế bào động vật

nên ít được dùng trong điều trị.

- Rifampin: Rifamin ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn bằng cách gắn chặt vào

các ARN polymerase nên ngăn chặn sự tổng hợp ARN của vi khuẩn.

- Quinolon: các quinolon và cacboxyflouroquinolon kết hợp vào ADN -

gyrase, ức chế tác dụng của enzyme ADN-gyrase làm cho hai mạch đơn của

ADN không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của ADN.

- Các sulfonamide: đối với nhiều vi sinh vật, acid para-aminobenzoic (viết tắt là

PABA) là một chất chuyển hoá cần thiết trong quá trình tổng hợp acid folic cần thiết

để tổng hợp purin trong ADN. Sulfonamide do có cấu trúc tương tự PABA) có tác

dụng cạnh tranh PABA, hậu quả là một chất tương tự acid folic nhưng không có hoạt

tính tổng hợp acid dihydrofolic được tạo thành và ngăn cản quá trình tổng hợp acid

nucleotid của vi khuẩn.

- Trimethoprin: ức chế hydrofolic reductase, enzyme này biến đổi acid hydrofolic

thành acid tetrahydrofolic, một giai đoạn trong chuỗi phản ứng tổng hợp nhân purin

làm ức chế quá trình tạo acid nucleic.

1.3.5. Ức chế chuyển hoá

Sự phối hợp một trong các sulfonamide và trimethoprin, hai chất tác động ở hai

khâu khác nhau của một quá trình tổng hợp làm tăng rõ hoạt tính của thuốc.

Cotrimoxazole (sulfamehtoxazol và trimethoprime) là chế phẩm phối hợp hiệu quả

cùng ức chế tổng hợp các acid nucleic được dùng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng

[1] [10].

1.4. Cơ chế kháng kháng sinh

1.4.1. Bản chất di truyền của tính đề kháng và các phương thức chuyển tải gen

Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có nguồn gốc ở gen. Các gen kháng

thuốc hiện diện trong nhiễm sắc thể (đề kháng nhiễm sắc thể), hoặc trong một yếu tố di

động như các plasmide, các yếu tố có thể chuyển vị trí hoặc integron (đề kháng ngoài

nhiễm sắc thể). Sự đề kháng có thể tự nhiên hoặc mắc phải [3] [5] [77] [87].

1.4.1.1. Đề kháng tự nhiên

- Các gen đề kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn. Đề kháng tự nhiên là

đặc điểm có ở tất cả các chủng của cùng một loài vi khuẩn, đã có tính kháng trước khi

tiếp xúc với kháng sinh và được biết ngay từ lúc đầu khi nghiên cứu xác định hoạt tính

và phổ tác dụng của thuốc kháng sinh.

- Nguyên nhân do kháng sinh không thể tiếp cận được đích hoặc có ái lực yếu

với đích. Ví dụ: các Pseudomonas kháng kháng sinh nhóm macrolides, hoặc vi khuẩn

Gram âm kháng vancomycine đều là tự nhiên. Đây là sự đề kháng thường xuyên và có

nguồn gốc nhiễm sắc thể, ổn định và di truyền lại cho các thế hệ con cháu (truyền dọc)

khi phân chia tế bào, nhưng không truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác (truyền

ngang) [3] [5] [77] [87].

1.4.1.2. Đề kháng mắc phải

- Vi khuẩn đang nhạy cảm với kháng sinh, sau một thời gian tiếp xúc trở thành

không nhạy cảm với kháng sinh đó nữa, do có sự thay đổi ở gen.

- Sự đề kháng này thường không ổn định và có thể là một trong hai nguyên nhân

sau: đột biến nhiễm sắc thể nhất thời hoặc mắc phải các gen đề kháng từ một vi khuẩn

khác.

a) Đột biến nhiễm sắc thể nhất thời (diễn tiến dọc)

- Đột biến nhiễm sắc thể nhất thời là cơ chế đề kháng kháng sinh của khoảng 10-

20% các vi khuẩn. Với các gen đề kháng có trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Sự đột

biến chỉ ảnh hưởng đến một đặc tính là sự đề kháng. Nói chung, chỉ liên quan đến một

kháng sinh hoặc một họ kháng sinh có cùng cơ chế tác dụng. Có thể việc ngăn ngừa sự

lây lan các thể biến dị đề kháng này bằng cách dùng phối hợp hai hoặc nhiều kháng

sinh.

- Ví dụ: đề kháng với kháng sinh rifampicine và các quinolone luôn luôn là do

đột biến.

b) Mắc phải các gen kháng thuốc từ một vi khuẩn khác (diến tiến ngang)

- Tính đề kháng của vi khuẩn do mắc phải các yếu tố di truyền ngoại lai, được

thấy ở cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Việc mắc phải yếu tố di truyền mới có

thể do trao đổi trực tiếp thông tin di truyền là nhiễm sắc thể hoặc do trao đổi các yếu tố

di truyền di động. Trường hợp thứ hai này, các gen đề kháng có ở trong một đoạn ADN

của vi khuẩn nằm ở bên ngoài hay trên một số yếu tố di động, như các plasmid. Dạng

đề kháng này có thể chuyển từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác và thậm chí ở các vi

khuẩn thuộc các loài khác nhau. Sự chuyển giao của một plasmide đơn độc cũng làm

tăng nguy cơ đề kháng với nhiều thuốc. Ví dụ : Vi khuẩn Shigella, gây bệnh tiêu chảy,

có thể chuyển một plasmide đề kháng với 4-5 kháng sinh khác nhau.

- Các gen hoặc nhóm gen đề kháng có thể lây truyền bằng nhiều cách: biến nạp

(transformation), tải nạp (transduction), chuyển vị (transposition) hoặc giao nạp

(conjugation). Sự biến nạp cho phép chuyển hay sát nhập ADN tự do trong môi trường

từ tế bào cho (do vi khuẩn mẹ chết phóng ra) vào tế bào nhận (ví dụ : lậu cầu kháng

penicillin). Sự tải nạp là cơ chế chuyển tải gen, mà vật mang gen là bacteriophage.

Bằng cách này thông tin di truyền được chuyển giữa các vi khuẩn thuộc cùng một loài.

Các plasmid thường được chuyển bằng cách giao nạp. Giao nạp là một tiến trình trong

đó ADN được chuyển từ một vi khuẩn cho sang một vi khuẩn nhận theo một cơ chế

phức hợp cần sự tiếp xúc chặt của tế bào và là cách thức chính gây sự phát tán tính

kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh. Tương tự như thế, tính đề kháng được truyền

cho các vi khuẩn con. Các vi khuẩn đã có yếu tố di động này có thể được phục hồi trở

lại tính nhạy cảm với kháng sinh nếu chúng không còn tiếp xúc với kháng sinh nữa [3]

[5] [77] [87].

Hình 1.5. Các phương thức lan truyền gen đề kháng

1.4.2. Cơ chế kháng kháng sinh

Vi khuẩn phát triển nhiều cơ chế đề kháng để tạo nên sự đề kháng kháng sinh. Sự

đề kháng này đã được nghiên cứu và ghi nhận với các cơ chế chủ yếu sau [51] [56]

[68] [74]:

Hình 1.6. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

1.4.2.1. Tạo enzyme phân hủy kháng sinh làm bất hoạt kháng sinh

- Vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh. Sự

sản xuất enzyme có thể được cảm ứng bởi một yếu tố bên ngoài hoặc không bị ảnh

hưởng bởi kích thích bên ngoài.

- Sự sinh beta-lactamase:

+ Các beta-lactamase là các enzyme do vi khuẩn sinh ra và lây truyền theo đường

nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Các enzyme này đề kháng kháng sinh rất hiệu quả. Chúng

làm bất hoạt các kháng sinh nhóm beta-lactam bằng cách phá hủy nối amide của vòng

beta-lactam làm tách vòng lactam của kháng sinh. Trên toàn cầu, kháng sinh họ beta-

lactam được sử dụng nhiều nhất trong tất cả các nhóm. Vì thế, vấn đề đề kháng với

kháng sinh nhóm này rất đáng lo ngại. Trong số các vi khuẩn Gram dương, tụ cầu vàng

và các cầu khuẩn Gram dương đường ruột là các tác nhân gây bệnh thường hay sinh

beta-lactamase lây truyền qua plasmid nhất. Ngoài ra, các trực khuẩn Gram âm, đặc

biệt là trực khuẩn Gram âm đường ruột, cũng sản xuất nhiều loại beta-lactamases,

được phân thành nhiều nhóm nhỏ, và chúng liên tục được phát hiện ra các nhóm mới

Phân loại enzyme β-lactamase

Dựa vào cấu trúc phân tử và trung tâm hoạt động của enzyme, Ambler (1980)

chia β-lactamases thành 4 lớp A, C, D và B. Chúng được phân thành 2 nhóm chính,

trong đó, trung tâm hoạt động của lớp A, C, D là serine, lớp B (metallo-β-lactamases)

là kim loại (Zn) [61] [67] [79].

Bảng 1.2. Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler

Lớp ESBLs Carbapenemase

Lớp A TEM, SHV, CTX-M, VER, PER, KPC, IMI, NMC, SME

TLA, FSO

NDM, IMP, VIM, SPM, GIM Lớp B

Lớp C AmpC (CMY, FOX,...)

OXA Lớp D OXA

Đến năm 1995, dựa vào chức năng thủy phân thuốc kháng sinh và tính nhạy cảm

của các β-lactamases đối với các chất ức chế enzyme, Karen Bush xếp β-lactamases

thành 4 nhóm 1,2,3 và 4.

Bảng 1.3. Phân loại enzyme β-lactamase theo Karen Bush

Nhóm Phân nhóm Lớp chức β-lactamase chính phân tử năng

Cephalosporinase

Có serine ở trung tâm hoạt động

1 C Có nguồn gốc từ nhiễm sắc thể hay plasmid

Kháng kháng sinh họ β-lactam trừ carbapenems

Không bị ức chế bởi acid clavulanic

Các enzyme có serine ở trung tâm hoạt động và 2 A, D hầu hết bị ức chế bởi acid clavulanic

Penicillinase được sản xuất bởi Staphylococci, 2a A Enterococci.

2b Broad-spectrum β-lactamase như TEM-1, SHV-1 A

Extended-spectrum β-lactamase (ESBLs) kháng 2be A oxyimino-cephalosporins và monobactams

Inhibitor-resistant β-lactamase các enzyme TEM, 2br A SHV

Carbenicillinase thủy phân kháng sinh 2c A Carbenicillin

Cloxacilanase/Oxacillinase thủy phân kháng sinh

2d D Cloxacillin/Oxacillin, ít bị ức chế bởi acid

clavulanic

2e A Cephalosporinases bị ức chế bởi acid clavulanic

Carbapenemase thủy phân kháng sinh 2f A Carbapenem

Metalloenzymes

Có kim loại (kẽm) ở trung tâm hoạt động

Kháng kháng sinh carbapenems và họ β-lactam 3 3a,3b,3c B (trừ monobactam)

Không bị ức chế bởi acid clavulanic

4 Chưa Penicillinases bị ức chế bởi acid clavulanic

xác định

Ngày nay, người ta đã tìm ra hơn 200 loại β-lactamase khác nhau.

β-lactamase phổ rộng (ESBL): Nhóm các enzyme đang nổi lên như một vấn đề

lớn ở Mỹ. Chúng có nguồn gốc từ plasmid, chúng phân hủy tất cả β-lactam kể cả

kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin và aztreonam thế hệ thứ ba trừ carbapenems.

Cho đến gần đây các enzyme này bị ức chế bởi acid clavulanic, sulbactam, và

tazobactam.

+ Vào đầu thập niên 1980, các cephalosporines thế hệ thứ 3 được lưu hành trên

thị trường, nhưng sau khi được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiều bệnh nhiễm trùng,

các biến đổi nhỏ trong chuỗi gen gốc đã làm thay đổi đáng kể tính ái lực của các

enzyme đối với cơ chất, và đã hình thành một nhóm beta-lactamase phổ rộng, hay còn

được gọi là ESBL (Extend Spectra Beta-Lactamases). Phần lớn các ESBL này đến từ

phổ TEM-1 và SHV-1. Thực tế có trên 90 types beta-lactamase TEM và 25 types beta-

lactamase SHV. Nhiều họ ESBL mới được mô tả gần đây là: CTX-M, OXA…

+ Sự đề kháng này diễn tiến nhanh và việc thay thế một lượng nhỏ acid amin của

các beta-lactamase làm cho vi khuẩn càng đề kháng cao hơn nữa, đặc biệt là các beta-

lactamase có gen AmpC hoặc các cephalosporinase cấp độ cao. Gần đây, việc sản xuất

quá mức các cephalosporinase từ nhiễm sắc thể ở cấp độ rất cao đã tạo nên một loại

mới đề kháng với các cephalosporine thế hệ 3. Các enzyme này không phân hủy kháng

sinh mà ức chế sự tiếp cận của kháng sinh tại vị trí tác dụng. Chúng được sinh ra ở các

loài vi khuẩn tự sản sinh cephalosporinase do cảm ứng (trực khuẩn đường ruột,

Pseudomonas aeruginosa), sau khi xảy ra đột biến, các vi khuẩn sản xuất ra một lượng

rất lớn các men này. Đó chính là kiểu hình : “tăng sản sinh cephalosporinases” hoặc

“cephalosporines bức phá”. Thêm nữa, việc sản sinh các carbapenemases bởi các vi

khuẩn Gram âm có thể làm cho vi khuẩn đề kháng với tất cả các thuốc nhóm beta-

lactam, bao gồm cả kháng sinh nhóm carbapenemes.

Tóm lại, việc tăng dần sự đề kháng của vi khuẩn, làm giảm hiệu quả các các

kháng sinh nhóm beta-lactam do sự sản sinh các beta-lactamase, đặc biệt là sự xuất

hiện men ESBL, đồng thời với việc sản sinh carbapenemase gây thu hẹp đáng kể “kho

vũ khí” hiện có và làm cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng ngày càng phức tạp.

1.4.2.2. Thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn

- Các vi khuẩn là các vi sinh vật đơn bào: màng tế bào chất phân cách tế bào chất

với môi trường bên ngoài. Các vi khuẩn Gram âm còn được trang bị thêm một vỏ bên

ngoài, gọi là thành ngoài, có tác dụng như một hàng rào che chở cho các PBP nằm ở

bên trong. Chất dinh dưỡng và kháng sinh phải đi ngang qua lớp vỏ này để thấm vào

bên trong vi khuẩn, theo cách thức khuyến tán thụ động ngang qua các kênh (lỗ nhỏ).

Sự giảm tính thấm của tế bào làm giảm lượng kháng sinh đi vào bên trong đến đích tác

dụng, nguyên nhân là do biến đổi tính thấm lớp màng bên trong hoặc bên ngoài vi

khuẩn. Sự biến đổi các lỗ trên thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thể làm giảm hoặc

ngăn cản sự khuyếch tán của kháng sinh vào đúng vị trí tác dụng. Dạng đề kháng này

xảy ra đối với nhiều kháng sinh của nhiều nhóm khác nhau, do có khi các kháng sinh

khác nhau nhưng có thể dùng chung một loại lỗ. Mặt khác, sự đề kháng này là đặc

hiệu khi một kháng sinh chỉ dùng riêng một loại lỗ. Ví dụ sự đề kháng của

Pseudomonas aeruginosa với imipenem là sự đề kháng đặc hiệu gây ra do mất đi các

lỗ riêng dành cho các carbapeneme.

- Các đột biến của các lỗ đóng vai trò quan trọng trong việc phát tán đề kháng,

đặc biệt sự giảm kích thước lỗ hoặc giảm số lượng các lỗ. Tính thấm liên quan đến các

lỗ thường phối hợp với việc tổng hợp các beta-lactamase tạo nên sự đề kháng cho vi

khuẩn. Đôi khi, có vi khuẩn chỉ trở nên đề kháng khi xảy ra đồng thời hai hiện tượng

trên. Ví dụ, với vi khuẩn Enterobacter sp. và vi khuẩn Serratia sp., sự đề kháng với

imipeneme là do sự biến đổi đồng thời tính thấm tế bào và tăng tổng hợp các beta-

lactamase ở nhiễm sắc thể.

1.4.2.3. Thay đổi cấu trúc receptor của kháng sinh làm giảm gắn kết của kháng

sinh với điểm tiếp nhận

Hiện tượng này là do nguồn gốc từ nhiễm sắc thể hoặc plasmide, theo cơ chế

biến đổi vị trí gắn kết làm giảm độ ái lực của kháng sinh tại vị trí tác dụng

- Biến đổi các protein liên kết với penicillin (PBP): Giảm ái lực của các PBP với

các thuốc nhóm beta-lactam có thể do đột biến gen ở nhiễm sắc thể, hoặc do mắc phải

gen bên ngoài có các PBP mới. Cơ chế này thường gặp với các cầu khuẩn Gram

dương, như Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumoniae, nhưng rất hiếm gặp

ở vi khuẩn Gram âm. Trong số các vi khuẩn Gram âm, cơ chế đề kháng này được thấy

ở Neisseria và hiếm gặp hơn ở Haemophilus influenza

- Biến đổi vị trí gắn kết ở ribosom: Biến đổi bên trong tế bào vi khuẩn ở tiểu đơn

vị ribosom đích có thể làm giảm hoạt tính của kháng sinh macrolides, clindamycine,

nhóm aminosides, hoặc chloramphenicol. Sự biến đổi này làm cho kháng sinh không

đủ khả năng ức chế tổng hợp protein cũng như sự tăng trưởng của vi khuẩn, do không

thể gắn kết vào vị trí tác dụng ở ribosom

- Biến đổi ADN-gyrase và topoisomerase: ADN-gyrase là enzyme cần thiết cho

hoạt tính của các quinolone. Sự đột biến nhất thời ở độc nhất một acid amine của

ADN-gyrase gây ra đề kháng. Tương tự như thế đối với các đột biến ở topoisomerase.

- Biến đổi các tiền chất đích ở thành tế bào vi khuẩn: Hiện tượng này có thể bị

xảy ra khi dùng vancomycine, như trường hợp các cầu khuẩn đề kháng với

vancomycine.

- Biến đổi các enzyme đích: Sự biến đổi của dihydropteroate synthetase kháng lại

sự gắn kết với sulfamide và của dihydropteroate reductase làm mất nhạy cảm với

trimetoprime gây ra kháng thuốc. Sự đề kháng của các vi khuẩn Gram âm đối với các

sulfamide là do plasmide tạo các enzyme đề kháng.

1.4.2.4. Bơm đẩy

Có hệ thống đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng, làm giảm nồng độ

kháng sinh trong tế bào vi khuẩn khuẩn

- Kháng sinh không thể đạt đến vị trí tác dụng do bơm đẩy chủ động đẩy kháng

sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn. Các chất vận chuyển đẩy kháng sinh ra là các thành phần

bình thường của tế bào vi khuẩn và góp phần lớn cho tính đề kháng nội sinh của vi

khuẩn chống lại nhiều thuốc kháng sinh. Các bơm này hoạt động cần năng lượng. Việc

tiếp xúc với kháng sinh làm thuận lợi cho việc tăng số lượng bơm do đột biến các chất

mang, làm tăng mạnh tính đề kháng của vi khuẩn. Đây cũng có thể là nguyên nhân gây

đề kháng chéo. Ví dụ, ciprofloxacine có thể làm thuận lợi việc phát tán đề kháng với

cephalosporine theo cơ chế bơm đẩy. Các vi khuẩn gây bệnh quan trọng trên lâm sàng

có mang bơm đẩy gây kháng thuốc là E.coli và Shigella. Staphylococcus aureus cũng

có bơm đẩy làm cho vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm macrolides.

1.4.3. Cơ chế kháng một số nhóm kháng sinh của vi khuẩn Gram âm

1.4.3.1. Kháng Penicillin và Cephalosporin

Đối với vi khuẩn Gram âm sinh β-lactamase phân hủy kháng sinh được tiết vào

khoảng không gian giữa màng ngoài và vách peptidoglycan.

- Vi khuẩn sinh ra penicillinase và cephalosporinase có khả năng thủy phân các

kháng sinh nhóm penicillin và cephalosporin. Tuy nhiên các enzyme này bị bất hoạt

bởi các chất ức chế beta-lactamase là clavulanic acid và sulbactam. Do đó, khi phối

hợp penicillin hoặc cephalosporin với các chất ức chế beta-lactamase này sẽ chống

được sự đề kháng của các vi khuẩn sinh beta-lactamase [28].

- Vi khuẩn gram âm đường ruột sinh men ESBL (+) [34] [40].

+ Trong số các vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram âm đường ruột là tác nhân

chính gây nhiễm trùng ở bệnh viện và có sự kháng kháng sinh mạnh, cơ chế đề kháng

chính là sinh beta-lactamases đặc biệt là ESBL, đề kháng với tất cả kháng sinh nhóm

ß-lactam đặc biệt là kháng cephalosporin thế hệ thứ ba. Việc sinh beta-lactamases phổ

rộng (ESBL) lây truyền qua plasmide được phát hiện lần đầu tiên ở Đức năm 1983 và

sau đó ở Mỹ. ESBL lần đầu tiền được xác định ở chủng Klebsiella pneumoniae. Sau

đó, chúng được lây truyền nhanh chóng và dễ dàng cho các vi khuẩn Gram âm đường

ruột khác như Escherichia coli. Hiện nay, đây là 2 chủng vi khuẩn Gram âm đường

ruột sinh ESBL thường gặp nhất, các chủng khác hiếm gặp hơn

+ Hiện chưa có số liệu thống kê chính xác tỷ lệ gặp các vi khuẩn sinh men ESBL

tại các bệnh viện là bao nhiêu. Mặc dù các báo cáo về các đợt nhiễm trùng bệnh viện

do các vi khuẩn này là rất nhiều. Một số phòng thí nghiệm vi sinh của các bệnh viện

chưa xác định được các vi khuẩn sinh ESBL.

1.4.3.2. Kháng Carbapenemes

Carbapenems là sự lựa chọn cuối cùng cho nhiều bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn

đa kháng, chẳng hạn như vi khuẩn Escherichia coli ( E. coli ) và Klebsiella

pneumoniae đã kháng cephalosporin thế hệ thứ ba. Gần đây, báo động đã được nâng

lên trên sự lây lan của việc kháng thuốc kháng sinh carbapenem giữa các vi khuẩn, do

chúng sản xuất carbapenemase, bao gồm KPC ( Klebsiella pneumoniae

carbapenemase) và NDM (New Delhi Metallo-beta-lactamase). KPC và NDM là các

enzyme phân hủy carbapenem. Hiện tại không có thuốc kháng sinh mới được phát

hiện để chống lại vi khuẩn đề kháng với carbapenems, và sự lây lan trên toàn thế giới

của các gen kháng được coi là một cơn ác mộng tiềm năng [69].

Người ta cũng đã phân lập được carbapenemase từ các vi khuẩn Pseudomonas

aeruginosa và Acinetobacter baumanii [24] [71].

Có hai kiểu đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh nhóm carbapenem: (1): tạo ra

serine tác động vào amino acide serine tại vị trí 70 hoạt động trong cấu trúc phân tử

của kháng sinh nhóm carbapenem (enzym nhóm A và D). (2): và nhóm B, sinh các

metallo-beta-lactamase (MBLs), các enzyme này hoạt hóa khi có sự tham gia của các

ion kim loại có hóa trị 2, thông thường là kẽm [69].

1.4.3.3. Kháng Aminoglycoside

Vi khuẩn kháng Aminoglycoside nhờ ba cơ chế [69]:

- Biến đổi thuốc bằng quá trình phosphoryl hóa, adenyl hóa được mã hóa bởi

plasmid và acetyl hóa các enzyme làm thay đổi thuốc kháng sinh. Đây là cơ chế quan

trọng nhất.

- Đột biến, ví dụ như đột biến gen mã hóa protein đích ở tiểu thể 30S của

ribosom vi khuẩn.

- Giảm tính thấm của thành tế bào vi khuẩn đối với kháng sinh.

1.4.3.4. Kháng Fuoroquinolones

Vi khuẩn kháng thuốc là do đột biến ở nhiễm sắc thể làm thay đổi ADN-gynase.

Kháng kháng sinh cũng có thể do thay đổi protein ở màng ngoài của vi khuẩn làm

giảm thu nhận kháng sinh [69].

- Tại bệnh viện, các kháng sinh nhóm beta-lactam và fluoroquinolones thường

được lựa chọn trong điều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm đường ruột. Cùng

với việc đề kháng với thuốc nhóm beta-lactam thì sự đề kháng với nhóm

fluoroquinolones cũng đang càng ngày phát triển.

- Lý do chính là việc tăng sử dụng thuốc kháng sinh fuoroquinolones trong cộng

đồng để điều trị viêm phổi, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng da và mô mềm. Cơ chế

đề kháng với nhóm fluoroquinolones theo 2 kiểu: biến đổi đích tác dụng của kháng

sinh và bơm đẩy thuốc ra ngoài làm giảm nồng độ kháng sinh bên trong vi khuẩn.

Chịu trách nhiệm chính hiện tượng này do đột biến gen liên quan đến protein acR.

1.4.3.5. Kháng Tetracyclin

Giảm khả năng tiếp nhận thuốc vào hoặc tăng khả năng loại thải thuốc ra khỏi vi

khuẩn hoặc cả hai. Điều này làm giảm nồng độ thuốc ở trong tế bào vi khuẩn do đó vi

khuẩn kháng lại thuốc [69].

1.4.3.6. Kháng Sulfonamid

Vi khuẩn kháng thuốc nhờ hai cơ chế [69]:

- Hệ thống vận chuyển được mã hóa ở plasmid, chủ động đẩy thuốc ra khỏi tế

bào.

- Đột biến nhiễm sắc thể ở tế bào gan mã hóa các enzyme đích như

dihydropteroatsynthetase có tác dụng làm giảm áp lực gắn thuốc kháng sinh vào vi

khuẩn.

1.5. Tình hình kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae trên thế giới và trong

nước

1.5.1. Trên thế giới

Nghiên cứu của Habeeb Khadri, S.Surekha, S.Lakshmi, G.Narasimha 2007 cho

thấy tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae là ampicillin 95%, cefotaxime

84%, ceftazidime 83%, co-trimoxazole70%, ceftriaxone 70%, amikacin 60%,

tetracyclin 58%, gentamycin 55%.

Theo nghiên cứu ở Đại học Gulbarga (Ấn Độ) từ năm 2008-2010, trong 1064

chủng phân lập từ các vùng khác nhau có 384 chủng Klebsiella pneumoniae (36,09%),

phân lập được nhiều nhất từ đàm 108 chủng (28,12%). Tỷ lệ kháng các kháng sinh

amoxicillin/clavalunic acid (81,63%), ceftazidime (70,40%), cefotaxime (65,30%),

ceftriaxone (65,30%). Nhạy với piperacillin (69,38%), amikacin (12,24%).

Sự kháng thuốc của là do chúng sản xuất các enzyme phân giải kháng sinh

+ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL (extended-spectrum beta-lactamases)

Châu Âu

Vi khuẩn đường ruột, đặc biệt là Klebsiella. spp và E. coli sản xuất ESBL được

tìm thấy lần đầu tiên vào năm 1983 tại Đức và Anh. Chúng kháng lại các loại kháng

sinh, đặc biệt là nhóm cephalosporin [53]. Ở Pháp và Italia có đến 40% chủng

Klebsiella pneumoniae kháng ceftazidime [32].

Tại châu Âu (trong thời gian 1999-2008), đã có sự gia tăng nhiễm trùng xâm lấn

do Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli kháng cephalosporin thế hệ thứ ba, và

điều này được cho là do sự phổ biến của ESBL trong các bệnh viện và cộng đồng [41].

Trong nghiên cứu SMART giữa năm 2009 và 2010 đã kết luận rằng ở châu Âu,

tỷ lệ ESBL do K. pneumoniae sinh ra là 38,9% . K. pneumoniae kháng với nhiều loại

kháng sinh khác nhau bao gồm tất cả β-lactam, fluoroquinolones và aminoglycosides

[46].

North America

Báo cáo phát hiện ESBL được tìm thấy tại Mỹ vào năm 1988. Tỉ lệ kháng

cephalosporin phổ rộng ở bệnh nhân ICU là 6,1% năm 1998-2002 [46] [64].

Tại Bắc Mỹ, tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL dao động từ 8,5 và 8,8% [46].

Latin America

Chương trình giám sát kháng khuẩn SENTRY vào năm 2001 lưu ý, trong khoảng

10000 mẫu vi khuẩn từ mười trung tâm phân phối rộng rãi khắp Nam Mỹ có 45% K.

pneumoniae sản sinh ESBL [86].

Châu Phi

Ở những bệnh nhân được điều trị tại các bệnh viện châu Phi, tỷ lệ vi khuẩn sinh

ESBL khác nhau giữa các quốc gia. Trong hai nghiên cứu về K. pneumoniae ở bệnh

viện Tunis, Tunisia (thời gian nghiên cứu: 1999-2005 và 2010), ESBL đã tăng 11,7-

77,8% [42].

Trong bệnh viện Algeria, ESBL 31,4%. ESBL thuộc lớp A là phổ biến nhất,

nhưng plasmid mã hóa AmpC (AmpC) thuộc lớp C cũng có mặt [73].

Tại Ai Cập, ESBL được tìm thấy 42,9% mẫu trong các bệnh viện Cairo và cộng

đồng; các gen mã hóa ESBL liên quan là lớp A [51].

Châu Á

Tỷ lệ kháng ESBL qua trung gian của Klebsiella. spp là 48,8% ở Hàn Quốc và

nằm trong khoảng từ 20-40% trên toàn khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc và Nhật

Bản [49].

Từ tháng 2-6 năm 2006 Ankur Goyal và cộng sự đã nghiên cứu về “β-lactamase

phổ rộng trong Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae và các yếu tố nguy cơ liên

quan” tại viện khoa học y khoa Sanjay Gandhi, Ấn Độ. Kết quả: trong 200 chủng phân

lập được E. coli (n = 143) và K. pneumoniae (n = 57), ESBL được tìm thấy trong

63,6% E. coli và 66,7% K. pneumoniae. Trong đó kiểu gen blaCTX-M là phổ biến

nhất (85,4%) tiếp theo là blaTEM (54,9%) và blaSHV (32,9%) [77]. Kháng amikacin

14,7 %, gentamicin 66,7 %, trimethoprim / sulphamethoxazole 79,1 % và ciprofl

oxacin 93,8% [30].

+ Sự xuất hiện của Klebsiella pneumoniae carbapenemases

Từ năm 2000, sự lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn Gram âm là căn

nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện có khả năng sinh ra ESBL (extended-

spectrum beta-lactamase) phân giải hầu hết các kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm

cephalosporin đã được ghi nhận trên toàn thế giới [15] [16]. Carbapenem là nhóm

kháng sinh mạnh nhất được sử dụng để điều trị cho các trường hợp bị nhiễm khuẩn

bệnh viện nặng do các chủng vi khuẩn Gram âm sinh ESBL. Tuy nhiên do sử dụng

rộng rãi loại kháng sinh này đã tạo áp lực cho vi khuẩn kháng lại carbapenem. Enzyme

phân giải carbapenem mã hóa bởi gen KPC, IMP và VIM được phát hiện ở khắp nơi

trên thế giới. Enzyme OXA-48 phân giải carbapenem tập trung chủ yếu ở các quốc gia

vùng Địa Trung Hải, châu Âu và Ấn Độ [59].

Vào năm 2001, Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) thuộc lớp A được

báo cáo đầu tiên trong một mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân ở Bắc Carolina [88].

KPC được mã hóa bởi gen blaKPC, có khả năng lan truyền rộng rãi do vị trí của nó nằm

trên TN3 loại transposon, Tn4401. Transposon này là một yếu tố di truyền có khả năng

chèn vào plasmid đa dạng của vi khuẩn Gram âm. Plasmid mang blaKPC thường cũng

liên quan đến yếu tố quyết định sức đề kháng cho các kháng sinh khác. Mặc dù, K.

pneumoniae vẫn là loài vi khuẩn phổ biến nhất mang KPC, enzyme này đã được xác

định trong một số trực khuẩn Gram âm khác [52]. Các ổ dịch vượt qua khỏi nước Mỹ

có mặt ở các quốc gia khác. Trong một nghiên cứu 2002-2003 giám sát tại thành phố

New York, 9 chủng K. pneumoniae của 602 mẫu bệnh phẩm phân lập được phát hiện

có chứa gen blaKPC. Một năm sau khi bùng phát lẻ tẻ ban đầu ở thành phố New York,

thêm 20 chủng phân lập KPC sản xuất đã được xác định từ 2 dịch bệnh viện trong

thành phố New York và New Jersey. Kể từ đó, KPC đã trở nên phổ biến trên toàn nước

Anh. Ở nghiên cứu tại một trung tâm y tế học tập tại thành phố New York, tỷ lệ kháng

carbapenem K. pneumoniae tăng từ 9% năm 2002 lên 18% vào năm 2004, sau đó tiếp

tục đến 38% trong năm 2008 [70]. Tại Israel, một số cơ sở báo cáo tăng KPC bắt đầu

vào năm 2006 làm 120-200 người tử vong [75]. Sau đó, sự bùng phát và lây truyền của

KPC đã trở thành cơ chế phổ biến kháng carbapenem tại Mỹ hiện nay [57]. Đến nay,

Klebsiella pneumoniae carbapenemase đã được phân lập ở ít nhất 33 quốc gia [52]. Sự

phát hiện KPC cũng đã được báo cáo tại Brazil, Trung Quốc, Colombia, Na Uy, Anh,

Ấn Độ, Thụy Điển, Ý và Phần Lan [66].

Tại Ý, một sự gia tăng nhanh chóng và đáng chú ý của carbapenem không nhạy

cảm Klebsiella pneumoniae đã được báo cáo kể từ năm 2010. Một nghiên cứu thực

hiện từ ngày 15 tháng 5 đến 30 tháng 6 năm 2011 để điều tra sự khuếch tán của CRE

tại Ý từ bệnh nhân nội trú (n = 7154) và bệnh nhân ngoại trú (n = 6595) trên hai mươi

lăm phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng lớn từ 23 thành phố của Ý. Thu được kết quả

K. pneumoniae là loài thường gặp nhất (tỷ lệ phân lập carbapenem không nhạy cảm:

11,9%). Các loại carbapenemase bao gồm OXA-48 là 1,3%. NDM, không được phát

hiện [84].

Đặc biệt, gần đây nhất vào năm 2008, giới khoa học đã công bố thông tin chấn

động, gây quan ngại lớn cho toàn thế giới về việc phát hiện ra chủng vi khuẩn mới có

sức kháng mạnh bất thường tên gọi K. pneumoniae ở bệnh nhân 59 tuổi người Thụy

Điển có tiền sử chữa bệnh tại Bệnh viện New Delhi-Ấn Độ. Khác với các dòng khuẩn

trước đây từng được biết đến, K. pneumoniae kháng thuốc mới được phát hiện đều rất

mạnh và có thể đánh bại bất kỳ loại thuốc kháng sinh nào mạnh nhất từ trước đến nay.

Trong các loại khuẩn mạnh nhất đã được phát hiện tại New Delhi, hầu hết đều có

chứa dòng metallo - beta - lactamase (NDM - 1) đều đã kháng thuốc. Loại enzyme của

vi khuẩn này đã phát triển mạnh và xuất hiện tại hơn 16 quốc gia khác trên khắp thế

giới, bao gồm cả nước Anh.

Điều đáng lo ngại hơn khi các nhà khoa học lấy mẫu gen của khuẩn K.

pneumoniae đem xét nghiệm và phát hiện một chuỗi nhỏ ADN có thể dễ dàng trao đổi

giữa các loại khuẩn khác nhau, làm gia tăng khả năng biến đổi của vi khuẩn. Điều đó

có nghĩa là một khi bị nhiễm khuẩn Klebsiella pneumoniae, bệnh nhân cũng có thể dễ

dàng bị nhiễm thêm nhiều loại khuẩn khác. Điều này cho thấy tính kháng kháng sinh

của vi khuẩn diễn ra đa dạng, phức tạp, xu hướng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng

và nguy hiểm hơn. Đây là vấn đề y tế nghiêm trọng mang tính toàn cầu được tổ chức Y

tế Thế giới cảnh báo, nếu không có các nghiên cứu kịp thời và đưa ra giải pháp nhanh

chóng và hiệu quả thì sẽ không có kháng sinh để điều trị hiệu quả cho các vi khuẩn

này trong 5 – 10 năm tới. Một nghiên cứu được công bố trên chuyên mục bệnh dịch

của tờ tạp chí Lancet cũng cho biết tình trạng khuẩn biến đổi và kháng thuốc đã lan ra

14 nhóm khuẩn khác nhau trên thế giới, trong đó bao gồm cả nhóm khuẩn gây bệnh lỵ

và dịch tả. Viện y học Mỹ gọi tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn là thảm hoạ đối với

môi trường và sức khoẻ cộng đồng. Trong khi đó, WHO coi sự gia tăng của NDM - 1

là viễn cảnh đen tối của nhân loại khi thuốc kháng sinh không còn tác dụng.

1.5.1. Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các báo cáo cho kết quả tại một số bệnh viện tại thành phố Hồ Chí

Minh, vi khuẩn Gram âm là căn nguyên thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện cũng

đã kháng lại cephalosporin thế hệ 3 và gia tăng từ 25% năm 2000-2001 lên đến 42%

vào năm 2009. Kháng sinh nhóm carbapenem được đưa vào thị trường Việt Nam vào

đầu những năm 2000 và xu hướng sử dụng nhóm kháng sinh này ngày càng gia tăng

và mở rộng đặc biệt tại các bệnh viện lớn. Điều đó cho thấy tình trạng vi khuẩn kháng

kháng sinh tại các bệnh viện đã ở mức độ cao.

Năm 2004-2005, tác giả Vũ Thị Kim Cương thực hiện nghiên cứu tại Bệnh Viện

Thống Nhất, Klebsiella pneumoniae sinh ESBL chiếm tỉ lệ 53,4% [7].

Một nghiên cứu tương tự trong năm 2005 tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 cho thấy K.

pneumoniae là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện đứng hàng thứ 2 sau E.coli và

được quan tâm nghiên cứu nhiều do đặc tính kháng kháng sinh của chúng và khả năng

đề kháng chéo rất cao trong trường hợp sử dụng nhiều loại kháng sinh. Đặc tính này có

được là do vi khuẩn có ESBL kháng được với các cephalosporin thế hệ thứ 3, 4 với tỷ

lệ từ 50 – 70%. Điểm đáng chú ý là tỷ lệ kháng imipenem của các chủng trong nghiên

cứu này lên đến 10% [13].

Theo nghiên cứu của Mai Văn Tuấn tại bệnh viện trung ương Huế năm 2006 cho

thấy 41,5 % E. Coli; 23,1% Klebsiella pneumoniae sinh ESBL. Chưa phát hiện thấy

các chủng này kháng với carbapenem [21].

Trong những nghiên cứu tương tự ở một số bệnh viện khác, tỷ lệ K. pneumoniae

kháng với carbapenem là rất thấp hoặc chưa phát hiện đựơc chủng kháng. Trong

nghiên cứu của Bác sĩ Trần Thị Ngọc Anh tại Bệnh Viện Nhi Đồng 2 năm 2007 thì so

với E. coli, K. pneumoniae kháng đa kháng sinh ở mức cao hơn. Tỉ lệ kháng rất thấp

với imipenem là 0,7% [2].

Nghiên cứu tại bệnh viện Đại Học Y Dược từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2008 của

tác giả Hoàng Thị Phương Dung có kết quả: trong 66 chủng vi khuẩn sinh ESBL thì có

10 chủng là Klebsiella pneumoniae chiếm 15,2% [8].

Theo báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam

năm 2008-2009 của Bộ Y tế - Việt Nam phối hợp với Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng

kháng sinh GARP- Việt Nam và đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng của Đại học Oxford. Tỉ

lệ kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella rất khác nhau giữa các bệnh viện. Nhìn

chung, Klebsiella giảm nhạy cảm với một số loại kháng sinh nhất định như

cephalosporin thế hệ 3, (ceftazidime), cotrimoxazole, ciprofloxacin và gentamicin.

Một số kháng sinh vẫn còn hiệu lực bao gồm carbapenem và beta-lactam phối hợp với

chất ức chế beta-lactamase. Tỉ lệ sinh ESBL của các chủng Klebsiella dao động giữa

các bệnh viện, cao nhất ở bệnh viện Nhiệt đới Trung ương (Bệnh viện đầu ngành về

bệnh truyền nhiễm) với 72,7% trên Klebsiella, sau đó là Bệnh viện Chợ Rẫy (Bệnh

viện đa khoa lớn nhất khu vực phía Nam) với 58,2%, Bệnh viện Việt Đức (Bệnh viện

chuyên khoa về phẫu thuật) với 48,5%, Bệnh viện Bình Định và 2 Bệnh viện Nhi (Nhi

Trung Ương và Nhi đồng I) với tỉ lệ hơn 50% trên Klebsiella.

Tại Bệnh Viện Trưng Vương, Bác sĩ Bùi Nghĩa Thịnh và cộng sự đã thực hiện

nghiên cứu từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2010 cho thấy các kháng sinh mạnh là

imipenem/cilastatin và meropenem có tỷ lệ kháng bởi K. pneumoniae lần lượt là 5,6%

và 4,3% [18].

Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh carbapenem năm 2010 trên các bệnh nhân

Hồi sức tích cực tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức của Nguyễn Thanh Hiền các chủng

sinh ESBL. Trong đó, tỷ lệ chủng tiết ESBL cao nhất gặp ở Klebsiella pneumoniae

(23/35 chủng chiếm 65,7%) [11].

Theo Nguyễn Đắc Trung nghiên cứu 43 chủng E. Coli 24 chủng Klebsiella

pneumoniae được phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương

Thái Nguyên và Bệnh viện Đại học Y Dược Thái Nguyên từ 4 - 2012 đến 4 - 2013.

Kết quả cho thấy 17 chủng E. coli (39,53%) và 8 chủng K. pneumoniae (33,33%) sinh

ESBL [20].

Với nghiên cứu đa trung tâm do bác sĩ Phạm Hùng Vân và nhóm MIDAS thực

hiện trên 16 bệnh viện tại Việt Nam cho thấy K. pneumoniae một khi đã tiết đựơc

ESBL thì không chỉ đề kháng với penicillin, cephalosporin thế hệ 1, 2, 3, 4,

monobactam mà còn có tỷ lệ kháng cao đối với aminoglycoside và fluoroquinolone.

Phân tích cho thấy vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae vẫn còn nhạy cảm cao với

imipenem và meropenem. Có 2,5% Enterobacter spp. kháng được imipenem nhưng

vẫn còn nhạy hoàn toàn với meropenem. Đối với K. pneumoniae, 3,2% kháng

imipenem và 1,2% kháng meropenem. Mặc dù tỷ lệ kháng đựơc carbapenem ghi nhận

là thấp nhưng cần phải đựơc lưu tâm làm rõ vì nếu cơ chế của đề kháng là do vi khuẩn

tiết được carbapenemase thì nguy cơ lan truyền tính kháng thuốc sẽ rất cao vì gen mã

hóa cho tính đề kháng có thể nằm trên plasmid và có thể lan truyền được [25].

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng

Tất cả các chủng Klebsiella pneumoniae được phân lập từ các bệnh phẩm (đàm,

mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu) khác nhau của bệnh nhân được chuẩn đoán bị nhiễm

trùng.

Chủng chuẩn quốc tế (ATCC) (dùng đối chứng trong phương pháp Kirby- Bauer,

dùng trong thử nghiệm Hodge test: Escherichia coli ATCC 25922 (vi khuẩn nhạy

carbapenem), K. pneumoniae ATCC 1705 (carbapenemase dương tính)

2.1.2. Cỡ mẫu

- Tất cả các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được từ các bệnh phẩm: đàm,

mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu của bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm trùng bệnh

viện (NTBV) theo tiêu chuẩn CDC [37] (tiêu chuẩn chuẩn đoán NTBV theo CDC)

(phụ lục 1) (phụ lục 4) được mang đến và được xét nghiệm tại phòng Vi sinh bệnh

phẩm, khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh từ 01/2014

đến tháng 06/2014.

Vì là nghiên cứu lần đầu nên cỡ mẫu được tính theo công thức xác định tỉ lệ:

Trong đó :

n: cỡ mẫu tối thiểu.

Z: hệ số tin cậy tra từ bảng phân phối chuẩn.

p: trị số mong muốn của tỷ lệ.

α: mức ý nghĩa thống kê.

d: độ chính xác (hay sai số cho phép).

Trong nghiên cứu này chúng tôi có 680 mẫu.

2.1.3. Thời gian nghiên cứu

Từ 01/2014 đến tháng 06/2014

2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài

Tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur

Thành phố Hồ Chí Minh.

2.2. Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp nghiên cứu: cắt ngang mô tả.

Xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2007

2.2.1. Vật liệu

a. Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa Petri, que cấy vòng, que cấy thẳng, giá ống nghiệm,

tăm bông vô trùng, ống hút nhựa vô trùng, đèn cồn, que cấy, lame, lamelle, kẹp, thước kẹp Sylvac dùng đo đường kính vòng vô khuẩn (serial N0 211047, Thụy Sỹ), bình

tam giác, ống đong 50 ml; 500 ml, micropipet, đầu tips, eppendorf, khay nhựa 16

giếng, lược nhựa….

b. Thiết bị

- Thiết bị dùng trong phân lập, nuôi cấy, định danh vi khuẩn, thử nghiệm

đĩa đôi, Hodge test

+ Kính hiển vi dùng để soi: Leitz Biomed, kiều loại 020-501-010, Đức

+ Kính hiển vi soi và chụp hình: Olympus CX41, U-CTR 30-2, 3K04189

+ Tủ cấy vô trùng ATSH ESCO, Model: SC24A1, Indonesia + Tủ ủ ấm 370C Memmert, Model: 600, Đức + Tủ ấm 420C Napco, Mỹ

+ Tủ CO2 ESCO (5% CO2), Serial: 2013-8724, Indonesia

+ Máy li tâm EBA III, Đức

+ Máy trộn Vortex Heidolph, loại Top-mix 94323, Đức

+ Máy đo độ đục MacFarland Densi-La-Metr II, loại Densi-2, EU

+ Tủ đông sâu giữ chủng, Nhật

+ Tủ lạnh bảo quản kháng sinh, môi trường, test định danh API loại Jean (1001),

Hàn Quốc

- Thiết bị dùng trong tách chiết ADN và PCR

+ Nồi hấp vô trùng, Nhật

+ Tủ an toàn sinh học EHRET, Đức

+ Máy li tâm lạnh Hermle, Đức

+ Tủ thao tác PCR: Scien-Plas

+ Máy ủ lắc nhiệt Thermo-Shaker TS 100, hãng PEQLAB – Đức

+ Máy Real-time PCR: nhãn hiệu Agilen techologies Stratagen Mx 3005P, Mỹ

+ Cân điện tử

+ Lò vi sóng Sanyo, mã hiệu EM-S2086W

+ Bộ điện di + Máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)

c. Môi trường

Vì các bệnh phẩm khác nhau nên được nuôi cấy trên những môi trường nuôi cấy

dưới đây. Tất cả các môi trường phải được kiểm tra chất lượng trước khi đem vào sử

dụng.

Môi trường nuôi cấy

+ Môi trường thạch máu CO (Columbia Agar + 5% máu cừu) (Bio-rad)

+ Môi trường thạch chocolate CA (CO + 5% máu cừu được chưng cất cách thủy

đến màu nâu đất)

+ Chai cấy máu (công ty Nam Khoa –Việt Nam)

+ Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) (BD, Mỹ)

+ Môi trường Sabouraud + Cloramphenicol (Bio-rad)

+ Môi trường BCP (Bromo Cresol Purple) (Bio-rad)

Môi trường sinh hóa định danh

+ Môi trường LDC (Lysin decarboxylase)

+ Môi trường KIA

+ Môi trường Urea/ Indol

+ Môi trường Simmons citrate

+ Môi trường di động

+ Ngoài cách định danh vi khuẩn bằng môi trường sinh hóa thì có thể định danh

bằng API 20E

Môi trường làm kháng sinh đồ, thử nghiệm ESBL, Hodge test

+ Môi trường MH (Mueller-Hinton Agar)

+ Môi trường TSA (Tryptic Soy Agar) (Merck, Đức)

Môi trường giữ chủng

+ Môi trường LB (Luria Bertami)

d. Hóa chất

- Hóa chất cho định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ

+ Nước muối sinh lý 0,85%.

+ Bộ thuốc nhuộm Gram: Crystol Violet, Lugol, Ethanol 95%, dung dịch Fuchsin

0,5%, nước cất.

+ Dầu soi cedré kính hiển vi.

+ Đĩa oxidase (Biomerieux, Pháp).

+ Khoanh giấy kháng sinh của công ty BioRad: các kháng sinh sử dụng được lựa

chọn theo tiêu chuẩn CLSI 2014 (phụ lục 3).

Kháng sinh nhóm β lactam các penicillins: Ampicilline, Piperacillin, Mecillinam.

Phối hợp β-lactam/chất ức chế β-lactamase: Amoxicilline/clavulanic.

Kháng sinh nhóm β lactam các cephalosporins: Cephalexine, Ceftazidime.

Kháng sinh nhóm carbapenems: Imipenem, Meropenem.

Kháng sinh nhóm aminoglycosides: Amikacin, Gentamicine, Netilmicine.

Kháng sinh nhóm fluoroquinolones: Ciprofloxacine.

Kháng sinh nhóm lipopeptides: Colistin.

Kháng sinh nhóm tetracyclines: 0.

Kháng sinh nhóm nitrofurans: Nitrofurantoin.

Kháng sinh phối hợp: Trimethoprim/sulfamethoxazol

+ Parafin lỏng.

+ Bộ định danh Klebsiella pneumoniae bằng các thử nghiệm hóa sinh hoặc API

20E.

- Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm đĩa đôi

Nước muối sinh lý 0,85%, kháng sinh ceftazidime (CAZ) và

amoxicilline/clavulanic acid (AMC/CLA) hoặc cefotaxim (CTX) và

cefotaxim/clavulanic acid (CTX/CLA).

- Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm Hodge test

Kháng sinh Meropenem 10 (µg) hoặc Ertapenem (10µg).

- Hóa chất cho tách chiết ADN, PCR, điện di

+ Bộ hóa chất dùng cho phản ứng PCR bao gồm: nước (DNase free, RNase free);

Top Taq Master mix (Quigen – Mỹ), primer (AIT – Singapore), TE (Tris-EDTA) của

Sigma, Mỹ.

+ Bộ hóa chất dùng cho điện di ADN bao gồm: agarose của hãng Lonza, TBE

(Tris-Borate-EDTA buffer) của hãng Sigma, ethidiume bromide của hãng Invitrogen,

nồng độ 10mg/ml, loading-dye (Bromothymol Blue) hãng sản xuất Qiagen, marker,

ladder (Aligent Technologies, Mỹ).

- Hóa chất cho giữ chủng + Glycerol 20% để lưu giữ chủng: giữ các chủng chuẩn ở -700C trong môi trường

LB có chứa 20% glycerol. Trước khi sử dụng, cấy và kiểm tra lại các đặc tính sinh hóa của chủng. Các chủng có thể được giữ trong các ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 2-80C

trong vòng 2 tuần.

Chủng trong nghiên cứu này: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella

pneumoniae ATCC 1705, Klebsiella pneumoniae đã phân lập được.

2.2.2. Phương pháp thực hiện

Phương pháp thu mẫu, nuôi cấy, phân lập, định danh, làm kháng sinh đồ, sàng

lọc chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamases phổ rộng,

carbapenemase, phát hiện gen kháng thuốc được thực hiện theo quy trình chuẩn của

Viện Pasteur Tp. HCM đạt chuẩn ISO 15189:2007.

Tiến trình:

+ Nuôi cấy vi khuẩn từ bệnh phẩm: Đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu.

+ Nhuộm Gram: xác định vi khuẩn Gram (-).

+ Dùng các thử nghiệm sinh hóa: oxidase, decarboxylase, di dộng, KIA,

Urea/Indol, Citrate, nitrate hoặc định danh bằng cách chạy API 20E để định danh

Klebsiella pneumoniae.

+ Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer.

+ Thử nghiệm đĩa đôi sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh β-

lactamases phổ rộng.

+ Thử nghiệm Hodge test sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh

carbapenemase.

+ Phương pháp PCR: xác định một số gen kháng thuốc của Klebsiella

pneumoniae.

Mẫu bệnh phẩm

(Đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu)

Bảo quản chủng ở -200C Phân lập định danh K.

pneumoniae theo quy trình của

viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đạt

chuẩn ISO 15189:2007 Thử nghiệm đĩa PCR phát hiện đôi để sàng lọc gen kháng kháng nhanh các chủng sinh Thử nghiệm kháng sinh đồ sinh ESBL

Thử nghiệm

Hodge test để Đọc và phân tích kết quả sàng lọc nhanh kháng sinh theo tiêu chuẩn các chủng sinh CLSI 2014 carbapenemase

Sơ đồ 2.1. Phương pháp nghiên cứu sự kháng kháng sinh của K. pneumoniae

2.2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu

+ Bệnh phẩm đàm

- Soi trực tiếp

Dùng tăm bông hay pipette Pasteur lấy một ít đàm trải đều thành một phết 2x3cm

trên một tấm lame, để khô tự nhiên, sau đó gắn nhẹ trên lửa và thực hiện nhuộm Gram.

Sau đó đánh giá mẫu đàm đạt độ tin cậy để cấy theo tiêu chuẩn thang điểm Barlett.

Bảng 2.1. Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm

Tính chất đại/vi thể Điểm

Mẫu đàm

10-25 bạch cầu +1

>25 bạch cầu +2

Nhầy, mủ, mủ nhầy +1

10-25 tế bào vẩy -1

>25 tế bào vẩy -2

Mẫu đàm hút qua mũi, nội soi phế quản

10-25 tế bào bạch cầu +1

>25 tế bào bạch cầu +2

Tế bào trụ +1

10-25 tế bào vẩy -1

>25 tế bào vẩy -2

Thang điểm đánh giá là cộng tất cả các điểm rồi đánh giá như sau:

• Điểm ≤ 0 không tin cậy để cấy mẫu.

• 1 ≤ Điểm ≤2 tin cậy vừa.

• Điểm ≥3 rất đáng tin cậy.

Tiến hành cấy khi mẫu được đánh giá hoàn toàn tin cậy. Riêng mẫu có độ tin cậy

vừa, có thể yêu cầu lấy mẫu lại hay cũng có thể tiến hành nuôi cấy nhưng phải lấy

được mẫu là vùng đàm mủ, tránh lấy nhớt hay nước bọt để nuôi cấy.

- Dùng tăm bông lấy đàm cấy vào ống thạch Sarbourand+Chloramphenicol để

tìm nấm.

- Làm lỏng đàm bằng nước muối sinh lý theo tỷ lệ đàm/nước muối = 1/1. Dùng

máy vortex trộn đều đàm và nước uối sinh lý. Lấy 10µl cấy 3 chiều trên thạch máu, ủ ở 35±20C/24h.

- Lấy 10µl mẫu bệnh phẩm đã pha loãng ở trên để pha loãng vào ống nước muối

sinh lý 10ml, vortex đều. Sau đó lấy 10µl cấy hình sao (cấy đếm) trên thạch chocolate, ủ trong bình nến 35±20C/24h.

- Sau 24h, quan sát hình thái khuẩn lạc, số lượng khuẩn lạc ưu thế và xác định vi

khuẩn gây bệnh.

Công thức tính X (CFU/ml) = n.2.1000.100

+ Bệnh phẩm là mủ

- Dùng tăm bông lấy mủ phết lên lame và thực hiện nhuộm Gram, cấy vào BHI

để tăng sinh vi khuẩn, phết lên thạch chocolate và thạch máu. Sau đó cấy 3 chiều để

thu khuẩn lạc riêng rẽ. Cuối cùng cấy lên Sabourand+Chloramphenicol để tìm nấm. Ủ ở điều kiện 35±20C/24h (riêng CA ủ trong tủ CO2).

- Quan sát hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa để định danh và làm kháng

sinh đồ.

+ Bệnh phẩm máu

- Máu bệnh nhân được lấy và cấy trực tiếp vào chai cấy máu (sử dụng chai cấy

máu của công ty Nam Khoa). Máu được cấy với tỷ lệ 1 phần máu/10 phần canh thang,

trong canh thang Trypticase soy có bổ sung 5% máu cừu hoặc máu động vật khác và

0,025% SPS (Sodium polyanethole sulfonate, là chất chống tạo áo máu và làm giảm tác dụng của các chất ức chế vi khuẩn có trong máu bệnh nhân), ủ 35±20C/24h. Khi có

dấu hiệu dương tính trong chai cấy máu, ta tiến hành đồng thời

- Nếu quan sát được hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa để định danh và

làm kháng sinh đồ.

- Cấy chuyển lên môi trường thạch máu và thạch chocolate, ủ ở điều kiện 35±20C/24h (CA ủ trong tủ CO2) để thực hiện thử nghiệm sinh hóa, định danh và làm

kháng sinh đồ.

+ Bệnh phẩm dịch não tủy

- Dùng kim tiêm hoặc pipette nhựa vô trùng hút dịch não tủy cho vào BHI, nhỏ 2

giọt lên thạch máu và 2 giọt lên thạch chocolate, trong đó 1 giọt sẽ ria ra và 1 giọt để nguyên. Đến khi dịch não tủy trên mặt thạch đã khô đem ủ ở điều kiện 35±20C/24h

(riêng CA ủ trong tủ CO2). Cấy lên thạch Sarbourand+Chloramphenicol để tìm nấm.

Nhỏ giọt dịch vào buồng đếm để đếm số lượng hồng cầu, bạch cầu.

- Dịch não tủy được ly tâm, lấy cặn cho lên 3 lame để nhuộm Gram, nhuộm mực

tàu tìm nấm Cryptococcus neoformans và nhuộm Ziehl-Nelson tìm trực khuẩn kháng

acid-cồn (vi khuẩn Lao).

- Sau 24h, khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch ở vị trí có ria và cả vị trí giọt dịch

không ria thì khẳng định bệnh nhân bị nhiễm khuẩn. Quan sát hình thái vi khuẩn, tiến

hành các test sinh hóa định danh và làm kháng sinh đồ.

+ Bệnh phẩm nước tiểu

- Trộn đều nước tiểu rồi nhỏ một giọt trực tiếp lên lame 1 để soi tươi và nhỏ 1

giọt lên lame 2 chờ khô tự nhiên rồi nhuộm Gram. Nếu có ít nhất một tế bào vi khuẩn

hay bạch cầu hiện diện trên một quang trường, có thể nghi ngờ bệnh nhân bị nhiễm

trùng nước tiểu. Nếu toàn phết nhuộm không phát hiện hay phát hiện được rất ít tế bào

vi khuẩn hay bạch cầu, bệnh nhân chắc chắn không bị nhiễm trùng nước tiểu.

- Dùng vòng cấy định lượng 10µl, lấy đầy một vòng cấy nước tiểu, trải toàn bộ

lên bề mặt hộp thạch BCP, ủ ở điều kiện 35±20C/24h.

- Sau 24h ủ thạch, đọc kết quả bằng cách đếm để biết số lượng vi khuẩn trong

mẫu cấy ban đầu, suy ra toàn bộ số lượng vi khuẩn sống (CFU) trong 1ml nước tiểu.

Công thức tính X (CFU/ml) = n.100

Nếu có: X ≤ 104 CFU/ml nước tiểu, không có nhiễm trùng tiểu. X ≥105CFU/ml nước tiểu, chắc chắn có nhiễm trùng tiểu. 104≤ X ≤ 105CFU/ml nước tiểu, nghi ngờ nhiễm trùng nước tiểu. Trong trường

hợp này, nếu bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng chắc chắn bị nhiễm trùng tiểu tái phát

nhiều lần, có thể định danh vi khuẩn phân lập được và làm kháng sinh đồ.

2.2.2.2. Nhuộm Gram: xác định vi khuẩn Gram âm a. Mục đích: Xác định vi khuẩn là Gram âm hay dương để tiến hành các bước định

danh tiếp theo.

b. Nguyên lý

Khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm Crystal Violet (Gentian) và một chất gắn

màu Iodine như Lugol nếu ta tẩy màu bằng ethanol 95%, vi khuẩn Gram dương có lớp

peptidolycan dày ăn màu tím của Crystal Violet, ngược lại vi khuẩn Gram âm bị tẩy

mất màu tím. Khi nhuộm lại với Fuchsin 0,5%, nhóm Gram dương vẫn giữ màu tím

còn nhóm Gram âm sẽ bắt màu hồng.

c. Cách nhuộm

- Phết nhuộm được cố định trên lame.

- Phủ Crystal Violet lên phết nhuộm trong 1 phút. Rửa nước và nghiêng kính để

cho ráo.

- Phủ Lugol lên phết nhuộm trong 1 phút. Rửa nước và nghiêng kính cho ráo.

- Phủ ethanol 95% lên phết nhuộm, để 30 giây. Rửa bằng nước và nghiêng kính

cho ráo.

- Nhuộm lại với dung dịch Fuchsin trong 30 giây. Rửa nước và thấm khô vết

nhuộm.

- Quan sát ở vật kính dầu.

Đọc kết quả:

+ Vi khuẩn Gram dương giữ màu tím của Crystal Violet (tím Gentian).

+ Vi khuẩn Gram âm giữ màu hồng của Fuchsin.

Hình 2.1. Klebsiella pneumoniae bắt màu hồng trên phết nhuộm Gram

2.2.2.3. Dùng các thử nghiệm sinh hóa để định danh Klebsiella pneumoniae a/ Thử nghiệm oxidase

Nguyên tắc: xác định sự hiện diện của enzym oxidase (hệ cytochrom C).

Thuốc thử: TMPD (0,1%) N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine

Cơ sở sinh hóa: 2 Cytochrom C bị khử + 2 H + + ½ O2 2 Cytochrom C bị oxi hóa+ H2O 2 Cytochrom C bị oxi hóa + thuốc thử  Hợp chất có màu (xanh indophenol)

Cách tiến hành:

- Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame.

- Lấy một đĩa oxidase đặt lên lame.

- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khuẩn lạc quệt lên đĩa giấy oxidase.

- Đọc kết quả sau 30 giây: phản ứng dương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiện

màu tím đen; âm tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen.

Đối với Klebsiella pneumoniae cho kết quả âm tính khi thử nghiệm oxidase.

b/ Thử nghiệm decarboxylase

Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase

thủy phân được các axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl.

Các enzyme carboxylase chỉ được cảm ứng tổng hợp khi môi trường có tính acid và

chứa chất cảm ứng đặc hiệu. Phản ứng tạo CO2 trong điều kiện kỵ khí, CO2 sinh ra

làm giảm pH của môi trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH.

Cách tiến hành

Dùng pipet Pasteur hay micropiper lấy 2-3 giọt huyền phù cho vào môi trường

Lysin decarboxylase (LDC), xuyên pha lớp parafilm.

- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.

- Đọc kết quả: dương tính khi môi trường có vi khuẩn mọc và có màu tím; âm

tính khi môi trường có màu vàng hoặc có vàng tím.

Thử nghiệm decarboxylase Klebsiella pneumoniae cho kết quả âm tính.

c/ Thử nghiệm di động

Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi trí

khác nhau trên tế bào vi sinh vật. Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ

sung triphenyltetrazolium chloride để phát hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành

formazan có màu đỏ.

Cách tiến hành

Dùng que cấy vô trùng lấy khúm khuẩn và cắm kim cấy cách 2/3 đáy ampule

chứa môi trường MOB, rút que cấy theo chiều thẳng đứng, cấy ria trên bề mặt thạch.

- Ủ 35-37oC/12-24 giờ

- Đọc kết quả: vi khuẩn có khả năng di động khi màu đỏ lan rộng ra khỏi đường

cấy.

Klebsiella pneumoniae cho kết quả âm tính khi thử nghiệm di động.

d/ Thử nghiệm KIA

Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate, khả

năng sinh H2S và sinh khí trong môi trường KIA chứa hai loại đường lactose 1% và

glucose 0.1%. Sau khi nuôi cấy chủng này 18-24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra:

+ Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng

trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể giải thích do vi

sinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít ỏi trên bề mặt mội trường, chúng

tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi

trường có pH kiềm. Ở phần sâu trong môi trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được

lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường. Nếu trong môi

trường có chất chỉ thị phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu

sẽ có màu vàng.

+ Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở

nên có pH acid, vi sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton để tạo năng lượng.

+ Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được

sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh

vật. Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng

kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của bề mặt môi trường và chỉ phần này mới trở nên có

màu đỏ. Trong khi đó, phần môi trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng

đổi màu.

Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí được

nhận biết nhờ các khí này đẩy ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch. Thử nghiệm này

cũng có thể phát hiện khả năng sinh H2S do thành phần môi trường có chứa sodium

thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S. Khí

H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thị ammonium citrate hiện diện trong môi trường.

Thử nghiệm KIA Klebsiella pneumoniae cho kết quả dương tính, không sinh

H2S.

e/ Thử nghiệm Urea/Indol

Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành CO2

và NH3 làm môi trường bị kiềm hóa. Chất chỉ thỉ Phenol Red trong môi trường thử

nghiệm làm môi trường chuyển sang màu đỏ.

Thử nghiệm khả năng sinh indol phát hiên vi sinh vật sản xuất men

tryptophanase khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường canh trypton. Phản ứng thủy

phân trytophan tạo thành Indole, chất này kết hợp với para-dimethylamino

benzaldehyde trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium

màu đỏ.

Thử nghiệm Urea/Indol Klebsiella pneumoniae cho kết quả: urease dương tính,

indol âm tính.

f/ Thử nghiệm Citrate

Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat

thành nitrite hay nitơ tự do trong điều kiện kị khí. Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với

sulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có

màu hồng.

Thử nghiệm citrate Klebsiella pneumoniae cho kết quả dương tính.

h/ Thử nghiệm API 20E

Bộ định danh API 20E (Biomerieux-Pháp) là bộ dụng cụ để định danh vi khuẩn

đến mức loài.

API 20E cho phép định danh chính xác họ vi khuẩn đường ruột

(Enterobacteriaceae) và các vi khuẩn Gram âm khác dựa trên cơ sở dữ liệu đã được

chuẩn hóa, có hệ thống kiểm tra nhanh chóng, an toàn và dễ sử dụng. Bộ định danh gồm hơn 20 phản ứng sinh hóa. Cộng với phần mềm API Web có chứa và cung cấp tất

cả các cơ sở dữ liệu chi tiết để định danh vi khuẩn giúp cho người sử dụng truy cập

nhanh chóng và chính xác hơn. Kết quả được hiện thị trên màn hình và có thể in ra

trực tiếp.

Hình 2.2. API định danh vi khuẩn của BIOMERIEUX - Pháp

- Thực hiện:

+ Kiểm tra độ đục ống nước muối sinh lý ban đầu có McFarland là 0,0. Dùng que

cấy lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cho vào ống nước muối, vortex để tạo huyền dịch đồng

nhất có McFarland là 0,5.

+ Cho nước cất vô trùng vào đáy hộp của bộ API 20E để tạo độ ẩm thích hợp cho

vi khuẩn hoạt động.

+ Dùng pipet nhựa hút huyền dịch và cho vào các giếng cho đến cổ giếng.

+ Các giếng ADH, LDC, ODC, URE, H2S thì nhỏ thêm parafin vào miệng giếng.

Các giếng CIT, VP, GEL thì nhỏ huyền dịch đến miệng giếng.

+ Thử nghiệm được tiến hành đồng thời với chủng E.coli ATCC 25922 để kiểm

tra API.

- Kết quả

Ghi kết quả vào giấy ghi kết quả sau 4 giờ, 18 – 24 giờ và dò tìm trên API Web

hoặc danh mục của nhà sản xuất (phu lục 2).

Hình 2.3. Kết quả định danh API 20E của Klebsiella pneumoniae

Kết quả: Định danh Klebsiella pneumoniae bằng API 20E

ONPG: ortho-nitrophenyl galactosidase (+) GEL: gelatin (-)

ADH: arginine dihydrolase (-) (+) GLU: glucose

LDC: lysine decarboxylase (+) (+) MAL: mannitol

ODC: ornithine decarboxylase (-) (+) INO: inositol

CIT: citrate (+) (+) SOR: sorbitol

(-) (+) RHA: rhamnose H2S: sinh H2S

URE: urea (+) (+) SAC: sucrose

TDA: tryptophane deaminase (-) (+) MEL: melibiose

IND: indole (-) AMY: amygdaline (+)

VP: phản ứng Voges-Proskauer (+) ARA: arabinose (+)

2.2.2.4. Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer

a. Mục đích

Đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh để giúp cho các

thầy thuốc lựa chọn các thuốc kháng sinh phù hợp cho bệnh nhân.

Đánh giá về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn qua đó sẽ đưa ra các biện

pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh

viện và cộng đồng.

b. Nguyên lý

Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Meuler-Hinton có chứa

các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh

được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng

sinh.

c. Thực hiện

Phân lập vi khuẩn K. pneumoniae từ bệnh phẩm

Tạo dịch huyền phù vi khuẩn trong ống EP 2ml tương đương 0,5 McFarland (nồng độ108 CFU/ml)

Điều chỉnh độ đục vi khuẩn: hút 0,1ml cho vào ống EP 9ml (nồng độ106 CFU/ml)

Láng vi khuẩn lên đĩa thạch MH và đợi khô mặt thạch

Đặt khoanh giấy kháng sinh

Đo vòng vô khuẩn, đọc và phân tích kết quả

Sơ đồ 2.3. Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh

giấy khuếch tán kháng sinh trên mặt thạch

+ Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 McFarland: dùng que cấy lấy

1 khuẩn lạc cho vào ống nước muối sinh lý 2ml, vortex, đo độ đục McFarland bằng

máy đo độ đục. Điều chỉnh cho đến khi độ đục vi khuẩn đạt 0,5 McFarland (tương đương 108 CFU/ml). Pha loãng 100 lần từ huyền dịch 0,5 McFarland trên để được huyền dịch nồng độ 106 CFU/ml.

Lưu ý: luôn luôn phải làm song song thử nghiệm với các chủng chuẩn Quốc tế

để kiểm tra chất lượng của qui trình.

+ Láng vi khuẩn lên đĩa thạch Sử dụng ngay huyền dịch nồng độ 106 CFU/ml (trong vòng 15 phút) láng đều lên

mặt thạch Mueller-Hinton.

Hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi.

Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi

đặt kháng sinh.

+ Đặt khoanh giấy kháng sinh

Các khoanh giấy kháng sinh phải được bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện

khô ráo, ở trong tủ lạnh nhiệt độ 20C - 80C hoặc -200C.

Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ âm, không được mở nắp, để

ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ trên khoanh

giấy kháng sinh.

Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, sau khi để khô mặt các đĩa

thạch.

Có thể sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh hoặc

dùng dụng cụ để đặt khoanh giấy kháng sinh nhẹ nhàng lên đĩa thạch. Dụng cụ này sử

dụng xong phải được đóng nắp chặt, cất trở lại vào trong tủ lạnh và làm ấm ở nhiệt độ

phòng trước khi sử dụng.

Không nên đặt quá 7 khoanh giấy lên đĩa thạch 90mm.

Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức

chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.

Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh

giấy khuếch tán trên mặt thạch.

Lộn ngược các đĩa thạch và ủ ấm ở 35 ± 20C trong vòng 16-18 giờ.

+ Đọc và phân tích kết quả theo tiêu chuẩn CLSI 2014

Sau khi ủ ấm, lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô

khuẩn (dùng thước kẹp đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp) của chủng

chuẩn.

So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn,

sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: nhạy cảm (S),

trung bình (I) và kháng (R) (phu lục 3).

Nếu có hiện tượng khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế thì đây có thể xuất hiện sự

thay đổi tính kháng của vi khuẩn hoặc do các huyền dịch vi khuẩn bị nhiễm. Các

khuẩn lạc này nên được nuôi cấy, phân lập và thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh.

Hình 2.4. Kháng sinh đồ của Klebsiella pneumoniae

2.2.2.5. Thử nghiệm đĩa đôi

a. Mục đích

Sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamases phổ rộng (ESBL).

b. Nguyên lí

Thử nghiệm sàng lọc, khi chủng cho đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ hơn

22mm đối với đĩa ceftazidime, cho thấy sự kháng đối với cephalosporins thế hệ thứ III.

Chủng đó được nghi ngờ sinh ESBL.

Thử nghiệm đĩa đôi được thực hiện trên nguyên tắc tìm tác dụng cộng hưởng

giữa đĩa ceftazidime (CAZ) và amoxicilline/clavulanic acid (AMC/CLA) hoặc

cefotaxim (CTX) và cefotaxim/clavulanic acid (CTX/CLA). Sự kết hợp chất ức chế

lactamase như clavulanic acid sẽ làm tăng hoạt tính của cephalosporins thể hiện bằng

sự giãn rộng của vùng kháng khuẩn.

c. Thực hiện

+ Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 McFarland: dùng que cấy lấy

1 khuẩn lạc từ khóm kháng ceftazidime cho vào ống nước muối sinh lý 2ml, vortex, đo

độ đục McFarland bằng máy đo độ đục. Điều chỉnh cho đến khi độ đục vi khuẩn đạt 0,5 McFarland (tương đương 108 CFU/ml). Pha loãng 100 lần từ huyền dịch 0,5

McFarland trên để được huyền dịch nồng độ 106 CFU/ml.

+ Láng đều huyền dịch vi khuẩn lên đĩa thạch Mueller-Hinton: để khô mặt

các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh.

+ Đặt khoanh giấy kháng sinh ceftazidime (CAZ) và amoxicilline/clavulanic

acid (AMC-CLA) lên đĩa thạch. Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho

kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.

Lộn ngược các đĩa thạch và ủ ấm ở 35 ± 20 C trong vòng 16-18 giờ [85].

+ Đọc và phân tích kết quả theo tiêu chuẩn CLSI 2014

Kết quả được đọc dựa theo hướng dẫn của CLSI 2014. Khi đường kính vòng

kháng khuẩn của đĩa amoxicilline/clavulanic acid (AMC/CLA) > 5mm so với đường

kính của vòng kháng khuẩn cephalosporin và tạo nên vòng kháng khuẩn dạng “nút

chai champagne” thì chủng đó được ghi nhận là mang kiểu hình ESBL [85].

Nút chai champagne

Hình 2.5. Thử nghiệm đĩa đôi

2.2.2.6 Thử nghiệm Hodge test

a. Mục đích

Sàng lọc Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase, xác định một chủng là

nhạy cảm hoặc kháng với kháng sinh nhóm carbapenems.

b. Thực hiện

- Thử nghiệm Hodge test: Sử dụng khoanh giấy khuếch tán với các kháng sinh

nhóm carbapenems. Cách tiến hành như sau [39]:

- Chuẩn bị huyền dịch E.coli ATCC 25922 có độ đục 0,5 McFarland.

- Trải đều huyền dịch này trên đĩa thạch Mueller-Hinton.

- Để một đĩa kháng meropenem hoặc ertapenem ở trung tâm của vùng đĩa thạch

MH thử nghiệm.

- Dùng que cấy cấy một đường thẳng khuẩn lạc chủng Klebsiella pneumoniae

ATCC 1705 chủng control (+) từ một mép của đĩa kháng sinh đến mép góc của đĩa

thạch. Tương tự như vậy cấy tiếp 4 đường thẳng của 4 chủng Klebsiella pneumoniae

cần thử nghiệm trên cùng đĩa MH đó.

- Lật ngược các đĩa thạch và ủ ấm ở 35 ± 20C trong vòng 16-24 giờ.

c. Kết quả

- Sau khi ủ tăng sinh trên MH, khảo sát sự tăng sinh (biểu hiện bằng các khuẩn

lạc tạo hình lan quạt do sự tăng sinh tại vùng giao thoa giữa vệt cấy và chu vi vùng ức

chế của chủng chỉ định E. coli ATCC 25922).

+ Chủng sản xuất carbapenemase (dương tính): biểu hiện sự tăng sinh.

E.coli ATCC25922

K. pneumoniae (+)

K. pneumoniae (-)

K. pneumoniae control (+)

+ Chủng không sản xuất carbapenemase (âm tính): không biểu hiện sự tăng sinh.

Hình 2.6. Thử nghiệm Hodge test

Chủng dương tính (sản xuất carbapenemase): số 615

Các chủng âm tính (không sản xuất Carbapenemase): số 721, 824,189, 912

2.2.2.7. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng kháng sinh

a. Mục đích

Phát hiện kiểu gen kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella pneumoniae thử

nghiệm [9].

b. Nguyên tắc PCR- Polymerase Chain Reaction

Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ

mạch khuôn đều cần có sự hiện diện của những mồi riêng biệt. Mồi là những đoạn

ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và ADN sẽ nối

dài mồi để hình thành mạch mới. PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các ADN polymerase [9].

Bảng 2.2. Các đoạn mồi dùng trong PCR phát hiện gen kháng kháng sinh

Kích thước Mã hóa gen kháng STT Tên primer Trình tự mồi (5’-3’) (bp) kháng sinh

CMY-2-F CTA TGG CGT GAA ATC CAG Cephalosporin 336 bp 1 [44] [55] [82] [81] CMY-2-R TTG TTT GCC AGC ATC ACG

Cephalosporin blaOXA-1-F TTTTCTGTTGTTTGGGTTTT phổ rộng 2 427 bp

[48] [50] [59] blaOXA-1-R TTTCTTGGCTTTTATGCTTG

Carbapenem blaNDM-1-F GGTTTGGCGATCTGGTTTTC 621 bp 3 [54] [66] blaNDM-1-R CGGAATGGCTCATCACGATC

Carbapenem blaIMP-F CATGGTTTGGTGGTTCTTGT 448-bp 4 [29] [31] [80] blaIMP-R ATAATTTGGCGGACTTTGGC

c. Thực hiện

- Tiến hành phản ứng

Tách chiết ADN từ chủng vi khuẩn bằng phương pháp nhiệt + Chủng được lấy ra từ tủ -200C, được cấy lên đĩa TSA ủ ở điều kiện

35±20C/24h.

+ Cho 1ml TE (Tris-EDTA) vào ống eppendorf có ghi nhãn.

+ Lấy 4-5 khuẩn lạc mọc trên môi trường TSA sau 24 – 48h bằng tăm bông vô

trùng hòa vào dung dịch TE trên, vortex dung dịch huyền phù vi khuẩn đạt độ đục 3,0

McFarland.

+ Đặt eppendorf chứa dịch huyền phù vi khuẩn vào máy ủ lắc nhiệt Thermo-

Shaker TS 100 (1000C trong 10 phút).

+ Ly tâm 10.000 vòng/2 phút lấy dịch nổi có chứa khuôn mẫu ADN.

+ Cho dịch nổi có chứa khuôn mẫu ADN vào các eppendorf được lưu trữ ở nhiệt độ -200C để tiến hành đặt phản ứng PCR. Chú ý tránh gây nhiễm ADN từ khu vực này

sang khu vực khác.

Pha primer

+ Primer dạng bột khô được cộng thêm 1 lượng TE 1x phù hợp, để đạt nồng độ

100µM ( theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

+ Nồng độ mồi trong PCR là 25µM: hút 25µl primer 100µM + 75 µl H2O không

RNase thu được primer có nồng độ 25µM.

Mồi sau khi pha được bảo quản trong tủ 200C để tiến hành cho phản ứng PCR

Đặt hỗn hợp cho 1 phản ứng PCR

+ Dùng Micropipette hút các hóa chất với tỷ lệ như bảng 2.3 cho vào các eppendorf

0,2 ml ở 1 tủ vô trùng sạch.

Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR

Thành phần phản ứng 1 mẫu (µl) Nồng độ cuối

Dung dịch Master-Mix buffer 2X 10 (MgCl2 15 µM)

dNTP 10 µM mỗi loại 200 µl mỗi loại dNTP 2

Taq Polymerase 1,25 unit/ phản ứng 0,5

0,5 Primer 1 0,25 µM

0,5 Primer 2 0,25 µM

Nước + Coral Loading đã loại 6,5 2X Polymerase

20 Tổng số: -

+ Cho 5µl ADN đã tách chiết

+ Vortex kỹ và đặt vào máy PCR.

Phản ứng PCR

+ Cài đặt chu trình nhiệt trên máy PCR sao cho phù hợp với mồi như bảng 2.4

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt cho từng gen mục tiêu

Giai đoạn Tên primer

CMY-2 blaOXA-1 blaNDM-1 blaIMP

95°C/10phút 95°C/6phút 95°C/5phút 95°C/7phút Tiền biến tính

95°C/45giây 94°C/45giây 95°C/40giây 95°C/40giây Biến tính

53°C/30giây 54°C/30giây 52°C/35giây 53°C/30giây Bắt cặp

72°C/45giây 72°C/45giây 72°C/45giây 72°C/40giây Kéo dài

72°C /7 phút 72°C /5 phút 72°C/4phút 72°C/7 phút Kết thúc

35 35 35 35 Số chu kỳ

30 phút 30 phút 45 phút 40 phút Thời gian điện di

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bước

[9]:

 Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các

thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94-950C trong vòng 30 giây - 1 phút.

 Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho

phép các mồi bắt cặp vào khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 giây - 1 phút.  Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation): Nhiệt độ tăng lên 720C giúp cho

ADN polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài trình tự

ADN cần khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút.

Một chu trình gồm ba bước trên được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại tăng

gấp đôi lượng ADN của lần trước.

Điện di sản phẩm PCR

Thực hiện điện di

- Chuẩn bị gel agarose 1,5%:

- Cân 0,6 g agarose cho vào 40 ml dung dịch TBE 0,5X, lắc đều và đun hòa tan

agarose bằng lò vi sóng.

- Để dung dịch đó nguội khoảng 70°C, thêm 0,2 µl ethidiumbromide vào 40 ml

gel, đổ khuôn tạo gel.

- Nạp mẫu:

+ Đặt bản gel vào buồng điện di có dung dịch đệm TBE 0,5X.

+ Cho 2 µl thang ADN chuẩn 100 bp, các sản phẩm PCR vào các giếng thạch.

- Điện di: Chạy điện di sản phẩm PCR ở hiệu điện thế 100V trong vòng 30 phút

hoặc 45 phút.

Đọc kết quả nhờ hệ thống chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ).

- Sản phẩm PCR sau khi điện di được đọc kết quả bằng máy chụp gel (GelDOc-

It2 – Mỹ).

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Đặc tính mẫu

Trong thời gian từ 01- 06/2014 chúng tôi phân lập được 35 chủng Klebsiella từ

680 mẫu bệnh phẩm. Tất cả các chủng Klebsiella phát hiện được là loài Klebsiella

pneumonia.

3.1.1. Đặc tính về giới tính của bệnh nhân

Từ 680 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu, chúng tôi phân lập được 35 chủng Klebsiella

pneumoniae có 26 chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được từ bệnh nhân nam và 9

chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được từ bệnh nhân nữ.

Bảng 3.1. Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo giới tính

Số lượng Số lượng mẫu Tỉ lệ mẫu phân lập Tỉ lệ phân bố theo

mẫu bệnh bệnh phẩm được K. pneumoniae giới trên tổng mẫu

phân lập được phẩm trên tổng số mẫu phân lập được K. Giới

nghiên cứu nghiên cứu (%) pneumoniae (%) K. pneumoniae

349 26 7,45 74,29 Nam

331 9 2,72 25,71 Nữ

680 35 10,17 100 Tổng

Trong 35 mẫu bệnh phẩm phân lập được Klebsiella pneumoniae, tỉ lệ bệnh phẩm

phân lập được K. pneumoniae từ bệnh nhân nam chiếm 74,29% cao hơn gần gấp 3 lần

so với tỉ lệ bệnh nhân nữ chiếm 25,71%. Kết quả của chúng tôi cao hơn kết quả nghiên

cứu của tác giả Ngô Thế Hoàng, Quế Lan Hương tại bệnh viện Thống Nhất TP. HCM

(57% nam bị nhiễm K. pneumoniae) [12].

Trong 680 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu thì tỉ lệ mẫu bệnh phẩm nghiên cứu gần

tương đương nhau giữa nam và nữ, cụ thể là 349 nam : 331 nữ. Tuy vậy, tỉ lệ bệnh

phẩm phân lập được K. pneumoniae trên tổng số bệnh phẩm nghiên cứu ở nam và nữ

lần lượt là 7,45% và 2,72%; tức là 3 bệnh phẩm nam : 1 bệnh phẩm nữ. Điều này chỉ

phản ánh đặc điểm bệnh nhân.

3.1.2. Đặc tính về tuổi bệnh nhân

Về tuổi bệnh nhân chúng tôi ghi nhận được kết quả sau

Bảng 3.2. Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo độ tuổi

Tỉ lệ bệnh phẩm

phân lập được

Số lượng mẫu Số lượng Tỉ lệ mẫu Tỉ lệ mẫu K.pneumoniae Tuổi

trên tổng số bệnh phẩm mẫu bệnh bệnh bệnh phẩm bệnh

bệnh phẩm phân lập được phẩm phẩm phân lập được nhân

nghiên cứu theo nghiên cứu nghiên K.pneumoniae K.pneumoniae

(%) từng độ tuổi (%) cứu (%)

2 92 13,53 5,71 2,17 0-15

4 100 14,70 11,43 4 16-30

8 181 26,62 22,86 4,42 31-45

11 154 22,65 31,43 46-60 7,14

6 91 13,38 17,14 61-75 6,59

4 62 9,12 11,43 75+ 6,45

35 680 100 100 Tổng

Từ bảng 3.2 cho thấy tỉ lệ mẫu bệnh phẩm nghiên cứu không đồng đều ở các lứa

tuổi khác nhau. Dẫn đến tỉ lệ mẫu bệnh phẩm phân lập được K.pneumoniae sẽ khác

nhau ở các lứa tuổi. Do đó, chưa thể có đủ căn cứ để kết luận được khả năng phân lập

được K. pneumoniae ở lứa tuổi nào là nhiều hay ít nhất. Vì thế tôi tính đại lượng tỉ lệ

bệnh phẩm phân lập được K. pneumoniae trên tổng số bệnh phẩm nghiên cứu theo

từng độ tuổi thu được kết quả như sau: ở nhóm tuổi từ 0 đến 45 tuổi thì tỉ lệ nhiễm

dưới 4,5%; từ độ tuổi 46 trở lên tỉ nhiễm cao hơn 6%. Điều này cho thấy cho thấy

bệnh nhân càng lớn tuổi thì suy giảm hệ thống miễn dịchsức đề kháng càng yếu và

nguy cơ bị nhiễm K. pneumoniae càng cao.

3.2. Sự phân bố vi khuẩn Klebsiella pneumoniae trong các loại bệnh phẩm

Bảng 3.3. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae phân lập từ các loại bệnh phẩm

Tỉ lệ bệnh phẩm phân lập

Số lượng Số lượng mẫu Tỉ lệ mẫu bệnh được K. pneumoniae trên

mẫu bệnh bệnh phẩm phẩm phân lập tổng số bệnh phẩm Loại bệnh

phẩm phân lập được được nghiên cứu theo từng loại phẩm

bệnh phẩm (%) nghiên cứu K. pneumoniae K. pneumoniae

(n=35) (%)

130 12 34,29 9,23 Đàm

162 12 34,29 7,41 Mủ

72 2 5,71 2,78 Máu

54 0 0 0 Dịch não

tủy

262 9 25,71 3,44 Nước tiểu

680 35 100 Tổng cộng

Trong 24 chủng phân lập được từ bệnh phẩm đàm và mủ, mỗi loại bệnh phẩm

chiếm 34,29%, bệnh phẩm nước tiểu phân lập được 9 chủng chiếm 25,71%, bệnh

phẩm máu phân lập được 2 chủng chiếm 5,71%. Còn ở dịch não tủy không tìm thấy

tác nhân gây bệnh là Klebsiella pneumoniae.

Bên cạnh đó, trong 130 mẫu đàm, 162 mẫu mủ, 72 mẫu máu, 54 mẫu dịch não

tủy và 262 mẫu nước tiểu nghiên cứu thì số mẫu phân lập được vi khuẩn này lần lượt

là 12, 12, 2, 0, 9 mẫu chiếm tỉ lệ lần lượt là 9,23%, 7,41%, 2,78%, 0%, 3,44%. Điều

này cho thấy, ở nghiên cứu của chúng tôi, Klebsiella pneumoniae phân lập được chủ

yếu từ các bệnh phẩm đàm và mủ. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Sĩ

Tuấn ở bệnh viện Đa Khoa Thống Nhất Đồng Nai từ tháng 12/2012-5/2013 [22].

Chứng tỏ Klebsiella pneumoniae là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra

viêm phổi, nhiễm trùng bệnh viện.

3.3. Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae

Tiến hành làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer, thu thập và tổng

hợp kết quả kháng sinh đồ (phụ lục 5) chúng tôi thu nhận được kết quả theo bảng sau:

Bảng 3.4. Tính nhạy cảm kháng sinh của Klebsiella pneumoniae

S I R

Kháng sinh N Tần Tần Tần Tỉ lệ (%) Tỉ lệ (%) Tỉ lệ (%) số số số

Ampicillin 35 1 2,86 1 2,86 33 94,29

Piperacillin 35 11 31,42 2 5,72 22 62,86

Mecillinam 35 19 54,28 3 8,58 13 37,14

Amoxicillin/ 34 18 52,94 14,71 5 11 32,35 clavulanate

Cephalexine 35 11 31,42 2 5,72 22 62,86

Ceftazidime 35 15 42,85 2 5,72 18 51,43

Imipenem 35 34 97,14 0 0 1 2,86

Meropenem 35 33 94,28 1 2,86 1 2,86

Amikacin 35 27 77,14 1 2,86 7 20,00

Netilmicin 35 27 77,14 0 0 8 22,86

Gentamicin 35 24 68,57 1 2,86 10 28,57

Ciprofloxacin 35 18 51,42 2 5,72 15 42,86

Colistin 35 34 97,14 0 0 1 2,86

Tetracyclin 35 20 57,14 1 2,86 14 40,00

Nitrofurantoin 35 18 51,43 1 2,86 16 45,71

Trimethoprim/ 29 1 3,45 23 79,31 5 17,24 sulfamethoxazol

Từ bảng kết quả kháng sinh đồ trên biểu diễn thành biểu đồ về mức độ kháng

kháng sinh của Klebsiella pneumoniae như sau

Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae

AM: Ampiciline 10µg, AMC: Amoxicillin/clavulanic acid 20/10µg, AN:

Amikacin 10µg, CAZ: Ceftazidime 30µg, CIP: Ciprofloxacin 5µg, CN: Cephalexine

30µg, CS: Colistin 50µg, FT: Nitrofurantoin 300µg , GM: Gentamicin10µg, MEC:

Micillinam 10µg, NET: Netilmicine 30µg, PIP: Piperacillin 75µg, SXT:

Trimethoprim/ sulfamethoxazol 1,25/23,75µg, TE: Tetracycline 30µg, IMP: Imipenem

10µg, MEM: Meropenem 10µg.

Phân tích kết quả kháng kháng sinh của 35 chủng thực hiện kháng sinh đồ cho

thấy Klebsiella pneumoniae có mức đề kháng với hầu hết các kháng sinh. Trong 14

kháng sinh được thực hiện thì Klebsiella pneumoniae kháng 8 loại kháng sinh ở mức

trên 40%. Trong đó Klebsiella pneumoniae đề kháng cao nhất với AM (94,29%), tiếp

đó là SXT (79,31%), CN, PIP (62,86%); CAZ (51,43%); FT (45,71%); CIP (42,86%);

TE (40%); MEC (37,14%); AMC (32,35%); GM (28,57%); NET (22,86%); AN

(20%); và cuối cùng tỉ lệ kháng với CS, IPM, MEM thấp nhất (2,86%).

Bảng 3.5. So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh với các nghiên cứu trước

Tỉ lệ kháng kháng sinh (%)

Tác giả Số AM AMC CN, IMP, NET, CIP TE

mẫu CAZ MEM AN, GM

Sevil Toroglu, n=22 95 82 MEM GM (46) - 59

(9) Dilek Keskin

2006-2007 [78]

Adnan Amin, Pir n=40 - 12,5 75 IMP, - 55 -

MEM Baksh Ghumro,

Shagufta Hussain (7,5)

2008 [26]

IMP Phạm Hùng Vân n= 304 98 39 45 30 53 64

(3,2) 5/2008 đến

MEM 11/2009 [24]

(1.2)

Ngô Thế Hoàng, n=42 95 44,5 54,8 IMP AN(52,4) 61,2 -

Quế Lan Hương (21) NET(47,5)

2012 [12]

Nghiên cứu này n=35 94,3 32,35 CN IMP, NET 42,86 40

1-6/2014 (62,86); MEM (22,86);

CAZ (2,68) AN (20);

(51,43) GM

(28,57)

Trong nghiên cứu của chúng tôi, ampicilline không còn tác dụng đối Klebsiella

pneumoniae với tỉ lệ kháng tới 94,29%. Tuy nhiên đối với các kháng sinh thuộc nhóm

penicillin có bổ sung thêm chất ức chế β – lactamase thì tỉ lệ kháng thấp hơn (tỉ lệ đề

kháng AMC 32,35%). Đối với kháng sinh nhóm cephalosporins thì tỉ lệ kháng cũng

khá cao >50%, tỉ lệ kháng CN: 62,86%, CAZ: 51,43%. Với kháng sinh thuộc nhóm

fluoroquinolones có tỉ lệ kháng CIP: 42,86%, còn tỉ lệ kháng với các kháng sinh thuộc

nhóm aminoglycosides lần lượt là AN: 20%, NET: 22,86%, GM: 28,57%. Tỉ lệ nhạy

cao nhất là colistin, imipenem, meropenem với tỉ lệ 97,14%. Khi so sánh kết quả của

chúng tôi với một số tác giả trong và ngoài nước khác nhận thấy có sự tương đồng với

nghiên cứu của Ngô Thế Hoàng [12], Phạm Hùng Vân [24].

Ngoài ra, từ số liệu dưới đây còn cho biết tỷ lệ đa kháng kháng sinh của

Klebsiella pneumoniae tương đối cao.

Bảng 3.6. Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae

Số kháng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

sinh

Số trường 0 4 2 2 3 4 3 1 3 2 1 3 2 0

hợp

Tỷ lệ K. 0 11,4 5,7 5,7 8,6 11,4 8,6 2,9 8,6 5,7 2,9 8,6 5,7 0,0

pneumoniae

kháng kháng

sinh (%)

Trong 35 chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được có 35/35 chủng (chiếm

74.28%) kháng với 2 loại kháng sinh trở lên (từ 2 tới 13 loại kháng sinh), trong đó tỷ

lệ kháng với 2 và 6 loại kháng sinh là cao nhất với 4/35 chủng (chiếm 11,4%/1 loại

kháng sinh). Điều này cho thấy sự đa kháng kháng sinh đang diễn ra phức tạp. Một

báo động lớn cho con người đang phải đối mặt với tình trạng Klebsiella pneumoniae

kháng hết các loại kháng sinh đang sử dụng, không còn thuốc để chữa. Do đó, khi sử

dụng kháng sinh cần cẩn thận, nghiên cứu kĩ để lựa chọn kháng sinh phù hợp nhất

tránh hiện tượng không còn thuốc để chữa.

3.4. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng

Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng

Từ 35 chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được trong 680 mẫu bệnh phẩm,

chúng tôi thực hiện sàng lọc nhanh các chủng Klebsiella pneumoniae sinh ESBL, có

23 chủng sản xuất ESBL chiếm 65,71% (Biểu đồ 3.3) (phụ lục 6).

Khi so sánh với các nghiên cứu khác tôi nhận thấy tỉ lệ này tương đồng với

nghiên cứu của một số tác giả dưới đây (bảng 3.7).

Bảng 3.7. Kết quả của một số nghiên cứu về Klebsiella pneumoniae sinh ESBL

Nghiên cứu Số mẫu Tỉ lệ sinh ESBL(%)

Ankur Goyal, Amit Prasad, 2006 [30] n=57 66.7

Fatemeh Ashrafian, Emran Askari, 2008 [43] n=128 43

Phạm Hùng Vân, 2007-2008 [24] n=346 66

Bùi Thị Mùi 2009-2010 [15] n=267 56,9

Nguyễn Thanh Hiền, 2010 [11] n=35 65,7

Nghiên cứu của chúng tôi, 2014 n=35 65,71

Với phương pháp thử nghiệm sàng lọc đĩa đôi thì kết quả nghiên cứu của chúng

tôi thu được tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL là khá cao chiếm 65,71%. Điều này chứng tỏ

việc lạm dụng các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporins thế hệ thứ ba là một trong

những lí do lảm xuất hiện nhiều chủng Klebsiella pneumoniae có khả năng sinh β-

lactamase phổ rộng.

Bảng 3.8. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL theo mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm Số mẫu khảo ESBL dương (n=23) ESBL âm (n=12)

sát (n=35) Tần số Tỉ lệ (%) Tần số Tỉ lệ (%)

Đàm 12 7 30,43 5 41,67

Mủ 12 10 43,48 2 16,66

Máu 2 2 8,7 0 0

Dịch não tủy 0 0 0 0 0

Nước tiểu 9 4 17,39 5 41,67

Tổng cộng 35 23 100 12 100

Từ bảng 3.8 cũng ta thấy được Klebsiella pneumoniae sinh ESBL nhiều nhất từ

bệnh phẩm mủ chiếm 43,48%, tiếp đó là bệnh phẩm đàm chiếm 30,43%. Điều này

được giải thích là do Klebsiella pneumoniae được phân lập chủ yếu từ nguồn bệnh

phẩm đàm và mủ. Bên cạnh đó, từ 2 mẫu được khảo sát từ bệnh phẩm máu đã có hết 2

chủng Klebsiella pneumoniae sinh ESBL. Vì vậy, với lượng mẫu nghiên cứu còn hạn

chế nên từ kết quả này chưa thể kết luận được tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL

phụ thuộc vào loại bệnh phẩm.

Kết quả tỉ lệ kháng kháng sinh của nhóm vi khuẩn sinh ESBL và không sinh

ESBL

Bảng 3.9. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL kháng với các kháng sinh

ESBL dương (n=23) ESBL âm (n=12)

Loại kháng sinh Tỉ lệ kháng Tỉ lệ kháng Tần số Tần số kháng sinh (%) kháng sinh (%)

11 Ampicillin 22 91,67 95,65

Piperacillin 18 33,33 4 78,26

Mecillinam 9 8,33 1 39,13

Amoxicillin/ 9 8,33 1 39,13

clavulanate

Cephalexine 18 33,33 4 78,26

Ceftazidime 14 33,33 4 60,87

Imipenem 1 0 0 4,35

Meropenem 1 0 0 4,35

Amikacin 6 8,33 1 20,09

Netilmicin 6 16,66 2 20,09

Gentamicin 10 8,33 1 43,48

Ciprofloxacin 12 33,33 4 52,17

Colistin 1 0 0 4,35

Tetracyclin 14 8,33 1 60,87

52,14 5 41,67 Nitrofurantoin 12

69,57 7 58,33 Trimethoprim/ 16

sulfamethoxazol

Từ bảng 3.9 chúng tôi có tỉ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae sinh

ESBL như sau:

+ Kháng kháng sinh thuộc nhóm penicillins: 39,1395,65%

+ Phối hợp ß- lactam/ chất ức chế ß- lactamase: 39,13%

+ Cephalosporin: 60,8778,26%

+ Carbapenems: 4,35%

+ Aminoglycosides: 20,0943,48%

+ Fluoroquinolones: 52,17%

+ Tetracycline: 60,87%

+ Kháng SXT: 69,57%

Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy: Klebsiella pneumoniae sinh ESBL có khả năng đề

kháng nhiều loại kháng sinh với tỉ lệ kháng cao hơn so với Klebsiella pneumoniae

không sinh ESBL, đặc biệt kháng với penicillins, cephalosporin kể cả cephalosporin

thế hệ thứ ba (CAZ: 60,87%). Vì ESBL là một trong những cơ chế quan trọng nhất

gây kháng với kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam kể cả cephalosporin thế hệ thứ ba

nên Klebsiella pneumoniae sinh ESBL có khả năng phân giải được cephalosporin thế

hệ thứ ba. Bên cạnh đó, Klebsiella pneumoniae sinh ESBL còn kháng được với các

kháng sinh thuộc các nhóm khác ở mức cao trên 50% như fluoroquinolones,

tetracycline.... Đây là một vấn đề cần được quan tâm và làm rõ cơ chế vì vi khuẩn tiết

ESBL có nguy cơ lan truyền tính kháng thuốc cũng rất cao.

Tuy nhiên, ESBL cũng bị ức chế bởi acid clavulanic nên tỉ lệ kháng của

Klebsiella pneumoniae sinh ESBL với kháng sinh phối hợp ß- lactam/ chất ức chế ß-

lactamase lại thấp (AMC: 39,13%). Ngoài ra, ở nghiên cứu này chúng tôi còn thu được

kết quả: đa số các chủng Klebsiella pneumoniae sinh ESBL vẫn nhạy với carbapenem

còn có một tỉ lệ nhỏ số chủng Klebsiella pneumoniae sinh ESBL kháng được

carbapenem chiếm 4,35%. Điều này là do áp lực chọn lọc thuốc nên vi khuẩn này bị

mất hay thay đổi kênh porin thì có nguy cơ dẫn đến kháng carbapenem. Qua đó chứng

tỏ khả năng vi khuẩn sinh ESBL cũng góp phần vào cơ chế kháng carbapenem. Vì vậy, việc xác định kiểu hình Klebsiella pneumoniae sinh ESBL vô cùng quan trọng

trong trị liệu.

3.5. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase

Bảng 3.10. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase

Tần số (n=35) Tỉ lệ (%) Hodge test

Carbapenemase + 7 20

Carbapenemase - 28 80

Tổng cộng 35 100

Kết quả ở bảng 3.10; phụ lục 7 cho thấy trong 35 chủng Klebsiella pneumoniae

đã phân lập được 7 chủng sinh carbapenemase. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh

carbapenemase là 20% của số chủng khảo sát.

Theo nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và nhóm nghiên cứu MIDAS tỉ lệ kháng

IMP là 3,2%; MEM là 1,2%) [25]. Tỉ lệ này tương đồng với kết quả từ kháng sinh đồ

của chúng tôi thu được tỉ lệ Klebsiella pneumoniae kháng IMP; MEM là 2,86%. Tuy

nhiên kết quả Hodge test ở nghiên cứu của chúng tôi thu nhận được tỉ lệ Klebsiella

pneumoniae sinh carbapenemase là 20%. Vậy có 17,14% số chủng Klebsiella

pneumoniae sinh carbapenemase cho kết quả nhạy với kháng sinh đồ. Điều này cho

thấy rằng nếu chỉ dựa trên kết quả của kháng sinh đồ để điều trị cho bệnh nhân bị

nhiễm Klebsiella pneumoniae bằng các kháng sinh thuộc nhóm carbapenem có thể dẫn

đến thất bại. Với kết quả nghiên cứu này cũng đã báo động cho các bác sĩ nên lựa chọn

kháng sinh phù hợp cho từng bệnh nhân để tránh tình trạng đa kháng thuốc.

Bảng 3.11. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase theo mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm Số mẫu khảo sát (n=35) Tần số Tỉ lệ (%)

Đàm 12 4 57,14

Mủ 12 3 42,86

Máu 2 0 0

Dịch não tủy 0 0 0

9 Nước tiểu 0 0

35 Tổng cộng 7 100

Từ bảng 3.11 cho thấy Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase nhiều nhất từ

bệnh phẩm đàm chiếm 57,14%, tiếp đó là bệnh phẩm mủ chiếm 42,86% còn các bệnh

phẩm còn lại không có. Với lượng mẫu nghiên cứu không đồng đều trên mỗi loại bệnh

phẩm và một số loại bệnh phẩm còn có số lượng hạn chế (0 mẫu dịch não tủy, 2 mẫu

máu) nên từ kết quả này chưa thể kết luận được tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh

carbapenemase phụ thuộc vào loại bệnh phẩm.

3.6. Kết quả PCR

Hiện nay, ở Việt Nam nói chung và TP. HCM nói riêng những nghiên cứu về

tình hình kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae còn hạn chế. Do đó, chúng tôi

tiến hành PCR 35 chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được để xác định tỉ lệ các

chủng mang các gen đó.

Klebsiella pneumoniae có mang gen mã hóa cho kiểu hình kháng kháng sinh, đặc

biệt là những gen mã hóa cho các enzyme phân giải các kháng sinh thuộc nhóm β-

lactam. Chúng tôi đã chọn 4 gen mục tiêu mã hóa cho enzyme phân giải vòng β-lactam

là CMY-2, blaOXA-1, blaNDM-1, blaIMP với các lí do sau: do chúng đang được nghiên

cứu nhiều trên thế giới. Bên cạnh đó, một trong những gen này còn mã hóa cho những

enzyme phân hủy những thế hệ kháng sinh mạnh nhất được xem là “vũ khí cuối cùng”,

có khả năng lan truyền khả năng kháng thuốc nhanh.

Với 4 gen mục tiêu đã chọn: CMY-2, blaOXA-1 mã hóa cho các enzyme thuộc lớp

C, D phân giải kháng sinh nhóm cephalosporin; blaNDM-1, blaIMP mã hóa enzyme lớp

MBL kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem. Kết quả thu được: gen CMY-2 được

phát hiện ở 27 chủng chiếm 77,14%; gen blaOXA-1 được phát hiện ở 11 chủng chiếm

31,43%; gen blaNDM-1 phát hiện ở 7 chủng chiếm 20,00%; còn gen blaIMP phát hiện 1

chủng chiếm 2,86% số chủng khảo sát (phụ lục 8).

Bảng 3.12. Kết quả PCR phát hiện 4 gen kháng kháng sinh

Kích thước của gen Số mẫu khảo Tần số Tỉ lệ (%)

Gen mục tiêu (bp) sát (n=35)

336 bp 35 27 77,14 CMY-2

427 bp 35 11 31,43 blaOXA-1

621 bp 35 7 20,00 blaNDM-1

448-bp 35 1 2,86 blaIMP

3.6.1. Gen CMY-2

Dựa vào nghiên cứu của Kyungwon Lee, Miae Lee, Jong Hee Shin, Myung Hee

Lee và cộng sự [55]; Ferran Navarro, Emilio Perez-Trallero và cộng sự [44]; Supoj

Singtohin, Aroonwadee Chanawong và cộng sự [82] và các tác giả khác, chúng tôi

chọn primer cho việc PCR gen CMY-2. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể mã hóa

enzyme AmpC-một dạng β-lactamase thuộc lớp C có đặc trưng đề kháng với

cephalosporins. Khi chúng tôi tiến hành PCR và điện di thu được kết quả hình 3.4 với

những vạch sản phẩm PCR ứng với mức thang 336bp trên thang chuẩn trong bảng gel.

Với đoạn mồi đã chọn khuếch đại đoạn gen CMY-2 có chiều dài 336 bp trên khuôn

ADN của K. pneumoniae. Theo nghiên cứu của chúng tôi thu được: trong 35 chủng

khảo sát có 27 chủng mang gen CMY-2 chiếm 77,14% số chủng khảo sát.

600bp 336bp

600bp

336bp 300bp

Hình 3.1. Kết quả PCR gen CMY-2 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)

Bảng 3.13. Kết quả điện di gen CMY-2

Mã STT PCR gen CMY-2 KSĐ CN KSĐ CAZ PXN

1 278 S S +

2 661 R R +

3 776 R I -

4 815 R R +

5 1 R R +

6 78 I S +

7 400 R R -

R - S 796 8

S - S 309 9

S + S 334 10

S + S 391 11

S + S 24 12

R + R 268 13

S - S 363 14

I + S 364 15

S + S 452 16

R - R 508 17

R + R 510 18

R + R 521 19

R + R 675 20

R + I 721 21

R + R 824 22

S + S 189 23

R + S 982 24

R + R 19 25

R + R 80 26

S + S 513 27

S + S 784 28

R + R 637 29

R + R 812 30

R + R 14 31

R - R 130 32

S + S 208 33

R - R 217 34

R + R 274 35

Đối chiếu với kết quả kháng sinh đồ của 35 chủng được khảo sát kháng hầu hết

các kháng sinh, đặc biệt với các kháng sinh nhóm β-lactam như penicillins và

cephalosporins trong kháng sinh đồ là AM: 94,29%; PIP: 62,86%;CN: 62,86%; CAZ:

51,43%.

Ở 27 chủng mang gen CMY-2 có16 chủng mang kiểu gen phù hợp với kiểu hình

kháng cephalosporins, còn 11 chủng mang gen CMY-2 nhưng cho kết quả nhạy với

kháng sinh đồ. Điều này chứng tỏ Klebsiella pneumoniae mang gen nhưng chưa biểu

hiện ra kiểu hình. Bên cạnh CMY-2 thì còn nhiều gen khác kháng β-lactam. Qua đó

cho chúng ta lời khuyên về việc cần cận thận khi sử dụng kháng sinh. Nếu chỉ dựa trên

kết quả của kháng sinh đồ để điều trị cho bệnh nhân bị nhiễm Klebsiella pneumoniae

bằng các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporins có thể dẫn đến thất bại. Do đó, chúng

ta cần đi sâu để tìm tiếp những gen khác có cùng cơ chế kháng β-lactam.

3.6.2. Gen blaOXA -1

Gen blaOXA-1 đã được tìm thấy trong các plasmid và integron ở các vi khuẩn

Gram âm. Gen blaOXA-1 mã hóa β-lactamase phổ rộng (ESBL) thuộc lớp D β-

lactamase, thủy phân ampicillin, penicillin, piperacillin và cephalosporin phổ hẹp, phổ

rộng.

Khi tiến hành tra cứu trên NCBI với chương trình blast nucleotic và primer blast

và báo cáo nghiên cứu của Madhan Sugumar và cộng sự [59]; Karmele Colom, Javier

Perez và cộng sự [50]; Jan M. Bell, John D. Turnidge, Patiyan Andersson [48] và

nhiều tác giả khác trên thế giới: cho thấy primer đã chọn bắt cặp và khuếch đại đoạn

gen blaOXA-1 có kích thước 427 bp ở nhiều chủng Klebsiella pneumoniae. PCR và điện

di 35 chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được thu được kết quả như hình 3.5 ứng

với những vạch sản phẩm sáng màu ứng với mức thang 427 bp ở thang chuẩn trên

bảng gel. Kết quả thu được có sự hiện diện của gen blaOXA-1 ở 11 chủng, chiếm 31,43

% số chủng khảo sát.

600bp

427bp

600bp 427bp

600bp

427bp

Hình 3.2. Kết quả PCR gen blaOXA-1 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)

Bảng 3.14. Kết quả điện di gen blaOXA- 1

Mã PCR gen KSĐ KSĐ KSĐ ESBL KSĐ STT PXN PIP CN CAZ MEC blaOXA-1

S S S S - - 278 1

S R R R + - 661 2

I R R I + + 776 3

R R R R + - 815 4

S R R R + - 1 5

S R I S + - 78 6

R R R R + + 400 7

R R R S + - 796 8

S I S S + - 309 9

R S S S - - 334 10

S S S S + - 391 11

S S S S + - 24 12

R R R R + + 268 13

S S S S - - 363 14

S S I S - - 364 15

S S S S + - 452 16

S R R R + + 508 17

R R R R + - 510 18

S R R R + + 521 19

R R R R + + 675 20

S R R I + + 721 21

S R R R + + 824 22

S S S S - - 189 23

S R R S + - 982 24

R R R R - - 19 25

R R R R + + 80 26

R S S S - - 513 27

I S S S - - 784 28

R R R R - - 637 29

30 812 - R R R R -

31 14 - S I R R +

32 130 + S R R R +

33 208 - S S S S -

34 217 + R R R R +

35 274 - I R R R -

Đối chiếu với kết quả kháng sinh đồ của 35 chủng được khảo sát kháng hầu hết

các kháng sinh, đặc biệt với các kháng sinh nhóm penicillins và cephalosporins trong

kháng sinh đồ là AM: 94,29%; PIP: 62,86%; MEC: 37,14%; CN: 62,86%; CAZ:

51,43%. Hơn nữa 11 chủng phát hiện gen blaOXA-1 bằng PCR có sự phù hợp với kiểu

hình kháng kháng sinh trên kháng sinh đồ và thử nghiệm phát hiện ESBL. Điều này

khẳng định phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình.

3.6.3. Gen blaNDM-1

Các enzyme thuộc lớp B metallo-β-lactamase (MBLs) khác với các

carbapenemase thuộc lớp khác bằng việc sử dụng kẽm tại vị trí hoạt động để tạo điều

kiện thủy phân kháng sinh. Gần đây, các MBLs phổ biến nhất trên toàn thế giới tìm

thấy ở Enterobacteriaceae là VIMS (Verona integron mã hóa MBLs) và IMP. Năm

2008, MBL New Delhi (NDM) được mô tả. NDM lần đầu tiên được ghi nhận trong

một K. pneumoniae phân lập từ một bệnh nhân người Thụy Điển đã nhận được chăm

sóc y tế ở Ấn Độ [89] và sau đó cũng được phát hiện ở Vương quốc Anh [35].

Theo nghiên cứu của Patrice Nordmann, Laurent Poirel và cộng sự [66];

Kumarasamy Karthikeyan, Padma Krishnan [54] và nhiều báo cáo nghiên cứu khác

chúng tôi chọn primer cho việc PCR gen NDM mã hóa carbapenemase thuộc lớp B

metallo-β-lactamases không những chỉ kháng lại kháng sinh cephalosporin mà còn với

carbapenems. Chúng tôi tiến hành PCR và điện di thu được kết quả hình 3.6 với những

vạch sản phẩm PCR ứng với mức thang 621 bp trên thang chuẩn trong bảng gel. Với

đoạn mồi đã chọn khuếch đại đoạn gen blaNDM-1 có chiều dài 621 bp trên khuôn ADN

của K. pneumoniae. Theo nghiên cứu của chúng tôi thu được kết quả: trong 35 chủng

khảo sát có 7 chủng mang gen blaNDM-1 chiếm 20% số chủng khảo sát.

621bp 500bp

621bp 600bp

621bp

600bp

Hình 3.3. Kết quả PCR gen blaNDM-1 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)

Bảng 3.15. Kết quả điện di gen blaNDM-1

Mã PCR gen KSĐ KSĐ Hodge STT ESBL KSĐ CN PXN CAZ IMP+MEM test blaNDM-1

1 278 - S S S - -

R R S + + - 661 2

I R S + - + 776 3

R R S + + - 815 4

R R S + - - 1 5

S I S + - - 78 6

R R S + - - 400 7

S R S + + - 796 8

S S S + - - 309 9

S S S - - - 334 10

S S S + - - 391 11

S S S + - - 24 12

R R R + + + 268 13

S S S - - - 363 14

S I S - - - 364 15

S S S + - - 452 16

R R S + - + 508 17

R R S + - + 510 18

R R S/I + + + 521 19

R R S + + - 675 20

I R S + - - 721 21

R R S + - - 824 22

S S S - - - 189 23

S R S + - - 982 24

R R S - - - 19 25

R R S + + - 80 26

S S S - - - 513 27

S S S - - - 784 28

R R S + - - 637 29

R R S - - - 812 30

31 14 - R R S + -

32 130 - R R S - -

33 208 - S S S - -

34 217 + R R S + -

35 274 + R R S - -

Theo kết quả kháng sinh đồ của 35 chủng khảo sát thì mức độ kháng kháng sinh

với các kháng sinh nhóm cephalosporins CN: 62,86%; CAZ: 51,43% và kháng

carbapenems là IMP: 2,86%; MEM: 2,86%. Kết quả PCR này cũng không trái ngược

với kiểu hình dựa trên kháng sinh đồ vì trong 35 chủng vi khuẩn này cũng có 11 chủng

đã mang enzyme OXA-1 phân hủy cephalosporins chiếm 31,43%. Và có 7 chủng sinh

enzym carbapenemase chiếm 20% số chủng khảo sát bằng thử nghiệm Hodge test.

Khi đối chiếu kết quả 7 chủng mang gen blaNDM-1 với kết quả thử nghiệm Hodge

thu đước kết quả sau: có 2 chủng (số 268, 521) là có sự phù hợp kiểu gen và kiểu hình.

Nhưng có 5 chủng (số 776, 508, 510, 217, 274) mang gen blaNDM-1 nhưng test kiểu

hình thì kết quả không phù hợp. Điều này được lí giải là do thử nghiệm Hodge test

sinh carbapenemase cho kết quả dương tính những chủng mang gen NDM thì cần độ

nhạy và độ đặc hiệu trên 11%. Vậy, Klebsiella pneumoniae mang đã gen blaNDM-1

nhưng chưa biểu hiện kiểu hình sinh carbapenemase để phân giải kháng nhóm

carbapenem. Do đó, cơ chế về sự điều hòa biểu hiện của gen này cần được nghiên cứu

sâu hơn nữa. Đồng thời, nên tiến hành sàng lọc kiểu hình bằng việc sàng lọc theo

phương pháp Hodge test cải tiến để phát hiện những chủng này sinh carbapenemase.

3.6.4. Gen blaIMP

Dựa vào nghiên cứu của Brandi M. Limbago, J. Kamile Rasheed, Karen F.

Anderson và cộng sự [31]; Andréia P. Penteado, Mariana Castanheira và cộng sự [29];

Shinako Fukigai, Jimena Alba, Soichiro Kimura và cộng sự [80], chúng tôi chọn

primer cho việc PCR gen IMP nằm trên nhiễm sắc thể, mã hóa enzyme IMP metallo-

β-lactamase thuộc lớp B (hiện nay đã biết được 17 loại), được tìm thấy ở Nhật (1990)

có khả năng phân giải tất cả các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam. K. pneumoniae

mang gen blaIMP không những chỉ kháng lại cephalosporin mà còn kháng cả “vũ khí

cuối cùng” là carbapenem. Chúng tôi tiến hành PCR và điện di thu được kết quả như hình 3.7 với vạch sản phẩm PCR ứng với mức thang 448bp trên thang chuẩn trong

bảng gel. Khi tôi chọn đoạn mồi khuếch đại đoạn gen blaIMP có chiều dài 448 bp trên

khuôn ADN của K. pneumoniae. Chúng tôi thu được kết quả trong 35 chủng khảo sát

có 1 chủng mang gen blaIMP chiếm 2,86%.

Qua việc khảo sát kiểu hình bằng kháng sinh đồ thì tỉ lệ kháng đối với kháng sinh

nhóm penicillins và cephalosproins (AM: 94,29%; PIP: 62,86%; CN: 62,86%; CAZ:

51,43%); đồng thời khi tiến hành thử nghiệm bằng phương pháp đĩa đôi và Hodge test

thì có đến 23 chủng sinh ESBL chiếm 65,75%; 7 chủng sinh carbapenemase chiếm

20%. Trong khi đó chúng tôi chỉ phát hiện 1 chủng có mang gen IPM chiếm 2,86%.

Điều này không ngược với kết quả kiểm tra kiểu hình vì kết quả PCR 35 chủng có 26

chủng mang gen CMY-2, 11 chủng mang gen blaOXA-1, 7 chủng mang gen blaNDM-1 đã

mã hóa cho enzyme phân giải kháng sinh thuộc nhóm β-lactam. Hơn nữa ngoài cơ chế

kháng bằng enzyme thì còn có nhều gen khác mã hóa cho cơ chế kháng β-lactam. Mặt

khác, kết quả này cũng khá phù hợp với kiểu hình kháng carbapenems (IMP; MEM:

2,86%) trên kháng sinh đồ. Vậy kiểu gen và kiểu hình phù hợp.

600bp

448bp

500bp

Hình 3.4. Kết quả PCR gen blaIMP đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)

Trong phạm vi đề tài và thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tôi chỉ có thể

nghiên cứu được ở 4 gen. Nếu thời gian dài hơn chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu nhiều

gen nữa.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Qua việc khảo sát khả năng kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae tại viện

Pasteur Tp. Hồ Chí Minh từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2014, chúng tôi thu được kết quả

- Tất cả các chủng Klebsiella phân lập được đều là loài Klebsiella pneumoniae.

- Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae phân lập được theo giới nam là 74,29% chiếm ưu

thế hơn so với nữ là 25,71%. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae phân lập được theo nhóm

tuổi chiếm ưu thế ở nhóm 46-60 tuổi với tỉ lệ 31,43%. Klebsiella pneumoniae phân bố

chủ yếu trên bệnh phẩm đàm và mủ chiếm 68,58%.

-Klebsiella pneumoniae có mức đề kháng với hầu hết các kháng sinh đặc biệt là

các loại kháng sinh thuộc nhóm penicillin; cephalosporins. Nhạy với kháng sinh nhóm

polypeotides và cacbarpenem.

- Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL là 65,71%; sinh carbapenemase là 20%.

- Kết quả PCR phát hiện gen CMY-2 được phát hiện ở 27 chủng chiếm 77,14%;

gen blaOXA-1 được phát hiện ở 11 chủng chiếm 31,43%; gen blaNDM-1 phát hiện ở 7

chủng chiếm 20%; còn gen blaIMP phát hiện 1 chủng chiếm 2,86% số chủng khảo sát.

2. Kiến nghị

Nghiên cứu này đã bước đầu xác định vi khuẩn Klebsiella pneumoniae là tác

nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện, gây viêm phổi. Đồng thời khảo sát tỉ lệ

kháng kháng sinh, xác định tỉ lệ kháng kháng sinh của những chủng sinh ESBL lẫn

những chủng không sinh ESBL, và tỉ lệ chủng sinh carbapenemase. Tìm gen kháng

thuốc bằng PCR. Từ đó, tôi xin có đề nghị sau:

- Nên hạn chế sử dụng những loại kháng sinh như ampicillin trong việc điều trị.

- Cần có những nghiên cứu sâu hơn về phân tử của vi khuẩn sinh ESBL và

carbapenemase.

- Nghiên cứu sự kháng thuốc thường niên để có thể dự đoán khuynh hướng

kháng thuốc của vi khuẩn cũng như phác đồ để điều trị thích hợp để nâng cao hiệu

quả, giảm chi phí điều trị cũng như hạn chế sự phát sinh những chủng kháng thuốc

mới.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Quốc Anh, Nguyễn Việt Hùng (2012),“Đặc điểm phân bố và kháng

kháng sinh của các tác nhân gây nhiễm khuẩn vết mổ tại một số bệnh viện

của Việt Nam (2009 - 2010)”, Tạp chí Y học lâm sàng, 66, Trang 32-38.

2. Trần Thị Ngọc Anh (2008), "Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh

thường gặp tại Bệnh Viện Nhi Đồng 2 năm 2007", Tạp chí Y Học Thành

Phố Hồ Chí Minh, 12(4), Trang 183 – 191.

3. Kiều Hữu Ảnh (2007), Giáo trình vi sinh vật học-Lí thuyết và bài tập giải sẵn,

Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật.

4. Nguyễn Thanh Bảo (2011), Vi khuẩn học, Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh.

5. Nguyễn Thị Yến Chi (2011), Khảo sát sự kháng kháng sinh của các vi khuẩn

Gram âm đường ruột thường gặp trong bệnh viện sinh ESBL, Luận văn thạc

sĩ sinh học, Đại học Sư phạm TP.HCM.

6. Lê Huy Chính (2003), Vi Sinh Y Học, Nhà xuất bản y học Hà Nội.

7. Vũ Thị Kim Cương (2007), Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của các vi

khuẩn gây nhiễm bệnh viện tại bệnh viện Thống Nhất từ 15/10/2004 đến

30/06/2005, Luận văn thạc sĩ Y học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí

Minh.

8. Hoàng Thị Phương Dung (2009), Khảo sát trực khuẩn Gram âm sinh men beta-

lactamase phổ rộng phân lập tại bệnh viện Đại Học Y Dược, Luận văn thạc

sĩ Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.

9. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục, trang

196 – 197.

10. Hoàng Kim Huyền (2011), Dược lâm sàng, Nhà xuất bản y học.

11. Nguyễn Thanh Hiền (2012), Đánh giá việc sử dụng của kháng sinh nhóm

carbapenem trên bệnh nhân điểu trị tại phòng hồi sức tích cực bệnh viện

Việt Đức, Luận văn thạc sĩ dược học của trường đại học dược Hà Nội, khóa

2010 - 2012, Trang 26.

12. Ngô Thế Hoàng, Quế Lan Hương, Nguyễn Bá Lương (2012), “Tính kháng thuốc

của Klebsiella pneumoniae trong viêm phổi bệnh viện tại bệnh viện Thống

Nhất Tp. Hồ Chí Minh”, Y Học TP. Hồ Chí Minh, 16(1), Trang 264-270.

13. Hoàng Trọng Kim, Nguyễn Hoài Phong (2005), “Đặc điểm nhiễm khuẩn bệnh

viện tại khoa hồi sức tăng cường Bệnh Viện Nhi Đồng 1”, Y Học Thành

Phố Hồ Chí Minh, 9(1), Trang 147-153.

14. Từ Minh Koóng (2007), Kĩ thuật sản xuất dược phẩm, tập II, Nhà xuất bản Y

học.

15. Bùi Thị Mùi, Lê Thị Ánh Hồng, Nguyễn Thanh Liêm (2010),“Tỷ lệ sinh men

Beta - lactamaes phổ rộng và tính nhạy cảm kháng sinh của Klebsiella

Pneumoniae gây nhiễm khuẩn đường hô hấp trẻ em từ sơ sinh đến 6 tuổi ở

Bệnh viện Nhi Trung ương”, Tạp chí y học dự phòng, Tập 21(7).

16. Trần Thị Thanh Nga(2010), “Nhiễm khuẩn và đề kháng kháng sinh tại bệnh viện

Chợ Rẫy năm 2008-2009”, Tạp chí Y học TP.HCM, Tập 14, Số 2.

17. Lê Văn Phủng (2009), Vi khuẩn y học, Nhà xuất bản giáo dục.

18. Bùi Nghĩa Thịnh và cộng sự (2010), "Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của

vi khuẩn tại khoa hồi sức tích cực và chống độc Bệnh Viện cấp cứu Trưng

Vương", Hội thảo Khoa Học Kỹ Thuật.

19. Lê Minh Trí (2004), “Đại cương về kháng sinh”, Bài giảng bộ môn Hóa dược, Đại

học Y dược TP. Hồ Chí Minh.

20. Nguyễn Đắc Trung (2013), “Phát hiện gen blaTEM và blaCTX-M ở các chủng

Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae bằng phản ứng Multiplex-PCR”,

Tạp chí Y-Dược Học Quân Sự, 9, Trang 76-85.

21. Mai Văn Tuấn, Nguyễn Thanh Bảo (2008),"Khảo sát trực khuẩn gram âm sinh

men b-lactamase phổ mở rộng phân lập tại Bệnh Viện Trung Ương Huế",

Tạp Chí Y Học TPHCM, 12(1), 150-156.

22. Nguyễn Sĩ Tuấn (2014), “Nghiên cứu mô hình kháng kháng sinh của vi khuẩn

gây bệnh tại bệnh viện đa khoa thống nhất Đồng Nai”, Tạp chí y học thực

hành, 1(903), Trang 2.

23. Nguyễn Sâm (2009) “Đánh giá một số phương pháp phát hiện β-lactamase phổ rộng (ESBL) của Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae”, Luận văn

thạc sĩ y học, Đại học Y Hà Nội.

24. Phạm Hùng Vân (2009), “Nghiên cứu đa trung tâm khảo sát tình hình đề kháng

các kháng sinh của các trực khuẩn Gram âm dễ mọc gây nhiễm khuẩn bệnh

viện phân lập từ 1/2007 đến 5/2008”, Tạp Chí Y Học TPHCM, Tập 13(2),

Trang 138-148.

25. Phạm Hùng Vân và nhóm MIDAS (2009), "Nghiên cứu đa trung tâm về tình hình

đề kháng Imipenem và Meropenem của trực khuẩn Gram âm dễ mọc kết

quả trên 16 bệnh viện tại Việt Nam". Tạp chí Y Học Tp. Hồ Chí Minh.

26. Adnan Amin, Pir Baksh Ghumro, Shagufta Hussain (2009), “Prevalence of

antibiotic resistance among clinical isolates of Klebsiella pneumoniae

isolated from a Tertiary Care Hospital in Pakistan”, Malaysian Journal of

Microbiology, 5(2), pp. 81-86.

27. Ahmad M, Urban C, Mariano N, Bradford PA, Calgani E, Projan JS et al (1999),

“Clinical characteristics and molecular epidemiology associated with

imipenem- resistant Klebsiella pneumoniae”, Clin Infect Dis;29, pp. 352-

355.

28. Alain Philippon, G. Arlet and A. Jacoby (2002), “Plasmid-Determined AmpC-

Type β-lactamase”, Antimicrobial Agents And Chemotherapy, pp.1-11.

29. Andreia P. Penteado, Mariana Castanheira (2009), “Dissemination of blaIMP-1-

carrying integron In86 amongKlebsiella pneumoniae isolates harboring a

new trimethoprim resistance gene dfr23”, Diagnostic Microbiology and

Infectious Disease, 63(1), pp. 87-91.

30. Ankur Goyal, K.N. Prasad, Amit Prasad, Sapna Gupta, Ujjala Ghoshal &

Archana Ayyagari (2009), “Extended spectrum β-lactamases in Escherichia

coli and Klebsiella pneumoniae & associated risk factors”, Indian J Med

Res, 129, pp. 695-700.

31. Brandi M. Limbago, J. Kamile Rasheed, Karen F. Anderson (2011), “IMP-

Producing Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae in the United

States”, J Clin Microbiol, 49(12), pp. 4239–4245.

32. Branger C, Lesimple CA, Bruneu B, et al (1998), “Long-term investigation of the

clonal dissemination of Klebsiella pneumoniae isolates producing extended-

spectrum β-lactamases in a university hospital”, J Med Microbiol, 47, pp.

210-09.

33. Bratu S, Mooty M, Nichani S, Landman D, Gullans C, Pettinato B, et al (2005),

Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, New

York: epidemiology and recommendations for detection. Antimicrob Agents

Chemother, 49(7), pp. 3018–3020.

34. Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA (1995), “A functional classification scheme

for β-lactamases and its correlation with molecular structure”,Antimicrob

Agents Chemoth, 39, pp. 1211-33.

35. Carvalhaes CG, Picao RC, Nicoletti AG, Xavier DE, Gales AC (2010),

“Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase

production in Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results”. J

Antimicrob Chemother, 65(2), pp. 249-51.

36. Castanheira M et al (2011), “Early dissemination of NDM-1 and OXA- 181-

producing Enterobacteriaceae in Indian hospitals: report from the SENTRY

Antimicrobial Surveillance Program”, Antimicrob Agents Chemother, 55(3),

pp. 1274-1278.

37. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Guidance for control of

infections with carbapenem-resistant or carbapenemase-producing

Enterobacteriaceae in acute care facilities (2009), Morb Mortal Wkly Rep,

58, pp. 256–260.

38. Clinical and Laboratory Standards Institute (2011). Performance Standards for

antimicrobial susceptibility testing. CLSI document Wayne, PA, USA.

Performace standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-second

informational supplement

39. Delphine Girlich, Laurent Poirel, and Patrice Nordmann (2012),“Value of the Modified Hodge Test for Detection of Emerging Carbapenemases in

Enterobacteriaceae”, J Clin Microbiol, 50(2), pp. 477–479.

40. Dubois SK, Marriott MS, Amyes SGB (1995), “TEM and SHV-derived extended

spectrum ß-lactamases: relationship between selection, structure, and

function”,J Antimicrob Chemother, 35, pp. 7-32.

41. ECDC. Bilthoven, the Netherlands: European Center for Disease Prevention and

Control 2008. EARSS annual report 2008.

42. Elhani D, Bakir L, M Aouni, Passet V, Arlet G, Brisse S, et al (2010),“Molecular

epidemiology of extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella

pneumoniae strains in a university hospital in Tunis, Tunisia”, Clin

Microbiol Infect, 16, pp. 157–64]

43. Fatemeh Ashrafian, Emran Askari, Elnaz Kalamatizade, Mohammad Javad

Ghabouli Shahrodi (2013), “The frequency of Extended Spectrum Beta

Lactamase (ESBL) in Escherichia coli and Klebsiela pneumoniae: a report

from Mashad, Iran”, J Med Bacteriol, 2, pp.12-19.

44. Ferran Navarro, Emilio Perez-Trallero và cộng sự (2001), “CMY-2- producing

Sallmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus

mirabilis and Escherichia coli, strains isolated in Spain”, Journal of

Antimicrobial Chemotherapy, 48, pp. 383-389.

45. Friedlander C. (1882), Uber die scizomyceten bei der acuten fibrosen

pneumonie,Arch Pathol Anat Physiol Klin Med, 87, pp. 319-324.

46. Hoban DJ, Lascols C, Nicolle LE, Badal R, Bouchillon S, Hackel M, et al

(2012), “Antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae, including

molecular characterization of extended-spectrum beta-lactamase-producing

species, in urinary tract isolates from hospitalized patients in North America

and Europe: results from the SMART study 2009–2010”,Diagn Microbiol

Infect Dis, 74, pp. 62–67.

47. Hsueh Po-Ren, Peter Michael Hawkey (2007),“Consensus statement on antimicrobial therapy of intra-abdominal infections in Asia”. International

Journal of Antimicrobial Agents, 30, pp. 129–133.

48. Jan M. Bell, John D. Turnidge, and Patiyan Andersson (2010), “aac(6′)-Ib-cr

Genotyping by Simultaneous High-Resolution Melting Analyses of an

Unlabeled Probe and Full-Length Amplicon”, 54(3), pp. 1378-1380

49. Jones RN. Summation, (1999), “β-Lactam resistance surveillance in the Asia-

western pacific region”, Diagn Microbiol Infect Dis, 35, pp. 333-338

50. Karmele C, Javier P, Rodrigo A (2003),“Simple and reliable multiplex PCR assay

for detection of blaTEM, blaSHV and blaOXA-1 genes in

Enterobactericeae”,FEMS Microbiol Lett, 23, pp. 147–151.

51. Khalaf NG, Eletreby MM, Hanson ND (2009),“Characterization of CTX-M

ESBLs in Enterobacter cloacae , Escherichia coli and Klebsiella

pneumoniae clinical isolates from Cairo, Egypt”,BMC Infect Dis, 9, pp. 84

52. Kitchel B, Rasheed JK, Patel JB, et al (2009), “Molecular epidemiology of KPC-

producing Klebsiella pneumoniae isolates in the United States: clonal

expansion of multilocus sequence type 258”,Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, 53, pp. 3365–3370.

53. Knothe H, Shah P. Kremery V, et al (1983), “Transferable resistance

tocefotaxime, cefoxitin, cefamandole and d cefuroxime in clinical isolates

of Klebsiella pneumoniae and Serratiamarcescens”, Infection, 11, pp. 315-

317.

54. Kumarasamy Karthikeyan, Krishnan Padma, Thirunarayan M. A (2010),

“Coexistence of blaOXA-23 with blaNDM-1 and armA in clinical isolates

of Acinetobacter baumannii in India”, J. AntimicrobChemother, 65(10), pp.

2253–2254.

55. Kyungwon Lee, Miae Lee, Jong Hee Shin, Myung Hee Lee, et al (2006),

“Prevalence of Plasmid-mediated AmpC β-Lactamases in Escherichia coli

and Klebsiella pneumoniae in Korea”, Microbial Drug Resistancem, 12(1),

pp. 44-49.

56. Leavitt A, Navon-Venezia S, Chmelnitsky I, et al (2007), “Emergence of KPC-2 and KPC-3 in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains in an

Israeli hospital”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51, pp. 3026–29.

57. Lee J, Patel G, Huprikar S, et al (2009),“Decreased susceptibility to polymyxin B

during treatment of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection”,

J Clin Microbiol, 47, pp. 1611–1612.

58. Livermore DM (1995), “ß-lactamases in laboratory and clinical resistance”, Clin

Microbiol Rev, 8, pp. 557-84.

59. Madhan Sugumar, K. M. Kumar, Anand Maroharan, Anand Anbarasu, Sudha

Ramaiah (2014), “Detection of OXA-1 β-Lactamase Gene of Klebsiella

pneumoniae from Blood Stream Infections (BSI) by Conventional PCR and

In-Silico Analysis to Understand the Mechanism of OXA Mediated

Resistance”, Journal.pone, 10, pp. 1371-1373.

60. Mahrouki S, Bourouis A, Chihi H, Ouertani R, Ferjani M, Moussa MB, et al

(2012), “First characterisation of plasmid-mediated quinolone resistance-

qnrS1 co-expressed bla CTX-M-15 and bla DHA-1 genes in clinical strain

of Morganella morganii recovered from a Tunisian intensive care unit.

Indian”, J Med Microbiol, 30, pp. 437–441.

61. Mark E. Rupp and Paul D. Fey (2003), “Extended Spectrum β-Lactamase

(ESBL)-Producing Enterobacteriaceae Considerations for Diagnosis,

Prevention and Drug Treatment”, Drugs; 63 (4), pp. 353-365.

62. McClelland, M., Florea, L., Sanderson, K., Clifton, S., Parkhill, J., Churcher, C.,

Dougan, G., Wilson, R., Miller, W (2000). "Comparison of the Escherichia

coli K-12 genome with sampled genomes of aKlebsiella pneumoniae and

three Salmonella enterica serovars, Typhimurium, Typhi and

Paratyphi". Nucleic Acids Res, 28(24), pp. 4974–4986.

(2005). “Plasmidmediated 63. Naas T, Nordmann P, Vedel G, Poyart C

carbapenemhydrolyzing beta-lactamase KPC in a Klebsiella pneumoniae

isolate from France”. Antimicrob Agents Chemother, 49(10), pp. 4423-

4424.

64. National Nosocomial Infections Surveillance, (2002), “National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) system report: data summary from January

1992 to June 2002”, Am J Infect Control, 30, pp. 458–75.

65. Navon-Venezia S, Chmelnitsky I, Leavitt A, Schwaber MJ, Schwartz D, Carmeli

Y (2006). “Plasmidmediated imipenemhydrolyzing enzyme KPC-2 among

multiple carbapenemresistant Escherichia coli clones in Israel”. Antimicrob

Agents Chemother, 50(9), pp.3098-3101.

66. Osterblad M, Kirveskari J, Koskela S, et al (2009),“First isolations of KPC-2-

carrying ST258 Klebsiella pneumoniae strains in Finland, June and

August”, Euro Surveill, 14 (40), pp. 19349.

67. Paterson DL, Bonomo RA (2005), “Extended-spectrum beta-lactamases: a

clinical update”,Clinical Microbiology Reviews, 18, pp. 657–686.

68. Patrice Nordmann, Laurent Poirel, Mark A. Toleman, and Timothy R. Walsh

(2011), “How To Detect NDM-1 Producers”, J Clin Microbiol, 49(2), pp.

718–721

69. Pfaller MA, Jones RN (1997), “A review of the in vitro activity of meropenem

and comparative antimicrobial agents tested against 30,254 aerobic and

anaerobic pathogens isolated world wide”, Diagn Microbiol Infect Dis,

28(4), pp. 157-63.

70. Phillips M, Sharma S, et al (2009), Clinical outcomes of infections caused by

KPC-producing organisms; NIH Workshop on ESKAPE Pathogens,

Bethesda, MD.

71. Pitout JD, Hanson ND, Church DL, Laupland KB, et al (2004),“Population-based

laboratory surveillance for Escherichiacoliproducing extended-spectrum β-

lactamases: importance of community isolates with blaCTX-M Genes”,

Clin Infect Dis, 38, pp. 1736-41.

72. Podschun R., Ullmann U. (1998). "Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens:

Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity

Factors". Clinical Microbiology Reviews, 11(4), pp. 589–603.

73. Ramdani-Bouguessa N, Manageiro V, Jones-Dias D, Ferreira E, Tazir M, Canica

M (2011), “Role of SHV beta-lactamase variants in resistance of clinical

Klebsiella pneumoniae strains to beta-lactams in an Algerian hospital”, J

Med Microbiol, 60, pp. 983–987.

74. Rhomberg PR, Jones RN (2009), “Summary trends for the Meropenem Yearly

Susceptibility Test Information Collection Program: a 10-year experience in

the United States (1999-2008)”, Diagn Microbiol Infect Dis, 65, pp. 414–

426.

75. Ryan S. Arnold, Kerri A. Thom, Michael Phillips, et al (2011), “Emergence of

Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)-Producing Bacteria”, South

Med J, 104 (1), pp. 40-45.

76. S.J. Hopkins (1999), Drugs and Pharmacology for Nurses, Churchill Livingstone.

77. Sanders CC, Sanders WE Jr (1992), “ß-lactam resistance in Gram-negative

bacteria: global trends and clinical impact”,Clin Infect Dis,15, pp. 824-839.

78. Sevil Toroglu and Dilek Keskin (2011), Antimicrobial Resistance and Sensitivity

among Isolates of Klebsiella pneumoniae from Hospital Patients in Turkey,

International Journal Of Agriculture And Biology, 13(6), 941-946.

79. Shigeyuki Notake, Mari Matsuda, Kiyoko Tamai, Hideji Yanagisawa, Keiichi

Hiramatsu and Ken Kikuchi (2013), Detection of IMP Metallo β -

Lactamase in Carbapenem-Nonsusceptible Enterobacteriaceae and Non-

Glucose-Fermenting Gram-Negative Rods by Immunochromatography

Assay, J. Clin. Microbiol, 51(6):1762.

80. Shinako Fukigai, Jimena Alba, Soichiro Kimura (2007), “Nosocomial outbreak

of genetically related IMP-1 β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae

in a general hospital in Japan”, International Journal of Antimicrobial

Agents, 29(3), pp. 306-310.

81. Singtohin, Aroonwadee Chanawong, et al (2010), “CMY-2, CMY-8b, and DHA-

1 plasmid-mediated AmpC β-lactamases among clinical isolates of

Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from a university hospital,

Thailand”, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 68, pp. 271-

277.

82. Supoj Singtohin, Aroonwadee Chanawong ect. al (2010), CMY-2, CMY-8b, and DHA-1 plasmid-mediated AmpC β-lactamases among clinical isolates of

Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from a university hospital

Thailand, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 68, pp. 271-

277.

83. Sylvie Carle (2009). La résistance aux antibiotiques : un enjeu de santé publique

important, Pharmactuel, 42(2), pp. 6-21.

84. T Giani, B Pini, F Arena, GM Rossolini, et al (2013), “Epidemic diffusion of

KPC carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Italy: results of

the first countrywide survey, 15 May to 30 June 2011”,

Eurosurveillance,18(22).

85. Thomson K. S. & Sanders C. C. (1992). “Detection of extended-spectrum β-

lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of

the double-disk and three-dimensional tests”. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, 36, 1877–82.

86. Winokur PL, Canton R, Casellas JM, et al (2001), “Variations in the prevalence

of strains expressing an extended-spectrum β-lactamase phenotype and

characterization of isolates from Europe, the Americas, and the western

pacific region”, Clin Infect Dis, 32(2), pp. 94-103.

87. Yamashita SK, Louie M, Simor AE, Rachlis A (2000), “Microbiological

surveillance and parenteral antibiotic use in a critical care unit. Can”.J

Infect Dis, 11, pp. 107-111.

88. Yigit H, Queenan AM, Anderson GJ, et al (2001),“Novel carbapenem-

hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from a carbapenem resistant strain of

Klebsiella pneumoniae”. Antimicrob Agents Chemother, 45, pp. 1151–1161.

89. Yong D et al (2009). “Characterization of a new metallo-beta-lactamase gen,

blaNDM-1, and a novel erythromycin esterase gen carried on a uniquie

genetic structure in Klebsiella pneumoniaesequence type 14 from India”,

Antimicrob Agents Chemother, 53(12): 5046-5054.

90. National Center of Biotechnology Information Taxonomy.

PHỤ LỤC 1

1. Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện theo CDC

1.1. Nhiễm khuẩn huyết

a. Nhiễm khuẩn huyết lâm sang

Phải thỏa mãn ít nhất một trong các điều kiện sau:

Tiêu chuẩn 1: Bệnh nhân có ít nhất một trong các dấu hiệu hay triệu chứng sau mà không tìm ra nguyên nhân nào khác: sốt >380C, hạ huyết áp (huyết áp tâm thu ≤90mmHg) hay thiểu niệu (<20cm3/giờ).

Không tiến hành cấy máu bệnh nhân hoặc không tìm ra các tác nhân gây bệnh hay

kháng nguyên trong máu.

Không thấy dấu hiệu nhiễm trùng ở vị trí khác.

Bác sĩ thiết lập phác đồ điều trị theo hướng nhiễm trùng huyết.

Tiêu chuẩn 2: Bệnh nhi ≤ 1 tuổi có ít nhất một trong các dấu hiệu hay triệu chứng sau mà không tìm ra nguyên nhân nào khác: sốt >380C, hạ thân nhiệt < 370C, ngừng thở,

tim đập chậm mà không tìm ra nguyên nhân nào khác.

Không tiến hành cấy máu bệnh nhân hoặc không tìm ra các tác nhân gây bệnh hay

kháng nguyên trong máu.

Không thấy dấu hiệu nhiễm trùng ở vị trí khác.

Bác sĩ thiết lập phác đồ điều trị theo hướng nhiễm trùng huyết.

b. Nhiễm khuẩn huyết xác định qua kết quả xét nghiệm

Phải thỏa mãn một trong các tiêu chuẩn sau:

Tiêu chuẩn 1: Bệnh nhân có một hay nhiều lần cấy máu cho kết quả dương tính.

Vi khuẩn phân lập từ máu không liên quan đến nhiễm trùng ở vị trí khác.

Tiêu chuẩn 2: Bệnh nhân có ít nhất một trong các dấu hiệu hay triệu chứng sau: sốt >380C, rét run, hạ huyết áp (huyết áp tâm thu ≤ 90mmHg).

Có ít nhất một trong các dấu hiệu sau:

- Phân lập được vi trùng thường trú trên da từ hai hoặc nhiều lần cấy máu khác

nhau.

- Phân lập được vi trùng thường trú trên da từ ít nhất một lần cấy máu trên bệnh

nhân có đường truyền mạch máu và bác sĩ thiết lập điều trị kháng sinh phù hợp

nhiễm trùng huyết.

- Test kháng nguyên dương tính trong máu (H. influenza, S. pneumonia,…). Và

triệu chứng cùng với kết quả xét nghiệm không liên quan đến nhiễm trùng ở vị

trí khác.

Tiêu chuẩn 3: Bệnh nhi ≤ 1 tuổi có ít nhất một trong các dấu hiệu hay triệu chứng sau mà không tìm ra nguyên nhân nào khác: sốt >380C, ngừng thở, tim đập chậm.

Và ít nhất có một trong các dấu hiệu dưới đây:

- Phân lập được vi khuẩn thường trú trên da từ hai hoặc nhiều lần cấy máu khác

nhau.

- Phân lập được vi trùng thường trú trên da từ ít nhất một lần cấy máu trên bệnh

nhân có đường truyền mạch máu và bác sĩ thiết lập điều trị kháng sinh phù hợp

nhiễm trùng huyết

- Test kháng nguyên dương tính trong máu ( H. influenza, S. pneumonia,…). Và

triệu chứng cùng với kết quả xét nghiệm không liên quan đến nhiễm trùng ở vị

trí khác.

1.2. Viêm phổi bệnh viện

Phải thỏa mãn ít nhất một trong các tiêu chuẩn sau:

Tiêu chuẩn 1: Bệnh nhân có rales hay gõ đục qua khám lâm sàng

Và có bất cứ các triệu chứng sau:

- Xuất hiện đàm mủ hay thay đổi tính chất của đàm.

- Cấy máu phân lập được vi khuẩn.

- Phân lập được vi khuẩn qua hút xuyên khí quản hoặc chải phế quản, hoặc sinh

thiết

Tiêu chuẩn 2: Bệnh nhân có X quang phổi có thâm nhiễm mới hay tiến triển, đông

đặc, tạo hang hay tràn dịch màng phổi

Và ít nhất có các triệu chứng sau:

- Xuất hiện đàm mủ hay thay đổi tính chất của đàm.

- Cấy máu phân lập được vi khuẩn.

- Phân lập được vi khuẩn qua hút xuyên khí quản hoặc chải phế quản, hoặc sinh

thiết.

- Phân lập được virus hoặc kháng nguyên virus từ chất tiết hô hấp.

- Tăng IgM hoặc tăng 4 lần IgG

- Huyết thanh chẩn đoán viêm phổi không điển hình dương tính với Legionella,

Clamydia hoặc Mycoplasma

Tiêu chuẩn 3: Bệnh nhi ≤1 tuổi có ít nhất 2 trong các triệu chứng: ngừng thở, thở

nhanh, tim đập chậm, khò khè, ran ngáy và ho.

Và có ít nhất một trong các dấu hiệu sau:

- Tăng tiết đường hô hấp

- Xuất hiện đàm mủ hoặc thay đổi tính chất đàm.

- Cấy máu phân lập được vi khuẩn có sự gia tăng IgM hoặc tăng 4 lần IgG.

- Phân lập được vi khuẩn qua hút xuyên khí quản hoặc chải phế quản, hoặc sinh

thiết.

- Phân lập được virus hoặc kháng nguyên virus từ chất tiết hô hấp.

- Hình ảnh viêm phổi trên mô học.

Tiêu chuẩn 4: Bệnh nhi ≤1 tuổi có X quang phổi có thâm nhiễm mới hay tiến triển,

đông đặc, tạo hang hay tràn dịch màng phổi.

Và có ít nhất một trong các triệu chứng sau:

- Tăng tiết đường hô hấp

- Xuất hiện đàm mủ hoặc thay đổi tính chất đàm

- Cấy máu phân lập được vi khuẩn có sự gia tăng IgM hoặc tăng 4 lần IgG

- Phân lập được vi khuẩn qua hút xuyên khí quản hoặc chải phế quản, hoặc sinh

thiết.

- Phân lập được virus hoặc kháng nguyên virus từ chất tiết hô hấp.

- Hình ảnh viêm phổi trên mô học.

Ghi chú:

Cấy đàm khạc ra không có giá trị chuẩn đoán viêm phổi nhưng có thể hữu ích

cho việc chẩn đoán nguyên nhân và thực hiện kháng sinh đồ. Cần lấy đàm đúng

quy cách.

Hình ảnh trên nhiều phim X quang có thể có giá trị nhiều hơn một phim

1.3. Nhiễm khuẩn bệnh viện đường niệu

a. Nhiễm khuẩn đường niệu có triệu chứng

Nhiễm khuẩn đường niệu có triệu chứng phải thỏa mãn ít nhất một trong các tiêu

chuẩn sau:

Tiêu chuẩn 1: Bệnh nhân có ít nhất một trong các dấu hiệu hay triệu chứng sau mà không tìm ra nguyên nhân nào khác: sốt >380C, tiểu gấp, tiểu lắt nhắt, khó đi tiểu, hay

căng tức trên xương mu. Và bệnh nhân có một cấy nước tiểu dương tính (>105CFU/cm3) với không hơn hai loại vi trùng.

Tiểu chuẩn 2: Bệnh nhân có ít nhất một trong các dấu hiệu hay triệu chứng sau mà không tìm ra nguyên nhân nào khác: sốt >380C, tiểu gấp, tiểu lắt nhắt, khó đi tiểu, hay

căng tức trên xương mu. Và bệnh nhân có một cấy nước tiểu dương tính (>105CFU/cm3) . Và bệnh nhân có ít nhất một trong các triệu chứng sau:

- Dipstick (+) đối với esterase và hoặc nitrate của bạch cầu. - Tiểu mủ (≥10 bạch cầu/mm3 nước tiểu hoặc ≥ 3 bạch cầu ở bàng quang có độ

phóng đại cao).

- Tìm thấy vi trùng trên nhuộm Gram

Ít nhất hai lần cấy nước tiểu có ≥102 CFU/cm3 với cùng một loại tác nhân gây -

nhiễm trùng tiểu (Gram âm hay S. saprophyticus)

- Cấy nước tiểu có ≤ 105CFU/cm3 đối với một loại tác nhân gây bệnh đường tiểu

(Gram âm hay S. saprophyticus) trên bệnh nhân đang điều trị kháng sinh hiệu

quả chống nhiễm trùng tiểu.

- Bác sĩ chẩn đoán nhiễm trùng tiểu

- Bác sĩ thiết lập điều trị phù hợp nhiễm trùng đường niệu.

Tiêu chuẩn 3: Bệnh nhi ≤1 tuổi có ít nhất một trong các triệu chứng sau mà không tìm ra nguyên nhân nào khác: sốt >380C, hạ thân nhiệt <370C, ngừng thở, tim đập chậm,

tiểu khó, mệt mỏi, nôn mửa. Và người bệnh có kết quả cấy nước tiểu dương tính ≤105CFU/cm3 với không hơn hai loại vi khuẩn.

Tiêu chuẩn 4: Bệnh nhi ≤1 tuổi có ít nhất một trong các triệu chứng sau mà không tìm ra nguyên nhân nào khác: sốt >380C, hạ thân nhiệt <370C, ngừng thở, tim đập chậm,

tiểu khó, mệt mỏi, nôn mửa. Và có ít nhất một trong các điều kiện dưới đây:

- Dipstick (+) đối với esterase và hoặc nitrate của bạch cầu. - Tiểu mủ (≥10 bạch cầu/mm3 nước tiểu hoặc ≥3 bạch cầu ở bàng quang có độ

phóng đại cao).

- Tìm thấy vi trùng trên nhuộm Gram.

Ít nhất hai lần cấy nước tiểu có ≥ 102 CFU/cm3 với cùng một loại tác nhân gây -

nhiễm trùng tiểu (Gram âm hay S. saprophyticus).

- Cấy nước tiểu có ≤ 105CFU/cm3 đối với một loại tác nhân gây bệnh đường. tiểu

(Gram âm hay S. saprophyticus) trên bệnh nhân đang điều trị kháng sinh hiệu

quả chống nhiễm trùng tiểu.

- Bác sỹ chẩn đoán nhiễm trùng niệu.

- Bác sĩ thiết lập điều trị phù hợp nhiễm trùng đường niệu.

b. Nhiễm khuẩn đường niệu không có triệu chứng

Nhiễm trùng niệu không triệu chứng phải có ít nhất một trong các tiêu chuẩn sau:

Tiêu chuẩn 1: Bệnh nhân được đặt Catheter lưu trong vòng 7 ngày trước khi cấy. Và cấy nước tiểu dương tính (>105CFU/cm3 với không hơn hai loại vi trùng). Và bệnh

nhân không có các triệu chứng sau: sốt, tiểu gấp, tiểu nhắt, khó đi tiểu hay căng tức

trên xương mu.

Tiêu chuẩn 2: Bệnh nhân được đặt Catheter lưu trong vòng 7 ngày trước lần cấy dương tính đầu tiên. Và có ít nhất hai lần cấy nước tiểu dương tính (≥105CFU/cm3) với

sự lặp lại cùng một loại vi trùng và không hơn hai loại vi trùng. Và bệnh nhân không

có các triệu chứng sau: sốt, tiểu gấp, tiểu nhắt, khó đi tiểu hay căng tức trên xương mu.

Ghi chú: Cấy đầu catheter đường tiểu dương tính không có giá trị trong chẩn đoán

NKBV đường tiết niệu. Mẫu nước tiểu dùng thử phải được lấy đúng về mặt kỹ thuật.

Ở trẻ em phải lấy nước tiểu bằng cách đặt ống thông bang quang hoặc hút trên xương

mu. Cấy nước tiểu dương tính trong túi chứa không đáng tin.

1.4. Viêm màng não hoặc viêm não thất

Phải đáp ứng một trong các tiêu chuẩn sau:

Tiêu chuẩn 1: Phân lập được tác nhân gây bệnh từ dịch não tủy. Tiêu chuẩn 2: Bệnh nhân có ít nhất một trong các dấu hiệu sau mà không tìm ra nguyên nhân: sốt >380C, nhức đầu, cứng cổ, dấu hiệu màng não, dấu hiệu thần kinh sọ

não và tình trạng kích thích. Và nếu chẩn đoán được đặt ra trước khi chết, bác sĩ thiết

lập điều trị kháng sinh thích hợp. Đồng thời có ít nhất một trong các triệu chứng sau

đây:

- Dịch não tủy: bạch cầu tăng, tăng protein và hay giảm đường huyết.

- Tìm thấy vi khuẩn trên phết nhuộm Gram dịch não tủy.

- Cấy máu dương tính.

- Test kháng nguyên dương tính ở dịch não tủy, máu hoặc nước tiểu.

- Tăng IgM hoặc tăng IgG.

cứng cổ, dấu hiệu thần kinh sọ não hoặc tình trạng kích thích. Và nếu chẩn đoán được

đặt ra trước khi chết, bác sĩ thiết lập điều trị kháng sinh thích hợp. Và có ít nhất một

trong các dấu hiệu dưới đây:

- Dịch não tủy: bạch cầu tăng, tăng protein và hay giảm đường huyết.

- Tìm thấy vi khuẩn trên phết nhuộm Gram dịch não tủy.

- Cấy máu dương tính.

- Test kháng nguyên dương tính ở dịch não tủy, máu hoặc nước tiểu.

- Tăng IgM hoặc tăng IgG.

1.5. Nhiễm trùng da và mô mềm

a. Nhiễm trùng da

Phải thỏa mãn ít nhất một trong các tiêu chuẩn sau:

Tiêu chuẩn 1: Chảy mủ, mủ mụn hoặc bong mủ

Tiêu chuẩn 2: Có ít nhất hai trong số các dấu hiệu hoặc triệu chứng dưới đây mà

không tìm ra nguyên nhân nào khác: Đau, sưng, đỏ, nóng tại chỗ. Và có ít nhất một

trong các dấu hiếu sau đây:

- Phân lập được tác nhân gây bệnh từ dịch hút hoặc dịch dẫn lưu từ nơi tổn

thương; nếu là vi khuẩn thường trú trên da, phải đảm bảo không tạp nhiễm khi

cấy.

- Cấy máu dương tính.

- Test kháng nguyên dương tính ở máu hoặc mô tổn thương.

- Tìm thấy tế bào khổn lồ đa nhân qua soi bằng kính hiển vi mô tổn thương.

- Tăng IgM hoặc 4 lần IgG.

b. Nhiễm trùng mô mềm (Viêm màng cân cơ hoại tử, hoại tử nhiễm trùng, viêm mô

tế bào hoại tử, viêm cơ nhiễm trùng, viêm hạch bạch huyết, viêm ống bạch huyết).

Phải đáp ứng ít nhất một trong các tiêu chuẩn sau:

Tiêu chuẩn 1: Phân lập được tác nhân gây bệnh từ mô hoặc dịch dẫn lưu của vùng tổn

thương.

Tiêu chuẩn 2: Chảy mủ từ vùng tổn thương.

Tiêu chuẩn 3: Hình ảnh abces hoặc bằng chứng của nhiễm khuẩn khác thấy được qua

phẫu thuật hoặc xét nghiệm mô học.

Tiêu chuẩn 4: Có ít nhất một trong số các dấu hiệu hoặc triệu chứng dưới đây mà

không tìm ra nguyên nhân: Sưng, nóng, đỏ, đau. Và có ít nhất một trong các điều kiện

dưới đây:

- Cấy máu dương tính.

- Test kháng nguyên dương tính ở máu hay nước tiểu.

- Tăng IgM hoặc 4 lần IgG.

PHỤ LỤC 2

Hướng dẫn đọc kết quả API 20E

http://www2.fiu.edu/~makemson/MCB3020Lab/API20eInstructions.pdf

Kết quả Thành phần Test Phản ứng/enzyme Âm Dương tính hoạt động tính

Β-galactosidase 2-Nitrophenyl- Không OPNG (Ortho NitroPhenyl- Màu vàng (1) βDgalactopyranoside màu βDGalactopyranosidase

ADH L-arginine Aginine DiHydrolase Vàng Đỏ/vàng cam (2)

LDC L-Lysine Lysine Decarboxylase Vàng Đỏ/vàng cam (2)

Orthinine ODC L-ornithine Vàng Đỏ/vàng cam (2) DeCarboxylase

Xanh Xanh da trời- CIT Trisodium citrate CITrate utilization nhạt/vàng Xanh lá cây (3)

Không Đen lắng đọng Sodium thiosulfate màu/ xám H2S H2S production đường mỏng nhạt

URE Urea URease Vàng Đỏ/vàng cam (2)

TDA/ngay lập tức Tryptophane TDA L-Tryptophane DeAminase Vàng Nâu đỏ

Thuốc thử Kovac’s/ nhay lập tức

IND L-Tryptophane INDole production

Hồng

Không màu Xanh nhạt/Vàng

VP1 + VP2/10 phút

VP Sodium pyruvate Aetoin production (Voges Proskauer) Hồng/đỏ (5) Không màu

GEI GELatinase Gelatin (bovine origin) Chất màu đen khuếch tán Không khuếch tán

Xanh da Lên men/ôxi hóa GLU D-glucose trời- xanh Vàng/ xám vàng (GLUcose)(4) lá cây

Xanh da Lên men/ôxi hóa MAN D-mannitol trời- xanh Vàng/ xám vàng (MANnitol)(4) lá cây

Xanh da Lên men/ôxi hóa trời- xanh Vàng INO inositol (INOsitol)(4) lá cây

Xanh da Lên men/ôxi hóa trời- xanh Vàng SOR D-sorbitol (SORbitol)(4) lá cây

Xanh da Lên men/ôxi hóa trời- xanh Vàng RHA L-rhamnose (RHAmnose)(4) lá cây

Xanh da Lên men/ôxi hóa trời- xanh Vàng SAC D-sucrose (SACcharose)(4) lá cây

Xanh da Lên men/ôxi hóa trời- xanh Vàng MEL D-melibiose (MELibiose)(4) lá cây

Xanh da Lên men/ôxi hóa trời- xanh Vàng AMY amygdalin (AMYgdalin)(4) lá cây

Xanh da Lên men/ôxi hóa trời- xanh Vàng ARA L-arabinose (ARAbinose)(4) lá cây

Màu vàng rất nhạt cũng nên xem như dương tính. (1)

Màu vàng cam sau 36-48h ủ phải xem như âm. (2)

Đọc kết quả trong phần hiếu khí. (3)

Lên men bắt đầu ở phần dưới tube, oxi hóa bắt đầu ở (4)

phần hiếu khí.

Màu hồng nhẹ sau 10 phút nên xem là âm tính. (5)

PHỤ LỤC 3

Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ

Cách đọc Hàm Tên khánh sinh Viết tắt Nhóm Lớp Phụ lớp sử dụng lượng Kháng Trung gian Nhạy

Ampicilline AM 10µg ≤13 14-16 ≥17

Ureido-penicillin Piperacillin PIP 75µg ≤ 17 18-20 ≥ 19 Penicillins

10µg ≤ 11 12-14 ≥ 15 Mecillinam MEC

β-lactams/yếu tố kết hợp Amoxicillin AMC 10µg ≤13 14-17 ≥18 β- ức chế β-lactamase /clavulanic acid lactams Cephalosporin II Cephalexine CN 30µg ≤13 14-15 ≥15 Cepems CAZ 30µg ≤14 15-22 ≥23 Cephalosporin III Ceftazidime

IPM 10µg ≤13 14-15 16 Imipenem Penems Carbapenem ≤13 14-15 ≥16 Meropenem MEM 30µg

AN 30µg ≤14 15-16 ≥17 Amikacin

GM 10µg ≤12 13-14 ≥15 Gentamycin Aminoglycosides

NET 30µg ≤12 13-14 ≥15 Netilmicin Non β-

lactams CIP 5µg ≤15 16-20 ≥21 Ciprofloxacin Fluoroquinolones

CS 50µg ≤14 - ≥11 Colistin Lipopeptides

TE 30µg ≤10 12-14 ≥15 Tetracycline Tetracyclines

Nitrofurans Nitrofurantoin FT 300µg ≤14 15-16 ≥17

Trimethoprim/sulf SXT 1,25/ - - - Phối hợp amethoxazol 23,75µg

PHỤ LỤC 4

Mã số của 35 chủng Klebsiella pneumoniae được khảo sát

Bảng. Mã số của 35 chủng Klebsiella pneumoniae được khảo sát

STT Lab code Giới Năm sinh Tuổi Bệnh phẩm SID

1514 Nam 278 1960 52 Đàm 1

6165 Nam 661 1954 58 Đàm 2

9943 Nam 776 1966 46 Mủ 3

1597 Nam 815 1932 80 Đàm 4

3181 Nam 1 2012 0 Nước tiểu 5

5053 Nam 78 1939 73 Máu 6

4475 Nam 400 1960 53 Mủ 7

5413 Nam 796 1963 50 Đàm 8

6699 Nam 309 1992 21 Mủ 9

7348 Nam 334 1983 30 Đàm 10

1459 Nam 391 1938 75 Đàm 11

8854 Nam 24 1977 36 Mủ 12

4365 Nam 268 1968 45 Mủ 13

8908 Nam 363 1969 44 Nước tiểu 14

8909 Nữ 364 1987 26 Nước tiểu 15

6679 Nam 452 1974 39 Nước tiểu 16

8680 Nam 508 1960 53 Mủ 17

8679 Nữ 510 1942 71 Máu 18

9409 Nam 521 1960 53 Mủ 19

5602 Nữ 675 1942 71 Mủ 20

8175 Nam 721 1948 65 Đàm 21

4749 Nam 824 2013 0 Nước tiểu 22

3257 Nam 189 1955 58 Đàm 23

6655 Nam 982 1930 84 Đàm 24

7931 Nữ 19 1954 60 Đàm 25

26 80 1401 Nam 1982 32 Đàm

27 513 8819 Nam 1971 43 Nước tiểu

28 784 2744 Nữ 1974 40 Đàm

29 637 5251 Nam 1979 35 Mủ

30 812 5818 Nam 1962 52 Mủ

31 14 5260 Nữ 1991 23 Mủ

32 130 8904 Nữ 1934 80 Nước tiểu

33 208 3079 Nam 1963 51 Mủ

34 217 3117 Nữ 1945 69 Nước tiểu

35 274 5131 Nữ 1945 69 Nước tiểu

PHỤ LỤC 5

Kết quả kháng sinh đồ của 35 chủng Klebsiella pneumoniae được khảo sát

Bảng. Kết quả kháng sinh đồ của 35 chủng Klebsiella pneumoniae được khảo sát

Năm Bệnh Kết quả KSĐ STT Số Lab sinh phẩm Giới

AM:R - AMC:S - AN:S - CAZ:S -

CIP:R - CN:S - CS:S - FT:S - 1 278 Nam 1960 Đàm GM:S - MEC:S - NET:S - PIP:S -

SXT:S - TE:S

AM:R - AMC:S - AN:S - ATM:R -

CAZ:R - CIP:R - CN:R - CS:R -

2 661 Nam 1954 Đàm FT:R - IPM:S - MEC:S - NET:S -

PEF:R - PIP:R - S:I - SXT:R -

TCC:R - TE:R

AM:R - AMC:I - AN:S - ATM:R -

CAZ:I - CIP:I - CN:R - CS:S -

3 776 Nam 1966 Mủ FT:S - IPM:S - MEC:I - NET:S -

PEF:S - PIP:R - S:R - SXT:R -

TCC:R - TE:R

AM:R - AMC:I - AN:R - ATM:R -

CAZ:R - CIP:R - CN:R - CS:S -

4 815 Nam 1932 Đàm FT:R - IPM:S - MEC:R - NET:R -

PEF:R - PIP:R - S:R - SXT:R -

TCC:R - TE:R

AM:R - AMC:S - AN:I - CAZ:R -

CIP:I - CN:R - CS:S - FT:S - 5 1 Nam 2012 Nước tiểu GM:R - MEC:S - NET:R - PIP:R -

SXT:S - TE:S -

6 78 Nam 1939 Máu AM:R - AMC:S - AN:S - ATM:S -

CAZ:S - CIP:S - CN:I - CS:S -

FT:R - GM:S - IPM:S - MEC:S -

MEM:S - NET:S - PIP:R - SXT:S -

TCC:R - TE:S

AM:R - AMC:I - AN:R - ATM:R -

CAZ:R - CIP:R - CN:R - CS:S -

7 400 Nam 1960 Mủ FT:R - GM:R - IPM:S - MEC:R -

MEM:S - NET:R - PIP:R - SXT:R

- TE:R

AM:R - AMC:S - AN:S - CAZ:S -

CIP:S - CN:R - CS:S - FT:S - 8 796 Nam 1963 Đàm GM:S - MEC:R - NET:S - PIP:R -

SXT:R - TE:S

AM:R - AMC:S - AN:S - CAZ:S -

CIP:S - CN:S - CS:S - FT:S - 9 309 Nam 1992 Mủ GM:S - MEC:S - NET:S - PIP:I -

SXT:R - TE:S -

AM:R - AMC:S - AN:S - CAZ:S -

CIP:S - CN:S - CS:S - FT:R - 10 334 Nam 1983 Đàm GM:S - MEC:R - NET:S - PIP:S -

SXT:R - TE:S -

AM:R - AMC:S - AN:S - CAZ:S -

CIP:S - CN:S - CS:S - FT:S - 11 391 Nam 1938 Đàm GM:S - MEC:S - NET:S - PIP:S -

SXT:I - TE:S -

AM:S - AMC:S - AN:R - CAZ:S -

CIP:S - CN:S - CS:S - FT:R - 12 24 Nam 1977 Mủ GM:S - MEC:S - NET:S - PIP:S -

SXT:S - TE:S -

AM:R - AMC:R - AN:S - ATM:R -

CAZ:R - CIP:R - CN:R - CS:S -

13 268 Nam 1968 Mủ FT:R - GM:S - IPM:R - MEC:R -

MEM:R - NET:S - PIP:R - SXT:R

- TCC:R - TE:R -

AM:I - AMC:S - AN:S - CAZ:S -

CIP:S - CN:S - CS:S - FT:R - 14 363 Nam 1969 Nước tiểu GM:S - MEC:S - NET:S - PIP:S -

TE:S -

AM:R - AMC:S - AN:S - CAZ:S -

15 364 Nữ 1987 Nước tiểu CIP:S - CN:I - CS:S - FT:S - GM:S

- MEC:S - NET:S - PIP:S - TE:S -

AM:R - AMC:S - AN:S - CAZ:S -

CIP:S - CN:S - CS:S - FT:S - 16 452 Nam 1974 Nước tiểu GM:S - MEC:S - NET:S - PIP:S -

TE:S -

AM:R - AMC:R - AN:S - ATM:R -

CAZ:R - CIP:S - CN:R - CS:S -

17 508 Nam 1960 Mủ FT:R - GM:S - IPM:S - MEC:S -

MEM:S - NET:S - PIP:R - SXT:R -

TCC:R - TE:S -

AM: R - AMC: R - AN: R - CAZ:

R - CIP: R - CN: R - CS: S - FT: R 18 510 Nữ 1942 Máu - GM: R - MEC: R - NET: R -

PIP: R - SXT: R - TE: R

AM:R - AMC:R - AN:S - ATM:R -

CAZ:R - CIP:S - CN:R - CS:S - 19 521 Nam 1960 Mủ FT:R - GM:S - IPM:S - MEC:S -

MEM:I - NET:S - PIP:R - SXT:R -

TCC:R - TE:S -

AM: R - AMC: R - AN: R - ATM:

R - CAZ: R - CIP: R - CN: R - CS:

20 675 Nữ 1942 Mủ S - FT: R - GM: R - IPM: S -

MEC: R - MEM: S - NET: R - PIP:

R - SXT: R - TCC: R - TE: R

AM: R - AN: R - ATM: R - CAZ:

R - CIP: R - CN: R - CS: S - FT: R

21 721 Nam 1948 Đàm - GM: R - IPM: S - MEC: R -

MEM: S - NET: R - PIP: R - TCC:

R - TE: S

AM: R - AMC: R - AN: S - CAZ:

R - CIP: S - CN: R - CS: S - FT: S 22 824 Nam 2013 Nước tiểu - GM: S - MEC: S - NET: S - PIP:

R - SXT: R - TE: S

AM: R - AMC: S - AN: S - CAZ: S

- CIP: S - CN: S - CS: S - FT: S - 23 189 Nam 1955 Đàm GM: S - MEC: S - NET: S - PIP: S

- SXT: S - TE: S

AM: R - AMC: I - AN: S - ATM: I

- CAZ: S - CIP: R - CN: R - CS: S

24 982 Nam 1930 Đàm - FT: S - GM: S - IPM: S - MEC: S

- MEM: S - NET: S - PIP: R -

TCC: R - TE: R

AM: R - AMC: S - AN: S - ATM:

R - CAZ: R - CIP: S - CN: R - CS:

25 19 Nữ 1954 Đàm S - FT: S - GM: S - IPM: S - MEC:

R - MEM: S - NET: R - PIP: R -

TCC: R - TE: S

AM: R - AMC: R - AN: R - ATM:

R - CAZ: R - CIP: R - CN: R - CS:

26 80 Nam 1982 Đàm S - FT: R - GM: R - IPM: S -

MEC: R - MEM: S - NET: R - PIP:

R - TCC: R - TE: R

AM: R - AMC: S - AN: S - CAZ: S

- CIP: S - CN: S - CS: S - FT: R - 27 513 Nam 1971 Nước tiểu MEC: R - NET: S - PIP: S - S: S -

SXT: R - TE: S

AM: R - AMC: S - AN: S - CAZ: S

- CIP: S - CN: S - CS: S - FT: R - 28 784 Nữ 1974 Đàm GM: S - MEC: I - NET: S - PIP: S

- SXT: R - TE: S

AM: R - AMC: R - AN: S - ATM:

R - CAZ: R - CIP: R - CN: R - CS:

29 637 Nam 1979 Mủ S - FT: S - GM: R - IPM: S - MEC:

R - MEM: S - NET: S - PIP: R -

SXT: R - TCC: R - TE: R

AM: R - AMC: I - AN: R - ATM:

R - CAZ: R - CIP: R - CN: R - CS:

30 812 Nam 1962 Mủ S - FT: I - IPM: S - MEC: R -

MEM: S - NET: R - PIP: R - S: R -

SXT: R - TCC: R - TE: R

AM: R - AMC: R - AN: S - CAZ:

R - CIP: S - CN: R - CS: S - FT: S 31 14 Nữ 1991 Mủ - MEC: S - NET: S - PIP: I - S: S -

SXT: R - TE: R

AM: R - AMC: S - AN: S - CAZ: 32 130 Nữ 1934 Nước tiểu R - CIP: R - CN: R - CS: S - FT: S

- MEC: S - NET: S - PIP: R - S: S -

SXT: R - TE: S

AM: R - AMC: S - AN: S - CAZ: S

- CIP: S - CN: S - CS: S - FT: S - 33 208 Nam 1963 Mủ MEC: S - NET: S - PIP: S - S: S -

SXT: R - TE: S

AM: R - AMC: R - AN: S - CAZ:

R - CIP: R - CN: R - CS: S - FT: S 34 217 Nữ 1945 Nước tiểu - MEC: R - NET: S - PIP: R - S: S

- SXT: R - TE: R

AM: R - AMC: R - AN: S - CAZ:

R - CIP: R - CN: R - CS: S - FT: R 35 274 Nữ 1945 Nước tiểu - MEC: I - NET: S - PIP: R - S: S -

SXT: R - TE: I

PHỤ LỤC 6

Kết quả 35 chủng Klebsiella pneumoniae được khảo sát khả năng sinh ESBL

Bảng. Kết quả khả năng sinh ESBL của 35 chủng Klebsiella pneumoniae

Bệnh Lab code ESBL phẩm STT

Đàm 278 - 1

Đàm 661 + 2

Mủ 776 + 3

Đàm 815 + 4

Nước tiểu 1 + 5

Máu 78 + 6

Mủ 400 + 7

Đàm 796 + 8

Mủ 309 + 9

Đàm 334 - 10

Đàm 391 + 11

Mủ 24 + 12

Mủ 268 + 13

Nước tiểu 363 - 14

Nước tiểu 364 - 15

Nước tiểu 452 + 16

Mủ 508 + 17

Máu 510 + 18

Mủ 521 + 19

Mủ 675 + 20

Đàm 721 + 21

Nước tiểu 824 + 22

Đàm 189 - 23

Đàm 982 + 24

Đàm 19 - 25

Đàm 80 + 26

Nước tiểu 513 - 27

Đàm 784 - 28

Mủ 637 - 29

Mủ 812 - 30

Mủ 14 + 31

Nước tiểu 130 + 32

Mủ 208 - 33

Nước tiểu 217 + 34

Nước tiểu 274 - 35

PHỤ LỤC 7

Kết quả 35 chủng Klebsiella pneumoniae được khảo sát sinh carbapenemase

Bảng. Kết quả sinh carbapenemase của 35 chủng Klebsiella pneumoniae

STT Lab code Bệnh phẩm ESBL Hodge test

Đàm - 1 278 -

Đàm + 2 661 +

Mủ + 3 776 -

Đàm + 4 815 +

Nước tiểu + 5 1 -

Máu + 6 78 -

Mủ + 7 400 -

Đàm + 8 796 +

Mủ + 9 309 -

Đàm - 10 334 -

Đàm + 11 391 -

Mủ + 12 24 -

Mủ + 13 268 +

Nước tiểu - 14 363 -

Nước tiểu - 15 364 -

Nước tiểu + 16 452 -

Mủ + 17 508 -

Máu + 18 510 -

Mủ + 19 521 +

Mủ + 20 675 +

Đàm + 21 721 -

Nước tiểu + 22 824 -

Đàm - 23 189 -

Đàm + 24 982 -

Đàm - 25 19 -

Đàm + 26 80 +

Nước tiểu - 27 513 -

Đàm - 28 784 -

Mủ - 29 637 -

Mủ - 30 812 -

Mủ + 31 14 -

Nước tiểu + 32 130 -

Mủ - 33 208 -

Nước tiểu + 34 217 -

Nước tiểu - 35 274 -

PHỤ LỤC 8

Kết quả phát hiện gen kháng kháng sinh của 35 chủng Klebsiella pneumoniae

Stt Mã PXN CMY OXA NDM IMP Ghi chú

- - - 1 278 +

- - - 2 661 +

- - 3 776 + +

- - - 4 815 +

- - - 5 1 +

- - - 6 78 +

- - - 7 400 +

- - - - 8 796

- - - - 9 309

- - - 10 334 +

- - - 11 391 +

- - - 12 24 +

13 268 + + + +

- - - - 14 363

- - - 15 364 +

- - - 16 452 +

- + + - 17 508

+ - + - 18 501

+ + + - 19 521

+ + - - 20 675

+ + - - 21 721

+ + - - 22 824

+ - - - 23 189

+ - - - 24 982

+ - - - 25 19

+ + - - 26 80

- 513 + - - 27

- 784 + - - 28

- 637 + - - 29

- 812 + - - 30

- 14 + - - 31

+ 130 - - - 32

- 208 + - - 33

+ 217 - + - 34

- 274 + + - 35

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella Pneumoniae tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Hoài An

KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH

CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE

TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Hoài An

KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH

CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE

TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. CAO HỮU NGHĨA

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014

Hình 1.1. Klebsiella pneumoniae

- Thiết bị dùng trong phân lập, nuôi cấy, định danh vi khuẩn, thử nghiệm

đĩa đôi, Hodge test

- Thiết bị dùng trong tách chiết ADN và PCR

- Hóa chất cho định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ

- Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm đĩa đôi

- Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm Hodge test

Sơ đồ 2.1. Phương pháp nghiên cứu sự kháng kháng sinh của K. pneumoniae

PHỤ LỤC 5

PHỤ LỤC 7

PHỤ LỤC 8

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sử dụng thông tin di truyền trên vùng gen ITS DNA trong định loại các mẫu sâm (Panax L.) thu thập ở tỉnh Hà Giang

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng