Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật xử lý nước thải chế biến tinh bột sắn

B NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

--------------

VŨ THÚY NGA

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÝ NƢỚC THẢI CHẾ BIẾN TINH BỘT SẮN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 62.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS. Phạm Văn Toản

2. PGS.TS. Nguyễn Văn Viết

HÀ NỘI, 2016

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

MỞ ĐẦU 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tinh bột sắn và nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 1.1.1.Tinh bột sắn và qui trình chế biến 1.1.2. Nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 1.1.3. Ô nhiễm môi trƣờng do nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 1.2. Xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn. 1.2.1. Phƣơng pháp xử lý sinh học trong điều kiện tự nhiên. 1.2.2. Phƣơng pháp xử lý sinh học trong điều kiện nhân tạo. 4 4 4 10 13 15 17 18

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, N I DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Các mẫu thu thập và chủng vi sinh vật 2.1.2. Hóa chất tinh khiết 2.1.3. Dung dịch và môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 2.1.4. Thiết bị, dung cụ 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu, xử lý mẫu 2.3.2. Phƣơng pháp xác định đặc điểm (tính chất) nƣớc thải CBTBS 2.3.3. Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn vi sinh vật 2.3.4. Định danh vi sinh vật tuyển chọn 2.3.5. Nhân sinh khối vi sinh vật bằng kỹ thuật lên men chìm 2.3.6. Nhân sinh khối vi sinh vật trên giá thể rắn 2.3.7. Tạo chế phẩm và đánh giá chất lƣợng chế phẩm 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 47 52 53 55 56

56

104 106 107 108 109 112 112 113

2.3.8. Phƣơng pháp xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn bằng chế phẩm vi sinh vật (Xử lý gián đoạn) 2.3.9. Đánh giá hiệu quả xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn của chế phẩm vi 57 sinh vật 58 2.3.10. Kiểm tra sự sống sót của vi sinh vật bằng kỹ thuật DGGE 61 2.3.11. Phƣơng pháp xử lý số liệu 62 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62 3.1. Hiện trạng nƣớc thải nhà máy chế biến tinh bột sắn tỉnh Ninh Bình. 66 3.2. Phân lập tuyển chọn vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 67 3.2.1. Vi sinh vật chuyển hóa hợp chất Cacbon (tinh bột, xenlulo) 69 3.2.2. Vi sinh vật chuyển hóa hợp chất chứa Phospho 70 3.2.3. Vi sinh vật chuyển hóa Phosphat hữu cơ và đồng hóa Phospho 73 3.2.4. Định danh và xác định độ an toàn của các vi sinh vật nghiên cứu 83 3.3. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 3.3.1. Khả năng tổ hợp các vi sinh vật nghiên cứu 83 3.3.2. Nhân sinh khối các vi sinh vật tuyển chọn bằng phƣơng pháp lên men chìm 85 99 3.3.3. Nhân sinh khối vi sinh vật trên giá thể rắn 101 3.3.4. Chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 3.4. Xây dựng qui trình sử dụng gchế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn 3.4.1. Ảnh hƣởng của pH nƣớc thải đến hiệu suất xử lý 3.4.2. Ảnh hƣởng của oxy hòa tan đến hiệu suất xử lý 3.4.3. Ảnh hƣởng của thời gian lƣu nƣớc thải đến hiệu suất xử lý 3.4.4. Ảnh hƣởng của lƣợng chế phẩm bổ sung 3.5. Nghiên cứu hiệu quả xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn của chế phẩm 3.5.1. Hiệu quả xử lý qui mô phòng thí nghiệm 3.5.2. Hiệu quả xử lý tại nhà máy chế biến tinh bột sắn tỉnh Ninh Bình 3.5.3. Xác định khả năng tồn tại của các vi sinh vật nghiên cứu trong bùn thải bằng kỹ thuật DGGE 114

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 117

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 119

TÀI LIỆU THAM KHẢO 120

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit Deoxyribonucleic

Anammox Anaerobic ammonium oxidizers

Ammonia-Oxidizing-Bacteria (vi khuẩn oxi hóa ammonium) AOB

Axit Ribonucleic ARN

Biochemical Oxygien Demand (Nhu cầu oxy sinh hóa) BOD

BTNMT Bộ Tài nguyên Môi trƣờng

CBTBS Chế biến tinh bột sắn

Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) CFU

Chemical Oxygien Demand (Nhu cầu oxy hóa học) COD

CIRAT Centre International Research Agriculture and Development

(Trung tâm hợp tác nghiên cứu phát triển nông nghiệp)

cs Cộng sự

DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (điện di biến tính)

3,5 axit dinitrosalicylic DNS

Cacboxymethyl xenluloza CMC

Dissolved oxygien (oxy hòa tan) DO

Đối chứng ĐC

Food and Agriculture Organization (tổ chức Lƣơng thực và Nông FAO

nghiệp Liên Hợp Quốc)

ISP International Streptomyces Project (Chƣơng trình xạ khuẩn Quốc

tế)

MPN Most Probable Number (số khả hữu)

Nitơ tổng số Nts

Nutrient agar NA

Nutrient broth NB

Optical Density (mật độ quang) OD

Phospho tổng số Pts

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PCR

Phát triển nông thôn PTNT

Quy chuẩn Việt Nam QCVN

Ribosomal axit Deoxyribonucleic rADN

Ribosomal axit Ribonucleic rARN

Sequencing Batch Reactor (Bể hiếu khí gián đoạn) SBR

Suspended Solid (Chất rắn lơ lủng) SS

Tinh bột sắn TBS

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TNHH MTV Trách nhiệm hữu hạn Một thành viên

TNMT Tài nguyên môi trƣờng

Tripticase Soya Agar TSA

Total suspended solids (tổng chất rắn lơ lửng) TSS

TTSA Thailand tapioca starch Organization (Hiệp hội tinh bột sắn Thái

L Lan)

vòng/phút v/p

Volum/volum (Thể tích/thể tích) v/v

Vi sinh vật VSV

Weight/volum (Khối lƣợng/thể tích) w/v

DANH MỤC BẢNG

TT bảng Tên bảng Trang

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 3.1 7 8 11 12 12 63

3.2 65

3.3 66

3.4 3.5 3.6 67 68 69

Sản xuất sắn ở một số địa phƣơng của Việt Nam năm 2014 Lƣợng tinh bột sắn xuất khẩu của Việt Nam theo thị trƣờng năm 2015 Thành phần tính chất nƣớc thải từ sản xuất tinh bột sắn Chất lƣợng nƣớc thải từ sản xuất tinh bột sắn (chƣa xử lý) Thành phần nƣớc thải nhà máy chế biến tinh bột sắn Hiện trạng nƣớc nƣớc thải chế biến tinh bột sắn trƣớc và sau xử lý kỵ khí tại nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình, năm 2012 Chất lƣợng nƣớc thải chế biến tinh bột sắn sau xử lý hiếu khí và tách lọc chất rắn lơ lửng tại nhà máy công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình, năm 2012 Một số nhóm vi sinh vật có ích trong nƣớc thải chế biến tinh bột sắn tại nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình, năm 2012 Khả năng chuyển hóa hợp chất cacbon của các vi sinh vật phân lập Hoạt độ enzym của các vi sinh vật phân lập Khả năng xử lý BOD5 và COD trong nƣớc thải chế biến tinh bột sắn của vi sinh vật phân lập Khả năng chuyển hóa amoni của vi sinh vật phân lập Khả năng xử lý Nts trong nƣớc thải CBTBS của vi sinh vật phân lập Khả năng chuyển hóa Phosphat hữu cơ của vi sinh vật phân lập Khả năng đồng hóa Phospho của vi sinh vật phân lập Khả năng xử lý Pts trong nƣớc thải CBTBS của vi sinh vật phân lập Hoạt tính sinh học của các vi sinh vật tuyển chọn Đặc điểm sinh học và sinh hóa của xạ khuẩn SHX.12 Khả năng sử dụng nguồn hydratcacbon của vi khuẩn SHV.22 Khả năng sử dụng nguồn hydratcacbon của chủng vi khuẩn SHV.OA7

3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 Mức độ an toàn của các vi sinh vật nghiên cứu 3.17 3.18 70 70 71 71 72 72 74 75 77 83 84 85

Khả năng tồn tại của vi sinh vật trong điều kiện đơn lẻ và tổ hợp Hoạt tính sinh học của vi sinh vật nghiên cứu trong điều kiện đơn lẻ và hỗn hợp sau 90 ngày bảo quản Sinh khối vi sinh vật nghiên cứu trong các môi trƣờng lên men Sinh khối vi sinh vật nghiên cứu ở các tỉ lệ tiếp giống khác nhau Sinh khối vi sinh vật nghiên cứu ở các tốc độ cấp khí khác nhau 3.19 3.20 3.21 89 90 91

3.22 Miền khảo sát yếu tố điều kiện lên men thu sinh khối của các chủng vi 94

3.23 3.24 3.25 94 94 95

3.26 98

3.27 3.28 98 100

3.29 3.30 3.31 3.32 100 101 103 104

3.33 3.34 3.35 105 107 112

3.36 113 sinh vật tuyển chọn Phân tích phƣơng sai Anova của mô hình đối với S.fradiae SHX.12 Phân tích phƣơng sai Anova của mô hình đối với B.velezensis SHV.22 Phân tích phƣơng sai Anova của mô hình đối với N.europea SHV.OA7 Kết quả tối ƣu các yếu tố lên men đối với chủng vi sinh vật nghiên cứu Điều kiện lên men thu sinh khối vi sinh vật Sinh khối vi sinh vật sau 5 ngày lên men xốp với chất mang khác nhau Sinh khối vi sinh vật sau 5 ngày lên men xốp ở các tỷ lệ tiếp giống Sinh khối các vi sinh vật nghiên cứu trên giá thể rắn Chất lƣợng chế phẩm MIC-CAS 02 Hiệu quả xử lý chất hữu cơ trong nƣớc thải của chế phẩm MIC-CAS 02 ở qui mô 80 lít Hiệu quả xử lý Nts, Pts của chế phẩm MIC-CAS 02 ở qui mô 80 lít Ảnh hƣởng của oxy hòa tan (DO) đến hiệu suất xử lý Kết quả phân tích chất lƣợng nƣớc sau xử lý qui mô 200 lít với chế phẩm MIC-CAS 02 Hiệu quả xử lý nƣớc thải nhà máy tinh bột sắn Elmaco Ninh Bình bằng chế phẩm MIC-CAS 02

3.37 Mật độ vi sinh vật hiếu khí tổng số trƣớc và sau sử dụng chế phẩm 116 MIC-CAS 02

DANH MỤC HÌNH

TT hình Tên hình Trang

1.1 1.2 1.3 3.1 4 5 26 62

3.2 3.3 3.4 3.5 73 75 76 79

3.6 70

3.7 81

Các nƣớc sản xuất sắn trên thế giới năm 2014 Sản lƣợng sắn trên thế giới từ 2001-2014 Cấu trúc phân tử tinh bột Sơ đồ hệ thống xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn tại nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình Khuẩn lạc và bào tử chuỗi của chủng xạ khuẩn SHX.12 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn SHV.22 Đặc điểm sinh hóa và tế bào của vi khuẩn SHV.OA7 Vị trí phân loại của chủng SHX.12 với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự 16S rADN Vị trí phân loại của chủng SHV.22 với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự 16S rADN Vị trí phân loại của chủng SHV.OA7 với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự 16S rADN Mật độ vi sinh vật nhân sinh khối ở các nhiệt độ khác nhau Mật độ vi sinh vật ở điều kiện pH môi trƣờng khác nhau

Ảnh hƣởng của các yếu tố lên men đến mật độ tế bào vi sinh vật Bề mặt đáp ứng của mật độ tế bào chủng xạ khuẩn S.fradiae SHX.12 Bề mặt đáp ứng của mật độ tế bào chủng B.velezensis SHV.22 Bề mặt đáp ứng của mật độ tế bào chủng N.europea SHV.OA7

3.8 3.9 3.10 Mật độ vi sinh vật nghiên cứu sau thời gian nhân sinh khối khác nhau 3.11 Mật độ vi sinh vật với các tỉ lệ tiếp giống khác nhau 3.12 Mật độ vi sinh vật nhân sinh khối ở tốc độ cấp khí khác nhau 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Mức độ đáp ứng sự mong đợi đối với các chủng vi sinh vật nghiên 86 87 88 90 91 96 97 97 97 98

102 108 109 110 3.18 3.19 3.20 3.21

114 3.22

115 3.23 cứu Sơ đồ tạo chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn Ảnh hƣởng của thời gian lƣu nƣớc đến hiệu suất xử lý Ảnh hƣởng của lƣợng chế phẩm bổ sung đến hiệu quả xử lý COD Sơ đồ qui trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải biogas của cơ sở CBTBS Sản phẩm PCR-DGGE gien 16S rADN của vi sinh vật trong các mẫu bùn và chủng đơn Điện di biến tính (DGGE) gien 16S rADN của vi sinh vật trong các mẫu bùn và chủng đơn

1

MỞ ĐẦU

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) một trong số loại cây lƣơng thực quan

trọng đặc biệt ở các nƣớc đang phát triển vì dễ trồng, không kén đất và cho thu

hoạch với năng suất cao. Hiện nay, do nhu cầu về tinh bột sắn tăng cao để phục vụ

nguyên liệu cho các ngành công nghiệp nhƣ chế biến thực phẩm, công nghiệp giấy,

công nghiệp dệt, nhiên liệu sinh học…nên các nƣớc trồng sắn trong đó có Việt Nam

tập trung vào sản xuất tinh bột sắn để đáp ứng nhu cầu trong nƣớc và xuất khẩu.

Các cơ sở, nhà máy chế biến tinh bột sắn (CBTBS) tuy đáp ứng nhu cầu

tiêu dùng của xã hội nhƣng do chỉ tập trung đầu tƣ để nâng cao năng suất và chất

lƣợng của sản phẩm, vấn đề quản lý và kiểm soát lƣợng nƣớc thải ra trong quá

trình sản xuất chƣa đƣợc đầu tƣ đồng bộ, hệ thống xử lý nƣớc thải không xử lý

triệt để dẫn đến các chỉ tiêu lý hóa sinh học đều vƣợt ngƣỡng cho phép, gây ô

nhiễm nghiêm trọng môi trƣờng. Thực tế đã có cơ sở nhà máy bị đình chỉ sản xuất

và phải nâng cấp xây dựng cải tạo hệ thống xử lý nƣớc thải để khắc phục hậu quả

theo quyết định 1788/QĐ TTg ngày 1/10/2013 của Thủ tƣớng Chính phủ về xử lý

triệt để các cơ sở gây ô nhiễm môi trƣờng.

Hiện tại, có rất nhiều phƣơng pháp xử lý nƣớc thải, tuy nhiên biện pháp hữu

hiệu nhất để xử lý nƣớc thải là biện pháp sinh học vì hiệu quả triệt để, không gây tái

ô nhiễm và chi phí đầu tƣ thấp (Chu Thị Thơm và cs, 2006). Biện pháp sinh học xử

lý nƣớc thải bằng vi sinh vật là phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm và đƣợc ứng rộng

phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới. Phƣơng pháp vi sinh vật không chỉ giải quyết

đƣợc tình trạng ô nhiễm môi trƣờng nƣớc mà còn không gây hại đến môi trƣờng

xung quanh, giúp ổn định cân bằng sinh thái và giá thành xử lý khá phù hợp với

các nƣớc đang phát triển. Do đó vấn đề sử dụng vi sinh vật có ích trong tự nhiên là

điều cần quan tâm và nghiên cứu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trƣờng nƣớc.

Theo Huỳnh Ngọc Phƣơng Mai (2006) trung bình để sản xuất đƣợc một tấn tinh bột sắn trong ngày phải sử dụng 12-20m3 nƣớc, do đó lƣu lƣợng nƣớc thải phát

sinh trong chế biến tinh bột sắn là rất lớn, mức độ ô nhiễm cao. Trong nƣớc thải chế

biến tinh bột sắn thƣờng có thành phần chất rắn lơ lửng cao do bột và xơ củ sắn sót

2

lại, nhu cầu oxy sinh hóa (BOD) và nhu cầu oxy hóa học (COD) có nồng độ cao

hàng chục ngàn mg/l gây khó khăn cho quá trình xử lý sinh học. Đặc biệt các chất

nhựa và hàm lƣợng nhất định hợp chất xyanua có trong nƣớc thải chế biến tinh bột

sắn còn làm cho nƣớc thải có màu đen, gây mùi khó chịu và ức chế nhiều loại vi

sinh vật có ích. Vì vậy, nghiên cứu các chủng vi sinh vật thích nghi với môi trƣờng

nƣớc thải nhằm lựa chọn đƣợc các chủng vi sinh vật phù hợp có khả năng phân hủy

mạnh các chất hữu cơ và chịu đƣợc các chất ức chế có trong nƣớc thải chế biến tinh

bột sắn là cần thiết.

Nhiều công trình khoa học nghiên cứu sử dụng vi sinh vật làm tác nhân

sinh học trong xử lý nƣớc thải giàu chất hữu cơ đã xác định đƣợc khả năng làm

giảm hàm lƣợng BOD, COD và chất hữu cơ trong nƣớc thải, tuy nhiên vẫn chƣa

có giải pháp hiệu quả trong việc tạo chế phẩm vi sinh vật cho xử lý nƣớc thải sau

CBTBS hoặc sử dụng kết hợp chế phẩm vi sinh vật với các giải pháp khác để nâng

cao hiệu quả xử lý nƣớc thải CBTBS, do vậy chất lƣợng nƣớc thải ra môi trƣờng

chƣa đảm bảo yêu cầu theo quy chuẩn 40/2011 của Bộ TNMT.

Xuất phát từ lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật xử lý

nước thải chế biến tinh bột sắn” có ý nghĩa cấp thiết góp phần xử lý triệt để nƣớc

thải sau chế biến tinh bột sắn.

Mục tiêu của đề tài luận án

- Tuyển chọn đƣợc vi sinh vật và tạo đƣợc chế phẩm vi sinh vật có khả năng xử lý

nƣớc thải chế biến tinh bột sắn.

- Đề xuất quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột

sắn.

Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Nƣớc thải sau chế biến tinh bột sắn của cơ sở, nhà máy chế biến tinh bột sắn ở

Ninh Bình, Hà Nội và Đăk Lăk.

- Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất ô nhiễm trong nƣớc thải chế biến

tinh bột sắn.

3

- Hệ thống xử lý nƣớc thải của nhà máy chế biến tinh bột sắn thuộc công ty TNHH

MTV Elmaco Ninh Bình.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Về khoa học: Luận án đã tuyển chọn đƣợc các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh

học cao, thích nghi với môi trƣờng nƣớc thải chế biến tinh bột sắn, và đƣợc áp dụng

trong sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn. Góp phần

cung cấp thêm tƣ liệu phục vụ giảng dạy và nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong

xử lý nƣớc thải bằng con đƣờng sinh học.

- Về thực tiễn: Ứng dụng chế phẩm vi sinh vật trong hệ thống xử lý nƣớc thải của

nhà máy chế biến tinh bột sắn Elmaco Ninh Bình, góp phần xử lý triệt để ô nhiễm

môi trƣờng của cơ sở sản xuất tinh bột sắn.

Đóng góp mới của đề tài luận án

- Luận án đã phân lập, lựa chọn đƣợc 3 chủng vi sinh vật từ nguồn nƣớc thải và bùn

thải của cơ sở sản xuất tinh bột sắn gồm Streptomyces fradiae SHX.12, Bacillus

velezensis SHV.22, Nitrosomonas europea SHV.OA7 có khả năng chuyển hóa các

hợp chất ô nhiễm và thích nghi với môi trƣờng nƣớc thải chế biến tinh bột sắn. Các

chủng vi sinh vật đƣợc nghiên cứu là các chủng đa hoạt sinh học. Chủng

Streptomyces fradiae SHX.12 vừa có khả năng chuyển hóa tinh bột vừa có khả năng

3- trong tế bào.

chuyển hóa xenlulo. Chủng Bacillus velezensis SHV.22 vừa có khả năng khoáng

hóa Phosphat hữu cơ vừa có khả năng đồng hóa và dự trữ PO4

- Luận án nghiên cứu có tính hệ thống về chế phẩm vi sinh vật bao gồm các khâu

phân lập, tuyển chọn vi sinh vật, nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện nhân sinh khối,

xây dựng quy trình công nghệ và tạo chế phẩm MIC-CAS 02 từ ba chủng vi sinh

vật trên để ứng dụng trong xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn.

- Đề tài luận án đã thử nghiệm thành công chế phẩm MIC-CAS 02 góp phần xử lý

triệt để nƣớc thải của nhà máy chế biến tinh bột sắn Elmaco Ninh Bình, chất lƣợng

nƣớc thải sau xử lý đạt giá trị loại A theo QCVN 40: 2011/BTNMT.

4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tinh bột sắn và nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

1.1.1.Tinh bột sắn và qui trình chế biến

Sắn (Manihot esculenta Crantz) một loại cây lƣơng thực quan trọng ở một số

quốc gia, hiện đƣợc trồng tại hơn 100 nƣớc trên thế giới, trong đó tập trung nhiều ở

các quốc gia có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Phi, châu Á và Nam Mỹ

(hình 1.1).

Hình 1.1. Các nƣớc sản xuất sắn trên thế giới năm 2014

Nguồn: FAO, 2015

Năm 2014, Nigeria là nƣớc sản xuất sắn lớn nhất thế giới (54,83 triệu tấn),

thứ hai là Thái Lan (30,02 triệu tấn), thứ ba là Indonesia (23,45 triệu tấn) và Brazil

đứng thứ tƣ (23,24 triệu tấn).

Sản lƣợng sắn toàn thế giới trong nhiều năm trở lại đây duy trì tƣơng đối ổn

định ở mức sản lƣợng 230 triệu tấn sắn/năm. Châu Á, đóng góp hơn một nửa sản

lƣợng sắn toàn cầu với sản lƣợng sắn hàng năm tăng 5 % cao hơn so với châu Phi

(3,5 %), trong đó năng suất tăng hàng năm đạt 3,1 % và diện tích trồng hàng năm

tăng 1,8 % (CIAT, 2014). Nƣớc có năng suất sắn cao nhất thế giới năm 2014 là Ấn

Độ đạt 35,66 tấn/ha (hình 1.1). Theo FAO (2015) từ năm 2001 sản lƣợng sắn toàn

cầu đã tăng lên hàng năm ở mức 3,4 % và đạt 270,3 triệu tấn trong năm 2014 (hình

1.2).

5

Nguồn:FAO,2015

Hình 1.2. Sản lƣợng sắn trên thế giới từ 2001-2014

Sắn là một thành phần quan trọng trong bữa ăn của hơn một tỷ ngƣời thuộc

các nƣớc nghèo trên thế giới. Tổ chức Nông lƣơng Liên hợp quốc (FAO) xếp sắn là

cây lƣơng thực quan trọng ở các nƣớc đang phát triển sau lúa gạo, ngô và lúa mì.

Tại châu Phi, sắn chiếm tỷ trọng cao trong cơ cấu lƣơng thực với mức tiêu thụ bình

quân khoảng 96 kg/ngƣời/năm.

Tinh bột sắn là sản phẩm chế biến từ củ sắn đƣợc sử dụng trực tiếp làm

lƣơng thực, đồng thời là nguồn nguyên liệu quan trọng trong sản xuất công nghiệp

và đặc biệt là công nghiệp nhiên liệu sinh học, do vậy cây sắn không chỉ quan trọng

đối với các hộ gia đình nông dân, mà còn đối với các nền kinh tế của nhiều quốc gia

đang phát triển. Ngành công nghiệp chế biến tinh bột sắn ở Đông Nam Á hiện tại

đang tạo ra hàng tỷ đô la mỗi năm nhờ xuất khẩu, trong đó Thái Lan hiện đang là

nƣớc đứng đầu thế giới về xuất khẩu tinh bột sắn với số lƣợng đạt 3,9 triệu tấn tinh

bột sắn trong năm 2014 (Boonmee Wattanaruangrong, 2015)

Tại Thái Lan, tinh bột sắn đƣợc chế biến theo cả công nghệ truyền thống và

hiện đại, trong đó công nghệ truyền thống đƣợc sử dụng trong các nhà máy sản xuất

quy mô nhỏ, có thể tách tinh bột từ củ sắn tƣơi bằng cách nghiền và ngâm sắn dƣới

nƣớc, sản phẩm tạo ra thƣờng kém chất lƣợng. Công nghệ chế biến hiện đại đƣợc áp

dụng trong các nhà máy có quy mô lớn và trung bình với nhiều các công đoạn chiết

suất kết hợp với xử lý bột bằng SO2 cho tỉ lệ thu hồi tinh bột cao, lƣợng tinh bột thất

6

thoát theo bã đƣợc hạn chế tới mức thấp nhất. Hiện tại ở Thái Lan các nhà máy chế

biến tinh bột sắn với công nghệ hiện đại đang dần dần thay thế những nhà máy quy

mô nhỏ (TTSA, 2015).

Indonesia là nƣớc sản xuất tinh bột sắn lớn thứ ba trên thế giới. Công nghiệp

chế biến tinh bột sắn ở Indonesia đƣợc bắt đầu từ những năm 1980. Tinh bột sắn ở

quốc gia này đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho công nghiệp dệt may, công nghiệp

giấy và một số ngành khác (Rety Setyawaty và cs, 2011).

Ở Ấn Độ, sản xuất tinh bột sắn tập trung chủ yếu ở bang Kerala và Tamil

Nadu, cung cấp hơn 80% nhu cầu cả nƣớc. Mặc dù Ấn Độ là một trong 10 quốc gia

sản xuất sắn lớn nhất thế giới, mỗi năm sản xuất khoảng 9 triệu tấn sắn, song với

dân số đông, nhu cầu tiêu dùng lớn, nên nƣớc này hàng năm vẫn phải nhập khẩu

tinh bột sắn và các sản phẩm khác từ sắn (Srinivas Tavva và cs, 2015).

Trung Quốc, nƣớc sản xuất ethanol lớn thứ ba trên thế giới, sau Mỹ và

Brazil. Vì không phải là quốc gia trồng nhiều sắn, để đáp ứng nhu cầu sử dụng tinh

bột sắn ngày càng cao, trong năm 2014 Trung Quốc phải nhập khẩu 9,4 triệu tấn sắn

lát và 1,9 triệu tấn tinh bột sắn (Jin Shu-ren, 2015). Công nghệ chế biến tinh bột sắn

của Trung Quốc đƣợc đánh giá đạt trình độ phát triển cao với đặc điểm tẩy trắng

không dùng SO2, hoặc chỉ sử dụng với số lƣợng không đáng kể.

Năm 2014, Việt Nam đứng thứ bảy về sản lƣợng sắn trên thế giới (đạt 10,21

triệu tấn), năng suất đạt 18,5 tấn/ha (hình 1.1), nhƣng là nƣớc xuất khẩu tinh bột sắn

đứng thứ hai trên thế giới sau Thái Lan. Sản xuất sắn là nguồn thu nhập quan trọng

của các hộ dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tƣ, phù hợp sinh thái và

điều kiện kinh tế nông hộ.

Đến nay, cả nƣớc đã hình thành các vùng nguyên liệu sắn tập trung, trồng ở

khắp các vùng từ miền núi phía Bắc tới miền Trung, Tây Nguyên và miền Đông

Nam bộ với tổng diện tích đạt trên 500 ngàn ha (bảng 1.1). Thời gian gần đây, một

số doanh nghiệp đã đầu tƣ sang cả Lào để mở rộng vùng nguyên liệu phục vụ cho

công nghiệp chế biến tinh bột.

7

Năm 2014, địa phƣơng có sản lƣợng sắn cao nhất nƣớc là Tây Ninh đạt 1.603,4

nghìn tấn, thứ hai là Gia Lai đạt 1.114,2 nghìn tấn, thứ ba là Đăk Lắk với sản lƣợng

sắn đạt 642,2 nghìn tấn và Kon Tum đứng thứ tƣ về sản lƣợng sắn đạt 566,2 nghìn

tấn (bảng 1.1). Tây Ninh cũng có số lƣợng cơ sở chế biến sắn và tinh bột sắn cao

nhất nƣớc, kim ngạch xuất khẩu chiếm khoảng 40% tổng kim ngạch xuất khẩu cả

nƣớc. Bên cạnh đó, Tây Ninh luôn đi đầu về công nghệ, về thiết bị sản xuất tinh bột

sắn.

Năng suất sắn của Việt Nam hiện nay đứng trong nhóm 10 quốc gia năng suất

cao trên thế giới. Số liệu trong bảng 1.1 cho thấy năm 2014 vùng thâm canh tốt nhƣ

ở Tây Ninh đã cho năng suất 31,8 tấn/ha, nhƣng năng suất bình quân cả nƣớc mới

chỉ đạt 18,5 tấn/ha, thấp hơn so với một số nƣớc trong khu vực (Ấn Độ đạt trên 35

tấn/ha, Thái Lan trên 22 tấn/ha).

Bảng 1.1. Sản xuất sắn ở một số địa phƣơng của Việt Nam năm 2014

Diện tích Năng suất Sản lƣợng TT Tên địa phƣơng (1000 ha) (tấn/ha) (1000 tấn)

1 2 Tây Ninh Gia Lai 50,5 61,6 31,8 18,1 1.603,4 1.114,2

3 Ðăk Lăk 31,4 20,5 642,2

4 Kon Tum 37,6 15,1 566,2

5 Bình Thuận 32,7 15,9 519,3

6 Sơn La 30,5 12,2 371,3

7 Phú Yên 19,5 18,3 356,2

8 Ðăk Nông 19,1 16,2 308,7

9 Quảng Ngãi Cả nƣớc 19,0 553,1 18,6 18,5 352,7 10.225,3

Nguồn: Tổng cục thống kê, 2015

Thống kê của hải quan cửa khẩu Chi Ma, mỗi ngày khoảng 300-500 tấn tinh

bột sắn đƣợc xuất khẩu sang Trung Quốc, năm 2013 xuất khẩu sắn và các sản phẩm

từ sắn đạt 3,1 triệu tấn với kim ngạch 1,1 tỷ đô la Mỹ (Trung tâm Thông tin Phát

triển Nông nghiệp Nông thôn, 2014).

8

Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và PTNT, trong quý I năm 2015, sản lƣợng

xuất khẩu sắn và các sản phẩm từ sắn đạt giá trị 420 triệu USD, tăng 24 % về lƣợng

và tăng 22,7 % về giá trị so với cùng kỳ năm 2014 (www.omard.gov.vn). Chỉ tính

riêng về tinh bột sắn, lƣợng xuất khẩu cả năm 2015 đã đạt 1,3 triệu tấn (Bảng 1.2).

Bảng 1.2. Lƣợng tinh bột sắn xuất khẩu của Việt Nam theo thị trƣờng năm 2015

(Đơn vị tính: tấn)

Thị trƣờng Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 Tháng 6 Tháng 7 Cả năm Tỉ lệ (%)

Trung quốc 243.930 161.820 118.581 108.106 121.781 1.148.256 87,26

Singapore 8.643 4.655 2.695 504 720 36.880 2,80

Philippines 6.856 5.014 4.786 4.047 4.537 32.587 2,48

Bangladesh 4.848 4.120 3.881 1.285 2.585 24.703 1,88

Malysia 2.354 4.518 1.967 3.063 1.925 19.608 1,49

Đài Loan 3.620 1.384 3.040 1.847 17.305 1,32

Ấn Độ 1.482 1.846 371 663 114 5.852 0,44

Indonesia 1.095 510 1.036 824 187 5.272 0,40

Nhật Bản 73 19 504 3.179 0,24

Khác 2.678 4.252 1.689 2.924 4.433 22.238 1,69

Tổng cộng 275.670 188.119 138.045 123.281 136.786 1.315.969 100

(Nguồn: AgroMonitor, 2015 )

Năm 2015, thị trƣờng xuất khẩu chính của Việt Nam là Trung Quốc, chiếm

87,26 % kim ngạch. Tiếp theo là Singapore chiếm 2,8 %; Đài Loan 1,32 % và một

phần rất nhỏ bắt đầu đến đƣợc Nhật Bản (AgroMonitor, 2015).

Theo Trung tâm Sản xuất sạch Việt Nam (2010), hiện tại trong cả nƣớc tồn

tại ba quy mô sản xuất tinh bột sắn điển hình gồm qui mô nhỏ (hộ và liên hộ), qui

mô vừa và qui mô lớn. Quy mô nhỏ (công suất 0,5-10 tấn tinh bột sản phẩm/ngày),

chủ yếu công nghệ thủ công, thiết bị tự tạo hoặc do các cơ sở cơ khí địa phƣơng chế

tạo. Hiệu suất thu hồi và chất lƣợng tinh bột sắn không cao. Qui mô vừa (công suất

dƣới 50 tấn tinh bột sản phẩm/ngày), đa phần sử dụng thiết bị chế tạo trong nƣớc

9

nhƣng có khả năng hoạt động ổn định và chất lƣợng sản phẩm không thua kém các

cơ sở nhập thiết bị của nƣớc ngoài. Qui mô lớn (công suất trên 50 tấn tinh bột sản

phẩm/ngày), với công nghệ, thiết bị nhập từ Châu Âu, Trung Quốc, Thái Lan. Công

nghệ tiên tiến, hiệu suất thu hồi sản phẩm và chất lƣợng sản phẩm cao hơn, lƣợng

nƣớc sử dụng ít nƣớc.

Trƣớc năm 1990, qui mô sản xuất tinh bột sắn ở Việt Nam phần lớn là các hộ

gia đình nhỏ, ngoài một số đơn vị của nhà nƣớc có quy mô lớn hơn (Đặng Thanh

Hà và cs, 1996; Đào Huy Chiên, 1997), chủ yếu sản xuất tinh bột khô và ƣớt phục

vụ cho làm bánh mì, bánh ngọt, rƣợu và sản xuất bánh kẹo... Sau năm 1990, cùng

với sự khởi động của thị trƣờng trong nƣớc, một số nhà máy chế biến tinh bột sắn

quy mô lớn hiện đại đã đƣợc xây dựng tại phía Nam và phần lớn đƣợc liên doanh

với công ty đa quốc gia của Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan nhƣ Vedan,

Ajinomoto…(Henry và cs, 1995).

Theo Nguyễn Văn Lạng (2015) chủ tịch hiệp hội sắn Việt Nam, hiện nay cả

nƣớc có khoảng 100 nhà máy chế biến tinh bột sắn có quy mô công nghiệp. So với

5 năm trƣớc đã tăng gấp đôi về số lƣợng nhà máy và gấp 3 về công suất. Mỗi năm,

các nhà máy này sản xuất đƣợc 1,8 đến 2 triệu tấn tinh bột sắn. Bên cạnh các nhà

máy sản xuất tinh bột sắn, ở Việt Nam đang có 7 nhà máy sản xuất ethanol từ

nguyên liệu sắn đƣợc xây dựng với tổng công suất thiết kế 502.000 tấn ethanol/năm.

Từ vai trò là cây lƣơng thực, cây sắn đã và đang chuyển đổi nhanh chóng thành cây

công nghiệp, cây nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học. Theo Trung tâm Sản

xuất sạch Việt Nam (2010), các cơ sở sản xuất tinh bột sắn ở Việt Nam áp dụng các

kỹ thuật, công nghệ chủ yếu sau:

- Chế biến tinh bột sắn theo phương pháp thủ công: Tất cả các khâu trong

quá trình chế biến sắn từ rửa, gọt vỏ, nạo, mài, lọc và rửa bột đều đƣợc tiến hành

thủ công. Phƣơng pháp thủ công áp dụng ở qui mô hộ gia đình, cho năng suất thấp

và chất lƣợng kém. Kỹ thuật sản xuất đơn giản và gián đoạn.

- Chế biến tinh bột sắn theo phương pháp bán cơ giới: Ngoại trừ khâu rửa,

gọt vỏ và tách tinh bột tiến hành thủ công. Quá trình nạo/mài đƣợc tiến hành bằng

10

máy mài. Bột nhão thu đƣợc qua sàng hệ thống gồm lọc thô, lọc mịn và lọc tinh.

Quá trình lắng đƣợc tiến hành trong bể lắng hoặc bàn lắng (lắng trọng lực). Phƣơng

pháp bán cơ giới áp dụng ở qui mô sản xuất nhỏ, chất lƣợng sản phẩm, hiệu suất thu

hồi tinh bột thấp, lao động vất vả và khó đảm bảo vệ sinh công nghiệp.

- Chế biến tinh bột sắn theo phương pháp hiện đại: Quá trình sản xuất đƣợc

tự động hóa hoàn toàn, từ khi tiếp nhận củ đến khi sấy, hoàn thiện sản phẩm phải

đƣợc tiến hành trong thời gian ngắn nhất có thể đƣợc, để giảm thiểu quá trình oxy

hoá, biến đổi hàm lƣợng tinh bột sau thu hoạch và trong chế biến. Trong quá trình

sản xuất tinh bột sắn sử dụng phƣơng pháp trích ly. Đây là phƣơng pháp sử dụng

thiết bị ly tâm để thực hiện quá trình tách, phƣơng pháp này cho chất lƣợng sản

phẩm cao, năng suất lớn, đảm bảo vệ sinh công nghiệp.

Trƣớc đây ở Việt Nam, chế biến tinh bột sắn thủ công và bán thủ công đƣợc

áp dụng ở hộ gia đình, cơ sở làng nghề với qui mô nhỏ chỉ vài tạ sắn/ngày. Trong

vòng 15 năm qua, các hoạt động chế biến tinh bột tại các làng nghề đã đƣợc cơ giới

hóa từ dây chuyền rửa củ, nghiền, tách bã, lọc… Năng suất tăng lên và quy mô lớn

hơn do áp dụng cơ khí hóa (CIAT, 2011). Chế biến tinh bột sắn theo phƣơng pháp

hiện đạị chủ yếu bằng công nghệ nhập từ nƣớc ngoài. Các nhà máy hiện nay chủ

yếu đƣợc đầu tƣ từ 10-15 năm trƣớc, công nghệ và thiết bị chủ yếu của Trung Quốc,

Thái lan.

1.1.2. Nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

Trong sản xuất tinh bột sắn phải sử dụng một lƣợng nƣớc lớn từ rửa nguyên

liệu đến quá trình kết lắng và làm sạch tinh bột. Lƣợng nƣớc phục vụ cho sản xuất chủ yếu đƣợc khai thác từ nguồn nƣớc ngầm mức tiêu thụ khoảng 3,5-12,0 m3/tấn củ tƣơi ở qui mô nông hộ và 3-5 m3/tấn củ tƣơi tại các nhà máy qui mô lớn (Huỳnh

Ngọc Phƣơng Mai, 2006). Trong tổng lƣợng nƣớc thải chế biến tinh bột sắn khoảng

10% phát sinh từ nƣớc rửa củ và 90% từ công đoạn ly tâm, lọc, khử…chiếm khoảng

80-90% lƣợng nƣớc tiêu thụ. Thành phần các loại nƣớc thải cụ thể nhƣ sau:

- Nƣớc thải trong quá trình rửa củ, cắt vỏ có chứa bùn, đất, cát, mảnh vỏ, HCN tạo

ra do phân hủy phazeolutanin trong vỏ thịt nhờ xúc tác của men xyanoaza… Nƣớc

11

sử dụng trong công đoạn rửa củ trƣớc khi lột vỏ để loại bỏ các chất bẩn bám trên bề

mặt củ, không làm ảnh hƣởng màu của tinh bột.

- Nƣớc thải trong quá trình nghiền củ, lọc thô có nhiều tinh bột, protein và khoáng

chất tách ra trong quá trình nghiền thô.

- Nƣớc thải trong quá trình tách dịch có nồng độ chất hữu cơ (BOD), chất rắn lơ

lửng (SS) cao. Ngoài ra trong nƣớc thải này còn chứa các dịch bào có tanin, men và

nhiều chất vi lƣợng có mặt trong củ sắn.

Lƣu lƣợng nƣớc thải lớn có pH thấp, nồng độ chất hữu cơ, vô cơ cao, đặc biệt là các hợp chất chứa N, P... cùng với các chất chứa xyanua (CN-) có nguồn gốc

từ vỏ sắn và lõi củ sắn là nguồn gây ô nhiễm chính đối với môi trƣờng, ảnh hƣởng

xấu đến sức khỏe cộng đồng (Trung tâm Sản xuất sạch Việt Nam, 2010). Thành

phần chính của nƣớc thải chế biến tinh bột sắn trong từng công đoạn của quá trình

sản xuất đƣợc tổng hợp trong bảng 1.3 về mặt cảm quan nƣớc thải sản xuất tinh bột

sắn có màu trắng, mùi chua và độ đục cao.

Bảng 1.3. Thành phần tính chất nƣớc thải từ sản xuất tinh bột sắn

Công đoạn Cặn lơ lửng COD Độ kiềm BOD5 pH sản xuất (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l)

Rửa củ 6,5 995 1350 1687 122

Lọc thô 4,5 660 3850 4812 122

Lọc tinh 4,05 660 3850 4800 122

Hỗn hợp 6,1 1655 5200 6499 140

(Dương Đức Tiến, Trần Hiếu Nhuệ, Nguyễn Kim Thái, 1991)

Thành phần nƣớc thải phụ thuộc vào quy mô sản xuất, trình độ công nghệ và

hệ thống thiết bị xử lý nƣớc thải, qui trình vận hành và quan trắc môi trƣờng. Số

liệu quan trắc của Trung tâm Sản xuất sạch Việt Nam (2010), đối với nƣớc thải từ

sản xuất tinh bột sắn chƣa xử lý (bảng 1.4) cho thấy mức ô nhiễm rất cao, cần đƣợc

xử lý nhằm đáp ứng tiêu chuẩn của môi trƣờng về nƣớc thải theo qui chuẩn Việt

Nam.

12

Bảng 1.4. Chất lƣợng nƣớc thải từ sản xuất tinh bột sắn (chƣa xử lý)

Qui mô nhỏ và QCVN 40:2011/BTNMT Chỉ tiêu Đơn vị Qui mô lớn Cột A Cột B

pH - vừa 4,0-5,6 3,8-5,7 6-9 5,5-9

BOD mg/l 7.400-11.000 6.200- 30 50

COD mg/l 13.000-17.800 100 150

50 100

SS CN- mg/l mg/l 1.200-2.600 3,4-5,8 7.000- 23.000 330-4.100 41.000 19-36

(Nguồn: Trung tâm Sản xuất sạch Việt Nam, 2010)

Ngoài thành phần chất hữu cơ BOD, COD trong nƣớc thải chế biến tinh bột

sắn còn chứa các hợp chất chứa Nitơ, Phospho. Theo báo cáo của Viện Nghiên cứu

Thiết kế Chế tạo máy Nông nghiệp (2005), hàm lƣợng các hợp chất chứa Nitơ và

Phospho cao hơn rất nhiều so với tiêu chuẩn cho phép (bảng 1.5).

Bảng 1.5. Thành phần nƣớc thải nhà máy chế biến tinh bột sắn

QCVN 40:2011/BTNMT Chỉ tiêu Đơn vị Giá trị

pH - 4,2-5,1 Cột A 6-9 Cột B 5,5-9

BOD mg/l 2.120-14.750 30 50

COD mg/l 2.500-17.000 100 150

mg/l 120-3.000 50 100

mg/l 2-75

mg/l 52-65

mg/l 136-300 - 10

mg/l 0,0-0,2 - -

mg/l mg/l 0,5-0,8 250-450 - 4 SS CN- 2- SO4 N-NH4 N-NO2 N-NO3 Pts

- 6 (Nguồn: Báo cáo Dự án cấp nhà nước (KC.05.11-2005),

Viện Nghiên cứu Thiết kế Chế tạo máy Nông nghiệp)

Các thành phần hữu cơ nhƣ tinh bột, protein, xenluloza, pectin, đƣờng có trong

nguyên liệu củ sắn tƣơi là nguyên nhân gây ô nhiễm cao cho các dòng nƣớc thải của

nhà máy sản xuất tinh bột sắn.

13

1.1.3. Ô nhiễm môi trƣờng do nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

Mặc dù tinh bột sắn có kim ngạch xuất khẩu lớn, đóng vai trò quan trọng

trong việc phát triển nền kinh tế, xã hội cho đất nƣớc, nhƣng tác động tiêu cực của

ngành sản xuất tinh bột sắn đến môi trƣờng cũng rất lớn. Chất lƣợng nƣớc thải của

ngành chế biến tinh bột sắn nếu không đƣợc xử lý sẽ gây ảnh hƣởng xấu đến chất

lƣợng môi trƣờng. Theo FAO (2001) và Trung tâm Sản xuất sạch Việt Nam (2010)

các chất ô nhiễm trong nƣớc thải chế biến tinh bột sắn bao gồm:

 Độ pH quá thấp sẽ làm mất khả năng tự làm sạch của nguồn tiếp nhận do các

loài vi sinh vật có trong tự nhiên trong nƣớc bị kìm hãm phát triển. Ngoài ra, khi

nƣớc thải có tính axít sẽ có tính ăn mòn, làm mất cân bằng trao đổi chất tế bào, ức

chế sự phát triển bình thƣờng của quá trình sống.

 BOD liên quan tới xác định mức độ ô nhiễm của thành phần có khả năng

phân hủy sinh học trong nƣớc thải, COD cho phép xác định mức độ ô nhiễm chất

hữu cơ, vô cơ có trong nƣớc thải công nghiệp. Hàm lƣợng chất hữu cơ (BOD,

COD) cao sẽ làm giảm nồng độ oxi hòa tan trong nƣớc, làm ảnh hƣởng đến đời

sống thủy sinh, đặc biệt là hệ vi sinh vật của nguồn tiếp nhận. Nồng độ oxy hòa tan

dƣới 50% còn có khả năng gây ảnh hƣởng đến sự phát triển của tôm, cá. Khi xảy ra

hiện tƣợng phân hủy yếm khí với hàm lƣợng BOD quá cao sẽ gây thối nguồn nƣớc

và giết chết hệ thủy sinh, gây ô nhiễm không khí xung quanh và phát tán trên phạm

vi rộng theo chiều gió.

 Chất rắn lơ lửng (SS) cũng là tác nhân gây ảnh hƣởng tiêu cực tới tài nguyên

thủy sinh đồng thời gây mất cảm quan, bồi lắng lòng hồ, sông, suối... Ô nhiễm xảy

ra khi nƣớc thải chế biến sắn thấm vào lòng đất hoặc chảy vào sông, suối. Okafor và

cs (1998) đã khẳng định các hạt chất rắn lơ lửng rất quan trọng, chúng là nơi để các

chất ô nhiễm và tác nhân gây bệnh bám trên bề mặt. Các hạt rắn lở lửng nhỏ hơn thì

mức độ gây ô nhiễm lớn hơn.

 Hàm lƣợng chất dinh dƣỡng, nồng độ các chất Nitơ, Phospho cao quá sẽ gây

nên hiện tƣợng phú dƣỡng hóa nguồn nƣớc, sự phát triển khó kiểm soát của rong và

tảo. Khiến môi trƣờng sống của nguồn tiếp nhận bị thay đổi và xấu đi.

14

 Xyanua (HCN) tồn tại trong nƣớc thải sản xuất tinh bột sắn, phản ứng với sắt

tạo thành sắt xyanua có màu xám. Nếu không đƣợc tách nhanh, HCN sẽ ảnh hƣởng

tới màu của tinh bột và màu của nƣớc thải. Ở trong nƣớc xyanua tồn tại ở dạng muối CN- và HCN. Khi vào cơ thể, xyanua kết hợp với enzym xitochrom làm men

này ức chế khả năng cấp oxy cho hồng cầu, gây ngộ độc cho ngƣời và động vật thuỷ

sinh. Nhiều quốc gia đã đƣa ra một giới hạn cho phép nồng độ xyanua khoảng 0,2

mg/l đƣợc phép xả thải vào lƣu vực nƣớc tự nhiên (Y.B. Patil và cs, 2000).

Ehiagbonare và cs (2009) đã nghiên cứu tác động của nƣớc thải tinh bột sắn

đối với môi trƣờng và cho thấy chúng có tác động tiêu cực đến cây trồng, không

khí, động vật nuôi, đất và nƣớc. Ô nhiễm là vì xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

đƣợc thực hiện không đúng và nƣớc thải đƣợc tích lũy qua thời gian.

Ở Việt Nam, các cơ sở chế biến tinh bột sắn qui mô nhỏ chủ yếu tập trung

thành làng nghề với trang thiết bị lạc hậu, hầu nhƣ không có hệ thống xử lý nƣớc

thải riêng và đúng kỹ thuật. Các cơ sở sản xuất với qui mô lớn tuy đa số có trang

bị hệ thống xử lý nƣớc thải nhƣng mới chỉ có rất ít hệ thống hoàn chỉnh có khả

năng xử lý triệt để nƣớc thải trƣớc khi thải ra môi trƣờng. Nhiều cơ sở chỉ xử lý

mang tính chất đối phó với cơ quan quản lý nhà nƣớc về môi trƣờng.

Bằng chứng là nhà máy chế biến tinh bột sắn Yên Bình, tỉnh Yên Bái có

công suất 160 tấn sản phẩm/ngày, hàng ngày nhà máy thải ra khoảng 380 tấn bã sắn và khoảng 3600 m3 nƣớc thải. Chất lƣợng nƣớc thải của nhà máy đều vƣợt tiêu

chuẩn Việt Nam cho phép nhiều lần đối với hầu hết các chỉ tiêu ô nhiễm. Sở Tài

nguyên Môi trƣờng Yên Bái và các cơ quan chức năng đã nhiều lần kiểm tra, phát

hiện việc xử lý nƣớc thải của nhà máy này vẫn chƣa đạt yêu cầu. Chính vì vậy ngoài

mùi hôi thối khó chịu cho cả vùng, nƣớc thải của nhà máy từ suối nhỏ Tầm Vông,

Làng Ngần đổ ra suối Hang Luồn làm con suối bị ô nhiễm nặng. Suối Hang Luồn là

nơi đắp đập thủy lợi Hang Luồn, cung cấp nƣớc tƣới tiêu cho 26 ha các thôn Ba

Luồn, Đồng Hen của Vũ Linh và 60 ha ruộng của xã Vĩnh Kiên. Vì vậy trong vụ đông xuân 2005 có 1834 m2 ruộng của thôn Tầm Vông, 11.288 m2 của thôn Làng

Ngần không thể cấy đƣợc. Số diện tích lúa còn lại bị ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng,

15

phát triển (Cổng thông tin điện tử Bộ TNMT ngày 15/4/2005). Nhà máy chế biến

tinh bột sắn Yên Bình, tỉnh Yên Bái là một trong nhiều đơn vị doanh nghiệp phải

hoàn thiện việc nâng cấp, cải tạo hệ thống xử lý nƣớc thải, giảm công suất sản xuất,

đồng thời có các giải pháp khác để giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng tuân theo Quyết

định số 1788/QĐ-TTg ngày 01 tháng 10 năm 2013 của Thủ tƣớng Chính phủ về xử

lý triệt để các cơ sở gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng đến năm 2020 (Quyết

định TTCP, 2013).

Tại Thừa Thiên Huế, nƣớc thải gây ô nhiễm môi trƣờng của nhà máy tinh bột

sắn Phong Điền đã khiến nhiều ngƣời dân xã Phong An, huyện Phong Điền thiệt hại

về sản xuất nông nghiệp (Cổng thông tin điện tử báo tin tức ngày 8/11/2013). Vụ

đông xuân năm 2013, nƣớc thải của nhà máy đã khiến ngƣời dân thôn Thƣợng An,

xã Phong An thiệt hại 11,8 ha lúa với mức độ từ 30-70 %, có nơi là 100 %.

Mới gần đây trong năm 2015 theo thông tin ngày 26/8 trên Báo tin tức, Cảnh

sát phòng, chống tội phạm về môi trƣờng, công an tỉnh Tây Ninh đã lập biên bản,

bắt quả tang nhà máy sản xuất tinh bột sắn có công suất khoảng 300 tấn củ sắn

tƣơi/ngày, thuộc Công ty Hữu Đức, địa chỉ ấp Tân Kiên, xã Tân Hà, huyện Tân

Châu, tỉnh Tây Ninh xả nƣớc thải trực tiếp ra suối Nƣớc Đục, chảy ra sông Vàm Cỏ

Đông. Nƣớc có màu đen sẫm, mùi hôi thối nồng nặc làm cho nguồn nƣớc bị ô

nhiễm nghiêm trọng.

Sản xuất tinh bột sắn là một ngành sản xuất có nhu cầu nƣớc lớn, nƣớc thải

có độ ô nhiễm cao đến rất cao. Theo Nguyễn Thị Sơn và cs (2006), chỉ với sản

lƣợng khoảng 500 ngàn tấn tinh bột, hàng năm các cơ sở sản xuất tinh bột trên phạm vi cả nƣớc thải vào môi trƣờng khoảng 3 triệu m3 nƣớc thải với tải lƣợng

COD khoảng 30.000 tấn, trong đó BOD5 khoảng 18.000 tấn. Nƣớc thải có độ ô

nhiễm cao trong sản xuất tinh bột không đƣợc xử lý đã góp phần gây ô nhiễm môi

trƣờng.

1.2. Xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn.

Các nghiên cứu về xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn trên thế giới không

nhiều, đa số là các nghiên cứu xử lý nƣớc thải cho các ngành khác.

16

Tại Brazil, công nghệ xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn chủ yếu sử dụng

hệ thống các hồ sinh học bao gồm hồ kị khí, hồ tùy nghi và hồ hiếu khí. Tuy nhiên,

hiệu quả xử lý nƣớc thải tại các nhà máy áp dụng công nghệ này không cao.

Lucilene Beatriz Pissinatto và cs (2004) đã tiến hành thử nghiệm bổ sung các chủng

vi sinh vật có hoạt tính cao vào các hệ thống hồ xử lý tùy nghi và hiếu khí, mục đích

nâng cao số lƣợng vi sinh vật xử lý nhằm nâng cao hiệu quả xử lý nƣớc thải. Thí

nghiệm đƣợc tiến hành tại hệ thống xử lý nƣớc thải của nhà máy chế biến tinh bột

sắn trong khu công nghiệp Amidos Yamakawa. Mỗi ngày, nhà máy này chế biến 400.000 tấn củ, thải ra hơn 2000 m3 nƣớc thải. Tổ hợp các chủng vi sinh vật đƣợc

hoạt hóa, nhân giống trong môi trƣờng có chứa rỉ mật. Dịch nuôi cấy vi sinh vật sau

đó đƣợc bổ sung vào bể xử lý với tỉ lệ 1:52500 (40 lít/ngày). Kết quả xử lý cho thấy

hàm lƣợng BOD và COD giảm hơn 85% so với lúc chƣa bổ sung vi sinh vật, chỉ số

BOD trong nƣớc sau xử lý thấp hơn 40 mg/l, đạt yêu cầu xả thải.

Công nghệ xử lý nƣớc thải chế biến sắn áp dụng theo công nghệ của Ấn Độ,

các chất hữu cơ trong nƣớc thải sẽ đƣợc phân hủy yếm khí ở các bể phản ứng sinh

học (UASB, EGSB, CSTR…) để thu hồi khí sinh học sau đó đƣợc phân hủy tiếp ở

các hệ thống hồ sinh thái (hiếu khí, tùy nghi hay bay hơi…). Nƣớc sau xử lý có thể

tái sử dụng hay dùng để tƣới cây. Với phƣơng pháp này cần một diện tích mặt hồ

lớn và khu xử lý gần nơi canh tác. Ví dụ nhà máy cồn sắn Rạjburi có tổng diện tích mặt hồ lên tới 94.256 m2, thời gian lƣu thủy lực tại các hồ này là 175 ngày, nhƣng

bù lại chi phí xử lý nƣớc thải sẽ rất thấp (CDM-PDD, 2012).

Nhóm tác giả Nitinard Chaleomrum và cs (2014) thuộc trƣờng đại học

Mahasarakham của Thái Lan cũng đã nghiên cứu xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột

sắn nhằm sản xuất polyhydroxyalkanoate (PHA) với sự hiển diện của vi khuẩn

Bacillus tequilensis MSU 112 trong hệ thống xử lý SBR (Sequencing Batch

Reactor) cho thấy nồng độ COD trong nƣớc thải tinh bột sắn là 4.000 mg/l thì hàm

lƣợng PHA sản sinh cao nhất. Năng suất PHA, và hiệu quả loại bỏ N, P ra khỏi

nƣớc thải tƣơng ứng 3.346 mg/lít, 20,6% và 27,7%, trong khi nồng độ COD là

5.000 mg/lít thì hiệu quả loại bỏ COD cao nhất đạt 94,8%. Kết quả tiết lộ hệ thống

17

SBR xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn với sự hiện diện của B.tequilensis MSU

112 là cách tiếp cận đầy hứa hẹn cho việc sản xuất PHA giúp ích trong việc tái tạo

nhựa sinh học ứng dụng trong cuộc sống.

Ở Việt Nam, xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn bằng ao, hồ sinh học và

cánh đồng trồng cây thủy sinh là phƣơng pháp đơn giản nhất đã và đang đƣợc ứng

dụng. Đã có một số công trình nghiên cứu trong nƣớc nghiên cứu giải quyết vấn đề

ô nhiễm trong quá trình chế biến tinh bột sắn và xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột

sắn. Kết quả nghiên cứu của Lê Thị Kim Cúc (2006) về mô hình tái sử dụng nƣớc

thải vùng chế biến tinh bột tại Tân Hóa, Quốc Oai, Hà Nội để phục vụ sản xuất

nông nghiệp, kết quả rất phù hợp với điều kiện sản xuất chế biến, điều kiện kinh tế

và trình độ quản lý của địa phƣơng. Trong thí nghiệm theo dõi các chỉ tiêu sinh

trƣởng của cây lúa nhƣ: Chiều cao cây, số nhánh và số bông trên 1 khóm, cho thấy

năng suất ở các ô ruộng tƣới bằng nƣớc thải đã qua xử lý đều có xu hƣớng cao hơn

so với đối chứng (tƣới bằng nƣớc thƣờng), năng suất cao nhất ở các ô tƣới 100%

nƣớc thải đã xử lý, đạt 9,2 tấn/ha.

Với đặc trung nƣớc thải chế biến tinh bột sắn chứa hàm lƣợng hữu cơ cao

đến rất cao, nên hƣớng xử lý là áp dụng các phƣơng pháp xử lý sinh học.

1.2.1. Phƣơng pháp xử lý sinh học trong điều kiện tự nhiên.

Phƣơng pháp sinh học xử lý nƣớc thải trong điều kiện tự nhiên có từ rất sớm,

và đã đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới ở các nƣớc nhƣ Đức, Pháp, Bỉ, Hà Lan…

với kết quả đã đƣợc ghi nhận. Hiện nay phƣơng pháp này vẫn đƣợc áp dụng và rất

phù hợp cho các nƣớc đang phát triển, vì không yêu cầu kỹ thuật cao, vốn đầu tƣ ít,

chi phí vận hành thấp, có thể triển khai trên phạm vi rộng lớn, phân tán. Theo Miloš

Rozkošný và cs (2014) phƣơng pháp này sử dụng các ao hồ sinh học (kỵ khí, tùy nghi,

hiếu khí), quy trình chảy tràn, thẩm thấu qua đất (các cánh đồng tƣới, bãi lọc trồng cây).

Hồ kỵ khí (độ sâu trên 2 m), các chất hữu cơ đƣợc phân hủy chủ yếu nhờ vi

khuẩn kỵ khí và sinh metan. Loại hồ này có thể dùng để xử lý nƣớc thải có nồng độ

các chất hữu cơ cao. Hồ hiếu khí (độ sâu 1-1,5 m), oxy từ không khí khuếch tán tự

nhiên vào nƣớc qua bề mặt hoặc kết hợp với làm thoáng, sục khí nhân tạo, ánh sáng

18

mặt trời cũng xuyên qua lớp nƣớc giúp cho tảo phát triển và thải oxy vào nƣớc tạo

điều kiện cho các vi sinh vật hiếu khí hoạt động. Hồ tùy nghi (độ sâu 1,5-2m)

thƣờng xảy ra cả quá trình phân hủy hiếu khí và kỵ khí. Loại hồ này đƣợc sử dụng

nhiều hơn hai loại hồ kỵ khí và hiếu khí.

Sử dụng phƣơng pháp cánh đồng tƣới, nƣớc thải đƣợc tƣới lên đất canh tác.

Một phần đƣợc cây sử dụng, phần còn lại sẽ chảy vào hệ thống tiêu nƣớc hoặc

ngấm vào mạch nƣớc ngầm. Phƣơng pháp này xử lý thƣờng không đƣợc triệt để và

vẫn còn nguy cơ ô nhiễm tiềm ẩn. Phƣơng pháp bãi lọc trồng cây thông qua các quá

trình lý, hóa và sinh học tự nhiên của hệ đất-nƣớc-sinh vật, các chất thải lơ lửng

trong nƣớc đƣợc thấm và giữ lại trong đất, sau đó đƣợc các vi sinh vật phân hủy và

chuyển thành chất dinh dƣỡng cung cấp cho cây trồng. Xử lý nƣớc bằng bãi lọc này

có thể đạt đƣợc ba mục đích là xử lý nƣớc ô nhiễm, tái sử dụng các chất dinh dƣỡng

có trong nƣớc sau khi xử lý dùng để tƣới cho cây trồng trong sản xuất nông nghiệp,

bổ sung nƣớc sạch cho các túi nƣớc ngầm.

1.2.2. Phƣơng pháp xử lý sinh học trong điều kiện nhân tạo.

1.2.2.1. Phƣơng pháp xử lý hiếu khí

Phƣơng pháp xử lý hiếu khí là các quá trình công nghệ trong đó xác lập ra

điều kiện hiếu khí để hệ vi sinh vật hiếu khí oxy hoá các hợp chất hữu cơ ô nhiễm,

bằng cách cấp khí vào bể xử lý (Pipeline, 1996). Một số giống vi sinh vật ứng dụng

nhiều trong các công trình xử lý hiếu khí là: Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus,

Streptomyces, Aspergillus…Trong điều kiện môi trƣờng có oxy, các vi sinh vật sử dụng oxy làm chất nhận H+ và electron, có thể oxy hoá hoàn toàn các cơ chất dinh

dƣỡng đến sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O (Pipeline, 1996). Do vậy, ƣu thế nổi

bật của quá trình phân huỷ hiếu khí là chất lƣợng xử lý triệt để (năng lực xử lý loại

bỏ hợp chất hữu cơ có thể đạt tới 95%). Tuy nhiên, việc cung cấp đủ oxy cho các vi

sinh vật hiếu khí trong các công trình hiếu khí nhân tạo là vấn đề công nghệ then

chốt và có ảnh hƣởng rất lớn đến giá thành xử lý. Một số công trình xử lý hiếu khí

nhân tạo điển hình là:

Bể Aeroten

19

Aeroten là hệ thống xử lý nhân tạo xác lập ra điều kiện hiếu khí cho hệ vi

sinh vật hiếu khí sinh trƣởng và phát triển, để chúng oxy hóa các hợp chất hữu cơ,

vô cơ trong nƣớc thải. Ở hệ thống này, vi sinh vật phát triển và hình thành các bông

bùn ở trạng thái lơ lửng trong bể sinh học (thƣờng đƣợc gọi là bùn hoạt tính). Hệ vi

sinh vật trong hệ thống này là tập hợp của nhiều loài vi sinh vật khác nhau, trong đó

một số giống vi khuẩn thƣờng gặp là Pseudomonas, Bacillus, Achromobacter,

Flavobacterium, Mycobacterium, Nitrosomonas, Nitrobacter, Sphaerotilus,

Beggiatoa, Thiothrix, Lecicothrix… ngoài ra còn có nấm, động vật nguyên sinh (Lê

Xuân Phƣơng, 2008). Phụ thuộc vào mục tiêu công nghệ cụ thể, hệ thống xử lý

aeroten đƣợc thiết kế và xây dựng dƣới nhiều dạng khác nhau nhƣ: hiếu khí tích

cực, hiếu khí giảm dần hay hiếu khí nhiều ngăn, hiếu khí nhiều bậc...

Hiệu quả hoạt động của các hệ thống xử lý hiếu khí phụ thuộc vào hàng loạt

thông số công nghệ khác nhau nhƣ: nồng độ oxy hòa tan trong môi trƣờng (thƣờng

yêu cầu duy trì liên tục hàm lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc ở ngƣỡng không dƣới 4

mg/l), năng lực phân hủy của hệ vi sinh vật hiếu khí (qua hàm lƣợng bùn hoạt tính

và tuổi của bùn), thành phần và tỉ lệ cân đối giữa các cấu tử dinh dƣỡng cho vi sinh

vật (qua chỉ số BOD, BOD/COD, tỷ lệ C:N:P phù hợp...), nhiệt độ và pH môi

trƣờng, thời gian lƣu thủy lực của nƣớc thải trong hệ thống...

Hạn chế lớn nhất cũng nhƣ yêu cầu đáp ứng công nghệ phức tạp của các hệ

thống xử lý hiếu khí tập trung vào giải pháp công nghệ và năng lƣợng tiêu tốn lớn

trong khuấy và sục khí vào môi trƣờng, để cung cấp đủ và liên tục oxy hòa tan cho

hệ vi sinh vật hiếu khí hoạt động. Nhƣng giải pháp xử lý hiếu khí lại có ƣu điểm rất

lớn là có thể xử lý triệt để các chất hữu cơ trong nƣớc tới sản phẩm cuối cùng là

CO2 và H2O. Giải pháp aeroten trong xử lý nƣớc thải đƣợc lựa chọn áp dụng hết sức

phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới, dƣới dạng giải pháp xử lý độc lập hay phối hợp

với giải pháp xử lý vi hiếu khí và kỵ khí khác trong các hệ thống xử lý phối hợp.

Lọc sinh học (Biofilter)

Nguyên tắc hoạt động của hệ thống lọc sinh học là khai thác năng lực trao

đổi chất của các loài vi sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn, sinh trƣởng bám dính (gắn

20

kết) hình thành lớp màng sinh học trên bề mặt vật liệu lọc. Trong môi trƣờng hiếu

khí, do đặc điểm cấu trúc lớp màng phía ngoài sẽ đƣợc cung cấp oxy hòa tan tốt

hơn, chuyển vào lớp giữa hiệu quả cung cấp oxy hòa tan giảm dần và lớp trong

cùng là điều kiện kỵ khí. Nhờ vậy, hệ thống lọc sinh học có đặc tính khai thác đƣợc

đồng thời năng lực phân huỷ chất ô nhiễm của cả các vi sinh vật hiếu khí (phân bố ở

lớp màng phía ngoài), vi sinh vật hô hấp tuỳ nghi (phân bố ở lớp màng giữa) và hệ

vi sinh vật yếm khí (phân bố ở lớp màng phía trong cùng).

Hệ thống lọc sinh học đƣợc thiết lập đầu tiên tại trại thực nghiệm Lawrence,

bang Matsachuset, Mỹ năm 1891. Đến năm 1940 ở nƣớc này đã có 60% hệ thống

xử lý nƣớc thải áp dụng công nghệ lọc sinh học. Năm 1946, phƣơng pháp lọc sinh

học đã đƣợc triển khai phổ biến tại nhiều quốc gia, đặc biệt là sau khi ra đời các vật

liệu lọc polymer. Công nghệ lọc sinh học tiếp tục đƣợc phát triển, ủng dụng rộng rãi

và ngày càng đƣợc ƣa chuộng trên thế giới (Markus Schmid và cs, 2003)

Colin X. và cs (2007), sử dụng lọc sinh học với giá thể bằng tre để xử lý yếm

khí nƣớc thải của cơ sở chế biến tinh bột sắn qui mô nhỏ ở Colombia cho thấy đã

loại bỏ 87% COD, 67% tổng chất rắn lơ lửng (TSS).

Đánh giá hiệu quả sử lý nƣớc thải tinh bột sắn bằng công nghệ lọc sinh học

trên các loại vật liệu lọc xơ dừa, than đá, nhựa PVC và nhựa Bio-Ball BB-15, tác

giả Nguyễn Thị Thanh Phƣợng và cs (2010) đã cho thấy cả 4 mô hình lọc sinh học

hiếu khí đều có khả năng xử lý hàm lƣợng hữu cơ và N với hiệu quả cao. COD, N giảm 90-98%; 61-92% ở tải trọng hữu cơ dao động từ 0,5; 1; 1,5 và 2 kg COD/m3

ngày. Trong khi đó Nguyễn Thị Thu Hiền (2012) đã ứng dụng thành công mô hình

công nghệ bể lọc sinh học ngập nƣớc (Submerged Biofilter –SBF) trong xử lý nƣớc

thải ƣơm nuôi cá biển. Chất lƣợng nƣớc ra khỏi bể lọc SBF đƣợc duy trì tốt trong

suốt thời gian vận hành với tải lƣợng cơ chất hữu cơ từ thấp đến cao.

1.2.2.2. Phƣơng pháp xử lý kỵ khí

Xử lý kỵ khí là quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ trong điều kiện

không có oxy nhờ vi sinh vật kỵ khí (chủ yếu là vi khuẩn). Trong điều kiện không có oxy, hệ vi sinh vật dị dƣỡng kỵ khí sẽ chuyển H+ và electron cho một chất hữu

21

cơ trung gian, làm cho quá trình này luôn đi kèm với việc tích tụ các chất hữu cơ

trung gian, chứ không thể chuyển hóa hoàn toàn đến sản phẩm cuối là CO2 và H2O

nhƣ với trƣờng hợp hệ vi sinh vật hiếu khí. Sản phẩm chuyển hóa sinh học kỵ khí

cuối cùng là một hỗn hợp khí (đƣợc gọi là khí sinh học hay biogas) bao gồm CH4

(chiếm tỉ lệ lớn nhất), C2H6, CO2… ngoài ra còn có H2S. Khí CH4 chiếm tới 65%

nên quá trình này còn gọi là lên men metan và quần thể vi sinh vật đƣợc gọi tên

chung là các vi sinh vật sinh metan. Phần và chất lƣợng khí sinh học tạo thành phụ

thuộc vào nồng độ hợp chất hữu cơ trong nƣớc thải, vào nhiệt độ môi trƣờng, pH,

thời gian xử lý... (Gruisasola và cs, 2008).

Đây là một quá trình phức tạp và cơ chế của nó chƣa đƣợc biết một cách đầy

đủ và rõ ràng. Có thể coi quá trình xử lý kỵ khí gồm 3 pha: pha ban đầu là phân

hủy, pha thứ hai là pha chuyển hóa axit, pha thứ ba là pha kiềm.

Trong pha axit, các vi sinh vật tạo thành axit gồm cả vi sinh vật kỵ khí và vi

sinh vật tùy tiện. Chúng chuyển hóa các sản phẩm phân hủy trung gian thành các

axit hữu cơ bậc thấp, cùng các chất hữu cơ khác nhƣ axit hữu cơ, axit béo, rƣợu, các

axit amin, glyxerin, axeton, H2S, CO2, H2.

Trong pha kiềm, các vi sinh vật sinh metan mới hoạt động. Chúng là các vi

sinh vật kỵ khí cực đoan, chuyển hóa các sản phẩm của pha axit thành CH4 và CO2.

Các phản ứng ở pha này chuyển pH của môi trƣờng sang kiềm.

Theo Kulwarang Suwanasri và cs (2015) xử lý nƣớc thải kỵ khí đã đƣợc phát

triển để sản xuất khí sinh học trong các nhà máy chế biến tinh bột sắn ở Thái Lan từ

năm 1984. Lúc đầu, hầu hết các nhà máy đều không quan tâm đến đầu tƣ sản xuất

khí sinh học do chi phí đầu tƣ cao. Tuy nhiên, điều này đã thay đổi hoàn toàn khi

việc giới thiệu các biện pháp mới và chiến lƣợc nhƣ hỗ trợ tài chính, ƣu đãi về thuế,

và pháp luật về môi trƣờng của chính phủ đƣợc thực thi.

Một số hệ thống xử lý khai thác năng lực hệ vi sinh vật kỵ khí điển hình là:

Bể xử lý kỵ khí UASB (upflow anaerobic sludge blanket)

Nƣớc thải đƣợc đƣa vào hệ thống theo dòng hƣớng ngƣợc lên và đi qua lớp

bùn kỵ khí. Hệ vi sinh vật kỵ khí trong lớp bùn sẽ phân huỷ hợp chất hữu cơ theo 3

22

giai đoạn, sản phẩm cuối cùng là một hỗn hợp khí, trong đó 2/3 là khí metan (Lê

Xuân Phƣơng, 2008). Giải pháp công nghệ này rất phổ biến và thích hợp với nƣớc

thải có hàm lƣợng hợp chất hữu cơ cao (COD lên tới vài nghìn mg/l). Tuy nhiên,

bản chất của quá trình phân huỷ kỵ khí là quá trình oxy hoá không triệt để nên hàm

lƣợng hợp chất hữu cơ trong nƣớc sau xử lý vẫn cao, do vậy sau xử lý UASB phải

tiếp tục xử lý hiếu khí thì nƣớc thải đầu ra mới đạt tiêu chuẩn cho phép thải ra ngoài

môi trƣờng (Trần Văn Nhân và cs, 2009).

Qua kết quả nghiên cứu xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn thu biogas bằng

hệ thống UASB, Nguyễn Thị Sơn và cs (2006) cho thấy khi pH dòng chảy đƣợc

điều chỉnh lên 5,5-6,0 hiệu quả xử lý và hiệu quả khí hóa tăng rõ rệt (từ 0,32 lít/g

lên 0,44 lít/g COD chuyển hóa). Thời gian lƣu của nƣớc thải trong hệ thống cũng

ảnh hƣởng không nhỏ tới tải trọng COD và hiệu quả khí hóa. Thời gian lƣu 3 ngày

cho hệ số khí hóa cao nhất (0,55 lít/g COD), tuy nhiên lƣợng biogas thu đƣợc và tải

trọng COD của hệ thống tăng khi lƣu lƣợng dòng vào tăng, tải trọng COD ở thời

gian lƣu 2 ngày là 5,49 g/l/ngày và ở 1,75 ngày là 6,05 g/l/ngày. Ứng dụng thành công hệ thống xử lý kỵ khí (UASB) công suất 10 m3/ngày đêm tại nhà máy tinh bột

sắn KMC Bình Phƣớc, tác giả Huỳnh Ngọc Phƣơng Mai (2006) đã cho biết sau 73

ngày vận hành hệ thống UASB với tải trọng hữu cơ trong khoảng 6,2-7,4 kg COD/m3ngày đêm, hiệu quả xử lý COD dao động trong khoảng 72-82%. Lƣợng khí

sinh ra dao động trong khoảng 260-350 lít khí biogas (> 60% metan) cho 1kg COD

bị khử. Tác giả cũng cho rằng hệ thống xử lý kỵ khí thực sự có hiệu quả đối với

những loại nƣớc thải chứa hàm lƣợng chất hữu cơ cao. Tuy nhiên, sau hệ thống xử

lý kị khí bao giờ cũng cần bƣớc xử lý triệt để tiếp theo để giảm thiểu nồng độ chất

hữu cơ và chất dinh dƣỡng đến mức thấp nhất, đạt tiêu chuẩn xả thải nƣớc thải công

nghiệp hiện hành tại Việt Nam.

Hầm khí sinh học (biogas)

Đây là hệ thống xử lý nƣớc thải có độ ô nhiễm cao và đƣợc áp dụng rất phổ

biến, đặc biệt là đối với nƣớc thải giàu chất hữu cơ. Bản chất công nghệ của hệ

thống này là khai thác năng lực phân huỷ hợp chất hữu cơ của hệ vi sinh vật kỵ khí

23

có trong lớp bùn đáy. Ƣu thế điển hình của hầm khí sinh học là chi phí vận hành rất

thấp vì không phải cấp khí, nhƣng nƣớc thải sau xử lý vẫn còn bị ô nhiễm và cần

phải đƣợc xử lý tiếp tục bằng giải pháp xử lý hiếu khí, cho đến khi đạt ngƣỡng yêu

cầu về chất lƣợng, rồi mới đƣợc thải ra môi trƣờng (Lƣơng Đức Phẩm, 2009).

Ở Thái Lan, từ năm 2003-2005 đƣợc sự giúp đỡ của Bộ Năng lƣợng Thái

Lan, các nhà máy chế biến tinh bột sắn đã xây dựng hệ thống biogas xử lý nƣớc thải

sắn gồm 4 loại công nghệ khác nhau: UASB, UASB A+, màng cố định và ao hồ có

màng bao phủ. Nƣớc thải CBTBS từ 9 nhà máy có hệ thống xử lý có thể tạo ra 36,4 triệu m3 khí sinh học/năm, tƣơng đƣơng với 21,8 triệu lít dầu đốt/năm đem lại nhiều

lợi nhuận kinh tế cho nhà máy và giảm thiểu đƣợc ô nhiễm môi trƣờng (TTSA,

2015).

Trong nghiên cứu của Phạm Đình Long và cs (2014), đã thu hồi khí biogas

từ nƣớc thải chế biến tinh bột sắn bằng phƣơng pháp lên men kỵ khí, nhằm mục

đích giúp các nhà máy chế biến tinh bột sắn xác định lƣợng biogas có thể thu hồi từ

quá trình xử lý kỵ khí nƣớc thải tinh bột sắn, qua đó giúp nhà máy tiết kiệm một

phần năng lƣợng, giảm ô nhiễm môi trƣờng đồng thời giảm phát thải khí nhà kính.

Năm 2007-2008, Bùi Trung và cs thuộc Viện Công nghệ Hóa học, đã tiến

hành khảo sát khảo sát hiện trạng và đánh giá mức độ xử lý ô nhiễm tại một số cơ

sở sản xuất tinh bột sắn ở Tây Ninh và đã xây dựng đƣợc quy trình xử lý nƣớc thải theo công nghệ xử lý yếm khí với công suất 600 m3/ngày. Công trình tận thu đƣợc

nguồn khí biogas, tiết kiệm chi phí xây dựng, phù hợp với các điều kiện xây dựng

của các nhà máy chế biến tinh bột sắn tại Việt Nam.

-.. nếu

1.2.2.3. Phƣơng pháp xử lý thiếu khí (vi hiếu khí)

+, NO2

-, NO3

Trong nƣớc thải thƣờng chứa lƣợng Nitơ dƣới dạng NH4

không đƣợc xử lý sẽ gây ra hiện tƣợng phú dƣỡng. Để loại trừ đƣợc các thành phần

ô nhiễm này, cùng với hoạt tính khử nitrat đồng hóa của các vi sinh vật dị dƣỡng,

ngƣời ta thƣờng cần phải khai thác đồng thời năng lực trao đổi chất của các vi

khuẩn phản nitrat hoá trong môi trƣờng. Để những vi sinh vật phản nitrat hóa điển

hình sinh trƣởng và phát triển, để chúng khử dị hóa mạnh mẽ và hiệu quả lƣợng

24

-, NO3

- thành sản phẩm cuối cùng là N2, hệ thống xử lý phải xác lập đƣợc điều

NO2

kiện môi trƣờng chỉ có rất ít oxy hòa tan (điều kiện vi hiếu khí). Các giải pháp công

nghệ xử lý vi hiếu khí các chất Nitơ vô cơ điển hình là công nghệ Anammox

(Anaerobic ammonium oxidation), công nghệ Sharon (Single reactor system for

Hing-rate Ammonium Removal Over Nitrite), công nghệ Sharon-Anammox, công

nghệ Canon (Completely autotrophic nitrogien removal over nitrite), công nghệ

Oland (Oxygien-limited autotrophic nitrification–denitrification)...

Ứng dụng phƣơng pháp xử lý vi hiếu khí tác giả Lê Công Nhất Phƣơng và cs

(2012) đã nghiên cứu xử lý ammonium trong nƣớc thải giết mổ bằng quá trình nitrit

một phần/Anammox trong một bể phản ứng, sử dụng giá thể poly acrylic và sợi

bông tăm. Kết quả cho thấy mô hình hoạt động hiệu quả với hiệu suất xử lý đạt 92% ở tải trọng 0,04 kg N-NH4/m3 ngày và 87,8% ở tải trọng 0,14 kg N-NH4/m3 ngày.

1.2.2.4. Hệ thống xử lý sinh học nƣớc thải phối hợp

Trong thực tiễn ứng dụng, để xử lý triệt để và hiệu quả các chất ô nhiễm

trong nƣớc thải, ngƣời ta thƣờng khai thác ứng dụng phối hợp nhiều giải pháp công

nghệ với nhau, bao gồm: cơ học (lọc tách rác, lắng cát, lắng phân ly bùn hoạt

tính…), xử lý sinh học nhờ vi sinh vật, xử lý hóa học-hóa lý (trợ lắng, keo tụ, khử

trùng)… Mục tiêu khai thác năng lực xử lý của vi sinh vật thƣờng đƣợc triển khai

trong các hệ thống có phân chia tách biệt, hoặc phân vùng đặc tính chức năng, để

xác lập môi trƣờng hoạt động hiệu quả đồng thời cho cả ba nhóm vi sinh vật: hệ vi

sinh vật hiếu khí, hệ vi sinh vật kỵ khí và hệ vi sinh vật vi hiếu khí phát triển, để

chúng phân hủy chuyển hóa các thành phần ô nhiễm tƣơng ứng mong muốn.

Hệ thống xử lý sinh học nƣớc thải phối hợp đƣợc xem là dạng công nghệ xử

lý nƣớc thải vi sinh đƣợc triển khai xây dựng rộng rãi trên thế giới. Với đặc trƣng

công nghệ là xây dựng các bể xử lý chức năng tách biệt nhau và việc đảm bảo, duy

trì nồng độ oxy hòa tan cho vi sinh vật hiếu khí phát triển trong bể xử lý hiếu khí

đƣợc thực hiện nhờ áp dụng các giải pháp cấp khí cƣỡng bức (bằng khuấy trộn sục

khí trên bề mặt, hay phổ biến hơn là sử dụng máy nén khí để nén rồi sục phân tán

khí vào đáy bể qua các thiết bị phân tán khí tƣơng ứng). Hệ thống xử lý nƣớc thải

25

phối hợp nhƣ mô tả trên có ƣu điểm lớn là đơn giản trong lắp đặt, vận hành, bảo

dƣỡng và có hiệu quả xử lý cao. Song các hệ thống này lại có yêu cầu lớn về diện

tích để xây dựng nhiều bể xử lý chức năng riêng tách biệt nhau và chi phí chung cho

quá trình xử lý vẫn luôn là áp lực đối với nhà đầu tƣ và luôn đặt ra nhu cầu cải thiện

chất lƣợng cũng nhƣ hiệu quả công nghệ.

Nƣớc thải từ các nhà máy tinh bột sắn đƣợc xả trực tiếp vào sông trƣớc khi

đƣợc xử lý là một nguồn ô nhiễm, đã gây ra các vấn đề về môi trƣờng cho ngƣời

dân Indonesia. Để giải quyết vấn đề này các nhà nghiên cứu đã phát triển tích hợp

quá trình sản xuất và tinh chế khí sinh học từ nƣớc thải tinh bột sắn kết hợp với vi

tảo. Kết quả cho thấy lƣợng khí sinh học tăng lên sau khi nƣớc thải đƣợc bổ sung vi

tảo và nấm men. Lƣợng khí sinh học từ vi tảo và nƣớc thải tinh bột sắn là 726,43

ml/g tổng rắn, lƣợng khí sinh học không có vi tảo là 189 ml/g tổng rắn (Budiyono

và cs, 2012).

Nghiên cứu của Kathia R. Kunzler và cs (2013) đã phối hợp hệ thống xử lý

kỵ khí với lọc sinh học có tỉ lệ chiều dài và đƣờng kính khác nhau trong xử lý nƣớc

thải ngành công nghiệp tinh bột sắn ở Bzaril cho thấy hai hệ thống đƣợc sử dụng có

tỉ lệ đƣờng kính và chiều dài là 1:6 và 1:3, tải trọng hữu cơ đƣợc áp dụng cho các hệ

thống là 0,519, 1,156, 1,471, 3,049, 4,347, 4,708 và 5.601g/l/d không có sự khác

biệt về hiệu quả loại bỏ COD, TSS.

Theo Trƣơng Văn Lung và cộng sự (2003) trƣờng Đại học Khoa học Huế thì

sử dụng phƣơng pháp keo tụ bằng Al2(SO4)3 để xử lý sơ bộ nƣớc thải CBTBS đã loại

đƣợc 38% chất rắn không hoà tan, 28-36% chất lơ lửng. Tiếp theo dùng phƣơng pháp

vi sinh vật kỵ khí sau 25 ngày có thể giảm 94,8% chất rắn lơ lửng, 86,9% chất rắn

tổng số, 91% BOD5 và 87,6% COD so với nƣớc thải chƣa xử lý. Ngoài ra, tiếp tục sử

dụng bèo tây (bèo Nhật Bản) để xử lý làm SS giảm 1,16%, BOD5 giảm 3,82%, COD

giảm 3,52% so với lúc đầu. Nhƣ vậy, dùng bèo để xử lý bậc 3 cho hiệu quả rất tốt.

Tóm lại, có rất nhiều phƣơng pháp xử lý nƣớc thải khác nhau có thể áp dụng

để xử lý nƣớc thải ngành công nghiệp chế biến tinh bột sắn. Tùy vào qui mô, năng

26

lực cũng nhƣ cơ sở hạ tầng kỹ thuật, khả năng kinh phí cho phép mà lựa chọn

phƣơng pháp xử lý cho phù hợp.

1.3. Chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải

1.3.1. Quá trình chuyển hóa vật chất của vi sinh vật trong nƣớc thải

Nƣớc thải mới ra khỏi dây truyền sản xuất thì mật độ vi sinh vật thƣờng

không nhiều. Sau một thời gian, những nhóm vi sinh vật thích nghi đƣợc với đặc

trƣng của nƣớc thải sẽ phát triển mạnh, số lƣợng và số loài dần phong phú hơn.

Trong nƣớc thải có chứa nhiều nhóm vi sinh vật nhƣ nhóm vi khuẩn phân giải

đƣờng Clostridium, Cytophaga sp., các vi khuẩn gây thối Proteus vulgaris, B.cereus,

các vi khuẩn oxy hóa lƣu huỳnh Thiobacillus, Beggiatoa, vi khuẩn phản nitrat hóa

Thiobacillus denitrificans, Micrococcus denitrificans… (Chu Thị Thơm và cs, 2006).

Quá trình làm sạch nƣớc do các VSV bao gồm ba giai đoạn sau:

- Các hợp chất hữu cơ tiếp xúc với bề mặt tế bào VSV;

- Quá trình khuyếch tán và hấp thụ các chất ô nhiễm nƣớc qua màng bán thấm

vào trong tế bào VSV;

- Chuyển hóa các chất ô nhiễm trong nội bào để sinh ra năng lƣợng và tổng

hợp vật liệu mới cho tế bào VSV.

Cả ba giai đoạn này có mối liên quan rất chặt chẽ với nhau làm nồng độ các

chất gây ô nhiễm trong nƣớc giảm dần.

Tinh bột và quá trình chuyển hoá tinh bột nhờ vi sinh vật

Tinh bột-(C6H10O5)n-một loại polysacarit chủ yếu trong hạt, trong củ, trong

quả. Tinh bột khi gặp thuốc thử iốt sẽ có màu từ nâu đỏ đến xanh. Tinh bột đƣợc

cấu tạo bởi hai thành phần có cấu trúc khác nhau: amylose và amylopectin.

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử tinh bột

27

Amylose là loại có cấu tạo xoắn, mỗi vòng xoắn gồm 6 gốc glucose. Trọng

lƣợng phân tử của amylose vào khoảng 10.000-100.000 dalton (Lê Xuân Phƣơng,

2008).

Amylopectin có cấu tạo phân nhánh. Bên cạnh dây nối α-1,4-glucozit trong

phân tử amylopectin còn có dây nối α-1,6-glucozit (ở đầu các nhánh). Mỗi nhánh

nhỏ gồm khoảng 20-25 gốc glucozit. Trọng lƣợng phân tử của amylopectin vào

khoảng 50.000-1.000.000 dalton (Lê Ngọc Tú, 2006).

VSV phân giải tinh bột có khả năng tiết ra môi trƣờng hệ enzym amilaza bao

gồm 4 enzym: α-amilaza (còn gọi là endoamilaza), β-amilaza, amilo 1,6 glucosidaza

và glucoamilaza. Dƣới tác động của 4 loại enzym này, phân tử tinh bột đƣợc phân

giải thành đƣờng glucoza.

Ứng dụng vi sinh vật sinh enzym thuỷ phân tinh bột đƣợc nhiều nhà khoa

học nghiên cứu. Năm 2010, ở Trung Quốc tác giả Zhou G. và cs đã nghiên cứu sử

dụng vi sinh vật để xử lý nƣớc thải chứa tinh bột, đầu tiên là sử dụng hệ vi sinh vật

kỵ khí, sau đó sử dụng hệ vi sinh vật hữu hiệu (EM) hiếu khí và tuỳ nghi để xử lý

tiếp, kết quả loại trừ đƣợc tới 99 % COD trong nƣớc thải (Zhou G. và cs, 2010).

Nitơ và quá trình chuyển hóa hợp chất Nitơ trong nước thải

Theo Soratikou và cs (1999), hợp chất Nitơ trong nƣớc thải tồn tại dƣới các

-, và NO3

+, NO2

dạng chính là các hợp chất Nitơ hữu cơ (protein, peptid, acid amin) và Nitơ vô cơ -). Quá trình chuyển hoá sinh học nguồn Nitơ hữu cơ trong tự (NH4

nhiên nhờ vi khuẩn, một phần lƣợng Nitơ này đƣợc đồng hóa quay trở lại thành

+ và NO3

nguồn Nitơ hữu cơ trong cấu trúc tế bào (hấp thu dƣới dạng các acid amin, hay nhờ - làm nguồn dinh dƣỡng Nitơ, năng lực khử nitrat đồng hóa các muối NH4

để tổng hợp tế bào, hay năng lực tự dƣỡng amin có ở nhiều loài vi sinh vật), phần

còn lại trong điều kiện hiếu khí cuối cùng thƣờng dẫn tới tích tụ muối nitrat (do quá

trình oxy hóa-khử sinh học để thu nhận năng lƣợng của các vi khuẩn nitrit và vi

khuẩn nitrat hoá, với hai giống điển hình là vi khuẩn Nitrosomonas, vi khuẩn

Nitrobacter). Tiếp theo, nhờ quá trình phân huỷ sinh học thiếu khí hoặc kỵ khí (do

28

quá trình oxy hóa-khử sinh học để thu nhận năng lƣợng của các loài vi khuẩn phản

nitrat hóa) các muối nitrat này có thể chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng là N2.

Quá trình amon hóa protein

Quá trình amon hóa protein là quá trình phân huỷ và chuyển hóa protein +, dƣới tác (cũng nhƣ các sản phẩm thủy phân trung gian của protein) thành NH4

+

dụng của các loài vi sinh vật:

-

+

Các hợp chất hữu cơ có N → NH3 hoặc NH4

+ OH NH3 + H2O → NH4

Quá trình chuyển hoá sinh học protein thành acid amin do nhiều vi sinh vật

hiếu khí và kỵ khí có năng lực sinh tổng hợp hệ enzym proteaza ngoại bào gây ra (Lê Xuân Phƣơng, 2008), theo sơ đồ cơ chế:

Protein → polypeptid → peptid → acid amin

Quá trình chuyển hoá tiếp theo, các acid amin này một phần sẽ đƣợc vi sinh

vật hấp thu làm nguồn vật liệu cấu trúc Nitơ để sinh trƣởng và phát triển, còn một

phần sẽ bị chuyển hóa theo cơ chế khử amin hóa (trong trƣờng hợp vi sinh vật sử

dụng nguồn acid amin này làm vật liệu chỉ để thu nhận mạch khung cacbon vào

mục tiêu chuyển hóa tiếp tục để thu năng lƣợng sinh học, hoặc để thu nhận vật liệu

cấu trúc nên các thành phần khác không chứa Nitơ trong tế bào nhƣ glucid, lipid…).

+ trong môi trƣờng.

Kết quả là quá trình khử amin hóa (dezamin) các acid amin đã dẫn đến xuất hiện và

tích tụ dần NH3 tự do, hay dƣới dạng NH4

Quá trình nirat hóa

Quá trình nitrat hóa là quá trình oxy hóa tiếp tục Nitơ amon, đầu tiên tạo

chính là oxy hóa muối amon thành NO2

thành nitrit và sau đó tạo thành nitrat. Quá trình nitrat hóa bao gồm 2 giai đoạn - (nitrit hóa), giai đoạn oxy hóa nitrit thành - (nitrat hóa) và quá trình này đƣợc thực hiện chủ yếu bởi hai nhóm vi khuẩn tự NO3

dƣỡng có năng lực chuyển hóa và sử dụng đƣợc nguồn năng lƣợng thoát ra từ quá

trình oxy hóa vô cơ amon và nitrit.

Giai đoạn 1: giai đoạn nitrit hóa

29

Bƣớc đầu tiên của quá trình nitrat hoá, vi khuẩn sẽ oxy hoá amoni thành

nitrit theo phƣơng trình:

- + H+ + H2O

NH3 + 1,5O2 NO2

Trong đó, Nitrosomonas là chi phổ biến nhất đƣợc phát hiện tham gia giai

đoạn này, sau đó đến Nitrosococcus, Nitrosospira và Nitrospira. Ngoài ra,

Nitrosolobus và Nitrosovibrio cũng có thể oxy hóa anoni (Leininger S. và cs, 2006).

Chúng đều là vi khuẩn gram âm, sinh ra các enzym hydroxylamine oxidoreductase

(HAO) và ammonia monooxygienase (AMO) để oxy hóa amoni thu năng lƣợng

(Patrick Chain và cs, 2003). Những vi khuẩn này còn có khả năng hoạt động tốt

trong môi trƣờng có hàm lƣợng nitrit cao, mà đối với vi sinh vật khác thì bị ức chế

(Ran Y., Kartik C., 2010).

Điều đáng chú ý nữa là trong quá trình nitrit hóa, cơ chất NH3 chứ không +, bởi vậy quá trình oxy hóa amon xảy ra mạnh nhất ở pH trung tính 7,5- phải là NH4

8,5 hoặc kiềm khi amoniac ở dạng không ion hóa (NH3) nhiều hơn (Andren D.E.,

Awwa, 1995).

Giai đoạn 2: giai đoạn nitrat hóa

Đó là giai đoạn oxy hóa nitrit thành nitrat do enzym nitritoxydase và

-

cytochrom oxydase xúc tác.

- + 0,5O2 NO3

NO2

Nitrobacter là chi phổ biến nhất đƣợc phát hiện thực hiện giai đoạn này.

Ngoài ra còn có các vi sinh vật tự dƣỡng khác cũng có khả năng oxy hoá nitrit thành

nitrat nhƣ: Nitrococcus, Nitrospira… (Watson S.W., 1991). Nhìn chung, vi khuẩn

nitrat hóa có thể phát triển đƣợc trong điều kiện hiếu khí, và cả trong môi trƣờng

hạn chế oxy. Các chủng vi khuẩn Nitrobacter có thể phát triển trong môi trƣờng tạp

dƣỡng hoặc dị dƣỡng, nhƣng các chủng Nitrospira, Nitrococcus, Nitrospina thƣờng

lại không phát triển đƣợc trên môi trƣờng dị dƣỡng cacbon.

Theo Philips S. và cs (2002), vi khuẩn oxy hóa amoni (AOB) sinh ra năng

lƣợng lớn hơn vi khuẩn oxy hóa nitrit (NOB) trong quá trình oxy hóa nên có tốc độ

tăng trƣởng tốt hơn. Các vi khuẩn này hoạt động đƣợc trong môi trƣờng có hàm

30

lƣợng oxy hòa tan thấp và Nitrosomonas có pH tối ƣu là 8,1, Nitrobacter là 7,9

(Grunditz C., 2001).

-

Quá trình phản nitrat hóa

để bù trả lại Nitơ cho không khí đƣợc Là quá trình chuyển hóa NO3 thành N2

gọi là quá trình phản nitrat hóa (Scott C. K., 1993). Trong tự nhiên có 2 dạng khử

+.

nitrat:

Quá trình đồng hóa (amon hóa nitrat): là quá trình khử nitrat thành NH4

Quá trình này xảy ra ở một số vi khuẩn nhƣ Bacillus, E. coli, Aerobacter và ở nhiều

loài vi sinh vật khác. Quá trình xảy ra trong điều kiện hiếu khí và có chức năng

- thành

cung cấp amon cho tế bào dùng tổng hợp acid amin.

- hoặc NO2

Quá trình dị hóa (phản nitrat hóa): là quá trình khử NO3

Nitơ phân tử, chỉ diễn ra trong điều kiện vi hiếu khí và điều kiện kỵ khí dƣới sự tác

động của các enzym nitrat reductase, nitrit reductase, nitrioxit reductase và

Nitrousoxit reductase

Nitrioxit reductase

Nitrit reductase

nitrousoxit reductase (Kh. Elbanna và cs, 2012), theo sơ đồ chuyển hóa sau:

Nitrat reductase

NO

N2

N2O

-

NO2

NO 3

Quá trình phản nitrat hóa đƣợc thực hiện với sự tham gia của các vi khuẩn

Pseudomonas, Azospirillum, Alcaligienes, Rhodopseudomonas, Propionibacterium,

Achromobacter, Micrococcus, Paracoccus… Bên cạnh một số vi khuẩn lƣu huỳnh

nhƣ Thiobacillus, Sulfomonas thì vi khuẩn Rhizobium cũng có khả năng khử Nitơ

trong trƣờng hợp môi trƣờng thiếu oxy, vi khuẩn này có thể oxy hóa nitrat thành

năng lƣợng cho cơ thể (Moir J.W.B., 2011). Các vi khuẩn phản nitrat hóa có vai trò

quan trọng trong xử lý nƣớc thải, vì chúng loại bỏ nguồn Nitơ liên kết độc hại đối

với môi trƣờng sinh thái. Trong môi trƣờng nƣớc thải, nitrit và nitrat thƣờng tồn tại

dƣới dạng muối của các kim loại kiềm và kiềm thổ. Trong quá trình phân giải các

muối kali, natri, canxi… sẽ kèm theo hình thành các muối cacbonat và kiềm. Vì thế,

quá trình phản nitrat hóa thƣờng kèm theo sự kiềm hóa môi trƣờng.

31

Phospho và quá trình chuyển hóa hợp chất Phospho trong nước thải

Cùng với Nitơ, Phospho là dinh dƣỡng cần thiết cho cơ thể sống. Mặc dù

Phospho không thuộc loại chất độc hại đối với con ngƣời nhƣng khi tồn tại trong

nƣớc thải ở nồng độ quá cao khi xả trực tiếp ra môi trƣờng mà không qua xử lý sẽ

gây ra hiện tƣợng phú dƣỡng nguồn nƣớc, gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới môi

trƣờng.

Trong nƣớc thải, Phospho tồn tại cả ở dạng Phospho vô cơ (orthophosphat 3-), polyphosphat, và Phospho hữu cơ (axit nucleic, inositol phosphat, phytin…), PO4

(n+2)-) đều

nhƣng chủ yếu là dạng orthophosphat (Charles P., 2003).

Tất các dạng polyphosphat (Phosphat ngƣng tụ mạch thẳng PnO3n+1

chuyển hóa về dạng orthophosphat trong môi trƣờng nƣớc, quá trình chuyển hóa

đƣợc thúc đẩy bởi nhiệt độ và trong môi trƣờng axit. Polyphosphat bị phân hủy

2-

nhanh nhờ quá trình thủy phân nhƣ sau:

5- + 2H2O = 2HPO4

+ H2PO4

P3O10

Các Phospho hữu cơ cũng đƣợc oxy hóa và thủy phân thành dạng

orthophosphat. Các ion Phosphat trong nƣớc thƣờng bị thủy phân theo 3 bậc sau

2-

đây (do H3PO4 có 3 nấc phân ly)

-

PO4

+ OH- 3- + 2H2O HPO4 2- + H2O H2PO4 + OH- + H2O H3PO4 + OH- -

HPO4

H2PO4

Theo Richard I. Sedlak (1991) việc loại bỏ Phospho trong nƣớc thải bằng

con đƣờng sinh học dựa vào khả năng của vi sinh vật có khả năng chuyển hóa và

tích lũy một lƣợng lớn Phospho dƣới dạng polyphosphat (hạt volutin) trong tế bào

của chúng. Những vi sinh vật này có khả năng loại bỏ các hợp chất axit béo đơn

giản sinh ra trong điều kiện kỵ khí và đồng hóa thành các sản phẩm dự trữ

polyhydroxybutyrate (PHB) trong các tế bào của vi sinh vật. Quá trình này liên

quan đến việc giải phóng Phospho. Trong điều kiện hiếu khí, năng lƣợng đƣợc sản

sinh nhờ quá trình oxy hóa của các sản phẩm dự trữ (PHB) và các polyphosphat

đƣợc tổng hợp và hình thành glycogien và kết quả vi sinh vật hấp thụ một lƣợng lớn

32

Phospho và dự trữ dƣới dạng hạt polyphosphat trong tế bào, do đó sinh trƣởng của

vi sinh vật đƣợc tăng lên (Bdrjanovic và cs, 1997).

Phospho không chỉ cung cấp cho hoạt động sống của vi sinh vật mà còn đƣợc

tích lũy để vi sinh vật sử dụng khi cần thiết. Trong qua trình xử lý nƣớc thải, nếu

sau vùng kỵ khí là vùng hiếu khí thì vi sinh vật sẽ hấp thu và tích lũy Phospho trên

mức bình thƣờng nhằm sử dụng khi cần thiết (Kong Y. và cs, 2005).

Xyanua và sự chuyển hóa xyanua nhờ vi sinh vật

Xyanua (CN-) là anion của xyanhydric axit có công thức là C=N, một chất

hóa học rất độc hại đối với sinh vật sống (Tổ chức Y tế Thế giới, 2004).

Trong tự nhiêu, hợp chất xyanua có thể đƣợc tìm thấy trong hơn 3.000 loài

thực vật, động vật, vi khuẩn và nấm. Thực vật sản sinh xyanua nhƣ một cơ chế

phòng vệ chống lại động vật ăn cỏ (Randviir và cs, 2015).

Trong sắn, xyanua tồn tại dƣới dạng xyanogenic glycoside gồm hai chất là

linamarin và lotaustralin. Chất này bị thủy phân tự nhiên bởi men linamarase tạo

thành xyanhytric axit (HCN) là chất gây độc cho cơ thể. Các giống sắn ngọt chứa

80-110 mg HCN/kg lá tƣơi và 20-30 mg HCN/kg củ tƣơi. Giống sắn đắng chứa

160-240 mg HCN/kg lá tƣơi và 60-150 mg HCN/kg củ tƣơi. Trong củ sắn, độc tố

xyanua thƣờng chỉ tập trung ở hai đầu, vỏ và lõi củ sắn. Tuỳ theo giống, vỏ củ, lõi

củ, thịt củ, điều kiện đất đai, chế độ canh tác, thời gian thu hoạch mà hàm lƣợng

HCN có khác nhau.

Xyanua rất độc, nhƣng may mắn là nó lại dễ bị phân hủy bởi nhiều tác nhân

lý hóa, xyanua rất dễ bị oxy hóa bởi những chất thông thƣờng nhƣ clo, nƣớc oxy

già, phóc môn, thuốc tím…và ngay cả với oxy trong không khí. Độc tố xyanua cũng

rất dễ tan trong nƣớc. Xyanua trong thực phẩm dễ dàng bị phá hủy bởi nhiệt độ, dễ

bốc hơi bay đi hoặc đƣợc rửa sạch bằng nƣớc.

Nhiều vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu có thể chuyển hóa hợp chất xyanua đơn

giản và phức tạp để tạo thành hợp chất ít độc hại hơn. Xyanua cũng có thể đƣợc vi

sinh vật sử dụng làm chất dinh dƣỡng (nguồn carbon và nguồn nitơ) cho sự tăng

trƣởng của chúng, vì vậy cung cấp nguồn carbon bên ngoài không còn cần thiết cho

33

các vi khuẩn này (Bouari, 2012). Một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa xyanua

nhƣ vi khuẩn Klebsiella oxytoca (Chen và cs, 2008), Pseudomonas fluorescens P70

(Dursun và cs, 1999), nấm Fusarium solani (Barclay và cs, 1998), Fusarium

oxysporum (Akinpelu và cs, 2015), tảo Scenedesmus obliquus (Gurbuz và cs, 2009).

Cơ chế chuyển hóa xyanua nhờ vi sinh vật: Đầu tiên là sự phân hủy, oxy hóa

xyanua nhờ các hệ enzym hydrolase thioxyanate, xyanidase, amidase hydratase…

trong tế bào vi sinh vật, bƣớc tiếp theo là quá trình hấp phụ và kết tủa các ion vào

màng tế bào. Xyanua và hợp chất của xyanua nhƣ thioxyanate sau đó đƣợc chuyển

thành amoniac, cacbonat và sunfat (Ackil, 2003). Trong bƣớc thứ hai, amoniac

đƣợc chuyển thành nitrat thông qua quá trình nitrat hóa.

Sự chuyển hóa hợp chất xyanua phụ thuộc vào liên kết hóa học của chúng,

xyanua tự do dễ dàng đƣợc phân hủy nhất, tiếp theo là hợp chất muối xyanua của

kẽm, niken, đồng, hợp chất sắt xyanua đƣợc phân hủy ít nhất (Mudder và cs, 1998).

Hiệu quả xử lý xyanua của các vi khuẩn khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi

trƣờng pH, nhiệt độ, dạng hợp chất xyanua và nồng độ xyanua ban đầu.

Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa HCN trong nƣớc nhƣ Pseudomonas

fluorescens NCIMB 11.764, hiệu quả phân hủy xyanua tự do là 105-706 mmol/phút

(Kunz và cs, 1992; Kunz và cs, 1998). Hỗn hợp vi khuẩn Klebsiella pneumoniae và

Ralstonia sp. có khả năng chuyển hóa thioxyanate là 1.042 mg/L/phút (Chaudhari

và Kodam, 2010). Nấm Gloeocercospora sorghi có khả năng chuyển hóa xyanua tối

đa là 4,4 mmol/phút/mg (Jandhyala, 2002).

Vi sinh vật có khả năng làm giảm xyanua (HCN) trong đất mạnh hơn so với

trong nƣớc. Xử lý xyanua nhờ vi sinh vật là quá trình xử lý sinh học phụ thuộc vào

các dạng liên kết của xyanua, nồng độ xyanua cũng nhƣ các yếu tố gây ô nhiễm môi

trƣờng tác động đến vi sinh vật. Xử lý xyanua sinh học là một quá trình tự nhiên,

phải mất thời gian, có hiệu quả vì tốn ít chi phí hơn so với các phƣơng pháp thông

thƣờng khác và không sử dụng bất kỳ hóa chất nguy hiểm. Xử lý sinh học xyanua

có thể đƣợc áp dụng ở quy mô lớn và nguồn ô nhiễm xyanua khác nhau trong chất

34

thải công nghiệp dạng lỏng, rắn và khí. Tuy nhiên, việc lựa chọn đơn chủng hoặc

hỗn hợp chủng vi sinh vật là rất quan trọng để áp dụng trong quá trình xử lý xyanua.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải

Sử dụng chế phẩm sinh học để làm sạch một phần chất hữu cơ phân hủy

trong nƣớc thải là phƣơng pháp đang đƣợc ứng dụng rộng rãi. Nhiều chế phẩm sinh

học đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng vào việc xử lý ô nhiễm nƣớc thải, trong đó đáng

chú ý là chế phẩm EM (Effective Microorganism-Vi sinh vật hữu hiệu) do Giáo sƣ

Tiến sĩ Teuro Higa-Trƣờng Đại học Tổng hợp Ruykyus, Okinawa, Nhật Bản nghiên

cứu tạo ra và đƣợc áp dụng vào thực tiễn từ đầu năm 1980. Chế phẩm EM gồm tập

hợp các nhóm vi sinh vật khác nhau: Vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm

men, xạ khuẩn, nấm mốc sống cộng sinh trong cùng môi trƣờng. Chúng đƣợc sử

dụng nhƣ một chất cấy tạo mầm, nhằm tăng cƣờng tính đa dạng vi sinh vật trong

đất, cũng nhƣ trong môi trƣờng tự nhiên, có tác dụng làm giảm thiểu ô nhiễm môi

trƣờng do các vi sinh vật có hại gây ra. Nghiên cứu của Lucilene Beatriz Pissinatto

và cs (2004) ở Brazil cho thấy khi sử dụng chế phẩm EM thông qua phân tích có

định hƣớng vi sinh và hóa - lý trong quá trình điều chỉnh vi sinh vật của hệ thống ao

hồ xử lý nƣớc thải CBTBS công nghiệp với công suất 400 tấn sắn/ngày với lƣợng nƣớc thải trung bình 2100 m3/ngày, thì hiệu quả xử lý đã tăng lên rõ rệt, mùi hôi

thối giảm tối đa và BOD5 loại bỏ trên 80% đến 99%, nƣớc thải đầu ra thấp hơn 40

mg/l.

Thí nghiệm của nhóm tác giả S. Karthick Raja Namsivayam và cs (2011)

đánh giá khả năng sử dụng chế phẩm EM chứa hỗn hợp các chủng vi sinh vật

Lactobacillus platarum, Candida itilis, Streptomyces albus và Aspergillus oryaze xử

lý nƣớc thải sinh hoạt. Kết quả thí nghiệm cho thấy tổng chất rắn hòa tan, nhu cầu

oxy sinh học, và nhu cầu oxy hóa học của nƣớc thải sinh hoạt ở công thức thí

nghiệm giảm rõ rệt so với đối chứng.

Nghiên cứu của Emad A. Shalaby (2011) đã sử dụng chế phẩm chứa chủng

Aspergillus terreus trên chất mang mùn cƣa, chế phẩm đƣợc sử dụng theo công

nghệ bùn hoạt tính để kiểm tra khả năng xử lý nƣớc thải công nghiệp từ các nhà

35

máy chế biến khoai tây thành đồ ăn nhanh, là nguồn gây ô nhiễm nƣớc nghiêm

trọng do có chứa hàm lƣợng BOD, COD, TDS, TSS cao, ngoài ra còn có thêm dầu,

mỡ động vật. Kết quả cho thấy hàm lƣợng BOD; COD; dầu mỡ; TDS; TSS giảm

tƣơng ứng 85; 79; 82,7; 74,6; 87,7%.

Mặt khác nhóm tác giả Lian và cs (2008) đã ứng dụng vi khuẩn Bacillus

mucilaginosus trong xử lý nƣớc thải sinh hoạt, nƣớc thải nhà máy bia, nhà máy

dƣợc liệu làm giảm 74,6%, 70,5% và 60,2% COD; giảm 93,3%, 93,6% và 88,4%

TSS theo thứ tự.

Năm 2013, Stephen Abban và công sự đã công bố kết quả nghiên cứu, tuyển

chọn nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phân giải các hợp chất chứa

xyanua ở pH 4,5-5. Kết quả của nhóm nghiên cứu đã phân lập đƣợc hơn 40 chủng

thuộc chi Bacillus (20 chủng B.subtilis, 11 chủng B.lichenifomis, 7 chủng

B.sonorensis, 2 chủng B.cereus). Trong đó đã tuyển chọn đƣợc các chủng B.sutilis

có khả năng phân giải hiệu quả các hợp chất xyanua trong điều kiện pH 4,5-5.

Trƣớc đó, năm 2009 Vasconcellos và cs đã công bố kết quả nghiên cứu phân lập các

chủng vi sinh vật có khả năng phân giải linamarin từ nƣớc thải chế biến tinh bột

sắn. Kết quả đã phân lập đƣợc 31 chủng vi sinh vật, tuyển chọn 2 chủng Bacillus

licheniformis (isolate 2_2) và Rhodotorulla glutinis (isolate L1) có khả năng phân

giải lần lƣợt 71% và 95% linamarin trong 7 ngày trên quy mô thí nghiệm. Kết quả

cho thấy khả năng phân giải sinh học và khử độc do xyanua hiệu quả trong nƣớc

thải chế biến tinh bột sắn (S.P. Vasconcellos và cs, 2009).

Trong khi đó nghiên cứu P. Kaewkannetraa và cs (2009) về sử dụng vi khuẩn

Azotobacter vinelandii TISTR 1094 để loại bỏ xyanua trong nƣớc thải tinh bột sắn.

Kết quả cho thấy khả năng loại bỏ xyanua của A.vinelandii phụ thuộc vào nồng độ

xyanua ban đầu. Khi nồng độ xyanua ban đầu tăng lên, tỉ lệ xyanua bị loại bỏ cũng

tăng lên và có thể đạt đến 65,3%. Trong hệ thống xử lý bằng bùn hoạt tính với sự có

mặt của A. vinelandii đã loại bỏ xyanua lên đến 90%.

Theo tác giả Cao Ngọc Điệp và cs (2012), sử dụng chế phẩm sinh học bao

gồm ba dòng vi khuẩn có hiệu quả kết tụ cao (dòng T2a, KT1 và P11) 3 dòng vi

36

khuẩn khử đạm và lân (dòng N9b, 6Rc và LV1) để xử lý nƣớc-bùn thải từ đáy ao cá tra, kết quả cho thấy sử dụng chế phẩm sinh học cho thể tích 200 m3 nƣớc-bùn đáy

ao, hàm lƣợng TSS giảm từ 3,018 mg/l (ban đầu) xuống 59 mg/l và hàm lƣợng

3-< 0,74 mg/l trong nƣớc ao sau 48 giờ xử lý.

COD giảm từ 336 mg/l xuống 43 mg/l và giảm hàm lƣợng amoni < 5,91 mg/l, hàm

lƣợng PO4

Nghiên cứu khác của nhóm tác giả Nguyễn Hoàng Mỹ và cs (2011) đã tiến

hành tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng xử lý tinh bột, protein và ứng

dụng trong xử lý nƣớc thải chế biến lƣơng thực, thủy sản. Kết quả đã tuyển chọn

đƣợc 6 chủng Bacillus có hoạt tính cao. Khả năng xử lý nƣớc thải sau 72 giờ của tổ

hợp 6 chủng Bacillus cho kết quả hàm lƣợng COD giảm 79,2%, BOD giảm 67%,

coliform tổng số giảm 92,5%.

Tác giả Nguyễn Văn Cách (2010) đã ứng dụng chế phẩm Bioproduct BK-1

với bể xử lý sinh học tích hợp 5 chức năng để xử lý nƣớc thải sinh hoạt đô thị tại

sông Kim Ngƣu, nƣớc thải sau xử lý đạt loại B theo QCVN 24:2009/BTNMT.

Thành phần vi sinh chính trong chế phẩm này là vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc

phân lập từ chính môi trƣờng nƣớc thải đó, có hoạt tính mạnh và khả năng thích ứng rất cao với môi trƣờng nên mật độ vi khuẩn cho vào bể xử lý chỉ khoảng 103

CFU/ml đã đem lại hiệu quả mong muốn.

Kiểm tra khả năng xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn trong điều kiện thí

nghiệm sử dụng 8 chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylaza và

glucoamylaza phân giải tinh bột. Kết quả cho thấy trong số các chủng sử dụng, ba

chủng Aspergillus oryzae có hiệu quả cao trong việc loại bỏ COD và TOD, phân

giải tinh bột và tăng sinh khối chủng. Chủng A.oryzae KCC F-0010 cho hiệu quả xử

lý 72% (TOC), 81% (COD), 94% (tinh bột) và sinh khối đạt 2,4 g/l sau 14 ngày xử

lý. Sự có mặt của xyanide có thể ức chế sự sinh trƣởng của nấm A.oryazae (Truong

Quy Tung và cs, 2004).

Trong khi đó tác giả Nguyễn Văn Năm (2004) nghiên cứu sử dụng các vi

sinh vật hữu hiệu để nâng cao hiệu quả xử lý nƣớc thải chế biến thực phẩm giàu tinh

bột bằng phƣơng pháp bùn hoạt tính. Kết quả cho thấy chế phẩm tạo ra từ bốn

37

chủng vi khuẩn Bacillus pumilus, Bacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides và

Pseudomonas marginata, đƣợc bổ sung vào hệ thống xử lý nƣớc thải của nhà máy

chế biến thực phẩm Kinh Đô, với thời gian lƣu nƣớc 4 giờ, nƣớc thải sau xử lý đạt

loại B theo yêu cầu về xả thải.

Một số sản phẩm thƣơng mại chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải trên thị

trƣờng Việt Nam, chế phẩm ngoại nhập theo Đào Thị Hồng Vân (2012) gồm có:

- Chế phẩm BIOWISH AQUA (nguồn gốc từ Thái Lan). Thành phần vi sinh

gồm Pediococcus acidilactici, Baccillus sp., Streptoccocus sp., Pichia, Dekkera.

Chế phẩm BIOWISH AQUA đƣợc sử dụng trong xử lý nƣớc thải và chất thải nuôi

tôm, có khả năng thúc đẩy quá trình phân hủy tự nhiên của các chất thải hữu cơ

nhanh hơn nhiều lần so với tốc độ phân hủy bình thƣờng.

- Chế phẩm RoeTech104 (nguồn gốc từ Mỹ), đƣợc ứng dụng để xử lý nƣớc

hồ bị ô nhiễm. Chế phẩm có khả năng làm giảm COD, BOD5 và Nitơ. Các vi sinh

vật có trong chế phẩm là B.subtilis, B.macerans, B.amyloliquefacien, B.pumilus.

- Chế phẩm MEGA SPO (Mỹ), chứa một số chủng vi khuẩn Bacillus và vi

khuẩn khử Nitơ denitrificans Thiobacillus, Paracoccus denitrificans có tác dụng

làm giảm chất thải hữu cơ và giảm hàm lƣợng amoniac trong nƣớc thải nuôi trồng

thủy sản.

- Chế phẩm Aqualact (Ấn Độ) chứa một số chủng vi khuẩn thuộc nhóm

Lactobacillus, Bacillus, Saccharomyces cervisiae và các enzyme amylaza, phytaza,

proteaza, xellulaza…sử dụng cho nƣớc nuôi cá.

- Ngoài ra còn có Envi-Bacillus, Aquabac, Pond Clear (Thái Lan), Aqua Bio,

Bz Bio (Mỹ)…xử lý nƣớc nuôi tôm, cá.

Chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải của Việt Nam hiện có:

- Chế phẩm JUMBO-A, JUMBO-G của Công ty môi trƣờng Gia Định.

Thành phần bao gồm vi khuẩn Lactic, Bacillus sp., xạ khuẩn, nấm mốc và các enzym amylaza, proteaza, lipaza... Mật độ vi sinh vật tổng số trong chế phẩm >1010

CFU/g. Chế phẩm có tác dụng xử lý chất hữu cơ (COD, BOD, SS..), mùi hôi, cặn

38

bã hữu cơ...trong nƣớc thải sinh hoạt và công nghiệp, với lƣợng sử dụng là 1 kg cho 2-3 m3 nƣớc thải.

- Chế phẩm BIO-EM đƣợc sản xuất bởi công ty Vi sinh môi trƣờng. Chế phẩm gồm nhiều chủng vi sinh vật hiếu khí, với mật độ tổng ≥109 CFU/g, có tác

dụng xử lý hợp chất hữu cơ trong nƣớc thải sinh hoạt, thực phẩm, dệt nhuộm.

- Chế phẩm Bioproduct I (Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực

phẩm- Đại học Bách khoa Hà Nội) đƣợc sản xuất từ một nhóm vi khuẩn Bacillus

phân lập từ nƣớc hồ. Chế phẩm có tác dụng làm sạch nƣớc hồ bị ô nhiễm (Trần

Liên Hà, 2008).

- Chế phẩm Biomix 2 (Viện Công nghệ Môi trƣờng) đƣợc ứng dụng để xử lý

nƣớc thải chăn nuôi và ao hồ, về cảm quan giảm đƣợc mùi hôi thối. Khi sử dụng

chế phẩm Biomix 2 xử lý nƣớc thải chăn nuôi các chỉ tiêu ô nhiễm nhƣ COD, BOD,

vi sinh vật gây bệnh giảm đƣợc 5-6 lần so với khi không sử dụng chế phẩm.

- Chế phẩm Biological (tác giả Nguyễn Tỷ-Doanh nghiệp Phƣơng Toàn,

Quảng Bình), chế phẩm Biological bao gồm các vi sinh vật có lợi nhƣ Protaza,

Lipasa, Xenluloza, Amylaza... giúp phân giải các chất hữu cơ có chứa đạm, đƣờng,

xenlulo, khử hết mùi hôi của nƣớc thải. Chế phẩm đƣợc khuyến cáo ứng dụng trong

xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn, nhƣng thực tế chất lƣợng của chế phẩm chƣa

đƣợc một cơ quan chức năng hoặc cơ quan khoa học nào đánh giá chính xác.

Xử lý nƣớc thải bằng vi sinh vật là phƣơng pháp phát triển từ rất lâu (lần đầu

tiên đƣợc sử dụng ở Anh vào năm 1918), hiện nay phƣơng pháp này vẫn phát triển

và đƣợc ứng dụng ở nhiều nƣớc trên thế giới. Trong thực tế các chế phẩm vi sinh

vật có tác dụng làm giảm BOD5, COD, TSS trong nƣớc thải sinh hoạt, nƣớc thải

nuôi trồng thủy sản và ô nhiễm sông hồ đã đƣợc sản xuất và thƣơng mại hóa ở

nhiều quốc gia trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Riêng chế phẩm vi sinh vật ứng

dụng trong xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn thì còn rất hạn chế.

Hầu hết các nhà máy chế biến tinh bột sắn hiện nay đều sử dụng phƣơng

pháp kỵ khí để xử lý nƣớc thải nhằm thu khí sinh học phục vụ cho nhu cầu của nhà

máy. Thực tế đã cho thấy rằng hệ thống xử lý kỵ khí thực sự có hiệu quả đối với

39

những loại nƣớc thải chứa hàm lƣợng chất hữu cơ cao. Tuy nhiên, sau hệ thống xử

lý kị khí bao giờ cũng cần bƣớc xử lý triệt để tiếp theo (Huỳnh Ngọc Phƣơng Mai,

2006). Vì vậy nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để xử lý giảm thiểu nồng độ chất

hữu cơ và chất dinh dƣỡng đến mức thấp nhất, đạt tiêu chuẩn xả thải theo QCVN

của Bộ TNMT là hƣớng đi rất khả thi. Đặc điểm hết sức đa dạng về chủng loại cũng

nhƣ năng lực chuyển hóa cơ chất trong từng loài, cùng với năng lực thích ứng cao

với điều kiện sống và sự biến đổi của điều kiện môi trƣờng ngoài, đã cho phép về

nguyên tắc, mọi cơ chất trong tự nhiên đều có thể chuyển hóa đƣợc nhờ năng lực

trao đổi chất của các loài vi sinh vật tƣơng ứng (Lê Gia Hy, 1997; Lƣơng Đức

Phẩm, 2009; Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002). Trong quá trình xử lý nƣớc thải chế

biến tinh bột sắn, hệ vi sinh vật tƣơng ứng sẽ chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, hợp

chất chứa Nitơ, chứa Phospho…có trong nƣớc thải để sinh trƣởng và phát triển (làm

nguồn vật liệu cấu trúc và nguồn cung cấp năng lƣợng để xây dựng, tái tạo cấu trúc

tế bào và phục vụ nhu cầu sinh trƣởng), do vậy nƣớc thải đƣợc làm sạch. Giải pháp

xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn bằng chế phẩm vi sinh vật là phƣơng pháp dễ

sử dụng, kinh tế và thân thiện với môi trƣờng.

40

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Các mẫu thu thập và chủng vi sinh vật

- Mẫu nƣớc thải, bùn thải của cơ sở sản xuất tinh bột sắn ở Hà Nội (8 mẫu), Ninh

Bình (6 mẫu) và ĐăkLăk (6 mẫu).

- Các chủng vi sinh vật đƣợc phân lập từ nƣớc thải và bùn thải của cơ sở chế biến

tinh bột sắn.

2.1.2. Hóa chất tinh khiết

Crystal violet, iodine, safranin, malachite green 5% (Sigma, Mỹ), alpha

naphthol, sulphanilic acid, phenolphthalein, xanh metylen, α-naphtyamin (Merck,

Đức).

Tris, EDTA, chloroform, isoamylalcohol, Na-phosphat, CTAB, isopropanol

polyacylamide, ethidium brommid…(Invitrogien-Mỹ). Taq-polymerase, dNTP, kit tinh sạch (PureLinkTM-ADN Purification), các đoạn mồi khuyếch đại gien 16S

rADN (Invitrogien-Mỹ).

K2Cr2O7, Ag2SO4, KH2PO4, SnCl2.H2O, Na2HPO4, CaCl2, FeCl3, NH4Cl,

NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, CH3COONa.3H2O...(Trung Quốc).

Casein, trypton, gelatin, starch, cao thịt, cao nấm men, glucose, arabinose,

xylose, sucrose, mannitol, glyxerol… (merck, Đức), aga, cồn 960 (Việt Nam).

2.1.3. Dung dịch và môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trƣờng: Tripticase soya agar (TSA), casitone glycerol yeast-extract agar

(CGYA), nitrite-calcium-carbonate, ammonium-calcium-carbonate, nutrient broth

(NB), nutrient agar (NA), Winogradsky, Gause… (phụ lục 1).

- Dung dịch: Lugol, fucshin, tím gentian, muối sinh lý, thuốc thử Griess-llosway,

thuốc thử Neisser...(phụ lục 1)

2.1.4. Thiết bị, dung cụ

Kính hiển vi điện tử S-4800 (Fe-SEM, Hitachi), kính hiển vi quang học

Olympius (CHD, Nhật Bản), buồng cấy BH-100 (Telstar, Tây Ban Nha), buồng

sinh trƣởng WTC (Binder, Đức), tủ sấy (Menmet, Đức), máy lắc KS-250 (Kika,

41

Đức), tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật Bản), nồi hấp khử trùng CL-32 (ALP, Nhật Bản),

máy đo pH (Metler, Thụy Sỹ), máy ly tâm (GUQ-Trung Quốc), máy so màu quang

phổ Spectrophotometer 722 visible (Trung Quốc), máy đo nồng độ oxy hoà tan

(Hanna); buồng ủ, bình kendan, máy chƣng cất đạm, sensor, bơm chân không (Mỹ),

máy Gien Amp PCR System 9700 (ABI, Mỹ), máy Sequencer ABM Prism 3100-

Avant (ABI, Mỹ), máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy ly tâm Eppendorf, bộ điện di ADN (Bio-Rad, Mỹ), bộ kit tinh sạch AND từ gel agaroza, Bộ điện di DcodeTM

System (BioRad) (Mỹ), máy sục khí, thiết bị trộn-sục khí tầng sôi (Việt Nam)…

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Hiện trạng nƣớc thải nhà máy chế biến tinh bột sắn tỉnh Ninh Bình

- Phân lập tuyển chọn vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

- Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

- Xây dựng qui trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải CBTBS

- Nghiên cứu hiệu quả xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn của chế phẩm.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu, xử lý mẫu

Mẫu đƣợc đựng trong lọ thủy tinh khử trùng, có ghi địa điểm, thời gian lấy

mẫu. Mẫu đƣợc bảo quản trong thùng lạnh và đƣợc phân tích trong vòng 3-4 giờ sau khi lấy mẫu. Với mẫu không kịp phân tích ngay thì đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 0-40C

và phải phân tích trong thời gian 24-48 giờ. Phƣơng pháp thu thập, vận chuyển, bảo

quản mẫu và xử lý mẫu theo TCVN 4556-88.

2.3.2. Phƣơng pháp xác định đặc điểm (tính chất) nƣớc thải CBTBS

2.3.2.1. Xác định BOD5 (TCVN 6001, 1995)

Kiểm tra pH, nếu pH 6-8 thì tiến hành xác định ngay, còn nếu ngoài khoảng

pH này thì phải tiến hành trung hoà về giới hạn này.

Lấy 250 ml mẫu cho vào các chai nâu (để tránh ánh sáng) và tiến hành khuấy

từ trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy mẫu ra, sau đó cho thêm một ít NaOH, đậy chai và điều chỉnh sensor. Sau đó cho mẫu vào thiết bị ổn nhiệt để ổn định nhiệt độ 200C

trong 5 ngày. Sau 5 ngày, chỉ số hiện trên sensor là chỉ số BOD5 của mẫu nƣớc thải.

42

2.3.2.2. Xác định COD (TCVN 6491, 1999)

Lấy 3 ml mẫu nƣớc thải cần đo + 1,5ml K2Cr2O7 2,5N + 4,5 ml hỗn hợp

H2SO4–Ag2SO4 cho vào ống đo COD, đậy kín và trộn đều mẫu. Công phá mẫu ở 1500C, đun lƣu kín trong 2 giờ trên bếp.

Sau 2 giờ, để nguội và đổ mẫu vào bình tam giác (dùng nƣớc cất tráng ống

đo), thêm nƣớc cất vào bình tam giác rồi nhỏ 3 giọt chỉ thị feroin.

Đổ muối Mo (FAS) vào buret và chuẩn độ hỗn hợp trên cho đến khi hỗn hợp

chuyển từ xanh lục sang màu đỏ gạch, ghi lại B ml muối Mo đã dùng chuẩn độ.

Kết hợp làm mẫu trắng tƣơng tự nhƣ trên, hết A ml muối Mo

COD = (mg/l)

A: Thể tích muối Mo khi chuẩn mẫu trắng (ml)

B: Thể tích muối Mo khi chuẩn mẫu thử (ml)

M: Nồng độ của muối Mo dùng để chuẩn độ

8000: Hệ số chuyển đổi

Vm: Thể tích mẫu đem phân tích (ml)

--N) (TCVN 6178, 1996)

--N) trong nƣớc bằng phƣơng pháp đo màu sử

2.3.2.3. Xác định hàm lƣợng nitrit (NO2

Xác định hàm lƣợng nitrit (NO2

dụng thuốc thử Griess. Trong môi trƣờng acid, ion nitrit phản ứng với acid

sunfanilic và α-naphtylamin tạo thành hợp chất có màu hồng. Cƣờng độ màu tỷ lệ

với hàm lƣợng nitrit trong nƣớc. Đem đo quang ở bƣớc sóng 520 nm, từ giá trị mật

- không gây ảnh hƣởng gì cho việc xác định.

độ quang thu đƣợc dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta rút ra đƣợc hàm lƣợng

nitrit tƣơng ứng. Ion NO3

Lấy 5 ml mẫu nƣớc cho vào ống nghiệm khô, thêm 1 ml acid sunfanilic và 1

ml α-naphtyamin. Lắc đều, để yên 10 phút rồi đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng

520 nm (máy đo quang Spectro 2000 Spectrophotometer). 2.3.2.4. Xác định hàm lƣợng nitrat (NO3--N) (TCVN 6180, 1996)

--N) trong nƣớc bằng phƣơng pháp đo màu sử -) có trong nƣớc tác dụng với

Xác định hàm lƣợng nitrat (NO3

dụng thuốc thử acid phenol disulfonic. Ion nitrat (NO3

43

acid phenol disulfonic tạo thành phức chất không màu nitrophenol disulfonic. Phức

-

chất này khi phản ứng với ammoniac sẽ tạo phức chất có màu vàng. Cƣờng độ màu

tỷ lệ với hàm lƣợng nitrat có trong dung dịch, màu vàng càng đậm thì nồng độ NO3

càng cao. Có thể đo độ hấp thụ quang trên máy quang phổ (Spectro 2000

Spectrophotometer) ở 410 nm.

Lấy 5ml mẫu nƣớc cần phân tích cho vào chén sứ đem đun cách thủy cho đến

khô, để nguội. Hòa tan kết tủa trong chén bằng 0,5 ml acid phenol disulfonic, khuấy

đều cho kết tủa tan. Chuyển dung dịch trong chén sứ sang một ống nghiệm thứ hai,

sau đó rửa sạch chén sứ bằng 5 ml nƣớc cất, nƣớc rửa này cũng cho vào ống

nghiệm. Tiếp tục cho vào ống nghiệm 5 ml NH3 đặc, lắc đều. Sau đó, để yên 10

phút, đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 410 nm.

2.3.2.5. Phân tích Phospho tổng số (TCVN 6202, 2008)

Chuyển toàn bộ các dạng Phospho trong mẫu về dạng octophosphat. Phản

ứng giữa ion octophosphat và dung dịch acid molipdat và ion antimony sẽ tạo ra

phức chất antimony Phosphomolipdat. Khử phức chất bằng acid ascorbic tạo thành

phức chất molipden màu xanh đậm. Đo độ hấp thụ có thể xác định đƣợc nồng độ

octophosphat.

Mẫu thử: Lấy 50 ml mẫu đã đƣợc đồng nhất mẫu vào bình tam giác chịu nhiệt dung tích 100 ml, thêm 1ml HNO3 đặc (65%, d =1,4 g/cm3) và 1,5 ml H2SO4 đặc (98%, d=1,84 g/cm3). Đun mẫu đến khi cạn và có khói trắng bay ra. Để nguội,

cho vào bình 1-2giọt phenolphthalein, dùng NaOH 6N đƣa pH của mẫu trong

khoảng pH 7-10, lọc mẫu qua màng lọc kích thƣớc 0,45 µm và định mức lên 50 ml.

Mẫu trắng (dùng nƣớc cất) song song với phân tích mẫu.

- Hiệu chuẩn:

Dung dịch hiệu chuẩn: Lấy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10 ml dung dịch chuẩn

octophosphat (dung dịch Phosphat làm việc) cho vào dãy bình định mức 50 ml. Pha

loãng bằng nƣớc cất tới 40 ml. Thêm vào mỗi bình 8ml dung dịch tác nhân khử (E).

Thêm nƣớc tới vạch và lắc kỹ. Đo độ hấp thụ của mỗi dung dịch sau 10 phút ở bƣớc

sóng 880 nm.

44

Dựng đƣờng chuẩn: Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị hấp thụ theo hàm

lƣợng Phospho (mg/l) của dãy dung dịch hiệu chuẩn.

- Xác định mẫu:

Dùng pipet lấy lƣợng mẫu thử đã định, cho vào bình định mức 50 ml và pha

loãng nƣớc tới 40 ml nếu cần. Thêm 8 ml dung dịch tác nhân khử (E), thêm nƣớc

tới vạch. Đo phổ hấp thụ của dung dịch sau 10 phút ở bƣớc sóng 880 nm.

3- đƣợc tính dựa trên độ hấp thụ của mẫu nƣớc và đồ thị

* Biểu thị kết quả

Hàm lƣợng P-PO4

chuẩn (hàm lƣợng-độ hấp thụ) theo công thức: C = M/V (mg/l)

3- có trong mẫu phân tích tính theo hàm số của đồ thị chuẩn, µg.

Trong đó:

M: Lƣợng P-PO4

V: Thể tích mẫu lấy đi phân tích, ml.

2.3.2.6. Xác định Nitơ tổng (TCVN 5987, 1995)

Nitơ tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl là hàm lƣợng Nitơ hữu cơ và Nitơ

amoniac trong mẫu đƣợc xác định sau khi vô cơ hoá.

Vô cơ hoá mẫu: chuyển các hợp chất Nitơ trong mẫu thử thành amonium

sunfat bằng cách vô cơ hoá với acid sunfuric có chứa lƣợng lớn kali sunfat để tăng

điểm sôi của hỗn hợp và có selen làm xúc tác. Giải phóng amoniac từ amonium

sunfat bằng cách thêm kiềm và chƣng cất vào dung dịch axit boric/chỉ thị. Xác định

amonium trong phần cất bằng cách chuẩn độ với acid chuẩn. Cũng có thể xác định

ion amonium bằng đo quang ở 655 nm.

Mẫu thí nghiệm cần lấy để trong bình polyetylen hoặc bình thuỷ tinh và cần phân tích càng sớm càng tốt. Nếu lƣu giữ cần để ở nhiệt độ 2-50C và acid hoá mẫu

đến pH < 2 , tránh để mẫu đã acid hoá hấp thụ amoniac từ không khí.

Lấy phần mẫu thử cho vào một bình Kendan, thêm 10 ml acid sunfuric và

5,0 0,5g hỗn hợp xúc tác. Thêm vài hạt đá bọt và đun mạnh dung dịch trong bình

cho sôi nhanh. Phải tiến hành giai đoạn này trong tủ hút thích hợp. Sau khi nƣớc

bay hơi hết, khói trắng bắt đầu bốc lên. Sau khi hết khói trắng, dung dịch trong bình

trở nên trong suốt, không mầu hoặc vàng nhạt thì tiếp tục đun thêm 60 phút. Để

45

bình nguội đến nhiệt độ phòng. Trong khi đó lấy 50 5ml dung dịch acid boric/chỉ

thị vào bình hứng của máy chƣng cất. Cần lƣu ý để sao cho đầu mút của ống dẫn ra

từ sinh hàn phải nhúng ngập vào dung dịch.

Thêm 250 5ml nƣớc cất không chứa N vào bình vô cơ hoá cùng vài hạt đá

bọt. Sau đó thêm 50 ml NaOH (500 g/l) và lắp ngay bình vào máy chƣng cất.

Đun nóng bình cất sao cho tốc độ chảy vào bình hứng khoảng 10 ml/phút.

Dừng cất khi đã thu đƣợc khoảng 200 ml ở bình hứng. Chuẩn độ phần hứng đƣợc

đến mầu xanh tím bằng acid clohidric 0,02 mol/l và ghi thể tích acid tiêu thụ.

Nồng độ Nitơ Kendan, CN, tính bằng mg/l, đƣợc biểu diễn bằng công thức:

(mg/l)

Trong đó:

Vo: là thể tích của phần mẫu thử, ml

V1: là thể tích của acid clohidric tiêu chuẩn dùng để chuẩn độ mẫu, ml

V2: là thể tích của acid clohidric tiêu chuẩn dùng để chuẩn độ mẫu trắng, ml

C: là nồng độ của acid clohidric tiêu chuẩn dùng để chuẩn độ, mol/l

14,01: là khối lƣợng nguyên tử của Nitơ

2.3.2.7. Xác định hàm lƣợng tổng chất rắn lơ lửng (TSS) (TCVN 6625, 2000)

Lấy 100 ml mẫu nƣớc thải lọc qua màng lọc thủy tinh đặt trên phễu lọc và

kết nối với máy bơm chân không.

Đƣa màng lọc đã có cặn sấy ở 1050C trong 2 giờ

Cân màng lọc ngay sau khi để nguội.

- -N) (TCVN 6179-1:1996)

2.3.2.8. Xác định hàm lƣợng amoni (NH4

Sử dụng phƣơng pháp đo màu ở bƣớc sóng 650 nm của hợp chất màu xanh

đƣợc tạo bởi phản ứng của amoni với salixylat và ion hypoclorit có sự tham gia của

natri nitrosopentaxyano sắt(III)taxyanosắt(III)(natri nitroprusiat). Các ion hypoclorit

đƣợc tạo trong cốc thuỷ phân kiềm của N, N/dicloro-1,3,5-triazin 2,4,6 (1H,3H,5H)

trion, muối natri (natri diclorosoxyanurat).

46

Lấy 40ml mẫu thử cho vào bình định mức 50 ml, thêm 4ml thuốc thử (natri

salixylat (C7H6O3Na) và 130g trinatri xytrat) lắc kỹ, sau đó thêm 4ml dung dịch

natri dicloroxyanuarat (32 g natri hydroxit trong 500 ml nƣớc không có amoni, thêm

2g natri diclorosoxyanurat 2 phân tử nƣớc (C2N3O3Cl2Na.2H2O), lắc kỹ. Sau 60

phút, đo độ hấp thụ của dung dịch trong cuvet có chiều dài quang học thích hợp so

sánh với nƣớc trong cuvet chuẩn.

Mẫu trắng sử dụng 40ml nƣớc không chứa amoni thay cho mẫu thử.

Vẽ đồ thị chuẩn về độ hấp thụ tƣơng ứng với khối lƣợng Nitơ dạng amoni, mN

cho mỗi chiều dàì quang của cuvet.

Hàm lƣợng Nitơ amoni pN, (mg/lít) đƣợc tính bằng công thức:

Trong đó: mN: là khối lƣợng của Nitơ dạng amoni tính bằng μg đƣợc xác định từ

mẫu thử và độ thị chuẩn với cuvet có chiều dài quang thích hợp.

V: là thể tích mẫu thử, tính bằng ml.

2.3.2.9. Xác định hàm lƣợng xyanua (CN-) (TCVN 6181:1996)

Lấy 100ml mẫu đun nóng với 10ml HCl (1.12 g/ml), 10ml CuSO4, 2ml SnCl2,

30ml nƣớc cất trong 1 giờ. Khí đƣợc thu vào bình chứa 100ml NaOH (1 mol/l).

Chuyển mẫu chứa trong bình hấp thu sang bình định mức 25ml, pha loãng với

nƣớc tới vạch và lắc đều. Mẫu đƣợc chuẩn độ trong tối với dung dịch AgNO3 (0,001

mol/l). Nồng độ xyanua tổng tính bằng miligam trên lít, theo công thức:

Trong đó

V0 là thể tích toàn phần của AgNO3 cho hai lần chuẩn độ thử mẫu trắng, ml;

V1 là thể tích của AgNO3 cần cho lần chuẩn độ thứ nhất, ml;

V2 là thể tích của AgNO3 cần cho lần chuẩn độ thứ hai, ml;

V3 là thể tích của mẫu thử, ml; f1=0,052, là khối lƣợng của CN- tƣơng ứng với 1 ml AgNO3 (0,001 mol/ml), mg;

f2=0,8 vì chỉ 80% lƣợng chứa trong bình hấp thu đã lấy để chuẩn độ;

47

f3=0,97 vì thể tích của mẫu thử tăng do thêm chất bảo quản ngay sau khi lấy mẫu.

2.3.2.10. Xác định hàm lƣợng lƣợng tinh bột (TCVN 4594:1998)

Hàm lƣợng tinh bột trong mẫu là hiệu số giữa hàm lƣợng gluxit tổng số với

hàm lƣợng đƣờng tổng số xác định theo phƣơng pháp Bectrang và nhân hệ số 0,9.

Đƣợc tính bằng % theo công thức: X = (X1 - X2) x 0,9

Trong đó:

X1 là hàm lƣợng gluxit tổng số (%) đƣợc chiết từ mẫu bằng nƣớc nóng, dùng axit

clohydric thủy phân thành đƣờng glucoza, lƣợng glucoza đƣợc xác định qua các

phản ứng với dung dịch pheling A, B.

X2 là hàm lƣợng đƣờng tổng số (%) đƣợc chiết từ mẫu thành đƣờng glucoza, lƣợng

glucoza đƣợc xác định qua các phản ứng với dung dịch pheling, sắt (III) sunfat và

kali pemanganat. Từ số ml kalipemanganat 0,1N đã dùng tra bảng Bectrang đƣợc số

mg glucoza tƣơng ứng.

2.3.3. Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn vi sinh vật

2.3.3.1. Phân lập tuyển chọn vi sinh vật chuyển hóa cacbon (tinh bột, xenlulo)

Mẫu đƣợc pha loãng bằng dung dịch muối sinh lý khử trùng (phụ lục 1) đến nồng độ 10-3 và 10-4. Lấy 100 μl dịch pha loãng, trang đều lên các đĩa petri có chứa môi trƣờng Gause (phụ lục 1). Sau đó, mẫu đƣợc để ở 300C từ 3-5 ngày. Khi khuẩn

lạc vi sinh vật xuất hiện, cho vào mỗi đĩa 5ml dung dịch lugol, để 15 phút rồi gạn bỏ

hết dung dịch lugol. Lựa chọn khuẩn lạc tạo vòng phân giải (vòng trong suốt) bao

quanh khuẩn lạc (Nguyễn Lân Dũng và cs (1976), TCVN 6168:2002).

* Xác định hoạt tính phân giải tinh bột và phân giải xenlulo

Xác định vòng phân giải tinh bột và xenlulo

- Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán enzym trên môi trƣờng thạch đĩa (Lausing M.

và cs, 2002).

-Tiến hành: Vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng đặc hiệu ở điều kiện

thích hợp, chiết dịch enzym thô. Sử dụng môi trƣờng thạch 0,1% tinh bột (để xác

định hoạt tính amylaza) hoặc 0,1% CMC, bột giấy (để xác định hoạt tính xenluloza)

đổ ra đĩa petri để khô và đục lỗ bằng dụng cụ khoan lỗ thạch, dùng 50-100 l dịch

48

enzym thô cho mỗi giếng. Enzym đƣợc khuếch tán ở 40C trong 6 giờ. Sau đó ủ ở nhiệt độ 35-370C trong 6 giờ.

+ Xác định vòng phân giải tinh bột, xenlulo bằng cách nhuộm dung dịch lugol

* Phần tinh bột bị enzym amylaza phân giải tạo vòng trong suốt không bắt màu với

lugol. Phần không bị phân giải có màu tím do tinh bột tạo màu với lugol.

* Phần CMC, bột giấy bị enzym xenluloza phân giải tạo vòng trong suốt không bắt

màu với dung dịch lugol. Phần không bị phân giải có màu đỏ do CMC, bột giấy tạo

màu với lugol. Xác định kích thƣớc vòng phân giải= (D-d, mm);

Trong đó D: Đƣờng kính vòng phân giải;

d: Đƣờng kính lỗ đục.

Xác định hoạt độ enzym amylaza và xenluloza

Hoạt độ enzym amylaza xác định dựa trên sự thủy phân tinh bột bởi các

enzyme của hệ amylaza thành các đƣờng khử có phân tử lƣợng khác nhau. Đo

cƣờng độ màu tạo thành giữa đƣờng khử và DNS ở bƣớc sóng 540 nm (phụ lục 2).

Hoạt độ enzym phân giải xenlulo đƣợc xác định thông qua hoạt độ CMCaza

do vi sinh vật sinh tổng hợp (phụ lục 2)

* Xác định mật độ tế bào vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng, 1983) Phương pháp đếm

số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch

+ Pha loãng mẫu rồi cấy trang trên đĩa petri chứa môi trƣờng thích hợp. + Ủ mẫu ở nhiệt độ 300C, trong 48-72 giờ.

+ Đếm số lƣợng khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch và tính toán số lƣợng vi

sinh vật có trong 1ml (1g) mẫu theo công thức:

N =

Trong đó: N là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (CFU/g/ml);

là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên tất cả các đĩa petri đƣợc giữ lại;

n1 là số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

n2 là số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng tƣơng ứng với độ pha loãng thứ nhất.

49

2.3.3.2. Phân lập tuyển chọn vi sinh vật chuyển hóa hợp chất chứa Nitơ

- Làm giàu các mẫu phân lập trong môi trƣờng Winogradsky từ 30-45 ngày

(Jane Meiklejohn, 1949). Lấy 1ml mẫu làm giàu cho vào ống facol chứa 20ml môi

trƣờng ammonium-calcium-carbonate và nitrite calcium-carbonate (phụ lục 1) để

phân lập vi khuẩn chuyển hóa Nitơ theo phƣơng pháp của Ehrlich (1975). Nuôi cấy mẫu trong khoảng 3 tuần ở 280C.

- Sử dụng thuốc thử Griess (phụ lục 1) để thử, quan sát chuyển màu và xác

định sự có mặt của vi khuẩn chuyển hóa Nitơ trong mẫu phân lập.

- Lấy 1ml dung dịch huyền phù các mẫu phản ứng với thuốc thử griess, tiếp

tục đƣợc nhân nuôi trong ống chứa 20 ml môi trƣờng ammonium-calcium- carbonate và môi trƣờng nitrite calcium-carbonate, ở 280C có che tối và lắc 150 v/p.

Cứ sau 5 ngày thì bổ sung dung dịch 0,53 mg (NH4)2SO4 và 0,005 ml NaOH 1M đã - và tiệt trùng vào môi trƣờng ammonium-calcium-carbonate; dung dịch 20 µM NO2

0,02 ml KOH 20% đã tiệt trùng vào môi trƣờng nitrite calcium-carbonate. Sau 15

ngày thì kiểm tra phản ứng với thuốc thử griess và kiểm tra khả năng nhiễm vi

khuẩn dị dƣỡng trong các ống đó bằng môi trƣờng TSA (bổ sung 1,5 % NaCl). Sau

4 ngày nếu không có vi khuẩn phát triển trên môi trƣờng TSA, chứng tỏ thu đƣợc

giống thuần.

*Xác định khả năng chuyển hóa hợp chất chứa Nitơ.

+ Phương pháp định tính

-Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thuốc thử Griess với nitrit tạo thành phức chất có

màu hồng (Ehrlich G., 1975).

-Tiến hành: Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi trong các ống nghiệm chứa 10-15 ml

môi trƣờng lỏng Winogradsky. Sau thời gian nuôi cấy 7 ngày, sử dụng thuốc thử

Griess để thử, quan sát màu phản ứng.

- trong môi trƣờng nuôi cấy.

+ Phương pháp định lượng

- hoặc NO3

-Nguyên tắc: Dựa vào sự tạo thành NO2

-Tiến hành: Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi trong các ống nghiệm chứa 10-15 ml

môi trƣờng lỏng Winogradsky. Sau thời gian nuôi cấy 7 ngày, xác định hàm lƣợng

- trong môi trƣờng nuôi cấy theo phƣơng pháp ở phần 2.3.2.3 và

50

- hoặc NO3

NO2

2.3.2.4.

*Xác định mật độ tế bào vi sinh vật chuyển hóa Nitơ (Kh. Elbanna và cs, 2012;

Trần Linh Thước, 2006).Phương pháp MPN-Most Probable Number

Phƣơng pháp MPN là phƣơng pháp định lƣợng dựa trên kết quả định tính của

một loạt thí nghiệm đƣợc lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thƣờng,

việc định lƣợng này đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp,

tổng cộng 3x3=9 ống nghiệm. Mỗi độ pha loãng đƣợc nuôi cấy lặp lại 3 lần. Dựa

vào kết quả chứng minh sự tăng trƣởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng

ống nghiệm (các hiện tƣợng nhƣ sinh hơi, đổi màu, đục…), ghi nhận số lƣợng các

ống nghiệm dƣơng tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào

bảng Mac Crady (phụ lục 5) suy ra mật độ vi sinh vật đƣợc trình bày theo công

thức: Số MPN/ml (MPN/1g) = a x f/10

Trong đó: a trị số tra từ bảng Mac Crady

f là độ pha loãng thấp nhất đƣợc chọn (10n)

2.3.3.3. Phân lập tuyển chọn vi sinh vật chuyển hóa Phosphat hữu cơ và đồng

hóa Phospho trong nƣớc thải

10g mẫu bùn hoặc 90ml mẫu nƣớc thải + 10ml KH2PO4 0,1%, trộn đều trong một bình nón 250ml. Sau đó hỗn hợp đƣợc lắc 150v/p ở 250C trong 2 ngày. Lấy

30ml hỗn hợp này chuyển vào bình 250ml có chứa 75ml môi trƣờng nutrien broth

đã đƣợc khử trùng và tiếp tục lắc thêm 5 ngày. Pha loãng mẫu liên tiếp từ nồng độ 10-1 đến 10-9, hút 0,1ml mẫu ở từng nồng độ trang đều trên môi trƣờng Casitone Glycerol Yeast extract Agar (CGYA) (phụ lục 1) và nuôi cấy ở 250C trong 5 ngày.

Lựa chọn khuẩn lạc đơn và tiếp tục nuôi cấy trên môi trƣờng CGYA cho đến khi

thu đƣợc khuẩn lạc thuần khiết (Bosch và Cloete, 1993).

*Khả năng chuyển hóa Phosphat hữu cơ trong nước thải.

+ Xác định vòng phân giải Phosphat hữu cơ của vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng và

cs (1976), TCVN 6167:1996)

51

- Nguyên tắc: Sự chuyển hóa Phosphat hữu cơ của vi sinh vật đƣợc xác định bằng

cách đo vòng phân giải (vòng tròn trong suốt) bao quanh khuẩn lạc hoặc lỗ thạch

trên môi trƣờng thạch thƣờng chứa 2% CaCO3 và bổ sung 0,05% lexitin.

-Tiến hành: Các chủng phân lập đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng lỏng đặc hiệu trong

điều kiện thích hợp, chiết dịch enzym thô. Sử dụng môi trƣờng thạch thƣờng chứa

2% CaCO3 và bổ sung 0,05% lexitin (để xác định hoạt tính phytaza) đổ ra đĩa petri

để khô và đục lỗ bằng dụng cụ khoan lỗ thạch, dùng 50-100l dịch enzym thô cho mỗi giếng. Enzym đƣợc khuếch tán ở 40C trong 6 giờ. Sau đó ủ ở nhiệt độ 28-300C

trong 6 giờ. Xác định kích thƣớc vòng phân giải= (D-d, mm)

Trong đó D: Đƣờng kính vòng phân giải

d: Đƣờng kính lỗ đục

+ Xác định hoạt độ enzym phytaza:

Hoạt tính phân giải Phosphataza các chủng vi sinh vật lựa chọn đƣợc xác

định thông qua hoạt độ enzym phytaza (cơ chất chứa Phosphat hữu cơ) bằng dung

dịch màu amonium molypdate (phụ lục 2).

3-) trong nước thải.

*Khả năng đồng hóa Phospho (PO4

+ Xác định hạt volutin (poly-P) trong tế bào vi sinh vật (Szabó và cs, 2011)

- Nguyên tắc: Dựa vào khả năng bắt màu của hạt volutin (hạt poly-P) với thuốc thử

Neisser (phụ lục 1) tạo thành các hạt màu đen xanh trong tế bào vi sinh vật.

-Tiến hành: Nuôi cấy khuẩn lạc thuần trong 100 ml môi trƣờng nƣớc thải (phụ lục 1) trên máy lắc 150v/p trong 5 ngày ở 250C. Lấy mẫu, sử dùng thuốc thử Neisser để

nhuộn tế bào, sau đó quan sát dƣới kính hiển vi quang học.

+Xác định nồng độ Phospho trong tế bào vi sinh vật (Bosch và Cloete, 1993).

Khuẩn lạc thuần đƣợc nuôi cấy trong 10ml môi trƣờng NB ở 250C trong

24giờ. Lấy 4 ml dịch nuôi cấy cho vào bình nón chứa 96 ml môi trƣờng nƣớc thải (nồng độ P ban đầu đã đƣợc xác định). Bình đã đƣợc đậy kín và ủ kỵ khí 250C trong

2 giờ, sau đó để ở điều kiện hiếu khí trong 5 giờ bằng cách đặt trên máy lắc 150 v/p ở 250C, lƣu ý pH 7.5. Dịch nuôi cấy đƣợc lọc qua phin lọc kích thƣớc 0,22 μm để

loại bỏ tế bào, xác định nồng độ P bằng máy quang phổ với bƣớc sóng 660 nm.

52

P hấp thu trong tế bào (mg/l) = [P môi trƣờng ban đầu (mg/l) - P dịch nuôi

cấy vsv (mg/l)] / [mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy (tế bào/ml)x1000].

*Xác định mật độ tế bào (Nguyễn Lân Dũng, 1983) Phương pháp đếm số khuẩn

lạc phát triển trên môi trường thạch (phần 2.3.3.1)

2.3.3.4. Đánh giá khả năng chuyển hóa chất ô nhiễm trong nƣớc thải CBTBS

của vi sinh vật phân lập

Dịch nuôi cấy vi sinh vật phân lập đƣợc bổ sung vào bình tam giác chứa 100ml nƣớc thải CBTBS, sao cho mật độ tế bào đạt khoảng 105CFU/ml. Đối chứng

là nƣớc thải CBTBS không bổ sung dịch vi sinh vật. Thí nghiệm đƣợc tiến hành ở

điều kiện nhiệt độ phòng, trên máy lắc với tốc độ 150v/p. Sau thời gian nuôi cấy 3-5

ngày, xác định các chỉ số COD, BOD5, Nts, Pts trong nƣớc thải CBTBS ở công thức

thí nghiệm và đối chứng.

Hiệu quả xử lý (COD, BOD5, Nts, Pts) so với đối chứng = chỉ số (COD, BOD5,

Nts, Pts) trong công thức thí nghiệm giảm đi /chỉ số (COD, BOD5, Nts, Pts) trong

công thức đối chứng x 100 (%).

2.3.4. Định danh vi sinh vật tuyển chọn

2.3.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống.

Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá và khoá phân loại của

Bergey (Niall A. và cs, 2009); chƣơng trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) (E.B. Shirling

và cs, 1966) đối với xạ khuẩn; khóa phân loại Bergey (Stanley T. và cs, 1989; Holt

J.G. và cs, 2000; Holt J.G. và cs, 1994) đối với vi khuẩn.

* Xác định đặc điểm hình thái, sinh hoá: Đặc điểm khuẩn lạc, khả năng hình thành

bào tử, phản ứng catalaza, nhu cầu oxy, các đặc điểm sinh hoá đƣợc thực hiện theo

các phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học thông thƣờng. Hình ảnh tế bào đƣợc

quan sát trên kính hiển vi điện tử.

* Xác định khả năng đồng hoá các nguồn hydratcacbon: Nuôi cấy vi sinh vật

trong môi trƣờng cơ bản đặc hiệu từng chủng (dạng dịch thể) ở điều kiện thích hợp,

thay thế các nguồn hydratcacbon khác nhau. Dựa vào sự chuyển biến màu của dịch

nuôi cấy để đánh giá phản ứng dƣơng tính hay âm tính.

53

2.3.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Là phƣơng pháp phân loại dựa trên giải trình tự gien 16S rADN. Xác định

trình tự 16S rADN của các chủng vi sinh vật theo phƣơng pháp của Sakiyama và cs

năm 2009. Chi tiết các bƣớc đƣợc trình bày trong phụ lục 3.

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự

động (ABI PRISM®3100-Avant Gienetic Analyzer-Mỹ). Kết quả đọc trình tự đƣợc

xử lý trên phần mềm Clustal X. Các trình tự đƣợc so sánh với trình tự 16S rADN

của các loài đã đƣợc công bố từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GienBank. Xây dựng

cây phát sinh chủng loại, phân tích Bootstrap đƣợc thực hiện từ 1000 lần lặp lại

ngẫu nhiên. Tên loài vi sinh vật đƣợc xác định với xác suất tƣơng đồng cao nhất

2.3.5. Nhân sinh khối vi sinh vật bằng kỹ thuật lên men chìm

*Xác định nhiệt độ tối ưu

Các chủng vi sinh vật nghiên cứu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể,

pH thích hợp, điều kiện lắc 150v/p. Nhiệt độ nuôi cấy đƣợc điều chỉnh trong khoảng từ 20-550C. Sau thời gian nuôi cấy phù hợp với từng chủng, xác định mật độ tế bào

trong môi trƣờng nuôi cấy để xác định ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng phát

triển các chủng vi sinh vật.

*Xác định pH tối ưu

Môi trƣờng nuôi cấy có các độ pH khác nhau từ 5-9, khử trùng bằng nồi hấp

ở điều kiện 1210C trong thời gian 20 phút.

Nuôi cấy vi sinh vật ở 300C và lắc với tốc độ 150v/p. Sau thời gian nuôi cấy

thích hợp tiến hành kiểm tra mật độ vi sinh vật. Xác định pH thích hợp cho sinh

trƣởng phát triển của vi sinh vật.

*Thời gian nhân sinh khối

Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trƣờng dịch thể, pH, nhiệt độ thích hợp với

từng chủng, ở điều kiện lắc 150v/p. Sau khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau (1-7

ngày), tiến hành kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy.

* Ảnh hưởng của môi trường nhân sinh khối

54

Các chủng vi sinh vật đƣợc lên men ở môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau,

điều kiện lắc 150v/p, ở nhiệt độ, pH, thời gian phù hợp với từng chủng. Kiểm tra

mật độ tế bào có trong các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau và xác định môi trƣờng

lên men thích hợp nhất cho các chủng vi sinh vật.

*Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống

Các chủng vi sinh vật nghiên cứu đƣợc nuôi cấy cấp 1 trong bình tam giác

250 ml ở môi trƣờng dinh dƣỡng đặc hiệu, pH và nhiệt độ thích hợp cho từng

chủng. Sau 24-48 giờ nuôi cấy, vi sinh vật đƣợc cấy truyền sang nuôi sinh khối cấp

2 trong thiết bị lên men 5 lít trong môi trƣờng lựa chọn ở trên với các tỷ lệ tiếp

giống thay đổi trong khoảng từ 3-10%. Kết thúc quá trình nuôi cấy kiểm tra mật độ

tế bào vi sinh vật để lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp nhất.

* Ảnh hưởng của tốc độ cấp khí

Các chủng vi sinh vật nghiên cứu đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng, tỷ lệ tiếp

giống thích hợp lựa chọn ở trên, pH, nhiệt độ thích hợp với từng chủng trong thiết

bị lên men 5 lít có kiểm soát lƣợng không khí sục vào thay đổi từ 0,25-1,0 lít không

khí/lít môi trƣờng/phút. Kết thúc quá trình nuôi cấy kiểm tra mật độ tế bào vi sinh

vật để lựa chọn chế độ cấp không khí thích hợp nhất.

* Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy theo phương pháp bề mặt đáp ứng

Phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface methodology) sử dụng kỹ

thuật mô hình thống kê thực nghiệm, để phân tích hồi quy đa điểm bằng phần mềm

(Design Expert Version 9.0.6.2). Tập hợp dữ liệu định lƣợng nhận từ thiết kế các

yếu tố, nhằm giải quyết đồng thời sự tác động của các yếu tố bằng phƣơng trình đa

biến. Các thành phần môi trƣờng đã lựa chọn có ảnh hƣởng đến hoạt tính enzym

đƣợc tối ƣu hóa sử dụng thiết kế phức hợp tại tâm điểm. Theo thiết kế này, tổng số

các phƣơng án kết hợp xử lý là 2k+ 2k + n0. Trong đó k là số biến độc lập và n0 là

số lặp lại thí nghiệm ở tâm. Để tính toán thống kê, các biến Xi đƣợc mã hóa là xi

theo phép biến đổi sau: xi = Xi –Xo/δX

Trong đó xi là giá trị đƣợc mã hóa vô hƣớng của biến số Xi, Xo là giá trị của

Xi tại tâm điểm và δX là bƣớc thay đổi (bƣớc nhảy). Để tối ƣu thành phần môi

55

trƣờng, ngƣời ta sử dụng thiết kế có 2k yếu tố. Phƣơng trình tối ƣu các thành phần

môi trƣờng đƣợc đƣa ra dựa trên cơ sở của phƣơng trình bậc hai sau:

Y= β0 + ∑βixi + ∑βiixi2 + ∑βijxj

Trong đó Y là kết quả dự đoán, β0 là giới hạn bị chặn, βi là ảnh hƣởng tuyến

tính, βii là ảnh hƣởng bậc hai và βij là sự tƣơng tác qua lại. Phƣơng trình hồi quy tối

ƣu cho giá trị lớn nhất nhận đƣợc ở các điều kiện tối ƣu sử dụng DX8. + Xây dựng mô hình toán học Y= β0 + ∑βixi + ∑βiixi2 + ∑βijxj

+ Xác định các biến ảnh hƣởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ

các tài liệu công bố và xây dựng trên cơ sở khảo sát thực nghiệm.

+ Xây dựng các biến số và khoảng chạy

+ Lập ma trận thực nghiệm và thu kết quả

+ Kiểm tra mức độ phù hợp của mô hình đã xây dựng và sự có nghĩa của các

hệ số hồi qui.

+ Đánh giá sự sai lệch giữa mô hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher.

+ Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phƣơng pháp hàm mong đợi.

2.3.6. Nhân sinh khối vi sinh vật trên giá thể rắn

*Lựa chọn và xử lý chất mang

- Chất mang: sử dụng tinh bột sắn, cao lanh có kích thƣớc hạt ≤ 0,1mm, với các hạt

kích thƣớc lớn thì phải nghiền nhỏ, để kích thƣớc chất mang đồng đều và tăng diện

tích dính bám với vi sinh vật.

- Tinh bột sắn bổ sung 1% rỉ đƣờng, hỗn hợp đƣợc khử trùng ƣớt ở 0,8 at trong thời

gian 15 phút;

- Cao lanh bổ sung 1% CaC03 để pH ở trạng thái kiềm nhẹ (pH 7,8), sau đó sấy khô hỗn hợp ở 1300C trong 60 phút để khử trùng và giảm độ ẩm của chất mang.

-Thử nghiệm lựa chọn chất mang đƣợc tiến hành bằng cách phối trộn dịch lên men

của mỗi chủng với cao lanh hoặc tinh bột theo tỉ lệ 1:10 trong các thùng vô trùng,

rồi đem ủ trong buồng sinh trƣởng. Xác định mật độ tế bào sau thời gian 5 ngày lên

men xốp.

*Xác định tỉ lệ tiếp giống trong lên men xốp

56

Để xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp, dịch sinh khối các chủng vi sinh vật

phối trộn với chất mang theo các tỷ lệ khác nhau: 5/100; 10/100; 15/100 và 20/100.

Nuôi cấy vi sinh vật trên chất mang trong thùng vô trùng và ủ trong buồng

sinh trƣởng. Xác định mật độ tế bào sau thời gian 5 ngày nhân nuôi.

*Xác định thời gian nhân nuôi trong lên men xốp

Thí nghiệm phối trộn dịch sinh khối của từng chủng với chất mang theo tỉ lệ

1:10 trong các thùng vô trùng, rồi đem ủ trong buồng sinh trƣởng. Xác định mật độ

tế bào sau thời gian nhân nuôi 1-5 ngày.

2.3.7. Tạo chế phẩm và đánh giá chất lƣợng chế phẩm

Chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy riêng rẽ trên chất mang dạng bột, sau thời

gian nhân nuôi 2-4 ngày, phối trộn với nhau theo tỉ lệ 1:1:1. Xác định khả năng

sống sót của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm ở điều kiện riêng lẻ và hỗn hợp

bằng cách xác định mật độ tế bào sau thời gian 0, 7, 15, 30, 60 và 90 ngày bảo quản.

2.3.8. Phƣơng pháp xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn bằng chế phẩm vi

sinh vật (Xử lý gián đoạn)

Sử dụng thùng chứa có dung tích 80 lít, cho lƣợng nƣớc thải nhất định vào

thùng (2/3 thùng), đồng thời thả vòi sục khí vào để cấp khí. Bổ sung chế phẩm vi

sinh vật. Xác định BOD, COD, Nts, Pts ban đầu và các ngày thí nghiệm tiếp theo.

* Ảnh hƣởng của oxy hòa tan đến hiệu suất xử lý

Oxy đƣợc cung cấp bằng máy sục 1 vòi, với oxy hòa tan trong nƣớc khoảng

3,9±0,2 mg/l (tƣơng đƣơng với 0,5 lít không khí/lít nƣớc thải/phút) và máy sục 2

vòi, với oxy hòa tan trong nƣớc khoảng 6,0±0,3 mg/l (tƣơng đƣơng với 0,8 lít

không khí/lít nƣớc thải/phút). Các điều kiện xử lý khác không thay đổi, Tính toán

hiệu suất xử lý thông qua chỉ số COD với thời gian sục khí 0, 4, 6, 8 giờ.

* Ảnh hƣởng của thời gian lƣu nƣớc thải đến hiệu suất xử lý

Thí nghiệm thay đổi thời gian lƣu nƣớc từ 24, 36, 48, 60, 72 giờ; các điều

kiện khác không thay đổi. Tính toán hiệu suất xử lý thông qua chỉ số COD với thời

gian lƣu nƣớc khác nhau.

* Ảnh hƣởng của lƣợng chế phẩm bổ sung

57

Bổ sung chế phẩm vào nƣớc thải xử lý tƣơng ứng với hàm lƣợng 1, 10, 100 và 1000 g chế phẩm/m3 nƣớc thải để mật độ vi khuẩn đƣợc bổ sung là 102, 103, 104 và 105 CFU/ml. Các thông số khác không thay đổi. Xác định chỉ số COD ở công

thức bổ sung chế phẩm khác nhau sau thời gian xử lý 3 ngày.

2.3.9. Đánh giá hiệu quả xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn của chế phẩm vi

sinh vật

* Hiệu quả xử lý qui mô phòng thí nghiệm

Hệ thống gồm 3 thùng: thùng chứa nƣớc thải (80 lít), thùng xử lý (200 lít) và

thùng lắng (80 lít). Các thùng đƣợc nối với nhau bằng ống dẫn, có van điều chỉnh

lƣu lƣợng nƣớc chảy.

Đƣa nƣớc thải cần xử lý vào thùng xử lý (quy mô 200 lít có lắp thêm cánh

khuấy). Điều chỉnh van cấp nƣớc từ thùng chứa đi vào thùng xử lý và từ thùng xử lý

đi vào thùng lắng cho lƣu lƣợng bằng nhau, luôn đảm bảo thể tích nƣớc thải nhất

định trong thùng xử lý và thời gian lƣu của nƣớc thải trong thùng xử lý là 36 giờ.

Đƣa vòi cấp khí vào trong thùng xử lý, điều chỉnh lƣợng khí cấp cần thiết.

-Hệ thống không bổ sung chế phẩm (đối chứng): cung cấp oxy để nƣớc thải

đƣợc làm sạch nhờ hệ vi sinh vật có sẵn trong nƣớc thải.

-Hệ thống có bổ sung chế phẩm (thí nghiệm): cung cấp oxy để nƣớc thải

đƣợc làm sạch nhờ hệ vi sinh vật có sẵn trong nƣớc thải và vi sinh vật trong chế phẩm bổ sung vào. Bổ sung 100 g chế phẩm/m3 nƣớc thải tƣơng đƣơng mật độ 104

CFU/ml và cấp khí cƣỡng bức có khuấy trong thời gian 8 giờ trƣớc khi dẫn vào

thùng lắng. Lƣợng khí cấp tƣơng đƣơng nồng độ oxy hòa tan 6 mg/lít nƣớc thải.

Hai hệ thống hoạt động song song, chất lƣợng nƣớc thải đầu vào giống nhau,

cùng điều kiện hoạt động và không cho bùn hoạt tính khởi động ban đầu.

Phân tích các chỉ tiêu chất lƣợng nƣớc thải ở đầu ra của hệ thống xử lý có

chế phẩm và không có chế phẩm (phân tích, đánh giá các chỉ tiêu nƣớc thải theo

phƣơng pháp ở phần 2.3.2).

Hiệu quả xử lý (tính theo các chỉ tiêu BOD, COD, Nts, Pts) = hàm lƣợng các

chỉ tiêu (mg/l) giảm đi/tổng hàm lƣợng các chỉ tiêu ban đầu x 100 (%).

58

* Hiệu quả xử lý tại nhà máy chế biến tinh bột sắn tỉnh Ninh Bình

Thử nghiệm trên hệ thống xử lý nƣớc thải của nhà máy chế biến tinh bột sắn

Elmaco Ninh bình có công suất 100 tấn tinh bột/ngày với lƣợng nƣớc thải trung bình là 1400-1500 m3/ngày. Nƣớc thải đƣợc xử lý thông qua hệ thống biogas, hệ thống bể sục và bể lắng đọng. Thí nghiệm sử dụng 100 g chế phẩm cho 1 m3 nƣớc

thải ở công đoạn xử lý hiếu khí trong bể sục khí của nhà máy.

Nƣớc thải của nhà máy sau xử lý biogas sẽ đƣợc bơm vào hệ thống xử lý

hiếu khí. Chế phẩm vi sinh vật đƣợc bổ sung vào nƣớc thải tại bể sục khí của hệ

thống. Trƣớc tiên nƣớc thải đƣợc bơm vào bể sục khí, thời gian chờ 2-3 ngày để

hoạt hóa hệ vi sinh vật có trong nƣớc thải và khi lƣợng nƣớc trong bể xử lý đã

tƣơng đối ổn định, thì bắt đầu bơm dịch chế phẩm MIC-CAS 02 đã đƣợc hoạt hóa

và điều chỉnh nƣớc thải để phù hợp với lƣợng chế phẩm đã bơm vào bể. Thời gian

lƣu nƣớc trong bể xử lý là 36 giờ.

Phân tích các chỉ tiêu chất lƣợng nƣớc thải trƣớc và sau xử lý bằng chế phẩm

VSV (phân tích, đánh giá các chỉ tiêu nƣớc thải theo phƣơng pháp ở phần 2.3.2)

Hiệu quả xử lý (tính theo các chỉ tiêu BOD, COD, Nts, Pts) = hàm lƣợng các

chỉ tiêu (mg/l) giảm đi/tổng hàm lƣợng các chỉ tiêu ban đầu x 100 (%).

2.3.10. Kiểm tra sự sống sót của vi sinh vật bằng kỹ thuật DGGE

-Nguyên tắc: Kỹ thuật DGGE hay điện di gel gradient biến tính (denaturing

gradient gel electrophoresis) cho phép phân biệt các trình tự ADN khác nhau dựa

trên sự khác nhau về tỷ lệ (G+C)/(A+T) giữa các trình tự. Khi đƣợc điện di trên một

gel có građien chất biến tính, tùy theo thành phần nucleotit mà một phân tử ADN sẽ

dừng lại ở một vị trí nhất định đặc trƣng. Trong phân tử càng nhiều G và C thì phân

tử càng lâu bị biến tính và do đó càng lâu dừng lại trên gel điện di. Vì vậy, vị trí

khác nhau trên điện di đồ DGGE phản ánh sự khác nhau về trình tự của các đoạn

ADN đƣợc phân tích. Trong từng trƣờng hợp cụ thể, mỗi vị trí có thể đặc trƣng cho

một trình tự ADN và phản ánh sự có mặt của một loài hay cá thể trong quần xã

đƣợc phân tích.

-Tiến hành:

59

* Tách chiết ADN tổng số (Zhou J., Bruns M. A., Tiedje J. M., 1996)

- Lấy bùn hoặc mẫu nƣớc vào ống falcon 50 ml. Ly tâm 5000 v/p trong 5 phút, loại

nƣớc, lấy cặn.

- Lấy 0,25 g cặn cho vào ống effendorf 2 ml.

- Bổ sung 625 µl ADN đệm tách (100mM Tris-HCl pH 8, 100 mM EDTA pH 8,

100mM Na-phosphat pH 8, 1.5M NaCl, 1% CTAB). - Bổ sung 50 µl lysozym (14,2 mg/ml). Trộn đều, ủ ở 370C trong 30 phút. - Thêm 50 µl proteaza K (10 mg/ml) để phân hủy proteinase. Trộn đều và ủ ở 370C

trong 30 phút. - Bổ sung 75 µl SDS 20% và ủ ở 650C trong 2 giờ.

- Bổ sung 600 µl hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1). Trộn đều và ủ ở 650C trong 20 phút.

- Trộn đều và ly tâm ở 10.000 v/p trong 10 phút. Chuyển dịch nổi trên cùng sang

effendorf mới.

- Thêm Rnase A 100 µg/ml vào dịch để đạt nồng độ 10 µg/ml để loại bỏ ARN. Ủ ở 370C trong 30 phút.

- Bổ sung hỗn hợp chloroform:isoamylalcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1. Trộn đều, ly tâm

ở 10.000 v/p, 10 phút. Chuyển dịch nổi trên cùng sang effendorf mới.

- Kết tủa ADN bằng cách bổ sung 0,6 thể tích isopropanol và để ở nhiệt độ phòng

trong 1 giờ. Sau đó ly tâm ở 10.000 v/p trong 20 phút, loại bỏ dịch nổi. Rửa phần

tủa bằng ethano l70% lạnh. Làm khô và hòa tan trong 30 µl TE (10 mM Tris, 1 mM

EDTA).

* Điện di ADN trên gel agarose (Quyền Đình Thi, 2005)

Việc phân ly dựa trên độ lớn và hình thái các chất trong điện trƣờng, do tích

điện âm nên các phân tử ADN dịch chuyển về phía anode (cực dƣơng) với tốc độ tỷ

lệ nghịch với khối lƣợng phân tử. Vì vậy các đoạn ADN càng lớn thì dịch chuyển

càng chậm, sau một khoảng thời gian di chuyển, tại một thời điểm nào đó các phân

tử có kích thƣớc khác nhau sẽ tách xa vị trí bắt đầu di chuyển những khoảng khác

nhau. Do đó, chúng đƣợc tách nhau ra. Quy trình (cho gel agarose 1%) nhƣ sau:

60

- Cân 1g agarose cho vào 100 ml TAE 1X và đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn. Để nguội 45-500C rồi đổ vào khuôn gel đã đƣợc chuẩn bị sẵn. Sau 20-30 phút, khi

gel đã trùng hợp hoàn toàn thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho

đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 1-2 mm.

- Tra mẫu: ADN đƣợc trộn với đệm mẫu 6X và tra vào các giếng trên gel.

- Chạy điện di: chế độ chạy 100 V và 90 mA.

- Nhuộm gel: trong dung dịch EtBr 0,5 µg/ml trong 5-10 phút, rửa lại bằng nƣớc

trƣớc khi soi gel.

- Quan sát: gel soi dƣới ánh đèn tử ngoại, ADN sẽ đƣợc phát sáng nhờ liên kết với

EtBr.

* Khuếch đại một đoạn ADN bằng phản ứng PCR (Muyzer G. và cs, 1993)

(µl) Thành phần phản ứng

đủ tới 25 l H2O

2,5

Đệm 10x Mg2+ 2,5

dNTP 2,5

BSA 0,5

Mồi GM5F-GC 0,5

Mồi 907R 0,5

Mẫu ADN template 1 ng

Taq polymerase 0,2

Chu trình nhiệt: Taq polymerase đƣợc đƣa vào phản ứng ở nhiệt độ 800C (sau bƣớc biến tính đầu tiên). Nhiệt độ gắn mồi đƣợc đặt cao hơn 100C so với nhiệt độ lý thuyết (tức là 650C). Sau mỗi chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi giảm đi 0,50C cho tới khi đạt tới 550C, ở nhiệt độ này phản ứng tiến hành thêm 15 chu kỳ nữa. Thời gian kéo dài chuỗi của mồi là 3 phút. Chu kỳ cuối thực hiện ở 720C trong 5 phút. Kết thúc phản ứng hạ nhiệt độ xuống 40C.

61

* Điện di trên gel gradient biến tính DGGE (Muyzer G. và cs, 1993)

Sản phẩm PCR đƣợc tra vào gel polyacrylamide 6% trong dung dịch TAE

1X (20 mM Tris, 10mM acetate, 0,5 mM EDTA-pH 7,4). Gel polyacrylamide đƣợc

làm trong vùng gradient nồng độ các chất biến tính với dải biến tính urea formanide từ 20-70%. Quá trình điện di đƣợc thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (Biorad). Quá trình điện di DGGE đƣợc tiến hành ở 600C, 200V, trong 3,5 giờ. Sau

khi kết thúc điện di, gel DGGE đƣợc nhuộm trong ethidium bromide sau 20 phút và

chụp ảnh trên ánh sáng đèn tử ngoại.

2.3.11. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Excel, phân tích phƣơng sai

(ANOVA) để tính sự khác biệt có ý nghĩa, vẽ đồ thị.

62

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hiện trạng nƣớc thải nhà máy chế biến tinh bột sắn tỉnh Ninh Bình.

Khảo sát nhà máy chế biến tinh bột sắn thuộc công ty TNHH MTV Elmaco,

địa chỉ xã Sơn Lai, huyện Nho Quan, tỉnh Ninh Bình cho thấy nhà máy có dây

chuyền thiết bị sản xuất nhập khẩu từ Thái Lan, sử dụng 350-400 tấn sắn củ/ngày để

sản xuất 100 tấn tinh bột sắn/ngày. Nhà máy đi vào hoạt động từ năm 2004. Thời

gian sản xuất từ tháng 10 năm trƣớc đến tháng 3, 4 năm sau, trung bình 6-7 tháng/năm. Theo thiết kế, mỗi ngày nhà máy sử dụng 1200-1400 m3 nƣớc cho quá

trình chế biến tinh bột sắn, trên thực tế lƣợng nƣớc sử dụng khoảng 700-800 m3/ngày.

Hiện tại, nhà máy đang áp dụng hai công nghệ xử lý nƣớc thải, gồm hệ thống

xử lý kị khí (bể biogas) và hệ thống xử lý hiếu khí (bể sục khí). Sơ đồ hệ thống xử

lý nƣớc thải của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình đƣợc tóm tắt trong sơ đồ ở

Nƣớc thải

hình 3.1.

Hệ thống hiếu khí (5 bể sục khí)

Hệ thống kỵ khí (5 bể biogas)

Bể lắng

Xả thải

Bể lọc Bể lọc

Hình 3.1. Sơ đồ hệ thống xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn tại nhà máy của

công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình

Nƣớc thải chế biến tinh bột sắn gồm 90% từ dây chuyền sản xuất tinh bột

sắn, và 10% từ việc rửa sàng, thiết bị, nƣớc sinh hoạt của nhà máy. Toàn bộ nƣớc

thải đƣợc dẫn tới hệ thống xử lý kị khí gồm 5 bể biogas với qui mô 9.000-32.500

63

m3/bể. Tại các bể biogas diễn ra quá trình phân giải chất hữu cơ, tạo ra khí biogas

phục vụ cho nhu cầu của nhà máy. Quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ trong bể

biogas đƣợc thực hiện trong thời gian 3-4 tháng. Sau quá trình xử lý kị khí, nƣớc thải đƣợc bơm vào hệ thống xử lý hiếu khí là các bể sục khí dung tích 150 m3/bể

ứng với 5 bể biogas. Thời gian sục khí là 6 giờ, tiếp đó nƣớc thải đƣợc dẫn tới bể

lắng. Tại bể lắng với sự trợ giúp của chất trợ lắng là phèn hoặc C525, các hợp chất lơ

lửng của nƣớc thải đƣợc làm lắng và nƣớc trong đƣợc thiết kế chảy tràn sang bể lọc

cơ học với vật liệu lọc là cát. Cuối cùng, nƣớc thải đƣợc thu hồi dẫn tới hồ chứa

nƣớc và xả thải ra môi trƣờng.

Bảng 3.1. Hiện trạng nƣớc nƣớc thải chế biến tinh bột sắn trƣớc và sau xử lý kỵ khí

tại nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình, năm 2012

Kết quả phân tích Hiệu quả Chỉ tiêu phân QCVN 40:2011/ Biogas TT Đơn vị Trƣớc Sau tích BTNMT (cột B) (%) Biogas biogas

mg/l 7232 423,3 94,1 50 1 BOD5

2 COD mg/l 13610 651,3 95,2 150

3 TSS mg/l 1226 153,7 87,5 100

-

mg/l 135,8 98,0 27,9 40 4 Nts

mg/l 52,13 10

mg/l 64,85 -

5 N-NH4 6 N-NO2- 7 N-NO3- mg/l 0,99 -

8 mg/l 25,4 17,8 29,6 6 Pts

mg/l 0,32 0,047 0,5

9 Sufua 10 Xyanua(CN-) mg/l < 0,01 < 0,01 0,1

11 pH 5,6 7,6 5,5-9

90 - 12 Tinh bột mg/l 5600 98,4

Vi khuẩn 5000 13 Coliform Kph Kph /100ml

Ghi chú: (-) không quy định; Kph: không phát hiện ở nồng độ pha loãng 10-1

64

Kết quả khảo sát chất lƣợng nƣớc thải của từng công đoạn chế biến tinh bột

sắn tại nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình vào mùa cao điểm sản

xuất tinh bột sắn đƣợc tổng hợp trong bảng 3.1, cho thấy các chỉ tiêu BOD5, COD,

chất rắn lơ lửng, Nts, Pts trong nƣớc thải sau quá trình sản xuất tinh bột sắn (trƣớc

biogas) vƣợt rất nhiều lần so với qui chuẩn Việt Nam (QCVN) 40:2011/BTNMT.

Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của Trung tâm Sản xuất sạch

Việt Nam năm 2010.

Hiệu quả tích cực về môi trƣờng của hệ thống biogas là không thể phủ nhận,

tuy nhiên các bể biogas tại các cơ sở chế biến tinh bột sắn do không đáp ứng đầu

vào, cơ chế vận hành chƣa tốt, cũng nhƣ điều kiện thời tiết mà hệ thống biogas chƣa

phải là hệ thống xử lý sau cùng để đảm bảo đủ điều kiện xả thải an toàn vào môi

trƣờng (Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu, 2012).

Mặc dù nƣớc thải chế biến tinh bột sắn tại nhà máy của công ty TNHH MTV

Elmaco Ninh Bình đã đƣợc xử lý bằng hệ thống biogas, song chất lƣợng nƣớc thải

sau biogas vẫn không đảm bảo yêu cầu đối với nƣớc thải cột B theo QCVN

40:2011/BTNMT. Số liệu bảng 3.1 cho thấy các chỉ số BOD, COD, tổng chất rắn lơ

lửng (TSS), hàm lƣợng Nts, Pts giảm đi rất nhiều so với nƣớc thải chƣa xử lý (COD

giảm 94,1%, BOD5 giảm 95,2%, TSS giảm 87,5%, tinh bột giảm 98,4%, Nts giảm

27,9%, Pts giảm 29,6%) nhƣng vẫn vƣợt quá giới hạn cho phép.

Kết quả khảo sát cũng xác định hàm lƣợng xyanua trong nƣớc thải sản xuất

tinh bột sắn trƣớc và sau xử lý kỵ khí tại công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình

đều dƣới ngƣỡng cho phép, đảm bảo yêu cầu xả thải ra môi trƣờng.

Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ

Đình Tôn, Lại Thị Cúc, Nguyễn Văn Duy (2008) và kết quả nghiên cứu của Nguyễn

Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu (2012). Theo báo cáo của Vũ Đình Tôn, Lại Thị Cúc,

Nguyễn Văn Duy việc xử lý chất thải bằng hệ thống hầm biogas của một số trang

trại ở đồng bằng sông Hồng cho thấy nồng độ BOD5 trong nƣớc thải ở chuồng lợn

nái giảm 75-80,8%, nồng độ COD giảm 66,85%, Nts giảm 10,1-27,46%. Kết quả

nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu về đánh giá hiệu quả xử lý

65

nƣớc thải chăn nuôi lợn bằng hầm biogas qui mô hộ gia đình ở Thừa Thiên Huế cho

thấy COD giảm 84,7%, BOD5 giảm 76,3%, chất rắn lơ lửng giảm 86,1%, Nts giảm

11,8% và Pts giảm 7,0%. Có sự chênh lệch về kết quả phân tích là do khác nhau về

đối tƣợng và qui mô hệ thống xử lý biogas.

Để đáp ứng tiêu chuẩn xả thải ra môi trƣờng, công ty TNHH MTV Elmaco

Ninh Bình đã đầu tƣ xây dựng hệ thống xử lý nƣớc thải hiếu khí và hệ thống tách

lọc bùn lắng, song kết quả xử lý vẫn chƣa ổn định. Tại thời điểm khảo sát năm

2012, chất lƣợng nƣớc thải sau xử lý hiếu khí vẫn cón một số chỉ tiêu vƣợt giới hạn

cho phép (bảng 3.2). Với sự trợ giúp của phèn hoặc C525, các chất rắn lơ lửng đã

đƣợc kết tủa và tách lọc ra khỏi nƣớc thải, song chỉ tiêu TSS của nƣớc thải tại hồ

chứa nƣớc trƣớc khi xả thải ra môi trƣờng vẫn còn cao hơn giới hạn cho phép, đặc

biệt vào giai đoạn cao điểm của mùa sản xuất.

Bảng 3.2. Chất lƣợng nƣớc thải chế biến tinh bột sắn sau xử lý hiếu khí và tách lọc

chất rắn lơ lửng tại nhà máy công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình, năm 2012

QCVN 40:2011/BTNMT Nƣớc thải sau sục Chỉ tiêu Đơn vị khí, lắng và lọc Cột A Cột B

pH 7,3 6-9 5,5-9

BOD mg/l 320,8 30 50

COD mg/l 443,0 100 150

TSS mg/l 131,6 50 100

mg/l 83,3 20 40 Nts

mg/l 14,2 4 6 Pts

Thực tế xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn tại công ty TNHH MTV

Elmaco Ninh Bình nói riêng và các nhà máy chế biến tinh bột sắn nói chung ở Việt

Nam cho thấy cần thiết phải triển khai các giải pháp nâng cao hiệu quả xử lý, góp

phần xử lý triệt để nguồn gây ô nhiễm, đảm bảo nƣớc xả thải đáp ứng theo QCVN

40:2011/BTNMT.

Thành phần chất rắn lơ lửng chính của nƣớc thải chế biến tinh bột sắn là tinh

bột sắn còn sót lại và bùn, đất, cát, vỏ cáy tạo ra trong quá trình rửa nguyên liệu

66

cùng các sợi xenlulo hình thành trong quá trình nghiền, tách tinh bột sắn. Quá trình

xử lý kỵ khí không loại bỏ đƣợc hết các chất hữu cơ trong nƣớc thải, do vậy cần

thiết có giải pháp quá trình chuyển hóa sinh học các hợp chất hữu cơ này. Ngoài

chất rắn lơ lửng, nƣớc thải chế biến tinh bột sắn còn chứa các hợp chất chứa Nitơ,

Phospho với nồng độ cao, ngay cả khi xử lý kỵ khí, hàm lƣợng Nts, Pts vẫn vƣợt quá

giới hạn cho phép.

Kết quả khảo sát một số nhóm vi sinh vật có ích (chuyển hóa tinh bột,

xenlulo, chuyển hóa lexitin, casein…) trong hệ thống xử lý nƣớc thải nhà máy của

công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình (bảng 3.3) cho thấy mật độ vi sinh vật có ích chỉ đạt 102 CFU/ml.

Bảng 3.3. Một số nhóm vi sinh vật có ích trong nƣớc thải chế biến tinh bột sắn tại

nhà máy của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình, năm 2012

Mật độ vi sinh vật

Chuyển hóa tinh bột (CFU/ml)

Chuyển hóa CMC (CFU/ml)

Chuyển hóa lexitin (CFU/ml) Nƣớc thải sau biogas 2,5x102 3,6x102 1,7x102 Bùn bể hiếu khí 3,2x102 4,1x102 1,3x102

Chuyển hóa casein (CFU/ml)

Vi khuẩn nitrít hóa (MPN/ml) - 2,5x102 - 1,6x102

Vi khuẩn nitrat hóa (MNP/ml) - -

Ghi chú: (-) không phát hiện

Kết quả phân tích của luận án phù hợp với nhận định của Đào Thị Hồng Vân

(2012) và Nguyễn Văn Phƣớc (2007), trong môi trƣờng nƣớc thải vốn luôn tồn tại

hệ vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các chất ô nhiễm, làm giảm lƣợng chất hữu

cơ trong nƣớc thải. Kết quả này cho phép khai thác các chủng vi sinh vật phân lập

từ nguồn nƣớc thải để tăng cƣờng năng lực xử lý hoặc bổ sung các chủng vi sinh vật

có khả năng chuyển hóa các chất ô nhiễm vào môi trƣờng xử lý là khả thi.

3.2. Phân lập tuyển chọn vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

Trong nƣớc thải luôn tồn tại hệ vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất

hữu cơ gây ô nhiễm. Các vi sinh vật này là các thể dị dƣỡng hoại sinh và các thể tự

67

dƣỡng hóa năng. Chúng vừa phân hủy vừa oxy hóa cơ chất tới sản phẩm cuối cùng

3-

là CO2 và H2O cùng một số khí khác, hoặc khoáng hóa hợp chất Nitơ và Phospho,

+ và PO4

để sinh trƣởng. Sinh khối của vi

đồng thời đồng hóa các chất hữu cơ, NH4

sinh vật tăng, sản sinh ra các enzyme thủy phân và oxy hóa-khử làm tăng hoạt tính

của quần thể vi sinh vật (Lƣơng Đức Phẩm, 2009).

Bằng kỹ thuật vi sinh vật thƣờng qui trong phòng thí nghiệm (phần 2.3.3), đề

tài đã phân lập và tuyển chọn đƣợc các vi sinh vật từ các mẫu nƣớc thải và bùn thải

thu thập của cơ sở chế biến tinh bột sắn ở Hà Nội, ĐăkLăk và Ninh Bình, ứng dụng

trong xử lý nƣớc thải tinh bột sắn bao gồm:

3.2.1. Vi sinh vật chuyển hóa hợp chất cacbon (tinh bột, xenlulo)

Trong quá trình chế biến tinh bột sắn, các hợp chất cacbon bị sót lại một

lƣợng chất hữu cơ trong nƣớc thải. Nồng độ chất hòa tan (cacbonhydrat, gluco và

đƣờng tổng số) sẽ đƣợc chuyển thành các chất có lợi do quá trình hoạt động của vi

sinh vật (Rety Setyawaty và cs, 2011).

Từ 20 mẫu thu thập (gồm 10 mẫu nƣớc và 10 mẫu bùn thải) của cơ sở sản

xuất tinh bột sắn, mƣời một dòng vi sinh vật đƣợc xác định định tính có khả năng

chuyển hóa hợp chất cacbon, gồm 4 dòng vi sinh vật chuyển hóa xenlulo và 7 dòng

vi sinh vật chuyển hóa tinh bột.

Bảng 3.4. Khả năng chuyển hóa hợp chất cacbon của các vi sinh vật phân lập

Hoạt tính phân giải hợp chất cacbon (D-d, mm) Ký hiệu VSV Nguồn gốc

phân lập mẫu phân lập Vòng phân giải CMC Vòng phân giải Tinh bột

Nƣớc thải SHX.8 34,80,6 20,80,8

Nƣớc thải SHX.11 27,30,6 26,01,0

SHX.12 Bùn thải 46,2±2,5 28,4±2,0

Bùn thải SHX.16 28,50,5 18,80,3

Bùn thải SHV.18 - 23,20,8

Nƣớc thải SHV.19 - 18,80,6

SHV.22 - 25,5±1,2 Bùn thải

Ghi chú:(-): không có vòng phân giải hoặc kích thước nhỏ, không rõ.

68

Kết quả đánh giá hoạt tính phân giải hợp chất cacbon của các dòng phân lập

đƣợc trình bày trong bảng 3.4 xác định bốn dòng vi sinh vật ký hiệu SHX.8,

SHX.11, SHX.12, SHX.16 đa hoạt tính sinh học, phân giải cả xenlulo và tinh bột,

trong đó dòng SHX.12 có khả năng chuyển hóa tinh bột cao nhất với đƣờng kính

vòng phân giải đạt 28,4±2,0 mm, đồng thời có khả năng chuyển hóa xenlulo với

đƣờng kính vòng phân giải đạt 46,2±2,5 mm.

Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa hợp chất các bon (tinh bột và xenlulo) là

nhờ các vi sinh vật này có thể tiết ra môi trƣờng hệ enzym ngoại bào (amylaza,

xenlulose...). Dƣới tác động của hệ enzym này, các hợp chất các bon đƣợc phân hủy

thành chất đơn giản hơn (gluco) có lợi cho vi sinh vật.

Bảng 3.5. Hoạt độ enzym của các vi sinh vật phân lập

Hoạt lực enzym Hoạt lực enzym Ký hiệu (CMCaza (U/ml) amylaza (U/ml)

SHX.8 4,13 1,68

SHX.11 4,51 3,65

SHX.12 5,53 4,68

SHX.16 2,32 1,22

SHV.18 - 2,13

SHV.19 - 1,04

SHV.22 - 3,17

Ghi chú:(-): không xác định.

Kết quả đánh hoạt độ enzym của các vi sinh vật thể hiện khả năng chuyển hóa

hợp chất các bon đƣợc trình bày trong bảng 3.5, xác định dòng SHX.12 có hoạt độ

enzym (CMCaza) đạt 5,53 U/ml và hoạt độ enzym amylaza đạt 4,68 U/ml.

Thử nghiệm đánh giá khả năng chuyển hóa hợp chất cacbon trong nƣớc thải

chế biến tinh bột sắn của các dòng vi sinh vật phân lập thông qua xác định hàm

lƣợng COD và BOD5 trong nƣớc thải khi bổ sung các vi sinh vật vào nƣớc thải

(bảng 3.6).

69

Bảng 3.6. Khả năng xử lý BOD5 và COD trong nƣớc thải chế biến tinh bột sắn của

vi sinh vật phân lập

Hàm lƣợng BOD5 (mg/l) Hàm lƣợng COD (mg/l)

Công thức Sau 3 ngày Hiệu quả xử lý so Sau 3 ngày Hiệu quả xử lý

với ĐC (%) so với ĐC (%) xử lý xử lý

- ĐC (không VSV) 218,2 392,6 -

43,6 SHX.8 123,1 229,7 41,5

58,8 SHX.11 89,9 171,6 56,3

SHX.12 78,7 46,5 91,1 76,8

33,8 SHX.16 144,4 268,1 31,7

29,2 SHV.18 154,5 297,6 24,2

18,9 SHV.19 177,0 313,7 20,1

Sau thời gian thí nghiệm 3 ngày, kết quả cho thấy các vi sinh vật phân lập đều

có khả năng chuyển hóa hợp chất các bon trong nƣớc thải tinh bột sắn, thông qua

làm giảm chỉ số BOD5 từ 18,9 % đến 78,9 %, giảm COD từ 20,1 % đến 76,8 %.

Công thức thí nghiệm bổ sung dòng SHX.12 cho hiệu quả xử lý BOD5 (đạt 78,7 %)

và COD (đạt 76,8 %) cao nhất trong số các vi sinh vật chuyển hóa hợp chất các bon

đƣợc phân lập.

3.2.2. Vi sinh vật chuyển hóa hợp chất chứa Nitơ

-, và NO3

+, NO2

Hợp chất Nitơ trong nƣớc thải tồn tại dƣới các dạng chính là các hợp chất -). Quá Nitơ hữu cơ (protein, peptid, acid amin) và Nitơ vô cơ (NH4

trình chuyển hoá sinh học nguồn Nitơ hữu cơ trong tự nhiên nhờ vi khuẩn, một phần

lƣợng Nitơ đƣợc đồng hóa quay trở lại thành nguồn Nitơ hữu cơ trong cấu trúc tế

-, NO3

bào, phần còn lại trong điều kiện hiếu khí cuối cùng thƣờng dẫn tới tích tụ muối -). Tiếp theo, nhờ quá trình phân huỷ sinh học thiếu khí hoặc kỵ nitrat (NO2

khí (do quá trình oxy hóa-khử sinh học để thu nhận năng lƣợng của các loài vi

khuẩn phản nitrat hóa) các muối nitrat này có thể chuyển hóa đến sản phẩm cuối

cùng là N2 (Soratikou và cs 1999).

70

Bằng phƣơng pháp làm giàu trên môi trƣờng Winogradsky và phƣơng pháp

của Ehrlich (1975), từ 20 mẫu thu thập của đề tài, đã phân lập và xác định đƣợc 2

dòng vi sinh vật có phản ứng dƣơng tính với với thuốc thử Griess và có khả năng - tạo thành sau 7 ngày nuôi cấy trong môi khử amoni thành nitrit. Hàm lƣợng NO2

trƣờng lỏng Winogradsky đƣợc xác định đạt 3,15±0,05 mg/l đối với chủng ký hiệu

SHV.OA5 và 7,04±0,05 mg/l đối với chủng ký hiệu SHV.OA7.

Bảng 3.7. Khả năng chuyển hóa amoni của vi sinh vật phân lập

-

Kí hiệu vi Phản ứng với Khử amoni Nguồn gốc Hàm lƣợng NO2

sinh vật thuốc thử Griess thành nitrit tạo thành (mg/l) phân lập

SHV.OA5 Màu hồng nhạt 3,15±0,05 Nƣớc thải +

SHV.OA7 Màu hồng 7,04±0,05 Nƣớc thải +

Ghi chú: (+) Phản ứng dương tính

Kết quả đánh giá khả năng xử lý Nitơ trong nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

thông qua thí nghiệm xác định chỉ tiêu Nts trong nƣớc thải khi bổ sung các vi sinh

vật phân lập sau thời gian xử lý 5 ngày trong bình tam giác 250 ml, ở điều kiện lắc

150 v/p, với nhiệt độ phòng thí nghiệm, kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Khả năng xử lý Nts trong nƣớc thải CBTBS của vi sinh vật phân lập

Hàm lƣợng Nts (mg/l) STT Công thức Sau 5 ngày Hiệu quả so với ĐC (%)

1 ĐC (không VSV) 95,8 -

2 SHV.OA5 51,5 46,2

3 SHV.OA7 18,6 80,6

Kết quả thí nghiệm (bảng 3.8) cho thấy công thức bổ sung vi sinh vật

(SHV.OA7) có khả năng xử lý Nts cao nhất, hiệu quả xử lý đạt 80,6% so với đối

chứng (không bổ sung vi sinh vật).

3-),

3.2.3. Vi sinh vật chuyển hóa Phosphat hữu cơ và đồng hóa Phospho

Trong nƣớc thải nói chung Phospho hiện diện ở dạng orthophosphate (PO4

poly-P vô cơ hoặc Phospho hữu cơ. Đôi khi nó cũng có mặt trong các dạng hạt

71

Phospho. Một lƣợng nhỏ Phospho tồn tại dạng hữu cơ; còn phần lớn đƣợc khoáng 3-) (Roussos S. và cs, 2003). hóa thành dạng vô cơ (PO4

Dựa vào phƣơng pháp phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học ở phần 2.3.3.3,

từ 20 mẫu thu thập (10 mẫu nƣớc thải, 10 mẫu bùn thải), đề tài đã phân lập và phát

hiện đƣợc 3 dòng vi khuẩn vừa có khả năng chuyển hóa Phosphat hữu cơ (phân giải 3-) hình thành hạt Poly-P (volutin) lexitin), vừa có khả năng đồng hóa Phospho (PO4

trong tế bào.

Bảng 3.9. Khả năng chuyển hóa Phosphat hữu cơ của vi sinh vật phân lập

Vòng phân giải Hoạt độ enzym Nguồn gốc Ký hiệu vi sinh vật lexitin (D-d, mm) phytaza (U/ml) phân lập

5,12 SHV.18 Bùn thải 17,80,4

3,23 SHV.19 Bùn thải 15,50,3

SHV.22 20,2±0,5 11,24 Bùn thải

Kết quả bảng 3.9 cho thấy vi sinh vật ký hiệu SHV.22 có hoạt tính phân giải

lexitin ổn định với đƣờng kính vòng phân giải đạt 20,2±0,5 mm, có hoạt độ enzym

phytaza cao nhất, đạt 11,24 U/ml.

Vi sinh vật có thể đồng hóa Phospho và dự trữ dƣới dạng hạt Poly-P nhƣ đã

đƣợc tìm thấy trong một số vi khuẩn (Fuhs và Chen,1975). Hạt poly-P trong tế bào

vi sinh vật đƣợc biết là "hạt bắt màu" hoặc "hạt volutin", và chúng có ái lực cao với

thuốc nhuộm, điều này cho phép phân biệt sự hiện diện của các "hạt volutin" sau

khi nhuộm Neisser (Gurr E., 1965).

Bảng 3.10. Khả năng đồng hóa Phospho của vi sinh vật phân lập 3- hấp thu Phản ứng thuốc Ký hiệu vi Tạo hạt Nồng độ PO4

sinh vật thử Neisser volutin

SHV.18 Đen xanh +

SHV.19 Đen xanh +

SHV.22 Đen xanh + trong tế bào (mg/tế bào) 1,31 x 10-11 2,16 x 10-11 3,05 x 10-11

Ghi chú: (+) Phản ứng dương tính

72

Quan sát dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần, các chủng

phân lập đều phát hiện hạt volutin (hạt bắt màu đen xanh khi nhuộm Neisser). Phân 3- của dịch nuôi cấy các chủng phân lập trong môi trƣờng nƣớc thải tích nồng độ PO4

(phụ lục 1), sau 5 ngày nhận thấy chủng SHV.22 có khả năng hấp thu Phospho lớn 3- hấp thu trong tế bào đạt 3,05 x 10-11mg/tế bào. nhất. Nồng độ PO4

Kết quả đánh giá khả năng xử lý Phospho trong nƣớc thải chế biến tinh bột

sắn của các vi sinh vật tuyển chọn thông qua phân tích chỉ tiêu Pts trong nƣớc thải

khi bổ sung các vi sinh vật tuyển chọn vào nƣớc thải (bảng 3.11), cho thấy SHV.22

có khả năng chuyển hóa P tổng số lớn nhất (hiệu quả xử lý Pts đạt 82.1%)

Bảng 3.11. Khả năng xử lý Pts trong nƣớc thải CBTBS của vi sinh vật phân lập

Hàm lƣợng Pts (mg/l) STT Công thức Sau xử lý Hiểu quả sử lý so với ĐC (%)

1 ĐC (không VSV) 16,1 -

2 SHV.18 6,2 61,7

3 SHV.19 7,6 52,6

4 SHV.22 2,9 82,1

Căn cứ vào kết quả đánh giá hoạt tính sinh học, bộ giống vi sinh vật đƣợc

tuyển chọn và sử dụng cho nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc

thải chế biến tinh bột sắn đƣợc xác định gồm 3 dòng vi sinh vật ký hiệu SHX.12,

SHV.22 và SHV.OA7 với các mức hoạt tính sinh học trình bày cụ thể trong bảng

3.12.

Xạ khuẩn SHX.12 có khả năng chuyển hóa hợp chất cacbon (phân giải tinh

bột và xellulo), đƣờng kính vòng phân giải tinh bột và CMC trên 20 mm. Vi khuẩn

lexitin đạt 20,2±0,5 mm vừa có khả năng đồng hóa Phospho (PO4

các hạt volutin trong tế bào, hàm lƣợng PO4

mg/tế bào. Vi khuẩn SHV.OA7 có khả năng chuyển hóa hợp chất Nitơ (khử NH4

SHV.22 vừa có hoạt tính chuyển hóa Phosphat hữu cơ, đƣờng kính vòng phân giải 3-) thông qua tạo 3- hấp thu trong tế bào đạt 3,05x10-11 +), - tạo thành phản ứng với thuốc thử Griess tạo phức màu hồng và hàm lƣợng NO2

trong môi trƣờng nuôi cấy 7,04±0,05 mg/ml.

73

Bảng 3.12. Hoạt tính sinh học của vi sinh vật tuyển chọn

3- hấp thu (mg/tế bào)

-

Hoạt tính sinh học SHV.22 SHV.OA7

tạo thành (mg/ml)

SHX.12 46,2±2,5 28,4±2,0 - 5,53 4,68 - - - - - - 25,5±1,2 20,2±0,5 - 3,17 11,24 + 3,05x10-11 - - - - - - - - - - + 7,04±0,05 Đƣờng kính vòng phân giải CMC (D-d) mm Đƣờng kính vòng phân giải tinh bột (D-d) mm Đƣờng kính vòng phân giải lexitin (D-d) mm Hoạt lực enzym (CMCaza)(U/ml) Hoạt lực enzym amylaza (U/ml) Hoạt lực enzym phytaza (U/ml) Phản ứng với thuốc thử Neisser Hàm lƣợng PO4 Phản ứng thuốc thử Griess Hàm lƣợng NO2

Ghi chú: (+) phản ứng dương tính; (-) không xác định

3.2.4. Định danh và xác định độ an toàn của các vi sinh vật nghiên cứu

3.2.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống

Ba dòng vi sinh vật tuyển chọn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có pH, nhiệt

độ và thời gian thích hợp cho từng loại, quan sát hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng

thạch đĩa và khả năng sinh trƣởng, các đặc điểm sinh hóa trong môi trƣờng dịch thể.

Hình dạng, kích thƣớc tế bào của ba dòng vi sinh vật đƣợc xác định trên kính hiển

vi điện tử Fe-SEM (S-4800) tại viện Vệ sinh Dịch tễ trung ƣơng.

 Chủng xạ khuẩn SHX.12

Xạ khuẩn SHX.12 thuộc nhóm hiếu khí, Gram (+), sinh trƣởng tốt trên môi

trƣờng ISP 3,4. Khuẩn lạc có dạng tròn không đều, màu xám hồng, chân bám chắc

vào môi trƣờng.

Hình 3.2. Khuẩn lạc và bào tử chuỗi của chủng xạ khuẩn SHX.12

74

Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử Fe-SEM của viện Vệ sinh dịch tế trung

ƣơng với độ phóng đại 3000 lần, cho thấy chủng SHX.12 có chuỗi bào tử dạng

xoắn, chuỗi bào tử dài với số lƣợng bào tử trên một chuỗi từ 10-50 bào tử, bề mặt

bào tử dạng trơn nhẵn.

Dựa vào khóa phân loại Bergey (Niall A. và cs, 2009) và phƣơng pháp

chƣơng trình xạ khuẩn Quốc tế (ISP) (E.B. Shirling và cs, 1966), xạ khuẩn SHX.12

đƣợc xác định đặc điểm trong bảng 3.13.

Bảng 3.13. Đặc điểm sinh học và sinh hóa của xạ khuẩn SHX.12

Đặc điểm

SHX.12

TT 1 Hình thành sắc tố melanin - -Trên môi trƣờng ISP6 -Trên môi trƣờng ISP7 - Sinh trƣởng ở 45°C + 2 Sinh trƣởng ở NaCl 7% - 3 Sinh trƣởng trên môi trƣờng bổ sung chất ức chế 4 - Phenol 0,1% - Sodium axit 0,01% + Crystal violet 0,05% Sử dụng nguồn các bon 5 + - Maltose - - Sucrose + - Arabinose + - Dextrose - - Mannitol - - Galactose + - D-Glucose + - D-Fructose - - Lactose - - Rhamnose - - Raffinose + - Xylose + - Tinh bột

Ghi chú: (+) phản ứng dương tính; (-) phản ứng âm tính

75

Xạ khuẩn SHX.12 không hình thành sắc tố melanin trên trƣờng ISP6 và ISP7, sinh trƣởng tốt ở điều kiện nhiệt độ 450C, có khả năng đồng hóa đƣờng

maltose, arabinose, dextrose, glucose, fructose, xylose. Xạ khuẩn SHX.12 nhậy cảm

với phenol và sodium axit, không phát triển đƣợc nếu có mặt chất này. Thuốc

nhuộm crystal violet 0,05% không kìm hãm sự phát triển xạ khuẩn SHX.12.

 Chủng vi khuẩn SHV.22

Vi khuẩn SHV.22 thuộc vi khuẩn Gram (+), hiếu khí hoặc kị khí không bắt

buộc. Trên môi trƣờng NA sau 2 ngày nuôi cấy, chúng tạo khuẩn lạc tròn có mép

không đều, màu kem, bề mặt khô hơi nhăn, đƣờng kính khuẩn lạc 0,4-1mm. Trên

môi trƣờng dịch thể lắc, sau 2 ngày nuôi cấy chủng SHV.22 sinh trƣởng làm môi

trƣờng chuyển sang màu vàng, tạo váng màu nâu nhạt trên thành bình. Ở điều kiện

nuôi cấy tĩnh, sau 2-3 ngày chủng SHV.22 sinh trƣởng làm đục môi trƣờng dịch thể,

bền mặt môi trƣờng đóng váng. Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy tế bào

vi khuẩn SHV.22 có dạng hình que, bào tử hình oval, kích thƣớc tế bào 0,5x1,5-3,5

µm.

Hình 3.3. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn SHV.22

Song song với việc đánh giá đặc điểm hình thái tế bào, thử nghiệm khả năng

đồng hóa các nguồn hydratcacbon, và một số phản ứng cần thiết khác đƣợc tiến

hành để xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật. Sử dụng hệ thống kit

sinh hóa API 50 CHB (BioMerieu, Pháp) đối với vi khuẩn SHV.22, kết quả tổng hợp trong bảng 3.14.

76

Bảng 3.14. Khả năng sử dụng nguồn hydratcacbon của vi khuẩn SHV.22

Nguồn đƣờng SHV.22 Nguồn đƣờng SHV.22

+ + Sử dụng Arabinose Sử dụng D-glucose Sử dụng Ramnose Sử dụng Fructose + +

+ Sử dụng Lactose Sử dụng Xylose +

+ - + Sử dụng Mannose Sử dụng Melibiose Sử dụng Metyl α-D Sử dụng Sucrose Sử dụng Mannitol Sử dụng Citrate + + +

+ Thủy phân tinh bột +

- - Sử dụng D-ribose glycoside Sử dụng D-Turanose Arginine dihydrolase Thủy phân casein Phân hủy gelatin + +

+ Sử dụng D-Raffinose Khử nitrate +

Ghi chú: (+) phản ứng dương tính; (-) phản ứng âm tính

Vi khuẩn SHV.22 sử dụng nguồn hydratcacbon khá đa dạng. Chúng có khả

năng đồng hóa với hầu hết nguồn đƣờng đặc trƣng dùng cho phân loại vi khuẩn

(glucose, lactose, mannitol, fructose, sucrose...) đồng thời chúng còn có khả năng

phân giải gelatin, thủy phân tinh bột, casein và khử nitrate.

 Chủng vi khuẩn SHV.OA7

Vi khuẩn SHV.OA7 là vi khuẩn hiếu khí, Gram (-), quan sát dƣới kính hiển

vi điện tử nhận thấy tế bào có khả năng di động, tế bào hình bầu dục có kích thƣớc

0,8-1,1x1,0-1,7 µm. Chủng SHV.OA7 sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng BE (có

bổ sung phytagel), chúng hình thành khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng. Vi khuẩn

Dịch nuôi cấy dương tính Griess

Tế bào dưới kính hiển vi điện tử S-4800

SHV.OA7 không sinh bào tử.

Hình 3.4. Đặc điểm sinh hóa và tế bào của vi khuẩn SHV.OA7

77

Ngoài việc xác định đặc điểm hình thái tế bào chủng SHV.OA7, thử nghiệm

khả năng đồng hóa một số nguồn hydratcacbon đối với vi khuẩn SHV.OA7 trong

môi trƣờng có bổ sung một số loại đƣờng, kết quả đƣợc tập hợp trong bảng 3.15.

Bảng 3.15. Khả năng sử dụng nguồn hydratcacbon của vi khuẩn SHV.OA7

Nguồn đƣờng SHV.OA7 Nguồn đƣờng SHV.OA7

Sử dụng glucose - Sử dụng mannose -

Sử dụng fructose +/- Sử dụng manitol -

Sử dụng pyruvate +/- Sử dụng citrate -

Sử dụng glycerol - Sử dụng sodium citrate -

Ghi chú: (+) phản ứng dương tính; (-) phản ứng âm tính; (+/-) không xác định

Chủng vi khuẩn SHV.OA7 hầu nhƣ không sử dụng các nguồn hydratcacbon

trong nghiên cứu, phản ứng âm tính với hầu hết các loại đƣờng, ngoại trừ fructose

và pyruvate phản ứng chƣa rõ ràng. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết

quả nghiên cứu của Connie Clark và E.L. Schmidt (1966), Normaan G. Hommes và

cs (2003) về khả năng đồng hóa nguồn hydratcacbon của Nitrosomonas europea.

Căn cứ vào kết quả đánh giá đặc điểm hình thái, các phản ứng sinh hóa so

với khóa phân loại Bergey, ba vi sinh vật nghiên cứu đƣợc xác định nhƣ sau:

- Xạ khuẩn SHX.12 có nhiều đặc điểm giống loài Streptomyces fradiae.

- Vi khuẩn SHV.22 có nhiều đặc điểm giống loài Bacillus velezensis.

- Vi khuẩn SHV.OA7 có nhiều đặc điểm giống loài Nitrosomonas europaea.

Kết quả nghiên cứu của luận án cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của

Cristina Ruiz-Garcia và cs (2005) về loài Bacillus velezensis, của El Meleigy M.A.,

và cs (2011); Sunanda Kumari và cs (2015); Mrinal K. Majumdar và S.K. Majumda

(1967), Sheikh Aftabuddin và cs (2013) về loài Streptomyces fradiae và của M.S.

Engel (1961), Hirofumi Toiyama và cs (2001) về Nitrosomonas europea.

3.2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Nhằm xác định chính xác tên loài của các chủng nghiên cứu, đề tài đã sử

dụng phƣơng pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử thông qua việc xác

78

định trình tự gien 16S rADN của chủng SHX.12, SHV.22 và SHV.OA7 để khẳng

định tên loài của các chủng vi sinh vật nghiên cứu trên.

Đoạn gien mã hóa cho 16S rADN của các chủng vi sinh vật đƣợc khuếch đại

nhờ phản ứng chuỗi trùng hợp sử dụng cặp mồi (phụ lục 3). Từ ADN thang chuẩn

10.000 bp, kết quả nghiên cứu xác định đƣợc chủng cần định danh cho sản phẩm

PCR đƣợc nhân lên nằm trong khoảng kích thƣớc nucleotit nào.

Để thực hiện việc xác định trình tự, trƣớc hết phải chuyển phân tử ADN

mạch kép thành phân tử ADN mạch đơn, biến tính phân tử ADN mạch kép qua

PCR. Phản ứng bao gồm 1 mạch ADN sẽ xác định trình tự (một trong hai chuỗi đơn

của phân tử ADN đã bị biến tính), các đoạn mồi ADN (các mẫu ADN bổ sung với

mạch sẽ xác định trình tự và đƣợc đánh dấu phóng xạ ở đầu 5‟). Xác định trật tự

ADN tự động đƣợc dựa trên phƣơng pháp kết thúc chuỗi và đoạn trình tự đƣợc thực

hiện bằng phƣơng pháp xác định tự động. Trong quá trình này, cả 4 loại

dideoxynucleotit đều xuất hiện, mỗi loại đƣợc đánh dấu bằng các màu khác nhau.

Các đoạn ADN sẽ đƣợc tách bằng điện di và máy xác định trình tự tự nhận biết các

màu khác nhau đó.

Sau khi loại bỏ lỗi của việc bắt cặp sai trong quá trình phân tích, dữ liệu

đƣợc gửi vào ngân hàng dữ liệu gien, so sánh đoạn nucleotit phân tích với trình tự

gien của đoạn ADNr 16S đã đƣợc đăng ký trong ngân hàng gien.

Kết quả đọc trình tự đƣợc xử lý bằng phần mềm Clustal X và so sánh với dữ

liệu trên gien bank bằng công cụ Blast Search sử dụng cho việc lập cây phả hệ trong

phân tích nguồn gốc tiến hóa của các vi sinh vật nghiên cứu với các mối quan hệ

khác trong hệ thống phát sinh chủng loại.

* Chủng SHX.12

Trình tự gien 16S rADN chủng SHX.12 tƣơng đồng 100% (1500/1500 bp) so

với trình tự của chủng Streptomyces fradiae AB184059. Mối quan hệ gần giữa

chủng SHX.12 với trình tự nucleotit các loài thuộc Streptomyces trong ngân hàng

dữ liệu gien cho thấy SHX.12 nằm cùng nhánh với Streptomyces fradiae AB184059

trên cây phát sinh.

79

0.01

Streptomyces fradiae_AB184059

64 SHX.12

98 Streptomyces rubrolavendulae_AB184463

66 Streptomyces roseoflavus_AF369704

79 Streptomyces thermolilacinus_AB184585

77 Streptomyces coeruleoprunus_AB184651

Streptomyces somaliensis_AJ007403

Streptomyces thermocarboxydovorans_STU94487

Streptomyces brasiliensis_EF626594 86

Streptomyces pseudogriseolus_X80827 55

100 Streptomyces tritolerans_DQ345779

99 Streptomyces tendae_D63873

Kitasatosporia setalba_U93332

Hình 3.5. Vị trí phân loại của chủng SHX.12 với các loài có quan hệ họ hàng gần

dựa vào trình tự 16S rADN

* Chủng SHV.22

Xác định trình tự gien 16S rADN của vi khuẩn SHV.22, so sánh mối quan hệ

trình tự nucleotit trong ngân hàng gien và xây dựng cây phát sinh chủng loại.

Trình tự gien 16S rADN của chủng vi khuẩn SHV.22 tƣơng đồng 99,9%

(1498/1500 bp) với trình tự của chủng Bacillus velezensis EF433407. Quan sát trên

cây phả hệ, chủng SHV.22 nằm cùng vị trí với Bacillus velezensis EF433407.

80

0.01

Bacillus velezensis_EF433407 50 SHV.22

59 55 Bacillus licheniformis_AY947531 54 Bacillus polyfermenticus_AY149473 53 Bacillus nematotocita_AY820954

91 Bacillus vallismortis_AB021198

Bacillus subtilis_AB201120 65 Bacillus mojavensis_AB021191 100

Bacillus axarquiensis_DQ993670

93 98 100 Brevibacterium halotolerans_AM747812

Bacillus atrophaeus_AB021181

83 Bacillus pumilus_AY741720

Bacillus isabelae_AM503357

Bacillus cibi_AY550276 53 100 Bacillus indicus_AJ583158 68

Bacillus catenulatus_AY523411

Bacillus cereus_AY138274

Staphylococcus aureus_X68417

Hình 3.6. Vị trí phân loại của chủng SHV.22 với các loài có quan hệ họ hàng gần

dựa vào trình tự 16S rADN

*Chủng SHV.OA7

Kết quả giải trình tự nucleotit cho thấy trình tự gien 16S rADN của chủng vi

khuẩn SHV.OA7 tƣơng đồng 99% với trình tự của chủng Nitrosomonas europaea

ATCC25978 và Nitrosomonas europaea ATCC19178. Mối quan hệ gần giữa chủng

SHV.OA7 với trình tự nucleotit các loài thuộc Nitrosomonas trong ngân hàng dữ

81

liệu gien cho thấy chủng SHV.OA7 nằm trên cùng nhánh của cây phát sinh với loài

Nitrosomonas europaea ATCC25978 và Nitrosomonas europaea ATCC19178.

Hình 3.7. Vị trí phân loại của chủng SHV.OA7 với các loài có quan hệ họ hàng gần

dựa vào trình tự 16S rADN

82

Căn cứ vào kết quả định danh theo phƣơng pháp truyền thống (dựa trên đặc

điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa) và kết hợp với kết quả định danh theo phƣơng

pháp sinh học phân tử (dựa trên kết quả giải trình tự các nucleotit và thiết lập cây

phả hệ) cho phép khẳng định xạ khuẩn SHX.12 thuộc chi Streptomyces fradiae,

chủng vi khuẩn SHV.22 thuộc chi Bacillus velezensis, vi khuẩn SHV.OA7 thuộc chi

Nitrosomonas europaea.

3.2.4.3. Độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2004 các nhóm tác nhân sinh học,

gồm vi khuẩn, vi rút, nấm, ký sinh trùng đƣợc phân làm 4 cấp độ an toàn cụ thể nhƣ

sau:

- Tác nhân sinh học có mức an toàn sinh học 1 là các tác nhân sinh học

không có nguy hiểm đối với sức khỏe ngƣời, động vật và môi trƣờng sinh thái.

- Tác nhân sinh học có mức an toàn sinh học cấp độ 2 là các tác nhân sinh

học có nguy cơ tiềm tàng đối với sức khỏe ngƣời, động vật và môi trƣờng sinh thái

ở mức độ thấp và hoàn toàn có thể khống chế đƣợc bằng các các biện pháp quản lý

an toàn.

- Tác nhân sinh học có mức an toàn sinh học cấp độ 3 là các tác nhân sinh

học gây tác động có hại ở mức độ trung bình đối với sức khỏe ngƣời, động vật và

môi trƣờng sinh thái. Các tác động gây ra về cơ bản có thể phòng tránh đƣợc bằng

các các biện pháp quản lý an toàn.

- Tác nhân sinh học có mức an toàn sinh học cấp 4 là các tác nhân sinh học

gây tác động có hại ở mức độ cao đối với sức khỏe ngƣời, động vật và môi trƣờng

sinh thái. Các tác động gây ra ngoài phạm vi giới hạn, hiện không có biện pháp

phòng tránh.

Trong 4 cấp độ an toàn, chỉ các tác nhân sinh học thuộc cấp độ 1 đƣợc ứng

dụng trong sản xuất ở điều kiện bình thƣờng. So sánh với danh mục các vi khuẩn,

xạ khuẩn cấp độ an toàn 1, đề tài xác định cả 3 chủng vi sinh vật nghiên cứu đều

thuộc nhóm tác nhân sinh học có mức an toàn cấp độ 1 (bảng 3.16).

83

Bảng 3.16. Mức độ an toàn của vi sinh vật nghiên cứu

STT Ký hiệu Tên xác định Mức độ an toàn

1 SHX.12 Streptomyces fradiae Cấp độ 1

2 SHV.22 Bacillus velezensis Cấp độ 1

3 SHV.OA7 Nitrosomonas europea Cấp độ 1

Bộ chủng vi sinh vật đƣợc tuyển chọn gồm: xạ khuẩn Streptomyces fradiae

(S.fradiae) SHX.12, vi khuẩn Bacillus velezensis (B.velezensis) SHV.22 và vi khuẩn

Nitrosomonas europea (N.europea) SHV.OA7 đảm bảo độ an toàn sinh học cao

(cấp độ 1), không gây ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe con ngƣời, vật nuôi cây trồng và

môi trƣờng, đáp ứng yêu cầu trong việc nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật ứng

dụng trong sản xuất nông nghiệp.

3.3. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

3.3.1. Khả năng tổ hợp các vi sinh vật nghiên cứu

3.3.1.1. Khả năng sống sót của các vi sinh vật trong điều kiện tổ hợp

Các chủng vi sinh vật có khả năng tồn tại cùng với nhau trong điều kiện tổ

hợp là yêu cầu cần thiết trong việc nghiên cứu tạo chế phẩm chứa nhiều loài vi sinh

vật. Để đánh giá khả năng sống sót trong điều kiện tổ hợp của các chủng vi sinh vật

nghiên cứu, thử nghiệm theo dõi biến động về mật độ tế bào vi sinh vật theo thời

gian với công thức thí nghiệm chủng vi sinh vật đƣợc nhiễm riêng rẽ và hỗn hợp

vào chất mang khử trùng.

Xác định khả năng tồn tại của vi sinh vật trong điều kiện đơn lẻ và hỗn hợp

thông qua theo dõi theo mật độ các chủng vi sinh vật biến động theo các khoảng

thời gian 7 ngày, 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng.

Mật độ các chủng vi sinh vật trong chất mang sau khi nhiễm vi sinh vật 7, 15, 30,

60 và 90 ngày ở điều kiện bình thƣờng đƣợc xác định theo phƣơng pháp pha loãng

trên môi trƣờng đặc phù hợp với từng chủng. Kết quả nghiên cứu đƣợc tổng hợp

cho thấy, cả ba chủng nghiên cứu đều có khả năng phát triển và tồn tại tốt cùng

nhau trong điều kiện đơn lẻ và hỗn hợp trên chất mang khử trùng thể hiện thông qua

diễn biến mật độ vi sinh vật theo thời gian nghiên cứu (bảng 3.17).

84

Bảng 3.17. Khả năng tồn tại của vi sinh vật trong điều kiện đơn lẻ và tổ hợp

Công Mật độ vi sinh vật (CFU/g) sau thời gian bảo quản Ký hiệu thức thí chủng 0 giờ 7 ngày 15 ngày 30 ngày 60 ngày 90 ngày nghiệm

Đơn lẻ 4,6 x 109 4,9 x 109 6,6 x 109 6,4 x 109 4,5 x 108 2,9 x 108

SHX.12

Hỗn hợp 4,1 x 109 5,1 x 109 5,9 x 109 5,5 x 109 3,3 x 108 2,7 x 108

Đơn lẻ 4,4 x 109 5,3 x 109 6,2 x 109 5,7 x 109 4,8 x 108 3,6 x 108

SHV.22

Hỗn hợp 3,4 x 109 5,5 x 109 6,3 x 109 5,6 x 109 4,7 x 108 3,5 x 108

Đơn lẻ 4,5 x 108 4,6 x 108 5,8 x 108 5,6 x 108 3,8 x 108 2,8 x 108 SHV.

OA7 Hỗn hợp 3,7 x 108 4,3 x 108 5,6 x 108 5,5 x 108 3,6 x 108 2,6 x 108

Cả ba chủng vi sinh vật nghiên cứu đều đạt mật độ trên 108CFU/g sau 90

ngày, vậy có thể xác định các vi sinh vật nghiên cứu có khả năng tồn tại cùng nhau

trong cùng điều kiện môi trƣờng, giữa các vi sinh vật nghiên cứu không có biểu

hiện đối kháng và có thể sử dụng hỗn hợp các chủng vi sinh vật nghiên cứu để sản

xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn.

3.3.1.2. Hoạt tính sinh học của các vi sinh vật trong điều kiện tổ hợp

Vi sinh vật có thể cùng tồn tại với nhau trong điều kiện hỗn hợp, song hoạt

tính sinh học của mỗi chủng có thể bị thay đổi. Để xác định ảnh hƣởng của việc hỗn

hợp các chủng vi sinh vật đến hoạt tính sinh học của chủng, đề tài tiến hành xác

định các hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu trong điều kiện

đơn lẻ và hỗn hợp sau 90 ngày. Kết quả đƣợc trình bày tại các bảng 3.18 cho thấy

các vi sinh vật nghiên cứu trong điều kiện tổ hợp vẫn giữ đƣợc các hoạt tính sinh

học ban đầu. Mức độ hoạt tính sinh học của các vi sinh vật nghiên cứu trong điều

kiện hỗn hợp so với điều kiện đơn lẻ hầu nhƣ không có sự khác biệt.

85

Bảng 3.18. Hoạt tính sinh học của vi sinh vật nghiên cứu trong điều kiện đơn lẻ và

hỗn hợp sau 90 ngày bảo quản

Mức hoạt tính Hoạt tính sinh học Đơn vị đo Đơn lẻ Hỗn hợp

S.fradiae SHX.12

Đƣờng kính vòng phân giải CMC (D-d) mm 46,0 46,1

Đƣờng kính vòng phân giải tinh bột (D-d) mm 28,4 28,3

Hoạt lực enzym (CMCase) U/ml 5,53 5,50

Hoạt lực enzym amylaza U/ml 4,68 4,63

B.velezensis SHV.22

Đƣờng kính vòng phân giải lexitin (D-d) mm 20,2 20,2

Hoạt lực enzym phytaza U/ml 11,24 11,20

+

Phản ứng thuốc thử Neisser, có hạt volutin 3- hấp thu mg/tế bào 3,05x10-11 + 2,95x10-11 Hàm lƣợng PO4

N.europea SHV.OA7

Phản ứng thuốc thử Griess + +

mg/ml 7,04 7,01 Hàm lƣợng NO2 tạo thành

Ghi chú: (+) phản ứng dương tính

Tổng hợp các các kết quả nghiên cứu nêu trên cho thấy trong điều kiện hỗn

hợp các vi sinh vật nghiên cứu có khả năng sống tƣơng hỗ với nhau và vẫn duy trì

đƣợc hoạt tính sinh học. Nhƣ vậy có thể sử dụng ba chủng vi sinh vật S.fradiae

SHX.12, B.velezensis SHV.22 và N.europea SHV.0A7 cho sản xuất chế phẩm vi

sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn.

3.3.2. Nhân sinh khối các vi sinh vật tuyển chọn bằng phƣơng pháp lên men

chìm

Với mục đích tạo sinh khối các vi sinh vật tuyển chọn cho các công đoạn sản

xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn, đề tài tiến hành

nghiên cứu các điều kiện nhân sinh khối và tối ƣu hóa điều kiện lên men chìm của

các vi sinh vật tuyển chọn.

86

3.3.2.1. Nhiệt độ tối ƣu

Để nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy, tiến hành nuôi

cấy chủng S.fradiae SHX.12 trong môi trƣờng Gause, chủng B.velezensis SHV.22

trong môi trƣờng NA, chủng N.europea SHV.OA7 trên môi trƣờng Winogradsky với các mức nhiệt độ là 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 và 550C. Nuôi cấy 48 giờ đối với

chủng SHV.22, 72 giờ đối với chủng SHX.12 và 96 giờ đối với chủng SHV.OA7,

xác định mật độ tế bào trong dịch lên men, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.8.

Hình 3.8. Mật độ vi sinh vật nhân sinh khối ở các nhiệt độ khác nhau

Mỗi loài vi sinh vật chỉ sinh trƣởng tốt trong một khoảng nhiệt độ thích hợp

nhất định. Hình 3.8 cho thấy chủng S.fradiae SHX.12 phát triển đƣợc trong khoảng nhiệt độ từ 20-550C, thích hợp nhất từ 35-400C, ngoài khoảng nhiệt độ này chủng

S.fradiae SHX.12 vẫn phát triển nhƣng mật độ không cao. Nguyên nhân là do nhiệt

độ ảnh hƣởng đến hoạt tính enzym và tốc độ của các phản ứng hóa học trong tế bào

nên ảnh hƣởng đến tốc độ sinh trƣởng của S.fradiae SHX.12.

Chủng N.europea SHV.OA7 chỉ phát triển trong khoảng 25-300C, nhiệt độ trên 350C đã ức chế sự phát triển của N.europea SHV.OA7 và nhiệt độ trên 450C thì

chúng ngừng phát triển. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lisa

Yael Stein (1998) và Đào Thị Hồng Vân (2012), Trần Liên Hà (2007), Lê Thanh

Huyền và cs (2014) về loài vi khuẩn Nitrosomonas.

Chủng B.velezensis SHV.22 phát triển đƣợc trong khoảng nhiệt độ nghiên cứu (20-550C), nhƣng thích hợp nhất là trong khoảng nhiệt độ từ 25-300C. Ngoài

87

khoảng nhiệt độ này chúng vẫn phát triển nhƣng mật độ không cao. Kết quả nghiên

cứu của luận án phù hợp với kết quả nghiên cứu của Phạm Bích Hiên (2012) về

khoảng nhiệt độ thích hợp cho loài Bacillus.

3.3.2.2. pH tối ƣu

pH môi trƣờng có ảnh hƣởng quyết định đến sinh trƣởng của nhiều chủng vi sinh vật, H+ nằm trong thành phần môi trƣờng làm thay đổi trạng thái diện tích của

thành tế bào. Tùy theo nồng độ mà chúng làm tăng hay giảm khả năng thẩm thấu

của của tế bào đối với những ion nhất định. Mặt khác chúng cũng làm ức chế phần nào các enzym có mặt trên thành tế bào. Nếu nồng độ H+ trong dung dịch vƣợt quá

mức bình thƣờng đối với vi sinh vật nào đó thì sự sống bị ức chế (Lƣơng Đức

Phẩm, 2009).

Hình 3.9. Mật độ vi sinh vật ở điều kiện pH môi trƣờng khác nhau

Kết quả nghiên cứu xác định pH môi trƣờng tối ƣu đối với nhân sinh khối

các vi sinh vật tuyển chọn trong hệ thống lên men chìm đƣợc thể hiện trong hình 3.9

cho thấy xạ khuẩn S.fradiae SHX.12 và vi khuẩn B.velezensis SHV.22 phát triển tốt

ở pH 6-8, trong đó mật độ đạt cao nhất ở pH=7. Vi khuẩn N.europea SHV.OA7

phát triển kém ở pH ≤ 6, thích nghi ở môi trƣờng kiềm yếu và đạt mật độ tối đa ở

pH=8. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Lisa Yael Stein (1998),

K. Vjaya Bhaskar và cs (2005), Đào Thị Hồng Vân (2012) về loài Nitrosomonas,

phù hợp với kết quả nghiên cứu của Phạm Bích Hiên (2012) về loài Bacillus và

Streptomyces.

88

3.3.2.3. Thời gian nhân sinh khối

Kết quả nghiên cứu về sinh trƣởng, phát triển của 3 chủng vi sinh vật tuyển

chọn trong hệ thống lên men chìm trong thời gian 1-7 ngày, đƣợc thể hiện trong

hình 3.10 cho thấy vi khuẩn B.velezensis SHV.22 đạt pha sinh trƣởng sau 2 ngày lên men với mật độ khoảng 109 CFU/ml, bắt đầu pha tử vong sau 3 ngày lên men. Xạ

khuẩn S.fradiae SHX.12 đạt pha sinh trƣởng sau 3 ngày lên men với mật độ đạt trên 109 CFU/ml và sau 5 ngày bắt đầu tử vong và giảm dần. Vi khuẩn N.europea SHV.OA7 đạt pha sinh trƣởng sau 4 ngày lên men với mật độ khoảng 108 MPN/ml,

pha tử vong diễn ra sau 7 ngày lên men. Nhƣ vậy, thời gian nhân sinh thích hợp

nhất cho chủng B.velezensis SHV.22 là 2 ngày, cho S.fradiae SHX.12 là 3 ngày và

N.europea SHV.OA7 là 4 ngày.

Hình 3.10. Mật độ vi sinh vật sau thời gian nhân sinh khối khác nhau

Kết quả nghiên cứu của luận án phù hợp với nghiên cứu của Phạm Bích Hiên

(2012) về thời gian nhân sinh khối đối với vi khuẩn Bacillus và xạ khuẩn

Streptomyce, phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đào Thị Hồng Vân (2012) về thời

gian nhân sinh khối đối với vi khuẩn Nitrosomonas.

3.3.2.4. Môi trƣờng nhân sinh khối

Với mục tiêu ứng dụng công nghệ sản xuất vào thực tiễn và hạ giá thành sản

phẩm, đề tài đã lựa chọn môi trƣờng lên men với tiêu chí thay thế hóa chất đắt tiền

bằng nguyên liệu tự nhiên sẵn có, dễ kiếm, thành phần môi trƣờng đơn giản, rẻ tiền.

Ba môi trƣờng sản xuất đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu trên cơ sở kế thừa các

kết quả nghiên cứu của Viện Môi trƣờng Nông nghiệp, gồm môi trƣờng rỉ đƣờng

89

(SX1), nƣớc chiết đậu (SX2) và môi trƣờng Winogradsky (phụ lục 1). Kết quả theo

dõi mật độ các vi sinh vật nghiên cứu sau thời gian nhân sinh khối 3 ngày đối với

S.fradiae SHX.12, thời gian 2 ngày đối với B.velezensis SHV.22 và 4 ngày đối với

N.europea SHV.OA7 đƣợc trình bày trong bảng 3.19 cho thấy S.fradiae SHX.12

phát triển tốt trên cả 3 loại môi trƣờng nghiên cứu, trong đó mật độ trong môi trƣờng nƣớc chiết đậu cao hơn cả đạt 3,5x109 CFU/ml. Môi trƣờng nƣớc chiết đậu

có chứa chất kích thích sinh trƣởng và vitamin là môi trƣờng phù hợp cho nhân sinh

khối S.fradiae SHX.12.

Bảng 3.19. Sinh khối vi sinh vật nghiên cứu trong các môi trƣờng lên men

Mật độ vi sinh vật (CFU/ml) trong môi trƣờng Chủng vi sinh vật

S.fradiae SHX.12

B.velezensis SHV.22

N.europea SHV.OA7 Rỉ đƣờng (SX1) Nƣớc chiết đậu (SX2) Winogradsky 3,5x109 3,6x109 3,7x107 3,1x 108 2,3x109 5,6x107 2,8x108 4,6x108 4.2x108

B.velezensis SHV.22 cũng phát triển tốt trên ba loại môi trƣờng nghiên cứu với mật độ đạt từ 4,6x108 đến 3,6x109 CFU/ml sau 2 ngày lên men, trong đó mật độ đạt ≥109 CFU/ml trong môi trƣờng SX1 và SX2. Xét về chi phí giá thành, và khả

năng dễ kiếm, thuận lợi đề tài đã lựa chọn môi trƣờng SX2 là môi trƣờng nhân sinh

khối cho vi khuẩn B.velezensis SHV.22.

N.europea SHV.OA7 phát triển tốt nhất trên môi trƣờng Winogradsky với mật độ đạt ≥108 MPN/ml sau 4 ngày lên men. Môi trƣờng Winogradsky là môi

trƣờng lên men phù hợp đối với N.europea SHV.OA7. Kết quả nghiên cứu này phù

hợp với nghiên cứu của Đào Thị Hồng Vân (2012) về môi trƣờng nhân sinh khối

cho chủng Nitrosomonas.

3.3.2.5. Tỷ lệ tiếp giống

Kết quả nghiên cứu xác định tỉ lệ tiếp giống thích hợp cho nhân sinh khối các

vi sinh vật nghiên cứu trong nồi lên men 5 lít với thời gian, pH, nhiệt độ và môi

trƣờng thích hợp với từng chủng đƣợc nghiên cứu ở trên, số liệu đƣợc thể hiện trong

bảng 3.20 cho thấy sinh khối vi sinh vật tăng khi tỉ lệ tiếp giống ban đầu tăng.

90

Chủng B.velezensis SHV.22 và chủng S.fradiae SHX.12 đạt sinh khối cao nhất khi

tỉ lệ tiếp giống là 5%, chủng N.europea SHV.OA7 đạt sinh khối cao nhất khi tỉ lệ

tiếp giống là 7%, nhƣng khi tăng tỉ lệ tiếp giống lên 10% thì lƣợng sinh khối của các

chủng nghiên cứu đều giảm.

Bảng 3.20. Sinh khối vi sinh vật nghiên cứu ở các tỉ lệ tiếp giống khác nhau

Mật độ tế bào vi sinh vật (CFU/ml) Tỉ lệ giống

cấy (%)

3

5

7

10 S.fradiae 2,8x108 5,1x109 4,2x109 3,7x109 B.velezensis 4,5x108 6,4x109 5,4x109 4,6x109 N.europea 3,8x107 2,3x108 5,5x108 4,2x108

Khi tỉ lệ tiếp giống nhỏ, tức lƣợng giống vi sinh vật ban đầu đƣa vào môi

trƣờng ít, thì vi sinh vật phải cần lƣợng thời gian nhất định (dài hơn) để tăng sinh

khối lên cực đại. Ở cùng một điều kiện nuôi cấy nếu tăng tỉ lệ tiếp giống thì thu

đƣợc sinh khối lớn hơn. Tuy nhiên, khi tăng tỉ lệ giống quá cao mà lƣợng dinh

dƣỡng trong môi trƣờng không thay đổi thì tốc độ nhân sinh khối ban đầu có tăng

nhanh hơn nhƣng về sau có sự cạnh tranh sử dụng dinh dƣỡng giữa các tế bào cùng

loài trong môi trƣờng, nên có thể một lƣợng sinh khối nhất định sẽ bị già nhanh hơn

và chết dần, làm cho tổng lƣợng sinh khối xu hƣớng giảm đi. Điều này đƣợc thể

hiện rất rõ thông qua đƣờng biểu diễn mật độ tế bào trong hình 3.11.

Hình 3.11. Mật độ vi sinh vật với các tỉ lệ tiếp giống khác nhau

91

Nhƣ vậy, tỉ lệ tiếp giống thích hợp đối với xạ khuẩn S.fradiae SHX.12 và vi

khuẩn B.velezensis SHV.22 là 5%, vi khuẩn N.europea SHV.OA7 là 7%. Kết quả

nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Phạm Thu Trang và cộng

sự (2014) về tỉ lệ tiếp giống đối với loài xạ khuẩn, phù hợp với kết quả nghiên cứu

của Đào Văn Thông (2012) về tỉ lệ tiếp giống đối với loài Bacillus, trùng với kết

quả nghiên cứu của Đào Thị Hồng Vân (2012) về tỉ lệ tiếp giống 7% đối với loài

Nitrosomonas trong lên men thu sinh khối vi sinh vật.

3.3.2.6. Tốc độ cấp khí

Oxy là nhu cầu cần thiết đối với vi sinh vật hiếu khí. Thiếu oxy vi sinh vật

hiếu khí bị kìm hãm sinh trƣởng. Nhu cầu oxy với mỗi vi sinh vật không giống nhau

(Nguyễn Văn Phƣớc, 2007), do đó cần xác định lƣợng oxy cần thiết cung cấp cho

từng vi sinh vật trong quá trình nhân sinh khối.

Thử nghiệm nhân sinh khối các chủng vi sinh vật ở các tốc độ cấp khí từ

0,25-1 lít không khí/lít môi trƣờng/phút, trong môi trƣờng dinh dƣỡng phù hợp, điều

kiện nhiệt độ, pH và thời gian thích hợp cho từng chủng nghiên cứu ở trên. Kết quả

thí nghiệm tốc độ cấp khí cho quá trình nhân sinh khối ba chủng vi sinh vật tuyển

chọn trong nồi lên men 5 lít thể hiện trong bảng 3.21.

Bảng 3.21. Sinh khối vi sinh vật nghiên cứu ở các tốc độ cấp khí khác nhau

Mật độ tế bào vi sinh vật Tốc độ cấp khí (lít không

khí/lít môi trƣờng/phút)

0,25

0,5

0,75

1 SHX.12 4,2x107 3,8x108 3,9x109 1,2x108 SHV.22 2,5x107 3,1x108 5,6x109 3,3x108 SHV.OA7 3,7x106 4,8x108 1,5x108 2,1x107

Với mức độ cấp khí 0,75lít không khí/lít môi trƣờng/phút thì xạ khuẩn S.fradiae SHX.12 và vi khuẩn B.velezensis SHV.22 có mật độ tế bào cao nhất (109

CFU/ml) sau thời gian lên men tƣơng ứng 3 và 2 ngày, trong khi vi khuẩn

N.europea SHV.OA7 sinh trƣởng phát triển tốt nhất khi đƣợc cấp 0,5lít không

92

khí/lít môi trƣờng/phút. Theo nghiên cứu của Ran Y. và cs (2010) N.europea là loài

vi hiếu khí và có thể hoạt động trong môi trƣờng có nồng độ oxy hòa tan thấp.

Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện rõ thông qua đƣờng biểu hiện mật độ tế

bào của ba chủng vi sinh vật nghiên cứu lên men ở các mức độ cấp khí khác nhau

trong thời gian, nhiệt độ, pH và môi trƣờng thích hợp với từng chủng.

Hình 3.12. Mật độ vi sinh vật nhân sinh khối ở tốc độ cấp khí khác nhau

Nhƣ vậy, tốc độ cấp khí 0,75lít không khí/lít môi trƣờng/phút là thích hợp

với chủng xạ khuẩn S.fradiae SHX.12 và vi khuẩn B.velezensis SHV.22, tốc độ

0,5lít không khí/lít môi trƣờng/phút thích hợp với chủng vi khuẩn N.europea

SHV.OA7. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đào Thị

Hồng Vân (2012) về tốc độ cấp khí cho loài Bacillus và loài Nitrosomonas.

3.3.2.7. Tối ƣu hóa điều kiện lên men chìm các vi sinh vật tuyển chọn

Theo nghiên cứu ở trên, mật độ tế bào của chủng S.fradiae SHX.12,

B.velezensis SHV.22 và N.europea SHV.OA7 chịu tác động của nhiều yếu tố.

Nhằm tìm ra điều kiện tối ƣu của các yếu tố ảnh hƣởng để thu đƣợc mật độ tế bào

lớn nhất, đề tài đã tiến hành tối ƣu các biến ảnh hƣởng theo phƣơng pháp hàm mong

đợi, sử dụng công cụ hỗ trợ tối ƣu là phần mềm Design Expert Version 9.0.6.2.

Các yếu tố nhƣ nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy có ảnh hƣởng đến mật độ tế

bào vi sinh vật trong quá trình lên men. Do vậy, trong nghiên cứu này đã chọn miền

khảo sát của các yếu tố điều kiện lên men để tiến hành tối ƣu mật độ tế bào vi sinh

vật đƣợc trình bày trong bảng 3.22.

93

Bảng 3.22. Miền khảo sát yếu tố điều kiện lên men thu sinh khối của các chủng vi

sinh vật tuyển chọn

Chủng vi sinh vật Nhiệt độ (0C)

S.fradiae SHX.12 34-40

B.velezensis SHV.22

N.europea SHV.OA7 Miền khảo sát điều kiện lên men thu sinh khối pH 6-8 6-8 7-9 Thời gian (giờ) 60-84 24-48 84-120 24-30 24-30

Trên cơ sở kết quả xác định miền khảo sát đối với các chủng vi sinh vật

nghiên cứu, tiến hành xác định và phân tích ma trận thực nghiệm đối với từng

chủng. Kết quả xác định ma trận thực nghiệm của chủng S.fradiae SHX.12,

B.velezensis SHV.22 và N.europea SHV.OA7 đƣợc tập hợp ở các bảng trong phụ

lục 4.

Kết quả xác định ma trận thực nghiệm cho thấy mật độ tế bào của chủng S.fradiae SHX.12 đạt cao nhất ở điều kiện nhiệt độ 370C, pH=7, thời gian nuôi cấy là 72 giờ (thí nghiệm 12) và thấp nhất ở nhiệt độ 340C, pH=6 và thời gian là 72 giờ

(thí nghiệm 9).

Chủng B.velezensis SHV.22 có kết quả xác định ma trận thực nghiệm với mật độ tế bào đạt cực đại ở thời gian 48giờ, nhiệt độ 300C và pH=7 (thí nghiệm 6), mật độ tế bào thấp nhất ở thời gian 24giờ, nhiệt độ 270C và pH=6 (thí nghiệm 3).

Đối với chủng N.europea SHV.OA7 kết quả xác định ma trận thực nghiệm

cho thấy mật độ tế bào chủng N.europea SHV.OA7 đạt cực đại ở thời gian 108giờ, nhiệt độ 300C và pH=8 (thí nghiệm 15), mật độ tế bào đạt thấp nhất ở thời gian 84 giờ, nhiệt độ 270C và pH=7 (thí nghiệm 13).

Phƣơng pháp hàm mong đợi cho phép đánh giá sự tác động đồng thời của

các yếu tố đến kết quả, dựa trên sự phân tích hồi quy đa điểm, từ đó tìm ra đƣợc một

phƣơng án có thể thu đƣợc kết quả cao nhất. Do vậy, các phƣơng án theo ma trận và

kết quả thu đƣợc trên thực nghiệm sẽ đƣợc phân tích theo phƣơng sai Anova của mô

hình đối với từng chủng (bảng 3.23, bảng 3.24 và bảng 3.25)

94

Bảng 3.23. Phân tích phƣơng sai Anova của mô hình đối với S.fradiae SHX.12

Thông số Phƣơng sai Chuẩn F Giá trị p (khả năng > F)

5724,71 < 0,0001 Mô hình 16,61

220,42 < 0,0001 A-Nhiệt độ 0,071

2612,01 < 0,0001 B-pH 0,84

3212,25 < 0,0001 C-Thời gian 1,036

43,01 0,00032 AB 0,014

83,19 0,00004 AC 0,027

2913,84 < 0,0001 0,939

15248,95 < 0,0001 4,916

13217,54 < 0,0001 4,26

9555,58 < 0,0001 BC A2 B2 C2 3,08

0,887 Không tƣơng thích 0,0003 0,21

Phƣơng sai Anova của mô hình cho phép kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số

và sự thích ứng của mô hình đƣợc tiến hành bằng phân tích hồi quy (bảng 3.23). Kết

quả nhận thấy chủng S.fradiae SHX.12, chuẩn F của mô hình bằng 5724,71 cho

thấy mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê, với độ tin cậy 99,99% (p< 0,0001). Sự

có nghĩa của các hệ số hồi quy đƣợc kiểm định bởi chuẩn F, các giá trị p< 0,05 cho

biết các hệ số hồi quy đều có nghĩa. Chuẩn F của mô hình còn cho biết giá trị không

tƣơng thích của mô hình là 0,21 (p=0,887), cho thấy mô hình hoàn toàn tƣơng thích

với thực nghiệm.

Bảng 3.24. Phân tích phƣơng sai Anova của mô hình đối với B.velezensis SHV.22

Phƣơng sai Chuẩn F Giá trị p (khả năng > F) Thông số

Mô hình 11,19 9460,50 < 0,0001

A-Nhiệt độ 0,130 991,67 < 0,0001

B-pH 0,305 2318,64 < 0,0001

C-Thời gian 2,65 20165,29 < 0,0001

AB 0,195 1487,60 < 0,0001

95

0,007 55,26 0,00015 AC

0,0014 10,28 0,01492

0,131 994,90 < 0,0001

6,571 50010,73 < 0,0001

0,764 5813,13 < 0,0001 BC A2 B2 C2

Không tƣơng thích 0,00013 0,23 0,874

Đối với chủng B.velezensis SHV.22 chuẩn F của mô hình là 9460,50 (bảng

3.24) cho thấy mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,99% (p <

0,0001). Giá trị không tƣơng thích của mô hình là 0,23 (p= 0,874˃0,5), cho thấy mô

hình hoàn toàn tƣơng thích với thực nghiệm.

Bảng 3.25. Phân tích phƣơng sai Anova của mô hình đối với N.europea SHV.OA7

Phƣơng sai Chuẩn F Giá trị p (khả năng > F) Thông số

3,911 2701,29 < 0,0001 Mô hình

0,3355 2085,47 < 0,0001 A-Nhiệt độ

0,0014 8,56 0,0221 B-pH

1,016 6317,88 < 0,0001 C-Thời gian

0,008 47,19 0,00024 AB

0,143 887,41 < 0,0001 AC

0,118 734,45 < 0,0001

0,902 5605,08 < 0,0001

0,969 6025,76 < 0,0001

0,204 1267,59 < 0,0001 BC A2 B2 C2

0,923 Không tƣơng thích 0,00011 0,15

Phân tích phƣơng sai Anova của mô hình đối với chủng N.europea

SHV.OA7, chuẩn F của mô hình là 2701,29 (bảng 3.25) cho thấy mô hình hoàn toàn

có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,99% (p< 0,0001). Giá trị không tƣơng thích

của mô hình là 0,15 (p=0,923˃0,5), cho thấy mô hình hoàn toàn tƣơng thích với

thực nghiệm.

96

Từ kết quả phân tích trên, thiết lập đƣợc phƣơng trình hồi quy đối với ba

chủng vi sinh vật nghiên cứu nhƣ sau:

+ Phƣơng trình hồi quy của chủng S.fradiae SHX.12:

Y = 9,73 + 0,0943 A + 0,324 B + 0,360 C – 0,0589 AB – 0,0819 AC + 0,485 BC – 1,08 A2 – 1,01 B2 – 0,855 C2

+ Phƣơng trình hồi quy của chủng B.velezensis SHV.22:

Y = 9,69 + 0,128 A + 0,195 B + 0,575 C – 0,221 AB – 0,0426 AC + 0,0184 BC – 0,176 A2 - 1,25 B2 – 0,426 C2

+ Phƣơng trình hồi quy của chủng N.europea SHV.OA7:

Y = 8,56 + 0,205 A + 0,0131 B + 0,356 C – 0,0436 AB + 0,189 AC – 0,172 BC – 0,463 A2 – 0,480 B2 – 0,220 C2

Lần lƣợt xem xét ảnh hƣởng tác động đồng thời của 3 yếu tố (nhiệt độ,

pH, thời gian nuôi cấy) đến mật độ tế bào của chủng S.fradiae SHX.12 (hình

3.13a), B.velezensis SHV.22 (hình 3.11b) và N.europea SHV.OA7 (hình 3.11c)

cho thấy cả yếu tố nhiệt độ (A), pH (B) và thời gian nuôi cấy (C) có ảnh hƣởng

đến mật độ tế bào của các chủng vi sinh vật nghiên cứu.

(a) (b) (c)

Hình 3.13. Ảnh hƣởng của các yếu tố lên men đến mật độ tế bào vi sinh vật

Hình 3.13a cho thấy đối với chủng S.fradiae SHX.12, giá trị A- nhiệt độ có

tác động lớn nhất (mật độ tế bào thay đổi rất rõ rệt khi nhiệt độ tăng hoặc giảm), sau

đó đến giá trị B- pH và giá trị C-thời gian có tác động ít nhất.

Đối với chủng B.velezensis SHV.22 thì yếu tố giá trị B-pH có tác động lớn

nhất sau đó đến yếu tố C-thời gian và giá trị A-nhiệt độ tác động ít nhất (hình

3.13b).

97

Chủng N.europea SHV.OA7 thì yếu tố giá trị A-nhiệt độ có tác động lớn

nhất sau đó đến yếu tố C-thời gian và B-pH có tác động ít nhất (hình 3.13c)

Bên cạnh đó, đề tài cũng xem xét sự tƣơng tác của các cặp yếu tố tới hàm

mục tiêu mật độ tế bào vi sinh vật, có thể thấy qua các đồ thị 3D-bề mặt đáp ứng.

Hình 3.14. Bề mặt đáp ứng của mật độ tế bào chủng xạ khuẩn S.fradiae SHX.12

Hình 3.15. Bề mặt đáp ứng của mật độ tế bào chủng B.velezensis SHV.22

Hình 3.16. Bề mặt đáp ứng của mật độ tế bào chủng N.europea SHV.OA7

Trong các đồ thị này, mật độ tế bào tăng dần từ mầu xanh đến màu vàng và

màu đỏ biểu thị mật độ tế bào cao nhất.

98

Sử dụng phƣơng pháp hàm kỳ vọng để tối ƣu hóa mật độ tế bào của chủng

S.fradiae SHX.12, B.velezensis SHV.22 và N.europea SHV.OA7 bằng phần mềm

qui hoạch thực nghiệm Design expert. Kết quả tìm đƣợc phƣơng án tốt nhất để cực

đại hàm mục tiêu đối với các chủng vi sinh vật nghiên cứu nhƣ sau:

Bảng 3.26. Kết quả tối ƣu các yếu tố lên men đối với chủng vi sinh vật nghiên cứu

Mật độ tế bào cƣc pH Chủng vi sinh vật Nhiệt độ (0C) Thời gian (giờ) đại (log CFU/ml)

9,79 S.fradiae SHX.12 37,1

B.velezensis SHV.22 9,79

7,4 6,9 7,7 N.europea SHV.OA7 27,6 27,8 76,2 38,4 99,2 8,64

Với phƣơng án tối ƣu này, thì mật độ tế bào chủng S.fradiae SHX.12 (hình

3.17a), B.velezensis SHV.22 (hình 3.17b) và N.europea SHV.OA7 (hình 3.17c) thu

đƣợc đối với 3 yếu tố ảnh hƣởng (thời gian, nhiệt độ, pH) đều đạt 100% nhƣ mong

muốn, và mục tiêu về mật độ tế bào cũng đạt 100% mong muốn và mục tiêu chung

cũng đạt 100% nhƣ mong muốn.

(a) (b) (c)

Hình 3.17. Mức độ đáp ứng sự mong đợi đối với các chủng vi sinh vật nghiên cứu

Từ những kết quả nghiên cứu trên, đề tài đã thiết lập đƣợc điều kiện lên men

thu sinh khối vi sinh vật bao gồm các thông số đƣợc tổng hợp trong bảng 3.27.

Do các thiết bị nhân sinh khối không điều chỉnh đƣợc con số tuyệt đối nhƣ

trong mô hình tối ƣu, đề tài thiết lập các thông số kỹ thuật bằng cách làm tròn số

theo giá trị gần điểm tối ƣu nhất.

99

Bảng 3.27. Điều kiện lên men thu sinh khối vi sinh vật

Chủng vi sinh vật

Điều kiện lên men S.fradiae B.velezensis N.europea

SHX.12 SHV.22 SHV.OA7

7,4 7,0 7,7

37 pH Nhiệt độ (0C) 28 28

76 Thời gian (giờ) 38 99

5 Tỷ lệ cấp giống (%) 5 7

Môi trƣờng SX2 Winogradsky

Lƣu lƣợng cấp không khí (lít 0,75 0,75 0,5 không khí/lít môi trƣờng/phút)

Thử nghiệm lên men các chủng vi sinh vật nghiên cứu theo các điều kiện

thông số (bảng 3.27) trong thiết bị lên men dung tích 30 lít. Sinh khối các vi sinh vật sau lên men chìm có mật độ đạt 5,9x109 CFU/ml đối với S.fradiae SHX.12 đạt 6,1x109 CFU/ml đối với B.velezensis SHV.22 và đạt 4,2x108 MPN/ml đối với

N.europea SHV.OA7. Nhƣ vậy, mật độ tế bào trong thực nghiệm không chênh lệch

nhiều so với trong lý thuyết, nên khẳng định rằng mô hình thống nhất với thực

nghiệm và hoàn toàn phù hợp cho quá trình lên men nhân sinh khối trong sản xuất.

3.3.3. Nhân sinh khối vi sinh vật trên giá thể rắn

Nhằm tạo chế phẩm dạng bột, thuận tiện cho vận chuyển và sử dụng, đề tài tiến

hành nghiên cứu nhân sinh khối các chủng vi sinh vật trên giá thể rắn.

3.3.3.1. Lựa chọn chất mang sinh khối

Với mục đích sử dụng chế phẩm xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn, nên

việc lựa chọn chất mang rất quan trọng. Chất mang phải hạn chế tối đa mức độ gây

thêm ô nhiễm cho nƣớc thải cần xử lý. Đề tài đã lựa chọn tinh bột sắn (C6H10O5)n và

cao lanh (Al2O3.2SiO2.2H2O) làm chất mang thử nghiệm trong lên men xốp các vi

sinh vật tuyển chọn vì khả năng keo tụ các phần tử lơ lửng ở trong nƣớc thải và

không làm gia tăng mức độ ô nhiễm hữu cơ của nƣớc thải.

100

Kết quả thí nghiệm xác định chất mang thích hợp trong lên men xốp đƣợc

tổng hợp trong bảng 3.28.

Bảng 3.28. Sinh khối vi sinh vật sau 5 ngày lên men xốp với chất mang khác nhau.

Mật độ vi sinh vật (CFU/g)

Chất mang S.fradiae B.velezensis N.europea

Cao lanh

Tinh bột sắn SHV.OA7 5,3 x 109 1,6 x 108 SHX.12 1,4 x 108 3,5 x 109 SHV.22 3,2 x 108 5,2 x 109

Đối với chất mang cao lanh sau 5 ngày nuôi cấy lên men xốp, mật độ vi khuẩn N.europea SHV.OA7 đạt cao nhất là 5,3x109 MPN/g, trong khi với tinh bột

sắn thì xạ khuẩn S.fradiae SHX.12 và vi khuẩn B.velezensis SHV.22 đạt mật độ ≥109 CFU/g. Nhƣ vậy tinh bột là chất mang phù hợp với chủng S.fradiae SHX.12

và B.velezensis SHV.22, cao lanh là chất mang phù hợp vơi chủng N.europea

SHV.OA7. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Đào Thị Hồng Vân

(2012) về chất mang trong sản xuất chế phẩm đối với loài Nitrosomonas.

3.3.3.2. Xác định tỉ lệ tiếp giống

Kết quả nghiên cứu tỷ lệ tiếp giống từ sinh khối lên men chìm các vi sinh vật

tuyển chọn cho quá trình lên men xốp đƣợc trình bày trong bảng 3.29 cho thấy với tỷ lệ tiếp giống 5%, mật độ các vi sinh vật nghiên cứu chỉ đạt 107 CFU/g, trong khi

tỷ lệ tiếp giống ở công thức 10-20%, mật độ các vi sinh vật nghiên cứu luôn đạt ≥109 CFU/g, giữa các công thức thí nghiệm không có sự chênh lệch đáng kể.

Bảng 3.29. Sinh khối vi sinh vật sau 5 ngày lên men xốp ở các tỷ lệ tiếp giống

Mật độ vi sinh vật (CFU/g) với tỷ các tỷ lệ tiếp giống Tên vi sinh vật

S.fradiae SHX.12

B.velezensis SHV.22

N. europea SHV.OA7 5/100 6,2 x 107 4,1 x 107 2,3 x 107 10/100 3,1 x 109 4,8 x 109 4,5 x 109 15/100 4,2 x 109 5,2 x 109 5,8 x 109 20/100 5,3 x 109 6,1 x 109 5,9 x 109

Từ kết quả nghiên cứu này có thể xác định tỷ lệ tiếp giống phù hợp cho quá

trình lên men xốp của các vi sinh vật nghiên cứu là 10%.

101

3.3.3.3. Thời gian nhân sinh khối trong lên men xốp

Kết quả xác định thời gian nhân sinh khối trong lên men xốp của các chủng

nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 3.30 cho thấy xạ khuẩn S.fradiae SHX.12, vi khuẩn B.velezensis SHV.22 trên chất mang tinh bột sắn đạt mật độ ≥109 CFU/g sau

ba và hai ngày nhân sinh khối tƣơng ứng với từng chủng, vi khuẩn N.europea SHV.OA7 đạt mật độ ≥109 CFU/g sau bốn ngày nhân sinh khối trên chất mang cao

lanh. Nhƣ vậy thời gian phù hợp cho thu sinh khối các vi sinh vật nghiên cứu là 2

ngày đối với B.velezensis SHV.22, là 3 ngày đối với S.fradiae SHX.12 và 4 ngày

đối với N.europea SHV.OA7.

Bảng 3.30. Sinh khối vi sinh vật nghiên cứu trên giá thể rắn

Mật độ tế bào (CFU/g) sau thời gian lên men xốp Chủng VSV

S.fradiae SHX.12

1 ngày 2,3 x 108 3,6 x 108 B.velezensis SHV.22 N.europea SHV.OA7 2,6 x 107 2 ngày 3,5 x 108 3,8 x 109 3,2 x 107 3 ngày 3,9 x 109 4,5 x 109 3,9 x 108 4 ngày 4,2 x 109 5,0 x 109 4,1 x 109 5 ngày 5,7 x 109 5,9 x 109 4,6 x 109

3.3.4. Chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các yếu tố thích hợp cho quá trình nhân sinh

khối của các chủng vi sinh vật nhƣ pH, nhiệt độ, thời gian, môi trƣờng lên men,

lƣợng khí cấp. Qui trình tạo chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột

sắn tóm tắt theo sơ đồ trong hình 3.18 gồm các công đoạn chính nhƣ sau:

Nhân sinh khối dạng lỏng

Ba chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy cấp 1 trong bình tam giác chứa 100-

150ml môi trƣờng và ở điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp, lắc 150v/p trong thời gian

24-48 giờ sau đó chuyển sang bình lên men cấp 2 dung tích 5 lít với tỉ lệ tiếp giống

5% đối với S.fradiae SHX.12 và B.velezensis SHV.22, tỉ lệ tiếp giống 7% đối với

N.europea SHV.OA7. Chủng B.velezensis SHV.22 đƣợc lên men cấp 2 trong 38giờ, điều kiện pH 7, nhiệt độ 280C, đối với chủng S.fradiae SHX.12 thời gian lên men cấp 2 là 76giờ, điều kiện pH 7,4; nhiệt độ 370C, chủng N.europea SHV.OA7 thời gian lên men cấp 2 là 99giờ, điều kiện pH 7,7 ở nhiệt độ 280C.

102

VSV chuyển hóa Nitơ (N.europea SHV.OA7)

VSV chuyển hóa Phosphat (B.velezensis SHV.22)

VSV chuyển hóa cacbon (S.fradiae SHX.12)

Kiểm tra hoạt tính

Kiểm tra hoạt tính

Nhân giống cấp 1 (Gause; 370C; pH 7.4; 150v/p, 48giờ

Nhân giống cấp 1 (ammonium; 280C; pH7.7; lắc 150v/p, 48giờ

Nhân giống cấp 1 (NB, 280C; pH 7; lắc 150v/p, 24giờ

Nhân sinh khối cấp 2 (SX2; 280C; pH 7; 38 giờ; 5%; 0,75lít kk/lít mt/phút)

Nhân sinh khối cấp 2 (Winogradsky; 280C; pH7,7; 99giờ; 7%; 0,5lít kk/lít mt/p)

Nhân sinh khối cấp 2 (SX2; 370C; pH 7,4; 76 giờ; 5%; 0,75lít kk/lít mt/phút) ),

Lên men xốp (tinh bột 99%; rỉ đƣờng 1%), 3 ngày, 10%

Lên men xốp (tinh bột 99%; rỉ đƣờng 1%), 2 ngày, 10%

Lên men xốp (cao lanh 99%; CaCO3 1%), 4ngày, 10%

Kiểm tra hoạt tính

Phối trộn hỗn hợp theo tỉ lệ 1:1:1

Kiểm tra chất lƣợng mật độ vsv ≥ 108 CFU/g

Bao gói thành phẩm và bảo quản

Hình 3.18. Sơ đồ tạo chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn

103

Lên men xốp

Sử dụng tinh bột sắn đã khử trùng đối với S.fradiae SHX.12 và B.velezensis

SHV.22, cao lanh đã khử trùng đối với N.europea SHV.OA7. Dịch sinh khối vi sinh

vật sau lên men cấp 2 đƣợc bổ sung vào thùng chứa 10 kg giá thể rắn với tỉ lệ dịch

10%. Thời gian lên men xốp của chủng B.velezensis SHV.22 là 2 ngày ở điều kiện nhiệt độ 280C, chủng S.fradiae SHX.12 là 3 ngày ở nhiệt độ 370C và đối với N.europea SHV.OA7 là 4 ngày trong điều kiện nhiệt độ 280C.

Tạo chế phẩm

Chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn đƣợc tạo thành

bằng cách phối trộn sinh khối các vi sinh vật sau khi kết thúc lên men xốp. Kế thừa

các kết quả nghiên cứu trƣớc đây của Viện Môi trƣờng Nông nghiệp, đề tài đã lựa

chọn tỉ lệ phối trộn ba chủng vi sinh vật nghiên cứu theo tỷ lệ 1:1:1 sau lên men

xốp. Hỗn hợp sau khi phối trộn đƣợc kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật và đóng gói

trong túi polyetylen tráng thiếc với khối lƣợng 200 g/túi.

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu về điều kiện nhân sinh khối các chủng vi

sinh vật lựa chọn trên thiết bị lên men chìm và lựa chọn chất mang thích hợp đề tài

đã sản xuất thử thành công chế phẩm vi sinh vật với tên MIC-CAS 02. Chế phẩm

chứa ba loại vi sinh vật gồm S.fradiae SHX.12, B.velezensis SHV.22 và N.europea

SHV.OA7. Kết quả kiểm tra chất lƣợng chế phẩm đƣợc trình bày trong bảng 3.31.

Bảng 3.31. Chất lƣợng chế phẩm MIC-CAS 02

Mật độ tế bào (CFU/g) TT Chủng vi sinh vật Hoạt tính sinh học sau 3 tháng bảo quản

Chuyển hóa xenlulo, 1 S.fradiae SHX.12 4,7x108 tinh bột

3-

Chuyển hóa Phosphat 2 B.velezensis SHV.22 4,1x108 hữu cơ, đồng hóa PO4

Chuyển hóa hợp chất 3 N.europea SHV.OA7 3,2 x108 Nitơ

104

Kết quả bảng 3.31 cho thấy chế phẩm MIC-CAS 02 chứa các chủng vi sinh vật có mật độ tế bào đạt 108 CFU/g sau 3 tháng bảo quản, đáp ứng yêu cầu về sản

xuất chế phẩm vi sinh vật.

3.4. Xây dựng qui trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế biến

tinh bột sắn

Theo kết quả phân tích các chỉ số trong nƣớc thải sau xử lý biogas của cơ sở sản

xuất tinh bột sắn (bảng 3.1), một số chỉ tiêu vƣợt ngƣỡng cho phép nhƣ Nts, Pts và

đặc biệt là hợp chất hữu cơ (biểu hiện qua hàm lƣợng BOD5 và COD). Cũng theo

kết quả ở phần phân lập và tuyển chọn, các chủng vi sinh vật lựa chọn có hoạt tính

chuyển hoá hợp chất cacbon, chuyển hóa Nitơ và Phospho. Chính vì vậy, bổ sung

thêm chế phẩm có chứa những vi sinh vật đƣợc tuyển chọn có hoạt lực chuyển hoá

cao để tăng hiệu quả xử lý là việc cần thiết.

Nhằm đánh giá khả năng làm sạch nƣớc thải của chế phẩm MIC-CAS 02, đề tài

đã thử nghiệm bằng cách sử dụng chế phẩm vi sinh vật đƣợc sản xuất (phần 3.3.4)

xử lý nƣớc thải trong phòng thí nghiệm trên hệ thống xử lý gián đoạn quy mô 80

lít/mẻ. Sau thời gian xử lý 3 ngày, phân tích chỉ số COD và BOD5 kết quả đƣợc

tổng hợp trong bảng 3.32.

Bảng 3.32. Hiệu quả xử lý chất hữu cơ trong nƣớc thải của chế phẩm MIC-CAS 02

ở qui mô 80 lít

COD (mg/lít) Tỉ lệ Tỉ lệ BOD5(mg/l)

giảm giảm Công thức COD Ban Ngày Ngày Ngày Ban Ngày Ngày Ngày BOD5 thí nghiệm sau 3 sau 3 đầu 1 2 3 đầu 1 2 3

ngày(%) ngày(%)

Không chế 347,6 342,5 315,6 301,2 13,4 281,5 272,6 261,3 244,8 13,1 phẩm

Có chế 347,6 274,9 191,8 82,9 76,2 281,5 219,2 136,6 28,9 89,7 phẩm

105

Số liệu kết quả bảng 3.32 cho thấy việc bổ sung chế phẩm MIC-CAS 02 đã

cải thiện rõ rệt hiệu quả xử lý chất hữu cơ trong nƣớc thải. Sau 3 ngày xử lý hàm

lƣợng COD, BOD5 trong nƣớc thải tinh bột sắn giảm 76,2%, và 89,7% so với nƣớc

thải trƣớc xử lý. Trong khi đó, mẫu đối chứng không bổ sung chế phẩm, chỉ sục khí

để hoạt hóa hệ vi sinh vật có sẵn trong nƣớc thải nên hiệu quả xử lý kém, chỉ giảm

13,1% sau 3 ngày xử lý và hàm lƣợng COD trong nƣớc thải vẫn cao hơn so với mốc

2 ngày khi có chế phẩm. Do vậy, việc bổ sung chế phẩm vào trong quá trình xử lý là

cần thiết để rút ngắn thời gian ổn định của hệ thống và nâng cao hiệu suất xử lý.

Cũng theo kết quả thí nghiệm xử lý gián đoạn ở bảng 3.32 nhận thấy tỷ lệ

COD giảm ở ngày thứ 1 thấp nhƣng tăng dần vào các ngày tiếp theo. Điều đó chứng

tỏ, khi mới bổ sung chế phẩm vào vi sinh vật chƣa kịp thích nghi với môi trƣờng

mới và theo thời gian vi khuẩn thích nghi dần nên hàm lƣợng COD giảm nhanh

hơn. Do đó, nếu đƣợc vận hành liên tục, thời gian hoạt hóa dài hơn, vi sinh vật thích

nghi hoàn toàn với môi trƣờng thì khả năng làm sạch nƣớc sẽ cao hơn.

Tiến hành phân tích hàm lƣợng Nts, Pts, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Bảng 3.33. Hiệu quả xử lý Nts, Pts của chế phẩm MIC-CAS 02 ở qui mô 80 lít

Tỷ lệ Tỷ lệ Hàm lƣợng Nts (mg/l) Hàm lƣợng Pts (mg/l)

giảm giảm Công thức sau 3 sau 3 Ban Ngày Ngày Ngày Ban Ngày Ngày Ngày thí nghiệm ngày ngày đầu 1 2 3 đầu 1 2 3

(%) (%)

Không bổ

sung chế 58,6 52,8 46,2 39,4 32,7 16,1 14,8 12,9 10,3 34,7

phẩm

Có bổ

sung chế 58,6 49,2 35,1 17,3 70,4 16,1 12,4 6,9 3,8 74,2

phẩm

106

Kết quả xử lý thử nghiệm (bảng 3.33) cho thấy việc bổ sung chế phẩm MIC-

CAS 02 đã tác động tích cực đến hiệu quả chuyển hóa Nitơ và Phospho trong nƣớc

thải:

Sau 3 ngày xử lý gián đoạn, hàm lƣợng Nts trong nƣớc thải đã giảm đƣợc

70,4% (từ 58,6 mg/l ban đầu xuống 17,3 mg/l). Trong khi đó, mẫu đối chứng không

bổ sung chế phẩm, chỉ sục khí để hoạt hóa hệ vi sinh vật có sẵn trong nƣớc thải nên

hiệu quả xử lý kém hơn (giảm 32,7% sau 5 ngày xử lý). Hàm lƣợng Pts trong nƣớc

thải đã giảm đƣợc 74,2% (từ 16,1 mg/l ban đầu xuống 3,8 mg/l). Mẫu đối chứng

không bổ sung chế phẩm, chỉ sục khí để hoạt hóa hệ vi sinh vật có sẵn trong nƣớc

thải nên hiệu quả xử lý kém hơn (giảm 34,7% sau 3 ngày xử lý).

Nhƣ vậy, hệ thống thử nghiệm xử lý gián đoạn cho thấy khi bổ sung chế

phẩm MIC-CAS 02 đã cải thiện rõ rệt hiệu quả làm sạch nƣớc thải so với không bổ

sung chế phẩm (chỉ hoạt hóa hệ vi sinh vật có sẵn trong nƣớc). Kết quả nghiên cứu

này đã mở ra xu hƣớng xử lý tiếp theo của đề tài, đó là cần bổ sung chế phẩm trong

quá trình thử nghiệm xử lý (làm sạch nƣớc thải).

Với những kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy chế phẩm MIC-CAS 02 thích

hợp cho việc xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn. Trong quá trình xử lý thử

nghiệm, đề tài đã cấp khí để lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc khoảng 6 mg/l, chế phẩm bổ sung hàng ngày cố định với lƣợng khoảng 104 CFU/ml, không có bùn hoạt tính

khởi động, không chờ hệ thống hoạt động ổn định và không điều chỉnh các yếu tố

khác nhƣ pH, thời gian lƣu nên hiệu quả xử lý chƣa cao.

Để xây dựng đƣợc quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật làm sạch nƣớc

thải, để nâng cao hiệu suất xử lý và ứng dụng trong thực tiễn, đề tài đã tiến hành

nghiên cứu các yếu tố có ảnh hƣởng đến quá trình xử lý và có thể điều chỉnh đƣợc,

đó là pH, thời gian lƣu của nƣớc thải, oxy hòa tan và lƣợng chế phẩm bổ sung.

3.4.1. Ảnh hƣởng của pH nƣớc thải đến hiệu suất xử lý

Qua xác định chỉ tiêu pH trong nƣớc cho thấy pH nƣớc thải luôn ở trạng thái

kiềm nhẹ (pH từ 7,5-7,6). Trong khi đó, chủng vi sinh vật để tạo chế phẩm MIC-

107

CAS 02 (S.fradiae SHX.12, B.velezensis SHV.22, N.europea SHV.OA7) theo khảo

sát ở phần 3.3.2.2 thì hoạt động tốt ở pH từ 7-8.

Kết quả phân tích chất lƣợng nƣớc thải của cơ sơ chế biến tinh bột sắn (bảng

3.1) cho thấy giá trị pH nằm trong vùng trung tính (pH=7,6) nên ở các nghiên cứu

tiếp theo không cần điều chỉnh pH trƣớc khi xử lý.

3.4.2. Ảnh hƣởng của oxy hòa tan đến hiệu suất xử lý

Trong nƣớc thải ô nhiễm hữu cơ, oxy hòa tan thƣờng rất thấp, nguyên nhân

chủ yếu do vi sinh vật hiếu khí đã sử dụng oxy để oxy hóa hợp chất hữu cơ. Chế

phẩm MIC-CAS 02 chứa các chủng hiếu khí gồm S.fradiae SHX.12, B.velezensis

SHV.22, N.europea SHV.OA7, chính vì vậy trong quá trình xử lý cần phải cung cấp

oxy bằng cách khuấy và sục khí. Tuy nhiên, để cung cấp oxy vào trong bể xử lý cần

phải tiêu tốn nhiều năng lƣợng, chi phí xử lý sẽ cao và khó ứng dụng thực tế. Do đó,

đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của oxy hòa tan đến hiệu suất xử lý để làm

cơ sở cho những nghiên cứu về sau.

Trong nghiên cứu này, oxy đƣợc cung cấp bằng máy sục 1 vòi, với oxy hòa

tan trong nƣớc khoảng 3,9±0,2 mg/l (tƣơng đƣơng 0,5 lít không khí/lít nƣớc

thải/phút) và máy sục 2 vòi, với oxy hòa tan trong nƣớc khoảng 6,0±0,3 mg/l (tƣơng

đƣơng 0,8 lít không khí/lít nƣớc thải/phút). Các điều kiện xử lý khác không thay

đổi, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Bảng 3.34. Ảnh hƣởng của oxy hòa tan (DO) đến hiệu suất xử lý

DO Thời gian sục khí (giờ) Giá trị xác

(mg/l) định 4 8 12 0

COD (mg/l) 352,4±5,9 251,6±3,6 102,9±2,7 93,1±2,1 6,0±0,3 Hiệu suất (%) 28,6 70,8 73,6 -

COD (mg/l) 352,4±5,9 263,6±1,5 165,9±3,0 127,6±2,1 3,9±0,2 Hiệu suất (%) 25,2 58,9 63,8 -

Qua số liệu bảng 3.34 cho thấy oxy hòa tan trong nƣớc khoảng 6,0 mg/l thì

hiệu suất làm sạch nƣớc thải ở trạng thái hệ thống sục khí vận hành sau 12 giờ là

73,6%. Nhƣng khi oxy hòa tan trong nƣớc thải giảm xuống khoảng 3,9 mg/l thì hiệu

108

suất tƣơng ứng là 63,8%. Nhƣ vậy, oxy hòa tan trong nƣớc đã có tác dụng rõ rệt đến

hiệu quả xử lý; DO=6,0 mg/l thì hiệu quả xử lý cao hơn DO=3,9 mg/l. Vì vậy, trong

quá trình xử lý, cần phải cung cấp đủ oxy để vi sinh vật hiếu khí oxy hóa hoàn toàn

hợp chất hữu cơ và tăng hiệu suất xử lý.

Bảng 3.34 cũng cho thấy thời gian sục khí 12 giờ hiệu suất xử lý cao không

đáng kể so với thời gian sục khí là 8 giờ, vì vậy để tiếp kiệm chi phí đề tài đã lựa

chọn thời gian sục khí là 8 giờ trong nghiên cứu tiếp theo.

3.4.3. Ảnh hƣởng của thời gian lƣu nƣớc thải đến hiệu suất xử lý

Trong xử lý nƣớc thải, thời gian lƣu của nƣớc thải trong bể xử lý hiếu khí

cũng là một yếu tố quan trọng vì nó tác động đến hiệu suất xử lý và chi phí vận

hành. Nếu thời gian lƣu ngắn thì vi sinh vật không kịp oxy hóa hoàn toàn hợp chất

hữu cơ, hiệu suất xử lý sẽ kém. Nhƣng nếu lƣu quá dài sẽ tốn năng lƣợng cấp khí và

xảy ra hiện tƣợng tan bùn, thậm chí tảo phát triển. Do đó, cần phải xác định đƣợc

thời gian lƣu phù hợp.

Trong thí nghiệm này, thay đổi thời gian lƣu 24, 36, 48, 60, 72 giờ; các điều

kiện khác không thay đổi. Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện ở hình 3.19.

Hình 3.19. Ảnh hƣởng của thời gian lƣu nƣớc đến hiệu suất xử lý

Qua nghiên cứu về thời gian lƣu của nƣớc, nhận thấy khi tăng thời gian lƣu

nƣớc thải trong bể xử lý thì hiệu suất xử lý cũng tăng theo. Điều này đƣợc giải thích

là với lƣợng hữu cơ dồi dào trong nƣớc thải, mật độ vi sinh vật ban đầu và hoạt tính

của chúng không thay đổi thì vi sinh vật sẽ cần một khoảng thời gian nhất định để

phân hủy chúng, mặt khác vi sinh vật sẽ nhân lên về số lƣợng và quá trình chuyển

109

hóa đƣợc thúc đẩy nhanh hơn. Nếu nhƣ thời gian lƣu thấp, vi sinh vật sẽ không đủ

số lƣợng và không tiêu thụ đƣợc hết nguồn dinh dƣỡng sẵn có trong nƣớc thải nên

tỷ lệ chất hữu cơ (đánh giá qua hàm lƣợng COD) giảm ít và ngƣợc lại.

Kết quả thí nghiệm với 3 lần xử lý cho thấy thời gian lƣu tăng 24-72 giờ thì

hiệu suất xử lý cũng tăng theo, nhƣng mức độ hiệu suất xử lý tăng nhanh nhất 24-48

giờ. Với thời gian lƣu 60-72 giờ mức độ tăng của hiệu suất xử lý không nhiều (hình

3.19).

Cũng theo kết quả hình 3.19, hiệu suất xử lý ở thời gian lƣu 48 giờ không

chênh lệch nhiều so với thời gian lƣu 36 giờ, nên đề tài chọn thời gian lƣu là 36 giờ

để tiết kiệm thời gian và chi phí, khi hệ thống đi vào hoạt động ổn định thì hiệu suất

sẽ tăng lên.

3.4.4. Ảnh hƣởng của lƣợng chế phẩm bổ sung

Qua các thí nghiệm ở phần 3.4 đã cho thấy khi không bổ sung chế phẩm thì

hệ vi sinh vật có sẵn trong nƣớc thải vẫn đảm nhận đƣợc vai trò xử lý, tuy nhiên

hiệu quả xử lý không cao, thời gian xử lý kéo dài. Đồng thời cũng chứng minh rằng,

bổ sung chế phẩm trong quá trình xử lý nhằm mục đích tích lũy và kích hoạt vi sinh

vật có trong chế phẩm, để rút ngắn thời gian ổn định của hệ thống và tăng hiệu quả

làm sạch nƣớc.

Ở nghiên cứu này, thay đổi lƣợng chế phẩm MIC-CAS 02 bổ sung vào môi trƣờng xử lý tƣơng ứng với hàm lƣợng 1, 10, 100 và 1000 g chế phẩm/m3 nƣớc thải để mật độ vi khuẩn đƣợc bổ sung là 102, 103, 104 và 105 CFU/ml. Các thông số khác

không thay đổi.

Hình 3.20. Ảnh hƣởng của lƣợng chế phẩm bổ sung đến hiệu quả xử lý

110

Kết quả hình 3.20 cho thấy, xu hƣớng chung là khi tăng lƣợng chế phẩm bổ

sung vào môi trƣờng xử lý thì hàm lƣợng COD giảm nhanh hơn. Tuy nhiên, khi mật độ tế bào là 105 CFU/g thì hiệu quả xử lý thấp hơn ở mật độ 104 CFU/g. Nguyên

nhân là do khi mật độ tế bào tăng mà dinh dƣỡng môi trƣờng không tăng thì sẽ có

sự cạnh tranh về dinh dƣỡng giữa các vi sinh vật, dẫn đến kìm hãm hoạt động của vi

sinh vật, hiệu quả xử lý thấp.

Nhƣ vậy, bổ sung chế phẩm với lƣợng 100g/m3 hay 0,1kg/m3 nƣớc thải

(tƣơng đƣơng 104 CFU/g) là phù hợp nhất.

Qua quá trình thử nghiệm xử lý ở qui mô phòng thí nghiệm, kết quả cho thấy

chế phẩm MIC-CAS 02 đã nâng cao hiệu xuất xử lý (thông qua hàm lƣợng BOD5 và

COD, Nts và Pts). Nhƣ vậy chế phẩm MIC-CAS 02 thích hợp cho xử lý nƣớc thải

tinh bột sắn.

Đề tài đề xuất quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải chế

Bƣớc 1

Xác định thông số qui mô nƣớc thải sau biogas (pH, BOD5, COD, Nts, Pts...)

Bƣớc 2

Xác định lƣợng chế phẩm bổ sung (tƣơng ứng 0,1 kg chế phẩm/m3nƣớc thải)

Bƣớc 3

Hoạt hóa tạo dịch chế phẩm (chế phẩm+20 lít nƣớc thải +0,1% rỉ đƣờng)

Bƣớc 4

biến tinh bột sắn theo sơ đồ sau:

Bổ sung dịch chế phẩm vào bể sục khí Sục khí 8 giờ, lƣu nƣớc 36 giờ

Bƣớc 5

Kiểm tra thông số nƣớc sau xử lý (pH, BOD5, COD, Nts, Pts...)

Hình 3.21. Sơ đồ qui trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật

xử lý nƣớc thải biogas của cơ sở CBTBS

111

Các bƣớc tiến hành

Bước 1: Xác định thông số qui mô nước thải biogas của cơ sở cần áp dụng.

Xác định thông số nƣớc thải pH, BOD5, COD, TSS, Ntst, Pts..., xác định qui

mô nƣớc thải của các cơ sở cần xử lý dựa trên các phƣơng pháp tiêu chuẩn đo lƣờng

của Việt Nam và các phƣơng pháp chuẩn của thế giới.

Bƣớc này đƣợc sử dụng để tính toán lƣợng chế phẩm vi sinh vật tối thiểu và

tối ƣu cần đƣợc bổ sung vào hệ thống xử lý, nhằm nâng cao hiệu quả xử lý, giảm

chi phí đầu tƣ cho việc xử lý.

Bước 2: Xác định khối lượng chế phẩm tối ưu nhất.

Tính toán lƣợng chế phẩm vi sinh vật cần bổ sung vào hệ thống với một mẻ xử lý dựa trên kết quả đã nghiên cứu là 0,1 kg chế phẩm/m3 nƣớc thải tƣơng đƣơng với mật độ vi sinh vật 104 CFU/ml. Khối lƣợng chế phẩm cần tính toán chính xác và

phải phù hợp với dung tích của bể xử lý, qui mô hệ thống xử lý nƣớc thải của từng

cơ sở chế biến TBS.

Bước 3: Hoạt hóa tạo dịch chế phẩm bổ sung.

Tiến hành hòa chế phẩm dạng bột với 20 lít nƣớc thải đầu vào, sau đó bổ sung

thêm rỉ đƣờng với tỉ lệ 0,1% tổng thể tích (tƣơng ứng 0,4 kg rỉ đƣờng). Dịch hoạt

hóa chế phẩm đƣợc để qua đêm trong điều kiện tĩnh hoặc đƣợc sục khí tùy điều kiện

của nơi cần xử lý.

Bước 4: Bổ sung dịch chế phẩm vào hệ thống xử lý nước thải

Chế phẩm vi sinh vật sau hoạt hóa tạo dịch, đƣợc bổ sung vào bể sục khí của

hệ thống nƣớc thải. Chế phẩm cần đƣợc bổ sung vào giữa và gần bộ phận sục khí,

nhằm phân phối đều chế phẩm trong thể tích của bể (do thông thƣờng bộ phận sục

khí đƣợc đặt ở giữa và đáy của bể)

Sử dụng máy bơm hoặc vòi bơm, trộn đều dịch vi sinh vật đã đƣợc hoạt hóa

vào nƣớc thải trong bể sục khí. Chế phẩm vi sinh vật đƣợc bổ sung theo ca sản xuất,

bổ sung khi hệ thống bơm bơm nƣớc thải từ bể biogas vào bể sục khí. Thời gian sục

khí 8 giờ và thời gian lƣu nƣớc trong bể là 36 giờ, sau đó nƣớc thải đƣợc cho chảy

112

sang bể lắng, tại đây diễn ra quá trình lắng sinh khối vi sinh vật cùng với các hạt lơ

lửng có trong nƣớc thải tạo thành bùn.

Bước 5: Kiểm tra thông số nước đầu ra (nước thải sau quá trình xử lý)

Kiểm tra, xác định các chỉ số liên quan BOD5, COD, hàm lƣợng Nts; Pts…

của đầu ra của nƣớc thải nhằm đánh giá hiệu quả xử lý của chế phẩm.

Bùn hoạt tính đƣợc hình thành sau quá trình xử lý, 1 phần đƣợc hồi lƣu sử

dụng cho quá trình xử lý tiếp theo, lƣợng đƣợc khuyến cáo hồi lƣu tối thiểu là 3 g/l,

một phần đƣợc ủ để làm phân bón cho cây trồng.

3.5. Nghiên cứu hiệu quả xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn của chế phẩm

3.5.1. Hiệu quả xử lý qui mô phòng thí nghiệm

Thử nghiệm hiệu lực chế phẩm MIC-CAS 02 trong hệ thống xử lý qui mô

200 lít với 36 giờ lƣu nƣớc thải và sử dụng hệ thống khuấy, vận tốc 150 vòng/phút,

với 2 công thức thí nghiệm bổ sung chế phẩm và không có chế phẩm. Hệ thống

đƣợc vận hành trong 10 ngày, với 2 ngày đầu là hoạt hóa hệ thống. Kết quả phân

tích nƣớc thải sau các đợt xử lý đƣợc tổng hợp trong bảng 3.35, kiểm tra thông số

BOD5, COD, Nts, Pts theo qui chuẩn Việt Nam 40:2011/BTNMT.

Bảng 3.35. Kết quả phân tích chất lƣợng nƣớc sau xử lý ở qui mô 200 lít với chế

phẩm MIC-CAS 02

QCVN Đầu Đầu ra không Đầu ra có Hiệu quả 40:2011/BTNMT Thông số vào chế phẩm chế phẩm chế phẩm % Cột A Cột B

COD (mg/l) 450,5 382,9 71,2 84,2 100 150

224,1 28,8 89,1 30 50 BOD5(mg/l) 263,7

pH 7,6 7,5 7,4 6-9 5,5-9

TSS (mg/l) 152,3 129,2 24,7 83,8 50 100

87,4 65,6 15,3 82,5 20 40 Nts (mg/l)

15,9 11,2 3,3 79,2 4 6 Pts (mg/l)

Kết quả bảng 3.35 cho thấy, hiệu quả xử lý BOD5 đạt 89,1%, COD đạt , Pts trong nƣớc thải 84,2%, Nts đạt 82,5% và Pts đạt 79,2%. Chỉ tiêu BOD5, COD, Nts

113

đầu ra ở thí nghiệm có bổ sung chế phẩm đều đạt tiêu chuẩn cột A theo QCVN

40:2011/BTNMT.

Qua số liệu phân tích còn cho thấy đối với những mẫu nƣớc thải không bổ

sung chế phẩm, các thông số đầu ra đều cao hơn so với mẫu có bổ sung chế phẩm,

và khi phân tích nhận thấy giá trị đo đƣợc giữa các đợt xử lý có sự chênh lệch nhau

rõ ràng, tức là thiếu ổn định và hiệu suất xử lý thấp hơn so với có bổ sung chế

phẩm. Mẫu bổ sung chế phẩm giá trị BOD5, COD đầu ra ổn định và hiệu suất xử lý

đạt trên 80%, hiệu suất xử lý Nitơ tổng số và Phospho tổng số đạt trên 75%.

Tóm lại, ở quy mô 200 lít đã thử nghiệm xử lý nƣớc thải CBTBS ở hai chế

độ: không và có bổ sung chế phẩm MIC-CAS 02. Kết quả cho thấy hiệu quả làm

sạch nƣớc thải của vi sinh vật trong chế phẩm cao hơn rõ rệt và ổn định hơn so với

đối chứng (không bổ sung chế phẩm trong quá trình xử lý).

3.5.2. Hiệu quả xử lý tại nhà máy chế biến tinh bột sắn tỉnh Ninh Bình

Sử dụng chế phẩm MIC-CAS 02 trong hệ thống xử lý nƣớc thải chế biến tinh

bột sắn của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình đƣợc thực hiện trong thời gian

từ tháng 10-11 năm 2014. Kết quả phân tích chất lƣợng nƣớc thải của nhà máy cho

thấy khi bổ sung chế phẩm MIC-CAS 02 đã cải thiện đƣợc chất lƣợng nƣớc thải đầu

ra (bảng 3.36).

Bảng 3.36. Hiệu quả xử lý nƣớc thải nhà máy tinh bột sắn Elmaco Ninh Bình bằng

chế phẩm MIC-CAS 02

QCVN Chế Chỉ tiêu Trƣớc Sau Hiệu quả chế 40:2011/BTNMT phẩm phân tích Biogas Biogas phẩm (%) xử lý Cột A Cột B

78,2 100 150 82,5 COD (mg/l) 11745 446,3

29,3 30 50 88,7 6653 259,5 BOD5(mg/l)

7,2 6-9 5,5-9 pH 5,4 7,6

28,4 50 100 81,5 TSS (mg/l) 1176 153,9

15,8 20 40 81,7 119,5 86,2 Nts (mg/l)

3,6 4 6 76,8 22,1 15,5 Pts (mg/l)

114

Số liệu trong bảng 3.36 cho thấy hiệu quả xử lý của chế phẩm MIC-CAS 02

tại nhà máy tinh bột sắn Elmaco Ninh Bình đạt trên 75%, giảm BOD5 từ 259,5

mg/ml xuống 29,3 mg/ml, COD từ 446,3 mg/ml xuống 78,2 mg/ml, Nts từ 86,2

mg/ml xuống 15,8 mg/ml, Pts từ 15,5 mg/ml xuống 3,6 mg/ml. Nƣớc thải chế biến

tinh bột sắn của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình sau xử lý đã đáp ứng yêu

cầu theo QCVN 40:2011/BTNMT (cột A) và đủ điều kiện thải ra hệ thống nƣớc thải

công cộng.

3.5.3. Xác định khả năng tồn tại của các vi sinh vật nghiên cứu trong bùn thải

bằng kỹ thuật DGGE

Để đánh giá khả năng tồn tại của các vi sinh vật nghiên cứu trong quá trình

xử lý nƣớc thải chế biến tinh bột sắn, đề tài đã sử dụng kỹ thuật DGGE để kiểm tra

sự sống sót của vi sinh vật nghiên cứu trong bùn hoạt tính từ bể xử lý sau 1 tháng

vận hành. Hình ảnh điện di trên gel agarose 1% của các mẫu nghiên cứu đƣợc thể

hiện tại hình 3.22 và 3.23.

M S B N B 1 B2 ĐC-

Hình 3.22. Sản phẩm PCR-DGGE gien 16S rADN của vi sinh vật trong các mẫu

bùn và chủng đơn

Chú thích:

M: Marker N: N.europea SHV.OA7

ĐC-: Đối chứng âm B2: Bùn hoạt tính sau xử lý có CP 1 tháng

S: S.fradiae SHX.12 B1: Bùn xử lý không có CP

B: B.velezensis SHV.22

115

Sản phẩm PCR nhân đoạn gien 16S rADN từ ADN tổng số của 5 mẫu thí

nghiệm ở hình 3.22 là một băng rõ nét có kích thƣớc khoảng 500 bp, đảm bảo chất

lƣợng để tiến hành điện di biến tính. Sản phẩm PCR thu đƣợc, tiếp tục tiến hành

điện di trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formamide từ 20% đến 70%. Quá trình điện di đƣợc thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (BioRad) trong đệm TAE, với nhiệt độ 600C, ở 200 V, trong 3,5 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện ở

hình 3.23.

S B N B 1 B2 ĐC-

Hình 3.23. Điện di biến tính (DGGE) gien 16S rADN của vi sinh vật trong các mẫu

bùn và chủng đơn

Chú thích:

S: S.fradiae SHX.12 B1: Bùn xử lý không có CP

B: B.velezensis SHV.22 B2: Bùn hoạt tính sau xử lý có CP 1 tháng

N: N.europea SHV.OA7 ĐC-: Đối chứng âm

Kết quả DGGE ở hình 3.23 cho thấy cả 2 mẫu bùn đều có nhiều băng đậm,

nhạt khác nhau, chứng tỏ sự đa dạng nhiều loài vi sinh vật trong đó. Tuy nhiên, ở

mẫu B2-bùn hoạt tính lấy sau 1 tháng xử lý có bổ sung chế phẩm thì có nhiều băng

đậm hơn. Kết quả này cho thấy hệ vi sinh vật trong bể xử lý (gồm vi sinh vật có sẵn

trong nƣớc thải cùng với vi sinh vật từ chế phẩm bổ sung vào) đã đƣợc hoạt hóa nên

số lƣợng tăng lên. Còn với mẫu B1-bùn xử lý không có chế phẩm cũng có các băng

tƣơng ứng nhƣ trong mẫu B2 nhƣng ít và mờ hơn, chứng tỏ mật độ vi sinh vật ít

hơn.

116

Hình 3.23 còn cho thấy mẫu bùn B2 có các băng tƣơng đồng với chủng

S.fradiae SHX.12, B.velezensis SHV.22 và N.europea SHV.OA7. Nhƣ vậy, ở mẫu

bùn B2 đều có mặt 3 chủng vi sinh vật nghiên cứu.

Với mẫu bùn B1 thu đƣợc băng đậm nhƣng không tƣơng ứng với băng nào

của các chủng đơn. Nhƣ vậy, có thể là trong các mẫu bùn xử lý không có chế phẩm,

mật độ vi sinh vật này thấp nên không thể hiện rõ nét trên ảnh điện di, hoặc trong

mẫu B1 không có mặt của vi sinh vật nghiên cứu.

Tiến hành phân tích mật độ vi sinh vật tổng số hiếu khí trong mẫu bùn B1 và

B2, kết quả trong bảng 3.37 cho thấy mẫu bùn B2 (Bùn hoạt tính sau xử lý chế phẩm 1 tháng) mật độ tế bào vi sinh vật tổng số đạt 2,3x109 CFU/g cao hơn so với

mẫu bùn B1 (Bùn xử lý không có chế phẩm). Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn phù

hợp với nhận định của Lê Thị Việt Hà và cs (2003) về số vi khuẩn hiếu khí trong bùn tạo đƣợc nhờ các chủng phân lập từ nƣớc thải tăng gấp nhiều lần (lên tới 2.107

lần) so với bùn tự nhiên.

Bảng 3.37. Mật độ vi sinh vật tổng số trƣớc và sau sử dụng chế phẩm MIC-CAS 02

B1 (Bùn không B2 (Bùn hoạt tính Chỉ tiêu phân tích

Vi sinh vật tổng số hiếu khí (CFU/g) có chế phẩm) 1,4x104 có chế phẩm) 2,3x109

Từ những kết quả nghiên cứu trên, đề tài đƣa ra nhận xét các chủng S.fradiae

SHX.12, B.velezensis SHV.22 và N.europea SHV.OA7 có khả năng thích nghi và

tồn tại tốt trong và sau quá trình xử lý. Để có kết luận chắc chắn về khả năng tái sử

dụng bùn thải chứa các vi sinh vật bổ sung, cần tiếp tục đánh giá và kiểm định trong

suốt thời gian vận hành hệ thống xử lý nƣớc thải.

117

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Đã phân lập, tuyển chọn và xác định đƣợc bộ chủng vi sinh vật xử lý nƣớc

thải CBTBS gồm 01 xạ khuẩn Streptomyces fradiae ký hiệu SHX.12 có khả năng

phân giải tinh bột, xenluloza; 01 vi khuẩn Bacillus velezensis ký hiệu SHV.22 vừa

có khả năng chuyển hóa Phosphat hữu cơ vừa có khả năng đồng hóa Phospho và 01

vi khuẩn Nitrosomonas europea ký hiệu SHV.OA7 có khả năng chuyển hóa Nitơ.

Ba chủng nghiên cứu trên đều thích nghi với nƣớc thải CBTBS và thuộc nhóm an

toàn sinh học cấp độ 1.

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu tối ƣu hóa các yếu tố điều kiện nhân sinh khối

các chủng trong thiết bị lên men chìm, thử nghiệm và lựa chọn các thông số trong

lên men xốp, đề tài đã xây dựng đƣợc qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý

nƣớc thải chế biến tinh bột sắn dạng bột với chất mang là cao lanh và tinh bột sắn.

Chế phẩm chứa Nitrosomonas europea SHV.OA7, Streptomyces fradiae SHX.12 và Bacillus velezensis SHV.22, có mật độ tế bào vi sinh vật đạt 108 CFU/g và đƣợc đặt

tên là MIC-CAS 02.

Xây dựng đƣợc 01 qui trình sử dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý nƣớc thải

cho các cơ sở nhà máy sản xuất tinh bột sắn có hệ thống xử lý biogas và xử lý hiếu khí. Chế phẩm đƣợc bổ sung vào bể sục khí với liều lƣợng là 100g/m3nƣớc thải, sục

khí 8 giờ và thời gian lƣu nƣớc là 36giờ.

Đánh giá hiệu quả xử lý nƣớc thải CBTBS của chế phẩm cho thấy chế phẩm

MIC-CAS02 đạt hiệu quả xử lý BOD5 84,2%, COD 89,1%, Nts 82,5% và Pts 79,2%

ở qui mô phòng thí nghiệm. Sau khi sử dụng chế phẩm MIC-CAS 02 trong hệ thống

nƣớc thải nhà máy CBTBS của công ty TNHH MTV Elmaco Ninh Bình, nƣớc thải

biogas của nhà máy đã giảm BOD5 từ 259,5 mg/ml xuống 29,3 mg/ml, COD từ

446,3 mg/ml xuống 78,2 mg/ml, Nts từ 86,2 mg/ml xuống 15,8 mg/ml, Pts từ 15,5

mg/ml xuống 3,6 mg/ml. Nƣớc thải đảm bảo chất lƣợng yêu cầu theo QCVN

40:2011/BTNMT (cột A) và đủ điều kiện thải ra hệ thống nƣớc thải công cộng.

118

Bằng kỹ thuật DGGE kiểm tra sự sống sót của vi sinh vật trong bùn hoạt tính

cho thấy Streptomyces fradiae SHX.12, Bacillus velezensis SHV.22 và

Nitrosomonas europea SHV.OA7 có khả năng thích nghi và tồn tại tốt trong và sau

quá trình xử lý.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật MIC-CAS 02 tại các cơ sở sản

xuất tinh bột sắn khác làm cơ sở cho việc đăng ký, lƣu hành chế phẩm trên cả nƣớc.

119

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Lƣơng Hữu Thành, Vũ Thúy Nga, Lê Thị Thanh Thủy, Đào Văn Thông, Hứa

Thị Sơn, Tống Hải Vân, Cao Hƣơng Giang, Hà Thị Thúy, Nguyễn Thị Hằng Nga

(2011), “Tuyển chọn bộ chủng vi sinh vật nhằm xử lý nƣớc thải của nhà máy chế

biến tinh bột sắn”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số

3(24), tr.29-33.

2. Vũ Thúy Nga, Lƣơng Hữu Thành, Phạm Văn Toản (2013), “Nghiên cứu cải

thiện chất lƣợng nƣớc thải chế biến tinh bột sắn bằng chế phẩm vi sinh vật”, Tuyển

tập báo cáo Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, quyển 2,

tr.389-392.

3. Vũ Thúy Nga, Nguyễn Đình Tráng, Lƣơng Hữu Thành (2014), “Nghiên cứu

khả năng xử lý nƣớc thải tinh bột sắn của chủng Streptomyces fradiae và Bacillus

velezensis”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số 7(53),

tr.28-32.

120

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. AgroMonitor (Công ty Cổ phần Phân tích và Dự báo thị trƣờng Việt Nam)

(2015), Bản tin thị trường sắn và tinh bột sắn Việt Nam, Tuần từ 14/08/2015-

20/8/2015, tr.13-14.

2. Nguyễn Văn Cách (2010), Báo cáo khoa học đề tài: Nghiên cứu ứng dụng

công nghệ vi sinh và hệ thống thiết bị tiết kiệm năng lượng để xử lý nước thải

sinh hoạt đô thị, Mã số KC.04.23/06-10, Trung tâm thông tin tƣ liệu Quốc

gia Việt Nam.

3. Lê Thị Kim Cúc (2006), “Mô hình công nghệ xử lý-tái sử dụng nƣớc thải

vùng chế biến tinh bột sắn tại Tân Hóa, Quốc Oai, Hà Tây”, Tạp chí Tài

nguyên và Môi trường, số 10 (36), tr.54-56.

4. CIAT (2011), Báo cáo kết quả điều tra cơ sở chế biến tinh bột ướt tại một số

địa phương miền Bắc Việt Nam, tr.18.

5. Nguyễn Lân Dũng (ngƣời dịch), Egorob, N, X. (1983), Thực tập vi sinh vật

học, NXB Mir, Maxcova và Đại học THCN, Hà Nội.

6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002) Vi sinh vật

học, NXB Giáo dục.

7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh

Phƣớc, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một

số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2, NXB Khoa học và Kỹ

thuật, tr.48-95.

8. Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Tân Bình và Nguyễn Thị Xuân Mỵ (2012), “Ứng

dụng chế phẩm sinh học xử lý nƣớc-bùn đáy ao cá tra nuôi công nghiệp“,

Tạp chí Khoa học, Trƣờng Đại học Cần Thơ, số 23a, tr.1-10.

9. Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thanh (2007), “Phân lập và

tuyển chủng các chủng vi khuẩn nitrat hóa để ứng dụng trong xử lý nƣớc hồ

ô nhiễm“, Tạp chí khoa học và công nghệ, tập 45, số 3, tr.95-100.

121

10. Trần Liên Hà (2008), Báo cáo khoa học đề tài: Nghiên cứu sử dụng chế

phẩm sinh học và vi sinh vật để xử lý nước hồ bị ô nhiễm, Mã số 01C-09/08-

2006-2. Sở Khoa học Công nghệ Hà Nội.

11. Đặng Thanh Hà, Lê Công Trụ và G. Henry (1996), “Phân tích thị trƣờng tinh

bột sắn Việt Nam hiện tại và tƣơng lai”, Tuyển tập báo cáo hội nghị nghiên

cứu thị trường, chế biến và sản xuất sắn của Việt Nam, Hà Nội ngày 29-31

tháng 10, tr.159-172.

12. Lê Thị Việt Hà, Lê Văn Tri, Ngô Tự Thành (2003), “Nghiên cứu xử lý nƣớc

thải của làng nghề Dƣơng Liễn (tỉnh Hà Tây) bằng biện pháp sinh học, phần

II. So sánh hai loại bùn để dùng cho xử lý hiếu khí”, Báo cáo khoa học Hội

nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, 16-17/12, tr.231-233.

13. Phạm Bích Hiên (2012), Nghiên cứu vi sinh vật để xử lý chất thải chăn nuôi

dạng rắn, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại

học Quốc Gia Hà Nội.

14. Nguyễn Thị Thu Hiền (2012), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ lọc sinh học

xử lý tuần hoàn nước thải trong ươm nuôi cá biển, Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật,

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiện-Đại học Quốc gia Hà Nội.

15. Nguyễn Thị Hồng, Phạm Khắc Liệu (2012), “Đánh giá hiệu quả xử lý nƣớc

thải chăn nuôi lợn bằng hầm biogas qui mô hộ gia đình ở Thừa Thiên Huế”,

Tạp chí khoa học, Đại học Huế, tập 73, số 4, tr.83-91.

16. Lê Gia Hy (1997), Công nghệ vi sinh vật xử lý nước thải, Viện Sinh thái và

Tài nguyên sinh vật, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia.

17. Lê Thanh Huyền, Đào Thị Ánh Tuyết, Đỗ Mạnh Hào (2014), “Một số đặc

điểm sinh học của chủng vi khuẩn oxy hóa ammonium phân lập từ vùng ven

biển Hải Phòng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển, Tập 14, số 3A,

tr.152-158.

18. Nguyễn Hoàng Mỹ, Vũ Hồng Thi, Trƣơng Thị Mỹ Khanh, Vũ Thị Hƣơng

Lan (2011), “Nghiên cứu tuyển chọn các vi khuẩn có tiềm năng phân hủy

tinh bột và protein để ứng dụng trong xử lý nƣớc thải chế biến lƣơng thực và

122

thủy sản”, Hội nghị khoa học Môi trường và Công nghệ Sinh học, Trƣờng

ĐH Kỹ thuật Công nghiệp TP HCM, tháng 5, tr.19-28.

19. Nguyễn Văn Lạng (2015), “Khái quát ngành sắn”, Hội thảo quốc tế Phát

triển bền vững cây sắn Việt Nam, ngày 15/1 tại Tây Ninh, Hiệp hội sắn Việt

Nam, tr.3-5.

20. Phạm Đình Long, Trần Văn Quang, Trƣơng Lê Bích Trâm, Nguyễn Văn

Đông, Nguyễn Thị Thanh Xuân (2014), “Nghiên cứu khả năng sinh khí

Biogas từ nƣớc thải chế biến tinh bột sắn bằng phƣơng pháp lên men kỵ khí“,

Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, Số 3(76), tr.41-47.

21. Trƣơng Văn Lung, Nguyễn Ngọc Thanh (2003), “Thăm dò một số phƣơng

pháp sinh học để xử lí nƣớc thải từ quá trình sản xuất của nhà máy chế biến

tinh bột sắn Quảng Nam”, Hội nghị CNSH toàn quốc, tr.313-317.

22. Nguyễn Văn Năm (2004), Nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật hữu hiệu để

nâng cao hiệu quả xử lý nước thải chế biến thực phẩm giàu tinh bột bằng

phương pháp bùn hoạt tính, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và

Công nghệ Việt Nam.

23. Trần Văn Nhân, Ngô Thị Nga (2009), Công nghệ xử lý nước thải, Nhà xuất

bản Khoa học & Kỹ thuật.

24. Lƣơng Đức Phẩm (2009), Công nghệ xử lý nước thải bằng biện pháp sinh

học, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội, tr.105-117.

25. Lƣơng Đức Phẩm (2009), Cơ sở khoa học trong công nghệ bảo vệ môi

trường, nhà xuất bản Giáo dục.

26. Nguyễn Văn Phƣớc (2007), Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học,

Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP HCM, tr.35-39.

27. Lê Công Nhất Phƣơng, Lê Thị Cẩm Huyền, Nguyễn Huỳnh Tấn Long

(2012), “Xử lý ammonium trong nƣớc thải giết mổ bằng quá trình nitrit một

phần/Anammox”, Tạp chí Sinh học, 34(SE), tr.105-110.

28. Lê Xuân Phƣơng (2008), Vi sinh vật học môi trường, Đại học Bách Khoa Đà

Nẵng, tr.258-269.

123

29. Nguyễn Thị Thanh Phƣợng, Nguyễn Văn Phƣớc, Thiệu Cẩm Anh (2010),

“Nghiên cứu đánh giá hiệu quả xử lý nƣớc thải tinh bột mì bằng công nghệ

lọc sinh học hiếu khí trên các loại vật liệu lọc khác nhau”, Tạp chí Phát triển

Khoa học&Công nghệ, tập 13, số M2, tr.54-66.

30. QCVN 40:2011/BTNMT, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về nước thải công

nghiệp, Quy chuẩn Việt Nam, Bộ Tài nguyên và Môi trƣờng.

31. Quyết định thủ tƣởng chính phủ (2013), Phê duyệt kế hoạch xử lý triệt để các

cơ sở gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng đến năm 2020, QĐ số 1788/QĐ-

TTg ngày 01 tháng 10 năm 2013 của Thủ tƣớng Chính phủ.

32. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Thu Hà (2006), Đề tài KC 04–02: Nghiên cứu

xử lý nước thải sản xuất tinh bột sắn thu biogas bằng hệ thống UASB, Viện

Khoa học và Công nghệ Môi trƣờng, Đại học Bách Khoa, Hà Nội.

33. TCVN 4556-88, Nước thải - Phương pháp lấy mẫu, vận chuyển và bảo quản

mẫu.

34. TCVN 6491:1999 (ISO 6060:1989): Chất lượng nước – Xác định nhu cầu

oxy hóa học.

35. TCVN 5987:1995: Chất lượng nước – Xác định Nitơ-Kjeldahl.

36. TCVN 6202:2008 (ISO 6878:2004): Chất lượng nước - Xác định Phospho,

Phương pháp trắc phổ dùng Amoni molipdat.

37. TCVN 6625-2000 (ISO 11923-1997): Chất lượng nước - Xác định chất rắn

lơ lửng bằng cách lọc qua cái lọc sợi thủy tinh.

38. TCVN 6001:1995: Chất lượng nước - Xác định nhu cầu oxy sinh hóa sau 5

ngày (BOD5).

39. TCVN 6178:1996 (ISO 6777:1984): Chất lượng nước - Xác định nitrit.

Phương pháp trắc phổ hấp thụ phân tử.

40. TCVN 6180:1996 (ISO 7890/3:1988): Chất lượng nước - Xác định nitrat.

Phương pháp trắc phổ dùng axitosunfosalixylic.

41. TCVN 6181:1996: Chất lượng nước- Xác định xyanua tổng

124

42. TCVN 4594:1998: Đồ hộp-Phương pháp xác định đường tổng số, đường khử

và tinh bột.

43. TCVN 6179 -1:1996: Chất lượng nước- Xác định amoni

44. TCVN 6168:2002: Chế phẩm vi sinh vật phân giải xenlulo

45. TCVN 6167:1996: Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất Phospho khó tan

46. Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ Sinh học tập 1, Những kỹ thuật cơ bản

trong phân tích ADN, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.

47. Đào Văn Thông (2012), Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón vi sinh vật

chức năng sử dụng cho khoai tây, Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học,

Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội.

48. Trần Linh Thƣớc (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,

thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục.

49. Tổng cục thống kê (2015), Số liệu thống kê, www.gso.gov.vn//default.aspx

?tabid=717

50. Phạm Thu Trang, Phạm Thanh Huyền, Lê Gia Hy, Phí Quyết Tiến, Hồ

Tuyên, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Phƣơng Nhuệ (2014), “Đặc điểm sinh

học của xạ khuẩn biển VD111 sinh chất kháng khuẩn”, Tạp chí Khoa học và

Phát triển, tập 12, số 8, tr.1258-1265.

51. Bùi Trung (2008), Báo cáo đề tài khoa học: Nghiên cứu hoàn thiện công

nghệ xử lý chất thải chế biến tinh bột sắn (khoai mì) tại Việt Nam, Viện Công

nghệ Hoá học.

52. Trung tâm thông tin phát triển nông nghiệp nông thôn (2014), Báo cáo

thường niên ngành hàng sắn và các sản phẩm từ sắn năm 2013, tr. 10-25.

53. Trung tâm Sản xuất Sạch Việt Nam (2010), Tài liệu hướng dẫn sản xuất

sạch hơn ngành sản xuất tinh bột sắn, tr.13-15.

54. Lê Ngọc Tú (2006), Hoá sinh công nghiệp, NXB Khoa học & Kỹ thuật.

55. Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), Cải tạo môi trường

bằng chế phẩm vi sinh vật, Nhà xuất bản Lao động, Hà Nội.

125

56. Vũ Đình Tôn, Lại Thị Cúc, Nguyễn Văn Duy (2008), ”Đánh giá hiệu quả xử

lý chất thải bằng bể biogas của một số trang trại chăn nuôi lợn vùng đồng

bằng sông Hồng”, Tạp chí Khoa học và phát triển, tập VI, Số 6, tr.556-561.

57. Đào Thị Hồng Vân (2012), Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật bản địa

nhằm xử lý nước thải sinh hoạt đô thị Hà Nội, Luận án tiến sĩ Công nghệ

sinh học thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh

58. Akcil A. (2003), “Destruction of Cyanide in Gold Mill Effluents: Biological

versus Chem- Ical Treatments, Biotechnol”, Biotechnology Advances, No.21,

p.501-511.

59. Andren D.E., Awwa (1995), Standand Methods for the examination of water

and wastewater, Amer. Pub Health Ass, Washington, p.351-356.

60. Barclay, Michelle, Alwyn Hart, Christopher J. Knowles, Johannes C. L.

Meeussen, and Vanessa A. Tetdl (1998), “Biodegradation of Metal Cyanides

bY Mixed and Pure Cultures of Fungi”, Enzyme and Microbial Technology

(97), p.223-231.

61. Bdrjanovic D, Van loosdrecht MCM, Hooijmans CM, Mino T, Alaerts GJ

and Heijnen JJ (1997), “Bioassay for Glyco-gien determination in biological

Phosphorus removal systems”, In: Proc. 2nd Int., Conf.on Microorganisms in

Activated Sludge and Biofilm Processes, July 21-23, Berkeley, California,

USA, p.335-342.

62. Boonmee Wattanaruangrong (2015), Thai Topica Industry strategic roadmap

to Sustain Its competitiveness, Thai Topica Strarch Association, p.5.

63. Bosch M and Cloete TE (1993), Research on Biological Phosphate Removal

in Activated Sludge. Water Research Commission Report, No. 314, p.64-80.

64. Budiyono and T.D. Kusworo (2012), “Microalgae for Stabilizing Biogas

Production from Cassava Starch Wastewater”, Internation Journal of Waste

Resources, Vol. 2(1), p.17-21.

126

65. CDM-PDD (2012), Advanced Wastewater Management at Rajburi Ethanol

Plant, Clean development Mechanism-Project design document form,

Version 3, p.8.

66. Chaudhari Ashvini U. and Kisan M. Kodam (2010), “Biodegradation of

Thiocyanate Using Co-Culture of Klebsiella Pneumoniae and Ralstonia Sp.”,

Applied microbiology and biotechnology, No.85(4), p.1167-1174.

67. Charles P., Ernesto l. (2003), Phosphorus removal in municipal wastewater,

Environmental Engineers.

68. Dao Huy Chien (1997), “Market prospects for Upland crops in VietNam“,

CGPRT Working Paper, No.26, CGPRT, Borgor, Indonesia, p.85.

69. CIAT (2014), “Building an Eco-Efficient Future“, CIAT Strategy 2014-2020,

Cali Colombia, February, p.24.

70. Colin X., Farinet J., Rojas O., Alazard D. (2007), “Anaerobic treatment of

cassava starch extraction wastewater using a horizontal flow filter with

bamboo as support“, Bioresource Technology 98, p.1602-1607.

71. Connie Clark and E. L. Schmidt (1967), “Uptake and Utilization of Amino

Acids by Resting cells of Nitrosomonas europea”, Journal of Bacteriology,

Vol. 93, No.4, p.1309-1315.

72. Cristina Ruiz-García, Victoria Béjar, Fernando Martínez-Checa (2005),

“Bacillus velezensis sp. Nov., a surfactant-producing bacterium isolated from

the river Veslez in Maslaga, southern Spain“, International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology, 55, p.191-195.

73. Dursun A.Y., Alık A. C., Aksu Z. (1999), “ Degradation of ferrous(II)

Cyanide Complex Ions by Pseudomonas Fluorescens ”, Process

Biochemistry, No.34, p.901-908.

74. E.B. Sirling and D.Gottlieb (1966),“Methods for characterization of

Streptomyces species“, International Journal of systematic Bacteriology,

Vol.16, No.3, p.313-340.

127

75. Ehiagbonare J.E., Enabulele S.A., Babatunde B. B., Adjarhore R. (2009),

“Effect of Cassava Effluent on Okada Denizens”, Sci. Res. Essay, 4(4),

p.310-313.

76. Ehrlich G.(1975), Nitrifying bacteria (most probable number, MPN, method)

in:quality of water branch technical memorandum,Water quality: Analytical

Methods, Pickering, No. 75, 13 p.

77. El-Meleigy M. A., Mokhtar M. M., Mohamed H. F. and Salem M. S. (2011)

“Morphologycal Biochemical and Sequen- Based Identification of some

selenium tolerant Actinomyces“, New York Science Journal, 4(8), p.20-26.

78. Emad A. Shalaby (2011), “Prospects of effective microoganisms technology

in wastes treatment in Egypt“, Asian Pacific Journal of Tropical

Biomedicine, 1(3), p.243-248.

79. FAO (2001), “Impact of cassava production on the environment“, Strategic

Environmetal Assessment, Volume 5, Reprinted 2004, p.10-41.

80. FAO (2015), Browse data, www.faostat3.fao.org/browse/Q/QC/E.

81. Fuhs G. W. and M. Chen (1975), “Microbiological basis of phosphate

removal in the activated sludge process for treatment of wastewater”,

Microbial. Ecol., 2(2), p.119-138.

82. Jane Meikilejohn (1949), “The isolation of Nitrosomonas europea in pure

culture”, Journal of General Microbiology, Vol.4, No.2, p.185-191.

83. Gurr E. (1965), The rational use of dyes in biology, Hill, London, United

Kingdom, p.216.

84. Gruisasola A., Hass D., Keller J., Yuan Z. (2008), “Methane formation in

sewer systems“, Water research 42, p.1421-1430.

85. Grunditz C., Dalhammar G. (2001), “Development of nitrification inhibition

assay using pure cultures of Nitrosomonas and Nitrobacter“, Water Res 35,

No.2, p.433-440.

86. Ha D. T., Tru L.G. and Henry G. (1996), “Prospects for cassava starch in

Vietnam. In. D. Dufour, G.M.O„ Brien and R. Best (Eds), Cassava flour and

128

starch“, Project in Research and Development, CIAT Publication No.271,

Cali, Colombia, p.78-88.

87. Henry G., B. titapiwatanakun, T. Botterna and D. S. Damardjati (1995),

“Asian cassava markets dynamics. Opportunities for Biotechnology, in. Proc.

2nd CBN Intern“, Scientific meeting held in Bogor, Indonesia, August, 22-

24, 1994 CIAT, Cali, Colombia, p.581-608.

88. Hirofumi Tomiyama, Mifuyu Ohshima, Satoko Ishii, Kazuo Satoh, Reui

Takahashi, Katsunori Isobe, Hidetoshi Iwano and Tatsuaki Tokuyama

(2001), “Characteristics of Newly Isolated Nitrifying Bacteria from

Rhizoplane of Paddy Rice”, Microbes and Environments, Vol.16, No.2,

p.101-108.

89. Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H. A. , Staley J. T., Williams S. T. (2000),

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Edition, Lippincott

Williams & Wilkins (4), p.1256-1259.

90. Holt J. G., N. R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, and S. T. Williams

(1994), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Williams and Wilkins.

Baltimore, Maryland, p.235-242.

91. Huynh Ngoc Phuong Mai (2006), Integrated Treatment of Tapioca

Processing Industrial Wastewater Based on Environmental Bio-Technology,

Wagieningien: Wagieningien University.

92. Jin Shu-ren (2015), Future Prospects for topica production and trade in East

Asia, Starch Inductrial Association of China (SIAC).

93. K.Vijaya Bhaskar and P. B. N. Charyulu (2005), “Effect of environmental

factors on nitrifying bacteria isolated from the rhizosphere of Setaria italic

Beauv”, African Journal of Biotechnology, Vol.4(10), p.1145-1146

94. Kathia R. Kunzler, Simone D. Gomes, Pitagoras A. Piana, Douglas G. B.

Torres, Marcia A. Vilas Boas, Maria H. F. Tavares (2013), “Anaerobic

reactors with biofilter and different diameter-length ratios in cassava starch

129

industry wastewater treatment“, Engienharia. Agrícola, Jaboticabal, Vol. 33,

No.4, p.612-624.

95. Kh. Elbanna, R.M. El-Shahawy, K.M. Atalla (2012), “A new simple method

for the enumeration of nitrifying bacteria in different environments“, Plant

soil environ, 58(1), p.49-53.

96. Kong Y., Nielsen J.L, Nielsen P.H. (2005), “Identity and Ecophysiology of

Uncultured Actinobacterial polyphosphate-accumulating organisms in full

scale enhanced biological Phosphorus removal plants”, Journal of Applied

and Environmental Microbiology, 71(7), p.4076-4085.

97. Kulwarang Suwanasri, Sivalee Trakulvichean, Uthaiwan Grudloyma,

Warinthorn Songkasiri, Terry Commins, Pawinee Chaiprasert and Morakot

Tanticharoen (2015), “Biogas-Key Success Factors for Promotion in

Thailand”, Journal of Sustainable Energy & Environment Special Issue,

p.25-30.

98. Kunz Daniel A., Jui-lin Chen and Guangliang Pan (1998), “Accumulation of

Α-Keto Acids as Essential Components in Cyanide Assimilation by

Pseudomonas Fluorescens NCIMB 11764”, Applied and Environmental

Microbiology, 64(11), p.4452-4459.

99. Lausing M. Prescott, John P. Harley, Donald A. Klein (2002), Microbiology,

Lisbon London, (Fourth edition), p.394-420.

100. Leininger S., Urich T., Schloter M., Schwark I., Qi J., Nicol G.W., Prosser

J.I., Schuster S.C., Schleper C. (2006), “Archaea predominate among

ammonia-oxydizing prokaryotes in soil“, Nature, 442:7014, p.806-809.

101. Lian B., Chen Y., Zhao J., Teng H.H., Zhu L., Yuan S. (2008), Microbial

flocculation by Bacillus mucilaginosus:Applications and mechanisms,

Bioresour Technology, 99(11), p.4825-4831.

102. Lisa Yael Stein (1998), Effects Ammonia, pH, and Nitrite on the Physiology

of Nitrosomonas europea, an Oligate Ammonia-Oxydizing Bacterium,

Oregon State University.

130

103. Lucilene Beatriz Pissinatto, Sérgio Mineo Oyama, Marcelo Zaia Gregorio

and Hiroshi Ota (2004), Microbiological Adjustment of a wastewater

treatment pond system from a cassava starch industry.

104. Marinal K. Majumdar and S. K. Majumdar (1967), “Utilization of Carbon

and nitrogien-containing Compounds for Neomycin production by

Streptomyces fradiae”, Applied Microbiology, Vol.15, No.4, p.744-749.

105. Markus Schmid, Kerry Walsh, Rick Webb, W. Irene C. Rijppstra, Katinka

van de Pas-Schoonen, Mark Jan Verbruggien, Thomas Hill, Bruce Moffett,

John Fuest, Stefan Shouten, Jaap S. Sinnighe Damste, James Harris, Phil

Shaw, Marc Strous, Mike S. M. Jetten (2003), Systematic and applied

microbiology, p.529-538.

106. Miloš Rozkošný, Michal Kriška, Jan Šálek, Igor Bodík, Darja Isteni (2014),

Natural Technologies of Wastewater Treatment, p.46-53.

107. Moir J.W.B. (2011), Nitrogien cycling in Bacteria; Molecular analysis,

caiste academic press, ISBN 978-1-904455-86-8.

108. Muyzer G., De Waal E. C., Uitterlinden A. G. (1993), “Profiling of complex

microbial population by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of

polymerase chain reation amplified gienes coding for 16S rRNA”, Appl

Environ Microbial, 59(3), p.695-700.

109. M.S. Engel (1961), “Morphology of Nitrosomonas europea and

classofication of the nitrifying bacteria“, J. Bacteriol, 81:5, p.833-840.

110. Nitinard Chaleomrum, Kannika Chookietwattana, Somchai Dararat (2014),

“Production of PHA from Cassava Starch Wastewater in Sequencing Batch

Reactor Treatment System”, APCBEE Procedia 8, p.167-172.

111. Niall A. logan, Paul D. V. (2009), Bergey’s Manual of Systematics of

Archaea and Bacteria, Published by John Wiley & Sons, Inc., in association

with Bergey‟s Manual Trust.

131

112. Norman G. Hommes, Luis A. Sayavedra-Soto and Daniel J. Arp. (2003),

“Chemolithoorganotrophic Growth of Nitrosomonas europea on Fructose“,

Jounal of Bacteriol, Vol.185, No.23, p.6809-6814.

113. Okafor N., Umeh C., Ibenegbu C (1998), “Amelioration of garri, a fermented

food derived from cassava, Manihot esculenta Crantz, by the inoculation

into cassava mask of microorganisms simultaneously producing amylase,

inamarase, and lysine”, World J. Microbiol. Biotechnol, Press.14, p.835-838.

114. Patrick Chain, Jane Lamerdin, Frank Larimer, Warren Regala, Victoria Lao,

Miriam Land, Loren Hauser, Alan Hooper, Martin Klotz, Jeanette Norton,

Luis Sayavedra-Soto, Dave Arciero, Norman Hommes, Mark Whittaker and

Daniel Arp (2003), “Complete gienome sequence of the ammonia-oxidizing

bacterium and obligate chemolithoautotroph Nitrosomonas europaea“,

Journal of Bacteriol, 185(9), p.2759-2773.

115. P. Kaewkannetraa, B. T. Imaic, F.J. Garcia-Garciad, T.Y. Chiue (2009),

“Cyanide removal from cassava mill wastewater using Azotobactor

vinelandii TISTR”, Journal of Hazardous Materials 172, p.224–228.

116. Philips S., Wyffels S., Sprengers R., et al. (2002), “Oxygien limited

autotrophic nitrification denification by ammonia oxidisers enables upward

motion towards more favourable conditions“, Applied microbiology and

biotechnology 59(4-5), p.557-566.

117. Pipeline (1996), Aerobic systems Swinter, Vol.7, No.1, p.1-7

118. Ran Y., Kartik C. (2010), “Strategies of Nitrosomonas europeae 19718 to

counter low dissolved oxygien and high nitrite concentrations“, BMC

Microbiology, 10:70.

119. Randviir Edward P. and Craig E. Banks (2015), “The Latest Developments

in Quantifying Cyanide and Hydrogen Cyanide”, TrAC Trends in Analytical

Chemistry, No.64, p.75-85.

132

120. Rety Setyawaty, Keiko Katayama-Hirayama, Hidehiro Kaneko and Kimiaki

Hirayama (2011), “Current Tapioca starch Wastewater (TSW) management

in Indonesia”, World Applied Sciences Journal 14(5), p.658-665.

121. Richard I. Sedlak (1991), Phosphorus and Nitrogien Removal from

Municipal Wastewater: Principles and Practice, Second Edition, CRC Press,

p. 256.

122. Roussos S., Soccol C.R., Pandey A., Augur C. (2003), New Horizons in

Biotechnologgy, Kluwer Academic Publishers, Netherlands.

123. Scott C.K., Daryl B. (1993), Nitrogien in the Enviroment: Denitrification,

United states Department of Agriculture, number 90-EWQI-1-9203.

124. S. Karthick Raja Namsivayam, G. Narendrakumar and J. Arvind Kumar

(2011),“Evaluation of Effective Microorganism (EM) for treatment of

domestic sewage“, Journal of Experimental Sciences, 2(7), p.30-32.

125. Sheikh Aftabuddin, M. Abul Kashem, M. Abdul Kader, M. Nurul Azim

Sikder and M. Abdul Hakim (2013), “Use of Streptomyces fradiae and

Bacillus megaterium as probiotics in the experimental culture of tiger shrimp

Penaeus monodon (Crustacea, Penaeidae)“, Aquaculture, quarium,

Conservation & Legislation, International Journal of the Bioflux Society,

Volume 6, Issue 3, p.253-267.

126. Soratikou E., et al (1999), “Ammonia and Phosphorua removal in municipal

wastewater treatment plant with extended earation“, Global Nest: the Int. J.

Vol.1, No.1, p.47-53.

127. S.P.Vasconcellos, M.P.Cereda, J.R.Cagnon, M.A.Foglio, R.A.Rodrigues, G.

P.Manfio, and V.M.Oliveira (2009), “In vitro degradation of linamarin by

microorganisms isolated from cassava wastewater treatment lagoons”,

Brazilian Journal Microbiology, 40(4), p.879-883.

128. Srinivas Tavva and M. Anantharaman (2015), Cassava marketing system in

India, St. Joseph‟s Press., p.80-85.

133

129. Stanley T., Williams M.E., Sharpe J.G. (1989), Bergey’s manual of

systematic bacteriology, Williams &Wilkins, 4, p.2452-2492.

130. Stephen Abban, Leon Brimer, Warda S. Abdelgadir, Mogiens Jakobsen, Line

Thorsen (2013), Screening for Bacillus subtilis group isolates that degrade

cyanogiens at pH 4.5–5.0, International Journal of Food Microbiology, No.

161, p.31-35.

131. Sunanda Kumari Kadiri and Nagiendra Sastry Yarla (2015), “Optimization

of antimicrobial metabolites production by Streptomyces fradiae”,

International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol.7,

p.223-225.

132. Szabó G., B. Khayer, A. Rusznyák, I. Tátrai, G. Dévai, K. Márialigeti and A.

K.Borsodi (2011), Seasonal and spatial variability of sediment bacterial

communities inhabiting the large shallow Lake Balaton, Hydrobiologia, 663,

p.217-232.

133. Thai Tapioca Starch Association (TTSA)(2015), Tapioca Starch Production,

www.thaitapiocastarch.org/product.asp.

134. Truong Quy Tung, Naoyuki, Miyata and Keisuke Iwahori (2004), “Growth

of Aspergillus oryzae during treatment of cassava starch processing

watewater with high content of suspended solids“, Journal of Bioscience and

Bioengineering, Volume 97, Issue 5, p.329-335.

135. Watson S.W., Valos F.W. and Waterbury J.B., (1981), The family

nitrobacteraceae in the prokaryotes, Berlin: Springer- Verlag.

136. Y. B. Patil, K. M. Paknikar (2000),“Development of a process for

biodetoxification of metal cyanide from wastewater“, Process Biochemistry,

35, p.1139-1151

137. WHO (2004), Laboratory biosafety manual, 3rd edition, Gieneva.

138. Zhou G., Li J., Fan H., Sun J., Zhao X. (2010), “Strarch Wastewater

Treatment with Effective Microorganims Bacteria”, Bioinformatics and Biomedical Engineering (iCBBE), 2010, 4th International Conference, p.1-4.

134

139. Zhou J., Bruns M A., Tiedje J.M. (1996), “DNA recovery from soils of

diverse composition“, Appl. Environ. Microbial, Vol. 62, No. 2, p.316-322.

Tài liệu Web

140. http://baotintuc.vn/phap-luat/bat-qua-tang-nha-may-tinh-bot-san-xa-thai-ra-

moi-truong-20150826152438960.htm.

141. http://www.nhandan.com.vn/khoahoc/item/28460702-nha-may-tinh-bot-san-

gay-o-nhiem-moi-truong-nghiem-trong.html.

142. http://www.moit.gov.vn/vn/tin-tuc/2827/tinh-hinh-san-xuat--xuat-khau-san-

nam-2013.aspx.

143. http://www.moit.gov.vn/vn/tin-tuc/4585/tinh-hinh-xuat-khau-tinh-bot-san-

sang-thi-truong-chau-phi--tay-a--nam-a.aspx.

144. http://hiephoisanvietnam.org.vn/chi-tiet-tin/xuat-khau-san-viet-nam-dung-

thu-2-the-gioi