Làm giàu trình tự toàn bộ exon của gen ARID1B trong u nguyên bào thần kinh

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> <br /> LÀM GIÀU TRÌNH TỰ TOÀN BỘ EXON CỦA GEN ARID1B<br /> TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH<br /> Lê Võ Hồng Ngọc*, Nguyễn Thị Dung, Đỗ Thị Thu Hằng**, Hồ Trần Bản***, Bùi Chí Bảo****<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là khối u đặc phổ biến ở trẻ dưới 15 tuổi, được hình thành từ<br /> các tế bào thần kinh sơ khai thuộc mô thần kinh giao cảm. Bệnh lý chiếm 7% các loại ung thư ở trẻ em và khoảng<br /> 15% các ca tử vong do ung thư ở trẻ em. Ngoài các đột biến trên gen hay thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể đã biết,<br /> những nghiên cứu mới gần đây về giải trình tự gen thế hệ mới cho thấy các đột biến thuộc ngoại di truyền<br /> (epigenetics) có vai trò quan trọng đến diễn tiến của bệnh, nổi bật là các đột biến trên gen ARID1B. ARID1B có<br /> vai trò như nhân tố phiên mã trong phức hợp SWI/SNF tái cấu trúc nhiễm sắc chất (chromatin remodeling). Tuy<br /> nhiên, mối quan hệ giữa UNBTK và ARID1B vẫn chưa được hiểu rõ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu<br /> tối ưu quy trình thu nhận 20 exon của gen ARID1B ở các bệnh nhân UNBTK dựa vào phương pháp PCR. Đây<br /> là bước quan trọng cho giải trình tự đột biến ARID1B ở các bệnh nhân UNBTK.<br /> Mục tiêu: Làm giàu sản phẩm toàn bộ exon của gen ARID1B nhằm thực hiện cho giải trình tự thế hệ mới ở<br /> các bệnh nhân UNBTK.<br /> Phương pháp: Khảo sát mồi in silico, khảo sát điều kiện bắt cặp và điều kiện PCR cho từng exon của gen<br /> ARID1B. Mẫu bệnh là khối u của bệnh nhân UNBTK thu nhận từ bệnh viện Nhi đồng II Tp.HCM. Mẫu được<br /> tiến hành phân loại nhóm mô (>50% tế bào nhỏ đặc trưng UNBTK sẽ được thu nhận), tách chiết DNA, PCR<br /> khuếch đại toàn bộ exon của ARID1B. Một số sản phẩm PCR được giải trình tự Sanger để kiểm chứng.<br /> Kết quả: Thu nhận được sản phẩm của 19 exon trong tổng số 20 exon của gen ARID1B, trong đó exon 1<br /> giàu GC nên sản phẩm PCR chưa đặc hiệu. Kết quả giải trình tự trên 3 mẫu bệnh nhân cho thấy sản phẩm PCR<br /> cho các sóng trình tự tốt. Tuy nhiên, vùng trình tự khuếch đại bởi cặp mồi 20c, 20d, 20e có 5 vùng homopolymer<br /> A/T nên tín hiệu sau các vùng này bị nhiễu.<br /> Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình PCR toàn bộ exon của gen ARID1B, ngoài trừ PCR<br /> exon 1 cần được tối ưu hóa thêm. Ngoài ra, kết quả giải trình tự ban đầu cho thấy exon 20 có một số vùng<br /> homopolymer A/T gây khó khăn trong đọc kết quả giải trình tự, do đó bổ sung mồi giải trình tự cho nhiều đoạn<br /> ngắn hơn. Nhìn chung đây là kết quả bước đầu cho nghiên cứu sâu hơn trên thông tin của gen ARID1B.<br /> Từ khóa: u nguyên bào thần kinh, ARID1B, PCR, giải trình tự Sanger.<br /> ABSTRACT<br /> TARGETED GENE ENRICHMENT FOR HIGH THROUGHPUT SEQUENCING OF ARID1B IN<br /> NEUROBLASTOMA<br /> Le Vo Hong Ngoc, Nguyen Thi Dung, Do Thi Thu Hang, Ho Tran Ban, Bui Chi Bao<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016: 144 - 150<br /> <br /> Background: Neuroblastoma is a solid tumor which originates from primitive neural cells of sympathetic<br /> system. It is a common disease in children under 15 years of age with disease prelevence and mortility in children<br /> cancer group are 7% and 15%, respectively. Recent studies using next generation sequencing showed that<br /> <br />  <br /> Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM Khoa Y - Đại học Quốc Gia Tp. HCM<br />  <br /> Bệnh viện Nhi đồng II Tp.HCM Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược Tp. HCM<br /> Tác giả liên lạc: TS. Bùi Chí Bảo ĐT: 0909708225 Email: bcbao@ump.edu.vn<br /> 144 Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> epigenetic mutations, particularly in ARID1B, aslo participated in tumor formation and progression, together<br /> with genetic mutations and chromosomal rearrangement. ARID1B serves as transcription factor which takes part<br /> in chromatin-remodeling complex SWI/SNF. Relationship between neuroblastoma and ARID1B, however, is not<br /> fully understood. In this study, we ebstablished a protocol targeting 20 exons of ARID1B by conventional PCR in<br /> neuroblastoma patients for further investigations.<br /> Objectives: Targeting 20 exons of ARID1B by conventional PCR for further DNA sequencing in<br /> neuroblastoma patients.<br /> Methods: We conducted a sets of optimization for PCR including primer designs, temperature and<br /> conditional pipeline for whole exomes of ARID1B. Samples are collected from patients who were diagnosed<br /> neuroblastoma and undergone surgical dissection in Children hospital II Ho Chi Minh city. DNA were extracted<br /> and amplified by conventional PCR targeting 20 exons of ARID1B. Specificity were checked by DNA Sanger<br /> sequencing.<br /> Results: The completed 19 exons of ARID1B were on right PCR size. But Exon 1 contains several sites of<br /> GC content, so PCR products were unqualified yet. DNA sequencing of 3 patient samples confirmed the right<br /> PCR products and specific with ARID1B. Of note, the amplicon of primer pairs 20c, 20d and 20e consists of 5<br /> homopolymer A/T showed noises and hindering DNA sequencing.<br /> Conclusions: The results ebstablished in-house protocol for targeting exons of ARID1B from<br /> Neuroblastomas. Exon 1 products are needed further technical target on high GC contents. DNA sequencing data<br /> were confirmed some homopolymeric regions hindered sequencing regions dute to homopolymer A/T at exon 20.<br /> This research is fundamental for the further study going on to build up the next generation sequencing of large<br /> samples of Neuroblastomas.<br /> Key words: neuroblastoma, ARID1B, PCR, Sanger sequencing.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ Đặc biệt, Sausen và cs. (2013) đã phát hiện 5 đột<br /> biến trên ARID1B khi khảo sát 71 bệnh nhân<br /> UNBTK là một loại ung thư có nguồn gốc từ<br /> UNBTK và độ tương quan giữa đột biến ARID1B<br /> các tế bào thuộc mào thần kinh. Đây là loại u<br /> đến thời gian sống của bệnh nhân(8).<br /> đặc, nằm ở ngoại vi não, thường xuất phát từ<br /> Gen ARID1B (AT rich interactive domain<br /> tuyến thượng thận hay ở hạch thần kinh giao<br /> cảm vùng cổ, ngực, bụng và cột sống. Bệnh lý 1B), còn có tên khác là BAF250B, nằm trên cánh<br /> thường xảy ra ở trẻ sơ sinh và trẻ em dưới 15 dài của nhiễm sắc thể 6 ở vị trí 6q25.3 với chiều<br /> tuổi. Đây là loại u ác tính đặc ngoại vi não phổ dài là 432934 bp, bao gồm 20 exon. Protein<br /> biến hàng thứ hai và là dạng u đặc phổ biến nhất ARID1B là một thành viên của họ ARID, chứa<br /> ở trẻ nhỏ(1). Các biến đổi di truyền đặc trưng của một domain quan trọng tương tác với trình tự<br /> DNA giàu AT(12). Nó còn là thành phần trong<br /> bệnh bao gồm khuếch đại gen MYCN, khuếch<br /> phức hợp tái cấu trúc nhiễm sắc chất SWI/SNF.<br /> đại hay đột biến kích hoạt ALK, thay đổi cấu trúc<br /> Các nghiên cứu gần đây cho thấy đột biến trên<br /> nhiễm sắc thể 1p, 3p, 11q và 17q(9,11). Mặt khác,<br /> ARID1B có thể có vai trò tiềm năng trong hình<br /> các biển đổi thuộc ngoại di truyền cũng được mô<br /> thành khối u ở một số ung thư gan, vú, buồng<br /> tả như: methyl hóa DNA (CASP8, RASSF1A),<br /> trứng và u nguyên bào tủy. ARID1B còn được<br /> miRNA (let7a, miR-9, miR-17-92a) và đột biến<br /> xem như một gen ức chế khối u trong ung thư<br /> trong phức hợp tái cấu trúc nhiễm sắc chất<br /> tuyến tụy hay ức chế con đường tín hiệu Wnt/b-<br /> SWI/SNF và tiểu đơn vị của nó như BRG1,<br /> catenin trong ung thư và được biết đến là một<br /> ARID1 và BRN đóng vai trò quan trọng trong<br /> trong 5 driver gen trong UNBTK(4,8,10). Tuy nhiên<br /> việc trưởng thành của tế bào mào thần kinh(3,5).<br /> chưa có tài liệu nào công bố nghiên cứu UNBTK<br /> <br /> <br /> Thần kinh 145<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> với đột biến gen ARID1B ở bệnh nhân Việt Nam. khoảng từ 40-60% và ba nucleotide ở cuối đầu 3’<br /> Nghiên cứu này là phần đầu của công việc thu có 1 đến 2 nucleotide G/C. Mồi cho 20 exon của<br /> thập mẫu và tối ưu điều kiện để thu nhận toàn gen ARID1B được thiết kế dựa trên phần mềm<br /> bộ exon của ARID1B cho giải trình tự. CLC Genomics Workbench 5.5 (CLC Bio) dựa<br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU trên trình tự gen ARID1B tham khảo tải về từ<br /> NCBI với mã số NG_032093.<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> PCR khuếch đại các exon<br /> Khối mô UNBTK (từ 2013-2015) ở Bệnh viện<br /> Sử dụng bộ kit Hot Start Taq Polymerase<br /> Nhi đồng II Tp. HCM.<br /> (Takara). Sau đó, điện di sản phẩm PCR trên gel<br /> Tiêu chuẩn chọn mẫu 2% ở 75V trong 40 phút để kiểm tra sản phẩm<br /> Bệnh nhân chẩn đoán bệnh lần đầu tiên, khuếch đại.<br /> chưa trải qua điều trị, không tái phát hoặc chẩn Giải trình tự exon<br /> đoán bất kì ung thư, bệnh di truyền nào khác.<br /> Sản phẩm PCR được nạp vào đĩa 96 giếng và<br /> Mẫu lấy được sự đồng thuận của gia đình bệnh<br /> giải trình tự Sanger (VNDAT), kèm theo mồi giải<br /> nhân.<br /> trình tự để thực hiện tinh sạch và đọc kết quả<br /> Phương pháp nghiên cứu giải trình tự.<br /> Ly trích DNA từ mẫu mô tươi KẾT QUẢ<br /> Lấy khoảng 20 mg mô đã được rã đông<br /> Thiết kế mồi<br /> nghiền trong dung dịch PBS để tạo hỗn hợp<br /> đồng nhất. Tiếp theo hỗn hợp được chuyển sang Dựa vào một số tiêu chí chung, chúng tôi đã<br /> falcon 15 mL, ly tâm và bỏ dịch nổi. Sau đó tiến thiết kế 23 cặp mồi dùng để khuếch đại 20 exon<br /> hành tách chiết DNA toàn phần bằng bộ kit của gen ARID1B (Bảng 1). Trong đó, cặp mồi 14F<br /> Wizard Genomic DNA Purification (Promega) và 15R cho sản phẩm gồm exon 14 và 15 do<br /> theo qui trình của nhà sản xuất. khoảng cách giữa hai exon này chỉ 257 bp. Riêng<br /> exon 20 có kích thước lên đến 4613 bp nên chúng<br /> Thiết kế mồi tôi thiết kế 5 cặp mồi (20a, 20b, 20c, 20d, 20e) sao<br /> Mồi trong PCR các exon sử dụng cho giải cho vùng trình tự khuếch đại của mỗi cặp mồi<br /> trình tự được thiết kế nằm trên các intron và chồng lấp lên nhau.<br /> cách đầu exon khoảng 50 nucleotide. Chiều dài<br /> mồi khoảng từ 18 đến 24 nucleotide, %GC trong<br /> Bảng 1: Trình tự mồi cho 20 exon của ARID1B.<br /> STT Tên Trình tự 5’-3’ Kích thước sản phẩm PCR Exon<br /> 1 1F TCACCATGAAAGCACACAGC<br /> 2068 1<br /> 2 1R GGCAAAGAAAGAAACTCAGG<br /> 3 2F TTGCTGGATGTTTTGTCAGG<br /> 459 2<br /> 4 2R AGCAGAAAATCCGTGCAATG<br /> 5 3F TAATAAGCCACAGGGCCAAG<br /> 289 3<br /> 6 3R GTATCATCAAGCAGGACATG<br /> 7 4F CCCTTCATGTTGCTGAATTG<br /> 315 4<br /> 8 4R GACAGGAAGATGATTCAGAG<br /> 9 5F GATGGAGTCTCCCTACATTG<br /> 491 5<br /> 10 5R ACTTATCCAGGACTACAGAG<br /> 11 6F CCAGAAAACCTTCATCTCTG<br /> 467 6<br /> 12 6R CTTAATATGTGGCCACTAGG<br /> 13 7F TAAATGTGGCTGTGTCTTGG<br /> 343 7<br /> 14 7R CTCCTCTCCATATTTGTTGG<br /> <br /> <br /> 146 Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> STT Tên Trình tự 5’-3’ Kích thước sản phẩm PCR Exon<br /> 15 8F GGAGAATCTTATGGTACCAG<br /> 430 8<br /> 16 8R ACAAACCTGTCAGGTAACAG<br /> 17 9F GTGCTGATCGCATTGTTGGA<br /> 507 9<br /> 18 9R GGGAACAATGCAGCTATGTG<br /> 19 10F TAGTAGAAATGACTGCCAGG<br /> 309 10<br /> 20 10R CCGTTTAGGCAGATTCACTG<br /> 21 11F CACTCTGTAACTTGTGTTGG<br /> 317 11<br /> 22 11R AAAATGAAGGCATGCAGAGG<br /> 23 12F GCCTGAACTAGTAGCCTTCA<br /> 495 12<br /> 24 12R CGACTTTCACACAGGCTTAG<br /> 25 13F GTGGGAGTAATGAGCATTAG<br /> 445 13<br /> 26 13R AAGTCCCAAGTTCCCTGTTG<br /> 27 14F CTGTATAACTAGCAAGGCAG<br /> 732 14-15<br /> 28 15R GAGTGAAAGGTGAACTGTTG<br /> 29 16F GAGATGACTAGAAGGGATGG<br /> 330 16<br /> 30 16R TATTGTCATCAGTGGCTCAG<br /> 31 17F AGTCAGGGTTCCAGAAATGG<br /> 357 17<br /> 32 17R TGACTTCAACATCCCAGGAG<br /> 33 18F TCAGTGTGTGACATGGTGTA<br /> 1072 18<br /> 34 18R ATCCCTTTAAGATGAGCAGG<br /> 35 19F CGCTTAACTGTCCTTGAGAG<br /> 373 19<br /> 36 19R TCAGTGCTCATCAACTCAGG<br /> 37 20Fa TGATGGAAAGGTATTGACGG<br /> 1033<br /> 38 20Ra TCGTGGTGAAGAAGAATCAG<br /> 39 20Fb AAAGTCACCGGAACATCAAG<br /> 1053<br /> 40 20Rb TCTTCACTCACACATGCTTG<br /> 41 20Fc GCTGGATATCTCGATATCAG<br /> 1141 20<br /> 42 20Rc CAGCTGCTCTCCTGAAATCG<br /> 43 20Fd TCATTAGGGCCATATCTCCA<br /> 1053<br /> 44 20Rd GTAACAGTCAATGACCCAGG<br /> 45 20Fe GCATTTAGTTTACTCCACCG<br /> 1188<br /> 46 20Re TAGCTATTGCTGAGCAGACG<br /> <br /> Kiểm tra hoạt động của mồi<br /> Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra khả năng hoạt kích thước sản phẩm dự đoán của các cặp mồi<br /> động của mồi trong thực tế bằng phản ứng PCR. (Hình 1, Hình 2). Cặp mồi 1 và 20c chúng tôi thu<br /> Trong 23 cặp mồi, chúng tôi có được 21 cặp mồi được sản phẩm PCR rất mờ, cần tiến hành tối ưu<br /> cho sản phẩm PCR là một băng duy nhất có tín hóa thêm.<br /> hiệu sáng, rõ nét và có kích thước phù hợp với<br /> <br /> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12<br /> <br /> <br /> <br /> 459 491 467 507<br /> 289 315 343 430 495<br /> 309 317<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Sản phẩm PCR của các cặp mồi 2 đến 12. 1: exon 2; 2: exon 3; 3: exon 4; 4: exon 5; 5: exon 6; 6: exon<br /> <br /> <br /> Thần kinh 147<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> 7; 7: exon 8; 8: exon 9; 9: exon 10; 10: exon 11; 11: exon 12; 12: thang 1kb plus.<br /> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11<br /> <br /> 107 103 105 105 118<br /> 732 2 3 8<br /> 445 3 3<br /> 481 357 373<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Sản phẩm PCR của các cặp mồi 13 đến 20e (trừ 20c).1: exon 13; 2: exon 14, 15; 3: exon 16; 4: exon<br /> 17; 5: exon 18; 6: exon 19; 7: exon 20a; 8: exon 20b; 9: exon 20d; 10: exon 20e; 11: thang 1kb plus.<br /> Tối ưu hóa PCR cho cặp mồi 1 không có sản phẩm kí sinh khi bổ sung thêm<br /> MgCl2 (Hình 4). Băng diện di sáng rõ tương ứng<br /> 1 2 3<br /> nồng độ MgCl2 thêm vào là 1 mM và 1,5 mM, tuy<br /> 2068<br /> nhiên không có sự khác biệt đáng kể nên chúng<br /> tôi chọn nồng độ MgCl2 bổ sung 1 mM là nồng<br /> độ tối ưu.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3: Sản phẩm PCR của mồi 1. 1: Thang 1 kb plus;<br /> 2: exon 1; 3: chứng âm.<br /> Phản ứng PCR của cặp mồi 1 cho lượng sản<br /> phẩm thấp (Hình 3). Do đó, chúng tôi đã tiến<br /> hành tối ưu hóa một số điều kiện như: gradient<br /> nhiệt độ bắt cặp mồi, nồng độ DNA, nồng độ<br /> MgCl2, số chu kỳ. Tuy nhiên, phản ứng PCR có<br /> Hình 4: Sản phẩm PCR của mồi 20c (1141 bp). 1:<br /> thêm sản phẩm không đặc hiệu và mồi chạy<br /> thang 1 kb plus; 2: không bổ sung MgCl2; 3: bổ sung 0,5<br /> không ổn định.<br /> mM MgCl2; 4: bổ sung 1 mM MgCl2; 5: bổ sung 1,5<br /> Tối ưu hóa PCR cho cặp mồi 20c mM MgCl2; 6: chứng âm.<br /> Cặp mồi 20c cho kết quả điện di là một vạch Như vậy, chúng tôi đã khuếch đại được 18<br /> mờ nên chúng tôi tiến hành tối ưu hóa để tăng exon của ARID1B với thành phần và chu trình<br /> lượng sản phẩm PCR. Nồng độ MgCl2 được PCR được trình bày trong Bảng 2.<br /> khảo sát do nó có vai trò là cofactor trong hoạt Sau khi thu được sản phẩm PCR của các cặp<br /> động của DNA polymerase, có thể làm tăng hiệu mồi, chúng tôi tiến hành giải trình tự trên 3 mẫu<br /> suất phản ứng. Nồng độ Mg2+ thường được sử bệnh. Kết quả giải trình tự cho thấy các cặp mồi<br /> dụng trong một phản ứng PCR từ 0,5 đến 5 khuếch đại đặc hiệu exon của gen ARID1B. Tín<br /> mM(7). Vì buffer PCR 10X đã có 1,5 mM MgCl2 hiệu của từng nucleotide thể hiện qua các đỉnh<br /> nên chúng tôi khảo sát ở khoảng bổ sung thêm sóng đều và rõ ở hầu hết các exon. Tuy nhiên,<br /> 0,5-1,5 mM MgCl2. Kết quả cho thấy sản phẩm chỉ đọc được tín hiệu khoảng 262 nucleotide ở<br /> PCR cho băng điện di sáng hơn, rõ nét hơn và<br /> <br /> <br /> 148 Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> phía đầu vùng trình tự exon 20c do ngay sau đó là homopolymer T (Hình 5).<br /> Bảng 2: Thành phần và chu trình PCR các exon của gen ARID1B.<br /> Exon Thành phần PCR Chu trình nhiệt<br /> Buffer PCR 10X 1X 1 chu kỳ:<br /> o<br /> dNTP 2,5 mM 0,25 mM 98 C trong 3 phút<br /> Mồi xuôi (10 M) 0,5 M 40 chu kỳ:<br /> o<br /> 2-20e (trừ exon 20c) Mồi ngược (10 M) 0,5 M + 98 C trong 10 giây,<br /> o<br /> Takara Taq HS 5 U/L 0,5 U + 56 C trong 20 giây,<br /> o<br /> gDNA 50-60 ng + 72 C trong 90 giây.<br /> Nước PCR 1 chu kỳ:<br /> o<br /> 20c Bổ sung thêm: MgCl2 25 mM 1 mM 72 C trong 5 phút.<br /> <br /> Giải trình tự các exon<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5: Kết quả giải trình tự exon 20c tại vùng có homopolymer T.<br /> Tương tự, kết quả giải trình tự exon 20d có trăm GC lên đến 74,6% nên gây khó khăn trong<br /> đỉnh sóng nhiễu toàn bộ do có vùng tối ưu hóa vì vậy tiếp theo nên khảo sát các chất<br /> homopolymer A ở ngay phần đầu. Sau đó, phụ gia dùng trong khuếch đại trình tự giàu GC<br /> chúng tôi phát hiện thêm ba vùng homopolymer như DMSO, betain, glycerol, polyethylene<br /> A/T khi tiến hành rà soát trên trình tự gen glycol, formamide, betaine hay sử dụng kit<br /> ARID1B tham khảo ở vị trí exon 20c, 20d và 20e chuyên dụng(6). Mặt khác, exon 20 chứa 5 vùng<br /> (Bảng 3). homopolymer A/T làm nhiễu tín hiệu sóng phía<br /> Bảng 3: Các vùng homopolymer A/T trên exon 20. sau các vùng này do hiện tượng trượt (slippage)<br /> Số lượng<br /> của DNA polymerase. Giải trình tự hai chiều bao<br /> Tên Exon Vị trí<br /> nucleotide A/T gồm cả mồi xuôi và mồi ngược đối với một vị trí<br /> Homopolymer 1 20c<br /> g.435112-<br /> 10 homopolymer hoặc thiết kế một cặp mồi giải<br /> 435121<br /> trình tự cho vùng nằm giữa hai vị trí<br /> g.435718-<br /> Homopolymer 2 20c 18 homopolymer có thể cho tín hiệu tốt hơn. Các<br /> 435735<br /> Homopolymer 3 20c-20d<br /> g.435880-<br /> 10<br /> nghiên cứu giải trình tự gen ARID1B gần đây sử<br /> 435889<br /> dụng hệ thống giải trình tự thế hệ mới đã không<br /> g.436131-<br /> Homopolymer 4 20d 14 đề cập đến các vấn đề mà chúng tôi gặp phải(2,8).<br /> 436144<br /> g.437709- Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi sử dụng<br /> Homopolymer 5 20e 14<br /> 437722 quy trình PCR và phân tích kết quả giải trình tự<br /> BÀN LUẬN Sanger đơn giản và ít tốn kém hơn so với giải<br /> Exon 1 với chiều dài 1542 nucleotide chứa trình tự thế hệ mới. Tiếp theo, cần tiến hành<br /> nhiều trình tự GC lặp lại ở phần đầu và phần khảo sát đột biến trên gen ARID1B trên số lượng<br /> <br /> <br /> <br /> Thần kinh 149<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> lớn bệnh nhân để hiểu rõ hơn vai trò của 4. Khursheed M, et al. (2013). ARID1B, a member of the<br /> human SWI/SNF chromatin remodeling complex, exhibits<br /> ARID1B trong UNBTK. tumour-suppressor activities in pancreatic cancer cell<br /> lines. Br J Cancer, 108(10): 2056-62.<br /> KẾT LUẬN 5. Louis CU, Shohet JM (2015). Neuroblastoma: Molecular<br /> Pathogenesis and Therapy. Annu Rev Med, 66: 49–63.<br /> Chúng tôi đã khuếch đại được 19 exon, trong 6. Musso M (2006). Betaine, Dimethyl Sulfoxide, and 7-<br /> đó exon 20c cần bổ sung thêm 1 mM MgCl2. Deaza-dGTP, a Powerful Mixture for Amplification of<br /> GC-Rich DNA Sequences. J Mol Diagn, 8(5): 544–550.<br /> Exon 1 chưa cho sản phẩm PCR đặc hiệu. Tiếp<br /> 7. Roux KH (2009). Optimization and Troubleshooting in<br /> theo, chúng tôi giải trình tự 19 exon khuếch đại PCR. In: Dieffenbach C, Dveksler G (eds). PCR Primer: A<br /> Laboratory Manual, 2nd edition, pp 56-62. Cold Spring<br /> được thì có 18 exon cho kết quả giải trình tự bình<br /> Harbor Laboratory Press, NY.<br /> thường, tương đồng với trình tự tham khảo, 8. Sausen M, et al. (2013). Integrated genomic analyses<br /> trong khi đó exon 20 chứa 5 vùng homopolymer identify ARID1A and ARID1B alterations in the childhood<br /> cancer neuroblastoma. Nature genetics, 45(1): 12-17.<br /> A/T làm nhiễu tín hiệu sóng phía sau các vùng 9. Trương Đinh Kiều Diễm và cs. (2015). Xây dựng quy trình<br /> này. Sau đó, cần tiến hành khảo sát đột biến trên phân loại nhóm nguy cơ của u nguyên bào thần kinh<br /> khuyếch đại MYCN. Y học Tp.HCM, phụ bản tập 19, số 5:<br /> gen ARID1B trên số lượng lớn bệnh nhân để 1-7.<br /> hiểu rõ hơn vai trò của ARID1B trong UNBTK. 10. Vasileiou G, et al. (2015). Chromatin-Remodeling-Factor<br /> ARID1B Represses Wnt/b-Catenin Signaling. The American<br /> Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Journal of Human Genetics, 97: 445–456.<br /> khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) 11. Vũ Đình Quang và cs. (2013). Đánh giá sự khuếch đại<br /> gen MYCN trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh. Y<br /> trong đề tài mã số 106-YS.06-2014.48. Khoa, 6(1): 68-73.<br /> 12. Wilsker D, et al. (2005). Nomenclature of the ARID family<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> of DNA-binding proteins. Genomics, 86(2): 242-251.<br /> 1. Brodeur GM (2003). Neuroblastoma: biological insights<br /> into a clinical enigma. Nat Rev Cancer, 3(3): 203-16.<br /> 2. Cajuso T (2014). Exome sequencing reveals frequent Ngày nhận bài báo: 24/11/2015<br /> inactivating mutations in ARID1A, ARID1B, ARID2 and Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015<br /> ARID4A in microsatellite unstable colorectal cancer. Int. J.<br /> Cancer, 135: 611–623. Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016<br /> 3. Decock A, et al. (2011). Neuroblastoma epigenetics: from<br /> candidate gene approaches to genome-wide screenings.<br /> Epigenetics, 6(8): 962-70.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 150 Chuyên Đề Nội Khoa II<br />