Làm giàu trình tự toàn bộ exon của gen ARID1A trong u nguyên bào thần kinh

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> <br /> LÀM GIÀU TRÌNH TỰ TOÀN BỘ EXON CỦA GEN ARID1A<br /> TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH<br /> Lê Thị Kim Hòa*, Phạm Thị Hồng Đào*, Bùi Thị Thanh Huyền**, Nguyễn Thị Hà Giang***,<br /> Bùi Chí Bảo***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Giới thiệu: U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là dạng u đặc nguyên phát của mô thần kinh giao cảm, có<br /> nguồn gốc từ tế bào mào thần kinh, thường gặp nhất trong các loại ung thư ở trẻ em, chiếm 15% các trường hợp<br /> tử vong do ung thư ở trẻ em. Gần đây, những nghiên cứu về giải trình tự gen thế hệ mới (high-throughput next<br /> generation sequencing) đã phát hiện các đột biến liên quan đến điều hòa ngoại di truyền trong ung thư trẻ em, đặc<br /> biệt là gen ARID1A ở UNBTK. ARID1A là một tiểu phần của phức hợp SWI/SNF tham gia điều hòa phiên mã<br /> gen thông qua thay đổi cấu trúc chromatin. Do đó, việc xây dựng quy trình giải trình tự gen thông qua làm giàu<br /> sản phẩm các exon ARID1A là cần thiết.<br /> Mục tiêu: Tối ưu hóa quy trình PCR khuếch đại toàn bộ 20 exon và vùng tiếp giáp exon-intron của gen<br /> ARID1A.<br /> Phương pháp: Khảo sát mồi in silico, khảo sát nhiệt độ bắt cặp, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng PCR, kiểm<br /> chuẩn bằng phương pháp giải trình tự. Áp dụng quy trình khảo sát trên DNA được tách chiết từ máu nhóm đối<br /> chứng và từ khối u của 3 bệnh nhân UNBTK. Toàn bộ sản phẩm khuếch đại được xác định bằng kỹ thuật giải<br /> trình tự Sanger.<br /> Kết quả: Tối ưu được phản ứng PCR của các cặp mồi của 20 exon từ một phần exon 1 (1b) đến exon 20.<br /> Tuy nhiên, exon 1a chưa được tối ưu hóa thành công do sản phẩm gen chứa nhiều vùng giàu GC.<br /> Kết luận: Quy trình tối ưu hóa PCR thành công là bước đầu xây dựng quy trình giải trình toàn bộ exon của<br /> gen ARID1A thành công.<br /> Từ khóa: U nguyên bào thần kinh, làm giàu sản phẩm PCR, ARID1A.<br /> ABSTRACT<br /> TARGETED GENE ENRICHMENT FOR SEQUENCING OF ARID1A IN NEUROBLASTOMA<br /> Le Thi Kim Hoa, Pham Thi Hong Dao, Bui Thi Thanh Huyen, Nguyen Thi Ha Giang, Bui Chi Bao<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016: 136 - 143<br /> <br /> Background: Neuroblastoma (NB) is a primitive solid tumor of sympathetic system which originates from<br /> neural crest. NB is the most common tumor of children, accounting for 15% cases of death in pediatric cancer.<br /> Recent studies using high-throughput next generation sequencing identified mutations that involved in epigenetic<br /> regulations, particularly ARID1A gene in neuroblastoma. ARID1A is a subunit of SWI/SNF complex which<br /> participates in transcriptional regulation through chromatin remodeling. Until now, there is no ARID1A<br /> sequencing data reported of NB cases in Vietnam. Therefore, establishing the process of ARID1A sequencing<br /> through enriching ARID1A exon products is required.<br /> Objective: To identify all 20 exons and exon-intron boundary regions of ARID1A gene.<br /> Methods: Optimizing all PCR parameters for 20 exons of ARID1A gene. DNA was extracted from blood of<br /> <br />   <br /> Đại học khoa học tự nhiên TP. HCM Bệnh viện Nhi Đồng 2 Đại học Y Dược TP. HCM<br /> Tác giả liên lạc: TS. Bùi Chí Bảo, ĐT: 09097008225 Email: bcbao@ump.edu.vn<br /> <br /> 136 Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> healthy people and tumors of neuroblastoma patients. All PCR products were confirmed by Sanger method.<br /> Results: PCR products showed specific for all primer designs of ARID1A from exon 2 to 20, and partial exon<br /> 1 (1b). Exon 1a was unqualified due to high GC contents.<br /> Conclusion: Successful optimization for 20 exons of ARID1A and ready to step in next sequencing of the<br /> whole exomes.<br /> Key words: Neuroblastoma, enrichment, sequencing, ARID1A.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ hóa và phát triển của tế bào. BAF250a tương tác<br /> với vùng methyl hóa nhằm làm “im lặng” các<br /> U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là một<br /> gen phiên mã trong một số ung thư ở người. Đột<br /> dạng u đặc ở trẻ em, chứa các tế bào ung thư<br /> biến gen ARID1A cũng được tìm thấy ở nhiều<br /> hình thành từ mô thần kinh của tuyến thượng<br /> loại ung thư khác nhau với tần số đột biến cao<br /> thận, cổ, ngực, hoặc cột sống. Hầu hết các trường<br /> như: ung thư tế bào ác tính ở tử cung (49,1%),<br /> hợp UNBTK xảy ra ở trẻ em dưới 5 tuổi .UNBTK<br /> ung thư nội mạc tử cung (39%), ung thư dạ dày<br /> chiếm khoảng 8-10% các trường hợp ung thư ở<br /> (18,7%), ung thư bàng quang (14,3%) , ung thư<br /> trẻ em và là nguyên nhân gây tử vong cho 15%<br /> ruột kết (9,7%) và ung thư phổi (9,7%)(6). Như<br /> số ca tử vong ung thư ở trẻ em(1). Bệnh nhân<br /> vậy việc khảo sát các đột biến gen ARID1A trên<br /> thường được phát hiện bệnh ở giai đoạn trễ khi<br /> các trường hợp mắc UNBTK - là hoàn toàn cần<br /> u đã di căn. Bệnh nhân UNBTK có tỷ lệ tái phát<br /> thiết, giúp xác định vai trò của gen này trong<br /> sau khi điều trị và tử vong cao. Nguyên nhân là<br /> việc hình thành và phát triển khối u. Ở giai đoạn<br /> do thiếu cơ sở di truyền để tiên lượng bệnh, chẩn<br /> đầu tiên của nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tối<br /> đoán và điều trị hiệu quả. Do đó, việc nghiên<br /> ưu hóa quy trình PCR toàn bộ exon của gen<br /> cứu sự biến đổi của gen nhằm xây dựng cơ sở di<br /> ARID1A nhằm thu nhận các sản phẩm PCR đủ<br /> truyền của UNBTK qua đó cung cấp các dấu ấn<br /> chất lượng tạo tiền đề cho quá trình giải trình tự.<br /> sinh học hỗ trợ chẩn đoán, điều trị, phát hiện dư<br /> lượng bệnh và theo dõi tình trạng bệnh là rất cần ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> thiết. Ở Việt Nam, có hai công trình nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu<br /> UNBTK tại bệnh viện Nhi Trung Ương và Đại<br /> Mẫu mô UNBTK được thu nhận từ bệnh<br /> học Y Dược TP HCM nhằm sàng lọc nhóm nguy<br /> viện Nhi Đồng 2. Tiêu chuẩn chọn mẫu: bệnh<br /> cơ MYCN(11,12). Nhiều nghiên cứu mới về<br /> nhân chưa phát hiện khối u nào khác và chưa<br /> UNBTK bằng giải trình tự gen thế hệ mới đã<br /> qua điều trị, đồng thời không mắc hội chứng<br /> giúp phát hiện các nhóm gen thường xuyên đột<br /> Coffin-siris (vì liên quan đến di truyền đột biến<br /> biến trên các bệnh nhân như: MYCN, ALK,<br /> trên gen ARID1A).<br /> ATRX,(1,2)… đồng thời cũng ghi nhận sự tác<br /> động của các yếu tố điều hòa ngoại di truyền Thu nhận mẫu<br /> (epigenetic), nổi bật trong đó là ARID1A và vai Máu được thu nhận từ tình nguyện viên<br /> trò của chúng trong sự thất bại trong điều trị ở khỏe mạnh.<br /> giai đoạn sớm và tiên lượng xấu trên ở bệnh Mẫu mô được thu nhận tại bệnh viện Nhi<br /> nhân UNBTK vào năm 2013(8). Đồng 2. Mô sau khi phẫu thuật được giữ trong<br /> ARID1A (AT-rich interactive domain – môi trường DMEM (Invitrogen), 10% FBS, 5% PS<br /> containing protein 1A) là gen ức chế khối u, nằm (Kháng sinh).<br /> trên cánh ngắn NST số 1 (1p35.3). ARID1A mã Tách chiết DNA<br /> hóa protein BAF250a, là tiểu phần lớn trong DNA bộ gen được ly trích bằng Wizard<br /> phức hợp SWI/SNF có chức năng điều hòa biến Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA).<br /> đổi chromatin trong quá trình tăng trưởng, biệt<br /> <br /> <br /> Thần kinh 137<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> Đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA, những Chu trình luân nhiệt<br /> mẫu có giá trị tỷ lệ về mật độ quang đo ở bước Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian<br /> o<br /> Biến tính 98 C 3 phút<br /> sóng 260/280 đạt từ 1,8 – 2,0 mới được sử dụng o o<br /> 98 C 10 giây 72 C<br /> để tiến hành phản ứng PCR. Bắt cặp<br /> o<br /> 56 C 20 giây<br /> o<br /> Thiết kế mồi Kéo dài 72 C 90 giây<br /> o<br /> 72 C 10 phút<br /> Mồi được thiết kế bằng phần mềm CLC<br /> Main Workbench 5.5 dựa trên trình tự tham Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên<br /> khảo của gen ARID1A trên NCBI (NG_029965.1). gel agarose<br /> Độ đặc hiệu của mồi được kiểm tra bằng phần Sử dụng gel agarose 2% có nhuộm ethidium<br /> mềm Primer-BLAST trên NCBI. bromide và quan sát dưới màn soi gel GelDoc-It<br /> Chương trình trực tuyến SNPCheck TS 310 (UVP, USA), sản phẩm PCR cho một<br /> (https://secure.ngrl.org.uk/SNPCheck/snpcheck.htm) băng duy nhất đúng kích thước.<br /> được sử dụng để kiểm tra vị trí đa hình đơn Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp<br /> nucleotide (SNP – Single Nucleotide Sanger<br /> Polymorphism) cần tránh ở đầu 3’ của mồi.<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng<br /> Khuếch đại exon của gen ARID1A bằng kỹ illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band<br /> thuật PCR Purification Kit (GE Healthcare, USA). Sản phẩm<br /> Thiết lập điều kiện cho phản ứng PCR với PCR sau khi tinh sạch được thực hiện phản ứng<br /> mỗi phản ứng PCR có chứa thành phần phản cycle sequencing với BigDye® version 3.1 Cycle<br /> ứng của Kit TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase Sequencing kit (Applied Biosystems, USA), theo<br /> (TaKara, Nhật Bản) và chu trình luân nhiệt được 2 chiều xuôi và ngược. Trình tự DNA được đọc<br /> thực hiện trên máy Mastercycler@ProS bằng máy ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied<br /> (Eppendorf, Đức) như bảng 1. Các phản ứng Biosystem, Mỹ). Kết quả giải trình tự được phân<br /> luôn kèm theo một chứng âm không chứa DNA tích bằng phần mềm CLC Main Workbench 5.5<br /> để kiểm soát ngoại nhiễm. và so sánh kết quả giải trình tự với trình tự tham<br /> khảo NG_029965.1 trên NCBI.<br /> Bảng 1: Điều kiện phản ứng PCR ban đầu<br /> Thành phần phản ứng Thể tích (µl) KẾT QUẢ<br /> PCR buffer 10X 1,5<br /> dNTP (250µM mỗi loại ) 1,5 Kết quả thiết kế mồi và thử nghiệm chạy<br /> Mồi xuôi (10 µM) 0,75 mồi<br /> Mồi ngược (10 µM) 0,75 Gen ARID1A nằm trên cánh ngắn NST số 1<br /> Taq Polymerase (5 U/µl) 0,1<br /> (1p35.3) gồm 20 exon với chiều dài hơn 86 kb<br /> DNA (50 ng – 100 ng) 1<br /> H2O 9,4 được thiết kế với 14 cặp mồi - Một số các exon có<br /> Tổng thể tích 15 kích thước ngắn và nằm gần nhau sẽ được<br /> khuếch đại chung một cặp mồi.<br /> Bảng 2: Trình tự mồi để khuếch đại 20 exon của gen ARID1A<br /> o<br /> STT Mồi Tên mồi Trình tự (5’ -> 3’) Vị trí exon Kích thướcPCR (bp) %GC Tm ( C)<br /> 1 1Fa GGTAAAATGGCAGTGCTGAG<br /> 1 1008<br /> 1Ra TTCCCGTTCGAGTTCTTCAG<br /> 2 1Fb TCGGAGCTGAAGAAAGCCGA 55 55,4<br /> 1 1217<br /> 1Rb GAGAGAAGAGCCAGACAATG 50 55,4<br /> 3 2F AGGTTACTAGGTTGGTCTCA 45 53,4<br /> 2 466<br /> 2R ATTCCTGTCAAGAGGCTTGG 50 55,4<br /> 4 3F CATCAGTGCATAGCTTCTCA 3-4 1872 45 53,4<br /> <br /> <br /> <br /> 138 Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> o<br /> STT Mồi Tên mồi Trình tự (5’ -> 3’) Vị trí exon Kích thướcPCR (bp) %GC Tm ( C)<br /> 4R TTGCATTGGTTTCCTCTCTG 45 53,4<br /> 5 5F ACGAGTGAAACACTGTCTCA 45 53,4<br /> 5-6 869<br /> 6R CTGCATAGGGCACTCAAATG 50 55,4<br /> 6 7F CAGGATAAGGATGGAGAGCA 50 55,4<br /> 7-8 1296<br /> 8R CTGGTTTAGGTCCAGAAGCA 50 55,4<br /> 7 9F ACAGCACTATTTGGCTCCAG 50 55,4<br /> 9 - 11 1939<br /> 11R TACCACATGAAGCCAGTGAG 50 55,4<br /> 8 12F GATGAATACCTTACAGCCTG 45 53,4<br /> 12 368<br /> 12R ATCCTGAATAAGAGGCCAGG 50 55,4<br /> 9 13F TTCGTGTGTTTGTGTGAGAG 45 53,4<br /> 13 - 17 1560<br /> 17R GCTTCTTAGACTTCAACACG 45 53,4<br /> 10 18F TGGCATCTGTGGGCTTTATG 50 55,4<br /> 18 1031<br /> 18R TAAGGTGGAGGGAACAATGG 50 55,4<br /> 11 19F CAGAGTAGCTTCACTGATGG 50 55,4<br /> 19 305<br /> 19R CCAAGGTGGCTAAAGATGAG 50 55,4<br /> 12 20Fa CCTCTCCCAACTGATACAGA 50 55,4<br /> 20a 982<br /> 20Ra CTCAAAGTCATTGCCTGGCA 50 55,4<br /> 13 20Fb AACCCCACAGTAAGGATGAG 50 55,4<br /> 20b 1192<br /> 20Rb AAGGAACAGAAAGGCGTGAG 50 55,4<br /> 14 20Fc AGAATCCAGTTTACCCTGTG 45 53,4<br /> 20c 1355<br /> 20Rc CTCACACTAAGGGAGGTTTG 50 55,4<br /> 15 20Fc2 TGACTGCTGAACTGTGTGTGG 55 57,2<br /> 216<br /> 20Rc2 TACAGCTTGCTGCTGACCCAG 55 57,8<br /> 1Fa2 GCAGAAAGCGGAGAGTCACA 55 57.8<br /> 16 1a 689<br /> 1Ra2 CCCGTTCGAGTTCTTCAGGT 55 57.4<br /> <br /> <br /> <br /> Kết quả khảo sát sự bắt cặp của mồi được khuếch đại cùng thành phần phản ứng và<br /> chu trình luân nhiệt theo bảng 1. Kết quả điện di<br /> DNA tách chiết từ mẫu máu được sử dụng<br /> được thể hiện trong hình 1.<br /> để tối ưu hóa phản ứng PCR. Tất cả 20 exon<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm 14 phản ứng PCR. M: Thang chuẩn GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder. A.<br /> Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi số 1 đến 5 (giếng 1 đến 5). B. Kết quả điện di sản phẩm PCR với<br /> cặp mồi số 6 đến 14 (giếng 6 đến 11)<br /> Từ hình 1 cho thấy trong 14 giếng trừ giếng 1 đúng kích thước nhưng mờ. Do đó, cặp mồi số 1<br /> và 4, tất cả các giếng còn lại đều cho vạch điện di và số 4 cần được tối ưu điều kiện phản ứng PCR.<br /> sáng rõ, kích thước các vạch đúng với kích mong Đối với cặp mồi số 4 (3F/4R), chúng tôi bổ<br /> muốn, không có sản phẩm ký sinh chứng tỏ với sung Mg2+ 25 mM vào thành phần phản ứng.<br /> điều kiện như bảng 1 là tối ưu để khuếch đại Khảo sát nồng độ Mg2+ lần lượt là 1,5 mM (có sẵn<br /> các trình tự đích. Trong khi đó, cặp mồi số 1 cho trong Kit nên không bổ sung); 2 mM (bổ sung 0,3<br /> kết quả âm tính và cặp mồi số 4 cho vạch điện di µl Mg2+ 25 mM); 2,5 mM (bổ sung 0,6 µl Mg2+ 25<br /> <br /> <br /> Thần kinh 139<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> mM) và 3 mM (bổ sung 0,9 µl Mg2+ 25 mM). Kết Đối với cặp mồi số 1 (1Fa/1Ra), chúng tôi đã<br /> quả cho thấy, ở nồng độ Mg2+ 2 mM (giếng 2) sản tiến hành phản ứng PCR ở các nhiệt độ bắt cặp<br /> phẩm PCR cho vạch điện di đúng kích thước, khác nhau: 54oC, 56oC, 58oC, 60oC, 62oC, và lần<br /> không có băng phụ như, sáng rõ hơn so với sản lượt bổ sung 1M Betaine và DMSO 5%, thậm chí<br /> phẩm của phản ứng không bổ sung Mg2+ (giếng vùng exon 1a cũng thiết kế thêm cặp mồi số 16<br /> 1) (Hình 2). Như vậy, đối với cặp mồi (3F/4R) cần (1Fa2/1Ra2) và tối ưu nhưng phản ứng PCR vẫn<br /> bổ sung 0,3 µl Mg2+ 25 mM vào thành phần phản không cho sản phẩm mục tiêu.<br /> ứng PCR để cho kết quả tối ưu. Áp dụng điều kiện tương tự trên DNA từ<br /> mẫu NB06, NB25, NB46. Kết quả điện di sản<br /> phẩm PCR của 3 mẫu được trình bày như hình 3.<br /> Kết quả cho thấy hầu hết sản phẩm PCR của các<br /> cặp mồi cho vạch điện di đúng kích thước, sáng<br /> rõ; trừ cặp mồi số 2 (1Fb/1Rb), 4 (3F/4R), 7<br /> (9F/11R), 10 (18F/18R) cho vạch phụ có kích<br /> thước thấp hơn và mờ hơn so với vạch của sản<br /> phẩm PCR mục tiêu (hình 3). Tuy nhiên, khi<br /> tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng lên 58oC đối<br /> với cặp mồi 4, 7, 10 (hình 4A) và 62oC đối với cặp<br /> mồi số 2 (hình 4B), kết quả sản phẩm PCR không<br /> còn sản phẩm ký sinh, vạch điện di sáng rõ,<br /> đúng kích thước (hình 4).<br /> Hình 2: Hình kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp<br /> mồi 3F/4R. Giếng 1: Mg2+ 1,5Mm; Giếng 2: Mg2+<br /> 2mM; Giếng 3: Mg2+ 2,5mM; Giếng 4: Mg2+ 3mM;<br /> M: thang chuẩn GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với Hình 4: Kết quả điện di cặp mồi 2, 4, 7,10. A. Kết quả điện di<br /> cặp mồi số 2 đến 14 trên mẫu NB06. M: sản phẩm PCR với cặp mồi số 4, 7, 10. B. Kết quả điện di sản<br /> thang chuẩn GeneRuler 1 kb Plus DNA o<br /> phẩm PCR với cặp mồi số 2 và nhiệt độ bắt cặp là 56 C (giếng<br /> Ladder o o o<br /> 1), 58 C (giếng 2), 60 C (giếng 3) , 62 C (giếng 4)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 140 Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bảng 3: Điều kiện tối ưu của phản ứng PCR của từng exon.<br /> Thành phần phản ứng<br /> Exon Chu trình luân nhiệt<br /> (Tổng thể tích là 15 µl)<br /> 1Fb/1Rb PCR buffer 10X : 1,5 µl Giai đoạn<br /> o<br /> dNTP (250 µM mỗi loại ) 1,5 µl Biến tính : 98 C 3 phút<br /> o<br /> Mồi xuôi (10 µM) 0,75 µl 98 C 10 giây<br /> o 40<br /> Mồi ngược (10 µM) 0,75 µl Bắt cặp: 62 C 20 giây<br /> o chu kỳ<br /> Taq Polymerase (5 U/µl) 0,1 µl Kéo dài: 72 C 90 giây<br /> o<br /> DNA (50 ng – 100 ng) 1 µl 72 C 10 phút<br /> Nước cất hai lần 9,4 µl<br /> <br /> 2F/2R, 5F/6R, 7F/8R, PCR buffer 10X 1,5 µl Giai đoạn<br /> 12F/12R, 13F/17R, , o<br /> dNTP (250µM mỗi loại ) 1,5 µl Biến tính : 98 C 3 phút<br /> 19F/19R, 20Fa/20Ra, Mồi xuôi (10 µM) 0,75 µl<br /> o<br /> 98 C 10 giây<br /> 20Fb/20Rb, 20Fc/20Rc o 40<br /> Mồi ngược (10 µM) 0,75 µl Bắt cặp: 56 C 20 giây<br /> o chu kỳ<br /> Taq Polymerase (5 U/µl) 0,1 µl Kéo dài: 72 C 90 giây<br /> o<br /> DNA (50 ng – 100 ng) 1 µl 72 C 10 phút<br /> Nước cất hai lần 9,4 µl<br /> 9F/11R, 18F/18R PCR buffer 10X 1,5 µl Giai đoạn<br /> o<br /> dNTP (250µM mỗi loại ) 1,5 µl Biến tính : 98 C 3 phút<br /> o<br /> Mồi xuôi (10 µM) 0,75 µl 98 C 10 giây<br /> o 40<br /> Mồi ngược (10 µM) 0,75 µl Bắt cặp: 58 C 20 giây<br /> o chu kỳ<br /> Taq Polymerase (5 U/µl) 0,1 µl Kéo dài: 72 C 90 giây<br /> o<br /> DNA (50 ng – 100 ng) 1 µl 72 C 10 phút<br /> Nước cất hai lần 9,4 µl<br /> 3F/4R PCR buffer 10X 1,5 µl Giai đoạn<br /> o<br /> dNTP (250 µM mỗi loại) 1,5 µl Biến tính : 98 C 3 phút<br /> o<br /> Mồi xuôi (10 µM): 0,75 µl 98 C 10 giây<br /> o 40<br /> Mồi ngược (10 µM) 0,75 µl Bắt cặp: 58 C 20 giây<br /> o chu kỳ<br /> Taq Polymerase (5 U/µl) 0,1 µl Kéo dài: 72 C 90 giây<br /> o<br /> DNA (50 ng – 100 ng): 1 µl 72 C 10 phút<br /> 2+<br /> Mg 25 mM 0,3µl<br /> Nước cất hai lần 9,1 µl<br /> <br /> Kết quả giải trình tự<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5: Vùng poly A của exon 20c của mẫu NB06<br /> Các sản phẩm PCR của mẫu NB06, NB25, DNA. Toàn bộ kết quả giải trình tự chuỗi DNA<br /> NB46 của 13 cặp mồi (từ exon 1b đến 20) đã tối đều cho kết quả trùng với các vùng gen ARIDA<br /> ưu hóa , không có cặp mồi số (1Fa/1Ra) sau khi từ GenBank. Tuy nhiên, vùng trình tự được<br /> tinh sạch được tiến hành giải trình tự chuỗi khuếch đại với cặp mồi 14 (20Fc/20Rc) (nằm trên<br /> <br /> <br /> Thần kinh 141<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016<br /> <br /> exon 20) có hai vùng poly A dài hơn 10 trong khi đó cặp mồi 1Fb/1Rb hoạt động tốt nhất<br /> nucleotide nên không đọc được kết quả sau ở 62oC.<br /> vùng poly A (hình 5). Vùng exon 1 có trình tự GC chiếm giàu GC<br /> BÀN LUẬN tới 77% nên dễ tạo cấu trúc thứ cấp ảnh hưởng<br /> đến phản ứng PCR. Đây cũng là một trong<br /> Thành phần phản ứng và chu trình luân những nguyên nhân chính gây thất bại trong<br /> nhiệt được thiết lập ban đầu (Bảng 1) thích hợp khuếch đại vùng exon 1 Nghiên cứu đã tiến<br /> để khuếch đại đa số các exon của gen ARID1A. hành tách riêng vùng trình tự này thành hai<br /> Tuy nhiên, cặp mồi 3F/4R cho kết quả vạch điện vùng nhỏ, đồng thời khảo sát nhằm tối ưu nhiệt<br /> di mờ nên tối ưu nồng độ Mg2+. Hầu hết DNA độ bắt cặp, nồng độ Mg2+ và thậm chí tối ưu nồng<br /> polymerase cần một cation hóa trị II như là một độ Betaine và DMSO, phối hợp 1M Betaine và<br /> đồng yếu tố để thực hiện chức năng. Phần lớn DMSO 5% vì betaine và DMSO giúp ổn định<br /> các trường hợp tối ưu hoá phản ứng PCR đều sử mạch khuôn, hạn chế tạo cấu trúc thứ cấp(6,5,10),<br /> dụng Mg2+ để tăng hoạt động của Taq tuy nhiên vẫn không cho kết quả khả quan. Vấn<br /> polymerase. Tuy nhiên, Mg2+ tạo thành phức hợp đề này có thể được giải quyết bằng cách sử dụng<br /> với dNTP, primer, DNA mạch khuôn mang điện Kit PCR chuyên cho vùng giàu GC để khuếch<br /> tích âm. Nếu lượng Mg2+ quá nhiều sẽ làm tăng đại exon 1a.<br /> khả năng bắt cặp sai của primer (mismatched<br /> Kết quả giải trình tự các exon đã được tối ưu<br /> primer), đồng thời làm giảm độ nhạy của<br /> hóa PCR, cho thấy các vùng khuếch đại trên 1kb<br /> enzyme trong việc gắn nucleotide vào mạch<br /> (3F/4R, 7F/8R, 9F/11R, 13F/17R, 20Fc/20Rc) cần<br /> khuôn tạo sản phẩm không đặc hiệu(5). Chính vì<br /> giải trình tự bằng cả mồi xuôi và mồi ngược<br /> vậy khi nồng độ Mg2+ 2 mM thì sản phẩm PCR<br /> nhằm thu nhận toàn bộ trình tự với kết quả tối<br /> cho vạch điện di sáng rõ, không băng phụ; lên<br /> ưu. Một số trình tự có chứa cấu trúc poly A/T<br /> 2,5 mM và 3 mM thì xuất hiện sản phẩm không<br /> (exon5, 6) nên tránh sử dụng mồi xuôi mà thay<br /> đặc hiệu.<br /> thế bằng mồi ngược để thu nhận kết quả. Ngoài<br /> So sánh kết quả PCR giữa mẫu máu và mẫu ra, exon 20c, hai trình tự poly A dài hơn 10<br /> mô nhận thấy có sự khác biệt ở các exon 1b, 3 - 4, nucleotide nằm ở giữa hai mồi cách nhau 216<br /> 9 - 11 và 18 là khi sử dụng DNA mẫu mô thì kết nucletotide gây nhiễu tín hiệu giải trình tự. Do<br /> quả PCR cho sản phẩm ký sinh. Sự khác biệt này đó, vùng exon 20c được thiết kế thêm mồi xuôi<br /> có thể do các chất ức chế PCR xuất phát từ mẫu (20Fc2) và mồi ngược (20Rc2) (bảng 2) giữa 2<br /> hoặc trong Kit tách DNA. Các chất ức chế này có vùng poly A để có thể đọc được toàn bộ exon.<br /> thể bất hoạt Taq polymerase, phá hủy hoặc bắt Kết quả giải trình vùng poly A cho thấy với cặp<br /> trên DNA, hoặc can thiệp vào bước ly giải tế bào. mồi 20Fc2 và 20Rc2 cho thấy đọc hết toàn bộ<br /> Đối với mô ung thư có thể chứa collagen, heme, giữa 2 vùng poly A. Như vậy, 20 exon của gen<br /> hemoglobin,… là một trong những nguyên nhân ARID1A trừ exon 1a đều cho kết quả giải trình tự<br /> làm giảm hiệu quả PCR. Thông thường, để ức sóng tốt.<br /> chế các chất này thì cần bổ sung albumin từ<br /> Trong nghiên cứu này, DNA được tách chiết<br /> huyết thanh bò (BSA – bovine serum albumin)(9)<br /> từ mẫu máu của người tình nguyện khỏe mạnh<br /> - hoặc có thể gia tăng nhiệt độ bắt cặp nhằm tăng<br /> để tối ưu phản ứng PCR. Quy trình tối ưu được<br /> khả năng bắt đặc hiệu của mồi vào DNA mạch<br /> áp dụng lên đối tượng nghiên cứu là ba mẫu<br /> khuôn. Do đó, khi tăng nhiệt độ bắt cặp lên 58oC<br /> DNA tách chiết từ mẫu mô UNBTK. Tuy nhiên,<br /> thì các cặp mồi 3F/4R, 9F/1R, 18F/18R bắt đặc<br /> kết quả giải trình tự không cho thấy bất thường<br /> hiệu với DNA và cho sản phẩm PCR tốt nhất;<br /> nào trên gen ARID1A.<br /> <br /> <br /> <br /> 142 Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Techniques, 1st edition, pp. 10.2.1-10.2.31. Jonh Wile & Sons,<br /> KẾT LUẬN<br /> New Jersey.<br /> Nghiên cứu đã tối ưu phản ứng PCR cho hầu 6. Masliah-Planchon J, et al. (2015). SWI/SNF chromatin<br /> remodeling and human malignancies. Annu Rev Pathol, 10:<br /> hết 20 exon của gen ARID1A (trừ 1a). Tạo nền 145-71.<br /> tảng cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phát 7. Radstrom P, et al. (2004). Pre-PCR processing: strategies to<br /> generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol, 26(2): 133-<br /> hiện đột biến của gen ARID1A trên bệnh nhân<br /> 46.<br /> UNBTK ở Việt Nam. Nghiên cứu này được tài 8. Sausen M, et al. (2013). Integrated genomic analyses identify<br /> trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ ARID1A and ARID1B alterations in the childhood cancer<br /> neuroblastoma. Nat Genet, 45(1): 12-7.<br /> Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106- 9. Schleiermacher G, et al. (2014). Recent insights into the biology<br /> YS.06-2014.48. of neuroblastoma. Int J Cancer, 135(10): 2249-61.<br /> 10. Susan Frackman, et al. (1998). Betaine and DMSO: Enhancing<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO Agents for PCR. Promega Notes, 65: 27.<br /> 1. Cheung NK, et al. (2013). Neuroblastoma: developmental 11. Trương Đinh Kiều Diễm và cs. (2015). Xây dựng quy trình<br /> biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev phân loại nhóm nguy cơ cao của U nguyên bào thần kinh<br /> Cancer, 13(6): 397-411. khuếch đại MYCN. Y học TP Hồ Chí Minh, tập 19: 1-7.<br /> 2. Daniel A, et al. (2014). Neuroblastoma. In: Graham Dellaire. 12. Vũ Đình Quang và cs. (2013). Đánh giá sự khuếch đại gen<br /> Cancer Genomics, 1st edition, pp. 357-376. Academic Press, MYCN trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh. Y Khoa, 6 (1):<br /> San Diego. 68-73.<br /> 3. Jennifer N, et al. (2013 ). ARID1A mutations in cancer: another<br /> epigenetic tumor suppressor?. Cancer Discov, 3(1): 35-43.<br /> 4. Jensen MA (2010). DMSO and betaine greatly improve Ngày nhận bài báo: 24/11/2015<br /> amplification of GC-rich constructs in de novo synthesis. PLoS<br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015<br /> One, 5(6): e11024.<br /> 5. Kuslich CD, et al. (2008). Overview of PCR. In: Sean RG, Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016<br /> Emily AW (eds). Current Protocols Essential Laboratory<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Thần kinh 143<br />