Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Biểu hiện và tinh sạch Staphylococcal enterotoxin B (SEB) từ chủng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus được phân lập tại Thái Nguyên

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm nhân dòng, biểu hiện gen seb534 tự nhiên và tinh sạch protein tái tổ hợp SEB dạng tự nhiên mang độc tính, làm cơ sở tạo protein tái tổ hợp ở dạng đột biến mất độc tính, làm nguyên liệu cho việc tạo que thử phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố tụ cầu vàng. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Biểu hiện và tinh sạch Staphylococcal enterotoxin B (SEB) từ chủng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus được phân lập tại Thái Nguyên

i HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẬU NINH THUẬN BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) TỪ CHỦNG TỤ CẦU VÀNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐƢỢC PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2016
ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẬU NINH THUẬN BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) TỪ CHỦNG TỤ CẦU VÀNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐƢỢC PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGHIÊM NGỌC MINH Thái Nguyên - 2016
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả luận văn Đậu Ninh Thuận
ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh - Phó Viện trƣởng Viện Nghiên cứu hệ gen, ngƣời thầy tâm huyết đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi để tôi thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học tại phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thầy luôn tận tình hƣớng dẫn, dành thời gian trao đổi, định hƣớng cũng nhƣ động viên, nhắc nhở và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể các anh chị trong phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng, đặc biệt là ThS. Nguyễn Thị Hoài Thu và KS. Phạm Thùy Linh đã luôn tạo điều kiện, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện, nghiên cứu, hoàn thành luận văn của mình. Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Khoa học sự sống - Trƣờng ĐH Khoa học - Đại học Thái Nguyên cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trƣờng cũng nhƣ tại viện. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên ng y tháng năm 2016 HỌC VIÊN Đậu Ninh Thuận
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................v DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột SEB trên thế giới và tại Việt Nam .......................................................................................3 1.1.1. Khái quát tình hình ngộ độc thực phẩm ............................................................3 1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do S. aureus v độc tố ruột SEB trên thế giới v tại Việt Nam.................................................................................................................5 1.2. Giới thiệu về Staphylococcus aureus ...................................................................9 1.2.1. Lịch sử phát hiện ...............................................................................................9 1.2.2. Đặc điểm phân loại .........................................................................................10 1.2.3. Đặc điểm vi khuẩn học ....................................................................................12 1.3. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B ..........................................................17 1.3.1. Cấu trúc phân tử v cơ chế gây độc của SEB .................................................18 1.3.2. Gen seb ............................................................................................................19 1.3.3. Triển vọng ứng dụng của SEB ........................................................................20 1.4. Các kỹ thuật xác định S. aureus trong phòng thí nghiệm ..................................21 1.4.1 Các kỹ thuật thông thường xác định S. aureus ................................................21 1.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử .........................................................................22 1.4.3. Một số kỹ thuật dựa trên miễn dịch .................................................................24 Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................27 2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ...................................................27 2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................27 2.1.2. Các bộ kit ........................................................................................................27 2.1.3. Hóa chất máy móc v thiết bị sử dụng ...........................................................27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................29 2.2.1. Phương pháp tách DNA tổng số .....................................................................29 2.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ..........................................30 2.2.3. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony - PCR).............................31 2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ...................................................31
iv 2.2.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm từ gel agarose ...........................................32 2.2.6. Phương pháp tách dòng gen seb trong vector pTZ57R/T ...............................32 2.2.7. Phương pháp xử lý enzym hạn chế trên gen seb v vector biểu hiện pET22b(+) .................................................................................................................33 2.2.8. Phương pháp ghép nối gen ngoại lai v o vector pET22b(+) .........................37 2.2.9. Phương pháp biến nạp DNA plasmid v o tế b o khả biến E. coli .................37 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................43 3.1. Tách chiết DNA tổng số chủng Staphylococcus aureus ....................................43 3.2. Tách dòng gen seb534 ........................................................................................43 3.2.1. Nhân gen seb534 từ chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus .........................43 3.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR ................................................................................44 3.2.3. Gắn đoạn gen đích seb534 v o vector tách dòng pTZ57R/T ..........................45 3.2.4. Xác định trình tự gen seb534 ..........................................................................46 3.3. Thiết kế vector biểu hiện pET22(b+) mang gen seb534 ....................................48 3.3.1. Xử lý enzym cắt hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb534 v vector pET22(b+) .................................................................................................................48 3.3.2. Gắn đoạn gen đích seb534 v o vector biểu hiện pET22(b+).........................50 3.3.3. Chọn lọc dòng tế b o chứa vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) ...............51 3.4. Tối ưu các điều kiện biểu hiện của gen seb534 trong tế b o E. coli BL21(DE3) ...................................................................................................................................53 3.4.1. Biểu hiện gen seb534 trong tế b o E. coli BL21(DE3)...................................53 3.4.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện của gen seb534 ..............................................55 3.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB534 .................................................................59 KẾT LUẬN ...............................................................................................................62 KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................63
v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl Microliter APS Ammonium persulphate Bp Base pair dH2O Nƣớc khử ion DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid Kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria - Bertani Ml Milliliter OD Optical density PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid S. aureus Staphylococcus aureus Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel SDS-PAGE electrophoresis SEB Staphylococcal enterotoxin B SEs Staphylococcal enterotoxins TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA
vi TEMED Tetramethylethylenediamine v/p Vòng/phút v/v volume/volume w/v Weight/volume WHO World Health Organization wtSEB Wild type SEB
vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus .........................................................12 Hình 1.2. Vi khuẩn tụ cầu S. aureus Gram dƣơng dƣới kính hiển vi .......................12 Hình 1.3. Các độc tố quyết định của S. aureus .........................................................16 Hình 1.4. Cấu trúc tinh thể của protein SEB .............................................................18 Hình 1.5. Cơ chế gây độc của siêu kháng nguyên ....................................................19 Hình 2.1. Chu trình nhiệt phản ứng PCR ..................................................................31 Hình 2.2. Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T .......................................................32 Hình 2.3. Cấu trúc vertor biểu hiện pET22(b+) ........................................................35 Hình 3.1. Sản phẩm tách DNA tổng số của chủng S. aureus ...................................43 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb534 ....................................44 Hình 3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR ..............................................................44 Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1%....45 Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm cắt seb534/pTZ57R/T .............................................46 bằng enzym hạn chế EcoRI và HindIII .....................................................................46 Hình 3.6. Trình tự gen seb534 của chủng S. aureus .................................................47 Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm seb534 sau tinh sạch................................................49 Hình 3.8. Điện di đồ plasmid pET22(b+) sau khi cắt bằng các enzym hạn chế .......49 Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) .............................50 Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc ......................................52 để chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp seb534/pET22(b+) ......................................52 Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid seb534/pET22(b+) của các dòng khuẩn lạc ...................................................................................................................................53 Hình 3.12. Điện di đồ kiểm tra biểu hiện protein SEB534 .......................................54 Hình 3.13. Điện di đồ ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cảm ứng tới hàm lƣợng protein SEB534......................................................................................................................56 Hình 3.14. Điện di đồ ảnh hƣởng của nồng độ IPTG tới hàm lƣợng protein SEB543 ...................................................................................................................................57 Hình 3.15. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cảm ứng ...................58 Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm protein SEB534 tái tổ hợp sau tinh sạch ...............60
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam từ năm 2007 - 2014 ....4 Bảng 1.2. Sơ bộ tình hình nhiễm độc S. aureus trên thế giới trong những năm gần đây ...............................................................................................................................6 Bảng 1.3. Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 - 2016. ......8 Bảng 1.4. Phân loại khoa học S. aureus ....................................................................10 Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng cho tách dòng ...............................................................27 Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng chính ......................................................................28 Bảng 2.3. Các máy móc và thiết bị sử dụng..............................................................29 Bảng 2.4. Thành phần PCR .......................................................................................30 Bảng 2.5. Thành phần gel tách 12% .........................................................................40 Bảng 2.6. Thành phần gel cô 5% ..............................................................................40 Bảng 3.1. Độ tƣơng đồng của gen seb534 ở chủng S. aureus nghiên cứu với một số chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) ................................................47
1 MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng, đƣợc tiếp cận với thực phẩm an toàn đang trở thành quyền cơ bản đối với mỗi con ngƣời. Thực phẩm an toàn đóng góp to lớn trong việc cải thiện sức khoẻ con ngƣời, chất lƣợng cuộc sống và chất lƣợng giống nòi. Tuy nhiên tình hình ngộ độc thực phẩm ở nƣớc ta nói riêng và trên thế giới nói chung có xu hƣớng ngày càng tăng không chỉ gây ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khoẻ, cuộc sống và tính mạng của mỗi ngƣời, mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế, là gánh nặng chi phí cho chăm sóc sức khoẻ, an sinh xã hội quốc gia. Chính vì thế mà không ít ngƣời đã đặt câu hỏi: “Liệu trong thời đại phát triển nhƣ hiện nay thì sức khỏe của con ngƣời có đƣợc đảm bảo hay không?”. Nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm có thể do: hóa chất, vi sinh vật, thực phẩm chứa sẵn một số chất độc,… thực phẩm nhiễm vi sinh vật là nguyên nhân phổ biến trong ngộ độc thực phẩm. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus (S. aureus) là một trong những tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm. S. aureus còn đƣợc biết đến với cái tên “vi khuẩn bệnh viện” thƣờng khu trú tại các vị trí khác nhau trong cơ thể ngƣời nhƣ trong hốc mũi, họng, trong vết thƣơng, vết mổ không đảm bảo quy trình vô trùng. Nguy hiểm hơn chúng còn có khả năng kháng methiciline, penicilline khi gặp điều kiện thuận lợi có thể lây lan và gây nên nhƣng căn bệnh nguy hiểm. Các độc tố ruột do S. aureus sản sinh ra phải kể đến độc tố staphylococcal enterotoxin B (SEB), đây là một độc tố mạnh, bền với nhiệt, hòa tan trong nƣớc và là tác nhân chính thƣờng gặp trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus. Vì vậy, việc xác định sự có mặt của SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò vô cùng quan trọng. Hiện nay, nhiều nƣớc trên thế giới đã sản xuất đƣợc que thử phát hiện nhanh độc tố SEB dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch. Tuy nhiên, que thử nƣớc ngoài khi sử dụng ở Việt Nam có nhiều hạn chế nhƣ: giá thành cao, kháng nguyên trong nƣớc có thể không tƣơng thích với que thử… từ những hạn chế trên, thúc đẩy chúng tôi phải chủ động sản xuất que thử trong nƣớc. Nhằm phục vụ cho nghiên cứu chế
2 tạo kit phát hiện nhanh sự có mặt của độc tố ruột SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Biểu hiện và tinh sạch Staphylococcal enterotoxin B (SEB) từ chủng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus được phân lập tại Thái Nguyên”. Mục tiêu của đề tài: Nhân dòng, biểu hiện gen seb534 tự nhiên và tinh sạch protein tái tổ hợp SEB dạng tự nhiên mang độc tính, làm cơ sở tạo protein tái tổ hợp ở dạng đột biến mất độc tính, làm nguyên liệu cho việc tạo que thử phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố tụ cầu vàng. Đối tƣợng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus đƣợc phân lập tại Thái Nguyên. Nội dung nghiên cứu: - Tách dòng và xác định trình tự gen seb534 tự nhiên từ chủng tụ cầu vàng S. aureus đƣợc phân lập tại Thái Nguyên. - Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên SEB. - Nghiên cứu các điều kiện để tối ƣu khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp SEB trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3). - Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB.
3 Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột SEB trên thế giới và tại Việt Nam 1.1.1. Khái quát tình hình ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm là hội chứng lâm sàng cấp tính xuất hiện sau khi ngƣời bệnh ăn các thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật, thực phẩm bị nhiễm hoá chất hoặc bản thân thực phẩm có độc (chất độc có tự nhiên trong thực phẩm nhƣ nấm độc, khoai tây mọc mầm, sắn, một số loài nhiễm thể, cá nóc, cóc). Ngộ độc thực phẩm có những triệu chứng đau bụng, buồn nôn, nôn, nóng sốt, tiêu chảy… hoặc kèm theo các triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ độc. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện nay có tới hơn 400 các bệnh lây truyền qua thực phẩm không an toàn, từ các bệnh nh tới các bệnh ung thƣ. Thực phẩm bị ô nhiễm bởi vi sinh vật hoặc độc tố của chúng là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm. Tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm bao gồm: vi khuẩn, nấm, virus và ký sinh trùng; trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh và tử vong ở ngƣời [1], [18]. Trong số các nguyên nhân đã đƣợc xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp tính rất nguy hiểm, với tỷ lệ tử vong cao nhƣ: Salmonella, E. coli, Clostridium perfringens, S. aureus, vi khuẩn Listeria,… trong đó S. aureus đƣợc xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm ở nhiều nƣớc chỉ sau Salmonella và Clostridium perfringens [1]. Theo báo cáo gần đây của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hơn 1/3 dân số các nƣớc phát triển bị ảnh hƣởng của các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm. Đối với các nƣớc đang phát triển, tình trạng lại càng trầm trọng hơn nhiều, hàng năm gây tử vong hơn 2,2 triệu ngƣời, trong đó hầu hết là trẻ em [1]. Các vụ ngộ độc thực phẩm có xu hƣớng ngày càng tăng. Nƣớc Mỹ hiện tại mỗi năm vẫn có 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm với 325000 ngƣời phải vào viện và 5000 ngƣời chết. Chi phí điều trị cho các bệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại do nghỉ
4 điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm. Trung bình cứ 1000 dân có 175 ngƣời bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm và chi phí cho 1 ca ngộ độc thực phẩm mất 1531 đô la Mỹ [1], [49]. Nƣớc Úc có Luật thực phẩm từ năm 1908 nhƣng hiện nay mỗi năm vẫn có khoảng 4,2 triệu ca bị ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm, trung bình mỗi ngày có 11500 ca mắc bệnh cấp tính do ăn uống gây ra và chi phí cho 1 ca ngộ độc thực phẩm mất 1679 đô la Úc. Ở Anh cứ 1000 dân có 190 ca bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm và chi phí cho 1 ca ngộ độc thực phẩm mất 789 bảng Anh. Tại Hàn Quốc, tháng 6 năm 2006 có 3000 học sinh ở 36 trƣờng học bị ngộ độc thực phẩm [1]. Mặc dù cho đến nay đã có khá nhiều tiến bộ về khoa học kỹ thuật trong công tác bảo vệ và an toàn vệ sinh thực phẩm, cũng nhƣ biện pháp về quản lý giáo dục, ban hành luật, điều lệ và thanh tra giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm, nhƣng tình hình ngộ độc thực phẩm do kém chất lƣợng về vệ sinh thực phẩm và thức ăn ở Việt Nam vẫn chiếm tỷ lệ khá cao (bảng 1.1) [1]. Bảng 1.1. Báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam từ năm 2007 - 2014 Kết quả điều tra TT Năm Vụ ngộ độc (vụ) Số mắc (người) Chết (người) 1 2007 247 7329 55 2 2008 205 7828 61 3 2009 152 5212 35 4 2010 175 5664 51 5 2011 148 4700 27 6 2012 168 5541 34 7 2013 163 5000 28 8 2014 189 5.100 43 Trung bình/năm 181 (148 - 247) 5797(4700 - 7828) 42 (27 - 61) Tổng cộng 1447 46376 334
5 Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế, trong năm 2015, toàn quốc ghi nhận 171 vụ ngộ độc thực phẩm với 4965 ngƣời mắc và 23 trƣờng hợp tử vong. Trong quý I năm 2016, toàn quốc ghi nhận 25 vụ ngộ độc thực phẩm với 969 ngƣời mắc, 669 ngƣời nhập viện và 2 trƣờng hợp tử vong. Nguyên nhân ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm 36%, do độc tố tự nhiên chiếm 12%, do hoá chất 4% và 48% vụ chƣa xác định đƣợc nguyên nhân. Trong 9 vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật thì ghi nhận 4 vụ do tụ cầu vàng S. aureus, 1 vụ liên quan đến E. coli còn lại chƣa xác định rõ nguyên nhân. 1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do S. aureus và độc tố ruột SEB trên thế giới và tại Việt Nam Trên thế giới, vụ ngộ độc thực phẩm lớn đầu tiên đƣợc Vaughan và Sternberg phát hiện trong pho mát có liên quan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở Michigan - Mỹ. Năm 1930, Dack xác định đƣợc vụ ngộ độc do S. aureus từ bánh giáng sinh [54]. Vào năm 1934, Jordan và Burrows tìm thấy sự hiện diện của Staphylococci trong 9 vụ ngộ độc thực phẩm [42]. Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trƣờng hợp ngộ độc thực phẩm do S. aureus đƣợc ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt là ruốc); 22% các trƣờng hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan sữa, 7% từ cá, sò, ốc .v.v và 3,5% từ trứng [60]. Tại Mỹ, ƣớc tính mỗi năm có 241000 ngƣời bị ngộ độc thực phẩm do S. aureus. Chi phí điều trị và chăm sóc sức khoẻ cho mỗi trƣờng hợp bị ngộ độc thực phẩm do S. aureus là 695 đô la, tổng chi phí hàng năm là 167.597.860 đô la [43]. Trong số các trƣờng hợp ngộ độc thực phẩm do S. aureus đƣợc báo cáo giữa các năm 1975 và 1982 thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ salad, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [33]. Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S. aureus đƣợc ghi nhận trong hai năm (1999 - 2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt là pho mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ trứng
6 (11%) hoặc các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [34]. Ghi nhận trong năm 2012 đã xảy ra 1288 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó ngộ độc thực phẩm do S. aureus là 300 (23%) vụ [51]. Tại Nhật Bản cũng đã xảy ra 2 vụ ngộ độc S. aureus lớn vào tháng 8 năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5 trƣờng tiểu học ở Tokyo và tháng 7 năm 2000 làm 14000 ngƣời ở 6 tỉnh bị ngộ độc. Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa bị nhiễm S. aureus của tập đoàn Snow. Vụ ngộ độc sữa tháng 7 năm 2000 khiến tập đoàn Snow phải bồi thƣờng cho 4000 nạn nhân 20000 Yên/ngƣời/ngày và Tổng giám đốc bị cách chức [1]. Ở Đài Loan, từ năm 1986 đến năm 1995 ngộ độc thực phẩm do S. aureus chiếm 30% trong tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm. Tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một trƣờng trung học ở thành phố Đài Trung làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc sau khi ăn sáng 2-3 giờ [59]. Trong những năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm S. aureus và độc tố của S. aureus ở các nƣớc diễn tiến ngày càng trở nên phức tạp, trên quy mô rộng, không phân biệt trình độ phát triển (bảng 1.2). Bảng 1.2. Sơ bộ tình hình nhiễm độc S. aureus trên thế giới trong những năm gần đây STT Địa điểm Thời gian Loại thực phẩm Số ngƣời mắc 1 Bỉ 2007 Bánh Hamburger 15 2 Áo 2007 Sữa, sữa cacao, sữa vani 166 3 Pháp 2008 Mì ống salad 100 4 Nhật Bản 2009 Bánh Crepes 75 5 New Zealand 2010 Hàu, phomai, thịt xông khói 22 6 Ý 2011 Salad hải sản 26 7 Úc 2012 Cơm chiên, thịt gà 22 8 Mỹ 2012 Thịt gà, lợn, xúc xích 35 9 Mỹ 2013 Thịt lợn 26 10 Pháp 2014 Cá hồi 31
7 Trong khu vực Đông Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do S. aureus cao nhất là Indonesia và Philippines. Việt Nam cũng là một trong những nƣớc có tỷ lệ nhiễm S. aureus cao. Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng, thƣờng gặp nhất là các thực phẩm đƣờng phố (46,6%), xúc xích (96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%)…[5]. Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quản thực phẩm không tốt. Tụ cầu thƣờng nhiễm trực tiếp vào thực phẩm từ tay ngƣời chế biến hay do ho, hắt hơi. Cùng với việc bảo quản thực phẩm không đúng quy cách, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ cầu sẽ là điều kiện để chúng tăng nhanh số lƣợng. Điều đáng lo ngại là độc tố đƣợc tạo ra trong suốt quá trình phát triển của tụ cầu không gây ảnh hƣởng đến cảm quan của thực phẩm, do đó ít đƣợc chú ý và khó phát hiện [11], [48]. S. aureus có thể gây ngộ độc cấp tính cho nhiều ngƣời trong cùng một thời điểm khi họ cùng tiêu thụ một loại thực phẩm và có thể xảy ra với bất kì đối tƣợng nào. Tuy nhiên, ngƣời già, trẻ em và những ngƣời có hệ miễn dịch kém sẽ dễ mắc và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc nặng nề hơn [7]. Dựa theo bảng 1.3, chúng ta nhận thấy tình hình ngộ độc thực phẩm do S. aureus diễn ra khá phổ biến ở khắp các tỉnh thành trong cả nƣớc.
8 Bảng 1.3. Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 - 2016. Số ngƣời Đối tƣợng STT Địa điểm Thời gian mắc mắc Trƣờng mầm non bán công Vĩnh Thọ - 1 9/2007 100 Học sinh Phú Thọ Cty TNHH Alliace One, KCN Giao 2 6/2008 100 Công nhân Long - Bến Tre Cty Phú Nguyên, KCN An Đồng - Hải 3 8/2009 160 Công nhân Dƣơng Khách dự 4 Vụ Bản - Nam Định 12/2010 65 đám cƣới Nhà máy dệt may Haivine Kim Liên - 5 12/2011 200 Công nhân Nam Đàn - Nghệ An Khách dự 6 Bản Hùn - Chiềng Cọ - Sơn La 4/2012 300 đám cƣới 7 Công ty TNHH Foremart - Hƣng Yên 7/2013 182 Công nhân Khách dự 8 Yên Dũng - Bắc Giang 6/2014 181 đám cƣới Trƣờng THCS Nguyễn Gia Thiều - 9 10/2014 39 Học sinh Phƣờng 12 - Vũng Tàu Công ty TNHH CY Vina - KCN Long 10 3/2015 229 Công nhân Đức - Trà Vinh Trƣờng mầm non Sao Mai - Ninh Kiều 11 4/2015 30 Học sinh - Cần Thơ KCN Minh Hƣng - Hàn Quốc, Chơn 12 4/2016 243 Công nhân Thành - Bình Phƣớc
9 Qua các số liệu trên chúng ta thấy, ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng S. aureus chiếm tỷ lệ nhiễm khá cao ở Việt Nam và trên toàn thế giới. Trên thực tế, bệnh làm mất nhiều thời gian và năng suất lao động cũng nhƣ tốn kém kinh phí cho điều trị tại bệnh viện. Hơn thế, bệnh cũng gây thiệt hại đáng kể về kinh tế trong ngành công nghiệp thực phẩm, các công ty cung cấp thực phẩm và nhà hàng. Do đó, việc kiểm soát, nắm bắt tình hình ngộ độc thực phẩm gây ra bởi S. aureus đóng vai trò quan trọng trong vấn đề sức khỏe của con ngƣời, kinh tế và xã hội. Trong các vụ ngộ độc thực phẩm gây ra bởi độc tố của S. aureus, ngộ độc thực phẩm bởi độc tố ruột SEB chiếm tỷ lệ khá cao. Tuy nhiên, trên thực tế, số ca mắc hay tử vong do ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB vẫn chƣa đƣợc thống kê cụ thể. Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn cho quá trình thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm do SEB nhƣ: 1. Bệnh nh nên ngƣời bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các cơ sở chuyên khoa. 2. Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thƣờng có nhiều bệnh có biểu hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chƣa kết luận đúng bệnh. 3. Việc tiến hành các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào các phƣơng pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời gian kéo dài. Do đó, khi bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu sẽ gặp nguy hiểm gấp bội vì SEB là một siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh, có thể dẫn tới tử vong ở ngƣời. 1.2. Giới thiệu về Staphylococcus aureus 1.2.1. Lịch sử phát hiện - S. aureus đƣợc nhà khoa học Robert Koch phát hiện đầu tiên vào năm 1878 sau khi thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt. - Năm 1880 Louis Pasteur tiến hành phân lập và nghiên cứu về S. aureus.
10 - Ngày 9 tháng 4 năm 1880, bác sĩ ngƣời Scotland - Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị Hội phẫu thuật Đức lần thứ 9 một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và trình bày tƣơng đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng. - Năm 1926, Julius Von Darányi là ngƣời đầu tiên phát hiện mối tƣơng quan giữa sự hiện diện của hoạt động enzym coagulase huyết tƣơng của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới đƣợc chấp nhận rộng rãi [31]. 1.2.2. Đặc điểm phân loại Đặc điểm phân loại của tụ cầu vàng S. aureus đƣợc trình bày trong bảng 1.4. Bảng 1.4. Phân loại khoa học S. aureus Phân loại khoa học Giới Prokaryote Ngành Firmicute Lớp Cocci Bộ Bacillales Họ Staphylococcaceae Chi Staphylococcus Loài Staphylococcus aureus Việc phân loại vi khuẩn tụ cầu có thể dựa trên yếu tố khác nhau nhƣ kháng nguyên, phage, enzym coagulase:  Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Vi khuẩn tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: Protein, polysaccharid, acid teichoic của thành tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, phân loại tụ cầu rất khó khăn nếu chỉ dựa trên yếu tố kháng nguyên.  Phân loại bằng phage: Sự ký sinh của phage trên vi khuẩn mang tính đặc hiệu rất cao. Do đó, đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều nhất trong phân loại S. aureus. S. aureus đƣợc phân vào các nhóm I, II, III, IV [4].