Kỹ thuật Isoenzyme

Chia sẻ: Traitao Traitao | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

469
lượt xem 95
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật isoenzims (isoenzymes) là kỹ thuật nghiên cứu đa hình enzim. Phương pháp này được đề nghị từ năm 1957 bởi Hunter và Market, sau đó được phát triển

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật Isoenzyme

CHƯƠNG I KỸ THUẬT ISOENZIMS I. Giới thiệu Kỹ thuật isoenzims (isoenzymes) là kỹ thuật nghiên cứu đa hình enzim. Phương pháp này được đề nghị từ năm 1957 bởi Hunter và Market, sau đó được phát triển bởi Harris (1966) và được sử dụng rất phổ biến từ thập niên 70 đến nay. Di truyền quần thể cần thiết cho nghiên cứu nguyên nhân và hậu quả của sự biến đổi di truyền giữa những quần thể và trong quần thể. Trong thời gian qua izoenzymes đã được sử dụng rộng rải như là dấu phân tử cho mục tiêu nầy. Mặc dù hiện nay nó đã được thay thế bởi những kỹ thuật DNA, kỹ thuật isoenzymes vẫn còn được sử dụng rộng rải vì cách thực hiện tương đối nhanh và chi phí thấp thích hợp cho những đề án nghiên cứu xác định mức độ thay đổi di truyền ở mức độ thấp. Việc kết hợp kỹ thuật isoenzymes với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA cho phép chúng ta phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện môi trường khác nhau của các giống loài vi sinh vật, động vật, cây trồng (Bernie May, 1992). II. Nguyên lý chung Isoenzim là các dạng khác nhau của nhóm enzim có đặc tính xúc tác cùng kiểu phản ứng hoá học. Các isoenzim này khác nhau do chúng có thành phần và trình tự các acid amin khác nhau trong cấu trúc phân tử. Do đó điểm đẳng điện của chúng cũng khác nhau. Các enzim tức các protein này như những acid amin mang điện tích trung tính khi pH môi trường bằng pHi ở điểm đẳng điện (i). Ở pH lớn hơn pHi các phân tử phân cực như một acid nghĩa là nó phân ly và mang điện tích âm (-). Trong một điện trường điện di các protein này di chuyển về anode (mang điện 1
tích dương +) vận tốc di chuyển tùy thuộc vào lượng điện tải và kích thước của các phân tử protein. Các isoezim có cùng phản ứng xúc tác nhưng do có điện tích khác nhau, và cấu trúc phân tử khác nhau nên có vị trí khác nhau trên gel. Nếu mỗi isoenzim này được mã hóa từ 1 cặp gen mang tính trạng di truyền (allele) thì chúng còn được gọi là allozim hay alloenzim. Izoenzims biểu hiện từ những gen khác nhau tiến hành hay xúc tác cùng phản ứng. Hai từ này thường được sử dụng thay đổi lẫn nhau. III. Qui trình thực hiện 1. Trích isoenzims ( Hiệu chỉnh theo Selander và ctv., 1986) Bước 1. Ly trích protein. Vi Khuẩn: Vi khuẩn được nuôi đến cuối thời kỳ tăng trưởng nhanh, được thu hoạch bằng cách ly tâm rồi rửa 3 lần bằng dung dịch ly trích. Sau đó tế bào vi khuẩn bị phá vỡ ra dưới tác dụng của siêu âm trong điều kiện lạnh để protein không bị phân hủy. Ly tâm loại bỏ các chất cặn dưới đáy ống nghiệm. Phần trong chứa protein ly trích được chia ra từng ống nghiệm nhỏ 5-15 µl. Trữ các ống nghiệm ở nhiệt độ từ -20oC đến -80oC. Cây trồng: Mẫu lá được nghiền trong nitơ lỏng bằng máy nghiền mẫu. Sau đó dung dịch ly trích được thêm vào ngay để trích Protein. Ly tâm loại bỏ các chất cặn dưới đáy ống nghiệm. Phần trong chứa protein được trữ trong ống nghiệm 2 ml ở -80oC. Bước 2. Điện di enzim: Đo nồng độ protein bằng phương pháp Bradford (1976) (1), dựa vào các số liệu này ta pha loãng các dung dịch ly trích để những mẫu chạy điện di có nồng độ protein tương đương nhau. Điện di được chạy từ cathode (-) đến anode (+) dưới cường độ dòng điện ổn định. pH, nồng độ dung dịch đệm và thành phần của gel không được thay đổi, nếu thay đổi sẽ cho kết quả không chính xác. 2
a. Nguyên tắc của phương pháp Bradford: Những phân tử protein hòa tan gắn liền với chất nhuộm màu Coomassie Blue G250 rất nhanh chóng, sự thành lập phức hợp nầy đưa đến sự thay đổi hấp thu màu ở bước sóng từ 465-595 nm. Theo Spector (1978) cường độ màu hấp thu tương quan chặt chẻ với hàm lượng protein trong dung dịch, khi hàm lượng protein nằm trong khoảng 1-1000 mg/l (1). Dựa vào tính chất nầy người ta đo lượng protein hòa tan kết hợp với Coomassie Blue G250 ở bước sóng 595nm rồi quy theo đường chuẩn để suy ra lượng protein hòa tan. b. Quy trình. Gồm 2 bước sau: Bước 1: Xác lập đường chuẩn. Dùng dung dịch Albumin (Bovine Serum Albulmin) 1mg/ml pha với nước cất để có các nồng độ tương ứng từ 0-500 µg/ml, cộng thêm 2 ml/ống nghiệm dung dịch màu Coomassie Blue G250 (100mg C.Blue + 50 ml ethanol 95% + 100ml H3PO4 85%, thêm nước cất cho đủ một lít.) như sau: Nồng độ chuẩn protein (µg/ml) 0 100 200 300 400 500 Dung dịch albumin (µl) 0 50 100 150 200 250 Nước (µl) 500 450 400 350 300 250 Dung dịch coomassie blue (µl) 2 2 2 2 2 2 Các ống nghiệm được pha thành dãy nồng độ như trên, lắc đều đợi 10 phút đo ở độ dài sóng 595 nm (màu nầy ổn định trong vòng 1 giờ). Vẽ đường chuẩn theo số liệu OD đo được. Bước 2. Đo mẫu: Dùng 200µl dung dịch muốn đo + 2 ml dung dịch hổn hợp màu Coomassie Blue, lắc đều đợi 10 phút, đo ở λ = 595 nm, từ OD đo được qui ra nồng độ protein theo đường chuẩn. 3
OD 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 100 200 300 400 500 600 N äöng âäü ot n ug/ l pr ei ( m ) Hình : Đường chuẩn protein theo phương pháp Bradford Sự thể hiện phổ diện enzim: Sau khi chạy điện di, dung dịch các cơ chất, chất cộng tác enzim (cofactor) và chất nhuộm màu được đổ trực tiếp lên gel. Hoá chất sẽ phản ứng nơi enzim lưu trú và những dãy băng isoenzim sẽ hiển thị (nếu có), ta có thể quan sát được bằng mắt thường. Cơ chế phản ứng của enzim trong gel: Phản ứng hoá học giữa cơ chất, isoenzymes và chất cộng tác của enzim (cofactor) sinh ra sản phẩm tác dụng với chất nhuộm màu (PMS, NBT v.v..) Các băng enzim sẽ có màu đậm hơn (trong khi các dãy băng protein khác sẽ không hiện màu), trừ trường hợp enzim SOD có màu âm tính: các dãy băng màu trắng trong suốt, trong khi phần còn lại màu xám đen. (xem phần nhuộm màu enzim.) Bước 3. Phân tích số liệu. Xác định các khoảng cách từ giếng đặt mẫu đến vị trí các dãy băng enzim. Xác định các phổ diện điện di để nhận diện các dòng vi sinh vật hay mã hoá, xác định hệ số trùng hợp, phân tích theo chương trình điện toán UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean). Hệ số trùng hợp (Coefficients de similarité, similarity coefficient) ký hiệu Sj (Selander và Jaccard) là hệ số biểu hiện tỉ số giữa phổ diện điện di giống nhau 4
của 2 dòng vi khuẩn trên tổng số phổ diện điện di nghiên cứu (4). Ví dụ trên 2 dòng vi khuẩn x, y: nx: tổng số phổ diện điện di của dòng x trên tổng số enzim. ny: ...............nt .................... của dòng y .............nt................ nxy: số phổ diện điện di giống nhau giữa 2 dòng Sj = 2nxy/(nx+ny) Khoảng cách di truyền. (Genetic distance). Hệ số trùng hợp có thể chuyển đổi thành hệ số khoảng cách di truyền D biểu hiện phần trăm khác nhau giữa 2 dòng vi khuẩn theo tổng số tính chất nghiên cứu. D = 1 - Sj = 1 - (2nxy/nx+ny) Từ khoảng cách đánh giá giữa từng cặp vi khuẩn, chúng ta có thể lập một lược đồ hình nhánh (Dendrogam) đại diện cho di truyền nòi giống (phylogenie) của những dòng vi khuẩn nghiên cứu. Chúng ta lập lược đồ nầy bắt đầu bằng những dòng có khoảng cách nhỏ kế đến những dòng có khoảng cách xa hơn. Ví dụ: Chúng ta xác định hệ số trùng hợp (Sj) hoặc hệ số khoảng cách (D) giữa 5 dòng vi khuẩn nghiên cứu với 4 enzim bằng phổ diện điện di như sau: Dòng Phổ diện điện di 4 enzim (A, B, C, D) A B C D I 1 3 3 2 II 1 3 3 2 III 1 3 4 1 IV 1 2 1 3 V 1 1 2 3 5
Tính hệ số trùng hợp: hệ số trùng hợp được tính giữ 1 dòng x và 1 dòng y ký hiệu Sj x/y và hệ số khoảng cách D x/y Sj 1/II = 2.4/(4+4) = 1 D 1/II = 1- 1 =0 Sj I/III = 2.2/(4+4) = 0,5 D I/III = 1- 0,5 = 0,5 Sj I/IV = 2.1/(4+4) = 0,25 D I/IV = 1- 0,25 = 0,75 v.v... Ta có tổng kết tất cả những khoảng cách: D x/y I II III IV V I 0 II 0 0 III 0,5 0,5 0 IV 0,75 0,75 0,75 0 V 0,75 0,75 0,75 0,75 0 Từ số liệu nầy chúng ta có lược đồ hình nhanh như sau: 1 0,75 0,50 0,25 0 I II III IV V 2. Nhuộm màu - α naphtyl acetate esterase - Pha α naphtyl acetate trong 1,5 ml acetone (được thực hiện trong tối, tránh ánh sáng) thêm 150 ml dung dịch đệm pH 7,4 với 60 mg O diazinidine tetrazotized. - Lọc dung dịch sau cùng. - Phản ứng khoảng 45 phút, xong cố định với acid acetic 7 %, trong 15 phút. - Hydroxybutyrate dehydrogenase (HBD). 6
- Pha: 100 ml dung dịch đệm tris HCl 0,2 M 0,2 g acid hydroxybutyric 0,4 g NaCl 4 ml MgCl2.6H2O 0,1M - Thêm trong tối theo thứ tự: 3 ml MTT 1% 1 ml PMS 1% 4 ml NAD 1% - Phản ứng xảy ra khoảng 30 phút, xong cố định với acid acetic 7 %, 15 phút. - Malate dehydrogenase (MDH) - Pha (đặt trong nước đá) 1,2 g Na 2CO3 trong 5 ml nước cất thêm từ từ 1,34 g acid malic và thêm đủ 10 ml nước cất. - thêm (trong tối) theo thứ tự: 5 ml NAD 1 % 3 ml NBT 1 % 0,2 ml PMS 1 % 20 ml dung dịch đệm tris HCl pH 8 70 ml nước cất. - Phản ứng trong 30 phút, xong cố định với acid acetic 7 %, 15 phút. - Lactate dehydrogenase (LDH). - Pha (đặt trong nước đá) 0,6 g Na2CO3 trong nước cất. 0,85 g acid lactic trong 5 ml nước cất. - Thêm 9trong tối) theo thứ tự: 5 ml NAD 1 % 3 ml NBT 1 % 0,2 ml PMS 1 % 20 ml dung dịch đệm tris HCl 0,2 MpH 8 62 ml nước cất - phản ứng màu khoảng 5 phút, xong cố định với acid acetic 7 %, 15 phút. - Superoxide dismutase (SOD) = Indolphenol oxidase (IPO) -Pha: 40 ml dung dịch đệm 0,2 M pH 8 0,2 ml MgCl2.6H2O (0,5M) 1 ml NAD 1 % -Thêm và giữ trong tối: 1 ml NBT 1 % 0,5 ml PMS 1 % - Ủ trong phòng dưới ánh đèn néon, dãy băng xuất hiện sau 1-2 giờ (dãy băng trong giữa nền xám đen), xong cố định với acid acetic 7 %, 15 phút. 7
- Phosphoglucose isomerase (PGI) - Pha: 10 mg fructose-6-phosphate 3 U (7ml) glucosê-phosphate dehydrogenase (250UI/600ul) 6 mg NADP 25 ml dung dịch đệm 0,2M pH 8 0,3 ml MgCl2 0,1M (2,3 g MgCl2.6H2O/100ml H2O) - Thêm 0,5 ml PMS 1 % 1 ml MTT 1,25 % -Phản ứng màu khoảng 30 phút được thực hiện trong tối, xong cố định với acid acetic 7 %, trong 15 phút. - Diaphorase. - Pha theo thứ tự (trong tối): 0,02 g NADH 80 ml dung dịch đệm 0,025 M pH 8,5 2 ml DCIP (DPIP) 1 % pha vừa trước khi thực hiện phản ứng. 4 ml MTT 1 % - Phản ứng xảy ra trong 30 phút, xong cố định với acid acetic 7 % trong 15 phút. * Chú thích: Cách pha các dung dịch đệm. - 150 ml Dung dịch đệm phosphate 0,15M pH 7,4: KH2PO4 / Na2HPO4 12H2O 20,41 g / l 53,72 g/l 29,4 ml / 120,6 ml - Dung dịch đệm tris HCl pH8: EGTA 0,4 g/l Tris 24,22 g/l Nước cất cho đủ 1 l chỉnh về pH 8 với HCl đậm đặc. Dung dịch đệm 0,025 M pH 8.5: 3,1 g tris M=121,1 1 l nước cất Các chữ viết tắt: NAD: β Nicotinamide adenine dinucleotide 8
NADP: β Nicotinamide adenine dinucleotidephosphate NADH: β Nicotinamide adenine dinucleotide reduce form NTB: Nitro blue tetrazolium PMS: Phenazine methosulfate MTT: 3-(4,5 Dimethylazol - 2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide; thyazolyl blue) DCIP: Dichlorophenol indophenol EGTA: Ethylene glycol-bis (β amino ethyl ether)N, N, N, N, tetra acetique acid 3. Ứng dụng Ứng dụng phương pháp điện di isozymes để đánh giá và phân loại tập đoàn giống cây có múi đã được nghiên cứu. Sử dụng 4 hệ enzymes: IDH (Isocitrate dehydrogenase), PGI (Phosphogluco issomerase), PMG (Phosphogluco mutase ) và AAT-1 (Aspartate amino transferase) cho việc tuyển chọn cây phôi tam ở hai loại gốc ghép chanh Volkamer (Citrus volkameriana) và cam đắng Carrizo cirtange (Poncirus trifoliata x C. sinensis) là những giống có nhiều ưu điểm và đang sử dụng rộng rãi trên nhiều nước sản xuất cây có múi (Phan Đình Pháp, 2004) Đỗ Ngọc Liên và công sự đã nghiên cứu đặc tính của các isozym photphataza axit trong tinh dịch người ứng dụng cho xét nghiệm trong điều tra hình sự. (Tạp chí khoa học số 2 PT. Trang 196-201, 2004). 9