Khảo sát quy trình chuỗi Polymerase (PCR) phát hiện một số loài Lactobacillus trong thực phẩm chức năng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHUỖI POLYMERASE (PCR) PHÁT HIỆN MỘT<br /> SỐ LOÀI LACTOBACILLUS TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG<br /> Lê Thị Hiên*, Trần Nguyễn Minh Đoan*<br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Probiotic là những vi sinh vật có lợi, được bổ sung trong nhiều sản phẩm thực phẩm chức<br /> năng – trong đó Lactobacillus là nhóm chủ yếu trong số các vi khuẩn probiotic. Các nhà sản xuất thường công bố<br /> tên loài vi khuẩn Lactobacillus trên bao bì nhằm tăng giá trị của sản phẩm. Hiện nay, các phương pháp truyền<br /> thống để xác định loài Lactobacillus còn hạn chế và phương pháp dựa trên sinh học phân tử được xem là giải<br /> pháp tiềm năng. Để có được phương pháp hiệu quả nhằm thực hiện chức năng giám sát sản phẩm thực phẩm<br /> chức năng được Bộ Y tế giao phó, đồng thời đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm của khách hàng, chúng tôi thực hiện<br /> đề tài này nhằm xây dựng phương pháp định danh một số loài Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức<br /> năng bằng kỹ thuật PCR.<br /> Mục tiêu: Khảo sát và lựa chọn quy trình phát hiện 9 loài Lactobacillus trong thực phẩm chức năng bằng<br /> phương pháp PCR có thể áp dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật – Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Thực<br /> phẩm Khu vực phía Nam, Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Lựa chọn quy trình tách chiết DNA; khảo sát độ đặc hiệu của mồi; tối ưu hóa<br /> điều kiện phản ứng PCR; khảo sát mức phát hiện LOD50 của phương pháp; ứng dụng quy trình phân tích một số<br /> mẫu thực tế.<br /> Kết quả: Chúng tôi đã lựa chọn được 9 cặp mồi đặc hiệu cho 9 loài vi khuẩn Lactobacillus, bao gồm: L.<br /> acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. reuteri, L. pentosus, L. fermentum và L. sakei.<br /> Mức phát hiện LOD50 của các phương pháp này đều ở mức thấp (dưới 3 CFU/g): thấp nhất 0,7 CFU L.<br /> acidophilus /g và cao nhất 2,5 CFU L. sakei /g trong nền mẫu thực phẩm chức năng dạng lỏng; thấp nhất 0,8<br /> CFU L. reuteri /g đến cao nhất 2,7 CFU L. sakei /g đối với mẫu thực phẩm chức năng dạng bột. Phương pháp có<br /> độ chọn lọc tốt, chỉ phát hiện đặc hiệu đúng chủng mục tiêu.<br /> Kết luận: Quy trình bước đầu có thể đưa vào áp dụng để phát hiện 9 loài vi khuẩn Lactobacillus trong thực<br /> phẩm chức năng.<br /> Từ khóa: phản ứng PCR, probiotic<br /> ABSTRACT<br /> SURVEYING POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) METHOD<br /> TO DETECT SOME LACTOBACILLUS SPECIES IN FUNCTIONAL FOOD<br /> Le Thi Hien, Tran Nguyen Minh Doan<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 5 - 2019: 429 – 437<br /> Background: Probiotics are live microorganisms that benefit the host's health. Most of the probiotics in<br /> many functional food products are lactobacilli. These bacteria are labeled to increase the value of the product.<br /> Currently, traditional methods to identify Lactobacillus species are limited and methods based on molecular<br /> biology are considered potential solutions. In order to have an effective method to perform the monitoring<br /> functional food products follow requirements of the Ministry of Health and at the same time to meet the testing<br /> needs of customers, we implemented this study to develop the rapid method for identification some common<br /> *Viện Y Tế Công Cộng TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Lê Thị Hiên ĐT: 0938640803 Email: lethihien@iph.org.vn<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 429<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019<br /> <br /> Lactobacillus species used in functional foods by PCR technique.<br /> Objectives: Assess and select PCR method to detect 9 Lactobacillus species in functional foods that can be<br /> applied in microbiology laboratory of The Southern Regional Centre of Food Safety, Institute of Public Health, Ho<br /> Chi Minh City.<br /> Methods: Select the DNA extraction procedures; assess the primers’ specificity; optimize PCR conditions;<br /> survey the detection level 50 (LOD50) of the method; apply PCR method to analyse samples.<br /> Results: 9 specific primer pairs were selected for 9 Lactobacillus species, including: L. acidophilus, L.<br /> rhamnosus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. reuteri, L. pentosus, L. fermentum and L. sakei. The detection<br /> level (LOD50) of these methods was low (below 3 CFU / g): range from 0.7 CFU L. acidophilus / g to 2.5 CFU L.<br /> sakei / g in the background of liquid functional food and from 0.8 CFU L. reuteri/g to 2.7 CFU L. sakei/g for<br /> powdered functional food. The PCR methods had good selectivity, and could be applied on actual samples.<br /> Conclusions: The methods can be applied to detect these Lactobacillus species in functional foods in our<br /> microbiological laboratory.<br /> Keywords: polymerase chain reaction, probiotics<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, có 3 nhóm kỹ thuật chính để xác<br /> định loài Lactobacillus. Các phương pháp vi sinh<br /> Probiotic là những vi sinh vật còn sống khi<br /> truyền thống dù được xem là tiêu chuẩn vàng,<br /> đưa vào cơ thể một lượng vừa đủ sẽ mang lại lợi<br /> nhưng số lượng loài vi khuẩn Lactobacillus có thể<br /> ích cho sức khỏe của vật chủ(6). Vì những lợi ích<br /> xác định được còn hạn chế. Các phương pháp<br /> mà probiotic mang lại cũng như sự tự do lựa<br /> dựa trên proteomics lại phát triển trên các thiết<br /> chọn sử dụng của người tiêu dùng nên tình hình<br /> bị, máy móc kỹ thuật cao và đắt tiền. Vì thế, các<br /> sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm probiotic gia<br /> phương pháp định danh ở cấp độ loài dựa trên<br /> tăng không ngừng. Doanh số bán các sản phẩm<br /> kiểu gen được khuyến cáo đưa vào ứng dụng<br /> probiotic có xu hướng gia tăng trên phạm vi<br /> nhiều hơn vì chúng cho kết quả nhanh và chính<br /> toàn cầu với tỷ lệ 35%: từ 23,1 tỷ đô la Mỹ (năm<br /> xác hơn - trong số đó, phương pháp PCR là<br /> 2010) lên 31,3 tỷ đô la Mỹ (năm 2014)(12).<br /> phương pháp tương đối đơn giản và phù hợp<br /> Lactobacillus là nhóm chủ yếu trong số các vi<br /> với điều kiện của phòng thí nghiệm vi sinh vật.<br /> khuẩn probiotic, được bổ sung vào các sản phẩm<br /> Để có được phương pháp hữu hiệu nhằm<br /> thực phẩm chức năng. Tuy nhiên, trước khi<br /> thực hiện chức năng giám sát sản phẩm thực<br /> được cho phép bổ sung vào trong thực phẩm<br /> phẩm chức năng cũng như đáp ứng nhu cầu<br /> như một probiotic, các chủng vi khuẩn<br /> kiểm nghiệm của khách hàng, chúng tôi thực<br /> Lactobacillus cần phải được nghiên cứu và chứng<br /> hiện đề tài này nhằm xây dựng phương pháp<br /> minh khả năng mang lại lợi ích cho sức khỏe<br /> định danh một số loài Lactobacillus thường gặp<br /> cũng như an toàn cho con người(7). Vì thế, chỉ có<br /> trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật PCR.<br /> 1 số ít loài Lactobacillus được xem là vi khuẩn<br /> probiotic và được phép đưa vào sử dụng cho Mục tiêu nghiên cứu<br /> con người. Hiện nay, trên thị trường Việt Nam, Khảo sát quy trình xác định 9 loài vi khuẩn<br /> có hơn 15 sản phẩm thực phẩm chức năng được Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức<br /> dán nhãn bổ sung các loài Lactobacillus. Tuy năng: L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei,<br /> nhiên, thông tin này cần được giám sát và kiểm L. plantarum, L. bulgaricus, L. reuteri, L. pentosus,<br /> tra bởi các cơ quan chức năng – trong đó, Viện Y L. fermentum và L. sakei thông qua việc lựa chọn<br /> tế công cộng Thành phố Hồ Chí Minh đóng vai mồi đặc hiệu, quy trình tách chiết DNA và tối ưu<br /> trò không nhỏ. hóa điều kiện phản ứng PCR.<br /> <br /> <br /> <br /> 430 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Khảo sát mức phát hiện LOD50 và độ chọn Phương pháp nghiên cứu<br /> lọc của quy trình. Tách chiết DNA vi khuẩn<br /> Ứng dụng quy trình để kiểm tra một số mẫu Thực hiện trên 3 quy trình:<br /> thực phẩm chức năng trên thị trường.<br /> Phương pháp tách chiết bằng nhiệt<br /> ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Ly tâm 1ml dịch nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn<br /> Đối tượng nghiên cứu ở 10.000g/ 5 phút/ 20- 250C.<br /> Nghiên cứu này tiến hành trên các chủng vi Sau khi ly tâm, đổ bỏ dịch nổi và rửa sinh<br /> khuẩn Lactobacillus mục tiêu và chủng không khối trong 1mL NaCl 0,85%. Vortex hỗn dịch và<br /> mục tiêu được liệt kê trong bảng 1. Chủng vi ly tâm ở 10.000g/10 phút ở 20 – 250C.<br /> khuẩn L. reuteri và L. pentosus phân lập từ thực Loại bỏ dịch nổi và huyền phù sinh khối<br /> phẩm chức năng và đã được tiến hành định trong 0,5ml TE 1X. Đun sôi 95oC/15 phút, sau đó<br /> danh theo phương pháp PCR - giải trình tự. đặt ống trong đá 5 phút. Ly tâm 10.000g/5<br /> Bảng 1: Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong phút/200C - 250C.<br /> nghiên cứu Chuyển 400µl dịch nổi chứa DNA vi khuẩn<br /> Chủng vi sinh vật không sang tube 1,5 ml mới. DNA vi khuẩn được bảo<br /> Chủng vi sinh vật mục tiêu<br /> mục tiêu<br /> Lactobacillus fermentum Lactobacillus quản ở -200C.<br /> ATCC 9338 brevis ATCC 14869 Phương pháp tách chiết A<br /> Lactobacillus casei ATCC Lactobacillus paracasei subsp.<br /> 334 paracasei ATCC BAA-52 Phương pháp này được điều chỉnh lại quy<br /> Lactobacillus plantarum Lactococcus lactis ATCC trình của tác giả Alimolaei M và cộng sự(1).<br /> ATCC 8014 19435 Trong đó, chúng tôi loại bỏ bước bổ sung<br /> Lactobacillus rhamnosus Bifidobacterium bifidum ATCC<br /> ATCC 53103 29521<br /> RNase A để xây dựng quy trình tách chiết A<br /> Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium animalis cho phòng thí nghiệm.<br /> ATCC 4356 subsp. lactis ATCC 25527<br /> Phương pháp tách chiết bằng bộ kit Wizard®<br /> Lactobacillus delbrueckii ssp. Bifidobacterium breve ATCC<br /> bulgaricus ATCC 11842 15700 Genomic DNA Purification (Promega, nước sản xuất)<br /> Lactobacillus sakei ssp. sakei Bacillus cereus ATCC 10876 Huyền dịch sau tách chiết được đo độ hấp<br /> ATCC 15521 thụ ánh sáng với máy đo OD (Quawell Q5000,<br /> Lactobacillus reuteri Bacillus subtilis ATCC 6633<br /> Mỹ) tại các bước sóng 230, 260, 280 nm, thu được<br /> Lactobacillus pentosus Escherichia coli ATCC 11775<br /> Staphylococcus aureus ATCC các giá trị A230, A260, A280. DNA được đánh giá<br /> 25923 tinh sạch khi có tỷ số A260/A280 thuộc khoảng 1,8 –<br /> Listeria monocytogenes ATCC 2,0 và tỷ số A260/A230 tốt nhất nếu lớn hơn 1,5.<br /> 19115<br /> Salmonella Typhimurium Lựa chọn mồi<br /> ATCC 13311 Tham khảo một số nghiên cứu đã công bố<br /> Shigella sonnei ATCC 9290<br /> trước đó về quy trình PCR phát hiện một số vi<br /> Pseudomonas aeruginosa<br /> ATCC 27853 khuẩn Lactobacillus trong thực phẩm (liệt kê<br /> Vibrio parahaemolyticus trong Bảng 2).<br /> ATCC 1780<br /> Các trình tự mồi đã được kiểm tra mô hình<br /> Enterococcus faecalis ATCC<br /> 29212 bằng chương trình BLAST trên NCBI. Các mồi<br /> Cronobacter sakazakii BCRC phù hợp được chọn và đưa vào trong nghiên cứu.<br /> 13988<br /> Bảng 2: Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR được sử dụng trong nghiên cứu<br /> Tham<br /> Mục tiêu Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chu trình nhiệt Sản phẩm (bp)<br /> khảo<br /> (8)<br /> Lactobacillus LacF AGCAGTAGGGAATCTTCCA 94°C/2p, 25 x (94°C/15s, 345<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 431<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019<br /> <br /> Tham<br /> Mục tiêu Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chu trình nhiệt Sản phẩm (bp)<br /> khảo<br /> spp. LacR ATTTCACCGCTACACATG 51°C/15s, 72°C/30s), 72°C/5p<br /> o o (5)<br /> casei-F TTATCATGTGGCCGAACAAA 98 C/30s, 35x (98 C/30s, 858<br /> L. casei 60<br /> o<br /> C/30s, 72<br /> o<br /> C/30s);<br /> o<br /> 72 C/5p<br /> casei-R GTTTGCGTCAAAGTCTGCAA<br /> o o (14)<br /> pentF CAGTGGCGCGGTTGATATC 94 C/1p, 30 x (94 C/1p, 219<br /> L. pentosus o o o<br /> 55 C/30s, 72 C/1p); 72 C/5p<br /> pREV TCAGGGTTTCCAAACATCAC<br /> o o (10)<br /> L. delbrueckii 16SbulF AACATGAATCGCATGATTCAAGTTTG 95 C/5p, 25 x (95 C/20s, 675<br /> o o o<br /> sp. bulgaricus 16SbulR ACCGGAAAGTCCCCAACACCTA 62 C/30s, 72 C/1p); 72 C/5p<br /> o o (11)<br /> Laci-F TGCAAAGTGGTAGCGTAAGC 95 C/4p; 35 x (95 C/20s; 207<br /> L. acidophilus o o o<br /> 62 C/30s; 72 C/30s); 72 C/5p<br /> Laci-R CCTTTCCCTCACGGTACTG<br /> o o (11)<br /> Lreu-F CAGACAATCTTTGATTGTTTAG 95 C/4p; 35 x (95 C/20s; 305<br /> L. reuteri o o o<br /> 60 C/30s; 72 C/30s); 72 C/5p<br /> Lreu-R GCTTGTTGGTTTGGGCTCTTC<br /> o o (11)<br /> Lpla-F ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT 95 C/4p; 35 x (95 C/20s; 248<br /> L. plantarum 60<br /> o<br /> C/30s; 72<br /> o<br /> C/30s);<br /> o<br /> 72 C/5p<br /> Lpla-R CCTGAACTGAGAGAATTTGA<br /> o o (11)<br /> Lrha-F CTAGCGGGTGCGACTTTGTT 95 C/4p; 35 x (95 C/ 20s; 113<br /> L. rhamnosus o o o<br /> 62 C/30s; 72 C/30s); 72 C/5p<br /> Lrha-R GCGATGCGAATTTCTATTATT<br /> o o (11)<br /> Lfer-F ACTAACTTGACTGATCTACGA 95 C/4p; 35 x (95 C/20s; 191<br /> L. fermentum 60<br /> o<br /> C/30s; 72<br /> o<br /> C/30s);<br /> o<br /> 72 C/5p<br /> Lfer-R TTCACTGCTCAAGTAATCATC<br /> o o (3)<br /> 94 C/5p; 35 x (95 C/ 20s; 433<br /> L. sakei sakeiF GAGCTTGCTCCTCATTGATAA o o o<br /> 58 C/30s; 72 C/ 30s); 72 C/ 5p<br /> sakeiR TTGGATACCGTCACTACCTG<br /> Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi (Takara, Nhật) với thành phần bao gồm 1X<br /> Takara PCR buffer, 0,2 mM dNTP mỗi loại, 0,4U<br /> Nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn<br /> Hot Start Taq Polymerase, 0,5 µM mồi, 10 - 50ng<br /> Các chủng vi khuẩn Lactobacillus và<br /> DNA khuôn, nồng độ MgCl2 được thay đổi từ<br /> Bifidobacterium sp. được nuôi trong môi trường<br /> 1,5 - 5,5 mM; nhiệt độ bắt cặp thay đổi trong<br /> canh thang De Man Rogosa Sharpe (MRS, Merck<br /> khoảng ± 5oC.<br /> - Đức) ở 37oC trong 48 giờ ở điều kiện kỵ khí.<br /> Khảo sát một số thông số của quy trình<br /> Chủng vi khuẩn khác được nuôi cấy trên<br /> môi trường thạch dinh dưỡng được nuôi cấy Xác định mức phát hiện LOD50<br /> trên môi trường Tryptic Soy Broth (TSB, Merck - Với nền mẫu này, chúng tôi lựa chọn 2 loại<br /> Đức) ở 37oC trong 24 giờ. mẫu khác nhau: thực phẩm chức năng dạng bột<br /> Phản ứng PCR và diễn giải kết quả và dạng lỏng. Các mẫu thực phẩm chức năng đã<br /> được kiểm tra trước cho thấy không có bổ sung<br /> Mỗi chủng được tiến hành phân tích một lần<br /> vi khuẩn Lactobacillus.<br /> theo quy trình nhiệt được trình bày trong bảng 2.<br /> Thành phần các phản ứng PCR bao gồm: 1X G2 Chuẩn bị 50 mẫu trắng. Mỗi mẫu được tiến<br /> Green GoTaq buffer, 0,5 µM mồi, 10 – 50ng hành cân 1g (hoặc 1mL) mẫu vào ống nghiệm<br /> DNA khuôn. PCR được tiến hành trên máy luân chứa 9 mL dung dịch canh thang MRS. Chuẩn bị<br /> nhiệt Eppendorf Nexus. Sau đó, sản phẩm PCR huyền dịch các chủng vi khuẩn ở 4 mức bậc 2: 20,<br /> được điện di trên gel agarose 2%, chạy ở điện thế 2-1, 2-2, 2-3. Tiến hành nhiễm 1 mL từ các ống<br /> 100V trong 35 phút; cuối cùng, gel được nhuộm chủng này vào huyền dịch mẫu (1g mẫu + 9ml<br /> với thuốc nhuộm Diamond Nucleic Acid Dye canh thang MRS). Mức nhiễm 0 CFU và 101 CFU:<br /> (Promega) và quan sát dưới đèn UV. Các phản mỗi mức được tiến hành trên 5 mẫu; 3 mức<br /> ứng PCR cho kết quả vạch điện di không rõ<br /> nhiễm còn lại: mỗi mức được tiến hành trên 10<br /> ràng, có sản phẩm phụ hoặc không đặc hiệu sẽ<br /> mẫu. Lượng vi khuẩn bổ sung sẽ đồng thời được<br /> được tiến hành tối ưu hóa bằng cách thay đổi 2<br /> trải 1ml trên đĩa thạch MRS. Các mẫu được phân<br /> thông số sau với Hot-start Taq polymerase<br /> <br /> <br /> 432 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> tích theo quy trình. LOD50 được tính theo Chúng tôi tiến hành thu thập 20 mẫu thực<br /> phương pháp Spearman-Karber(9). phẩm chức năng (2 mẫu ở dạng lỏng và 18<br /> Xác định độ chọn lọc mẫu ở dạng bột) được bán tại các nhà thuốc tại<br /> TP. Hồ Chí Minh, ghi nhận thông tin bao bì và<br /> Độ chọn lọc của phương pháp thể hiện qua<br /> tiến hành phân tích theo quy trình đang khảo sát.<br /> tính chọn lọc bao hàm và chọn lọc loại trừ. Các<br /> chủng vi khuẩn mục tiêu được chuẩn bị với KẾT QUẢ<br /> lượng gấp 10 lần mức phát hiện trong 1 ml Lựa chọn quy trình tách chiết DNA<br /> huyền dịch mẫu. Chọn các chủng vi khuẩn Bước đầu tiên trong nghiên cứu và phân tích<br /> không mục tiêu thường được bổ sung trong thực về mặt di truyền từ bất kỳ sinh vật nào là quá<br /> phẩm chức năng có khả năng gây phản ứng trình tách chiết và tinh sạch DNA chất lượng.<br /> chéo với chủng mục tiêu. Các chủng này được Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn lựa<br /> chuẩn bị với lượng gấp 100 lần mức phát hiện chọn một phương pháp tách chiết phù hợp cho<br /> trong 1 ml huyền dịch. Bổ sung 1 ml huyền dịch phân tích PCR từ vi khuẩn Lactobacillus. Từ cùng<br /> vi khuẩn được cho vào 9 ml canh thang MRS, 1 dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sau 48 giờ,<br /> đồng thời được trải và kiểm tra trên đĩa thạch chúng tôi tiến hành tách chiết theo 3 phương<br /> không chọn lọc thích hợp. Mẫu sẽ được tiến pháp: nhiệt, quy trình A và bộ kit Promega.<br /> hành phân tích 1 lần theo quy trình nghiên cứu<br /> Để đánh giá hiệu quả của các phương pháp<br /> và ghi nhận kết quả.<br /> tách chiết, các tỷ số độ hấp thụ A260/A280, A260/A230<br /> Áp dụng quy trình để phân tích trên một số và nồng độ DNA của dịch sau tách chiết được so<br /> mẫu thực phẩm chức năng thực tế sánh với nhau, kết quả được thể hiện ở Bảng 3.<br /> Bảng 3: So sánh kết quả tách chiết DNA từ 3 phương pháp khác nhau<br /> STT Chủng vi khuẩn A260/A280 A260/A230 [DNA] (ng/µl)<br /> Nhiệt A Kit Nhiệt A Kit Nhiệt A Kit<br /> 1 L. acidophilus 1,58 2,18 1,86 0,95 1,83 1,84 143,6 459,5 323,0<br /> 2 L. rhamnosus 1,56 2,25 2,00 1,15 2,14 2,30 279,8 599,7 369,1<br /> 3 L. bulgaricus 1,45 2,11 2,34 0,88 1,88 1,79 122,6 547,4 368,0<br /> 4 L. casei 1,60 2,12 1,98 1,04 1,94 2,19 199,9 227,2 348,8<br /> 5 L. fermentum 1,57 2,22 1,83 0,90 1,99 1,87 190,4 503,2 236,0<br /> 6 L. plantarum 1,58 2,23 2,02 1,13 2,07 2,26 263,8 429,5 349,7<br /> 7 L. pentosus 1,39 2,20 2,14 0,93 2,03 2,23 105,2 601,2 353,7<br /> 8 L. reuteri 1,46 2,23 2,05 0,80 2,30 2,15 177,4 516,3 402,0<br /> 9 L. brevis 1,69 1,79 2,48 0,80 1,76 1,89 91,8 138,4 156,5<br /> 10 L. sakei 1,46 2,30 1,76 0,94 1,83 1,69 87,1 190,8 156,0<br /> Trung bình 1,53 2,16 2,05 0,95 1,98 2,02 166,16 421,32 306,28<br /> Phương pháp tách chiết bằng nhiệt cho sản cho các loài vi khuẩn này(2,4). Tham khảo nhiều<br /> phẩm sau tách chiết có tỷ lệ A260/A280, A260/A230 và công bố trước, dựa trên kết quả kiểm tra bằng<br /> hàm lượng DNA thấp nhất; trong khi 2 phương chương trình BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),<br /> pháp tách chiết theo quy trình A (thay đổi từ chúng tôi lựa chọn 9 cặp mồi cho 9 loài vi khuẩn<br /> quy trình của tác giả Alimolaei M và cộng sự (1)) Lactobacillus, với trình tự được liệt kê trong Bảng<br /> và tách chiết bằng bộ kit Wizard® Genomic 2. Cặp mồi này giúp khuếch đại gen mục tiêu<br /> DNA Purification (Promega, Mỹ) cho các tỷ lệ khác nhau, bao gồm vùng trình tự giữa gen mã<br /> xấp xủ bằng nhau. hóa cho 16S RNA và 23S RNA (gọi là 16S-23S<br /> Khảo sát độ đặc hiệu của mồi ISR), hoặc các gen giữ nhà (“house-keeping<br /> gene”) như recA, polA. Khi tiến hành phản ứng<br /> Để phát hiện các loài Lactobacillus khác nhau,<br /> PCR trên 25 chủng vi khuẩn không mục tiêu, kết<br /> một số tác giả đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 433<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019<br /> <br /> quả cho thấy các cặp mồi này chỉ cho kết quả đặc 1 là kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ<br /> hiệu cho vi khuẩn mục tiêu, đồng thời không đặc hiệu mồi phát hiện L. fermentum (Hình 1).<br /> cho sản phẩm trên chủng không mục tiêu. Hình<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 500 bp<br /> 191 bp<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi Lfer-F và Lfer-F phát hiện L. fermentum<br /> Giếng 1: L. acidophilus; 2: L. bulgaricus; 3: L. casei; 4: L. fermentum; 5: L. brevis; 6: L. pentosus; 7: L. plantarum; 8: L.<br /> reuteri; 9: L. rhamnosus; 10: L. sakei; 11: L. paracasei; 12: Lc. lactis; 13: E. coli; 14: S. aureus; 15: B. cereus; 16: B. subtilis; 17:<br /> S. Typhimurium; 18: Shi. sonnei; 19: P. aeruginosa; 20: En. faecalis; 21: S. thermophilus; 22: B. animalis; 23: B. lactis; 24: B.<br /> breve; 25: B. bifidum; 26: Chứng âm; Lad: Thang DNA 100bp.<br /> Tối ưu hóa quy trình phát hiện L. reuteri Kết quả khảo sát cho thấy khi sử dụng<br /> 500 bp pháp Hot start PCR với nồng độ magie<br /> phương<br /> Khi áp dụng quy trình phát hiện vi khuẩn<br /> L .reuteri, chúng tôi nhận thấy xuất hiện vạch thay đổi từ 1,5 mM đến 5,5 mM để phát hiện L.<br /> sản phẩm phụ trên gel điện di bên cạnh sản reuteri với sản phẩm có kích thước 305bp thì<br /> phẩm chính (305 bp). Vì vậy, để phương pháp lượng sản phẩm phụ giảm dần (Hình 2). Phản<br /> đạt được hiệu quả tốt, chúng tôi tiến hành tối ưu ứng đạt điều kiện tối ưu ở 4,5mM Mg2+ với bộ kit<br /> hóa phản ứng PCR này. Phương pháp Hot-start Hot start PCR (Takara). Kết quả PCR khi thay<br /> b)<br /> PCR có thể ngăn chặn sự kéo dài của DNA đổi nhiệt độ bắt cặp của phản ứng này không<br /> polymerase ở nhiệt độ thấp hơn, giảm các sản cho thấy có sự khác biệt.<br /> phẩm phụ không mong muốn. Thay đổi nồng Khảo sát một số thông số của quy trình<br /> độ magie cũng là một trong những cách thức Mức phát hiện<br /> đơn giản nhất để tối ưu hóa điều kiện phản ứng<br /> Bảng 4: Kết quả xác định mức phát hiện LOD50 của<br /> do tác động dễ thấy nhất lên tính nghiêm ngặt<br /> phương pháp trên nền mẫu thực phẩm chức năng<br /> của phản ứng PCR.<br /> (Đơn vị: CFU/ g hoặc mL)<br /> Thực phẩm chức Thực phẩm chức<br /> STT Vi khuẩn<br /> năng dạng lỏng năng dạng bột<br /> 1 L. acidophilus 0,7 1,3<br /> 2 L. bulgaricus 1,3 1,5<br /> 3 L. casei 1,0 1,2<br /> 4 L. fermentum 1,1 1,1<br /> 5 500bp<br /> L. plantarum 1,8 1,4<br /> 6 L. pentosus 1,5 1,1<br /> 7 L. reuteri 1,0 0,8<br /> 8 L. rhamnosus 1,9 1,0<br /> Hình 2: Kết quả thay đổi nồng độ MgCl2 để tối ưu 9 L. sakei 2,5 2,7<br /> hóa điều kiện phản ứng phát hiện L. reuteri. NC: Kết quả xác định mức phát hiện LOD50 của<br /> chứng âm, số ghi trên mỗi giếng là nồng độ MgCl2 phương pháp chúng tôi nghiên cứu trên 9 loài<br /> (tăng dần từ 1,5 - 5,5 mM). Lad: thang DNA 100bp vi khuẩn Lactobacillus khác nhau được thể hiện<br /> <br /> <br /> 434 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> trong Bảng 4. không phát hiện đối với các chủng vi khuẩn<br /> Xác định độ chọn lọc không mục tiêu. Theo đó, các quy trình đều cho<br /> thấy có độ chọn lọc tốt: chỉ cho kết quả dương<br /> tính trên chủng vi khuẩn mục tiêu và âm tính<br /> trên chủng vi khuẩn không mục tiêu (Hình 3).<br /> Ứng dụng quy trình trên mẫu thực tế<br /> Chúng tôi thu thập ngẫu nhiên 20 mẫu thực<br /> phẩm chức năng có bổ sung vi khuẩn<br /> Lactobacillus để phân tích bằng quy trình xây<br /> dựng. Kết quả cho thấy trong tổng số 20 mẫu<br /> phân tích, có 5 sản phẩm không bổ sung loài vi<br /> 500 bp<br /> 248 bp khuẩn đúng như thông tin ghi trên bao bì (Bảng<br /> 5). Phần lớn các sản phẩm đều ghi nhãn có bổ<br /> Hình 3. Kết quả kiểm tra độ chọn lọc của quy trình sung vi khuẩn L. acidophilus (17/20 mẫu); tuy<br /> phát hiện L. plantarum nhiên, theo kết quả phân tích, chỉ có 15/17 mẫu<br /> Giếng 1: L. acidophilus; 2: L. bulgaricus; 3: L. casei; 4: L. có phát hiện L. acidophilus và 2/17 mẫu không<br /> fermentum; 5: L. brevis; 6: L. pentosus; 7: L. plantarum; 8: phát hiện vi khuẩn này (M6, M17). Bên cạnh đó,<br /> L. reuteri; 9: L. rhamnosus; 10: L. sakei; 11: L. paracasei; 2 mẫu (M2, M11) được nhà sản xuất công bố có<br /> 12: Lc. lactis; 13: Chứng âm; Lad: Thang DNA 100bp chứa 3 loài vi khuẩn Lactobacillus khác nhau, tuy<br /> Phương pháp được kiểm tra khả năng phát nhiên kết quả chỉ phát hiện 1 loài duy nhất.<br /> hiện chọn lọc các chủng vi khuẩn mục tiêu và<br /> Bảng 5: Kết quả phân tích mẫu thực phẩm chức năng trên thực tế<br /> STT Mã số Thông tin ghi trên bao bì Kết quả phân tích<br /> mẫu L. acidophilus L. plantarum L. rhamnosus L. casei L. reuteri<br /> 1 M1 L. acidophilus +<br /> 2 M2 L. rhamnosus, L. plantarum, L. acidophilus + - -<br /> 3 M3 L. acidophilus +<br /> 4 M4 L. acidophilus +<br /> 5 M5 L. acidophilus +<br /> 6 M6 L. acidophilus +<br /> 7 M7 L. acidophilus +<br /> 8 M8 L. acidophilus +<br /> 9 M9 L. acidophilus +<br /> 10 M10 L. acidophilus +<br /> 11 M11 L. plantarum, L. casei, L. acidophilus + - -<br /> 12 M12 L. acidophilus +<br /> 13 M13 Lactobacillus - - + - -<br /> 14 M14 L. acidophilus -<br /> 15 M15 L. acidophilus +<br /> 16 M16 L. acidophilus +<br /> 17 M17 L. acidophilus -<br /> 18 M18 L. acidophilus +<br /> 19 M19 L. casei +<br /> 20 M20 L. reuteri +<br /> <br /> BÀN LUẬN đến thành công của một phản ứng PCR. Kết quả<br /> so sánh các thông số của sản phẩm sau tách chiết<br /> Tách chiết DNA là một bước quan trọng<br /> bằng 3 phương pháp khác nhau thể hiện ở bảng<br /> trong một quy trình PCR, ảnh hưởng trực tiếp<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 435<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019<br /> <br /> 3 cho thấy phương pháp tách bằng nhiệt cho này đã được kiểm tra đạt độ đặc hiệu với chủng<br /> thấy hiệu quả thấp nhất. Bên cạnh đó, quy trình vi sinh vật mục tiêu. Các thông số của quy trình<br /> A cho kết quả tương đương với phương pháp PCR được khảo sát có khả năng cho phản ứng<br /> tách bằng bộ kit thương mại về 2 chỉ số: tỷ lệ PCR tốt. Tuy nhiên, trước khi đưa vào áp dụng<br /> A260/A280, A260/A230 nhưng có khả năng thu được phương pháp để xác định 9 loài vi khuẩn<br /> DNA với hàm lượng cao nhất. Tỷ lệ hấp thụ ở Lactobacillus trong thực phẩm chức năng tại<br /> 260 nm và 280 nm được sử dụng để đánh giá độ phòng thí nghiệm, cần thiết phải đánh giá khả<br /> tinh khiết của DNA và RNA. Nucleic acid có độ năng áp dụng phương pháp trong điều kiện<br /> hấp thụ cực đại ở 260 nm. Một tỷ lệ A260/A280 xấp thực tế của phòng thí nghiệm với 2 thông số:<br /> xỉ 1,8 thường được chấp nhận cho DNA tinh mức phát hiện và độ chọn lọc. Kết quả khảo sát<br /> sạch. Khi tỷ lệ này thấp hơn đáng kể có nghĩa là cho thấy phương pháp có khả năng phát hiện<br /> trong dịch sau tách chiết có thể có sự hiện diện các vi khuẩn Lactobacillus trong nền mẫu thực<br /> của protein, phenol hoặc các chất tạp nhiễm khác phẩm chức năng dạng lỏng với mật độ khá thấp:<br /> có độ hấp thụ mạnh ở hoặc gần bước sóng 280 LOD50 đều dưới 5 CFU/g, trong đó thấp nhất là<br /> nm. Trong khi đó, tỷ lệ A260/A230 cũng được sử Lb. acidophilus (0,7 CFU/g) và cao nhất là Lb. sakei<br /> dụng như một thước đo thứ cấp về độ tinh sạch (2,5 CFU/g). LOD50 của phương pháp phát hiện 9<br /> của acid nucleic. Giá trị A260/A230 mong muốn loài vi khuẩn Lactobacillus trên mẫu thực phẩm<br /> thường nằm trong khoảng 1,8 - 2,2(13). Dịch DNA chức năng dạng bột dao động từ 0,8 CFU/ g (L.<br /> sau tách chiết bằng quy trình A và kit có độ tinh reuteri) - 2,7 CFU/ g (L. sakei). Thông qua bước<br /> sạch tốt hơn so với phương pháp tách chiết bằng tăng sinh trong canh thang MRS sau 48 giờ ở<br /> nhiệt vì có tỷ lệ A260/A280 và tỷ lệ A260/A230 đều lớn điều kiện kỵ khí, vi khuẩn có thể được phát hiện<br /> hơn 1,9 – điều này có thể do 2 phương pháp này bằng phương pháp PCR chỉ với một số lượng<br /> có trải qua các bước phân hủy và loại bỏ protein. thấp của vi khuẩn ban đầu trong mẫu. Phương<br /> Hàm lượng DNA thu được từ 3 phương pháp pháp cũng thể hiện độ chọn lọc tốt khi chỉ phát<br /> tách chiết mặc dù đều đạt mức để sử dụng cho hiện vi sinh vật mục tiêu và không cho phản ứng<br /> phản ứng PCR nhưng trong 3 phương pháp dương tính giả trên các chủng vi sinh vật không<br /> nghiên cứu thì quy trình A cho thấy khả năng mục tiêu.<br /> thu được DNA với hàm lượng cao nhất. Trong Khi áp dụng phương pháp để phân tích<br /> quy trình A, chính việc sử dụng lysozyme đồng ngẫu nhiên 20 mẫu thực phẩm chức năng có bổ<br /> thời với EDTA và Triton X-100 giúp tăng hiệu sung vi khuẩn Lactobacillus, kết quả cho thấy có<br /> quả trong việc phá vỡ các tế bào vi khuẩn (1). Việc một số mẫu được ghi thông tin trên bao gì<br /> loại bỏ bước sử dụng RNase A trong quá trình không đúng với thực tế (xem bảng 5). Như vậy<br /> tách chiết không làm thay đổi hiệu quả của quá cho thấy, trên thị trường thực phẩm chức năng,<br /> trình tách DNA. So sánh về mặt kinh tế, quy có một tỷ lệ không nhỏ các sản phẩm được ghi<br /> trình A là phương pháp thích hợp có thể đưa nhãn sai thực tế - thể hiện nhu cầu cần phải kiểm<br /> vào ứng dụng tại phòng thí nghiệm. soát chặt chẽ để tránh được gian lận thương mại.<br /> PCR là phương pháp được sử dụng rất phổ KẾT LUẬN<br /> biến để phát hiện nhiều đối tượng, do tính đặc<br /> Qua nghiên cứu, chúng tôi đã xây dựng<br /> hiệu và đơn giản của chúng. Để bắt đầu phản<br /> phương pháp phát hiện 9 loài vi khuẩn<br /> ứng kéo dài khuếch đại đoạn trình tự DNA mục<br /> Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức<br /> tiêu của enzyme Taq polymerase, PCR cần phải<br /> năng với mức phát hiện: LOD50 đều dưới 3<br /> có các cặp mồi đặc hiệu. Thành công của phản<br /> CFU/g đối với cả 2 dạng thực phẩm chức năng<br /> ứng PCR phụ thuộc rất lớn vào cặp mồi này. Có<br /> khác nhau. Phương pháp cũng đồng thời có độ<br /> 9 cặp mồi lựa chọn đưa vào trong nghiên cứu<br /> chọn lọc tốt, không cho kết quả dương tính giả<br /> <br /> <br /> 436 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> trên các chủng vi khuẩn không mục tiêu. Như 7. FAO, WHO (2002). Guidelines for the Evaluation of Probiotics<br /> in Food. URL: https://www.who.int/foodsafety/fs_management/en.<br /> vậy, quy trình có thể đưa vào ứng dụng tại 8. Karapetsas A, Vavoulidis E, Galanis A, Sandaltzopoulos R,<br /> phòng thí nghiệm vi sinh vật – Trung tâm Kiểm Kourkoutas Y (2010). Rapid Detection and Identification only by<br /> Probiotic Lactobacillus casei ATCC 393 by Multiplex PCR. J Mol<br /> nghiệm an toàn thực phẩm khu vực phía Nam.<br /> Microbiol Biotechnol, 18:156–161.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO 9. NMKL (2009). Protocol for the validation of alternative<br /> microbiological methods. NMKL, pp.5-12.<br /> 1. Alimolaei M, Golchin M (2016). An Efficient DNA Extraction<br /> 10. Prosekov A, Babich O, Bespomestnih K (2013). Identification of<br /> Method for Lactobacillus casei, a Difficult-to-Lyse Bacterium. Int J<br /> Industrially Important Lactic Acid Bacteria in Foodstuffs. Foods<br /> Enteric Pathog, doi:10.17795/ijep32472.<br /> Raw Mater, 1(2):42–45.<br /> 2. Amin M, Jorfi M, Khosravi AD, Samarbafzadeh AR, Sheikh AF<br /> 11. Song Y, et al (2000). Rapid identication of 11 human intestinal<br /> (2009). Isolation and Identification of Lactobacillus casei and<br /> Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and<br /> Lactobacillus plantarum from Plants by PCR and Detection of<br /> species-specific primers derived from the 16S - 23S rRNA<br /> their Antibacterial Activity. J Biol Sci, 9(8):810–814.<br /> intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA. FEMS<br /> 3. Belfiore C, Raya RR, Vignolo GM (2013). Identification,<br /> Microbiol Lett, 187:167–173.<br /> technological and safety characterization of Lactobacillus sakei<br /> 12. Statista (2014). Probiotic functional foods: global retail sales<br /> and Lactobacillus curvatus isolated from Argentinean anchovies<br /> value by region 2012 - 2014. URL:<br /> (Engraulis anchoita). Springerplus, 2(1):1–8.<br /> www.statista.com/statistics/252941/probiotic-products-sales-<br /> 4. Bottari B, et al (2017). Effective identification of Lactobacillus casei<br /> worldwide-by-region/.<br /> group species: genome-based selection of the gene mutL as the<br /> 13. Thermo-Fisher-Scientific. T042-TECHNICAL Bull NanoDrop<br /> target of a novel multiplex PCR assay. Microbiology, 163:950–960.<br /> Spectrophotometers - Thermo Fish Sci. URL:<br /> 5. Cai H, Rodríguez BT, Zhang W, Broadbent JR, Steele JL (2007).<br /> doi:10.1002/jobm.19770170116.<br /> Genotypic and phenotypic characterization of Lactobacillus casei<br /> 14. Torriani S, Felis GE, Dellaglio F (2001). Differentiation of<br /> strains isolated from different ecological niches suggests<br /> Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum by recA<br /> frequent recombination and niche specificity. Microbiology,<br /> gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA<br /> 153(8):2655–2665.<br /> gene-derived primers. Appl Environ Microbiol, 67(8):3450–3454.<br /> 6. FAO (2001). Probiotics in food - Health and nutritional<br /> properties and guidelines for evaluation. Jt FAO/WHO Expert<br /> Consult Eval Heal Nutr Prop Probiotics Food Incl Powder Milk Ngày nhận bài báo: 15/08/2019<br /> with Live Lact Acid Bact, 1-4:2. Ngày phản biện nhận xét bài báo: 31/08/2019<br /> Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 437<br />