Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn Streptococcu s mutans trên biofilm và định hướng ứng dụng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

------*****------

NGUYỄN VŨ ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA α- MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT Garcinia mangostana L. LÊN VI KHUẨN Streptococcus mutansTRÊN BIOFILM VÀ ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

HÀ NỘI - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiê ̣n luận văn khoa học , tôi đã nhận được r ất nhiều sự giúp đỡ, khích lệ và động viên của các Thầy, Cô giáo, các bạn đồng nghiệp, bạn bè

ể hoàn

và những người thân trong gia đình. Qua đây, tôi xin được gử i lờ i cảm ơn sâu sắ c của mình đến những cá nhân và tập thể đã hết lòng giú p đỡ để tôi có th thành bản luận văn nà y.

lòng biết ơn sâu sắc tới TS

. Nguyễn Thi ̣ Mai

Trướ c hết , tôi xin bà y tỏ

Phương, phòng Sinh hóa Thực vật , Viê ̣n Công nghê ̣ sinh học , Viê ̣n Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Viê ̣t Nam đã tận tình hướ ng dẫn trong suốt quá trình học tập và thực hiê ̣n nghiên cứ u.

Tôi xin chân thà nh cảm ơn cá c cá n bộ nghiên c ứu của phò ng Sinh hóa thực

vật, Viê ̣n Công nghê ̣ sinh học , Viê ̣n Hàn lâm Khoa h ọc và Công nghệ Viê ̣t Nam ,

ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh họcđã nhiê ̣t tình giú p đỡ và tạo điều kiê ̣n thuận lợi để tôi hoà n thà nh bản luận văn này.

Cuối cù ng , tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu , bạn bè , ngườ i thân và đ ồng nghiệp - những ngườ i đã luôn luôn ở bên tôi, luôn động viên , khích lệ và là chỗ dựa vững chắ c cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứ u.

---------------

Hà Nội, 18tháng 12 năm 2015

Học viên

Nguyễn Vũ Anh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

EPS exopolysaccharide

GTF glucosyltransferase

HPLC high performance liquid chromatography

NMR nuclear magnetic resonance

NSM nước súc miệng

PTS sugar-phosphotransferase system

TLC thin layer chromatography

TSA tryptic soy agar

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4

1.1. Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococus mutans ................................. 4

1.1.1. Bệnh học sâu răng ............................................................................. 4

1.1.1.1 Nguyên nhân gây sâu răng.............................................................. 4

1.1.1.2. Mảng bám răng (dental plaque) ..................................................... 5

1.1.1.3. Cơ chế gây sâu răng ...................................................................... 6

1.1.1.4. Vi khuẩn Streptococcus mutans ...................................................... 7

1.1.2. Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam ........................... 9

1.1.3. Các biện pháp ngăn ngừa sâu răng .................................................. 10

1.1.3.1. Sử dụng chất kháng khuẩn ........................................................... 10

1.1.3.2. Sử dụng chất thay thế đường ........................................................ 12

1.1.3.3. Liệu pháp thay thế (replacement therapy) ................................... 12

1.1.3.4. Vacxin .......................................................................................... 13

1.1.3.5. Kiểm soá t sự hình thà nh biofilm.................................................. 13 1.2. Một số cơ chế thích nghi acid của vi khuẩn xoang miệng.................. 15

1.2.1. Bơm proton F-ATPase .................................................................... 16

1.2.2. Sự thay đổi của màng tế bào vi khuẩn khi thích nghi acid .............. 17

1.2.3. Sự sinh các chất kiềm ..................................................................... 18

1.2.3.1. Urease ......................................................................................... 18

1.2.3.2. Hệ thống arginin deiminase (ADS) .............................................. 19

1.3. Giới thiệu về cây măng cụt .................................................................. 20

1.3.1. Đặc điểm sinh học .......................................................................... 20

1.3.2. Các chất xathone trong măng cụt .................................................... 20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

1.3.3. Sinh tổng hợp các chất xanthone ..................................................... 21

1.3.4. Tác dụng sinh học của các chất xanthone trong cây măng cụt ......... 23

1.3.4.1. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................. 23

1.3.4.2. Hoạt tính kháng nấm.................................................................... 23

1.3.4.3. Tác dụng chống oxi hóa ............................................................... 23

1.3.4.4. Tác dụng chống viêm (anti-inflamation) ...................................... 24

1.3.4.5. Hoạt tính chống ung thư .............................................................. 24

Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................... 25

2.1. Chủng vi sinh vật và các điều kiện nuôi cấy ....................................... 26

2.2. Nguyên liệu thực vật ............................................................................ 26

2.3. Hóa chất và thiết bị .............................................................................. 26

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 27

2.4.1. Các phương pháp nghiên cứu tế bào ............................................... 27

2.4.1.1. Chuẩn bị dịch tế bào .................................................................... 27

2.4.1.2. Đo mức độ sinh acid của tế bào (pH drop) .................................. 27

2.4.2. Các phương pháp xác định hoạt đô ̣ enzyme .................................... 28

2.4.2.1. Chuẩn bị tế bào thấm ................................................................... 28

2.4.2.2. Xác định hoạt độ enzyme phosphoryl hóa đường (PTS) ............... 28

2.4.2.3. Xác định hoạt độ enzyme F – ATPase .......................................... 29

2.4.2.4. Xác định hoạt độ enzyme glucosyltransferase (GTF) .................. 29

2.4.3. Các phương pháp nghiên cứu về biofilm......................................... 30

2.4.3.1. Tạo biofilm .................................................................................. 30

2.4.3.2. Xác đi ̣nh thà nh phần biofilm ........................................................ 31 2.4.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm dưới kính hiển vi huỳnh quang quét lase .. ............................................................................................................... 31

2.5. Đá nh giá sƣ̣ tích lũy củ a α-mangostin trên biofilm ............................ 32 2.6. Tinh sạch hoạt chất khoáng khuẩn S. mutans từ vỏ quả măng cụt ... 32

2.6.1. Tách các hợp chất polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ....................................................................................................... 32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

2.6.2. Phân tích cấu trúc hóa học bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ... 33 2.7. Xử lý số liệu .......................................................................................... 33

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 34

3.1. Nghiên cứu quy trình chiết xuất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt .. 34

3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa -mangostin từ vỏ quả măng cụt ..... 34

3.1.2. Tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt .................................... 36

3.1.2.1. Lựa chọn hê ̣ dung môi thích hợp để chạy cột sắ c ký silica gel ..... 36 3.1.2.2. Tinh sạch -mangostin trên cột sắc ký silica gel sử dụng hệ dung môi n-hexane: acetone (3:1) ..................................................................... 37

3.2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của α-mangostin lên S. mutans trên biofilm ......................................................................................................... 44

S. mutans trên 3.2.1. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn biofilm… .................................................................................................. 44

3.2.1.1. Ức chế sự giảm pH của môi trường ............................................. 44

3.2.1.2. -mangostin ức chế hoạt tính enzyme liên quan đến quá trình sinh và chống chịu acid F-ATPase và PTS ....................................................... 45 3.2.2. Đánh giá tác dụng ứ c chế sự hình thành biofilm củ a vi khuẩn S . mutans ...................................................................................................... 48

3.2.2.1. -mangostin ức chế sự sinhtổng hợp EPS ngoại bào ................... 48

3.2.2.2. -mangostin làm thay đổi cấu trúc biofilm của S. mutans ............ 49

ến sự 3.2.2.3. -mangostin ức chế hoạt tính các enzyme GTF liên quan đ hình thành biofilm của vi khuẩn S. mutans ............................................... 51 3.3. Khả năng giết vi khuẩn trên biofilm của α-mangostin ...................... 52

3.4. Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm ............................... 53

3.4.1. Bướ c đầu đánh giá tác du ̣ng chống sâu răng của dung dịch nước súc miệng có chứa α-mangostin ...................................................................... 54

3.4.1.1. Khả năng ức chế sự sinh acid ...................................................... 54

3.4.1.2. Khả năng ức chế sự hình thà nh biofilm (mảng bám răng)............ 55 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 58

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

PHỤ LỤC........................................................................................................ 67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Trang

Bảng 1. Công thức hóa học một số xanthone có trong vỏ quả măng cụt 21

Bảng 2.Độ sạch của chế phẩm α-mangostin so vớ i chất chuẩn 40

Bảng 3. Độ sống sót của S. mutans trên biofilm được xử lý vớ i -mangostin53

Bảng 4. Khả năng tích lũy củ a α-mangostin trên biofilm củ a vi khuẩn S. mutans53

Bảng 5. Khả năng ức chế sự sinh a cid của S. mutans trên biofilm của các dung dịch nước súc miệng 55

Bảng 6. Ảnh hưở ng củ a NSM chứa α-mangostin lên sự tích lũy sinh khối biofilm củ a vi khuẩn S. mutans56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Trang

Hình 1.1.Cấu trúc của răng 4

Hình 1.2. Ba giai đoạn chính hình thành mảng bám răng 6

Hình 1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans 8

Hình 1.4. Quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) 20

Hình 1.5. Quá trình hình thành xanthone trong thực vật 22

Hình 2.1. Mô hình ta ̣o biofilm S. mutans trên bề mă ̣t đĩa hydroxyapatite 31

Hình 3.1. Sắc ký đồ phân đoạn chiết vỏ quả măng cụt trong ethanol và n-hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng 36

Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng 37

Hình 3.3. Sắc ký cột silica gel phân đoạn chiết n-hexane của vỏ quả măng cụt với hệ dung môi rửa chiết n-hexane: acetone theo tỉ lệ (3:1) 38

Hình 3.4.A. Sắc ký đồ α-mangostin tinh sa ̣ch từ v ỏ quả măng cụt với hệ dung môi Hexane: acetone (3:1 v/v) 38

Hình 3.4.B. Sắc ký đồ α-mangostin tinh sa ̣ch từ vỏ quả măng cụt với hệ dung môi TEAF (5:3:1:1 v/v) 38

Hình 3.5. Phổ HPLC của chất tinh sạch (A) so vớ i chất chuẩn (B) sau khi qua cột sắc ký silica gel đo trên máy LC-MSD-Trap-SL 39

Hình 3.6. Phổ Proton (A) và 13C (B) của chất -mangostin đo trên máy NMR Bruker, Avance 500 42

43 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của -mangostin (C24H26O6)

Hình 3.8. Sơ đồ qui trình tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Hình 3.9. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutanstrên bioflm 45

Hình 3.10. Ảnh hưởng của -mangostin lên hoạt độ F-ATPase và PTS củaS. mutans trên biofilm 46

Hình 3.11. Ảnh hưởng của -mangostin lên sinh khối biofilm củ a vi khuẩn S. mutans 49

Hình 3.12. -mangostin 150 µM làm thay đổi cấu trúc biofilm của S. mutans 50

Hình 3.13. -mangostin 150µM ảnh hưở ng đến hoa ̣t độ GTF củaS. mutans 51

Hình 3.14. Chế phẩm nướ c súc miê ̣ng chứ a α-mangostin từ vỏ quả măng cu ̣t 54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

MỞ ĐẦU

Sâu răng là một trong những bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và

đang có xu hướng ngày một tăng lên ở các nước đang phát triển. Tổ chức Y tế

thế giới đã c ảnh báo về mức độ phổ bi ến củ a bê ̣nh này ch ỉ sau các bệnh tim

mạch và ung thư [5]. Theo số liệu mới nhất (2015) của Hội Răng Hàm Mặt Việt

Nam, thực tế có tớ i hơn 90% dân số Việt Nam đang đối mặt với các vấn đề về

răng miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng dẫn đến mất răng [59], [60]. Đây

là tỷ lệ thuộc hàng cao nhất thế giới. Ngay cả ở những nước phát triển như Hoa

Kỳ, tỷ lệ sâu răng hiện nay vẫn còn tới 84% ở lứa tuổi thanh niên. Đi kèm với

sâu răng là các bệnh về răng miệng. Trong những năm qua, chi phí cho việc

chăm sóc, sửa chữa răng ta ̣i Viê ̣t Nam đã lên t ới nhiều tỷ đồng. Bệnh sâu răng là

do vi khuẩn trên mảng bám răng gây ra. Những vi khuẩn trên mảng bám răng sử

dụng carbonhydrate để lên men t ạo acid, trong đó chủ yếu là lactic . Môi trường acid sẽ phá v ỡ sự cân b ằng của hệ vi khuẩn đường miệng, tạo điều kiện thích

hợp cho những vi khuẩn có khả năng chịu được pH thấp tiếp tục sinh acid. Khi

lượng acid đủ lớn sẽ hòa tan các chất khoáng có trong men răng dẫn đến làm

mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng [38].

Sử dụng chất kháng khuẩn trong các sản phẩm vệ sinh răng miệng là một

trong những biện pháp phòng chống sâu răng có hiệu quả nhất hiện nay. Trong

số các chất kháng khuẩn đã được sử dụng vào mục đích này, fluor là chất có

tiềm năng hơn cả. Đây là chất có cơ chế tác động hai mặt. Một mặt chất này có

tác dụng kháng vi khuẩn sâu răng mạnh, mặt khác nó lại có vai trò giúp tái tạo

lại men răng và vì vậy có tác dụng làm bền răng. Chính vì thế, fluor vẫn được sử

dụng rộng rãi và cho đến nay chưa có một chất kháng khuẩn nào có thể thay thế

được [43].

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Tuy nhiên, việc xuất hiện hiện tượng bệnh nhiễm fluor (fluorosis) do sử

dụng lâu dài các sản phẩm vệ sinh răng miệng có chứa fluor đã khiến cho các

nhà nghiên cứu và các công ty sản xuất các sản phẩm vệ sinh răng miệng phải

tìm kiếm thêm những hợp chất mới để có thể thay thế fluor hay kết hợp với

fluor, nhưng ở nồng độ thấp hơn mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao. Hàng

loạt các chất kháng khuẩn mới bao gồm những chất tổng hợp và tự nhiên như

các acid yếu, dẫn xuất của các acid béo, triclosan, muối kim loại và cả những

chất có nguồn gốc từ thực vật đã được nghiên cứu và thử nghiệm. Việc tìm kiếm

và sử dụng những chất kháng khuẩn tự nhiên, đặc biệt là các chất có nguồn gốc

thực vật (phytochemicals) đang rất được quan tâm. Hướng nghiên cứu này còn

được gọi là cuộc cách mạng xanh trong y học (green medicine) [9], [19], [43].

Trong lĩnh vực bảo vệ răng miệng, đây cũng là hướng nghiên cứu có nhiều triển

vọng do tính hiê ̣u quả và an toàn cao củ a các chất này .

Những kết quả điều tra trước đây của chúng tôi cho thấy vỏ quả măng cụt

(Garcinia mangostanaL.) có chứa một số polyphenol thuộc nhóm chất

xanthone, trong đó có α-mangostin, có khả năng ức chế sự sinh trưởng, sự sinh

acid, sự hô hấp và diệt vi khuẩn gây sâu răng S. mutans mạnh. Ngoài ra, vỏ quả

măng cu ̣t cũng là nguồn nguyên liê ̣u khá phong phú và rẻ tiền để tách chiết các

chất xanthone vì th ế, Garcinia mangostanaL. sẽ là đối tượng tiềm năng để tinh

sạch, nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng vi khuẩn sâu răng mới (anticaries

, chúng tôi tiến hành agents).Vớ i mong muốn có mô ̣t nghiên cứ u đầy đủ về cơ chế tác du ̣ng kháng vi khuẩn sâu răng củ a α-mangostin từ vỏ quả măng cụt và ứng dụng chúng trong viê ̣c sản xuất mô ̣t loa ̣i sản phẩm vê ̣ sinh răng miê ̣ng mớ i

thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu ả nh hưở ng củ a α-mangostin từ vỏ quả măng cụt

(Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn Streptococcu s mutans trên biofilm và đi ̣nh hướ ng ứ ng dụng ” nhằm mu ̣c đích đưa ra được qui trình tách chiết α- mangostin hiê ̣u quả , đơn giản đồng thờ i kh ẳng định được tác dụng kháng khuẩn

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học sâu răng của chất này trênđối tượng vi khuẩnS. mutans trên biofilmvà bước đầu tạo đươ ̣c chế phẩm nước súc miệng mớ i có tác du ̣ng phòng ch ống bệnh sâu răng.

Đề tài khoá luận tập trung nghiên cứu các nội dung chính sau:

i. Xây dựng qui trình tách chiết α-mangostinđơn giản, đạt hiệu suất cao. ii. Nghiên cứu tác dụng của α-mangostinlên vi khuẩn S. mutans trên biofilm

thông qua việc nghiên cứu ảnh hưởng của chất này lênquá trì nh sinh acid và tạo biofilm c ủa vi khuẩn cũng như các enzyme liên quan đến các quá

trình này.

iii. Nghiên cứ u khả năng tích lũy củ a α-mangostin trên biofilm iv. Tạo dung dịch nước súc miệng có chứa xanthone cùng một số chất hoạt

động khác và đánh giá khả năng chống sâu răng của chế phẩm thu được

trên mô hình biofilm nhân tạo cóso sánh tác dụng với chế phẩm nước súc

miệng thương mại thông qua các chỉ tiêu: i) Ảnh hưởng của chúng lên quá

trình sinh acid của vi khuẩn; ii) Khả năng hạn chế sự tạo mảng bám răng

(dental plaque).

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococus mutans 1.1.1. Bệnh học sâu răng Bệnhsâu răng thực chất là sự tiêu hủy cấu trúc vôi hóa hữu cơ (tinh thể

canxi) của men răng và ngà răng, tạo nên lỗ hổng trên bề mặt răng, do vi khuẩn

gây ra. Ban đầu chỉ là sự tạo thành các lỗ trên bề mặt răng, giai đoạn này không

gây ra triệu chứng, có thể kéo dài vài tháng thậm chí vài năm. Nếu không phát

hiện và điều trị kịp thời thì “sâu răng” sẽ ăn sâu vào tủy, phá hủy tủy, gây chết

tủy. Từ bệnh sâu răng và viên tủy có thể phát sinh ra các biến chứng như viên

quanh cuống răng, rụng răng, viêm xương, viêm hạch v.v... nhiều trường hợp

gây ra tử vong.

Hình 1.1. Cấu trúc của răng

1.1.1.1 Nguyên nhân gây sâu răng

Thương tổn sâu răng là kết quả của sự phân huỷ khoáng (mineral

dissolution) ở tổ chức cứng của răng [4],[6]. Sâu răng xảy ra do nhiều nguyên

nhân nhưng có 3 yếu tố chủ yếu cùng tác động để gây sâu răng:

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

 Vi khuẩn trong hốc miệng.

 Chất bột, đường, dính vào răng bị lên men do vi khuẩn tạo thành acid.

 Acid phá huỷ men răng, tạo điều kiện để hình thành lỗ sâu răng [2].

1.1.1.2. Mảng bám răng (dental plaque)

Mảng bám răng, được xem là mô ̣t biofilm sinh ho ̣c điển hình , chính là một quần thể các vi sinh vật đa dạng về chủng loại tồn tại trên bề mặt răng

[27],[43]. Đó là một lưới polymer sinh học chứa các vi sinh vật và nước bọt.

Thuật ngữ biofilm mô tả quần thể các vi sinh vật bám vào bề mặt giá thể. Sử

dụng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử trong đó có kỹ thuật PCR

(polymerase chain reaction) đã phát hiện tới hơn 500 loài vi khuẩn khác nhau

có mặt trong mảng bám răng [22]. Nhìn chung biofilm có các tính chất sau:

i. Bảo vệ cơ thể vi sinh vật khỏi hệ thống phòng thủ của chính vật chủ hay

của vi sinh vật kẻ thù.

ii. Chống lại sự mất nước.

iii. Chống lại các chất kháng khuẩn thông qua việc tạo kiểu hình mới có tốc

độ sinh trưởng giảm, hạn chế sự tiếp xúc và có khả năng bất hoạt hay

trung hoà các chất kháng khuẩn.

iv. Nồng độ các chất dinh dưỡng trong biofilm tăng cao hơn so với môi

trường xung quanh.

Chính vì những đặc điểm này mà các vi sinh vật sống trên biofilm thường

có khả năng chống chịu cao với các chất kháng khuẩn so với các tế bào sống tự

do trong môi trường nuôi cấy (độ chống chịu có thể cao hơn tới khoảng 1000

lần) [57]. Sự hình thành biofilm bao gồm ba giai đoạn chính. Giai đoạn mở đầu:

vi khuẩn bắt đầu bám vào bề mặt răng. Các mối tương tác đặc hiệu và không đặc

hiệu giữa bề mặt răng và tế bào xuất hiện dẫn đến sự tạo liên kết và sự xâm

chiếm dần dần. Giai đoạn bùng nổtăng trưởng: hình thành biofilm đồng thời với

sự sinh tổng hợp polymer ngoại bào. Giai đoạn mất đi các tế bào trên mảng bám

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học răngvào nước bọt: thúc đẩy sự xâm nhập của các cơ thể vi sinh vật mới vào các

vị trí vừa được giải phóng trên mảng bám răng [43].

thể vi khuẩn vào các tế bào đã

chuyển đến bề mặt của răng

nghịch hình thành do mối

định cư trước. Sự bùng nổ

tương tác phân tử hoá lập thể

tăng trưởng để hình thành

và bám vào răng nhờ các lực tĩnh điện yếu.

biofilm đồng thời với sự sinh

giữa tế bào vi khuẩn và các receptor trên bề mặt răng.

tổng hợp polymer ngoại bào.

C.Sự đồng gắn kết của các cơ A. Vi khuẩn được vận B.Các liên kết không thuận

Hình 1.2. Ba giai đoạn chính hình thành mảng bám răng [43]

1.1.1.3. Cơ chế gây sâu răng

Bệnh sâu răng được khởi đầu bằng sự hình thành mảng bám răng (dental

plaque). Hydrat cacbon trong thức ăn được chuyển hoá thành glucose. Glucose

sau đó được polymer hoá thành dextran bởi enzyme dextranase và

glucosyltransferase. Dextran có tính dính bám nên tạo điều kiện để các vi khuẩn

khác và các mảnh thức ăn bám thêm vào. Sự dính bám còn được gia tăng bởi

những protein trên bề mặt vi khuẩn đang sinh sống tại đó và các polysaccharide

do chúng chuyển hoá tạo ra như là các glucan [38],[43]. Việc hình thành nhiều

lớp vi khuẩn cộng với thức ăn còn tạo ra môi trường cho cả các vi khuẩn kỵ khí

sinh sống. Quá trình tiêu thụ đường thông qua con đường glycolysis với sự sinh

acid bởi vi khuẩn làm cho pH trong mảng bám rănggiảm xuống thấp, thậm chí

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học dưới 4,0. Ở điều kiện pH thấp này, lớp men răng bị bào mòn và dẫn đến sâu

răng.

Các vi khuẩn tham gia chủ yếu vào quá trình này là các Streptococcus

mutans. Ngoài ra còn có S. sobrinus và một số chủng lactobacillus[38]. Acid do

chúng sinh ra còn tấn công cả phần lợi gây ra một số bệnh như viêm nướu răng

(gingivitis), viêm quanh răng (periodontal diseases)... Vì vậy có thể nói, bệnh

sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn gây ra và kiểm soát vi khuẩn trên mảng bám là

biện pháp hữu hiệu để phòng chống sâu răng.

1.1.1.4.Vi khuẩn Streptococcus mutans

Streptococcus là các vi khuẩn Gram (+), gồm một lượng lớn các loài,

phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Một số là các nhân tố gây ra những bệnh

nguy hiểm như viêm phổi (pneumonia), sốt phát ban (scarlet fever), viêm màng

não (meningitis)… Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN mã hoá cho ARN

ribosome 16S, sơ đồ phả hệ của streptococci đã được xây dựng [43]. Trong sơ

đồ đó, ngoài thành viên của hai nhóm Pyrogenic và Bovis cùng với

Streptococcus pneumoniae (nhóm mitis),Streptococcus thermophilus (nhóm

salivarius),Streptococcus suis,Streptococcus acidominimus, là các streptococci

không sinh sống trong miệng động vật, còn lại đều là streptococci xoang miệng

(oral streptococci). Ở xoang miệng của người chỉ thấy hai thành viên của nhóm

mutans là Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus [43].

Streptococcus mutans lần đầu tiên được Clark mô tả năm 1924 sau khi

phân lập được nó từ vùng răng bị tổn thương. Tuy vậy phải đến thập niên 60, khi

các nhà khoa học tập trung nghiên cứu bệnh sâu răng từ giai đoạn sớm, vi khuẩn

này mới được chú ý đến nhiều. Cũng từ đó, rất nhiều dòng mang những đặc tính

hoá sinh tương tự nhau nhưng hoàn toàn phân biệt bởi chỉ thị kháng nguyên đã

được phân lập. Tổng cộng có 7 kiểu chỉ thị kháng nguyên đã được mô tả là a, b,

c, d, e, và f[43]. Những nghiên cứu về sau trên protein, cấu trúc màng, ADN

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học tổng số cũng khẳng định có rất nhiều các biến thể ở những vi khuẩn vốn vẫn

được coi là S. mutans. Dựa trên tất cả các nghiên cứu, S. mutans được chia nhỏ

thành rất nhiều dưới loài riêng biệt. Từ đó, đã ra đời cụm từ "mutans

streptococci" và tên gọi S. mutans không còn thực sự chính xác về mặt phân

loại, tuy nhiên, nó vẫn còn được dùng như một thói quen để gọi tên dòng

Streptococcus xoang miệng phổ biến nhất ở người [43].

Hình 1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans

S. mutans được phát hiện ở tất cả các mảng bám răng và có tỉ lệ rất cao ở

những vùng răng sâu. Các nghiên cứu khác nhau [38], [43] cũng đã chỉ ra đây

chính là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến bệnh sâu răng. Sở dĩ như vậy là vì S.

mutans có những đặc điểm đặc biệt, đó là: i) có khả năng chuyển hoá được

nhiều loại hydrat cacbon khác nhau, ii) chuyển hoá đường bằng con đường lên

men sinh ra rất nhiều acid lactic, iii) chống chịu được pH rất thấp của môi

trường, iv) có khả năng sinh polysaccharide ngoại bào (EPS) mạnh.Do vậy, vi

khuẩn này thường được sử dụng như là đối tượng điển hình cho các nghiên cứu

về sâu răng.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học 1.1.2. Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam

Từ những năm 1940 cho đến những năm 1960, tình hình sâu răng ở các

nước công nghiệp hoá rất nghiêm trọng. Trung bình mỗi trẻ em 12 tuổi có tới 8-

10 răng sâu hoặc răng đã bị mất do sâu. Chỉ số DMFT ( Decayed Mising, Filling

Teeths, phản ánh số răng sâu, số răng mất do sâu hoặc số răng đã trám) ở tuổi 12

của Na Uy năm 1940 cao tới mức 12,0 [2]. Tới những năm 1980, chỉ số DMFT

ở tuổi 12 của các nước công nghiệp đã giảm xuống đáng kể (nằm trong khoảng

từ 2-4) và chỉ còn từ 1 - 2 vào năm 1993. Tuy vậy, tại thời điểm 1997, chỉ số

DMFT ở lứa tuổi trung niên (35 – 44 tuổi) tại các nước công nghiệp phát triển

vẫn còn ở mức rất cao. Ví dụ như Canada, Nhật Bản, Úc và Bắc Âu là 13,9, Hoa

Kỳ là 9,0 - 13,9. Theo những thông báo gần đây, tình trạng sâu răng tuổi thanh

niên của Hoa Kỳ vẫn còn ở mức cao. Cụ thể là 84% thanh niên lứa tuổi 17 có

răng sâu và trung bình mỗi người có 11 mặt răng bị phá huỷ do sâu. Người từ 40

tuổi trở lên có trung bình 30 mặt răng bị sâu và 41% người từ 65 tuổi trở lên

không còn răng.

Ở các nước đang phát triển như Thailand, Uganda, Zaire... chỉ số DMFT

tuổi 12 cuối những năm 1960 chỉ từ 1,0 đến 3,0, nhưng lại tăng lên mức 3,0 - 5,0

và thậm chí cao hơn vào những năm 1970-1980. Nhìn chung, tình trạng sâu răng

có xu hướng tăng lên ở các nước này. Tới 1997, chỉ số DMFT ở lứa tuổi 12 lớn

hơn 4,4 còn gặp ở nhiều nước như Ba Lan (châu Âu), Philipin (châu Á), và

Trung Mỹ. Còn ở lứa tuổi trung niên, mức độ sâu răng cũng rất cao, trung bình

mỗi người có trên 13,9 răng sâu [5].

Ở Việt Nam, các kết quả điều tra răng miệng năm 1991 của Võ Thế

Quang cho thấy sâu răng ở Việt Nam tăng dần theo tuổi, cả về tỉ lệ sâu răng và

chỉ số DMFT. Trần Văn Trường và cs [5] công bố tỉ lệ sâu răng ở Việt Nam sau

điều tra sức khoẻ răng miệng toàn quốc lần thứ 2 năm 2001 là 84,9% ở lứa tuổi

6 - 7; 56,6% ở lứa tuổi 12 và 67,6% ở lứa tuổi 15. Ở người lớn, tỉ lệ này là

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học 75,2% ở lứa tuổi 18 - 34 và 89,7% ở lứa tuổi trên 45. Kèm theo đó, tỉ lệ bệnh

viêm quanh răng cũng rất cao ở cả trẻ em và người lớn. Tỉ lệ người có răng khoẻ

mạnh chỉ đạt mức dưới 10%. Theo số liệu mới nhất (2015) của Hội Răng Hàm

Mặt Việt Nam, thực tế có tớ i hơn 90% dân số Việt Nam đang đối mặt với các vấn đề về răng miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng dẫn đến mất răng [59],

[60].

Đứng trước tình hình đó, ngay từ năm 1908, liên đoàn Nha khoa Quốc tế

(FDI) đã rất quan tâm đến vấn đề dự phòng sâu răng, tuyên bố ủng hộ nguyên

tắc phòng bệnh hơn chữa bệnh, và từ đó liên tục nghiên cứu, tìm kiếm các biện

pháp phòng bệnh sâu răng. Các khuyến cáo về dự phòng sâu răng luôn được đưa

ra nhằm duy trì thành tựu ở các nước công nghiệp phát triển và ngăn chặn gia

tăng bệnh răng miệng ở các nước đang phát triển. WHO đã đưa ra mục tiêu cho

toàn cầu năm 2010 là chỉ số DMFT phải dưới1. Tại Việt Nam, mục tiêu phấn

đấu đến năm 2010 ở độ tuổi 5-6 có 50% trẻ em không bị sâu răng, ở độ tuổi 18

có 85% người giữ được toàn bộ răng, ở tuổi từ 35-44 tuổi giảm 50% số người

không còn răng và trên 65 tuổi giảm 25% số người không còn răng.

1.1.3. Các biện pháp ngăn ngừa sâu răng

Việc loại bỏ bằng cơ học có thể ngăn chặn hoàn toàn sự tạo mảng bám

răng [43].Điều này sẽ có hiệu quả hơn nếu kết hợp với việc giảm bớt thói quen

ăn các sản phẩm có đường. Tuy vậy, việc thay đổi thói quen ăn uống và duy trì

vệ sinh răng miệng tốt rất khó thực hiện. Vì vậy hàng loạt các biện pháp khác

nhau nhằm ngăn chặn sâu răng đã được nghiên cứu và ứng dụng.

1.1.3.1. Sử dụng chất kháng khuẩn

Việc sử dụng chất kháng khuẩn để kiểm soát mảng bám răng đã được

thực hiện trong nhiều năm qua, chủ yếu là những chất chống tạo mảng bám. Sử

dụng nước súc miệng là cách rất có hiệu quả để đưa các chất kháng khuẩn như là

các bisbiguanides, enzyme, muối kim loại, tinh dầu... tiếp xúc với các vi khuẩn

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học trong mảng bám răng [43]. Khi hấp phụ vào mảng bám răng, các chất này sẽ

xâm nhập dần vào bên trong mảng bám, ức chế sự phát triển hoặc quá trình trao

đổi chất của vi khuẩn, làm giảm sự gắn kết của vi khuẩn với bề mặt răng vì vậy

ngăn ngừa sự tạo mảng bám, hạn chế quá trình tích tụ hay liên kết bắc cầu vì vậy

ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn. Các đặc tính quan trọng nhất của chất

kháng khuẩn là ngăn ngừa sự gắn kết, sự xâm nhiễm của vi khuẩn và tác động

đến quá trình trao đổi chất của chúng. Các chất kháng khuẩn thường không tác

động lớn đến các quá trình sinh học, không làm tổn thương lớp màng nhày ở

miệng và ít độc. Vì thế, có thể nói sử dụng chất kháng khuẩn là biện pháp hữu

hiệu nhất hiện nay để kiểm soát sâu răng. Scheie [53] đã phân loại 6 nhóm chất

kháng khuẩn chính là:

1. Cation : các ion tích điện dương có khả năng làm thay đổi chức năng của

màng, sự gắn kết và sử dụng glucose của vi khuẩn.

2. Anion : các ion tích điện âm có khả năng làm thay đổi chức năng của

màng tế bào hay quá trình trao đổi chất trong quá trình đường phân và sử

dụng glucose.

3. Các tác nhân không phải ion: các ion không tích điện có khả năng ức

chế các enzyme trên màng tế bào, dẫn đến làm giảm sử dụng glucose.

4. Enzyme: một số enzyme có khả năng ngăn chặn sự gắn kết của vi khuẩn

hay làm tăng hoạt tính lysozyme.

5. Các đƣờng đa (polyol): có khả năng làm thay đổi quá trình đường phân

hoá của vi khuẩn.

6. Các chất khác: bao gồm các dịch chiết thực vật, các tác nhân tạo phức

càng cua, các acid béo, các tác nhân gây tổn thương oxi hoá (oxidative-

damaging agents). Cơ chế tác động của các chất này rất phức tạp và vẫn

còn đang được nghiên cứu.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học 1.1.3.2. Sử dụng chất thay thế đường

Do thói quen sử dụng đường trong cuộc sống hàng ngày nên vi khuẩn trên

mảng bám răng có điều kiện lên men, sinh acid và kết quả là làm mòn men răng,

gây sâu răng. Vì vậy, người ta đã nghĩ đến việc sử dụng những chất làm ngọt mà

vi khuẩn không thể tiêu thụ được để thay thế đường. Những chất này không gây

ra sự sinh acid nên không gây sâu răng.

Các loại đường nhân tạo này có khả năng kháng khuẩn nhất định thông

qua việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Các đường như manitol, sorbitol

không ngọt như sucrose nên được dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm.

Các đường này không bị vi khuẩn tiêu thụ. Tuy nhiên, việc sử dụng thường

xuyên các loại đường này sẽ dẫn đến sự hình thành các chủng vi khuẩn có khả

năng đồng hoá chúng, đặc biệt là các loài S. mutans. Cơ chế tác động của xylitol

lên vi khuẩn S. mutans cũng đã được tìm hiểu. Khi xylitol đi vào tế bào S.

mutans sẽ can thiệp vào quá trình lên men đường của vi khuẩn bằng cáchtiêu thụ PEP và NAD+ trong quá trình phosphoryl hoá, đồng thời ức chế cạnh tranh với

enzyme phosphofructokinase nhờ chất trao đổi trung gian xylitol-5-phosphate

[43].Chính điều này làm giảm quá trình sinh acid của tế bào, giảm mật độ S.

mutans nên giảm sâu răng ở những người sử dụng xylitol. Nhìn chung, việc sử

dụng các chất thay thế đường có tác dụng khá hiệu quả vì chúng làm mất đi hay

hạn chế tối đa cơ hội phát triển của các vi khuẩn có khả năng sinh và chịu acid.

1.1.3.3. Liệu pháp thay thế (replacement therapy)

Việc sử dụng các vi khuẩn đối kháng để kiểm soát sâu răng đã được sử

dụng từ nhiều năm nay [43].Lợi ích của liệu pháp này là có tác dụng bảo vệ răng

lâu dài và ít tốn kém. Tuy nhiên, liệu pháp này chưa được thử nghiệm nhiều ở

người vì tính an toàn của các chủng vi khuẩn đối với người sử dụng chưa được

nghiên cứu kỹ. Liệu pháp này có hai hướng chính là :

i. Hướng tiền nhiễm: Cấy vào mảng bám răng những vi khuẩn có lợi hay

không gây hại trước khi các chủng không mong muốn xâm nhập và định

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

cư trên mảng bám. Những vi khuẩn tiền nhiễm sẽ loại bỏ những tác nhân

gây bệnh không mong muốn. Các chủng đột biến của streptococci đã bị

làm mất khả năng tạo glucosyltransferase (GTF), hoặc polysaccharide nội

bào, hoặc không có lactate dehydrogenase là những đối tượng thường

được sử dụng trong liệu pháp này.

ii. Hướng thay thế các cơ thể tiền nhiễm có mặt trong mảng bám răng:

Cách này có ưu điểm là không phải xử lý loại bỏ những chủng không

mong muốn trước khi gây nhiễm mới. Ví dụ, S. salivarius thay thế cho S.

mutans trên mảng bám răng của chuột đã làm giảm tỉ lệ sâu răng vì nó

thay thế chủng S. mutans có khả năng sinh acid mạnh.

1.1.3.4. Vacxin

Các nghiên cứu cho thấy có thể tạo được các đáp ứng miễn dịch chống lại

vi khuẩn sâu răng. Vì các đột biến của streptococci là tác nhân chính gây sâu

răng nên người ta nghĩ đến khả năng tạo ra các vacxin bằng việc sử dụng chính

các vi khuẩn này (vacxin) hay các phân tử của các vi khuẩn này (sub-unit

vacxin) để gây miễn dịch [43]. Trên thực tế, hướng nghiên cứu này đã xuất hiện

ở Anh từ hơn 20 năm trước đây. Mặc dù đã thu được một số kết quả khả quan

như làm giảm mật độ tế bào streptococci, giảm tỉ lệ sâu răng, nhưng lại xuất

hiện các phản ứng phụ cũng như xuất hiện các tổn thương mô.

Các nhà nghiên cứu Mỹ lại sử dụng S. sobrinus trên mảng bám răng chuột

để tạo vacxin. Các vacxin sản xuất theo hướng này nhằm mục đích chống lại

enzyme glucosyltransferase, nhờ đó làm giảm khả năng tạo mảng bám răng.

Hướng nghiên cứu này tỏ ra rất có hiệu quả ở chuột nhưng lại không có hiệu quả

ở các loài linh trưởng. Vì vậy người ta nghi ngờ khả năng ứng dụng của nó cho

người.

1.1.3.5. Kiểm soá t sự hình thành biofilm

S. mutans được xác định là tác nhân gây sâu răng chính tồn tại trên mảng

bám răng với 2 đặc tính gây bệnh quan trọng là: i) khả năng sinh acid cao; và ii)

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học khả năng sinh biofilm mạnh do nó có khả năng sản xuất các EPS, bộ khung

chính của biofilm [38]. Trong đó, khả năng sinh EPS của S. mutans gần đây

được xem là nhân tố gây bệnh quan trọng cần được quan tâm nghiên cứu [36],

[37]. Như vậy, có thể nói rằng kiểm soát sâu răng là kiểm soát các đặc tính gây

bệnh của vi khuẩn , hay nói một cách khác là tìm kiếm các chất kháng khuẩn có

khả năng ức chế sự sinh acid (anti-acidogeneic agents) và ức chế sự tạo biofilm

(anti-biofilm agents) của vi khuẩn.

Các nghiên cứu hiện nay tập trung nhiều vào việc làm giảm khả năng biểu

hiện của các yếu tố gây bệnh của S. mutans mà không nhất thiết phải diệt vi

khuẩn đích này. Làm mất khả năng gây bệnh của vi khuẩn nhưng không đe dọa

sự tồn tại của chúng có thể sẽ làm giảm khả năng kháng thuốc và tránh được sự

xáo trộn lớn trong quần thể vi khuẩn cư ngụ. Ví dụ, các chiến lược kiểm soát sự

tạo biofilm thông qua việc ức chế sự hình thành EPS trên bề mặt có thể là biện

pháp thay thế (hay kết hợp) hữu hiệu [37]. Lý do là vì các EPS có thể đóng vai

trò như là một chất hấp thụ phản ứng, vì vậy sẽ làm giảm sự xâm nhập của chất

kháng khuẩn với các tế bào trên biofilm [54]. Như vậy, các chất có khả năng làm

giảm EPS có thể làm tăng tính hiệu quả của chất kháng khuẩn với các tế bào

biofilm. Nhìn chung, các chất kháng khuẩn mới nên có một hay nhiều đặc tính

sau: (1) ức chế sự gắn kết của các glucosyltransferase (GTF) vào bề mặt film;

(2) ức chế sự sinh tổng hợp các EPS trên bề mặt; (3) ảnh hưởng đến cấu trúc

của lưới EPS; (4) ức chế sự dính kết và xâm chiếm của vi khuẩn; (5) làm mất

khả năng sinh acid và các cơ chế thích nghi acid; (6) làm giảm khả năng sinh

trưởng của các vi khuẩn gây bệnh xoang miệng; (7) làm thay đổi hệ sinh thái và

hóa sinh của biofilm [21], [37].

Các chất kháng khuẩn tự nhiên, đặc biệt là các chất kháng khuẩn từ thực

vật (phytochemicals) có thể là những chất thay thế an toàn và hiệu quả. Thực vật

là nguồn cung cấp các chất kháng khuẩn sâu răng mới vì chúng rất giàu các chất

thứ cấp và rất nhiều trong số chúng là những chất kháng khuẩn mạnh [1],[7],

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học [36], [41]. Theo hướng nghiên cứu này, một số dịch chiết thực vật đã được phát

hiện có hoạt tính chống sâu răng khá tốt, ví dụ như dịch chiết chè xanh, ca cao,

chè ôlong, tỏi, licorice, cranberry... Đi sâu nghiên cứu, Makimura và cs[41] cho

thấy epicatechin galat và epigalocatechin galat của chè xanh có khả năng ức chế

colagenease, do đó được xem là có thể có tác dụng làm giảm bệnh viêm quanh

răng. Đặc biệt, Hamada và cs[34] đã phát hiện thấy dịch chiết chè xanh ôlong

người Nhật thường dùng có tác dụng ức chế hoạt tính enzyme GTF của S.

mutans, enzyme có vai trò sản xuất các EPS, do vậy có khả năng ức chế sự hình

thành mảng bám răng. Nghiên cứu của Koo và cs với một số chất polyphenol

trong dịch chiết quả cranberry đã chứng minh chúng có tác dụng ức chế sự sinh

acid của S. mutans [35]. Kết quả này gợi ý rằng việc sử dụng các sản phẩm nước

ép quả cranberry hiện nay trên thị trường không chỉ mang lại lợi ích về dinh

dưỡng mà còn góp phần nâng cao sức khoẻ răng miệng cho cộng đồng dân cư

nói chung. Công bố gần đây của Murata và cs[44] với chất 7-epiclusianone từ

thực vật Rheedia brasiliensis đã cho thấy chất này ức chế mạnh sự sinh acid của

vi khuẩn S. mutans thông qua việc ức chế hai enzyme chịu trách nhiệm cho quá

trình sinh và chịu acid là F-ATPase và phosphotransferase system (PTS) cũng

như ức chế các enzyme GTFB và GTFC, sản xuất các EPS không tan. Nghiên

cứu trên mô hình in vivo của nhóm tác giả này cũng cho kết quả khả quan về tác

dụng ức chế sự tạo mảng bám, qua đó làm giảm tỷ lệ sâu răng trên chuột nghiên

cứu của 7-epiclusianone.

1.2. Một số cơ chế thích nghi acid của vi khuẩn xoang miệng

Các vi khuẩn trong mảng bám răng luôn phải đối mặt với các stress trong

đó có stress acid sinh ra khi vi khuẩn tiêu thụ đường. Vậy các vi khuẩn đã sử

dụng những cơ chế gì để chống chọi và thích nghi với điều kiện khắc nghiệt

này?

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học 1.2.1. Bơm proton F-ATPase

F-ATPase là enzyme liên kết màng, có vai trò vận chuyển proton tạo ra

sự cân bằng pH cho tế bào. Enzyme này có chứa các tiểu đơn vị liên quan đến

việc cung cấp ATP cho hệ thống bơm proton qua màng và trực tiếp tạo ra ATP

thông qua quá trình hô hấp của tế bào. Hệ thống bơm proton qua màng nhờ lực

đẩy proton (proton-motive force) giúp thúc đẩy quá trình bơm proton từ tế bào

chất ra ngoài, nhờ đó duy trì sự ổn định của pH nội bào (pHi) [16], [17], [18].

F-ATPase bao gồm 8 tiểu đơn vị, tồn tại như một tổ hợp protein liên kết

với màng, có khả năng kết hợp giữa việc sản xuất ATP và vận chuyển proton

[18]. Tổ hợp F0 nằm trên màng tế bào có hoạt tính vận chuyển proton bao gồm

các tiểu đơn vị a, c, b. Các tổ hợp F1 liên kết với nhau theo kiểu vòng tròn bao

gồm các tiểu đơn vị α, β, γ, δ và ε.F-ATPase có hoạt tính khi F1 được giải phóng

khỏi màng, lúc này nó xúc tác cho quá trình vận chuyển proton kết hợp với sự

sinh tổng hợp hay phân huỷ ATP. Một điều thú vị là pH tối thích của các tiểu

đơn vị F1 là giống nhau, chỉ khác nhau đáng kể ở phần liên kết với F0 [14].

Không giống các vi khuẩn đường ruột có pH nội sinh (pHi) ổn định,

streptococcus có pHi thay đổi theo môi trường bên ngoài và phụ thuộc vào F-

ATPase để bơm proton ra khỏi tế bào [17]. Sự khác nhau về khả năng chịu acid

của các loài vi khuẩn sinh acid xoang miệng liên quan đến khả năng thấm

proton. Quivey và cs [49] đã chứng minh được khả năng thực hiện đường phân

và chống chịu acid của các chủng S. mutans, S. salivarius và S. sanguis phụ

thuộc chủ yếu vào việc loại proton khỏi tế bào chất nhờ F-ATPase. Các thí

nghiệm với các chất kìm hãm ATPase như dicycloaxylcarbodiamide (DCCD)

cho thấy sự giảm hoạt tính enzyme F-ATPase đã làm tăng tính thấm proton [54].

Như vậy, dòng proton đi vào tế bào ở pH thấp bị loại trừ nhờ bơm proton phụ

thuộc ATP nằm trên màng. Giá trị pH mà tại đó khả năng thấm proton là thấp

nhất khác nhau ở các loài, ví dụ S. mutans (pH 5,0); S. salivarius (pH 6,0) và

loài nhạy cảm acid S. sanguis (pH 7,0), tương ứng với hoạt động của ATPase

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học cho các loài này là 6,0; 7,0; và 8,0. Điều này phản ánh tính chống chịu acid của

các vi khuẩn này và cho thấy tầm quan trọng của F-ATPase trong việc chống lại

stress ở pH thấp.

Vi khuẩn Streptococcus không có chuỗi hô hấp nên không có khả năng sử

dụng phức hệ F1-F0 để tổng hợp ATP thông qua con đuờng phosphoryl hoá-oxy hóa [37]. Do đó, vai trò duy nhất của phức hệ trong các vi khuẩn này là bơm H+

ra ngoài để thiết lập trạng thái cân bằng pH. Tầm quan trọng của phức hệ F1-F0

đã được chứng minh bằng việc tạo ra các đột biến nhạy cảm acid ở pH 6,0 do bị

thiếu hụt phức hợp này [37]. Rõ ràng khả năng tạo ATP nhờ F-ATPase ở pH

thấp có ý nghĩa cơ bản cho sự sống sót của vi khuẩn ở pH thấp cho đến khi pH

môi trường tăng lên [28].

1.2.2. Sự thay đổi của màng tế bào vi khuẩn khi thích nghi acid

Các nghiên cứu về sinh lý của vi khuẩn xoang miệng đã chứng minh rằng

màng tế bào đóng một vai trò quan trọng trong quá trình điều hoà acid-base

[15],[22]. Vai trò này bao gồm việc bơm proton ra khỏi tế bào và loại bỏ proton

khỏi môi trường. Nhờ vậy khi các vi khuẩn sản xuất nhiều acid hay ở trong môi

trường acid thì pHi ở tế bào chất luôn cao hơn pH ở môi trường bên ngoài. Sự

chênh lệch pH qua màng là điều kiện sống còn cho hoạt động của các hệ thống

nhạy cảm acid của tế bào như hệ thống đường phân.

Các nghiên cứu của Bender và cs [18], Chang và Cronan [25] và sau đó

của Ma và cs [39] đều cho thấy tính thấm proton của màng tế bào streptococci

giảm đi khi tế bào thích nghi với điều kiện pH thấp. Như vậy, trong quá trình

thích nghi này, màng tế bào đã có những điều chỉnh nhằm đáp ứng lại những tác

động bất lợi của stress acid. Sự điều chỉnh này đã được Fozo và Quivey phát

hiện khi nghiên cứu thành phần acid béo trên màng tế bào sinh trưởng trong điều

kiện pH thấp [48]. Chủng S. mutans sinh trưởng ở pH 5,0 có thành phần acid

béo bão hoà tăng lên và các chuỗi acid béo cũng dài hơn so với khi sinh trưởng

ở pH 7,0. Trái lại, chủng S. mutans không thích nghi tốt với stress acid thì ít có

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học khả năng thay đổi thành phần màng tế bào. Điều này gợi ý rằng việc tạo ra

những acid béo mạch thẳng C14:0 và C16:0 cũng như sự giảm C18:0 liên quan

đến sự thích nghi acid và có thể có vai trò làm tăng khả năng chống chịu với các

chất diệt khuẩn cũng như ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn ở pH thấp.

Các protein trên màng cũng góp phần vào việc duy trì tính ổn định của

màng tế bào ở pH thấp. Đột biến S. mutans AS17 nhạy cảm acid được tạo ra nhờ

đưa vào bộ gen vi khuẩn đoạn gen Tn917. Kiểu hình này nhạy cảm với acid là

do gen ffh (fifty-four homologue) bị thay đổi [33]. Gen này mã hoá protein Ffh,

có trọng lượng phân tử 54 kDa và giống với tiểu phần nhận biết tín hiệu SRP

(signal recognition particle) của sinh vật nhân chuẩn. Protein này tham gia vào

quá trình vận chuyển protein và sinh tổng hợp màng. Chủng đột biến ffh bị giảm

đáng kể khả năng sinh tổng hợp enzyme F-ATPase, không có khả năng lên men

sorbitol và không thể sinh trưởng ở pH 5,0 [33]. Kết quả này chứng tỏ các

protein trên màng có vai trò bảo vệ tế bào ở điều kiện pH thấp.

1.2.3. Sự sinh các chất kiềm

Một trong các cơ chế giúp vi khuẩn xoang miệng có thể sống sót trong

điều kiện stress acid là khả năng sinh amoniac để trung hoà acid trong tế bào

chất và môi trường bên ngoài [23]. Ba con đường chính mà các vi khuẩn sử

dụng để tạo amoniac là: urease, arginin deiminase (ADS) và agmatin deiminase

(AgDS). NH3 được tạo ra thông qua các con đường này ngay lập tức kết hợp với

các proton có trong tế bào chất hay được vận chuyển qua màng tế bào và kết hợp +, nhờ đó làm tăng pHi với các proton ở môi trường bên ngoài để hình thành NH4

nội bào hay pH của môi trường bên ngoài. Điều này làm tăng tính chống chịu

acid của vi khuẩn.

1.2.3.1. Urease

Urease là enzyme có cấu trúc bậc 4 chứa Ni trong trung tâm hoạt động.

Enzyme này thủy phân ure thành 2 phân tử amoniac và một phân tử CO2. Ở

nước bọt của người khoẻ mạnh, hàm lượng urease đạt từ 3 – 10 mM [34].

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Urease có hoạt tính cao nhất ở pH 7,0, còn khoảng 80% hoạt tính ở pH 5 - 5,5,

nhưng dễ mất hoạt tính ở các pH quá cao hoặc thấp và mất hoàn toàn hoạt tính ở

pH 4,3. Ở pH thấp (pH 5,5), mức độ biểu hiện của enzyme này trong tế bào tăng

lên tới 600 lần so với tế bào phát triển ở pH 7,0. Điều này được chứng minh khi

phát hiện thấy mức độ thay đổi ARNtt đặc hiệu urease cũng phụ thuộc pH. Việc

loại bỏ hệ thống tiếp nhận đường phospho transferase system (PTS) phụ thuộc

glucose đã làm giảm hoạt độ của urease tới 20 lần. Như vậy có mối liên quan

giữa PTS, sự đồng hoá đường và sự điều hoà hoạt tính urease. Mức độ ARNtt

đặc hiệu urease liên quan chặt chẽ với pH đã chứng tỏ urease được điều hoà ở

mức độ phiên mã [26].

1.2.3.2. Hệ thống arginin deiminase (ADS)

Arginin deiminase được mã hoá bởi arc, nằm trong con đường đa enzyme

xúc tác sự chuyển hoá arginin thành ornitin, amoniac, CO2 đồng thời tạo ra

ATP. Arginin deiminase phổ biến rộng rãi ở các vi khuẩn nhân sơ và cấu trúc

bậc một của enzyme này cũng có tính bảo thủ cao [24], [29].

ADS được phát hiện ở nhiều vi khuẩn xoang miệng như S. gordonii, S.

rattus, S. sanguis và nhiều loài lactobacillus [12],[30], [31], [32]. Các vi khuẩn

này có thể sử dụng Arg ở trạng thái tự do, trong các liên kết peptit hay trong

protein của nước bọt [51]. ADS có vai trò quan trọng trong chống chịu acid của

các vi khuẩn, đặc biệt là những loài ít có khả năng chịu acid. ADS có thể tạo

NH3 ở pH dưới ngưỡng cần cho sự phát triển hay cần thiết để tiến hành đường

phân. NH3 hình thành trong tế bào chất sẽ lập tức kết hợp với proton để tạo + làm tăng pHi, vì vậy có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nhạy cảm với thành NH4

acid trong tế bào chất [29]. Chính điều này giúp các vi khuẩn có thể sống sót

được trong mảng bám răng, nơi có nhiều chủng vi khuẩn khác có khả năng chịu

acid cao hơn. Trong số các vi khuẩn xoang miệng có ADS thì S. gordonii là một

trong số vi khuẩn có mặt phổ biến nhất, xuất hiện sớm trên mảng bám răng và là

thành viên chủ yếu trong mảng bám quanh lợi ở người khoẻ mạnh. Sự định cư

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học của nó có lẽ đã ngăn cản sự xâm chiếm của những loài vi khuẩn chịu acid gây

sâu răng khác [30].

Mức độ cảm ứng của hệ thống ADS tăng lên ở pH acid đã phản ánh tầm

quan trọng của nó. Ví dụ mức độ này tăng tới 48 lần ở S. rattus, 1467 lần ở S.

sanguis và hơn 300 lần ở S. gordonii. Ở phần lớn vi khuẩn, ADS được cảm ứng

bởi arginine và bị kìm hãm bởi glucose [50].

1.3. Giới thiệu về cây măng cụt

1.3.1. Đặc điểm sinh học

Măng cụt có tên khoa học là Garcinia mangostana L.thuộc họ Clusiaceae

(Guttiferae). Măng cụt là loại cây gỗ to, có thể cao tới 20 m, lá dày, màu lục

sẫm, hình thuôn dài 15-20 cm, rộng 7-10

cm. Quả măng cụt hình cầu, to bằng quả

cam trung bình, vỏ ngoài màu đỏ sẫm,

dày, phía dưới có lá dài, phía đỉnh có đầu

nhụy. Trong quả có từ 6 đến 18 hạt, quanh

hạt có áo hạt ăn được (hình 1.4 ). Măng

cụt được trồng rộng rãi ở Nam Bộ. Ở

nhiều nước như Malaysia, Indonesia,

Philipin và Campuchia, nước sắc vỏ quả

Hình 1.4. Quả măng cụt (Garcinia mangostana L.)

măng cụt thường được dùng để chữa bệnh đi ngoài hay bệnh lỵ [8].

1.3.2. Các chất xathone trong măng cụt

Măng cụt có chứa nhiều chất hóa học khác nhau và thành phần của chúng

thay đổi tùy theo từng bộ phận của cây. Ví dụ, hàm lượng tannin ở vỏ cây là

khoảng 9-13% nhưng ở vỏ quả chỉ khoảng 5,5%. Các chất hóa học chính được

tìm thấy trong đối tượng này là tannin, chất nhựa (resin), pectin và các dẫn xuất

xanthone.

Măng cụt là thực vật giàu các chất xanthone nhất được phát hiện cho đến

nay. Trong số hơn 200 dẫn xuất xanthone được phát hiện ở thực vật thì có đến

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học hơn 60 dẫn xuất được tìm thấy ở măng cụt và tập trung nhiều ở phần vỏ quả.

Với những tính chất sinh học đặc biệt quý, các chất xanthone, đặc biệt là

xanthone từ măng cụt đang được các nhà khoa học hết sức quan tâm. Bảng 1

giới thiệu một số xanthone chính có trong vỏ quả măng cụt.

Bảng 1. Công thức hóa học một số xanthone có trong vỏ quả măng cụt [47] STT Hợp chất CTHH

(1,3,6,7- Tetrahydroxy-2,8-diprenylxanthone;7-Me ether)

α- Mangostin 1 C24H26O6

(1,3,6,7- Tetrahydroxy-2,8-diprenylxanthone;3,7-Di-Me ether)

β- Mangostin 2 C25H28O6

( 1,3,6,7- Tetrahydroxy-2,8-diprenylxanthone)

γ- Mangostin 3 C23H24O6

3-isomagostin 4 C24H26O6

1-isomagostin 5 C24H26O6

Garcinone A 6 C24H28O7

Garcinone B 7 C24H26O7

Egonol 8 C19H18O5

1.3.3. Sinh tổng hợp các chất xanthone

Xanthone ở thực vật được tổng hợp chính từ acetate và acid shikimic, một

sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi acid amin thơm. Vì vậy, nó được gọi

là con đường sinh tổng hợp shikemate-acetate. Tuy nhiên, ở các loài thực vật

bậc thấp, xanthone được tổng hợp hoàn toàn chỉ từ acetate mà thôi [47].

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Quá trình tổng hợp xathone theo con đường shikemate-acetate (Hình 1.5)

bao gồm những bước chính là: (i) sự kết hợp của acid shikimic với acetate, (ii)

sự hình thành chất trung gian benzophenon và (iii) sự oxy hóa phân tử

benzophenon để hình thành nên vòng xanthone.

Hình 1.5. Quá trình hình thành xanthone trong thực vật [47]

Các dẫn xuất của acid shikimic được sử dụng như là các tiền chất cho sự

sinh tổng hợp các tetrahydroxyxanthone. Các loài thực vật thuộc các họ khác

nhau có các con đường sinh tổng hợp tetrahydroxyxanthone khác nhau. Điều

này liên quan tới thành phần các enzyme và cơ chất tham gia vào quá trình sinh

tổng hợp, dẫn đến sự hình thành các chất trung gian khác nhau. Sự tổng hợp

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học tetrahydroxyxanthone từ 3-hydroxybenzoate và benzoate trong Centaurium

erythraea và Hypericum androsaemum được trình bày ở hình 1.5.

1.3.4. Tác dụng sinh học của các chất xanthone trong cây măng cụt

Các chất xanthone trong cây măng cụt có nhiều đặc tính dược lý và các

hoạt tính sinh học quý. Chính vì thế, việc tìm thấy các xanthone trong măng cụt

được coi là một trong những phát hiện lớn của y học. Những hoạt tính sinh học

chủ yếu đã được phát hiện bao gồm:

1.3.4.1. Hoạt tính kháng khuẩn

Các xanthone trong măng cụt có tác dụng diệt khuẩn mạnh. Hàng loạt các

nghiên cứu đã chỉ ra rằng xanthone của măng cụt trong đó có mangostin có khả

năng kháng nấm và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus

kháng methicilin ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) khoảng 0,3 – 1,2 µg/ml, thấp

hơn nhiều so với giá trị MIC của chất kháng sinh vancomycin với vi khuẩn này

(3,13 – 6,25 µg/ml) [47]. Không những thế, α-mangostin của vỏ quả măng cụt

còn có tác dụng ức chế hoạt tính enzyme HIV-1 protease với nồng độ ức chế

50% hoạt độ enzyme (IC50) là 5,1 µM.

1.3.4.2. Hoạt tính kháng nấm

Mangostin của măng cụt có khả năng kháng được một số loài vi khuẩn

gây bệnh ngoài da như Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum và

Epidermophyton floccosum ở nồng độ 1µg/ml, nhưng không có tác dụng trên

nấm Candida albicans [7]. Ngoài ra, một số xanthone tách từ vỏ măng cụt còn

có hoạt tính chống các loại nấm gây bệnh cho lúa mì và các cây nông nghiệp

như Fusarium oxysporum, Alternaria tenuis và Dreschlera oryzae.

1.3.4.3. Tác dụng chống oxi hóa

Mangostin trong măng cụt được chứng minh là có khả năng chống oxi

hóa, thậm chí còn mạnh hơn gấp nhiều lần so với các vitamin nhóm C và nhóm

E. Các nghiên cứu in vitro của Williams và cs [58] và tiếp theo là của

Mahabusarakam và cs [40] đã cho thấy mangostin trong măng cụt có tác dụng

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học làm ức chế sự oxi hóa các lipoprotein có tỷ trọng thấp (low density lipoprotein –

LDL). Chúng đóng vai trò như là các chất săn lùng gốc tự do để bảo vệ các LDL

khỏi bị tổn thương oxi hóa, vì thế ngăn ngừa được hội chứng xơ vữa động mạch

và có tác dụng làm chậm sự lão hóa.

1.3.4.4. Tác dụng chống viêm (anti-inflamation)

Nakatami và cs [45] đã chứng minh được γ-mangostin trong măng cụt là

chất ức chế mạnh của COX (cyclooxgenase)-2. Enzyme COX-2 là tác nhân gây

viêm trong cơ thể người. Các enzyme này thường có mặt ở các bệnh nhân bị đau

khớp hay bị viêm khớp. Các tác giả đã phát hiện thấy chất này làm giảm rõ rệt

sự hình thành enzyme COX-2. Hội chứng viêm kinh niên là một trong những

căn nguyên hàng đầu dẫn đến bệnh tiểu đường tuýp 2, các chất xanthone có thể

giúp ngăn ngừa bệnh này thông qua việc làm giảm và điều hòa lượng đường

trong máu, tăng sinh lực cho cơ thể người bệnh.

1.3.4.5. Hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất xanthone trong măng cụt được

đặc biệt quan tâm trong thời gian gần đây do chúng có khả năng ức chế sự phát

triển của các dòng tế bào ung thư khác nhau. Sato và cs [52] khi nghiên cứu tác

dụng gây apoptosis của 8 dẫn xuất xanthone khác nhau trên tế bào ung thư ưa

crôm (pheochromocytoma) ở chuột đã phát hiện thấy các dẫn xuất này đều có

tác dụng gây ra hiện tượng apoptosis nhưng α-mangostin có tác dụng mạnh nhất.

Nhóm nghiên cứu của Ho [33] lại phát hiện thấy garcinone-E có hoạt tính diệt

mạnh các tế bào ung thư người thuộc các dòng ung thư dạ dày, phổi và gan. Đặc

biệt, Matsumoto và cs [42] khi nghiên cứu tác dụng của 6 xanthone khác nhau từ

vỏ quả măng cụt lên sự phát triển của dòng tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở

người đã thu được một kết quả hết sức thú vị là tất cả các dẫn xuất xanthone

nghiên cứu đều có tác dụng ức chế, trong đó α-mangostin có hoạt tính ức chế

hoàn toàn ở nồng độ 10µM thông qua con đường apoptosis.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy rằng các dẫn xuất xanthone từ

măng cụt có tác dụng ức chế có hiệu quả sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung

thư người khác nhau và có thể nói các chất này có rất nhiều tiềm năng ứng dụng

trong điều trị bệnh ung thư.

Việt Nam là nước trồng măng cụt nhiều. Đây chính là nguồn nguyên liệu

phong phú để tinh sạch, nghiên cứu tác dụng sinh học và khả năng ứng dụng của

các chất xanthone, đặc biệt là hoạt tính kháng biofilm .Cơ chế sâu về tác dụng

kháng biofilm củ a chất này cũng như tiềm năng ứ ng du ̣ng củ a nó là vấn đề rất

hấp dẫn, cần phải được làm sáng tỏ.

Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học 2.1. Chủng vi sinh vật và các điều kiện nuôi cấy

Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans UA159 là quà tặng của GS .

Robert E. Marquis, Khoa Vi sinh và Miễn dịch học, Trường Đại học Rochester,

Hoa Kỳ. Đây là chủng vi khuẩn có lý lịch rõ ràng, thường được các phòng thí

nghiệm quốc tế sử dụng trong các nghiên cứu về sâu răng. Chủng này được giữ

và cấy chuyển hàng tuần trên môi trường tryptic soy agar (TSA) của hãng Difco (Hoa Kỳ). Vi khuẩn được nuôi cấy ở 37oC trong môi trường chứa 3% tryptone,

0,5% dịch chiết nấm men và 1% glucose (TYG).

2.2. Nguyên liệu thực vật

Vỏ quả măng cụt được thu mua từ các chợ ở Hà Nội và được GS.TS.

Phan Kế Lộc giúp định tên khoa học là Garcinia mangostanaL.. Nguyên liệu được sấy khô trong tủ ấm ở 60oC, nghiền thành bột mịn và sau đó được ngâm

chiết trong ethanol 96% theo tỉ lệ 1 nguyên liệu : 3 thể tích dung môi. Dịch chiết

rút sau đó được cô chân không và sử dụng như nguyên liệu khởi đầu cho các

bước tinh sạch tiếp theo.

2.3. Hóa chấtvà thiết bị

Hóa chất

- Các thành phần môi trường được sử dụng trong việc nuôi cấy vi sinh vật

bao gồm tryptone, dịch chiết nấm men, cao thi ̣t bò , peptone (Difco, Mỹ).

-Bản silica gel tráng sẵn 60 F254 25 , tấm nhôm (20 x 20 cm) của hãng

Merk (Đức).

- Silica gel (Grade 7734, 63-200 μm 70-230 mesh).

- Các chất nhuộm huỳnh quang Alexa Fluor® 647-và SYTO®9 green

đươ ̣c mua từ hãng Invitrogen (Mỹ).

- Các dung môi dùng trong sắc ký có độ sạch phân tích và có nguồn gốc

từ Trung Quốc.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

- Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết cho phân tích.

Thiết bị

- Máy ly tâm

- Máy đo quang phổ

- Máy đo pH

- Máy soi bản gel sắc ký lớ p mỏng

- Box cấy laminare

- Máy quay cất khô chân không

- Kính hi ển vi huỳnh quang quét laser

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu tế bào

2.4.1.1. Chuẩn bị dịch tế bào

Dung dịch tế bào được chuẩn bị trong dung di ̣ch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM pH 7,0 với mật độ khoảng 109 tế bào/ml. Dịch tế bào được

pha loãng trong dung dịch peptone 1% ở các mật độ nhỏ dần 10 lần và được cấy

trải trên đĩa thạch TSA, nuôi ở 37C cho đến khi các khuẩn lạc hình thành rõ rệt

và có thể đếm bằng mắt thường [10].

2.4.1.2. Đo mức độ sinh acid của tế bào (pH drop)

Khả năng sinh acid của tế bào được đánh giá thông qua việc làm giảm pH

của môi trường bên ngoài dẫn đến sự tụt pH (pH drop). Các giá trị pH tại mỗi

thời điểm nghiên cứu nhất định được đo bằng máy đo pH.

Sau khi thu tế bào từ biofilm bằng cách ly tâm 6000 gở 40C trong 15 phút, tế bào được rửa 2 lần với dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1

mM.Sau đó, tế bào được hòa trở lại trong dung dịch muối này ở mật độ khoảng 5 x 109 CFU/ml, tương đương 2 mg trọng lượng khô tế bào/ml. pH của dịch tế

bào được chỉnh đến 7,2 bằng KOH 1M. Glucose được bổ sung vào để đạt nồng

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học độ cuối cùng là 0,04%, đảm bảo môi trường dư thừa cơ chất cho quá trình

đường phân. Sự giảm pH môi trường do sự sinh acid trong quá trình đường phân

được theo dõi sử dụng máy đo pH MP225 Mettler Toledo, Đức [10].

2.4.2. Các phƣơng pháp xác định hoạt đô ̣ enzyme

2.4.2.1. Chuẩn bị tế bào thấm

Tế bào S.mutans được thu hoạch từ biofilm sau 68 giờ nuôi cấy . Tiến hành ly tâm với tốc độ 6000 g ở 40C trong 15 phút. Cặn tế bào được rửa 2 lần

với dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM, sau đó tế bào được

hòa trở lại trong đệm Tris – HCl 75 mM, pH 7,0 có chứa MgSO4 10 mM. Sau khi thêm toluene (tỉ lệ 1 : 10 thể tích), dịch tế bào được trộn đều và ủ ở 370C

trong 5 phút. Tế bào nhanh chóng đươ ̣c làm đông lạnh trong hỗn hợp đá khô với ethanol trong 1 phút. Ngay sau đó, dịch tế bào được làm tan ở 370C trong 5 phút.

Chu kỳ này được lặp lại 2 lần. Toluene được loại bỏ bằng cách ly tâm với tốc độ 6000 g ở 40C trong 15 phút. Tế bào thấm được hòa trở lại trong đệm Tris – HCl 75 mM, pH 7,0 có chứa MgSO4 10 mM và được cất giữ ở -700C đến khi dùng

[10].

2.4.2.2. Xác định hoạt độ enzyme phosphoryl hóa đường (PTS)

Hoạt động của hệ thống ezyme chuyển hóa đường (PTS) được xác định

theo phương pháp của Belli và Marquirs [16]. Phản ứng được thực hiện với tế

bào thấm. Hoạt độ của enzyme được xác định dựa trên sản phẩm tạo thành là

pyruvate từ phosphoenolpyruvate, là sản phẩm trung gian khi tế bào tiêu thụ

glucose. Pyruvate tạo thành được xác định bằng enzyme lactate dehydrogenase

trong sự có mặt của NADH. Hỗn hợp phản ứng bao gồm đệm Tris – malate 50

mM (có chứa MgCl2 20 mM, NAF 1 mM và glucose 40 mM, pH 7,0), MgCl2 10

mM, KCl 100 mM, EDTA 0,5 mM, ADP và tế bào thấm. Phản ứng được bắt

đầu bằng việc thêm vào hỗn hợp phản ứng phosphoenolpyruvate (PEP) 10 mM.

Đo độ hấp thụ tại A340.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Một đơn vị hoạt độ PTS là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển

hóa 1µmole pyruvate thành lactate trong 1 phút, tương ứng với 1µmole glucose

được phosphoryl hóa trong 1 phút ở điều kiện phân tích.

2.4.2.3. Xác định hoạt độ enzyme F – ATPase

ATPase được xác định với tế bào thấm theo phương pháp của Sturr và

Marquis [55]. Hoạt động của enzyme được xác định thông qua việc đo lượng

phospho vô cơ được giải phóng ra sử dụng thuốc thử Beccini. Thuốc thử này có

chứa ZnCl2 100mM và amonium molybdate 15mM. Hỗn hợp phản ứng enzym

có chứa đệm Tris – malate 100 mM, pH 7,0, MgCl2 10 mM và tế bào thấm.

Phản ứng được bắt đầu bằng việc bổ sung ATP 5 mM. Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp này được ly tâm với tốc độ 6.000 g ở 40C trong 15 phút. Phần dịch

trên kết tủa được trộn đều với thuốc thử Beccini và đo độ hấp thụ ở A350. Lượng

phospho trong mẫu nghiên cứu được tính dựa vào đồ thị chuẩn sử dụng dung

dịch phospho chuẩn (Sigma).

Một đơn vị hoạt độ ATPase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1

µmole phospho vô cơ trong 1 phút ở điều kiện phản ứng.

2.4.2.4. Xác định hoạt độ enzyme glucosyltransferase (GTF)

Hoạt độ GTF được xác định theo phương pháp của Koo và cs [35]. GTFB

và GTFC thu được từ những chủng tế bào tái tổ hợp mang gen sinh tổng hợp chỉ

một loại enzyme này. Chủng S. milleri KSB8 mang gen gtfB lấy từ chủng S.

mutans GS-5. Chủng S. mutans WHB 410 có các gen gtfB và gtfD đã bị cắt bỏ

chỉ còn gen gtfC. Các enzyme GTFB và GTFC là những chế phẩm enzyme tinh

sạch đến mức gần đồng nhất, sử dụng cột sắc ký hydroxyapatite theo phương

pháp của Venkitaraman và cs [56]. Trong thí nghiệm ở đây, các enzyme GTFB

và GTFC được Koo H. (Trung tâm Sinh học Xoang miệng, Đại học Rochester,

Hoa Kỳ) cung cấp.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Một đơn vị hoạt độ enzyme GTF là lượng emzym cần thiết để kết hợp 1,0

mol glucose vào glucan trong 4 giờ phản ứng ở điều kiện thí nghiệm.

Hoạt độ enzyme được xác định đối với enzyme ở trạng thái enzyme hoà

tan trong dung dịch. Các enzyme GTFC và GTFB được trộn đều với chất nghiên cứu và được ủ với cơ chất [14C-glucose]- sucrose. Hỗn hợp phản ứng bao gồm

cơ chất 0,2 Ci/ml, sucrose 200 mM, dextran 9000 40 mM, Na3N 0,02% và đệm

hấp phụ có chứa KCl 50 mM, KHPO4 1,0mM, CaCl2 1,0 mM và MgCl2 0,1mM,

pH 6,5. Mẫu đối chứng có chứa các thành phần tương tự chỉ khác là chất nghiên

cứu được thay thế bằng ethanol. Hỗn hợp phản ứng được lắc liên tục trong 4 giờ ở 37oC sau đó 1 ml ethanol lạnh được thêm vào để dừng phản ứng. Quá trình kết tủa glucan được thực hiện trong vòng 18 giờ ở 4oC. Các glucan có mang glucose

đánh dấu được xác định bằng máy đếm nhấp nháy lỏng (Hoa Kỳ).

2.4.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu về biofilm

2.4.3.1. Tạo biofilm

Biofilm (mô hình bắt chước mảng bám răng) được hình thành trên các lam

kính và trên các đĩa hydroxyapatite có đường kính 0,5 cm (Clarkson

Chromatography Products Inc . Hoa Kỳ ) (Hình 2.1). Môi trường cho nuôi cấy tế bào biofilm có chứa tryptone 3%, dịch chiết nấm men 0,5% và sucrose 1%.

Biofilm được thu hoạch sau 68 giờ nuôi cấy . Để tách rời các tế bào khỏi màng

biofilm, các màng này đư ợc tách khỏi giá thể vào trong dung dịch NaCl 0,89%

và sau đó đư ợc làm đồng nhất bằng máy nghiền đồng thể và máy siêu âm

(Branson sonifier 150, Hoa Kỳ ). Biofilm đươ ̣c xử lý vớ i chất nghiên cứ u lần/ngày, cách nhau 8 tiếng trong thờ i gian 1 phút. Trong mô ̣t số thí nghiê ̣m , biofilm cũng đươ ̣c ta ̣o trên nền giá đỡ là lam kí nh thủ y tinh có kích thướ c 3 x 12 cm vớ i một quy trình tương tự [10], [35],[37].

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Đĩa hydroxyapatite Giá đỡ biofilm Đĩa nuôi cấy biofilm

Hình 2.1. Mô hình ta ̣o biofilm S. mutans trên bề mă ̣t đi ̃a hydroxyapatite

2.4.3.2. Xác định thành phần biofilm

Sau 5 ngày nuôi cấy, biofilm được thu hoạch, siêu âm và dùng để đánh

giá: i) Sinh khối biofilm: được thu lại sau khi ly tâm 10.000 g trong 10 phút ở 4oC. Phần tủa được rửa 2 lần với nước cất loại ion và xác định trọng lượng khô;

ii) Độ sốngcủa tế bào trên biofilm: đươ ̣c xác đi ̣nh bằng cách cấy trải tế bào trên

biofilm lên đĩa tha ̣ch TSA.

2.4.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm dưới kính hiển vi huỳnh quang quét lase

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ đánh giá sinh khối biofilm (biomass)

và sự phân bố các thành phần EPS và vi khuẩn trong các biofilm sử dụng

phương pháp nhuộm huỳnh quang đánh dấu in situ đặc hiệu kết hợp với phân

tích hình ảnh trên kình hiển vi huỳnh quang đồng tụ quét laser (LSCFM).

Phương pháp này cho phép phân tích định tính và quan sát được các tế bào vi

khuẩn và thành phần EPS, qua đó kiểm tra chính xác được cấu trúc biofilm.

Đánh dấu in situ EPS được thực hiện như sau: phức hợp dextran đánh dấu Alexa

Fluor® 647-(10,000 MW; Molecular Probes Inc., Eugene, OR) được thêm vào

môi trường nuôi cấy trong quá trình phát triển của biofilm. Dextran đánh dấu

huỳnh quang đóng vai trò như là 1 primer cho các enzyme GTF và được kết hợp

một cách tự động vào khung EPS trong quá trình hình thành biofilm nhưng

không nhuộm tế bào vi khuẩn ở nồng độ sử dụng này. Vi khuẩn trong biofilm

được đánh dấu với chất nhuộm acid nucleic SYTO® 9 green (480/500 nm;

Molecular Probes Inc., Eugene, OR). Hình ảnh của biofilm được quan sát sử 31

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học dụng kính hiển vi LSCFM. Mỗi biofilm được quét 5 lần tại một vị trí lựa chọn.

Cấu trúc 3 chiều của biofilm được phân tích dùng phần mềm Amira™ 4.1.1

(Chelmsford, MS, USA)[37].

2.5. Đánh giá sƣ̣ tích lũy củ a α-mangostin trên biofilm Biofilm đươ ̣c thu hoa ̣ch sau 68 giờ nuôi cấy. Sinh khối biofilm đươ ̣c thu lại bằng cách siêu âm và ly tâm ở 9.500gtrong 10 phút ở 4oC. Tủa biofilm đươ ̣c rử a 2 lần vớ i nướ c loa ̣i ion . -mangostin đươ ̣c phản hấp phu ̣ bằng viê ̣c rử a vớ i

100% ethanol (Sigma). Hàm lượng -mangostin trên mỗi biofilm đ ược đo bằng

máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Alliance series 2695, detector PDA 2996

Waters, US). -mangostin thương ma ̣i 96% (ChromaDex) đươ ̣c sử du ̣ng như là

chất chuẩn. Các thông số đ ược sử dụng trên c ột HPLC là : column: Sunfire -C18

RP (4.6 x 150 mm), 5µm, phase di động: H2O thêm 0,1% formic acid (channel

A) và Acetonitrile (channel B), flow rate: gradient 1ml/min, detector PDA: 315

nm.

2.6. Tinh sạch hoạt chất khoáng khuẩn S. mutans từ vỏ quả măng cụt

2.6.1. Tách các hợp chất polyphenol bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

(TLC)

Việc phân tích được thực hiện trên các bản sắc ký đã được chuẩn bị sẵn

có độ dày 1mm (60 F254, Merck). Các hệ dung môi phân tích được sử du ̣ng

gồm có: i) Toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5: 3: 2:

1; ii) Hexane: acetone theo tỉ lệ 3:1 và 2:1; iii) Hexane: ethyl acetate theo tỉ lệ

3:1. Sau khi chạy sắc ký xong, bản sắc ký được làm khô ở nhiệt độ phòng. Màu

sắc các vạch được quan sát dưới ánh sáng thường hoă ̣c xông hơi NH 3.

Sắc ký cột silica gel

Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân

bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh. Đối với sắc ký cột:

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

- Pha tĩnh: là chất rắn, thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó

có thể được nạp nén vào trong một cột có kích thướ c đươ ̣c tính toán dựa trên lươ ̣ng mẫu sẽ na ̣p lên cô ̣t .

- Pha động: là chất lỏng, được gọi là dung môi rử a cô ̣t .

Trong thí nghiê ̣m này , phân đoạn chứ a chất quan tâm được phân tách trên các cột sắc ký nhồi h ạt silica có kích thước 70 - 230 mesh (Merck) sử du ̣ng hê ̣

dung môi đã lựa cho ̣n vớ i các bư ớc gradient khác nhau . Các phân đoạn tinh sạch sau đó đươ ̣c kiểm tra đô ̣ sa ̣ch bằng sắc ký lớ p mỏng và đo phổ cô ̣ng hưở ng từ hạt nhân 1HNMR, 13C NMR (Bruker Avance - 500, Hoa Kỳ).

2.6.2. Phân tích cấu trúc hó a học bằng cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) Đối với phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, chất nghiên cứu sau khi

được đưa vào vùng từ trường Bo sẽ bị tách thành những proton có các mức năng

lượng khác nhau từ thấp đến cao. Sự khác nhau này được phản ánh thông qua

tần số cộng hưởng. Tần số này được ghi lại dưới dạng các phổ proton, carbon,

HMBC, HPQC, COSY, NOESY nhờ máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker,

Avance 500 (Hoa kỳ). Dựa vào độ dịch chuyển của các proton khi giải các phổ

trên sẽ xác định được số nguyên tử C, H cũng như những nhóm chức có thể

tham gia vào bộ khung carbon. Kết hợp với những số liệu thu được từ máy đo

khối phổ sẽ cho phép xác định cấu trúc hoá học của chất cần nghiên cứu.

2.7. Xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sử dụng tiêu chuẩn t-

test hoặc ANOVA trong trường hợp so sánh nhiều mẫu với giá trị p < 0,05.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu quy trình chiết xuất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt

3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa -mangostin từ vỏ quả măng cụt

Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện thấy cây măng cụt, đặc biệt là vỏ

quả và vỏ cây, chứa nhiều hợp chất phenol nhất là nhóm chất xanthone trong đó

có -mangostin [1],[7]. Đến nay, đã có hơn 60 dẫn xuất xanthone khác nhau

trong măng cụt được tinh sạch và xác định cấu trúc (Dictionary of Natural

Products - DNPonCD-Rom). Mặc dù đã tr ở thành chế phẩm hóa chất thương

(150 mại trong thời gian gần đây , nhưng giá thành c ủa chất này còn rất cao

USD/ 10 mg–Sigma).Trong khi đó , viê ̣c nghiên cứ u sâu cũng như ứ ng du ̣ng đò i

hỏi cần một lượng chất lớn . Vì thế, việc tách và tinh sạch chúng từ nguồn

nguyên liệu tự nhiên là cần thiết .

Để tinh sạch các xanthone, phần lớn các phòng thí nghiệm đều bắt đầu

bằng việc sử dụng dịch chiết với ethanol hay methanol. Các xanthone sẽ được

tinh sạch từ các dịch chiết này bằng phương pháp sắc ký trên các cột silica gel

sử dụng các hệ dung môi hữu cơ có tỉ lệ phân cực khác nhau để đẩy dần các chất

này ra khỏi cột. Nhìn chung, để tinh sạch được một chất xanthone phải sử dụng

thêm nhiều phương pháp sắc ký khác như sắc ký ngược pha, sắc ký trên cột

sephadex LH-20, nên rất phức tạp và tốn kém. Nguyễn Thị Mai Phương và

cscũng đã tách được α-mangostin từ dịch chiết ethanol của vỏ quả măng cụt sử

dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi toluene: ethyl acetate:

acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5:3:1:1 [10]. Tuy vậy, qui trình tách chiết

chất này tỏ ra không hiệu quả mặc dù khá đơn gi ản vì hiệu suất thu hồi sản phẩm rất thấp. Các tác giả này cũng phát hiện thấy rằng các chất phenol có hoạt

tính sinh học quan tâm là những chất có hệ số Rf lớn, nằm trong khoảng từ 8,0

đến 9,0 đồng nghĩa với việc chúng có tính phân cực thấp. Nhóm nghiên cứu này

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học sau đó đã đơn gi ản hóa quá trình tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt

bằng cách sử dụng những phân đoạn chiết trong dung môi hữu cơ có độ phân

cực thấp như toluene, chloroform hay n-hexane nhằm loại bỏ phần lớn các chất

không mong muốn khác có trong nguyên liệu ban đầu. Dung môi n -hexane đã được lựa chọn vì nó có điểm sôi thấp hơn (61oC) so với chloroform hay toluene (>100 oC) và cũng có hằng số lưỡng điện (dielectric constant) rất thấp (1,89 so

với 4,81 của chloroform và 2,38 của toluene). Nhờ vậy, qui trình tinh sạch này

đã có hiệu suất caohơn . Nhóm tác giả đã tinh sạch -mangostin sử du ̣ng quy

trình gồm các bước : i) tách chiết phân đoạn trong n-hexane; ii) sắc ký phân đoa ̣n

cao chiết n-hexane trên 2 cô ̣t silica gel liên tiếp sử du ̣ng h ệ dung môi rửa chiết n-

hexane : ethyl acetate : methanol vớ i gradient dung môi có tính phân c ực giảm

dần. Bằng quy trình này , -mangostin đã được tinh sạch hoàn toàn với hiệu suất thu hồi đạt 0,013% và độ sạch đạt >98% [11]. Hiệu suất này cao hơn nhiều so

với qui trình tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng đã thực hiê ̣n trướ c đây [10]. Tuy nhiên, có thể thấy quy trình đ ược đưa ra vẫn chưa đa ̣ t hiê ̣u quả cao so với các quy trình đã được các tác giả khác công bố [10].

Vớ i mu ̣c đích tìm ra đ ược quy trình tinh sa ̣ch -mangostin tối ưu hơn ,

trong nghiên cứ u này , chúng tôi đã tiến hành tinh sa ̣ch -mangostin từ phân

đoạn chiết n -hexane sử du ̣ng cô ̣t sắc ký sil icagel vớ i hê ̣ du ̣ng môi rử a c hiết đươ ̣c thay đổi. Cụ thể như sau:

Bột nguyên liệu vỏ quả măng cụt khô (2,0 kg) đã tiến hành chi ết rút vớ i ethanol bằng phương pháp ngâm chiết theo tỉ lê ̣ 1 nguyên liê ̣u : 3 thể tích ethanol trong 3 ngày để thu cao ethanol tổng số . Ethanol đã được kh ẳng đi ̣nh là dung môi phù hơ ̣p nhất để chiết r út polyphenol từ vỏ quả măng cụt xét về tiêu chí hiệu suất thu

. Quá trình chiết này

hồi cao chiết và hiê ̣u quả kinh tế củ a quy trình thu nhâ ̣n được lặp la ̣i 3 lần. Dịch chiết s au đó đươ ̣c cô cất quay để thu cao ethanol tổng số.Khối lươ ̣ng cao ethanol tổng số thu đươ ̣c từ thí nghiê ̣m này là 153,6 g.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Để thu nhâ ̣n phân đoa ̣n chiết n -hexane, cao ethanol tổng số đươ ̣c hòa vào nướ c và tiến hành chiết p hân đoa ̣n vớ i n -hexane trong phễu chiết . Phần phân đoa ̣n n-hexane sau khi thu được quay cất khô chân không và cân để đi ̣nh lươ ̣ng

phân đoa ̣n thu đươ ̣c . Trong thí nghiê ̣m này , lươ ̣ng cao phân đoa ̣n n -hexane thu được là 8,2 g chiếm 0,41% so vớ i khối lươ ̣ng ban đầu .

Độ sạch của phân đoạn n-hexane được kiểm tra bằng phương pháp TLC

trên silica gel (Hình 3.1) sử dụng hệ dung môi n-hexane : acetone theo tỉ lệ 3:1

vớ i chất chuẩn -mangostin (ChromaDex) làm đối chứng . Kết quả thu được

9cho thấy phân đoạn n -hexane có chứ a -mangostin và có độ sạch tăng lên rõ

rệt so với di ̣ch chiết tổng số trong ethanol (Hình 3.1).

1 2 3

Hình 3.1. Sắc ký đồ phân đoạn chiết vỏ quả măng cụt trong ethanol và n-

hexane sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi

hexane: acetone (3:1).1. Chất chuẩn ; 2. Phân đoạn chiết ethanol; 3. Phân

đoạn chiết n-hexane.

3.1.2. Tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt

3.1.2.1. Lựa chọn hê ̣ dung môi thích hợp để chạy cột sắc ký silica gel

Để tinh sa ̣ch thành công chất nghiên cứ u bằng phương pháp sắc ký thì viê ̣c chọn lựa được hê ̣ dung môi sắc ký thích hơ ̣p là hết s ức quan tro ̣ng. Dựa trên kinh 36

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học nghiê ̣m và tham khảo c ác nghiên cứ u trướ c đây, chúng tôi đã kiểm tra khả năng phân tách phân đoa ̣n n -hexane trên TLC sử dụng 3 hê ̣ dung môi là hexane : ethyl

acetate (2:1); hexane: ethyl acetate (3:1) và h exane: acetone (3:1). Kết quả thu

được cho thấy hê ̣ dung môi h exane: acetone (3:1) là phù hơ ̣p nhất để tinh sa ̣ch

-mangostin từ phân đoa ̣n n-hexane.

1 2 3 1 2 3 1 2 3

A B C

Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexane sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp

mỏng trong hệ dung môi: A) hexane: ethyl acetate (2:1); B) hexane: ethyl

acetate (3:1); C) hexane: acetone (3:1).1. Chất chuẩn ; 2. Phân đoạn chiết

ethanol; 3. Phân đoạn chiết n-hexane.

3.1.2.2. Tinh sạch -mangostin trên cột sắcký silica gel sử dụng hệ dung môi

n-hexane: acetone (3:1)

Phân đoạn n-hexane có khối lượng khoảng 8,2 g được đưa lên cột sắc ký

silica gel có kích thước 3 x 80 cm và được rửa chiết với hệ dung môi n-hexane:

acetone tỉ lê ̣ 3:1 (v/v). Sau khi thu các phân đoạn 10ml, độ sạch của các phân đoa ̣n được xác định bằng TLC kết hơ ̣p so sánh vớ i chất chuẩn. Kết quả cho thấy

-mangostin đươ ̣c rử a ra khỏi cô ̣t ở phân đoa ̣n t ừ 30 đến 42 (Hình 3.3). Các

phân đoa ̣n này sau đó đươ ̣c dồn lại và đông khô để xác định độ sạch , hiê ̣u suất

của quy trình thu nhận .Kết quả cho thấy sắc ký đồTLC chỉ còn một băng duy

nhất khi sử du ̣ng cả hai hê ̣ dung môi cha ̣y TLC kh ác nhau là TEAF (5:3:1:1) và 37

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Hexane: acetone (3:1). Điều này chứng tỏ chất thu được đã được tinh sạch(Hình

thu được 1,3 g chất tinh sa ̣ch vớ ihiệu suất đạt

3.4). Quy trình này đã cho phép 0,06%, cao hơn khoảng 5 lần so vớ i quy trình đã đươ ̣c công bố trướ c đây [11].

0-35 40-80 80-95

Hình 3.3. Sắc ký cột silica gel phân đoạn chiết n-hexane của vỏ quả măng

Rf0,85

Rf0,82

cụt với hệ dung môi rửa chiết n-hexane: acetone theo tỉ lệ (3:1)

1 2

Hình 3.4B. Sắc ký đồ α- Hình 3.4A. Sắc ký đồ α-mangostin

ỏ quả tinh sa ̣ch tƣ̀ v ỏ quả măng cụt với hệ

mangostin tinh sa ̣ch tƣ̀ v măng cụt với hệ dung môi TEAF dung môi hexane: acetone (3:1 v/v).

(5:3:1:1 v/v) 1. Chất chuẩn; 2. Chất tinh sạch.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Sắc ký lỏng hiê ̣u năng cao HPLC kết hơ ̣p vớ i khối phổso sánh vớ i mẫu α- mangostinchuẩn cho thấy còn mô ̣t đỉnh chính vớ i thờ i gian lưu là 18,72 phút vàđô ̣ sa ̣ch đa ̣t tương đương vớ i chất chuẩn >83,3% chỉ sau mô ̣t lần sắc ký (Bảng

2, hình 3.5)

Hình 3.5. Phổ HPLC của chất tinh sạch (A) so vớ i chấ t chuẩ n (B) sau khi

qua các cột sắc ký silica gel đo trên máyWaters Alliance 2695 – PDA

2996(Xem phụ lục)

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Bảng 2. Độ sạch của chế phẩm α-mangostin so vớ i chấ t chuẩ n

α-mangostintinh sa ̣chα-mangostin chuẩ n

Để khẳng định chính xác chất tinh sạch được chính là -mangostin chúng tôi đã tiến hành đo và phân tích phổ 1H và 13C của chất thu được trên máy cộng

hưởng từ hạt nhân.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Hình 3.6. Phổ Proton (A) và 13C (B) của chất -mangostin đo trên máy

NMR Bruker, Avance 500

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Số liệu thu được trên hình 3.6 đã khẳng định đây chính là -mangostin, có công

thức hóa học là C24H26O6, có cấu trúc của một xanthone điển hình (hình 3.7) và

trọng lượng phân tử là 410.

B A

Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của -mangostin (C24H26O6). A. Cấu trú c hó a

học; B. Sản phẩm thu nhận được sau khi tinh sạch qua cột sắc ký

Toàn bộ qui trình tinh sạch -mangostin được tóm tắt trong sơ đồ ở hình

3.8.

Ethanol

Bột vỏ quả măng cụt (2000 g)

Cặn Ethanol

H2O

Phân đoạn H2O

Phân đoạn n-hexane (8,3g)

Sắc ký cột silica gel

Phân tích HPLC-MS

Phân tích NMR

α-mangostin (1,3 g)

Hình 3.8. Sơ đồ qui trình tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Như vậy, sử dụng phương pháp tách chiết phân đoạn trong n-hexane kết

hơ ̣p vớ i sắc ký silica gel sử du ̣ng h ệ dung môi rửa cột n-hexane: acetone theo tỉ

lê ̣ 3:1, chất -mangostin đã được tinh sạch vớ i đô ̣ sa ̣ch đa ̣t > 83% tương đương

. vớ i chất chuẩn , hiệu suất thu hồi đạt 0,06% chỉ sau một lần sắc ký duy nhất

Hiệu suất này cao hơn nhiều so v ới qui trình tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng và

bằng quy trình sử du ̣ng 2 cô ̣t sắc ký silicagelmà các tác gi ả trước đây đã công bố [10],[11].

3.2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của α-mangostin lên S. mutans trên

biofilm

3.2.1. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans trên biofilm

3.2.1.1. Ức chế sự giảm pH của môi trườ ng

Vi khuẩn S. mutans được xem là tác nhân chính gây ra sâu răng do khả

năng sinh acid cao (chủ yếu là acid lactic), đặc biệt là trong môi trường dư thừa

glucose. Chính sự acid hóa mảng bảm răng (thậm chí đến pH dưới 4,0) đã dẫn

đến làm mòn men răng và gây sâu răng. Vì vậy, hoạt tính ức chế sự sinh acid

của vi khuẩn được xem là một trong những thí nghiệm khởi đầu để khảo sát tác

dụng bảo vệ răng của hợp chất cần quan tâm.

Trong thí nghiệm này, biofilm được đưa vào môi trường dư thừa glucose,

vì thế quá trình glycolysis sinh acid bị dừng lại bởi pH thấp chứ không phải do

thiếu cơ chất đường phân glucose. Hoạt tính ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S.

mutans đươ ̣c đánh giá thông qua viê ̣c xác đi ̣nh khả năng ứ c chế sự giảm pH củ a

môi trườ ng củ a các tế bào S. mutans đã xử lý vớ i các di ̣ch chiết nghiên cứ u . Kết

quả nghiên cứu đươ ̣c trình bày ở hình 3.9. Số liê ̣u thu đươ ̣c cho thấy di ̣ch -

mangostin ở các nồng độ 100M, 150 M và 200 M đã ứ c chế rõ rê ̣t sự sinh

acid củ a vi khuẩn S. mutans. Giá trị pH cuối cùng thu được với dịch chiết ở các

nồng đô ̣ lần lươ ̣t là : 5,05; 5,3 và 5,4 trong khi ở mẫu đối chứ ng (không xử lý

dịch chiết ) là 4,4. Như vâ ̣y, dịch chiết -mangostintinh sạch được tại Việt Nam

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học cũng có khả năn g ứ c chế sự sinh a cid của S. mutans trên biofilm . Nồng đô ̣ 150

ì đây là nồng đô ̣ có tác du ̣ng M đươ ̣c lựa cho ̣n cho các thí nghiê ̣m về sau v

mạnh và phù hợp hơn ước của - cho thí nghiê ̣m vì tính tan kém trong n

mangostin.

H p

0 2 4 6 8

Thờ i gian (giờ )

Hình 3.9. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans trên

biofilm() Đối chứng ; () -mangostin100 M; () -mangostin150 M;

()-mangostin200 M

3.2.1.2. -mangostin ức chế hoạt tính enzyme liên quan đến quá trình sinh và chống chịu acid F-ATPase và PTS

Enzyme ATPase được tìm thấy ở tất cả các sinh vật nhân chuẩn, có vai trò

phân giải ATP và bơm proton từ tế bào chất ra bên ngoài nhằm ổn định pH nội

sinh (pHi), nhờ vậy duy trì được hoạt động của các enzyme và bào quan trong

nguyên sinh chất. Ở nhiều loài vi khuẩn, trong đó có S. mutans, enzyme này

đóng vai trò chìa khoá trong việc đảm bảo sự thích nghi của tế bào với điều kiện

acid. Có hai loại ATPase là F-ATPase mang phức hệ protein F1-F0 nằm trên

màng tế bào có vai trò tạo hoạt tính enzyme và các ATPase vận chuyển các cation như K+-ATPase và Na+-ATPase. Phần lớn hoạt tính phân giải ATP

(ATPase) của S. mutans thuộc về F (H+)-ATPase trên màng. Trong số các vi

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học khuẩn đường miệng, S. mutans là một trong số rất ít loài có khả năng chống chịu

acid cao. Vi khuẩn này vẫn có thể tiến hành quá trình đường phân ở pH thậm chí

dưới 3,0. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng F-ATPase đóng vai trò chính giúp

vi khuẩn S. mutans thích nghi với điều kiện khắc nghiệt này [14],[15],[16].

Số liệu ở hình 3.10 cho thấy hoạt độ F-ATPase của các tế bào thấm đã bị

ức chế mạnh bởi -mangostin. Ở nồng đ ộ 150M,hoạt tính enzyme đã bị ức chế

100

>70%. Có thể kết luận rằng F-ATPase rất nhạy cảm với -mangostin.

ế h c c Ứ %

F-ATPase PTS

Hình 3.10. Ảnh hƣởng của -mangostin lên hoạt độF-ATPase và PTS của S.

mutans trên biofilm

Phospho transferase system (PTS)

Đường là nguồn carbohydrate chủ yếu của các vi khuẩn Streptococcus. Tế

bào vi khuẩn này có thể đồng hoá được nhiều loại đường khác nhau như glucose,

fructose, sucrose...Trước khi đi vào còn đường glycolysis, đường được hoạt hoá

thành dạng glucose-6-phosphate nhờ hệ thống enzyme chuyển gốc phosphate

(sugar-phosphotransferase system) viết tắt là PTS và hexokinase, trong đó hệ

thống PTS đóng vai trò chính [55]. Thí nghiệm được thực hiện với tế bào thấm.

Ở tế bào thấm, màng tế bào bị chọc thủng do xử lý với toluene nên tạo điều kiện

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học để các enzyme có thể tiếp xúc dễ dàng hơn với chất nghiên cứu. Trong thí

nghiệm này, hệ thống glucose-PTS của tế bào thấm S. mutansbị ức chế bởi -

mangostin. Ở nồng độ 150M, khoảng >50% hoạt tính enzyme bi ̣ ứ c chế (Hình

3.10). Điều đó chứng tỏ phức hệ PTS cũng nhạy cảm với -mangostin. Sự ức

chế PTS có lẽ đã đóng vai trò quan tro ̣ng trong việc thể hiện hoạt tính kháng

khuẩn của -mangostin vì enzyme này ức chế quá trình tiếp nhận đường, khâu

đầu tiên quan trọng của quá trình đồng hóa đường và sinh acid tiếp theo.

Viê ̣c ứ c chế các enzyme nằm trên màng tế bào cũng gơ ̣i ý màng tế bào là

theo kiểu không bị ion hóa (nonionic đích tác du ̣n g đầu tiên củ a -mangostin. Rất nhiều hơ ̣p chất phenol có thể hoa ̣t đô ̣ng như là các chất hoa ̣t đô ̣ng bề mă ̣t

agent) can thiê ̣p vào liên kết lipi d- protein trên màng tế bào . Nhóm hydroxyl (OH) của các chất này cũng c ó khả năng hình thành liên kết vớ i protein và các

. - phân tử sinh ho ̣c k hác như acid lipoteichoic trên bề mă ̣t màng tế bào

có khả năng tương tác mangostin có mang nhóm OH trong cấu trú c nên có thể

và phá hủy màng. Hơn thế nữa, tính chất không phân c ực cao của chất này gơ ̣i ý các tương tác này là có thể xảy ra với các nhóm chất ky ̣ nướ c trên màng tế bào . Kết quả của tương tác này là những thay đổi bao gồm cả viê ̣c phá hủy cấu trúc

màng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các chất phenol có khả năng

tương tác vớ i màng tế bào [46]. Nghiên cứ u về cơ chế kháng khuẩn củ a thymol một chất phenol từ thực vâ ̣t, lên hàng loa ̣t đối tươ ̣ng vi khuẩn cũng đã cho thấy chất này hoa ̣t đô ̣ng chủ y ếu theo cơ chế phá hủ y màng tế bào mô ̣t cách nhanh

chóng thông qua tương tác bề mă ̣t (surfactant-like action) [46]. Các kết quả

nghiên cứ u chư a công bố củ a chú ng tôi gần đây cũng khẳng đi ̣nh tác dụng này

của -mangostin trên tế bào hồng cầu . Vì vậy, có thể khẳng định tương tác dẫn

đến thay đổi cấu trúc màng tế bào là một trong những cơ chế tác dụng của -

mangostin.

Nguyễn Vũ Anh

huẩ n

Luận văn Thạc sỹ Khoa học 3.2.2. Đá nh giá tác d ụng ƣ́ c chế sƣ̣ hình thành biofilm củ a vi k S.mutans

3.2.2.1. -mangostin ức chế sự sinhtổng hợp EPS ngoại bào

Các nghiên cứu trướ c đây đã cho th ấy các vi sinh vật sống trên biofilm (biofilm cells) thường có khả năng chống chịu các chất kháng khuẩn cao hơn (từ 10 tới

1000 lần) so với các tế bào sống tự do (planktonic cells) [57]. Việc loại bỏ các

biofilm bằng con đường truyền thống sử dụng kháng sinh là không hiện thực vì

tính chống chịu cao của các tế bào trên biofilm.Sự thích nghi cao về trao đổi

chất của các tế bào này với kiểu sống trên biofilm và hơn thế nữa, có thể làm

xuất hiện những chủng vi khuẩn kháng kháng sinh. Như vậy, các chiến lược hữu

hiệu nhằm kiểm soát các bệnh gây ra do biofilm, trong đó có bệnh sâu răng, hiện

nay đang tập trung vào việc tìm kiếm những chất kháng khuẩn có khả năng làm

tổn thương hay can thiệp vào sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây bệnh.

Đánh giá ảnh hưở ng củ a -mangostin lên sự hình thành biofilm đươ ̣c thực

. hiê ̣n thông qua viê ̣c nghiên cứ u ảnh hưở ng củ a nó lên sinh khối củ a biofilm

Sinh khối biofilm (EPS) của S. mutans trên các đĩa hydroxyapatide sau 68 giờ nuôi cấy đã đươ ̣c thu la ̣i để xác đi ̣nh tr ọng lươ ̣ng khô và so sánh vớ i mẫu đối

chứ ng. Kết quả thu đư ợc cho thấy ở các nồng đô ̣ 100, 150 và 200 M, sinh khố i

biofilm đều giảm đi rõ rê ̣t . Đặc biệt ở nồng độ 200 M, sinh khối biofilm giảm

tớ i 35% (Hình 3.11). Các số liệu này gợi ý -mangostin ảnh hưởng tới enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hơ ̣p bi ofilm làglucosyltransferase (GTF).

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

m

6,0

l i f o i

b / ) g m

4,0

2,0

( ô h k g ̣n ơ ƣ

l

0,0

g n ọ r T

ĐC 100 150 200

-mangostin(M)

Hình 3.11. Ảnh hƣởng của -mangostin lên sinh khối biofilm củ a S. mutans

3.2.2.2.-mangostin làm thay đổi cấu trúc biofilm của S. mutans

Biofilm sau 68 giờ phát triển ở điều kiê ̣n có xử lý và không xử lý vớ i -

mangostin 150 µM đã đươ ̣c quan sát dướ i kính hiển vi huỳnh quang đồng tu ̣ quét laser. Hình ảnh biofilm thu được (Hình 3.12) cho thấy cấu trú c củ a biofilm

đã thay đổi đáng kể ở mẫu đươ ̣c xử lý vớ i nồng đô ̣ 150 M so vớ i đối ch ứng.

ạc (micrcolony)

Cấu trú c bi ofilm xuất hiê ̣n nhiều khoảng rỗng và các vi khuẩn l có vẻ to hơn so với mẫu đối chứ ng.

Nguyễn Vũ Anh

vi khuẩn lạc

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Đối chứng -mangostin 150 M

Hình 3.12. -mangostin 150 µM làm thay đổi cấu trúc biofilm của S.

mutans. Ảnh nhuộm huỳnh quang biofilm trong đó EPS có màu đỏ và vi khuẩn

có màu xanh.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học 3.2.2.3. -mangostin ức chế hoạt tính các enzyme GTF liên quan đến sự hình thành biofilm của vi khuẩn S. mutans

Enzyme GTFở S. mutanssử dụng cơ chất sucrose để tổng hợp các glucan

ngoại bào. Những glucan này làm tăng khả năng gây bệnh của vi khuẩn nhờ việc

tăng cường sự dính kết và tích luỹ các vi khuẩn trên bề mặt biofilm. Các phân

tích hoá học cho thấy 40% mảng bám răng được tạo thành từ chính các glucan

này [35],[36],[37]. Vì vậy, enzyme này được xem như là nhân tố quan trọng

trong quátrình gây bệnh của vi khuẩn. S. mutans sản xuất 3 loại GTF chủ yếu là

GTFB, xúc tác cho sự sinh tổng hợp một polymer không tan từ sucrose có chứa

liên kết -1,3 glucan, GTFC sinh tổng hợp một hỗn hợp polymer tan và không

tan có chứa liên kết -1,3 và 1,6 glucan và GTFD sinh tổng hợp một polymer

tan có chứa liên kết -1,3 glucan [20],[56]. Kết quả nghiên cứu trình bày ở mục

3.2.2.1ở trên gơ ̣i ý -mangostin ức chế sự hoạt tín h enzyme chịu trách nhiê ̣m

ủa S.mutans. Để tìm hiểu vấn đề này, chúng tôi đã

GTFB và GTFCở cho sự hình thành EPS c nghiên cứ u ảnh hưở ng củ a chất này lên hoa ̣t đô ̣ các enzyme

100

dạng hoà tan, là những enzyme đóng vai trò chủ đa ̣o trong viê ̣c hình thành EPS không tan củ a vi khuẩn .

ế h c c Ứ %

GTFC GTFB

Hình 3.13. -mangostin 150 µM ức chế đến hoạt độ GTF của S. mutans

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Kết quả trình bày ở hình 3.13 cho thấy -mangostin ở nồng độ 150 M đã

ức chế tới 83% hoạt độ GTFB và 72% hoạt độ GTFC. Số liê ̣u này ch ứng tỏ rằng

các GTF là đích tác dụng của-mangostin. Đây là cơ sở để có thể sử dụng-

mangostin để ngăn chặn mảng bám răng có hiệu quả.

3.3.Khả năng giết vi khuẩn trên biofilm của α-mangostin

Các nghiên cứu về biofilm đã cho thấy nó có các tính chất đặc biệt: i) bảo

vệ cơ thể vi sinh vật khỏi hệ thống phòng thủ của chính vật chủ hay của vi sinh

vật kẻ thù; ii) chống lại sự mất nước; iii) chống lại các chất kháng khuẩn thông

qua việc tạo kiểu hình mới có tốc độ sinh trưởng giảm, hạn chế sự tiếp xúc và có

khả năng bất hoạt hay trung hoà các chất kháng khuẩn; iv) nồng độ các chất dinh

dưỡng trong biofilm tăng cao hơn so với môi trường xung quanh [43]. Chính vì

những đặc điểm này mà các vi sinh vật sống trên biofilm (biofilm cells) thường

có khả năng chống chịu cao hơn (từ hàng 100 tới hàng 1000 lần) với các chất

kháng khuẩn so với các tế bào sống tự do (planktonic cells) [57]. Các chiến lược

hữu hiệu nhằm kiểm soát các bệnh gây ra do biofilm, trong đó có bệnh sâu răng,

hiện nay đang tập trung vào việc tìm kiếm những chất kháng khuẩn có khả năng

làm tổn thương hay can thiệp vào sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây bệnh

nhưng không làm xáo trộn hệ vi sinh vật có mặt trên mảng bám [21].

Số liê ̣u thu đư ợc ở bảng 3 đã cho thấy -mangostinkhông gây chết vi

.Như khuẩn trên biofilm khi xử lý biofilm trong thờ i gian ngắn vớ i chất này

nhưng không vâ ̣y,-mangostinở nồng độ 150 Mức chế sự hình thành biofilm

ảnh hư ởng đến khả năng sống sót củ a vi khuẩn . Hoạt tính kh áng biofilm củ a -

mangostin dườ ng như liên quan chủ yếu đến khả năng gây ức chế hoạt tính các

GTF chịu trách nhiệm cho sự hình thành biofilm của S. mutans.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học Bảng 3. Độ sống sót của S. mutans trên biofilms đƣợc xƣ̉ lý vớ i -mangostin

Biofilm CFU x 108/ml

Đối chứng 2,623 ± 0,61

2,515 ± 0,69 150 M -mangostin

Có thể thấy rằng , -mangostin là chất kháng sâu răng tiềm năng vì nó tác

động vào bô ̣ m áy sinh khung biofilm củ a vi khuẩn đồng thờ i ứ c chế enzyme

S. h sinh và ch ống chi ̣u acid củ a vi khuẩn chịu tr ách nhiê ̣m cho quá trìn

mutans.Nói một cách khác, -mangostin có đa đích tác dụng, vừa là chất chống

sự sinh acid, vừa là chất kháng biofilm (anti-biofilm agents) của vi khuẩn S.

mutans.

3.4.Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm

Các chất kháng khuẩn sử dụng trong các sản phẩm vệ sinh răng miệng

thường có thể tích lũy trên mảng bám răng. Trong nhiều trường hợp như fluor,

nồng độ tích lũy đạt tới 0,5 mM [42]. Nồng độ này thừa đủ để ức chế sự sinh

acid của vi khuẩn, vì thế nó có tác dụng lâu dài ngay cả khi các sản phẩm vệ

sinh răng miệng không còn được sử dụng nữa. Đây cũng là một chỉ số quan

trọng để đánh giá tác dụng của một chất kháng khuẩn sâu răng tiềm năng. Kết

quả nghiên cứu của chúng tôi (Bảng 4) đã cho thấy -mangostin có khả năng

tích lũy trên bio film tới nồng đô ̣ 4,5 g/biofilmsau 68 giờ nuôi cấy qua 5 lần xử

lý ngắn trong 1 phút vớ i -mangostin150 M.

Bảng 4.Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm củ a vi khuẩ n S. mutans

Biofilm Diện tích peak -mangostin (g/biofilm)

Đối chứng 2909 ± 1238,654 0

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

29206 ± 3612,628 4,536 ± 0,01 150 M -mangostin

3.4.1. Bƣớ c đầu đánh giá tá c du ̣ng ch ống sâu răng của dung dịch nƣớc súc

miệng có chứa α-mangostin

Dựa trên những kết quả nghiên cứ u thu đươ ̣c ,chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm

chế ta ̣o nướ c sú c miê ̣ng có chứ a -mangostin ở nồng đô ̣ 150 M kết hơ ̣p mô ̣t số

chất hoa ̣t đô ̣ng bề mă ̣t khác , gồm các methol,tinh dầu bạc hà, NaF nhằm đánh

giá khả năng ứng dụng của chất này làm nước súc miệng phòng chống sâu răng

(Hình 3.14). Tác dụng của dung dịch nước súc miệng này đượ c đánh giá trên mô

hình biofilm và so sánh với tác dụng của nước súc miệng Listerin thương mại về

các chỉ tiêu : i) Khả năng ức chế sự sinh acid ; ii) khả năng ức chế sự hình thành

biofilm của S. mutans.

Hình 3.14. Chế phẩ m nƣớ c sú c miê ̣ng chƣ́ a α-mangostin tƣ̀ vỏ quả măng cụt

3.4.1.1. Khả năng ức chế sự sinh acid

Khả năng ức chế sự sinh a cid của vi khuẩn S. mutans đươ ̣c đánh giá thông qua

viê ̣c xác đi ̣nh khả năng ứ c chế sự giảm pH môi trườ ng củ a các tế bào S. mutans

trên biofilm đã được xử lý vớ i các dung di ̣ch nướ c sú c miê ̣ng (NSM). Kết quả trình bày ở bảng 5 cho thấy dung di ̣ch NSM ta ̣o đươ ̣c ứ c chế rõ rê ̣t sự sinh a cid

của vi khuẩn S. mutans trên biofilm . Giá trị pH cuối cùng thu được với NSM

Nguyễn Vũ Anh

5,31 và 5,60, trong khi ở mẫu đố i Luận văn Thạc sỹ Khoa học chứ a -mangostin và Listerin lần lươ ̣t là

chứ ng (không xử lý NSM ) là 3,99. Như vâ ̣y, khả năng ức chế sự sinh a cid của S.

mutans là gần tương đương với tác dụng của dung dịch NSM thương mại

Listerin.

Bảng 5.Khả năng ức chế sự sinh a cidcủa S. mutans trên biofilm củ a cá c

dung di ̣ch nƣớ c sú c miê ̣ng

Giá trị pH môi trƣờng Mẫu nghiên cƣ́ u

(sau 240 phút)

3,99 Đối chứ ng

NSM 5,31

Listerin 5,60

3.4.1.2. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm (mảng bám răng) Nhằm tìm hiểu khả năng h ạn chế sự tạo mảng bám răng củ a dung di ̣ch NSM

ạo, chúng tôi đã tiến chứ a -mangostintạo được trên mô hình biofilm nhân t

hành xử lý các biofilm của S. mutans vớ i các dung di ̣ch NSM , sau đó đo sinh

khối các biofilm thu đươ ̣c sau 5 ngày nuôi cấy . Kết quả thu đươ ̣c ở bảng 6 cho

thấy sinh khối biofi - lm trung bình củ a các mẫu đươ ̣c xử lý vớ i NSM chứ a

mangostin và NSM Listerin giảm đi tớ i hơn 50% so vớ i đối chứ ng . Trọng lượng sinh khối khô củ a mỗi biofilm lần lươ ̣t là 7,1 và 8,5 mg/biofilm so vớ i đối chứ ng

là 19,5 mg/biofilm. NSM chứ a -mangostin dườ ng như có tác du ̣ng ứ c chế sự

hình thành sinh khối biofim rõ rệt hơn Listerin . Như vâ ̣y , NSM chứ a -

mangostin chế ta ̣o đươ ̣c có tiềm năng ứ c chế sự hình thành mảng bám răng .

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Bảng 6. Ảnh hƣở ng củ a NSM chứaα-mangostin lên sƣ̣ tích lũy sinh khố i biofilm củ a vi khuẩ n S. mutans.Số liệu sau dấu ± chỉ các giá trị độ lệch chuẩn

SD với n=3. Biofilm được hình thành trên các lam kính thủy tinh (3 x 12 cm)

Mẫu xử lý Trọng lƣợng khô biofilm

(mg/biofilm)

19,5  2,80 Đối chứ ng

NSM -mangostin 7,1  1,10

NSM Listerin 8,5  0,81

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

---------------

1. Đã đưa ra được qui trình tinh sạchα-mangostin đơn giản t ừ vỏ quả măng

đa ̣t

cụt (Garcinia mangostanaL.) gồm 2 bướ c chính là : i) chiết phân đoa ̣n vớ i n - hexane và ii) sắc ký trên cột silica gel vớ i hê ̣ dung môi n-hexane : accetone theo tỉ lê ̣ 3:1). Chất thu được có đô ̣ sạch tương đương vớ i chất chuẩn >83%.

2.α-mangostinở nồng độ 150 M ứ c chế quá trình sinh acid và sinh tổng hơ ̣p polysaccharide ngoa ̣i bào củ a S. mutans trên biofilm.

3. α-mangostin ở nồng độ 150 M ứ c chế hoa ̣t đô ̣ các enzyme liên quan trực

tiếp đến quá trình sinh và chịu acid của vi khuẩn S. mutans trên màng tế bào

làF-ATPase và phospho transferase system (PTS) với tỉ lệ ức chế đạt >70%

và 50% theo thứ tự, và các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

biofilm là GTFB (>83% ức chế) và GTFC (>72% ức chế).

biofilm với hàm lượng đạt 4,5

4.α-mangostin có khả năng tích lũy trên µg/biofilm.

- 5. Bướ c đầu đã chế ta ̣o và chứ ng minh đươ ̣c nướ c sú c miê ̣ng có chứ a

S. mutans trên mô hình

mangostin có tác du ̣ng kháng vi khuẩn sâu răng biofilm nhân ta ̣o .

ĐỀ NGHỊ

1. Cải tiến công thức để nâng cao hơn nữa hiệu quả của NSM chứa α-

mangostin.

2. Đánh giá đô ̣ an toàn củ a sản phẩm .

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Trƣơng Văn Châu, Trần Hồng Quang, Đỗ Ngọc Liên, (2004), Đặc tính

kháng khuẩn của các chất phenolic từ một số loài thực vật thuộc chi

Garcini str., Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống,

định hướng Y, Dược học, tr. 50-53, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà

Nội.

2. Trịnh Đình Hải, (2004), Giáo trình dự phòng sâu răng, Nhà xuất Y học.

3. Trịnh Đình Hải, (2004), Giáo trình sử dụng flour trong chăm sóc răng

miệng, Nhà xuất Y học.

4. Đỗ Văn Hòa, Lại Văn Hòa, Lê Hƣng, Bạch Vọng Hải, (2003), Về hàm

lượng canxi, phospho và magie trong các hàm răng lớn bình thường và

răng sâu ở người trưởng thành, Thông báo khoa học các trường Đại học Y

– Dược, tr. 63-65.

5. Trần Văn Trƣờng, Trịnh Đình Hải, Spencer J. A., Thomson R. K.,

(2002), “Điều tra sức khoẻ răng miệng toàn quốc ở Việt Nam 1999 -

2000”, Tạp chí Y học Việt Nam, 8, tr. 1 – 10.

6. Mai Đình Hƣng, (1998), Sâu răng, Bài giảng Răng Hàm Mặt, Nhà xuất

bản Y học.

7. Đỗ Tất Lợi, (2000), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y

học Hà Nội, tr.567-568.

8. Nguyễn Thị Mai Phƣơng, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Ngọc Dao,

Đặng Minh Phƣơng, (2003), “ Tác dụng của dịch chiết vỏ quả măng cụt

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

(Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn sâu răng Streptococcus mutans”,

Hội nghị Khoa học Sự sống lần thứ 2, Huế, tr. 983-986.

9. Nguyễn Thị Mai Phƣơng, Phan Tuấn Nghĩa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn

Thị Ngọc Dao, (2004), “Thành phần polyphenol vỏ quả măng cụt

(Garcinia mangostana L.) và tác dụng ức chế sự sinh acid của vi khuẩn

sâu răng Streptococcus mutans”, Tạp chí Dược học, (44), tr. 18-21.

10. Nguyễn Thị Mai Phƣơng, (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số

chất kháng khuẩn lên các quá trình sinh lý và hóa sinh của vi khuẩn gây

sâu răng Streptococcus mutans”, Luận án tiến sỹ.

11. Nguyễn Thi ̣ Mai Phƣơng và Marquis R .E, (2011) Hoạt tính kháng vi

khuẩn Streptococcus xoang miệng của -mangostin tinh sạch từ vỏ quả

măng cụt (Garcinia mangostana L.). Tạp chí Dược liê ̣u . 16(5): tr.298-

303.

Tài liệu tiếng Anh

12. Abdelal, T.T., (1979), Arginine catabolism by microorganisms, Ann. Rev.

Microbiol. 8, tr. 139-168.

13. Almeida L.S., Murata R.M., Yatsuda R., Dos Santos M.H., Nagem

T.J., Alencar S.M., Koo H., Rosalen P.L., (2008), Antimicrobial activity

of Rheedia brasiliensis and 7-epiclusiannone against Streptococcus

mutans. Phytomedicine., 15(10), tr. 886-891.

14. Arikado E., Ishihara H., Ehara T., (1999), Enzyme level of

enterococcal F1-F0 ATPase is regulated by pH at the step of assembly.

Eur. J. Biochem., 259, tr. 262-268.

15. Bearon S., Bearson B., Foster J.W., (1997), Acid stress reponses in

enterobacteria. FEMS Microbiol. Lett., 147, tr. 173-180.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

16. Belli W.A., Marquis R.E., (1991), Adaptation of Streptococcus mutans

and Enterococcus hirae to acid stress in continuous culture. Appl.

Environ. Microbiol., 57, tr. 1134-1138.

17. Bender G.R., and Marquis R.E., (1995), Membrane ATPases and acid

tolerance of Actinomyces viscosus and Lactobacillus casei. Appl. Environ.

Microbiol ., 53, tr. 2124-2128.

18. Bender G.R., Sutton S.V., and Marquis R.E., (1986), Acid tolerance,

proton permeabilities, and membrane ATPases of oral steptococci. Infect.

Immum., 53, tr. 331-338.

19. Badria, F.A., and Zidan, O.A., ( 2004) Natural products for dental caries

prevention. J Med Food7(3), tr.381–384.

20. Bowen WH, Koo H.,(2011)Biology of Streptococcus mutans-derived

glucosyltransferases: role in extracellular matrix formation of cariogeneic

biofilms. Caries Res; 45, tr. 69-86.

21. Burne RA, Ahn SJ, Wen ZT, Zeng L, Lemos JA, Abranches J,

Nascimento M.,(2009) Opportunities for disrupting cariogenic biofilms.

Adv Dent Res; 21(1), tr. 17-20.

22. Burne R.A., Marquis R.E, (2001), Biofilm acid /base physiology and

gene expression in oral bacteria. Methods Enzymol., 337, tr. 403-415.

23. Burne R.A., Marquis R.E, (2000), Alkali production by oral bacteria and

protection against dental caries, FEMS Microbiol. Lett., 193, tr. 1-6.

24. Casiano-Colon A. And Marquis R.E., (1988), Role of arginine

deiminase system in protecing oral bacteria and an enzymatic basic for

acid tolerance, Appl. Environ. Microbiol., 54, tr. 1318-1324.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

25. Chang Y-Y. and Cronan J.E., (1999), Membrane cyclopropane fatty

acid content is a major factor in acid resistance os Escherichia coli, Mol.

Microbiol., 33, tr. 249-249.

26. Chen Y-Y., Clancy K.A., and Burne R.A., (1996), Streptococcus

salivarius urease: genetic biochemical charaterization and expression in a

dental plaque streptococcus, Infect, Immun., 64,tr. 585-592.

27. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R and

Lappin-Scoott H.M., (1995), Microbial biofilms, Ann. Rev. Microbiol.,

49, tr. 711-745.

28. Cotter P.D. and Hill C., (2003), surviving the acid test: responses of

gram-positive bacteria to low pH, Microbiol. Mol. Bio. Rev., 67, tr. 429-

453.

29. Cunin R., Glansdorff N., Peirad A. And slaton V., (1986), Biosynthesis

and metabolism of arginin in bacteria, Microbiol. Rev., 50, tr. 314-352.

30. Curran T.M., Lieou J. and Marquis R.E., (1995), Arginine deimiase

system and acid adaptation of oral streptococci, Appl. Environ.

Microbiol., 61, tr. 4494-4496.

31. Curan T.M., Ma Y., Rutherford G.C and Marquis R.E., (1998),

Turning on and turning off the arginine system in oral streptococci, Can.

J. Microbiol., 44, tr. 1078-1085.

32. Dong Y., Chan M.Y.Y and Burne R.A., (2004) Control expression of

the arginine deimiase operon os Streptococcus gordonii by CcpA and, J.

Bacteriol., 186 (8), tr. 2511-2514.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

33. Ho CH, Huang YL, Chen CC, (2002) Garcininne E, a xanthone

derivatives, has potent cytotoxic effect against hepatocellular carcinoma

cell lines. Planta Med. 68(11), tr. 975-979.

34. Hamada S., Kontani M., Hosono H., Ono H., Tanaka, T., Ooshima T.,

Mitsunaga T. and Abe S.,(1996), Catechin inhibits glucosyltransferase

from Streptococcus mutans,FEMS Microbiol. Lett., 143, tr. 35-40.

35. Koo H, Duarte S, Muarata RM, Scott-Anne K, Gregoire S, Warson

GE, Singh AP, Vorsa N., (2010) Influence of cranberry

proanthocyanidins on formation of biofilms by Streptocoocus mutans on

saliva-coated apatitic surface and on dental caries development in vivo.

Caries Res. 44(2), tr. 116-126.

36. Jeon JG, Klein MI, Xiao J, Gregoire S, Rosalen PL, Koo H, (2009),

Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on

gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in

biofilms,BMC Microbiol., 9, tr. 228-232.

37. Koo H, Xiao J, Klein MI, (2009), Extracellular polysaccharides matrix--

an often forgotten virulence factor in oral biofilm research, Int J Oral Sci.,

1(4), tr. 229-234.

38. Loesche W.J., (1986), Role of Streptococcus mutans in human dental

decay, Microbiol. Rev., 50, tr. 353-380.

39. Ma Y., Rutherford G.C., Curran T.M., Reimiller J.S., Marquis R.E.,

(1999), Menbrane locus and pH sensitivity of paraben inhibition of alkali

production by oral streptococci, Oral. Microbiol. Immunol., 14, tr. 244-

249

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

40. Mahabusarakam W., Proudfoot J., Taylor W., Croft K., (2000),

"Inhibition of lipoprotein oxidation by prenylated xanthones derived from

mangostin", Free Rad. Res., 33(5), tr. 643-659.

41. Makimura M, Hirasawa M, Kobayashi K, Indo J, Sakanaka S,

Taguchi T, Otake S, ( 1993), Inhibitory effect of tea catechins on

collagenease activity,J Periodontol., 64(7), tr. 630-636.

42. Matsumoto K., Akao Y., Kobayashi E., Ohguchi K., Ito T., Tanaka

T., Iinuma M., Nozawa Y., (2003), "Induction of apoptosis by xanthones

from mangosteen in human leukemia cell lines", J. Nat. Prod., 66(8),

tr.l124-1127.

43. Marsh P., Martin M.V., (2000), Oral microbiology, 4lh edition, Reed

Educational and Professional Publishing Ltd. USA.

44. Murata RM, Branco-de-Almeida LS, Franco EM, Yatsuda R, dos

Santos MH, de Alencar SM, Koo H, Rosalen PL, (2010), Inhibition of

Streptococcus mutans biofilm accumulation and development of dental

caries in vivo by 7-epiclusianone and fluoride,Biofouling, 26(7), tr. 865-

872.

45. Nakatani K., Yamakuni T., Kondo N., Arakawa T., Oosawa K.,

Shimura S., Inoue H., Ohizumi Y., (2004), "Gamma-mangostin inhibits

inhibitor-kappaB kinase activity and decreases lipopolysaccharide-

induced cyclooxygenase-2 gene expression in C6 rat glioma cells", Mol.

Pharmacol., 66(3), tr.667-747.

46. Nguyen P.T.M and Marquis R.E.,(2011) Antimicrobial actions of

alpha-mangostin against oral Streptococci, Can. J. Microbiol., 57(3), tr.

217-25.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

47. Peres V., Nagem T.J. and Oliveira F.F., (2000), Tetraoxygenated

naturally occurring xanthones, Phytochem., 55(7), tr. 28-33.

48. Quivey R.G., Faustoferri R.C., Monahan K. and Marquis R.E.,

(2000), Shifts in membrane fatty acid profiles associated with acid

adaptation of Streptococcus mutans, FEMS. Microbiol. Lett., 189, tr. 89-

92.

49. Quivey R.G., Kuhnert W.L. and Hahn K., (2000), Adaptation of oral

streptococci to low pH, Adv. Microbiol. Physiol., 42, tr. 239-274.

50. Quivey R.G., Kuhnert W.L. and Hahn K., (2001), Genetics of acid

adaptation of oral streptococci, Crit. Rev. Oral Biol. Med., 12, tr. 301-

314.

51. Rogers A.H., Zilm P.S., Gully N.J. and Pfenning A.L., (1988),

Response of a Streptococcus sanguis strain to arginine-containing

peptides. Infect. Iniinun., 56, tr. 687-692.

52. Sato A., Fujiwara H., Oku H., Ishiguro K., Ohizumi Y., (2004), Alpha-

mangostin induces Ca(2+)-ATPase-dependent apoptosis via mitochondrial

pathway in PC 12 cells. J. Pharmacol. Sci., 95(1), tr. 33- 40.

53. Scheie A.A., (1989), Modes of action of currently known chemical anti-

plaque agents other than chlorohexidine, J. Dent. Res., 68, tr. 1609-1616.

54. Schilling K.M., Bowen W.H., (1992) Glucans synthesized in situ in

experimental salivary pellicle function as specific binding sites for

Streptococcus mutans, Infect Immun. 60, tr. 284-295.

55. Stur M.G. and Marquis R.E., (1992), Comparative acid tolerances and

inhibitor sensitivities of isolated F-ATPases of oral lactic acid bacteria,

Appl. Environ. Microbiol., 58, tr. 2287-2291.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

56. Venkitaraman A.R., Vacca-Smith A.M., and Kopec

(1995), Characterization of L.K.,

glucosyltransferase B, GtfC, and GtfD in solution

and on the surface of hydroxyapatite, J. Dental.

Res., 74, tr. 1695-1701.

57. Wilson M., (1996), Susceptibility of oral bacterial biofilms to

antimicrobial agents, J. Med. Microbiol., 44, tr. 79-87.

58. Williams P., Ongsakul M., Proudfoot J., Croft K., Beilin L., (1995),

Mangostin inhibits the oxidative modification of human low density

lipoprotein, Free. Rad. Res., 23(2), tr. 175-841.

Tài liệu khác

59. http://nld.com.vn/hoi-nhap/song-chung-voi-sau-rang-

20150322170059182.htm

60. http://news.zing.vn/Can-benh-khien-moi-nguoi-Viet-Nam-mat-hon-6-

chiec-rang-post546699.html

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

-------------

1. Nguyễn Thi ̣ Mai Phương ,Bạch Như Quỳnh , Trần Thi ̣ Nhung , Nguyễn Công

Thành, Quách Thị Liên , Nguyễn Vũ Anh, Phạm Văn Liệu . (2015) Dịch chiết lá sim (Rhodomyrtus tomentosa (Aliton) Hassk) ức chế sự sinh acid và sự hình

thành biofilm của vi khuẩn Streptcocccus mutans. Tạp chí Y ho ̣c Viê ̣t Nam 433:

tr. 177-183.

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

PHỤ LỤC

Phổ Proton và 13C của chất -mangostin

Nguyễn Vũ Anh

Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Pos Group

Chem.shif-1H (ppm)

Chem.shif-13C (ppm) 156.57

102.72

C=O

183.02

125.03

138.34

6.63, 1H, s

103.67

C-OH

156.05

144.67

112.12

6.19, 1H, s

93.14

C-OH

161.43

111.35

C-OH

163.49

O-CH3

3.72, 3H, s

61.26

CH2

4.01, 2H, d(J=5.6

27.04

Hz)

5.19,1H, d(J=5.6

125.04

Hz)

131.70

CH3

1.62, 3H, s

25.89

CH2

3.23, 2H, d(J=5.6

22.14

Hz)

5.19,1H, d(J=5.6

123.81

Hz)

131.61

CH3

1.63, 3H, s

25.91

CH3

1.74, 3H, s

17.86

CH3

1.78, 3H, s

18.26

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn Streptococcu s mutans trên biofilm và định hướng ứng dụng

NGUYỄN VŨ ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA α- MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT Garcinia mangostana L. LÊN VI KHUẨN Streptococcus mutansTRÊN BIOFILM VÀ ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.4. Quả măng cụt (Garcinia mangostana L.)

Hình 1.5. Quá trình hình thành xanthone trong thực vật [47]

Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Ethanol

H2O

Phân tích HPLC-MS

Phân tích NMR

H p

Thờ i gian (giờ )

ế h c c Ứ %

F-ATPase PTS

m

l i f o i

b / ) g m

( ô h k g ̣n ơ ƣ

l

g n ọ r T

ế h c c Ứ %

Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

PHỤ LỤC

Pos Group

Chem.shif-1H (ppm)

Chem.shif-13C (ppm) 156.57

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sử dụng thông tin di truyền trên vùng gen ITS DNA trong định loại các mẫu sâm (Panax L.) thu thập ở tỉnh Hà Giang

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu