Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học từ lá cây trứng cá Muntingia calabura L.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

-----------------------------

PHẠM HỮU TUẤN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA

THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH

HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA

CALABURA L.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 60420201

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng…năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

-----------------------------

PHẠM HỮU TUẤN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA

THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH

HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA

CALABURA L.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 60420201

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN NGỌC HỒNG

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng…năm 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM

ngày 11 tháng 11 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TT Họ và tên Chức danh Hội đồng

1 PGS TS. Nguyễn Tiến Thắng Chủ tịch

2 TS. Nguyễn Hoàng Dũng Phản biện 1

3 PGS TS. Thái Văn Nam Phản biện 2

4 TS. Võ Đình Lệ Tâm Ủy viên

5 TS. Nguyễn Thị Hai Ủy viên, Thư ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa

(nếu có). Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

TP. HCM, ngày..… tháng….. năm 20..…

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: ...............Phạm Hữu Tuấn...............................Giới tính: Nam .................

Ngày, tháng, năm sinh: ............18/04/1993................................Nơi sinh: TP.HCM ..........

Chuyên ngành: .....................Công nghệ sinh học......................MSHV: 1541880011 ......

I- Tên đề tài:

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ HOẠT

TÍNH SINH HỌC TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ MUNTINGIA CALABURA L.

II- Nhiệm vụ và nội dung:

Nhiệm vụ: Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học của lá

cây trứng cá.

Nội dung: Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, định tính thành phần hóa học bằng phương

pháp hóa, khảo sát năng chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn, khả năng điều hòa đường

huyết, khả năng giải độc gan, khả năng điều trị tiêu chảy, định tính một số thành phần

hóa học nhờ sắc ký cao áp ghép khối phổ.

III- Ngày giao nhiệm vụ: (Ngày bắt đầu thực hiện LV ghi trong QĐ giao đề tài)

15/02/2017

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/08/2017

V- Cán bộ hướng dẫn: (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên)

Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công

trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được

cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Học viên thực hiện Luận văn

ii

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại

học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh

học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức

quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.

Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Ngọc Hồng

người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong

suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở

Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các bạn

đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của

mình.

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên

con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như

trong cuộc sống.

iii

TÓM TẮT

Cây trứng cá (Muntingia calabura) được trồng nhiều ở miền Nam Việt Nam

và thường dùng để làm bóng mát nhưng hoạt tính sinh học ít được nghiên cứu. Trong

nghiên cứu này dịch chiết ethanol 70% (EMC70), ethanol 90% (EMC90) và dịch

chiết nước (AMC) từ lá cây trứng cá được sử dụng để đánh giá sơ bộ thành phần hóa

học và khảo sát một số hoạt tính sinh học bao gồm: Khả năng chống oxi hóa, khả

năng kháng khuẩn, khả năng điều hòa đường huyết, khả năng trị tiêu chảy, khả năng

giải độc gan đồng thời định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp

LC-MS/MS. Kết quả định tính cho thấy có nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid,

tannin và steroid trong các dịch chiết EMC70 và EMC90, trong khi AME chứa

saponin và amino acid tự do. Kết quả định tính cũng cho thấy hàm lượng pholyphenol,

flavonoid và tannin tổng số trong dịch chiết EMC70 là cao nhất. Khả năng kháng

khuẩn của EMC70 và EMC90 là tương đương nhau đối với các chủng E.coli-ETEC,

Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria innocua và Staphylococcus

aureus. Dịch chiết EMC90 có khả năng hạ đường huyết tốt nhất trong tổng số 2 loại

dịch chiết còn lại tại nồng độ 200 mg/kg. Khả năng ức chế tiêu chảy của dịch chiết

EMC70 tại nồng độ 750 mg/kg lên tới 78,87 % và tương đương với đối chứng

loperamide 3 mg/ml. Khả năng giải độc gan của 3 loại dịch chiết được xác định dựa

trên chỉ số men gan ALT và AST. Dịch chiết EMC70 tại nồng độ 50 mg/kg với kết

quả giá trị ALT giảm đáng kể so với lúc trước khi được chữa trị. Phân tích HPLC-

MS của dịch chiết EMC70 cho kết quả hướng tới sự hiện diện của chrysoeriol có khả

năng bảo vệ gan nhiễm độc cũng như tác động tích cực trong điều trị bệnh tiểu đường.

Một số chất khác thuộc nhóm flavonoid cũng được tìm thấy trong dịch chiết này. Kết

quả tổng hợp cho thấy cây Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa, tiềm năng

kháng khuẩn đối với một số chủng vi sinh gây bệnh đường ruột, khả năng trị tiêu

chảy, điều hòa đường huyết và bảo vệ gan của dịch chiết ethanol.

iv

ABTRACT

Muntingia calabura L. was grown in southern Vietnam. Until now there are

not many scientific articles published on the bioactivity of Muntingia calabura

leaves. In this study, ethanol 70% extract (EMC70), ethanol 90% extract (EMC90)

and aqueous extract (AMC) from Muntingia calabura leaves are used to test

phytochemical and evaluation of bioactivities such as antioxidant, antimicrobial

activity, hypoglycemia, anti-diarrhea and hepatoprotective activity. Determination of

compounds by high performance liquid chromatography ‒ mass spectrometry

(HPLC/MS). The result of phytochemical screening showed that phenolics,

flavonoids, tannins and steroids in EMC70 and EMC90. AMC with saponins and free

amino acids. Result of EMC70 in total polyphenol content, total flavonoid content

and total tannin content were highest. Antimicrobial activity of EMC70 and ECM90

were the same in E.coli-ETEC, Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria

innocua and Staphylococcus aureus. Anti-diarrhea activity of EMC70 was reached

78.87% and it was equivalent to the group was treated by loperamide 3 mg/ml.

Hepatoprotective activity of EMC70, EMC90 and AMC was determined based on

ALT and AST. EMC70 resulted in a significant reduction in ALT at 50 mg/kg

compared with prior to treatment. Qualitative HPLC/MS analysis of EMC70 was

showed the results toward the presence of chrysoeriol that is capable of protecting the

liver from toxicity as well as positive effects in treatment of diabetes. Other flavonoid

compounds were found in this extract. The results in this study were showed that

Muntingia calabura had antioxidant activity, potential antimicrobial activity, anti-

diarrhea activity, hypoglycemia and hepatoprotective activity of ethanol extracts.

v

MỤC LỤC

TRANG

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii

TÓM TẮT ................................................................................................................ iii

ABTRACT ................................................................................................................ iv

MỤC LỤC .................................................................................................................. v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... ix

DÁNH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... x

DANH SÁCH CÁC HÌNH.................................................................................... xiii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4

1.1. Tổng quan về cây Muntingia calabura ............................................................. 4

1.1.1. Nguồn gốc ......................................................................................................... 4

1.1.2. Phân loại ........................................................................................................... 4

1.1.3. Đặc điểm chung của cây Muntingia calabura ................................................ 4

1.1.4. Công dụng ........................................................................................................ 6

1.1.5. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Muntingia calabura ......... 6

1.1.6. Cây trứng cá và các bài thuốc dân gian .......................................................... 8

1.1.7. Các nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................................. 9

1.2.Tổng quan về chất chống oxi hóa .................................................................... 11

1.2.1. Khái niệm chất chống oxi hóa ....................................................................... 11

1.2.2. Cơ chế chống oxi hóa của các hợp chất tự nhiên ........................................ 11

1.2.3. Một số chất tự nhiên từ thực vật có khả năng chống oxi hóa ..................... 11

1.3. Vi sinh vật chỉ thị .............................................................................................. 12

1.3.1. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Escherichia ....................................................... 12

1.3.2. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Listeria .............................................................. 13

1.3.3. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Shigella ............................................................. 15

1.3.4. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus ................................................. 17

1.4. Hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ................................................................ 19

1.4.1. Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật .............................................. 19

vi

1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật ...................................... 19

1.5. Giới thiệu về bệnh tiểu đường ......................................................................... 22

1.5.1. Khái niệm ........................................................................................................ 22

1.5.2. Phân loại ......................................................................................................... 23

1.5.3. Thuốc trị tiểu đường glibenclamide .............................................................. 24

1.6. Giới thiệu về bệnh tiêu chảy ............................................................................ 25

1.6.1. Khái niệm ........................................................................................................ 26

1.6.2.Nguyên nhân gây bệnh ................................................................................... 26

1.6.3. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy ............................................................................. 28

1.6.4. Cơ chế gây tiêu chảy bằng tác nhân castor oil ............................................. 29

1.6.5. Thuốc trị tiêu chảy loperamide ...................................................................... 29

1.7. Giới thiệu các bệnh về gan và acetaminophen .............................................. 30

1.7.1. Các bệnh về gan ............................................................................................. 30

1.7.2. Các loại enzyme của gan ................................................................................ 30

1.7.3. Cơ chế gây độc gan của acetaminophen ....................................................... 31

1.7.4. Thuốc giải độc gan Silymarin ........................................................................ 33

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 34

2.1.Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 34

2.1.1. Thời gian ......................................................................................................... 34

2.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 34

2.2. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 34

2.2.1. Nguyên liệu thực vật ...................................................................................... 34

2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị ........................................................................................... 34

2.2.3. Đối tượng động vật ......................................................................................... 34

2.2.4. Hóa chất, dụng cự và thiết bị ......................................................................... 34

2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 35

2.3.1. Thu hái và xử lý mẫu ..................................................................................... 35

2.3.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn dược liệu .............................................. 35

2.3.3. Phương pháp xác định thành phần hóa học ................................................ 38

2.3.4. Hàm lượng flavonoid tổng số ........................................................................ 39

2.3.5. Hàm lượng phenolic tổng số ......................................................................... 39

vii

2.3.6. Hàm lượng tannin tổng số ............................................................................. 39

2.3.7. Phương pháp FRAP....................................................................................... 39

2.3.8. Khả năng chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH ........................................... 40

2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử ........................................................... 40

2.3.10. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................................ 40

2.3.11. Xác định độc tính cấp diễn .......................................................................... 40

2.3.12. Mô hình chuột tiểu đường cấp tính............................................................. 41

2.3.13. Mô hình chuột bi ̣ nhiễm độc acetaminophen ............................................. 41

2.3.14. Mô hình chuột tiêu chảy castor oil ................................................................. 41

2.3.15. Phương pháp sắc ký cao áp ghép khối phổ (HPLC-MS) ........................... 41

2.3.16. Xử lý số liệu .................................................................................................. 41

2.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... 41

2.4.1. Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết EMC70, EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura .................................................................................................. 43

2.4.2. Thí nghiệm 2: Định tính một số thành phần hóa học có trong cây ............ 43

2.4.3. Thí nghiệm 3: Hàm lượng flavonoid tổng số................................................ 46

2.4.4. Thí nghiệm 4: Hàm lượng phenolic tổng số ................................................. 46

2.4.5. Thí nghiệm 5: Hàm lượng tannin tổng số .................................................... 47

2.4.6. Thí nghiệm 6: Khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp FRAP ........... 47

2.4.7. Thí nghiệm 7: Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ................... 48

2.4.8. Thí nghiệm 8: Xác định năng lực khử .......................................................... 49

2.4.9. Thí nghiệm 9: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura .......................................................... 51

2.4.10. Thí nghiệm 10: Xác định độc tính cấp diễn ................................................ 52

2.4.11. Thí nghiệm 11: Mô hình chuột tiểu đường cấp tính .................................. 53

2.4.12. Thí nghiệm 12: Mô hình chuột bi ̣ nhiễm độc acetaminophen ................... 54

2.4.13. Thí nghiệm 13: Mô hình chuột tiêu chảy castor oil ................................... 55

2.4.14. Thí nghiệm 14: Định tính bằng phương pháp sắc ký sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ HPLC ................................................................................................ 56

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................ 57

3.1. Bước đầu góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu ...................................... 57

3.1.1. Khảo sát vi phẩu và soi bột dược liệu ............................................................ 57

viii

3.1.2. Độ tinh khiết của dược liệu ........................................................................... 61

3.1.3. Hàm lượng cắn thu được từ dịch chiết lá cây trứng cá ............................... 62

3.2. Thành phần hóa học có trong cây Muntingia calabura ................................ 62

3.3. Định lượng flavonoid phenolic và tannin ....................................................... 65

3.4. Khả năng chống oxy hóa.................................................................................. 65

3.4.1. Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP ..................................... 65

3.4.2. Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp xác định năng lực khử .......... 67

3.4.3. Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ........................................... 68

3.5. Hoạt tính kháng khuẩn .................................................................................... 72

3.5.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Muntingia calabura ............ 72

3.5.2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC . 76

3.6. Độc tính cấp diễn .............................................................................................. 79

3.7. Khả năng điều hòa đường huyết trên mô hình chuột tiểu đường cấp tính 80

3.8. Khả năng trị tiêu chảy trên mô hình castor oil ............................................. 82

3.9. Khả năng giải độc gan trên mô hình acetaminophen ................................... 85

3.10. Phân tích sắc kí HPLC-MS ........................................................................... 89

KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 93

4.1. Kết luận ............................................................................................................. 93

4.2. Đề nghị ............................................................................................................... 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 95

ix

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMC: Aqueous extract of Muntingia calabura (Dịch chiết nước từ lá cây Muntingia calabura)

EMC70: 70% ethanol extract of Muntingia calabura (Dịch chiết ethanol 70% từ lá cây Muntingia calabura)

EMC90: 90% ethanol extract of Muntingia calabura (Dịch chiết ethanol 70% từ lá cây Muntingia calabura)

FRAP: Ferric reducing antioxidant power (Khả năng chống oxi hóa thông qua việc khử sắt).

HPLC/MS: High performance liquid chromatography / mass spectrometry (Sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ)

PSMs: Plant secondary metabolites: (Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật)

x

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 1.1. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật ............................ 20

Bảng 2.1. Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................. 52

Bảng 3.1. Độ ẩm của lá cây và bột dược liệu ........................................................... 61

Bảng 3.2. Định tính thành phần hóa học có trong Muntingia calabura L. .............. 63

Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol, flavonoid và tannin tổng số ............................... 65

Bảng 3.4. Kết quả tính toán giá trị FRAP ................................................................. 66

Bảng 3.5. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP ................................................................... 66

Bảng 3.6. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng chống oxi hóa theo theo năng lực khử ...................................................................... 68

Bảng 3.7. Kết quả IC50 chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ................................... 70

Bảng 3.8. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ......................................................................... 70

Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100 mg/ml) đối với các chủng vi sinh vật khác ............................................................... 74

Bảng 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn từ cây Muntingia calabura L. tại nồng độ 100 mg/ml ........................................................................................................................ 75

Bảng 3.11. Nồng độ ức chế tối thiểu EMC70 ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml ................................................................................................................ 77

Bảng 3.12. Nồng độ ức chế tối thiểu EMC90 ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml ................................................................................................................ 77

Bảng 3.13. Nồng độ ức chế tối thiểu AMC ở các nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml ........................................................................................................................ 78

Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số hợp chất từ dịch chiết cây Muntingia calabura bằng phương pháp sắc ký HPLC-MC ...................................................................... 89

xi

DANH MỤC CÁC HÌNH

TRANG

Hình 1.1. Ảnh chụp cây Muntingia calabura L ......................................................... 5

Hình 1.2. Mô phỏng hình thái cây Muntingia calabura L ......................................... 5

Hình 1.3. Mô phỏng cấu tạo bầu nhụy, nhị và cánh hoa ............................................ 6

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa ............................................... 11

Hình 1.5. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử ................................................. 12

Hình 1.6. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB ................................................... 13

Hình 1.7. Hình thái Listeria monocytogenes trên kính hiển vi điện tử .................... 14

Hình 1.8. Khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên môi trường thạch thường .......... 14

Hình 1.9. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử ............................................. 15

Hình 1.10. Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey .................................... 16

Hình 1.11. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử ................................ 17

Hình 1.12. Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker bổ sung egg yolk ..................................................................................................................... 18

Hình 1.13. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm ................................................................................................................................... 20

Hình 1.14. Cơ sở đánh giá các loại phân .................................................................. 26

Hình 1.15. Sơ đồ chuyển hóa acetaminophen trong cơ thể ...................................... 32

Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát ......................................................................................... 42

Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận cắn chiết từ cây Muntingia calabura .............................. 43

Hình 2.3. Quy trình định tính dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura .................................................................................................................... 44

Hình 2.4. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP .. 47

Hình 2.5. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH ........ 48

Hình 2.6. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo năng lực khử ............. 50

Hình 2.7. Quy trình thực hiện khả năng kháng khuẩn ............................................. 51

Hình 2.8. Mô hình chuột tiểu đường cấp tính .......................................................... 53

Hình 2.9. Mô hình giải độc gan acetaminophen ....................................................... 54

Hình 2.10. Mô hình tiêu chảy castor oil ................................................................... 55

Hình 3.1. Lông tiết .................................................................................................... 57

Hình 3.2. Mặt cắt biểu bì lá ...................................................................................... 57

xii

Hình 3.3 A. Mặt cắt ngang thân B. Mặt cắt dọc thân ............................................... 58

Hình 3.4. Mặt cắt dọc hoa cây Muntingia calabura. ................................................ 58

Hình 3.5 A. Cấu tạo nhị hoa. B. Chỉ nhị C. Bao phấn ............................................. 59

Hình 3.6. Hình thái hạt phấn .................................................................................... 59

Hình 3.7. Bề mặt cánh hoa ....................................................................................... 60

Hình 3.8. Cấu tạo noãn ............................................................................................. 60

Hình 3.9. Bột dược liệu ............................................................................................ 61

Hình 3.10. Hàm lượng của 3 loại cắn thu được từ lá cây Muntingia calabura. ....... 62

Hình 3.11. A Định tính saponin B. Định tính flavonoid (thử nghiệm shinoda), C. Định tính alkaloid trên AMC, D. Định tính amino acid trên AMC, E. Định tính phenolic, F. Định tính steroid. .................................................................................. 64 Hình 3.12 Đường chuẩn Fe2+-TPTZ ......................................................................... 66

Hình 3.13. Khả năng khử của 3 dịch chiết EMC70, EMC90, AMC và đối chứng acid ascorbic...................................................................................................................... 67

Hình 3.14. Đường chuẩn acid ascorbic nồng độ từ 20 đến 70 µg/ml ...................... 68

Hình 3.15. Hoạt tính quét gốc tự do ở các nồng độ từ cây Muntingia calabura ..... 69

Hình 3.16. Hoạt tính chống oxi hóa của acid ascorbic ............................................. 69

Hình 3.17. Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do của EMC70 ở các nồng độ khác nhau ........................................................................................................................... 70

Hình 3.18. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100 mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC. ......................................................................... 73

Hình 3.19. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70, EMC90 và AMC (100 mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri và Shigella boydii. ..................................... 73

Hình 3.20. A. Hoạt tính kháng khuẩn của EMC90 (100 mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri, B. AMC (100 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes, C. EMC70 (100 mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC, D. EMC70 (100 mg/ml) đối với chủng Staphylococcus aureus .............................................................................................. 76

Hình 3.21. Chỉ số đường huyết của các nhóm chuột uống cao chiết, nhóm tăng đường, đối chứng và glibenclamide 10 mg/kg ...................................................................... 80

Hình 3.22. Tỷ lệ ức chế tiêu chảy ............................................................................. 82

Hình 3.23. Thời gian tiêu chảy ................................................................................. 83

Hình 3.24. Chỉ số men gan ALT của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70, EMC90, AMC, sylimarin, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng .............. 86

xiii

Hình 3.25. Chỉ số men gan AST của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70, EMC90, AMC, sylimarin, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng .............. 87

Hình 3.26. Sắc ký đồ HPLC-MS dịch chiết EMC70 từ lá cây Muntingia calabura 90

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cây thuốc dân gian từ lâu đã được nhiều người quan tâm đến. Từ những năm

đầu thế kỷ XX con người ta đã biết sử dụng thực vật như một nguồn thuốc chữa bệnh

bằng kinh nghiệm dân gian. Theo đà phát triển của lịch sử, kho tàng kinh nghiệm dân

gian phòng chống bệnh tật ngày càng phong phú và đa dạng. Đây là nguồn tài nguyên

thực vật có giá trị cao trong việc phòng chữa nhiều loại bệnh thay cho một số loại

thuốc Tây y. Trong chẩn đoán và điều trị bệnh, một số loại thuốc Tây y luôn đi kèm

với nhiều tác dụng phụ không mong muốn như nôn mửa, rối loạn tiêu hóa, chóng

mặt, nhức đầu, có nguy cơ tái bệnh,… Bên cạnh một hiện trạng thực tế là việc kháng

thuốc kháng sinh ngày càng trở nên phổ biến ở các nước phát triển thì việc tìm đến

các loại thảo dược thiên nhiên để chữa bệnh thay cho các loại thuốc tây là điều tất

yếu và dần đang trở thành một xu thế. Trong những năm trở lại đây, từ xu hướng sử

dụng các loại cây thuốc dân gian để chữa bệnh, các nước phát triển đầu tư vào nghiên

cứu nhiều loại cây thuốc dân gian nhằm tách chiết cũng như trích ly các hợp chất thứ

cấp có hoạt tính sinh học để tìm ra hướng ứng dụng và điều chế nhiều loại thuốc mới.

Cây mật sâm (trứng cá) trên một số nghiên cứu trên thế giới có tác dụng

chống oxi hóa, kháng khuẩn cùng với kháng viêm. Tại Việt Nam, cây trứng cá chủ

yếu được trồng khắp nơi để làm bóng mát với số lượng đáng kể, nhưng hoạt tính sinh

học ít được nghiên cứu đến. Thậm chí, ở nhiều nơi còn bắt đầu chặt phá loài cây này.

Tannin, một thành phần hóa học được biết đến với khả năng ức chế quá trình tiêu

chảy được tìm thấy nhiều trong cây trứng cá nhưng cho tới hiện nay vẫn chưa có bất

cứ nghiên cứu nào liên quan tới khả năng này. Nhằm tận dụng nguồn nguyên liệu

tiềm năng trong chữa trị một số bệnh cũng như khẳng định tầm quan trọng cây trứng

cá trong từ điển trị liệu Đông y. Chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Bước đầu

nghiên cứu thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học từ lá cây trứng cá

Muntingia calabura L.” nhằm tìm hiểu sâu hơn về tác dụng sinh học, cũng như hướng

2

ứng dụng thực tiễn cùng với khả năng chữa bệnh của cây trứng cá theo một góc nhìn

khoa học.

2. Mục đích

Đánh giá một số thành phần hóa học có trong cá dịch chiết từ cây Muntingia

calabura.

Khảo sát một số hoạt tính sinh học tiềm năng trong dịch chiết từ cây

Muntingia calabura.

3. Nội dung nghiên cứu

Đánh giá sơ bộ hoạt tính hóa học.

Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cây Muntingia calabura.

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các dịch chiết từ lá cây Muntingia calabura.

Đánh giá khả năng hạ đường huyết của cây Muntingia calabura trên mô hình

động vật.

Đánh giá khả năng trị tiêu chảy của cây Muntingia calabura trên mô hình

động vật

Đánh giá khả năng bảo vệ gan chống lại chất độc từ cây Muntingia calabura.

Định tính một số thành phần hóa học cơ bản bằng phương pháp HPLC/MS.

4. Ý nghĩa khoa học

Lá cây Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa, kháng một số vi

khuẩn gây hại ở đường ruột, có tiềm năng bảo vệ gan và ổn định đường huyết.

Bên cạnh đó, hoạt tính lá cây Muntingia calabura có tiềm năng phòng ngừa

và hỗ trợ điều trị bệnh tiêu chảy mà các nghiên cứu trong và ngoài nước chưa thấy

nghiên cứu về tác dụng sinh học này.

5. Ý nghĩa thực tiễn

3

Nguyên liệu lá cây Muntingia calabura trong nghiên cứu có tác dụng điều

hòa đường huyết, giải độc gan cũng như chống lại một số chủng gây bệnh đường ruột

hỗ trợ điều trị tiêu chảy nên có thể ứng dụng làm thực phẩm chức năng. Một sản phẩm

hướng ứng dụng của lá cây này là làm trà thảo mộc ngăn ngừa béo phì và các biến

chứng về tim mạch, ngăn ngừa các bệnh về gan và tốt cho hệ tiêu hóa. Sản phẩm này

mang lại hiệu quả về mặt kinh tế vì có nguồn nguyên liệu phong phú, giá rẻ. Nghiên

cứu cũng chứng minh được hoạt tính dược lý của bộ phận lá nên cũng góp phần tạo

nên thu nhập cho người dân trồng loại cây này.

6. Phạm vi nghiên cứu

Khảo sát chỉ giới hạn trên đối tượng là bộ phận lá

Các khảo sát chỉ thực hiện trên 3 loại dung môi ethanol 70%, ethanol 90% và

nước.

Giới hạn khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chỉ trên 9 chủng vi sinh vật chỉ thị

Khảo sát khả năng giải độc gan chỉ dựa trên 2 loại enzyme alanine

transaminase và aspartate transaminase

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây Muntingia calabura L.

1.1.1. Nguồn gốc

Cây trứng cá hay còn gọi là cây mật sâm có tên khoa học là Muntingia

calabura, thuộc họ Elaeocarpaceae (Morton, 1987), loài duy nhất của giống

Muntingia, là cây có hoa ở phía nam Mexico, Caribean, trung Mỹ và đông nam Mỹ,

các quần đảo Bắc Mỹ, các mẫu cây còn được tìm thấy ở Jamaica. Ngoài ra nó còn

được trồng ở khu vực ấm áp như Ấn Độ hay một số quốc gia trong khu vực Đông

Nam Á như Malaysia, Indonesia, Philippines và Việt Nam (Jensen, 1999). Lá, vỏ cây

và hoa có giá trị làm thuốc chữa bệnh.

1.1.2. Phân loại

Giới (regnum) Plantae

(không phân hạng) Angiospermae

(không phân hạng) Eudicots

(không phân hạng) Rosids

Bộ (ordo) Malvales

Họ (familia) Muntingiaceae

Chi (genus) Muntingia

Loài (species) Muntingia calabura L.

1.1.3. Đặc điểm chung của cây Muntingia calabura

Muntingia calabura là loài cây mọc phát triển nhanh chóng chiều cao có thể

đạt được từ 7,5 - 12 m, cùng với cành dang rộng xung quanh. Lá dài 5 – 12,5 cm

thuông dài nhọn ở cuối lá, mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt sau lá có nhiều lông tơ

nhỏ mịn. Hoa nhỏ mọc nơi lá, gắn vào các nhánh, hoa rộng 1,25 – 2 cm, hoa mau tàn

khoảng một ngày, thường rụng vào buổi chiều. Cây mọc nhiều trái nhỏ 1 – 1,25 cm,

5

quả Muntingia calabura có màu xanh, vàng và đỏ khi chín, bề mặt nhẵn bóng và

mỏng, quả chứa nhiều hạt nhỏ li ti có vị ngọt và mùi thơm đặc trưng (Morton, 1987).

Hình 1.1. Ảnh chụp cây Muntingia calabura (David H. Lorence)

Hình 1.2. Mô phỏng hình thái cây Muntingia calabura (J.S. Kerner)

6

Hình 1.3. Mô phỏng cấu tạo bầu nhụy, nhị và cánh hoa

1.1.4. Công dụng

Cây trứng cá được sử dụng trong nhiều mục đích khác nhau nhưng chủ yếu

được dùng nhiều trong thực phẩm và trong y học. Quả Muntingia calabura được ăn

trực tiếp khi vừa hái khỏi cây. Chúng cũng có thể được nấu chín trong bánh nướng

hoặc làm thành mứt quả. Lá cây có thể được ứng dụng làm trà hoặc làm tăng hương

vị của trà khi ngâm trong nước ấm (Zakaria và ctv, 2007).

1.1.5. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Muntingia calabura

1.1.5.1. Saponin

Saponin thuộc nhóm glycosides, dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi

khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần

glucid thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong

aceton, ether, hexan, hòa tan vào nước từ đó làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch

và tạo bọt. Phát hiện trong mẫu có saponin bằng thử nghiệm lắc tạo bọt.

Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi

lỏng), một số saponin có tác dụng chống viêm, một số có tác dụng kháng khuẩn,

kháng nấm, ức chế virus, kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt (Hoàng Sầm và Hứa

Văn Thao, 2012).

1.1.5.2. Flavonoid

Flavonoid là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc

của hoa, giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa. Bộ khung cơ bản gồm 2

vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, có độ tan không giống

7

nhau. Flavonoid glycosid, flavonoid sulfat không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu

cơ, tan được trong nước, cồn, aglycon flavonoid tan trong dung môi hữu cơ, không

tan trong nước. Flavonoid được phân loại dựa trên vị trí của gốc aryl đính vào.

Flavonoid được xác định bằng các thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm acid clohydric

và thử nghiệm Benidict.

Flavonoid có vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic

trong tế bào, ngăn cản 1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng…),

tham gia quá trình lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa.

Một số hợp chất Flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn có thể kể đến như

catechin. Chúng là một trong những hợp chất flavonoid có khả năng ức chế Vibrio

cholera, Streptococcus mutans, Shigella và một số vi sinh vật khác. Catechin hoạt

động bằng cách vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế enzyme

glucosyltransferase của Streptococcus mutans, cơ chế hoạt động là do khả năng tạo

phức không thuận nghịch với các amino acid ái nhân trong protein từ đó làm bất hoạt

chức năng gây bệnh của protein trong vi sinh vật. Galangin có hoạt tính chống lại vi

khuẩn Gram dương cũng như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV-1 và Coxsackie B

type I (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010).

1.1.5.3. Tannin

Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết

bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và

alkaloid), có vị chát, tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không

tan trong các dung môi hữu cơ, tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân,

kẽm, sắt). Có thể chia tannin làm hai loại tannin thủy phân được (Tannin pyrogalic)

và tannin không thủy phân được (Tannin pyrocatechic). Tannin thủy phân được thì

được thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo thành phần đường (glucose) và

phần không đường (các acid), nối với nhau theo dây nối este, tủa xanh đen với muối

sắt III, dễ tan trong nước, ví dụ: Ðại hoàng, Ðinh hương, lá cây Bạch đàn. Tannin

không thủy phân được thì dễ tạo thành chất phlobaphen không tan, thường là chất

8

trùng hợp từ catechin (hoặc từ leucoanthoxyanidin), (hoặc là những chất đồng trùng

hợp của hai loại), tủa xanh với muối sắt III, ví dụ: Vỏ Quế, Ô môi, Ðại hoàng. Tannin

thường được định tính bằng thử nghiệm Gelatin, thử nghiệm chì acetate, thử nghiệm

FeCl3, thử nghiệm KMnO4.

Tannin có vai trò bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc

trừ sâu, tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng, công dụng chữa

viêm ruột, tiêu chảy.

1.1.5.4. Terpen

Terpen là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon của terpen được

tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8, terpen có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài

họ thông. Terpen có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và các động vật nguyên

sinh (Nguyễn Tiến Thắng, 2011).

1.1.6. Cây trứng cá và các bài thuốc dân gian

Theo y học cổ truyền, lá cây trứng cá có thể được sử dụng như trà để điều trị

viêm, sưng và hạ sốt. Lá trứng cá cũng có thể giúp bảo vệ tim khỏi các cơn đau do có

chứa chất chống oxy hóa ngăn ngừa viêm động mạch dẫn đến nhồi máu cơ tim. Cây

trứng cá chứa một lượng lớn oxit nitric, một hóa chất tự nhiên giúp làm giãn mạch

máu, giúp máu lưu thông, hạ huyết áp. Quả trứng cá có chứa nhiều hợp chất kháng

khuẩn mạnh, biến nó trở thành nguồn chất kháng khuẩn mới nên nó đặc biệt tốt cho

điều trị nhiễm trùng tụ cầu khuẩn, Staphylococcus epidermidis, Proteus vulgaris,

Kocuria rhizophila, Corynebacterium diphtheriae và các vi khuẩn khác nên người

xưa thường dùng dịch chiết đắp lên các vết thương tránh nhiễm trùng (Nhật Linh,

2015). Đây là điều quan trọng vì hiện nay có rất nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh. Ở

Campuchia cũng như ở Việt Nam cụ thể là tỉnh Khánh Hòa, rễ cây được dùng phối

hợp với các vị thuốc khác làm thuốc điều kinh và trị các bệnh về gan. Qua nhiều thế

kỷ, nhiều quốc gia sử dụng quả trứng cá để ngăn chặn cơn đau liên quan với bệnh

gout, ăn 9-12 quả trứng cá ba lần một ngày có tác dụng tốt cho điều trị cơn đau. Quả

trứng cá có chứa một số lượng lớn vitamin C là một chất chống oxy hóa mạnh giúp

9

chống lại cảm lạnh và thậm chí cả bệnh tim mạch. Quả trứng cá còn giảm đáng kể

lượng đường trong máu nên thường được dùng làm thực phẩm lý tưởng cho các bệnh

nhân bị tiểu đường (Nguyễn Vy, 2015). Dịch chiết lá trứng cá làm trà giúp bảo vệ tim

khỏi các cơn đau tim vì lá có chứa chất chống oxy hóa ngăn ngừa viêm động mạch

dẫn đến nhồi máu cơ tim. Trà từ hoa trứng cá khử trùng tốt cho vết thương trên da và

cũng có tác dụng tốt trong điều trị đau bụng. Hoa Muntingia calabura được cho là có

hoạt tính kháng khuẩn. Nước chiết từ hoa Muntingia calabura có tác dụng giảm co

thắt, dịch chiết Muntingia calabura còn được dùng để giảm nhức đầu và các triệu

chứng đầu tiên của cảm lạnh (Nhật Linh, 2015).

1.1.7. Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Theo phương thuốc dân gian của người Peru, lá Muntingia calabura khi nấu

lên hoặc sắc thuốc có thể giảm loét dạ dày, giảm sưng tuyến tiền liệt hay giảm bớt

cơn đau đầu, các triệu chứng cảm lạnh (J.F Morton, 1987; Zakaria, 2007b). Bên cạnh

đó, dịch chiết lá cây còn có thể dùng như trà để uống (Zakaria, 2007e). Khoa học đã

và đang chứng minh dịch chiết lá cây Muntingia calabura có hoạt tính giảm đau,

kháng viêm và hạ sốt (Yusof, 2011; Sani, 2012; Zakaria, 2006a; 2007; 2007a; 2007f;

2008). Hơn nữa, lá Muntingia calabura có hoạt tính kháng oxi hóa (Siddiqua, 2010;

Zakaria, 2007b; 2011), 22 hợp chất được phân lập từ lá cây Muntingia calabura có

khả năng chống đông máu (Su et al, 2003). Ngoài ra, hoạt tính kháng khuẩn được

nghiên cứu từ dịch chiết methanol (Yasunaka, 2005) hay các dịch chiết nước,

chloroform (Zakaira, 2006b). Trong những nghiên cứu khác, dịch chiết lá Muntingia

calabura có hoạt tính chống loét dạ dày (Ibrahim et al, 2012; Balan et al, 2013), trị

tiểu đường (Sridhar et al, 2011) và bảo vệ tim mạch (Nivethetha et al, 2009). Dịch

chiết methanol cùng phân đoạn butanol có khả năng chống tăng huyết áp (Shih et al,

2006; 2009). Ngoài ra theo các báo cáo khoa học khác thì lá cây trứng cá còn có khả

năng kháng ung bướu (Parka và ctv, 2003), giảm đau nhức (Sulaiman và ctv, 2006),

kháng viêm và hạ sốt (Zakaria, 2007). Các khả năng giảm đau, kháng viêm và hạ sốt

được phát hiện khi sử dụng dịch chiết nước từ cây.

10

Dịch chiết methanol của quả từ cây Muntingia calabura có khả năng kháng

khuẩn đối với chủng Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và

Shigella flexneri (Sibi và ctv 2013).

Một số hợp chất được tìm thấy từ dịch chiết ethanol từ thân cây Muntingia

calabura bao gồm β-Sitosterol, 1,2,3-Benzenetriol, Stigmastan-3,5-diene và 4-

Isopropylthiouracil, dịch chiết ethanol từ thân cũng có hoạt tính kháng khuẩn đối với

Staphylococcus aureus, nấm Aspergillus niger và nấm Candida albicans

(Krishnaveni và ctv 2015).

Một số hợp chất mới được tìm thấy trong cây trứng cá bao gồm 2

dihydrochalcones là 2,3-dihydroxy-4,3’,4’,5’-tetramethoxydihydrochalcone và

4,2’,4’-trihydroxy-3’-methoxydihydrochalcone và 1 hợp chất thuộc nhóm flavanone

mới đó là (2R,3R)-(-)-3,5-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavanone (Chen và ctv 2007).

Phân đoạn ethanol từ là cây Muntingia calabura trong nghiên cứu của Su và ctv 2003

còn tìm thấy sự hiện diện của một số hợp chất chủ yếu thuộc 2 nhóm flavanone and

flavone bao gồm (2R,3R)-7-methoxy-3,5,8-trihydroxyflavanone, những hợp chất đã

biết như (2S)-5-hydroxy-7-methoxyflavanone, 2’,4’-dihydroxychalcone, 4,2’,4’-

trihydroxychalcone, 7-hydroxyisoflavone và 7,3’,4’-trimethoxyisoflavone. Cũng

được tìm thấy trong loài cây này. 3 chất thuộc nhóm flavon và 1 chalcone bao gồm

5,7-dihydroxy-3,8-dimethoxyflavone, 2’,4’-dihydroxychalcone, 5-hydroxy-3,7-

dimethoxyflavone và 3,5,7-trihydroxy-8-methoxyflavone được tìm thấy trong phân

đoạn ethanol (Adila và ctv 2013). Các hợp chất 5-hydroxy-3,7,8-trimethoxyflavone,

3,7-dimethoxy-5-hydroyflavone, 2’,4’-dihydroxy-3’-methoxychalcone, và

calaburone trong phân đoạn petroleum ether được cho là có khả năng ức chế quá trình

viêm tại nồng độ thử nghiệm là 50 mg/kg (Mohamad và ctv 2013).

Từ những số liệu được công bố trước đó có thể thấy rằng Muntingia calabura

đặc biệt là dịch chiết từ lá cây đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới và đã thu

được nhiều kết quả tốt liên quan đến hoạt tính sinh học nhất là từ dịch chiết lá nhưng

tại Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu về loài này.

11

1.2.Tổng quan về chất chống oxi hóa

1.2.1. Khái niệm chất chống oxi hóa

Có ảnh hưởng lên phản ứng dây chuyền củ a các gốc tự do. Có khả năng ta ̣o nên

các gốc tự do bền và kém hoa ̣t động hơn. Nhâ ̣n điện tử tự do của các gốc tự do hoa ̣t

động biến gốc tự do hoa ̣t động thành gốc tự do kém hoa ̣t động (Gunnell và ctv 2002).

1.2.2. Cơ chế chống oxi hóa của các hợp chất tự nhiên

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa trong tế bào có thể ngăn cản sự ta ̣o thành củ a các

gốc tự do hoa ̣t động và kết thúc phản ứng dây chuyền gốc tự do (dâ ̣p tắt gốc tự do).

Các chất chống oxy hóa là nhóm của các vitamin, chất vô cơ, enzyme và những chất

có nguồn gốc tự nhiên giúp bảo vệ tế bào khi các gốc tự do - những chất là căn

nguyên gây ra các tổn ha ̣i tế bào (Atta và ctv 2002).

1.2.3. Một số chất tự nhiên từ thực vật có khả năng chống oxi hóa

1.2.3.1. Vitamin E (α- tocoferol)

Chức vu ̣ thiên nhiên củ a vitamin E là bảo vệ cơ thể chống những tác du ̣ng

độc ha ̣i củ a những FR. Vitamin E gắn nơi màng lipid, và chính nhờ chức vu ̣ gắn gốc

phenol mà nó có tính chất có tính chống oxy hóa. Nó đươ ̣c xem là hàng phòng thủ

trước tiên chống la ̣i quá trình peroxyd hóa lipid.

12

1.2.3.2. Vitamin C (acid ascorbic)

Vitamin C hiện nay là một trong những chế phẩm bổ sung vitamin phổ biến

nhất, nó đóng một vai trò hết sức quan trọng trong mọi hoa ̣t động củ a cơ thể. Chức

năng củ a vitamin C là giúp cho cấu trúc collagen ổ n định, vitamin C cần thiết cho sự

lành vết thương, tăng sức đề kháng cho cơ thể. Vitamin C cũng là một chất chống

oxy hóa rất quan trọng. Vitamin C hoa ̣t động như một chất chống oxy hóa trong môi

trường nước củ a cơ thể – cả nội bào lẫn ngoa ̣i bào.

Các chất chống oxy hóa ngoại sinh có nhiều trong thực vật, điển hình là nhất

là các hợp chất polyphenol (phenolic acid, flavonoid: flavon, flavonol, isoflavon,

anthocyanin, catechin, proanthocyanidinn,... tanin và các nhóm hơ ̣p chất phenol

khác…).

1.3. Vi sinh vật chỉ thị

1.3.1. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Escherichia

1.3.1.1. Đặc điểm

Escherichia là một loài vi khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không

sinh bào tử. Nhiệt độ thích hợp 370C, pH 7.2-7.4. Sống chủ yếu hội sinh trong đường

ruột của người và động vật. Chúng được biết đến như là nguyên nhân chủ yếu gây

nhiễm trùng đường tiết niệu và các bệnh đường tiêu hóa. Đơn cử là Escherichia coli

(Trần Văn Cường, 2009).

Hình 1.5. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử

13

Escherichia phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy phổ thông. Môi

trường thạch thường: hình thành khuẩn lạc tròn ướt, lồi, bóng láng, màu trắng xám

hơi đục, đường kính 2-3mm. Môi trường MacConkey khuẩn lạc có màu hồng cánh

sen, tròn, lồi, không làm chuyển màu môi trường. Môi trường thạch máu khuẩn lạc

Escherichia to, bóng, lồi, màu xám nhạt. Một số chủng có khả năng gây hiện tượng

tan máu. Môi trường Simmon citrat khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. Môi

trường Endo khuẩn lạc màu đỏ. Môi trường EMB khuẩn lạc có ánh kim tím.

Hình 1.6. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB

Đặc điểm sinh hóa dòng Escherichia: do chúng có phản ứng lên men đường

nên dòng Escherichia cụ thể là E. coli lên men sinh hơi các loại đường lactose,

fructose, glucose, levulose, galactose, xylose, manitol; lên men không chắc chắn các

loại đường duncitol, saccarose và salixin. Ngoài ra chúng còn có một số phản ứng

sinh hoá khác như phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm

tính (Trần Văn Cường, 2009).

1.3.1.2. Khả năng gây bệnh

Escherichia sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, vertoxin, neurotoxin.

Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra (Trần Văn Cường, 2009).

1.3.2. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Listeria

1.3.2.1. Đặc điểm

14

Listeria là trực khuẩn Gram dương không có vỏ, không sinh bào tử, hiếu khí

tùy nghi. Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5 µm, chiều dài khoảng

1- 2 µm phát triển ở nhiệt độ 370C đến 400C (Võ Thành Hưng, 2013).

Hình 1.7. Hình thái Listeria monocytogenes trên kính hiển vi điện tử

Trên thạch thường vi khuẩn mọc tạo thành những khuẩn lạc nhỏ, tròn, xám

lơ, bóng không tạo bào tử.

Hình 1.8. Khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên môi trường thạch thường

1.3.2.1. Khả năng gây bệnh

Listeria monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào của cơ thể vật chủ thông qua

cơ chế thực bào. Nếu Listeria monocytogenes vẫn còn sống sau giai đoạn đầu xâm

15

nhiễm này, nó được cơ thể vật chủ tiếp nhận nhờ protein bề mặt được gọi là internalin,

đáng chú ý là internalin A (InlA), internalin B (InlB). inlA tương tác với E – Carherin

tạo điều kiện cho Listeria monocytogenes đi vào tế bào biểu mô, InlB nhận diện Clq

–R (hoặc Met) cho phép Listeria monocytogenes xâm nhập vào trong nhiều loại tế

bào của vật chủ như tế bào gan, nguyên sợi bào và các tế bào biểu mô.

Listeria monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dưới 1 tháng

tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mô cấy ghép và những bệnh nhân có hệ

miễn dịch kém (Võ Thành Hưng, 2013)

1.3.3. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Shigella

1.3.3.1. Đặc điểm

Shigella là trực khuẩn Gram âm, mảnh dài 1-3 micromet, rộng 0,5-0,6

micromet, không có tiên mao, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ, không

sinh bào tử, Shigella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện

hiếu khí, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích

hợp là 370C (Chang Tran, 2014).

Hình 1.9. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử

Trong môi trường lỏng Shigella làm đục đều môi trường. Trên môi trường

đặc SS (Salmonella- Shigella) sau 24h khuẩn lạc có đường kính khoảng 2mm, tròn

lồi, mặt nhẵn bờ đều (Chang Tran, 2014).

16

Hình 1.10. Khuẩn lạc Shigella trên môi trường Macconkey

Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella

dysenteriae không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có

Shigella sonnei lên men lactose nhưng chậm. Không sinh H2S, Urease âm tính, phản

ứng Indol thay đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng

citrat âm tính (Chang Tran, 2014).

1.3.3.2. Khả năng gây bệnh

Các shigella đều có độc ruột (enterotoxin) là ShET-1 và ShET-2 chúng làm

thay đổi sự vận chuyển điện giải ở các tế bào niêm mạc đại tràng, gây tăng tiết dịch.

Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính

kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại độc

tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae 01 và ETEC,

hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với

tế bào. Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người, đây là một bệnh truyền nhiễm có thể

gây thành các vụ dịch địa phương và thương tổn đặc hiệu khu trú ở ruột già, trên lâm

sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng như đau bụng quặn, đi ngoài

nhiều lần, phân có nhiều nhầy và thường có máu. Shigella gây bệnh bằng cơ chế xâm

nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và nhân lên với số lượng lớn trong tổ

chức ruột. Các Shigella đều có nội độc tố. Riêng trực khuẩn Shiga còn có thêm ngoại

độc tố bản chất là protein. Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc

17

tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản

ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của

Vibrio cholerae 01 và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn

Shiga là tác dụng độc đối với tế bào (Chang Tran, 2014).

1.3.4. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus

Staphylococcus là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường

kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành

cụm (tụ) trông giống như chùm nho. Staphylococcus chủ yếu phân thành 2 nhóm:

Staphylococcus có enzyme coagulase: Staphylococcus aureus, Staphylococcus

intermedius và Staphylococcus không có enzyme coagulase: Staphylococcus

epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus,

Staphylococcus capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis,

Staphylococcus warneri.

1.3.4.1. Đặc điểm

Staphylococcus thuộc loại vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên

các môi trường nuôi cấy thông thường. Staphylococcus có khả năng phát triển được

ở khoảng nhiệt độ dao động từ 100C tới 450C và môi trường có nồng độ muối cao tới

10% (Trần Quang Cảnh, 2012).

Hình 1.11. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử

18

Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau

24 giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với Staphylococcus aureus) hoặc có màu

trắng (đối với các loại Staphylococcus khác) (Trần Quang Cảnh, 2012).

Trên môi trường thạch máu Staphylococcus phát triển nhanh: Khuẩn lạc

Staphylococcus aureus dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có

màu vàng. Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, có màu trắng

và thường không gây tan máu, khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm,

có màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm

quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. aureus có thể không tạo các vòng sáng

quanh khuẩn lạc (Trần Quang Cảnh, 2012).

Hình 1.12. Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker bổ sung egg yolk

1.3.4.2. Khả năng gây bệnh

Gây bệnh nhờ yếu tố độc lực nội bào: Staphylococcus aureus còn sản xuất

nhiều yếu tố độc lực có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn. Vỏ polysaccharide:

một số chủng Staphylococcus có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với protein

A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Hầu hết các chủng

Staphylococcus aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A)

có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. Chính nhờ hiện tượng gắn

độc đáo này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn

dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa: chúng là các receptor cho

các đại thực bào. Quá trình gắn trên giúp Staphylococcus aureus tránh không bị thực

19

bào bởi đại thực bào. Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất

một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học

bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc (Trần

Quang Cảnh, 2012).

Gây bệnh nhờ yếu tố độc lực ngoại bào: Ngoài coagulase và yếu tố kết cụm

thì Staphylococcus còn sản xuất một số enzyme quan trọng góp phần tạo nên độc lực

mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này, cụ thể như hyaluronidase là một enzyme có khả

năng phá hủy mô liên kết của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong cơ thể.

Hemolysine và leukocidine: phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào bạch

cầu hạt cũng như đại thực bào. Exfoliatine: là các enzyme phá hủy lớp thượng bì.

Enzyme này gây tổn thương da tạo các bọng nước. Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell

do tụ cầu. Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) đóng vai trò quan trọng

trong ngộ độc thực phẩm. Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc là nguyên nhân gây

nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng. Hầu hết các chủng

Staphylococcus đều sản xuất được men penicillinase (beta- lactamase). Enzyme này

phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G,

Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng (Trần

Quang Cảnh, 2012).

1.4. Hợp chất kháng khuẩn từ thực vật

1.4.1. Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật

Chất kháng khuẩn thực vật là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có tác

dụng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn

thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ thường rất

nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010).

1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm

việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng

hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào,

20

gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin

của tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant

secondary metabolites) các hợp chất thứ cấp từ thực vật tác động tới màng tế bào,

khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó

ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv 2013).

Hình 1.13. Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm

Các hợp chất từ thực vật có tác động kháng khuẩn không chỉ là đối với vi

khuẩn Gram dương và Gram âm mà còn với cả nấm, trong đó các chủng Gram âm là

nhạy cảm dễ bị các hợp chất thực vật tác động lên nhất, có tới 5 hướng mà các hợp

chất thực vật có thể tác động tới các chủng Gram âm. Trường hợp điển hình là của

thymol, hợp chất này có tác động tới cả màng tế bào của tế bào chất bên ngoài và bên

trong bằng cách tích hợp vào nhóm đầu cực của lớp đôi lipid dẫn tới sự chênh lệch,

làm tăng tính bán thấm của màng tế bào và gây chết, tuy nhiên thymol cũng có thể

tham gia vào việc quy định các gen tham gia vào tổng hợp protein màng ngoài, ức

chế enzyme liên quan đến bảo vệ chống lại stress nhiệt, tổng hợp ATP, các con đường

trao đổi chất citric. Tiềm năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của PSMs có thể

21

bị ảnh hưởng và phụ thuộc bởi rất nhiều yếu tố như tính năng của tế bào đích (vi

khuẩn, nấm, Gram dương, Gram âm), điều kiện môi trường, khả năng hòa tan, nồng

độ, nhiệt độ, độ pH ảnh hưởng quan trọng tới tác động kháng khuẩn của PSMs cũng

như các hỗn hợp của chúng (Radulovíc và ctv, 2013).

Bảng 1.15. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật

Nhóm Phân nhóm Hợp chất Cơ chế Nghiên cứu

Phenolic Vòng phenol Catechol Làm mất chất (Phillipson và

đơn giản nền ctv 1987)

Epicatechin Phá vỡ màng (Toda và ctv

tế bào 1992)

Acid phenolic Acid cinnamic (Fernandez và

ctv 1996)

Quinon Hypericin Kết dính bề (Duke, 1985)

mặt tế bào, bất

hoạt enzyme

Flavonoid Chrysin Kết dính bề (Perrett và ctv

mặt tế bào 1995)

Flavonol Rối loạn vách Rojas và ctv

tế bào (1992)

Abyssinon bất hoạt (Taniguchi và

enzyme Kubo, 1993)

Flavonol Totarol Chưa được (Kubo và ctv

nghiên cứu 1993)

22

Tannin Ellagitannin Kết tụ protein (Schultz,

Kết dính bề 1988)

mặt tế bào (Scalbert

Làm mất chất 1991),

nền (Haslam,

Rối loạn vách 1996)

tế bào

Phá vỡ màng

tế bào

Terpenoid Capsaicin Phá vỡ màng (Cichewicz và

tế bào ctv 1996)

Alkaloid Berberin Chèn vào (Atta và

vách tế bào và Choudhary,

DNA 1995)

Lectin và Fabatin Tạo cầu nối (Zhang và

polypeptide disulfid Lewis, 1997)

Polyacetylen 8S-Heptadeca- Chưa được (Estevez và

2(Z),9(Z)- nghiên cứu ctv 1994)

diene-4,6-

diyne-1,8-diol

1.5. Giới thiệu về bệnh tiểu đường

1.5.1. Khái niệm

Tăng đường huyết là tình tra ̣ng có quá nhiều glucose trong máu do sự dư thừa

glucose ta ̣i các mô củ a cơ thể. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, có thể coi là tăng đường

huyết nếu mức đường trong máu cao hơn 1,26 g/l (lúc đói) hoặc hơn 2g/l (vào những

23

thời điểm khác trong ngày). Tình tra ̣ng này nếu nặng và kéo dài sẽ gây tổ n thương

cho các ma ̣ch máu và mô. (Lê Hoa, 2016)

Tăng đường huyết không gây ra triệu chứng cho đến khi giá trị đường huyết

cao có ý nghĩa - trên 200 mg / dL (mg / dL), hoặc 11 millimoles / lít (mmol / L). Các

triệu chứng củ a tăng đường huyết phát triển từ từ trong vòng vài ngày hoặc vài tuần.

Đường trong máu càng ở mức cao, càng có nhiều các triệu chứng trở thành nghiêm

trọng. Các triệu chứng thường lâm sàng là thường xuyên đi tiểu, mờ mắt, mệt mỏi,

nhức đầu. Nếu tăng đường huyết không đươ ̣c điều trị, nó có thể gây ra Xeton xây

dựng lên trong máu và nước tiểu, hơi thở có mùi trái cây, buồn nôn và ói mửa, đau

bu ̣ng, khó thở, khô miệng, lẫn lộn, hôn mê. Gây ra các bệnh tim ma ̣ch, thiệt ha ̣i thần

kinh (neuropathy), thâ ̣n hư (thâ ̣n) hoặc suy thâ ̣n, thiệt ha ̣i cho các ma ̣ch máu củ a võng

ma ̣c (bệnh lý võng ma ̣c tiểu đường), có khả năng dẫn đến mù lòa, đu ̣c ống kính mắt

(đu ̣c thủy tinh thể), các bệnh về nhiễm trùng, xương và các vấn đề chung như loãng

xương. Nếu lươ ̣ng đường trong máu tăng cao đủ cho một thời gian dài, nó có thể dẫn

đến hai điều kiện nghiêm trọng. (Lê Hoa, 2016)

1.5.2. Phân loại

Tiểu đường type I: Bệnh tiểu đường toan xê tôn (ketoacidosis). Bệnh tiểu

đường ketoacidosis phát triển khi có quá ít insulin trong cơ thể. Nếu không có đủ

insulin, đường (glucose) không thể nhâ ̣p vào các tế bào cho năng lươ ̣ng. Lươ ̣ng đường

trong máu tăng cấp độ, và cơ thể bắt đầu phá vỡ các chất béo cho năng lươ ̣ng. Điều

này tạo ra acid độc ha ̣i đươ ̣c biết đến như xeton. Dư thừa tích tu ̣ ketone trong máu và

cuối cùng "tràn qua" vào nước tiểu. Nếu không điều trị, ketoacidosis tiểu đường có

thể dẫn đến hôn mê và bệnh tiểu đường đe dọa tính ma ̣ng.

Tiểu đường type II: Hội chứng tăng thẩm thấu bệnh tiểu đường

(hyperosmolar). Tình tra ̣ng này xảy ra khi sản xuất ra insulin, nhưng nó không hoa ̣t

động đúng cách. Đường huyết có thể trở nên rất cao - lớn hơn 600 mg/dL (33

mmol/L). Bởi vì insulin hiện ta ̣i không làm việc đúng cách, cơ thể không thể sử du ̣ng

đường hoặc chất béo cho năng lươ ̣ng. Glucose trong nước tiểu, gây đi tiểu tăng lên.

24

Nếu không điều trị, bệnh tiểu đường hyperosmolar có thể dẫn đến hôn mê và mất

nước đe dọa tính ma ̣ng. Khẩn cấp chăm sóc y tế là cần thiết. Nguyên nhân là do trong

quá trình tiêu hóa, cơ thể phá vỡ carbohydrate từ thực phẩm, chẳng ha ̣n như ga ̣o, bánh mì và mì ống thành phân tử đường khác nhau. Một trong những phân tử đường

glucose, một nguồn năng lươ ̣ng chính cho cơ thể. Glucose đươ ̣c hấp thu ̣ trực tiếp vào

máu sau khi ăn, nhưng nó không thể nhâ ̣p vào các tế bào củ a hầu hết các mô mà

không cần sự giúp đỡ củ a insulin, một hormone tiết ra từ tuyến tu ̣y. (Gouni và Krone

2006).

Khi mức độ glucose trong máu tăng lên, nó truyền tín hiệu tuyến tu ̣y tiết

insulin. Insulin lần lươ ̣t mở ra các tế bào để glucose có thể nhâ ̣p và cung cấp nhiên

liệu tế bào cần phải hoa ̣t động đúng. Glucose thêm vào đươ ̣c lưu trữ trong gan và cơ

bắp dưới da ̣ng glycogen. Quá trình này làm giảm lươ ̣ng đường trong máu và ngăn

cản nó đa ̣t đến mức độ nguy hiểm cao. Khi lươ ̣ng đường trong máu trở về bình thường, thì sự tiết insulin từ tuyến tu ̣y giảm. Đối với người bị tiểu đường, các tác

du ̣ng củ a insulin trên cơ thể giảm sút đáng kể, vì tuyến tu ̣y không sản xuất đủ insulin

(tiểu đường type 1) hoặc do cơ thể giảm khả năng chịu ảnh hưởng củ a insulin hoặc không sản xuất đủ insulin để duy trì lươ ̣ng đường bình thường (bệnh tiểu đường tuýp 2). Kết quả là, đường có xu hướng tích tu ̣ trong máu và có thể đa ̣t đến mức độ nguy

hiểm cao (tăng đường huyết) nếu không đươ ̣c điều trị đúng cách. Insulin hoặc các

thuốc khác đươ ̣c sử du ̣ng để lươ ̣ng đường trong máu thấp hơn. (Gouni và Krone

2006).

1.5.3. Thuốc trị tiểu đường glibenclamide

1.5.3.1. Cơ chế

Thuốc hoạt động bằng cách gắn vào các thụ thể sulfonylurea 1 (SUR1) và

kích hoạt chúng, các tiểu đơn vị quản lý các kênh Kali nhạy cảm với ATP của tế bào

β trong tuyến tụy. Sự kích hoạt trên dẫn đến ức chế làm cho màng tế bào khử cực mở

kênh Canxi phụ thuộc vào điện thế. Điều này làm gia tăng canxi nội bào của tế bào β

và sau đó kích thích giải phóng insulin.

25

1.5.3.2. Dược lực học

Glibenclamid là một sulfonylure có tác dụng làm giảm nồng độ glucose trong

máu, do đó làm tăng tính nhạy cảm của tế bào β tuyến tụy với glucose nên làm tăng

giải phóng insulin. Tác dụng của thuốc phụ thuộc vào chức năng tiết của tế bào beta.

Glibenclamid có thể còn làm tăng mức insulin, do làm giảm nồng độ thanh thải của

insulin qua gan. Cơ chế tác dụng của glibenclamid trong điều trị đái tháo đường khá

phức tạp. Khi mới dùng cho người đái tháo đường không phụ thuộc insulin (type 2),

glibenclamid làm tăng giải phóng insulin ở tuyến tụy. Trong những tháng điều trị đầu

tiên, các sulfonylure làm tăng đáp ứng insulin. Khi lâu dài, nồng độ insulin trong máu

giảm xuống mức như trước khi điều trị, nhưng nồng độ glucose trong huyết tương

vẫn giữ mức thấp.

1.5.3.3. Dược động học

Glibenclamid được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa. Tuy nhiên thức ăn và tăng

glucose huyết có thể làm giảm hấp thu của glibenclamid (sự tăng glucose huyết ức

chế nhu động của dạ dày và ruột, do đó làm chậm hấp thu). Để sớm đạt nồng độ tối

ưu trong huyết tương, dùng glibenclamid có hiệu quả nhất là 30 phút trước khi ăn.

Điều này cũng đảm bảo tốt giải phóng insulin trong suốt bữa ăn.

Glibenclamid liên kết nhiều (90-99%) với protein huyết tương, đặc biệt là

albumin. Thể tích phân bố của glibenclamid khoảng 0,2 lít/kg. Thời gian tác dụng

của thuốc không có liên quan gì đến thời gian bán thải trong huyết tương. Thời gian

bán thải của Glibenclamid chỉ là 2-3 giờ, còn tác dụng ổn định đường huyết còn thấy

rõ từ 12 đến 24 giờ và thường có thể dùng thuốc một lần trong ngày.

Glibenclamid chuyển hóa hoàn toàn ở gan, chủ yếu theo đường hydroxyl hóa.

Các chất chuyển hóa cũng có tác dụng hạ glucose huyết vừa phải, tuy nhiên ở người

có chức năng thận bình thường thì tác dụng không quan trọng về mặt lâm sàng. Các

chất chuyển hóa thải từ trong nước tiểu và phân theo tỷ lệ 1:1.

1.6. Giới thiệu về bệnh tiêu chảy

26

1.6.1. Khái niệm

Theo Tổ chức Y tế Thế Giới (2009), tiêu chảy là 1 dạng bệnh lý xảy ra khi

một cơ thể đi ngoài có phân lỏng bất thường (phân lỏng, phân tóe nước, phân có nhầy

máu,…) từ 3 lần trở lên trong vòng 24 giờ.

Phân được chia thành 7 dạng, trong đó dạng 1 – 2 thể hiện sự táo bón, dạng

3 – 4 là dạng bình thường, dạng 5 – 7 được xem là dấu hiệu của bệnh tiêu chảy và

tiêu chảy cấp (Heaton, 1997).

Hình 1.14. Cơ sở đánh giá các loại phân (Thompson, 2006)

1.6.2.Nguyên nhân gây bệnh

1.6.2.1. Do virus

Rotavirus là nguyên nhân chính gây tiêu chảy nặng nề và đe dọa tính mạng

cho trẻ em, Rotavirus gây tiêu chảy ở khoảng 40% trẻ em dưới 5 tuổi phải nhập viện

trên phạm vi toàn cầu theo Tổ chức Y tế Thế Giới (2009). Rotavirus tấn công nhanh

vào hê ̣ tiêu hó a, phá hủy tế bào ở thành ruột non gây viêm dạ dày ruột, tiêu chảy, nôn

27

ói dẫn đến mất nướ c nhanh chóng và có thể tử vong nếu không được bù nước kịp

thời. Ngoài ra, các loại virus khác có thể gây tiêu chảy như: Adenovirus, Enterovirus,

Norovirus,... (Lê Anh, 2012).

1.6.2.2. Do vi khuẩn

Đây là nguyên nhân thường gặp nhất. Nguyên nhân này là do mất cân bằng

giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại trong đường ruột. Các vi khuẩn có hại xâm

nhập vào đường ruột, nếu mạnh hơn vi khuẩn có lợi chúng sẽ lấn át các vi khuẩn có

lợi và tiết ra độc tố gây tiêu chảy.

1.6.2.3. Do ký sinh trùng

Entamoeba histolytica (Amip): Xâm nhập vào liên bào đại tràng hoặc hồi

tràng khi ở thể hoạt động, tạo các ổ apxe nhỏ, loét và biểu hiện hội chứng lỵ (Trần

Anh Văn, 2011). Giardia lamblia: Là ký sinh trùng đơn bào, Giardia lamblia bám

dính lên liên bào ruột non làm teo các nhung mao ruột dẫn đến giảm hấp thu và gây

tiêu chảy (Trần Anh Văn, 2011). Cryptosporidium: Xâm nhập vào ruột cư trú ở biểu

mô, nhân lên và tạo ra các nang đào thải qua phân ra ngoài. Cryptosporidium gây đau

bụng, buồn nôn và gây tiêu chảy kéo dài ở người đang bị suy giảm miễn dịch (Bùi

Quỳnh Nga, 2011).

1.6.2.4. Do các nguyên nhân khác

Thuốc: Nhiều loại thuốc có thể gây ra tiêu chảy. Phổ biến nhất là thuốc kháng

sinh. Thuốc kháng sinh tiêu diệt cả vi khuẩn tốt và xấu, có thể làm rối loạn sự cân

bằng tự nhiên của vi khuẩn trong đường ruột dẫn đến tiêu chảy. Ngoài ra, còn có

những loại thuốc như thuốc chống cao huyết áp, thuốc nhuận tràng, thuốc Antacids

chứa magnesium cũng dễ gây tiêu chảy (Hà Hiền, 2014). Fructose: Đây là một loại

đường tự nhiên được tìm thấy trong trái cây, mật ong và làm chất tạo ngọt ở một số

đồ uống. Fructose có thể gây tiêu chảy ở những người gặp vấn đề trong việc tiêu hóa

chúng (Hà Hiền, 2014). Không dung nạp lactose: Lactose là một loại đường được tìm

thấy trong sữa và các sản phẩm sữa khác. Nhiều người gặp khó khăn trong tiêu hóa

lactose vì không có enzyme để phân giải lactose trong sản phẩm. Vì thế, cơ thể không

28

thể dung nạp lactose và gây ra hiện tượng tiêu chảy (Nguyễn Thị Yến, 2011). Ngoài

ra còn các nguyên nhân như: Chất ngọt nhân tạo, các rối loạn tiêu hóa hay phẫu

thuật,…

1.6.3. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy

1.6.3.1. Tiêu chảy do thẩm thấu

Tiêu chảy thẩm thấu xảy ra khi trong ruột xuất hiện nhiều lượng chất tan có

hoạt tính thẩm thấu nhưng lại hấp thu kém. Lượng chất tan này tạo áp lực thẩm thấu

đến màng nhầy trong ruột làm nước bị hút vào lòng ruột, khiến cho Na và Cl cũng bị

kéo theo vào lòng ruột. Nước mất nhiều hơn Na nên có khuynh hướng làm tăng Na

trong máu và độ thẩm thấu của dịch phân cao hơn độ thẩm thấu của các điện giải

trong phân (Đỗ Minh Quang, 2012).

1.6.3.2. Tiêu chảy do xuất tiết

Tiêu chảy xảy ra do sự bài tiết nước và điện giải bất thường vào lòng ruột.

Sau khi qua dạ dày, vi khuẩn cư trú ở phần dưới hồi tràng và sản sinh ra độc tố ruột,

đơn vị B của độc tố gắn vào bộ phận tiếp nhận đặc hiệu của tế bào giải phóng ra đơn

vị A của độc tố. Đơn vị này đi vào tế bào ruột hoạt hoá adenylcyclase làm ATP trở

thành AMP vòng. Sự tăng AMP vòng trong tế bào làm ức chế hoặc ngăn cản sự hấp

thu Na ở ruột, nhưng không ức chế đối với cơ chế hấp thu Na gắn với glucose và các

chất vận chuyển trung gian khác, làm tăng sự bài tiết ở các tế bào hẽm tuyến vào

trong lòng ruột do làm tăng tính thấm của màng tế bào phía lòng ruột (Đỗ Minh

Quang, 2012).

1.6.3.3. Tiêu chảy do tăng nhu động ruột

Để các chất dinh dưỡng và nước được hấp thu hiệu quả thì dịch ruột phải

được tiếp xúc với tất cả các biểu mô niêm mạc và giữ lại đủ lâu để có thể hấp thụ.

Nhưng khi có sự rối loạn về nhu động ruột sẽ làm đẩy nhanh thời gian di chuyển ở

ruột. Nhu động ruột tăng lên khiến cho thời gian giữ thức ăn trong ruột bị giảm sút,

29

làm giảm thời gian tiếp xúc giữa tế bào niêm mạc và dịch ruột, dẫn đến tiêu chảy

(Bowen, 2006).

1.6.3.4. Tiêu chảy do tổn thương niêm mạc ruột

Khi các tác nhân gây tiêu chảy xâm nhập vào đường tiêu hoá sẽ sản sinh ra

các độc tố ruột (enterotoxin) kích thích tiết các chất điện giải, tấn công trực tiếp và

phá huỷ các tế bào biểu mô niêm mạc ruột gây viêm tại ruột và toàn thân. Do tế bào

niêm mạc bị tổn thương nên làm giảm sự hấp thu các chất và gia tăng sự bài tiết ion

do tăng số lượng tế bào hẻm tuyến từ đó dẫn đến tiêu chảy (Low-Beer và Read, 1971).

1.6.4. Cơ chế gây tiêu chảy bằng tác nhân castor oil

Castor oil còn được gọi là Oleum palmae christi được chiết xuất bằng cách

ép lạnh từ hạt thầu dầu (Ricinus communis) và có tác dụng chữa bệnh trong nhiều thế

kỷ (Gaginella và ctv, 1975). Castor oil là triglyceride chứa hàm lượng cao acid béo

không bão hòa ricinoleic acid [(9Z, 12R)-12-hydroxyoctadec-9-enoic acid] theo

Saalmüller L. (1848). Sau khi uống castor oil, ricinoleic acid sẽ được phân giải nhờ

enzyme lipase, một lượng lớn ricinoleic acid được hấp thụ vào ruột (Meyer H., 1890).

Năm 2012, Tunaru S. và ctv đã chứng minh ricinoleic acid là chất đầu tiên được cơ

thể hấp thụ qua niêm mạc ruột giúp hoạt hóa thụ thể prostaglandin E receptor 3 (EP3)

ở trên tế bào cơ của ruột và dạ con, gây co thắt cơ trơn của ruột, làm tăng nhu động

ruột và giúp nhuận tràng.

1.6.5. Thuốc trị tiêu chảy loperamide

1.6.5.1. Dược lực

Loperamid là dược phẩm chứa hoạt chất gắn kết với thụ thể opiat tại thành

ruột, làm giảm tính kích ứng niêm mạc và kích thích gây co thắt ống tiêu hóa. Làm

giảm nhu động ruột đẩy tới, kéo dài thời gian lưu thông trong lòng ruột. Loperamid

làm tăng cường lực cơ thắt hậu môn vì vậy làm giảm bớt sự gấp gáp trong phản xạ

đại tiện không kìm chế. Do thuốc có ái lực cao với ruột và chuyển hóa chủ yếu khi

qua gan lần đầu nên khó đến hệ thống tuần hoàn. Loperamid ức chế nhu động ruột do

30

ảnh hưởng ngoại biên trực tiếp của nó lên thành ruột. Nghiên cứu ở động vật cho thấy

rằng hiệu ứng ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương chỉ xuất hiện khi sử dụng thuốc

ở liều vượt quá liều sử dụng cho con người. Vì vậy, có thể sử dụng loperamid một

cách hợp lý để điều trị triệu chứng tiêu chảy cấp và mãn tính, làm tăng thời gian lưu

thông và hấp thu ở những bệnh nhân sau phẫu thuật mở thông hồi tràng.

1.6.5.2. Dược động học :

Loperamid dễ dàng hấp thu từ ruột (khoảng 40% liều của loperamid được

hấp thu từ ruột) nhưng phần lớn được lọc và chuyển hoá bởi gan thành dạng không

hoạt tính (trên 50%) và được bài tiết qua phân và nước tiểu cả dưới dạng không đổi

và chuyển hoá (30 40%). Nồng độ thuốc tiết qua sữa rất thấp. Liên kết với protein

huyết tương khoảng 97%. Thời gian bán hủy của loperamid ở người trong khoảng

9 14 giờ. Thải trừ chủ yếu qua phân.

1.7. Giới thiệu các bệnh về gan và acetaminophen

1.7.1. Các bệnh về gan

Gan có nhiệm vu ̣ chuyên thải lọc các độc tố trong cơ thể. Nó cũng hỗ trơ ̣ hoa ̣t

động củ a túi mâ ̣t. Ngoài ra, trong gan còn chứa các tế bào có khả năng miễn dịch,

chống la ̣i những vi khuẩn xâm nhâ ̣p có ha ̣i.

1.7.2. Các loại enzyme của gan

Bước đầu tiên để xác định gan có bị tổ n thương hay không là xét nghiệm máu

để tìm sự hiện diện củ a một số loa ̣i men gan. Bình thường các enzyme này nằm trong các tế bào gan, nhưng do gan bị tổ n thương bởi một nguyên nhân nào đó, chúng sẽ

tràn vào máu. Những loa ̣i enzyme có trong gan: Aminotransferase là một trong những

enzyme nha ̣y cảm và gặp nhiều nhất trong số các enzyme củ a gan. Aminotransferase

bao gồm aspartate aminotransferase (AST hoặc SGOT) và alanine aminotransferase

(ALT hoặc SGPT). Những enzyme này bình thường nằm trong tế bào gan. Khi gan bị tổ n thương, các tế bào gan bị đổ tràn các enzyme này vào máu làm tăng nồng độ

enzyme này trong máu và báo động cho ta biết gan bị tổ n thương. Ngoài AST và ALT

31

còn có những enzyme khác bao gồm alkaline photsphatase, 5-nucleotidase (5- prime

nucleotidase), lactase dehydrogenase (LDH), và gama – glutamyl transpeptidase

(GGT) thường đươ ̣c khảo sát trong những bệnh gan.

Nguyên nhân gây tăng men gan: Có rất nhiều nguyên nhân gây tăng men gan

nhưng thường gặp là: Viêm gan do virus A, B , C, D. Trong trường hơ ̣p viêm gan cấp

tính thì hai loa ̣i men gan ALT, AST tăng rất cao trên tám lần so với chỉ số bình thường. Trong trường hơ ̣p viêm gan mãn tính thì ALT, AST chỉ tăng nhẹ khoảng hai lần so với chỉ số bình thường nhưng sự gia tăng này kéo dài trên sáu tháng. Viêm gan do thuốc: tiền sử du ̣ng các loa ̣i thuốc như Ethanol, rifamicin, tetracycline, sulfonamide,

isoniazid, aminodarone (Cordarone), phenytoin (Dilatin), hydralazine (Apresoline)…

có thể kèm theo các biểu hiện khác như ngứa, nổ i mề đay, sốt. Men gan có thể tăng

đến 3000 U /L trong viêm gan do thuốc. Viêm gan do rươ ̣u thì AST cao từ 2-10 lần giới ha ̣n bình thường và ALT chỉ ở mức bình thường hoặc tăng nhẹ. Do gan bị nhiễm độc: như chì, photpho, thuốc mê, tetraclorua carbon… nặng sẽ gây hoa ̣i tử nhu mô gan, nếu nhẹ thì gan còn có thể phu ̣c hồi trở la ̣i đươ ̣c. Thiếu α-1-antitrypsine: Là một rối loa ̣n di truyền do thiếu một loa ̣i glycoprotein (phức hơ ̣p carbonhydrate-protein)

có tên là α-1-antitrypsin dẫn đến bệnh phổ i mãn tính và bệnh gan. (MedicineNet)

1.7.3. Cơ chế gây độc gan của acetaminophen

Quy trình chuyển hóa một số loại thuốc ở gan đặc biêt là acetaminophen xảy

ra trên 2 pha:

Pha 1: xảy ra các phản ứng sinh hóa như phản ứng khử, phản ứng thủy phân

nhưng chủ yếu là phản ứng oxy hóa do enzyme gan Cytochrome P450 xúc tác, thuốc

bị ion hóa do các phân tử thuốc bị mất điện tử.

Pha 2: xảy ra các phản ứng kết hợp giữa thuốc với các nhóm ion hóa như:

acid glucuronic, glutathione, glycin, gốc methyl, acetyl… tại tế bào chất của tế bào

gan, kết quả tạo ra chất chuyển hóa dễ hòa tan trong nước.

Trong quá trình chuyển hóa thuốc ở pha 1, có một số loại thuốc sẽ bị chuyển

hóa thành chất độc với tế bào. Nếu như lượng thuốc nạp vào cơ thể lớn, gan không

32

đủ để khử độc chất chuyển hóa và sự tích tụ của chất chuyển hóa có độc tính này sẽ

ảnh hưởng đến tế bào gan, gây viêm gan (Nguyễn Văn Mùi, 2011).

Hình 1.15. Sơ đồ chuyển hóa acetaminophen trong cơ thể

Hầu hết Acetaminophen chuyển hoá ta ̣i gan (90%), gắn kết với Sulfate và

Glucuronide, rồi thải ra nước tiểu. Phần còn la ̣i: một nửa (5%) thải ra nước tiểu dưới

da ̣ng nguyên vẹn, một nửa đươ ̣c oxy hoá thành N-acetyl-p-benzoquinone imine

(NAPQI) qua cytochrome P450 ở gan (CYP2E1, CYP1A2, CYP3A4). NAPQI là

chất độc cho tế bào gan (hình 1.8).

NAPQI gắn đồng hoá trị với phân tử tế bào gan gây tổ n thương do oxy hoá

(oxidative injury), và hoa ̣i tử tế bào gan trung tâm thuỳ. Mặc dù không đặc trưng lắm,

nhưng sự tổ n thương ở ty thể và sự peroxy hoá lipid có vai trò trong quá trình tổ n thương tế bào gan. Thêm vào đó, sự phóng thích những cytokines và những chất oxy

phản ứng từ tổ n thương tế bào gan có vai trò trong tổ n thương tế bào gan lan rộng.

Cytokines phóng thích từ tế bào gan có thể khởi phát đáp ứng viêm thứ phát từ tế bào

Kupffer và những tế bào viêm khác, làm lan rộng tổ n thương tế bào gan. (Dong và

ctv 2000).

33

1.7.4. Thuốc giải độc gan Silymarin

1.7.4.1. Cơ chế

Silymarin bao gồm 4 đồng phân flavonolignan - silybin, isosilybin, silydianin

và silychristin, trong số chúng thì silybin có hoạt tính tốt nhất và thường được dùng

phổ biến nhất, được hấp thụ bằng đường miệng và thải ra thông qua sulphates và các

gốc liên hợp, (Pradhan và ctv, 2006). Silymarin làm tăng chỉ số glutathion ở gan giúp

chúng gắn với những độc tố và đẩy chúng ra khỏi cơ thể, ngoài ra silymarin còn tạo

ra một lớp bảo vệ chống oxi hóa góp phần bảo vệ gan tốt hơn, silymarin còn giúp

tăng cường tổng hợp protein ở gan bằng cách kích thích hoạt tính của RNA

polymerase I (Nancy và ctv 2014).

1.7.4.2. Công dụng

Silymarin bảo vệ tế bào gan, tăng cường chức năng gan và kích thích sự phát

triển củ a các tế bào gan mới để thay thế các tế bào gan cũ bị tổ n thương, kích thích

phu ̣c hồi các tế bào gan đã bị hủ y hoa ̣i cũng như có tác du ̣ng chống peroxyde hóa

lipid, chống viêm, từ đó cải thiện các dấu hiệu cũng như triệu chứng bệnh gan, làm

giảm nồng độ các enzyme gan trong máu.

Silymarin hỗ trơ ̣ điều trị một số bệnh liên quan đến gan như: Hỗ trơ ̣ điều trị

viêm gan cấp và ma ̣n tính, suy gan, gan nhiễm mỡ. Bảo vệ tế bào gan và phu ̣c hồi

chức năng gan cho những người uống rươ ̣u, bia, bị ngộ độc thực phẩm, hóa chất.

Những người đang sử du ̣ng các thuốc có ha ̣i tới tế bào gan như thuốc điều trị bệnh

lao, ung thư, đái tháo đường, các thuốc tác động lên thần kinh, thuốc chống viêm

steroid. Những người có rối loa ̣n chức năng gan với biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, ăn

khó tiêu, vàng da, dị ứng, bí tiểu tiện, táo bón. Phòng và hỗ trơ ̣ điều trị xơ gan, ung

thư gan.

34

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Thời gian và địa điểm

2.1.1. Thời gian

Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2016 đến 06/2017.

2.1.2. Địa điểm

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực

phẩm – Môi trường, trường đại học Công Nghệ TP. HCM.

2.2. Đối tượng nghiên cứu

2.2.1. Nguyên liệu thực vật

Mẫu lá cây Muntingia calabura được thu hái ở TP.HCM.

2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị

Các chủng vi sinh vật gây bệnh sử dụng bao gồm: Escherichia coli, E.coli-

ETEC, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Salmonella typhi, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus, Shigella boydii và Shigella flexneri được cung

cấp bởi Viện vệ sinh y tế công cộng, trường đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM.

2.2.3. Đối tượng động vật

Chuột bạch 6 – 8 tuần tuổi có cân nặng từ 25 – 30 g được mua từ viện Pasteur.

2.2.4. Hóa chất, dụng cự và thiết bị

2.2.4.1. Hóa chất

Folin-Ciocalteu (Darmstadt, Germany), DPPH (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl) và ascorbic acid từ MP Biomedicals (Illkirch, France), gallic acid,

rutin từ Riedel-de-Haen (Seelze, Germany) aluminum chloride, sodium carbonate,

iron(III) chloride từ BDH Labs (Cambridge, England), TSB (Tryptone casein soy

broth), TSA (Tryptone casein soy agar) từ New Delhi (India), Dimethyl sulfoxyde

35

(Xilong – China), Castor oil (India), GPT (ALAT) IFF mod.liquiUV và GOT (ASAT)

IFF mod.liquiUV (Human – Germany).

2.2.4.2. Dụng cụ

Micropipet (100-1000 μl), (10-100 μl), erlen (250 ml), (500 ml), que cấy

trang, que cấy vòng, đĩa petri, ống nghiệm, bình môi trường 250 ml, 500 ml, efpendoff

(2 ml), becher (100ml), (250 ml), (500 ml), các loại dụng cụ khác như: Đầu típ các

loại, đũa thủy tinh, đèn cồn, dao, kéo, thước đo, bao chịu nhiệt, bông thấm và bông

không thấm nước, thun, muỗng, …

2.2.4.3. Thiết bị

Cân phân tích (Orbital - Gemany), bếp từ (Billy - England), máy ly tâm

(Tuttligen - Germany), tủ ấm (Memmert - Gemany), Autoclave (Huxky - Taiwan),

máy cô quay chân không (Hahn shin - Korea), máy tạo nước cất (Branstead - USA),

máy lắc (IKA - Germany). Máy đo động học enzyme U-3900 (Hitachi – Nhật Bản).

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Thu hái và xử lý mẫu

Mẫu lá cây Muntingia calabura được lấy ở TP.HCM vào giữa tháng 4 và

tháng 5. Mẫu sau khi được thu nhận được loại bỏ bụi bẩn tạp chất, sấy ở nhiệt độ

không quá 700C, xay và sàng bằng rây với kích thước 1,0 mm. Mẫu bột cây được bảo

quản nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời. 50 g mẫu cây được ngâm trong dung môi

ethanol 70%, ethanol 90% và nước. Sau 48 giờ, các dịch chiết ethanol được lọc thu

dịch. Đối với dịch chiết nước là 24 giờ. Các cắn chiết ethanol có được bằng cách sử

dụng máy cô quay chân không tại 400C, riêng cắn chiết từ nước được thu bằng cách

cô cách thủy ở nhiệt độ không quá 700C. Dịch chiết thô ethanol 70 (EMC70), ethanol

90 (EMC90) và dịch chiết nước (AMC) được chuẩn bị bằng cách hòa cắn chiết mỗi

loại trong DMSO 1%.

2.3.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn dược liệu

2.3.2.1. Vi học kiểm nghiệm

36

a) Vi phẫu

Cắt mẫu bằng tay với dao lam. Dao lam mới, khi cắt đặt dao lam thẳng góc

với mẫu vật. Cắt ở khoảng 1/3 phía dưới nhưng không sát đáy phiến lá. Bỏ bớt phần

thịt lá 2 bên, còn lại bề rộng 0,6 - 0,8cm. Độ dày lát cắt khoảng < 1 mm. Chọn các lát

cắt thật mỏng để nhuộm.

b) Soi bột

Lá cây Muntingia calabura cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ khoảng 600C, tán nhỏ,

nghiền nát hoặc dùng máy xay. Rây qua rây số 32. Phần còn lại trên rây được tán

hoặc xay và rây tiếp (có thể sấy lại cho dễ xay tán, nếu cần) cho đến khi tất cả dược

liệu trở thành bột mịn. Bột lá sau khi xay thường có màu xanh lục hoặc xanh nâu. Các

cấu tử thường thấy là: biểu bì mang khí khổng, lông che chở, lông tiết, tinh thể calci

oxalat, các mạch gỗ v.v…

• Làm tiêu bản bột

Cho 1 giọt nước cất vào giữa lame kính, lấy một ít bột cho vào giữa chất lỏng.

Đậy lamette lại, dùng ngón trỏ di nhẹ trên lá kính để các phần tử phân tán đều. Loại

bỏ phần bột và nước cất thừa bằng giấy thấm rồi quan sát bằng kính hiển vi. Nếu

không nhìn thấy rõ vân tễ có thể bổ sung thêm 1 giọt dung dịch KOH 5% để quan sát

rõ hơn.

2.3.2.2. Độ tinh khiết dược liệu

a) Xác định độ ẩm

Độ ẩm của dược liệu được thực hiện bằng phương pháp Xác định khối lượng

mất do làm khô. Sấy trong tủ sấy ở áp suất thường theo DĐVN IV. Phụ lục 9.6 (Trang

PL-182).

Cách thực hiện: Sấy cốc cân ở nhiệt độ 125-1300C trong 1h. Cho cốc vào

bình hút ẩm 30 phút. Dùng cân phân tích có độ chính xác 0,001g cân khối lượng của

cốc. Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào cốc cân (đã biết trước khối lượng). Đặt

37

vào tủ sấy ở nhiệt độ 125-1300C trong 1 giờ và cân khối lượng. Làm tương tự như

vậy cho đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5 mg.

Tính toán kết quả

Độ ẩm được tính bằng phần trăm theo công thức:

𝑊 = ∗ 100% 𝑚𝑏𝑑 − 𝑚𝑠𝑎𝑦 𝑚𝑏𝑑

Trong đó:

W: độ ẩm của dược liệu (%)

mbd: Khối lượng ban đầu (g)

msay: Khối lượng sấy (g)

b) Xác định tro toàn phần

Xác định tro toàn phần dựa theo phụ lục 9.8 (trang PL-183)

Cách thực hiện: Cho 2g đến 3g bột mẫu thử vào một chén sứ hoặc chén platin

đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 4500C tới khi không còn carbon, làm

nguội rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước

nóng cho vào khối chất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc

không tro. Rửa đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy

lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng.

Tập trung dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt

độ không quá 4500C đến khi khối lượng không đổi.

Tính toán kết quả

Tro toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt theo công thức sau:

𝑋 = (𝑎 − 𝑏) ∗ 100 𝑐 − (𝑐 ∗ 𝑊)

Trong đó:

X: Tỷ lệ tro toàn phần. tính ra phần trăm

a: Khối lượng chén có tro

38

b: Khối lượng chén không

c: Khối lượng dược liệu dùng

W: độ ẩm dược liệu, tính ra phần trăm

c) Tro tan trong nước

Đun sôi tro toàn phần theo phụ lục 9.8 (Trang PL-183) với 25 ml nước trong

5 phút. Tập trung những chất không tan vào một phễu thủy tinh xốp, hoặc vào trong

một chén lọc thủy tinh xốp, hoặc trên một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi

nung 15 phút ở nhiệt độ không quá 4500C. Để nguội rồi cân để xác định khối lượng

cắn không tan trong nước. Lấy khối lượng tro toàn phần trừ đi khối lượng cắn không

tan trong nước, được khối lượng tro tan trong nước. Tính tỷ lệ phần trăm tro tan trong

nước so với dược liệu đã làm khô trong không khí.

d) Tro không tan trong acid

Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M (TT) vào tro toàn phần, đun sôi 5

phút, lọc để tập trung nhũng chất không tan vào một phễu thủy tinh xốp đã cân bì,

hoặc vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 5000C đến khối

lưọng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu

đã làm khô trong không khí.

2.3.3. Phương pháp xác định thành phần hóa học

Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp của Yadav

và ctv (2013) nhằm định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ cây

Muntingia calabura bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa

học của chúng bao gồm các thử nghiệm:

Định tính thành phần alkaloid bằng phản ứng với các loại thuốc thử Mayer,

Dragendroff , Hager và Wagner.

Định tính thành phần saponin bằng phản ứng tạo bọt.

Định tính thành phần anthraquinone glycosides bằng phản ứng Bontrager.

39

Định tính thành phần flavonoid bằng phản ứng alkaline, phản ứng Shinoda,

phản ứng ferric chloride.

Định tính thành phần phenolic bằng phản ứng với chì acetate và phản ứng

với gelatin.

Định tính thành phần tannin bằng phản ứng với chì acetate và phản ứng với

ferric chloride.

Định tính thành phần steroids bằng phản ứng Salkowski và phản ứng

Libermann – Burchard.

Định tính thành phần amino acid bằng phản ứng với thước thử Ninhydrin.

2.3.4. Hàm lượng flavonoid tổng số

Hàm lượng flavonoid được xác định theo phương pháp của Woisky and

Salatino (1998), sử dụng rutin là chất chuẩn. So màu ở bước sóng λ = 420 nm.

2.3.5. Hàm lượng phenolic tổng số

Hàm lượng phenolic được xác định bởi phương pháp Folin-Ciocalteu

(Singleton, Rossi, 1965), sử dụng acid gallic là chất chuẩn. So màu ở bước sóng λ =

765 nm.

2.3.6. Hàm lượng tannin tổng số

Hàm lượng tannin được xác định theo phương pháp của Sun và ctv (1998),

sử dụng catechin là chất chuẩn. So màu ở bước sóng λ = 500 nm.

2.3.7. Phương pháp FRAP

Phương pháp FRAP đươ ̣c thực hiện đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng

lực khử trong huyết tương (Chun và ctv, 2002), nhưng cũng đươ ̣c sử du ̣ng để phân

tích các chất chống oxy hóa trong thực vâ ̣t. Phương pháp này dựa vào sự khử phức

Fe (III) – TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine) thành phức Fe (II) –TPTZ bền hơn bằng

một chất khử (chất chống oxi hóa) ở pH thấp. Fe (II) –TPTZ có màu xanh dương đậm

40

và có thể đo mật độ quang ở bước sóng  max = 593nm. Tác động chống oxy hóa

đươ ̣c đánh giá bởi sự tăng cường độ màu củ a phức Fe (II) –TPTZ.

2.3.8. Khả năng chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH của cây Muntingia calabura

được xác định dựa theo mô tả của Nur Alam (2012). Khả năng chống oxy hóa được

xác định dựa trên nồng độ IC50 mà tại đó có khả năng ức chế 50% gốc tự do. Khả

năng quét được đo bằng máy T70 UV-visible spectrometer ở bước sóng λ=517 nm.

AC - AS AC

Hoạt tính quét gốc tự do (%) = x 100%

Ac và As tương ứng là mẫu đối chứng (DPPH trong methanol) và các mẫu

thí nghiệm acid ascorbic đã được sử dụng như đối chứng dương. Các thử nghiệm

được tiến hành trong ba lần lặp.

2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử

Năng lực khử của dịch chiết cây trứng cá được xác định theo phương pháp

của Mayakrishnan và ctv (2013). Chất kháng oxy hóa có khả năng khử ion Fe3+ trong

phân tử [Fe(CN)6]3- thành Fe2+ trong K4[Fe(CN)6]3, kết quả thu được là phức màu

xanh ngọc bích có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 700nm.

2.3.10. Hoạt tính kháng khuẩn

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết dựa trên phương

pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Aibinu và ctv (2007), các hợp chất kháng khuẩn

có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ

thị. Nếu các hợp chất trong cây có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng

kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.

2.3.11. Xác định độc tính cấp diễn

Thử nghiệm xác định độc tính cấp diễn theo phương pháp của Bộ Y tế Việt

Nam ban hành. Dịch chiết được pha ở nồng độ cao nhất có thể pha loãng nhằm khảo

sát độc tính cấp diễn.

41

2.3.12. Mô hình chuột tiểu đường cấp tính

Tiến hành theo phương pháp củ a Joy và Kuttan (1999) và đươ ̣c sửa chữa bởi

Rahman và cộng sự (2011). Có một số sự thay đổ i về liều lươ ̣ng mẫu thử.

2.3.13. Mô hình chuột bi ̣ nhiễm độc acetaminophen

Mô hình thử nghiệm khả năng bảo vệ gan trên chuột được thực hiện theo giáo trình củ a bộ Y tế (2006) có thay đổ i về liều gây độc trên chuột. Chuột đươ ̣c nuôi ổ n

định trong 7 ngày với các điều kiện phòng thí nghiệm và đươ ̣c ăn uống tự do. Cho

chuột nhịn ăn 6 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm.

2.3.14. Mô hình chuột tiêu chảy castor oil

Mô hình gây tiêu chảy bằng castor oil trên chuột được thực hiện theo phương

pháp của Dosso và ctv (2012). Sử dụng tác nhân gây tiêu chảy sau khi uống dung

dịch thí nghiệm. Sau đó tính khối lượng phân tiêu chảy và đem so sánh với nhóm đối

chứng. Từ đó, xác định được tỷ lệ ức chế tiêu chảy.

2.3.15. Phương pháp sắc ký cao áp ghép khối phổ (HPLC-MS)

Phân tích dịch trích ly ethanol 70% từ lá cây Muntingia calabura bằng

phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (HPLC/MS) bằng máy TOF-time of

Fly được thực hiện trong cột C18 (kích thước 4,6 x 150 mm, 3,5 μm) được cung cấp

bởi Weber Consulting Ltd., Hungary. Dùng phần mềm Chemstation (Agilent

Corporation, MA, USA) để thu thập và xử lý dữ liệu.

2.3.16. Xử lý số liệu

Tất cả các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft® Excel® 2016

(16.0.7070.2022) và phần mềm SAS (r) 9.4 TS Level 1M1.

2.4. Bố trí thí nghiệm

42

Mẫu lá cây Muntingia calabura Định tính một số thành phần hóa học

Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Định lượng

Tách chiết bằng các hệ dung môi

Phenolic

Flavonoid

Tannin

Cắn

Thử hoạt tính sinh học in vitro Thử hoạt tính sinh học in vivo

Hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính kháng khuẩn

Khả năng trị tiêu chảy Chống oxi hóa theo phương pháp FRAP Năng lực khử sắt Xác định nồng độ ức chế MIC Khả năng điều hòa đường huyết Khả năng quét gốc tự do DPPH Khả năng giải độc, bảo vệ gan

Dịch chiết có hoạt tính sinh học tốt nhất

Xác định một số hợp chất bằng sắc ký HPLC/MS

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí tổng quát

43

2.4.1. Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết EMC70, EMC90 và AMC từ cây

Muntingia calabura

2.4.1.1. Quy trình

Mẫu cây Muntingia calabura

Phơi khô, xay

bã Ngâm và chiết kiệt trong các dung môi

cô quay chân không

Cắn Muntingia calabura

Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận cắn chiết từ cây Muntingia calabura

2.4.1.2. Thuyết minh quy trình

Mẫu lá cây Muntingia calabura trưởng thành được thu hái từ thành phố Hồ

chí Minh và phơi khô trong bóng mát từ 3 - 5 ngày sau đó toàn cây được đem đi xay

thành hạt đường kính 0,2 tới 1,0 mm bằng cách sử dụng sàng rây 1,0 mm. Một phần

bột mẫu được đem bảo quản ở nhiệt độ 40C. Phần còn lại đem đi ngâm với dung môi

ethanol 70%, ethanol 90% và nước theo tỷ lệ 1:15 trong vòng 48 giờ đối với EMC70

và EMC90 và 24 giờ đối với AMC. Sau đó ly tâm 4000 v/p trong 10 phút thu được

dịch lần 1, bã còn lại tiếp tục được ngâm với ethanol 70%, ethanol 90% và nước trong

24 giờ và ly tâm được dịch lần 2, làm tương tự cho đến khi chiết kiệt các hợp chất

trong dịch chiết. Tiến hành cô quay chân không ở 400C đối với EMC70 và EMC90.

Riêng đối với mẫu AMC cô cách thủy ở nhiệt độ không quá 700C thu được cắn chiết

ethanol 70% (EMC70), ethanol 90% (EMC90) và nước (AMC) từ cây Muntingia

calabura.

2.4.2. Thí nghiệm 2: Định tính một số thành phần hóa học có trong cây

44

2.4.2.1. Quy trình

Cắn chiết từ cây Muntingia calabura

Ngâm trong DMSO 1% Ngâm trong H2SO4 10%

Lọc Lọc

định tính định tính

Alkaloid Phenolic Flavonoid Saponin Amino acid

Anthraquinon glycosid Tannin Steroid s

Hình 2.3. Quy trình định tính dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC từ cây

Muntingia calabura

2.4.2.2. Thuyết minh quy trình

Cao chiết methanol từ cây Muntingia calabura được chia làm 2 phần. Phần

thứ nhất pha với H2SO4 10% sau đó lọc hết cắn, dịch thu được dùng để thực hiện các

thử nghiệm kiểm tra sự có mặt của nhóm alkaloid. Phần thứ hai sẽ pha trong DMSO

1% sau đó bỏ cắn thu dịch, dịch này được đem phân tích và định tính một số thành

phần hóa học như saponin, flavonoid, anthraquinone glycoside, steroid, phenolic,

tannin và amino acid.

a) Định tính thành phần alkaloid

Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm, cho vài giọt

thuốc thử Mayer. Quan sát kết tủa màu đục tạo thành.

Thử nghiệm Dragendroff: Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ vài

giọt thuốc thử Dragendroff và quan sát sự hình thành kết tủa màu vàng cam.

Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử

Hager và quan sát hình thành kết tủa màu vàng.

45

Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc

thử Wagner và quan sát sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ.

b) Định tính thành phần saponin

Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh và quan

sát sự hình thành bọt ổn định.

c) Định tính thành phần anthraquinone glycosides

Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml H2SO4

loãng và đun sôi trong 30 phút, thêm H2O2 hoặc FeCl3. Tiến hành lọc nóng và để

nguội dịch lọc, thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene, thêm

2 ml ammonia 10% và đun trong 30 phút quan sát màu trong lớp ammonia. Quan sát

sự xuất hiện màu đỏ.

d) Định tính thành phần flavonoid

Thử nghiệm alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài

giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước

cất để so sánh, thêm vài giọt HCl loãng. Quan sát sự xuất hiện màu vàng khi bổ sung

NaOH và mất màu khi cho HCl.

Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Cho một ít bột Mg

và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm. Bổ sung 5 ml cồn 95%. Nếu mẫu có

màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid.

Thử nghiệm ferric chloride: Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt

thuốc thử ferric chloride 10%. Quan sát sự xuất hiện màu xanh hoặc tím.

f) Định tính thành phần phenolic

Thử nghiệm chì acetate: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho 1,5 ml chì

acetate 10%. Quan sát sự xuất hiện kết tủa trắng.

Thử nghiệm gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm một vài giọt

gelatin 1% và quan sát sự xuất hiện kết tủa trắng.

46

g) Định tính thành phần tannin

Thử nghiệm chì acetate: 2 ml dịch chiết được cho vào ống nghiệm và thêm 2

ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt Chì acetate. Quan sát sự xuất hiện kết tủa màu vàng.

Thử nghiệm ferric chloride: 2 ml dịch chiết được cho vào ống nghiệm, thêm

2 ml NaCl 10%. Cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. Quan sát sự xuất hiện màu xanh.

h) Định tính thành phần steroid

Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml

chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2

lớp và quan sát ở mặt phân cách nếu xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới  sterol, màu vàng

ở lớp dưới  triterpenoid.

Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm

2ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh, nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo

thành ống nghiệm. Quan sát nếu xuất hiện màu xanh dương đậm hay xanh lá cây 

steroid, nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm  triterpenoid.

i) Định tính thành phần amino acid

Thử nghiệm Ninhydrin: hút 1 ml dịch cao chiết, sau đó cho vào một vài giọt

thuốc thử Ninhydrin. Đun sôi trong 5 phút và quan sát sự xuất hiện màu tím.

2.4.3. Thí nghiệm 3: Hàm lượng flavonoid tổng số

2 ml mẫu (mg/ml) được thêm vào 2 ml AlCl3 2%, ủ ở nhiệt độ phòng trong

45 phút rồi đo quang ở bước sóng λ = 420 nm. Mẫu chuẩn để so sánh là mẫu được

thêm 2 ml nước cất trong 2 ml AlCl3. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hàm lượng flavonoid

được tính toán dựa vào đường chuẩn rutin.

2.4.4. Thí nghiệm 4: Hàm lượng phenolic tổng số

Cho nồng độ mẫu (mg/ml) vào ống nghiệm. Thêm 2,5 ml thuốc thử Folin-

Ciocateau (1/10). Sau khoảng 5 đến 8 phút bổ sung thêm 2 ml Na2CO3 7,5%, lắc đều,

ủ ở 400C ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 765

47

nm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hàm lượng phenolic tổng số được tính toán dựa vào

đường chuẩn acid gallic.

2.4.5. Thí nghiệm 5: Hàm lượng tannin tổng số

Để 50 µl mẫu vào 3 ml dung dịch vanilin 4% trong methanol và 1,5 ml dung

dịch HCl đậm đặc đã được thêm vào. Các ống nghiệm được ủ trong 15 phút. Tiến

hành đo quang ở bước sóng 500 nm với methanol là mẫu trắng. Thí nghiệm lặp lại 3

lần. Hàm lượng tannin tổng số được tính toán dựa theo đường chuẩn catechin.

2.4.6. Thí nghiệm 6: Khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp FRAP

2.4.6.1. Quy trình

Mẫu EMC70, EMC90 và AMC được pha loãng với nồng độ thích hợp

Hút 50 µl mỗi nồng độ

1,5 ml thuốc thử FRAP

Ủ 30 phút nhiệt độ phòng

Đo độ hấp thu (λ = 593nm)

Hình 2.4. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP

2.4.6.2. Thuyết minh quy trình

Thuốc thử FRAP bao gồm: Đệm acetat 300mM (pH= 3.6), 10 mM 2,4,6-

tripyridyl-s-triazin (TPTZ) trong 40mM HCl, 20mM FeCl3.6H2O.

Tiến hành phân tích:

Thực hiện phản ứng và đo độ hấp thu ̣ trên máy quang phổ UV như sau: Mẫu

trắng: thuốc thử FRAP. Mẫu đo: 1,5 ml thuốc thử FRAP + 50 µl mẫu, ủ 30 phút ở nhiệt

độ phòng. Đo độ hấp thu ở λmax = 595nm.

48

Đường chuẩn: Đường chuẩn sử dụng FeSO4.7H2O pha thành các nồng độ 1000,

800, 600, 400, 200, 100 µM.

Tương ứng với mỗi nồng độ Fe2+, cho phản ứng với thuốc thử FRAP và đo độ

hấp thu như sau: Tất cả các mẫu được thực hiện 3 lần. Hoa ̣t lực củ a chất chống oxi

hoá đươ ̣c đánh giá thông qua giá trị FRAP xác định từ đường chuẩn. Giá trị FRAP

càng lớn, chất chống oxi hoá càng ma ̣nh và ngươ ̣c la ̣i.

2.4.7. Thí nghiệm 7: Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH

2.4.7.1. Quy trình

Mẫu EMC70, EMC90 và AMC được pha loãng với nồng độ thích hợp

Hút 50 µl mỗi nồng độ

2 ml DPPH

Ủ trong tối 15 phút

Đo bước sóng λ=517 nm

Lập đường chuẩn tính IC50

Hình 2.5. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH

2.4.7.2. Thuyết minh quy trình

Dựng đường chuẩn Vitamin C

Pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ sau: 0; 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5

(mg/ml). Dùng micropipet hút 50 µl mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn

2ml dung dịch DPPH. Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. So màu ở bước sóng

λ=517 nm.

Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất

nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm

49

thí nghiệm như trên. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị IC50 (Inhibitory

concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự

do DPPH trong khoảng thời gian xác định. Mẫu Vitamin C được dùng để so sánh

thông số giá trị IC50.

Tính toán kết quả

Phần trăm ức chế (%I) =

x 100%

ADPPH- ATN ADPPH

Trong đó:

ADPPH là giá trị OD517nm của dung dịch DPPH ban đẩu pha trong methanol

(ADPPH = 0,705)

ATN là giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu)

Giá trị IC50 được tính toán dựa theo đường chuẩn: y=ax+b theo công thức:

X = 50 - b a

2.4.8. Thí nghiệm 8: Xác định năng lực khử

50

2.4.8.1. Quy trình

Mẫu EMC70, EMC90 và AMC được pha loãng với nồng độ thích hợp

2,5 ml đệm phosphate 0,2M

Hút 2,5 ml mẫu vào ống nghiệm

2,5 ml K3[Fe(CN)6]) 1%

Ủ 30 phút ở 500C

2,5 ml TCA 10%

Ly tâm hỗn hợp 3000vòng/p x10 phút

Hút 2,5 ml dd vào 2,5 ml nước cất

Đo độ hấp thu (λ = 700 nm)

Hình 2.6. Quy trình thực hiện khả năng chống oxi hóa theo năng lực khử

2.4.8.2. Thuyết minh quy trình

Chuẩn bị dung dịch mẫu cần khảo sát trong khoảng nồng độ 1 – 25 g/ml.

Sử dụng chứng dương là Vitamin C. Hút 2,5 ml dịch mẫu vào ống nghiệm, sau đó

cho vào thêm 2,5 ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,2M pH = 6,0. Thêm 2,5 ml

dung dịch K3[Fe(CN)6]) 1% vào hỗn hợp trên, lắc đều. Ủ ở 50oC trong 20 phút. Thêm

2,5 ml dung dịch TCA 10%, lắc đều. Ly tâm hỗn hợp 3000 vòng/p x 10 phút. Hút 2,5

ml dịch nổi vào 2,5 ml nước cất. Thêm vào 0,5 ml FeCl3 1%. Đo mật độ quang ở

bước sóng 700 nm. Ghi nhận kết quả và lập biểu đồ biểu diễn OD theo nồng độ.

51

2.4.9. Thí nghiệm 9: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EMC70,

EMC90 và AMC từ cây Muntingia calabura

2.4.9.1. Quy trình

Tăng sinh trong môi trường TSB

Vi sinh vật chỉ thị Cao chiết EMC70, EMC90 và AMC

Lắc 150 vòng/phút trong 18 giờ

Pha dịch chiết có nồng độ 100 mg/ml

Cấy trang lên môi trường TSA

Đo quang phổ ở 600 nm và pha loãng VSV trong nước muối sinh lý (106cfu/ml)

0 Ủ 37

Nhỏ 100 μl dịch chiết mỗi nồng độ vào các giếng trên môi trường TSA

C trong 24 giờ

Đọc kết quả

Hình 2.7. Quy trình thực hiện khả năng kháng khuẩn

2.4.9.2. Thuyết minh quy trình

Vi sinh vật chỉ thị bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C được lấy tăng sinh trong erlen

chứa 10 ml môi trường TSB được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó môi

trường TSB chứa vi sinh vật được lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ.

Sau khi tiến hành đo quang phổ bước sóng 600 nm, các chai môi trường được pha

loãng theo dãy thập phân trong ống nước muối sinh lý vô trùng sao cho mật độ vi

sinh vật đạt 106 cfu/ml. Hút 0,1 ml dịch khuẩn cho vào đĩa môi trường thạch TSA,

tiến hành cấy trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn. Các đĩa thạch

52

sau đó được đục lỗ tạo thành các miệng giếng bằng một ống kim loại hình trụ thẳng,

không gỉ có đường kính 6 mm, khoảng cách giữa các lỗ được tính toán từ trước sao

cho cân bằng và khoảng cách giữa các vòng kháng không trùng lên nhau. Các công

đoạn trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng với ngọn lửa đèn cồn.

Cao chiết EMC70, EMC90 và AMC từ Muntingia calabura L. trữ lạnh được

cân và hòa với DMSO 1% sao cho thu được dịch chiết có nồng độ 100 mg/ml. Sử

dụng micropipet hút chính xác 100 μl dịch chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa môi

trường TSA đã được đục lỗ trước đó thí nghiệm được lặp lại 3 lần trên mỗi chủng vi

sinh vật chỉ thị. Các thao tác trên đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Đường

kính vòng kháng khuẩn được xác định sau khi ủ các đĩa TSA ở 370C trong vòng 24

giờ.

2.4.10. Thí nghiệm 10: Xác định độc tính cấp diễn

Chuột bạch đực được chia thành nhiều nhóm tương tự nhau, mỗi con ở cùng

nhóm sẽ nhận cùng một liều khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng sống hay chết

của chuột trong mỗi nhóm. Sau khi cho chuột uống thuốc với liều duy nhất trong

ngày, quan sát hành vi, thể trạng của chuột sau 24, 36 và 48 giờ. Ghi nhận giờ xuất

hiện các triệu chứng bất thường như co giật hoặc chết. Nếu có chuột chết thì xét

nghiệm đại thể chủ yếu gan, thận, tim, phổi. Xác định liều làm chết 50% động vật

thử.

Bảng 2.1. Các chỉ tiêu theo dõi

Xem sự thay đổi màu sắc của lông, quan Màu lông sát kỹ ở vùng cổ

Trạng thái lông Xem dấu hiệu có sự rụng lông không

Xem chuột còn tỉnh, nhạy hay lừ đừ, Sự linh hoạt nằm yên một chỗ

53

Quan sát trong trấu có phân lỏng không, Tình trạng tiêu chảy quan sát hậu môn có dính phân không

Lượng thức ăn Kiểm soát lượng thức ăn hằng ngày

Lượng nước uống Kiểm soát lượng nước sử dụng mỗi ngày

Trọng lượng Kiểm tra xem chuột có xuống cân không

Tỷ lệ sống Xem có con chuột nào bị chết không

Để thăm dò liều, đối với mỗi cao chiết, liều dùng 6 con chuột, mỗi con có

trọng lượng 20 ± 3 g, cho uống liều duy nhất trong ngày với thể tích thuốc tối đa

chuột có thể nhận được là 0,2 ml/10 gam thể trọng/lần/ngày (quy định cho chuột

nhắt), đây là liều thực hiện cho lượng cao chiết tối đa có thể hòa tan được trong 0,2

ml nước cất và chất trợ tan (Đỗ Trung Đàm, 2003).

Cao chiết EMC70, EMC90 và AMC được pha thành liều 3000 mg/kg thể

trọng chuột nhằm khảo sát độc tính cấp diễn trong 1 ngày. Sau đó ghi nhận kết quả

sau khi uống dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC từ cây.

2.4.11. Thí nghiệm 11: Mô hình chuột tiểu đường cấp tính

2.4.11.1. Quy trình

Chuột bạch

Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 4 Nhóm 5 Nhóm 3 Nhóm 6

Dịch chiết AMC Glibenclamid 10 mg/kg 1% Tween 80 trong nước (10 ml/kg) Dịch chiết EMC70 Dịch chiết EMC90

Glucose (2g/kg)

Kiểm tra đường huyết

Hình 2.8. Mô hình chuột tiểu đường cấp tính

54

2.4.11.2. Thuyết minh quy trình

Đánh số thứ tự trên đuôi chuột ba ̣ch. Nuôi ổ n định trong 2 tuần đầu. Sau đó

chia chuột ba ̣ch thành 5 nhóm, mỗi nhóm 6 con và đươ ̣c cho ăn chế độ ăn riêng biệt.

Nhóm 1 (nhóm chứng trắng): Chuột đươ ̣c uống 1% Tween 80 trong nước (10 ml/kg).

Nhóm 2 (nhóm độc): Chuột đươ ̣c uống 1% Tween 80 trong nước (10 ml/kg). Nhóm

3 - nhóm chứng sinh học: chuột đươ ̣c uống thuốc với thành phần glibenlamide

(10mg/kg). Nhóm 4: Chuột đươ ̣c uống dịch chiết AMC (100 mg/kg). Nhóm 5: Chuột

đươ ̣c uống dịch chiết EMC70 (100 mg/kg). Nhóm 6: Chuột đươ ̣c uống dịch chiết

EMC90 (100 mg/kg). Sau 1 giờ các nhóm từ 2 đến 5 đươ ̣c dùng thêm đường glucose,

với liều dùng 2 g/kg. Sau 2 giờ, các nhóm từ 1 đến 5 đươ ̣c tiến hành lấy máu kiểm tra

lươ ̣ng đường huyết bằng máy đo HGM-112 (hãng OMRON - Nhâ ̣t Bản).

2.4.12. Thí nghiệm 12: Mô hình chuột bi ̣ nhiễm độc acetaminophen

2.4.12.1. Quy trình

Chuột bạch

Nhóm 2 Nhóm 5 Nhóm 3 Nhóm 6 Nhóm 4 Nhóm 1

Acetaminophen (500 mg/ml)

Silymarin Dịch chiết EMC70 Dịch chiết EMC90 Dịch chiết AMC

Kiểm tra hoa ̣t tính enzyme ALT AST

Hình 2.9. Mô hình giải độc gan acetaminophen

2.4.12.2. Thuyết minh quy trình

Chuột được chia thành 5 nhóm, mỗi nhóm 6 con:

Nhóm chứng trắng (nhóm 1): Nhóm chuột bình thường không bị xử lý độc.

55

Nhóm độc (nhóm 2): Nhóm chuột bị gây độc bởi acetaminophen: Chuột được

uống 0,4 ml acetaminophen, liều 500 mg/kg. Sau 24 giờ, chuột được uống thêm

acetaminophen với liều tương tự.

Nhóm chuột dùng sản phẩm nghiên cứu hoặc thuốc (nhóm 3, 4, 5, 6): Nhóm

chuột bị gây độc tương tự như nhóm độc nhưng đươ ̣c uống thêm dịch chiết từ cây

Muntingia calabura hoặc đươ ̣c uống thuốc bảo vệ gan (silymarin). Cả 4 nhóm chuột

đều được uống 0,4 ml acetaminophen liều 500 mg/kg, sau 1 giờ nhóm 3 đươ ̣c uống

thêm 0,4 ml dịch chiết EMC70, nhóm 4 uống thêm 0,4 ml dịch chiết EMC90, nhóm

5 uống thêm 0,4 ml dịch chiết AMC, nhóm 6 uống thuốc silymarin. 6 giờ sau chuột

đươ ̣c uống thêm 0,4 ml sản phẩm (liều thử nghiệm sản phẩm và thuốc đều sử du ̣ng

cùng liều là 15, 25 và 50 mg/kg). Các nhóm chuột đươ ̣c nhịn ăn 6 tiếng trước khi lấ y

máu. Huyết tương chuột đươ ̣c dùng để đo hoa ̣t tính enzyme ALT (alanine

transaminase) và AST (aspartate transaminase).

2.4.13. Thí nghiệm 13: Mô hình chuột tiêu chảy castor oil

2.4.13.1. Quy trình

Chuột bạch

Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4 Nhóm 5

Loperamide (3 mg/kg) DMSO 1% Dịch chiết AMC Dịch chiết EMC70 Dịch chiết EMC90

Castor oil 0.3 ml

Xác định thời điểm tiêu chảy và tính lượng phân tiêu chảy trong 4 giờ

Hình 2.10. Mô hình tiêu chảy castor oil

56

2.4.13.2. Thuyết minh quy trình

Chuột bạch có khối lượng từ 25 - 30 gram được sử dụng làm thí nghiệm, sau

khi đã nhịn đói 24 giờ. Chúng được chia thành 5 nhóm:

Nhóm 1 uống dung dịch DMSO 1% (2 ml/kg) được xem là nhóm đối chứng.

Nhóm 2 uống thuốc trị tiêu chảy Loperamide (3 mg/kg).

Nhóm chuột dùng sản phẩm nghiên cứu (Nhóm 3, 4, 5). Nhóm 3 uống dịch

chiết EMC70, nhóm 4 uống dịch chiết EMC90, nhóm 5 uống dịch chiết AMC. Sau 1

giờ, tất cả chuột được uống 0,3 ml castor oil. Tất cả chuột được nhốt ở những lồng

riêng có lót miếng nhựa và quan sát dạng phân trong 4 giờ.

Tỷ lệ ức chế tiêu chảy (%) =

x 100

T0- T1 T0

T0: lượng phân tiêu chảy ở nghiệm thức đối chứng (gram).

T1: lượng phân tiêu chảy ở nghiệm thức thí nghiệm (gram).

2.4.14. Thí nghiệm 14: Định tính bằng phương pháp sắc ký sắc ký lỏng cao áp

ghép khối phổ HPLC

Pha động gồm nước – formic acid (A; 100:0,1, v/v) – methanolic - formic

acid (B; 100:0.1, v/v). A và B được cho theo khoảng thời gian như sau: 0 min, A: B

= 90:10; 35 min, A: B = 0:100; 60 min, A: B = 0:100. Tốc độ dòng chảy là 0,5 ml/phút

và nhiệt độ cột sắc ký giữ ở 400C. Tất cả các dung môi được lọc qua bộ lọc 0,45 µm

và khử khí bằng siêu âm trong buồng siêu âm trước khi sử dụng. Tình trạng MS như

sau ion hóa tia điện ESI; ion dương âm; pin đối RF: với tốc độ 250,0 vòng/phút; khí

khô 9,0 l/phút, chất làm nóng khô 200C; van điều chỉnh: nguồn; áp lực máy phun

sương: 1,2 bar; bộ mao dẫn: 4500V; tấm Offset: -500V; quét từ 50 – 3000 m/z.

57

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1. Bước đầu góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu

3.1.1. Khảo sát vi phẫu và soi bột dược liệu

3.1.1.1. Vi phẫu lá

Hình 3.1. Lông tiết

Lông tiết nhìn ở mặt cắt ngang của lá cây Muntingia calabura có phần giống

với lông tiết của cây thuốc lá và cây kim ngân, cà độc dược,… đều có chất tiết trong

tế bào tiết trên đỉnh ngọn.

Khí khổng

Hình 3.2. Mặt cắt biểu bì lá

Lá cây trưởng thành có kích thước 6,0 – 8,0 cm x 1,5 – 2,5 cm, lông tơ dày

đặc ở mặt trên kích thước khoảng 60 – 85 µm.

58

3.1.1.2. Vi phẫu thân

Tầng sinh bần

B A

Bần

Bó mạch Lục bì

Hình 3.3 A. Mặt cắt ngang thân B. Mặt cắt dọc thân

Cấu tạo thân của cây Muntingia calabura được sắp xếp theo dạng các bó

mạch xếp thành các bó đồng tâm bao gồm lớp bần ở ngoài, kế đến là tầng sinh bần,

tới lớp lục bì và cuối cùng bên trong là các bó mạch, đường kính mặt cắt ngang

khoảng 1,5 – 2,0 mm.

3.1.1.3. Vi phẫu hoa

Hình 3.4. Mặt cắt dọc hoa cây Muntingia calabura

59

Mặt cắt dọc hoa Muntingia calabura (hình 3.4) minh họa hoa được cấu tạo

gồm cuốn hoa, đài hoa, cánh hoa, nhị hoa chứa hạt phấn và nhụy hoa chứa noãn. Đài

hoa kích thước khoảng 0,8 – 0,9 cm có nhiều lông tơ dày ở mặt đáy, bầu nhụy có kích

thước khoảng 5,0 – 6,0 mm.

A

B C

Hình 3.5 A. Cấu tạo nhị hoa. B. Chỉ nhị C. Bao phấn

Chỉ nhị gắn túi phấn ở đỉnh. Chỉ nhị có chiều dài khoảng 0,5 – 0,6 cm, bao

phấn có dạng túi kép kích thước mỗi túi vào khoảng 75 – 100 µm x 30 – 55 µm, khắp

bề mặt mỗi bao phấn được bao phủ nhiều nốt nhỏ trong suốt. Mỗi bao phấn bên trong

chứa 1 túi phấn.

Hình 3.6. Hình thái hạt phấn

60

Hạt phấn hoa bên trong bầu nhị có dạng hình bầu dục, kích thước hạt phấn

vào khoảng 15 x 20 µm.

Hình 3.7. Bề mặt cánh hoa

Cánh hoa cây Muntingia calabura mỏng có màu trắng soi dưới kính hiển vi

có thể tìm thấy khí khổng trên bề mặt, kích thước cánh hoa trưởng thành vào khoảng

0,8 – 1,2 cm x 0,65 – 0,8 cm.

Hình 3.8. Cấu tạo noãn

Bề mặt noãn có nhiều nốt giống như trên bề mặt túi phấn có chiều dài vào

khoảng 80 – 100 µm.

3.1.1.4. Bột dược liệu

Bột dược liệu từ lá cây Muntingia calabura có kích thước vào khoảng 100 –

150 µm. Bột dược liệu có kết cấu dạng sợi sơ kết lại với nhau do bột dược liệu chứa

nhiều thành phần glycoside. Bên ngoài bột dược liệu có nhiều lông che chở và các

mảnh tế bào khi soi bột trên lam kính, không tìm thấy sự hiện diện của tinh thể canxi

oxalate.

61

Hình 3.9. Bột dược liệu

3.1.2. Độ tinh khiết của dược liệu

3.1.2.1. Độ ẩm bột dược liệu

Độ ẩm dược liệu cây Muntingia calabura được xác định theo bảng 3.1

Bảng 3.1. Độ ẩm của lá cây và bột dược liệu

Bột dược liệu Lá dược liệu

Độ ẩm 0,17±0,01% 1,81±0,06%

3.1.2.2. Tro toàn phần

Tro toàn phần của dược liệu được xác định là 14,08±0,17%

3.1.2.3. Tro tan trong nước

Cách tính toán tương tự với tro toàn phần nhưng đã được loại bỏ thành phần

tro không tan trong nước, tỷ lệ tro tan trong nước của dược liệu là 3,63±0,56%.

3.1.2.4. Tro không tan trong acid

Cách tính toán tương tự với tro toàn phần nhưng đã được loại bỏ thành phần

tan trong sulfuric acid, tỷ lệ tro không tan trong sulfuric acid của dược liệu là

8,27±0,19%.

62

3.1.3. Hàm lượng cắn thu được từ dịch chiết lá cây trứng cá

Hàm lượng cắn thu được

30.00

25.00

a

20.00

15.00

10.00

b

5.00

0.00

EMC70

EMC90

AMC

c

Hình 3.10. Hàm lượng của 3 loại cắn thu được từ lá cây Muntingia calabura

Hàm lượng cắn trích ly của ba loại dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC từ

cây Muntingia calabura được thể hiện ở hình 3.10 với hàm lượng cắn EMC70,

EMC90 và AMC lần lượt là 18,21±0,66 %; 7,31±0,34 % và 22,59±2,25 %. Dựa vào

số liệu thu được, hàm lượng cắn AMC thu được là tốt nhất tiếp đến là hàm lượng cắn

EMC70 và cuối cùng là hàm lượng cắn EMC90. Hàm lượng cắn EMC90 (7,31±0,34

%) nhỏ hơn gấp khoảng 2,49 lần so với hiệu suất thu hồi EMC70 (18,21±0,66 %) và

3,09 lần so với AMC (22,59±2,25 %). Dịch chiết AMC có hàm lượng cắn cao nhất

là do nước là một dung môi có độ phân cực cao khả năng lôi kéo nhiều hợp chất có

độ nhầy cùng khối lượng phân tử lớn dẫn tới hàm lượng cắn trích ly của AMC cao

hơn so với dịch chiết EMC70 và EMC90.

3.2. Thành phần hóa học có trong cây Muntingia calabura

Cắn chiết từ cây Muntingia calabura được chia làm 2 phần. Phần thứ nhất

pha với H2SO4 10% sau đó lọc hết cắn, dịch thu được dùng để thực hiện các thử

nghiệm kiểm tra sự có mặt của nhóm alkaloid. Phần thứ hai sẽ pha trong DMSO 1%

sau đó bỏ cắn thu dịch, dịch này được đem phản ứng với một số thuốc thử định tính

một số thành phần hóa học như saponin, flavonoid, anthraquinone glycoside, steroid,

63

phenolic, tannin và amino acid. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học của cây

Muntingia calabura cho thấy nhóm hợp chất phenolic cụ thể là flavonoid chứa nhiều

trong cả ba loại dịch chiết (bảng 3.2). Điều này giống với nghiên cứu trước đó của

Ogunleye và Ibitoye (2003). Kết quả định tính dịch chiết EMC70 và EMC90 cho thấy

sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid, phenolic, tannin và steroid. Trong khi dịch

chiết AMC có sự hiện diện của flavonoid, phenolic, tannin, saponin và amino acid tự

do. Do saponin là một glycoside tan tốt trong nước, và các amino acid là những phân

tử phân cực nên chúng dễ bị lôi kéo bởi dung môi phân cực mạnh là nước, steroid đặc

biệt là triterpenoid không được tìm thấy trong dịch chiết AMC do chúng là những

chất không phân cực. Sở dĩ trong nhóm thử nghiệm định tính flavonoid dịch chiết

EMC70 và EMC90 chỉ dương tính với 2 thử nghiệm Shinoda và ferric clorid nhưng

lại âm tính với alkaline vẫn được gọi là có sự hiện diện của nhóm flavonoid là do

trong flavonoid có nhiều nhóm hợp chất trong đó mỗi phản ứng định tính giúp nhận

biết một nhóm chất riêng trong đó phản ứng của ferric clorid giúp nhận biết chalcon

trong nhóm chất flavonoid (Pál và Zsuzsanna, 2008), phản ứng alkaline giúp phân

biệt nhóm flavon và flavonol (Hediat và Najat, 2010) và phản ứng shinoda giúp phân

biệt anthocyanidins trong nhóm chất flavonoid (Sumalatha và ctv 2012). Kết quả này

tương đồng với kết quả của Pretorius và ctv (2003). Alkaloid đều không có sự hiện

diện trên cả ba loại dịch chiết, điều này đúng với nghiên cứu của Vijayanand và ctv

(2016).

Bảng 3.2. Định tính thành phần hóa học có trong Muntingia calabura

Mẫu Thử nghiệm EMC70 EMC90 AMC

Marquis ‒ ‒ ‒

Mayer ‒ ‒ ‒

Alkaloid Dragendroff ‒ ‒ ‒

Hager ‒ ‒ ‒

Wagner ‒ ‒ ‒

64

‒ Saponin Foam Test ‒ ++

‒ Anthraquinone BonTrager ‒ ‒

+ Amino acid Ninhydrin ‒ ++

‒ Alkaline ‒ ++

+++ Flavonoid Shinoda +++ +

++++ Ferric clorid ++++ +++

+++ Lead acetate +++ +++ Phenolic ++ Gelatin +++ ++

Ferric clorid ++++ ++++ +++

Tannin Lead +++ +++ +++ acetate

Steroid Salkowski Triterpenoid Triterpenoid ‒

Ghi chú: ‒ không có + có ít ++ có +++ có nhiều ++++ có rất nhiều

B A EMC90 (-) EMC90 (+)

EMC70 (-) EMC70 (+) AMC (+) AMC (+)

C D AMC (+) Dragendroff (-)

Wager (-) Hager (-) Mayer (-)

F E EMC90 (+) EMC70 (+) EMC90 (+) AMC (-) EMC70 (+) AMC (+)

Hình 3.11. A Định tính saponin B. Định tính flavonoid (thử nghiệm shinoda),

C. Định tính alkaloid trên AMC, D. Định tính amino acid trên AMC, E. Định

tính phenolic, F. Định tính steroid.

65

3.3. Định lượng flavonoid phenolic và tannin

Hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số từ các dịch chiết của cây

được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol, flavonoid và tannin tổng số

Hàm lượng polyphenol Hàm lượng flavonoid Hàm lượng tannin Mẫu tổng số tổng số tổng số

EMC70 120,77±0,54 mg GAE/g 90,94±2,12 mg RE/g 4,98±1,12 mg CE/g

EMC90 43,18±0,30 mg GAE/g 35,48±1,23 mg RE/g 0,78±0,17 mg CE/g

AMC 60,60±0,93 mg GAE/g 20,25±1,39 mg RE/g 3,55±0,82 mg CE/g

EMC70 có hàm lượng polyphenol, flavonoid và tannin cao nhất lần lượt là

120,77 ± 0,54 mg GAE/g, 90,94 ± 2,12 mg RE/g và 4,98±1,12 mg CE/g, Điều đặt

biệt là dịch chiết EMC70 và EMC90 tuy chỉ khác nhau ở tỷ lệ ethanol trong dịch chiết

nhưng hàm lượng polyphenol, flavonoid và tannin của EMC70 lại cao hơn lần lượt

gấp khoảng 2,80; 2,56 và 6,38 lần so với dịch chiết EMC90. Điều này ít nhiều ảnh

hưởng tới sự khác biệt trong kết quả khảo sát hoạt tính sinh học giữa hai loại dịch

chiết tưởng chừng như tương tự nhau. Dựa trên kết quả phân tích tương quan pearson

cho thấy polyphenol và flavonoid có tương quan chặt với nhau với hệ số pearson =

0,91114 (p<0,01) (Phụ lục B).

3.4. Khả năng chống oxy hóa

3.4.1. Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP

Phương pháp này dựa vào sự khử phức Fe (III) – TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-

triazine) thành phức Fe (II) –TPTZ bền hơn bằng một chất khử (chất chống oxy hóa) ở

pH thấp. Fe (II) –TPTZ có màu xanh dương đậm và có thể đo mâ ̣t độ quang ở bước

sóng  = 593nm. Tác động chống oxy hóa đươ ̣c đánh giá bởi sự tăng cường độ màu

củ a phức Fe (II) –TPTZ.

66

OD

Đường chuẩn Fe2+

y = 0.0005x + 0.0215 R² = 0.997

0.600

0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.000

μg/ml

0

200

400

600

800

1000

1200

Hình 3.12 Đường chuẩn Fe2+-TPTZ

Bảng 3.4. Kết quả tính toán giá trị FRAP

Mẫu thử nồng độ 0,2 (mg/ml) EMC70 EMC90 AMC Ascorbic acid

Giá trị FRAP (μM Fe2+/L) 5005±167 2732±222 3062±142 7335±20

Kết quả khảo sát khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP thể hiện

ở bảng 3.6. Tại nồng độ 0,2 (mg/ml) dịch chiết EMC70 thể hiện khả năng chống oxi

hóa tốt nhất, tiếp theo là EMC90 và cuối cùng là AMC. EMC70 có hoạt tính chống

oxi hoá tốt nhất trong 3 loại dịch chiết và hoạt tính chống oxi hóa chỉ thấp hơn khoảng

1,46 lần so với đối chứng là ascorbic acid là hợp chất tinh khiết ở cùng nồng độ.

Bảng 3.5. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng

chống oxi hóa theo phương pháp FRAP

Hàm lượng polyphenol Hàm lượng flavonoid

Khả năng chống oxi hóa 0,98537 0,93520

FRAP (p<0,01) (p<0,01)

Kết quả phân tích tương quan pearson cho thấy hàm lượng polyphenol và

flavonoid tương quan rất chặt với khả năng chống oxi hóa theo phương pháp FRAP

với hệ số pearson lần lượt là 0,98537 và 0,93520 (p<0,01). Điều này kết luận hàm

lượng polyphenol và flavonoid càng tăng thì khả năng chống oxi hóa càng cao và

ngược lại.

67

3.4.2. Khả năng chống oxi hóa theo phương pháp xác định năng lực khử

Phương pháp xác định năng lực khử dựa trên nguyên tắc Ion Fe3+ trong phân

tử kali ferricyanid K3[Fe(CN)6] bị khử thành Fe2+ trong phân tử K4[Fe(CN)6]. Sau đó,

bổ sung Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành phức hợp ferric ferrocyanid

Fe4[Fe(CN)6]3 có màu xanh. Cường độ màu ở bước sóng 700 nm tỷ lệ với hàm lượng

ion ferriocyanid cũng như tỷ lệ với khả năng khử của dịch chiết từ lá cây Muntingia

calabura.

X + [Fe(CN)6]3- ⟶ [Fe(CN)6]4-

4Fe3+ + 3[Fe(CN)6]4- ⟶ Fe4[Fe(CN)6]3

Kết quả đánh giá năng lực khử của 3 dịch chiết EMC70, EMC90, AMC được

thể hiện ở hình 3.12, đối chứng được sử dụng trong phương pháp này là acid ascorbic.

Ở nồng độ thấp, EMC70 và EMC90 thể hiện hoạt tính chống oxi hóa như nhau, nhưng

càng ở nông độ cao thì cụ thể là tại nồng độ 70 µg/ml EMC90 thể hiện hoạt tính

chống oxi hóa tốt nhất (1,122 ± 0,006) so với 2 loại dịch chiết còn lại, tiếp đến là

EMC70 (1,029 ± 0,005) và cuối cùng là AMC (0.861 ± 0,007).

Năng lực khử

1.400

1.200

1.000

0.800

0.600

0.400

0.200

OD

10

20

30

40

50

60

70

80

Acid ascorbic

EMC70

EMC90

AMC

µg/ml

Hình 3.13. Khả năng khử của 3 dịch chiết EMC70, EMC90, AMC và đối

chứng acid ascorbic

68

Hình 3.14. Đường chuẩn acid ascorbic nồng độ từ 20 đến 70 µg/ml

Acid ascorbic ở nồng độ thấp cụ thể là tại 20 µg/ml thể hoạt tính chống oxi

hóa thấp nhất so với cả 3 loại dịch chiết nhưng khi càng tăng nồng độ thì khả năng

chống oxi hóa càng mạnh. Ở nồng độ 70 µg/ml EMC90 có khả năng chống oxi hóa

kém hơn so với đối chứng acid ascorbic là khoảng 1,09 lần.

Bảng 3.6. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng

chống oxi hóa theo theo năng lực khử

Hàm lượng polyphenol Hàm lượng flavonoid

Năng lực khử 0,61413 0,88228

(p>0,05) (p<0,01)

Kết quả phân tích tương quan pearson cho thấy hàm lượng flavonoid có

tương quan chặt với năng lực khử với hệ số pearson là 0,88228 (p<0,01) có nghĩa là

năng lực khử tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid. Cả ba loại dịch chiết EMC70,

EMC90 và AMC đều có khả năng lôi kéo được nhiều nhóm hợp chất phenolic đặc

biệt là flavonoid có khả năng chống oxi hóa tốt.

3.4.3. Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH

Phương pháp DPPH được dùng phổ biến trong các nghiên cứu về chống oxi

hóa hiện nay vì nó đơn giản, dễ thực hiện và cho kết quả ổn định. Do đó, phương

pháp này được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxy hóa. Kết quả chống

oxi hóa quét gốc tự do DPPH được trình bày ở hình 3.14. Trong đó, khả năng chống

oxi hóa của EMC70 và EMC90 là gần bằng nhau với giá trị IC50 lần lượt là

69

16,70±0,10 μg/ml và 16,49±0,03 μg/ml và thấp hơn khoảng 3,10 lần so với đối chứng

ascorbic acid (IC50 = 5,38±0,12 μg/ml). AMC có khả năng chống oxi hóa kém hơn

khoảng 4,60 lần so với ascorbic acid (IC50 = 24,77±0,04 μg/ml).

So với các nghiên cứu trước đó thì khả năng chống oxi hóa của dịch chiết

EMC70 và EMC90 thấp hơn khoảng 1,69 lần so với dịch chiết methanol

(Premakumari và ctv 2010) và cao hơn khoảng 3,96 lần so với dịch chiết petroleum

ether trên cùng cây Muntingia calabura (Aruna Sindhe và ctv 2013).

90.00 %

80.00 %

70.00 %

60.00 %

50.00 %

40.00 %

30.00 %

20.00 %

10.00 %

0.00 %

I%

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

EMC70

EMC90

AMC

µg/ml

Hình 3.15. Hoạt tính quét gốc tự do ở các nồng độ từ cây Muntingia calabura

I%

100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00

0

5

10

15

20

µg/ml

Hình 3.16. Hoạt tính chống oxi hóa của acid ascorbic

70

Hình 3.17. Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do của EMC70 ở các nồng độ

khác nhau

Bảng 3.7. Kết quả IC50 chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH

Mẫu EMC70 EMC90 AMC ascorbic acid

IC50 DPPH 16,70±0,10b 16,49±0,03b 24,77±0,04a 5,38±0,12c μg/ml

Bảng 3.8. Tương quan pearson giữa hàm lượng polyphenol và flavonoid với khả năng

chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH

Hàm lượng polyphenol Hàm lượng flavonoid

Quét gốc tự do DPPH -0,45667 -0,78111

(p>0,05) (p<0,05)

Kết quả phân tích tương quan pearson cho thấy hàm lượng flavonoid có

tương quan ngược với kết quả quét gốc tự do DPPH với hệ số pearson là -0,45667

(p>0,05) chứng tỏ khi hàm lượng flavonoid càng tăng thì số lượng gốc tự do DPPH

càng giảm chứng tỏ khả năng chống oxi hóa càng cao.

Kết quả cho thấy nồng độ IC50 của EMC70 và EMC90 là tương đương nhau

về mặt ý nghĩa thống kê mặt dù có sự chênh lệch đáng kể về hàm lượng polyphenol

cũng như flavonoid (bảng 3.3) nhưng có thể trong thành phần của 2 dịch chiết này

đều mang chung các hợp chất chống oxi hóa tốt trong phân nhóm polyphenol, và mỗi

một hợp chất polyphenol cũng như flavonoid trong tự nhiên đều cho khả năng chống

71

oxi hóa khác nhau. Điều này giúp cho 2 dịch chiết này đều có khả năng quét gốc tự

do tốt như nhau. Kết luận trên được củng cố bằng nghiên cứu của Belsare và ctv

(2010) so sánh hoạt tính chống oxi hóa của 2 phân nhóm 2’-hydroxychalcones bao

gồm 6 chất A, B, C, D, E và F khác nhau vị trí gắn nhóm OCH3 và halogen; phân

nhóm 3-hydroxyflavones gồm 5 chất được đánh số 1, 2, 3, 4 và 5 khác nhau vị trí

ngắn nhóm OCH3, COOH và nhóm halogen. Các chất này được so sánh khả năng

chống oxi hóa theo 4 phương pháp khác nhau bao gồm quét gốc tự do DPPH, Nitric

oxide, Hydrogen peroxide và phương pháp phenyl hydrazine hydrochloride. Với

phương pháp DPPH chất A có IC50 (137,67 µg/ml) tốt nhất trong nhóm 2’-

hydroxychalcones, chất 1 có IC50 (98,30 µg/ml) tốt nhất trong nhóm 3-

hydroxyflavones, với phương pháp nitric oxide thì chất F và chất 1 lại có IC50 tốt nhất

lần lượt trong 2 phân nhóm 2’-hydroxychalcones và 3-hydroxyflavones, đối với

phương pháp hydrogen peroxide thì chất B và 1 cho kết quả IC50 tốt nhất, còn đối với

phương pháp phenyl hydrazine hydrochloride thì chất B và 4 lại có nồng độ IC50 là

tốt nhất. Nghiên cứu này chỉ ra rằng các hợp chất khác nhau dù trong cùng 1 phân

nhóm flavone hay chalcone cũng đều có khả năng chống oxi hóa khác nhau trong mỗi

phương pháp chống oxi hóa khác nhau, cùng với việc trong tự nhiên có khoảng hơn

8000 hợp chất polyphenol cũng như hơn 4000 hợp chất flavonoid nên các hợp chất

trong 3 loại dịch chiết từ lá cây Muntingia calabura đặc biệt là EMC70 và EMC90

tuy tương đồng nhau trong kết quả định tính thành phần hóa học (bảng 3.2) nhưng lại

có khả năng chống oxi hóa khác nhau trong cả ba phương pháp.

Kết quả trong cả 3 phương pháp quét gốc tự do FRAP, năng lực khử và DPPH

thì dịch chiết EMC70 cho kết quả chống oxi hóa tốt nhất trong cả 3 loại dịch chiết.

Đồng thời, EMC70 lại có hàm lượng polyphenol cũng như flavonoid là cao nhất.

Điều này chứng tỏ phần lớn các hợp chất polyphenol cũng như flavonoid có khả năng

chống oxi hóa tốt. Dịch chiết EMC90 tuy có hàm lượng polyphenol không cao nhưng

vẫn thể hiện được hoạt tính chống oxi hoa tốt là do ngoài polyphenol ra thì dịch chiết

EMC90 có thể lôi kéo nhiều nhóm hợp chất khác cũng có khả năng chống oxi hóa tốt

hoặc cũng có trường hợp các nhóm hợp chất có số lượng không nhiều nhưng khả

72

năng chống oxi hóa có hiệu quả tốt điển hình như acid ascorbic, rutin hay quercetin

(Zakaria và ctv 2014). Trong trường hợp của dịch chiết AMC tuy kết quả chống oxi

hóa trong cả 3 phương pháp chưa thật sự thuyết phục nhưng với hàm lượng cao trích

ly thu được khá tốt AMC hứa hẹn cũng sẽ đem lại những kết quả liên quan tới hoạt

tính sinh học tốt nhờ những chất có trong dịch chiết nước này.

3.5. Hoạt tính kháng khuẩn

3.5.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Muntingia calabura

Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC của cây

Muntingia calabura được xác định thông qua mức độ kháng khuẩn với 9 chủng vi

sinh vật chỉ thị. Trong đó ciproloxacin được sử dụng như đối chứng dương tại nồng

độ 500 µg/ml và 125 µg/ml đối với chủng E.coli-ETEC. Trong phương pháp này các

hợp chất kháng khuẩn có trong dịch chiết sẽ được khuếch tán vào trong môi trường

agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nếu các hợp chất trong cây có khả năng tiêu

diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Kết quả

được xác định dựa trên đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh các giếng thạch

đã được đục lỗ và bơm dịch chiết trước đó. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

đối với 9 chủng chỉ thị cho thấy rằng dịch chiết từ Muntingia calabura thể hiện hoạt

tính đối kháng 6 trên 9 chủng vi sinh vật với 1 chủng E.coli (hình 3.18), 2 chủng

Shigella (hình 3.19), 2 chủng Listeria và Staphylococcus aureus (hình 3.20).

73

E.coli-ETEC

a

ETEC

c

mm

0

5

10

15

20

25

30

AMC

EMC90

EMC70

Ciprofloxacin (125 μg/ml)

b

(100 mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC.

Hình 3.18. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC

Trong số 2 chủng E.coli khảo sát thì chỉ có có dịch chiết EMC70 và EMC90

thể hiện hoạt tính ức chế đối với chủng E.coli-ETEC. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch

chiết EMC70 (11,00±0,87 mm) tốt hơn so với dịch chiết EMC90 (8,00±0,50) nhưng

đều thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin 125 µg/ml trên cùng chủng E.coli-ETEC.

Chủng Shigella

S.boydii

b 1 a

S.flexneri

mm

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

AMC

EMC90

EMC70

Ciprofloxacin (500 μg/ml)

a b

Hình 3.19. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC (100

mg/ml) đối với chủng Shigella flexneri và Shigella boydii.

74

Đối với chủng Shigella flexneri dịch chiết EMC90 100 mg/ml và đối chứng

ciprofloxacin 500 µg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn như nhau và không có sự

khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê (P>0,05). Dịch chiết EMC70 tuy khả năng ức chế

đối với Shigella flexneri thấp hơn so với EMC90 và đối chứng ciprofloxacin nhưng

lại thể hiện khả năng kháng khuẩn ở mức khá đối với với chủng Shigella boydii

(11,17±0,29 mm) trong khi các dịch chiết còn lại là EMC90 và AMC, thậm chí là đối

chứng ciprofloxacin 500 µg/ml đều không thể hiện hoạt tính trên chủng này. Dịch

chiết EMC70 (11,17±0,29 mm) có hoạt tính kháng khuẩn tương đương với dịch chiết

ethanol của Crataegus pinnatifida (11 mm) trong nghiên cứu của Lee và ctv (2002)

tại nồng độ 100 mg/ml. Đối với chủng Shigella boydii và thấp hơn (10 mm) so với

EMC90 (14,33±0,29) đối chủng Shigella flexneri trong cùng nghiên cứu cũng tại

nồng độ 100 mg/ml. Một nghiên cứu khác cũng trên chủng Shigella flexneri lần này

là của Kim và ctv (2005), trong nghiên cứu này dịch chiết ethanol từ cây Terminalia

chebula (16 mm) có hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn so với EMC70 (11,83±1,04) ở

cùng nồng độ 100 mg/ml.

Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC (100

mg/ml) đối với các chủng vi sinh vật khác

Dịch chiết

Chủng vi khuẩn Ciprofloxacin EMC70 EMC90 AMC 500 µg/ml

S. aureus 13,33±0,76c 11,33±0,29e 0 12,17±0,29de

L. innocua 17,00±0,50a 16,50±0,50a 11,00±0,71e 12,00±0,50de

L. monocytogenes 12,00±0,50de 12,83±0,29cd 14,67±0,58b 12,17±0,29de

EMC70 và EMC90 tiếp tục thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên phổ rộng đối

với cả 3 chủng Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes và Listeria innocua.

Đối với chủng Staphylococcus aureus dịch chiết EMC90 có hoạt tính kháng khuẩn

tương đương với đối chứng ciprofloxacin. Trong nghiên cứu của Amjad Khail (2013)

dịch chiết ethanol từ cây lá cây Ocimum basilicum tại nồng độ 100 mg/ml có hoạt

75

tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus (9 mm) thấp hơn so với EMC70

(13,33±0,76 mm) và EMC90 (11,33±0,29 mm) ở cùng nồng độ. Dịch chiết EMC70

100 mg/ml có khả năng ức chế Staphylococcus aureus cao hơn so với đối chứng

ciprofloxacin 500 µg/ml trong khi AMC không có hoạt tính kháng khuẩn. Listeria

innocua tỏ ra nhạy cảm với 2 loại dịch chiết EMC70 (17,00±0,50 mm) và EMC90

(16,50±0,50 mm), AMC thể hiện khả năng kháng tương đương với đối chứng

ciprofloxacin và thấp hơn so với EMC70 và EMC90. Dịch chiết AMC tuy không thể

hiện khả năng kháng trên phổ rộng nhưng lại thể hiện khả năng kháng đặc hiệu đối

với Listeria monocytogenes (14,67±0,58 mm). Hoạt tính kháng khuẩn của EMC70

và EMC90 tương đương so với đối chứng ciprofloxacin cũng trên cùng chủng Listeria

monocytogenes.

Bảng 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn từ cây Muntingia calabura tại nồng độ 100

mg/ml

STT Chủng vi khuẩn EMC70 EMC90 AMC

E.coli-ETEC 11,00±0,87e 8,00±0,50f 0 1

Shi. Flexneri 11,83±1,04de 14,33±0,29b 0 2

Shi. Boydii 11,17±0,29e 0 0 3

S. aureus 13,33±0,76bc 11,33±0,29e 0 4

L. innocua 17,00±0,50a 16,50±0,50a 11,00±0,71e 5

L. monocytogenes 12,00±0,50cde 12,83±0,29cd 14,67±0,58b 6

76

B A

D C

Hình 3.20. A. Hoạt tính kháng khuẩn của EMC90 (100 mg/ml) đối với chủng

Shigella flexneri, B. AMC (100 mg/ml) đối với chủng Listeria monocytogenes, C.

EMC70 (100 mg/ml) đối với chủng E.coli-ETEC, D. EMC70 (100 mg/ml) đối với

chủng Staphylococcus aureus.

Dịch chiết EMC70 và EMC90 100 mg ml có khả năng kháng khuẩn khá tốt

6 trong số 9 chủng vi sinh vật chỉ thị, 2 loại dịch chiết này có phổ kháng khuẩn rộng

đặt biệt là EMC70 kháng được cả 6 chủng E.coli-ETEC, Shigella flexneri, Shigella

boydii, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes và kháng đặc hiệu với

Listeria innocua (17,00±0,50 mm). Dịch chiết AMC 100 mg/ml tuy chỉ có phổ ức

chế thấp với 2 chủng Listeria monocytogenes và Listeria innocua nhưng lại kháng

đặc hiệu đối với chủng Listeria monocytogenes. Trong nghiên cứu của Zakaria và ctv

(2006), dịch chiết methanol của cây Muntingia calabura có hoạt tính kháng khuẩn

đối với chủng E.coli, trong khi dịch chiết chloroform không có khả năng kháng khuẩn

trên chủng Listeria monocytogenes điều mà dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC đều

làm rất tốt. Kết quả này khẳng định các dịch chiết khác nhau trong cùng một cây chứa

mỗi loại hợp chất kháng khuẩn tự nhiên khác nhau, chúng phụ thuộc vào từng loại

dung môi có khả năng lôi kéo các nhóm hợp chất kháng khuẩn khác nhau.

3.5.2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết EMC70, EMC90 và AMC

77

3.5.2.1. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết EMC70

Tương tự như xác định hoạt tính kháng khuẩn, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

được xác định dựa trên vòng kháng khuẩn ở các giếng thạch đã được đục lỗ và bơm

dịch chiết ở những nồng độ khác nhau dựa trên các chủng vi khuẩn đã kháng trước

đó ở phần xác định hoạt tính kháng khuẩn nhằm để xác định được khoảng nồng độ

ức chế vi sinh vật tối thiểu. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC được xác định dựa trên kết

qua bảng 3.11. Đối với 9 chủng vi sinh vật chỉ thị chỉ số MIC của 3 loại dịch chiết

khảo sát từ 100 mg/ml tới 12,50 mg/ml. Trong đó nồng độ ức chế tối thiểu của dịch

chiết EMC70 đối với chủng E.coli-ETEC và Shigella flexneri nằm trong khoảng 50

mg/ml tới 25 mg/ml. Đối với Shigella boydii và Listeria innocua trong khoảng 100

mg/ml đến 50 mg/ml. Đối với chủng Staphylococcus aureus và Listeria

monocytogenes trong khoảng 25 mg/ml đến 12,50 mg/ml.

Bảng 3.11. Nồng độ ức chế tối thiểu EMC70 ở các nồng độ 50 mg/ml; 25 mg/ml;

12,50 mg/ml

EMC70 Chủng vi khuẩn 50 mg/ml 25 mg/ml 12,50 mg/ml

E.coli-ETEC 8,33± 1,04hi 0 0

Shigella flexneri 8,83± 1,04h 0 0

Shigella boydii 0 0 0

Staphylococcus 10,67± 0,29g 7,17± 0,29i 0 aureus

Listeria innocua 0 0 0

Listeria 8,83± 0,58h 7,17± 0,29i 0 monocytogenes

3.5.2.2. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết EMC90

Bảng 3.12. Nồng độ ức chế tối thiểu EMC90 ở các nồng độ 50 mg/ml; 25 mg/ml;

12,50 mg/ml

78

EMC90 Chủng vi khuẩn 50 mg/ml 25 mg/ml 12,50 mg/ml

E.coli-ETEC 8,67± 0,29h 7,50± 0,29i 0

Shigella flexneri 12,33± 0,76def 8,67± 0,29h 0

Shigella boydii 0 0 0

Staphylococcus 7,76± 0,29hi 0 0 aureus

Listeria innocua 0 0 0

Listeria 10,83± 0,29g 8,17± 0,76hi 0 monocytogenes

Nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết EMC90 đối với chủng E.coli-ETEC,

Shigella flexneri và Listeria monocytogenes trong khoảng 25 mg/ml đến 12,50

mg/ml. Đối với chủng Shigella boydii và Listeria innocua trong khoảng 100 mg/ml

đến 50 mg/ml. Đối với chủng Staphylococcus aureus nằm trong khoảng 50 mg/ml tới

25 mg/ml.

3.5.2.3. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết AMC

Bảng 3.13. Nồng độ ức chế tối thiểu AMC ở các nồng độ 50 mg/ml; 25 mg/ml; 12,50

mg/ml

AMC Chủng vi khuẩn 50 mg/ml 25 mg/ml 12,50 mg/ml

E.coli-ETEC 0 0 0

Shigella flexneri 0 0 0

Shigella boydii 0 0 0

Staphylococcus 0 0 0 aureus

Listeria innocua 0 0 0

Listeria 0 12,00± 0,50defg 8,33± 0,58hi monocytogenes

79

Nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết AMC đối với chủng L. innocua trong

khoảng 100 mg/ml đến 50 mg/ml. Đối với chủng Listeria monocytogenes nằm trong

khoảng 25 mg/ml đến 12,50 mg/ml.

Kết quả cho thấy chủng Listeria monocytogenes một chủng vi khuẩn có nhiều

trong thịt và các sản phẩm từ sữa gây ra một số biểu hiện rối loạn tiêu hóa, đặc biệt

là dễ gây sảy thai đối với phụ nữ mang thai. Listeria monocytogenes khá nhạy đối với

3 loại dịch chiết từ cây Muntingia calabura có thể do Listeria monocytogenes chịu

tác động bởi các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn có nhiều trong lá cây Muntingia

calabura cụ thể là nhóm flavonoid, phenolic và tannin. Dịch chiết EMC90 cũng cho

thấy tiềm năng điều trị một số bệnh liên quan tới rối loạn tiêu hóa gây ra bởi một số

chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Shigella flexneri và Listeria monocytogenes khi

cho nồng độ ức chế tối thiểu trong khoảng 25 mg/ml đến 12,50 mg/ml. Dịch chiết

AMC nhìn chung có hoạt tính kháng khuẩn không cao chỉ có khả năng kháng lại 2

chủng Listeria. Điều này cho thấy các chủng Listeria nhạy với các thành phần có

nhiều trong dịch chiết AMC đặc biệt là tannin và saponin. Kết quả cũng cho thấy

EMC70 và EMC90 vẫn duy trì được phổ hoạt động mạnh tại các nồng độ 50 mg/ml

và 25 mg/ml. Điều cho thấy các thành phần flavonoid và phenolic cho tiềm năng

kháng khuẩn tốt tồn tại trong dịch chiết EMC70 và EMC90.

3.6. Độc tính cấp diễn

Tỷ lệ sống của chuột sau khi uống EMC70, EMC90 và AMC ở nồng độ 3000

mg/kg sau 120 giờ khảo sát không có sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng. Về

hình dáng bên ngoài, màu sắc lông không bị thay đổi và không có dấu hiệu của sự

rụng lông khi so sánh với đối chứng. Về hoạt động của chúng, trong thời gian 12 giờ

sau khi uống thuốc một số con tỏ ra hung hăng hơn, tuy nhiên hiện tượng này không

kéo dài và chuột vẫn hoạt động bình thường sau 24, 48, 72, 96 và 120 giờ theo dõi.

Về hoạt động ăn uống, bài tiết, chuột vẫn ăn uống, bài tiết và tăng cân bình thường.

Không thấy xuất hiện phân lỏng và cũng không có bất kỳ dấu hiệu ngộ độc nào xảy

ra trên chuột.

80

Thông qua các chỉ số đánh giá các dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC từ lá

cây Muntingia calabura ở nồng độ 3000 mg/kg là an toàn trên chuột theo đường

uống.

3.7. Khả năng điều hòa đường huyết trên mô hình chuột tiểu đường cấp tính

Khả năng điều hòa đường huyết của lá cây Muntingia calabura được xác

định thông qua chỉ số đường huyết của các nhóm chuột được cho uống 3 loại dịch

chiết từ lá cây, kết quả được so sánh với đối chứng glibenclamide 10 mg/kg.

Chỉ số đường huyết

mmol/L

12.00

10.00

8.00

6.00

4.00

2.00

0.00

100 mg/kg

150 mg/kg

200 mg/kg

EMC70 EMC90 AMC Đường ĐC Glibenclamide (10 mg/kg)

ab a a a ab b bc bc ecd bcd ed ef f f f f f f

đường, đối chứng và glibenclamide 10 mg/kg

Hinh 3.21. Chỉ số đường huyết của các nhóm chuột uống dịch chiết, nhóm tăng

Ở nồng độ 100 mg/kg, các nhóm chuột ở nhóm uống dịch chiết EMC70 và

AMC cho kết quả đường huyết tương đương với nhóm đối chứng chỉ uống đường,

tại nồng độ này chỉ có nhóm uống dịch EMC90 (8,14±0,83 mmol/L) thể hiện chỉ số

đường huyết thấp hơn so với nhóm chỉ uống đường. Ở nồng độ 150 mg/kg cả 3 nhóm

uống dịch EMC70, EMC90 và AMC đều cho kết quả tương đương nhau lần lượt là

8,33±0,44 mmol/L; 7,71±0,46 mmol/L và 8,20±0,48 mmol/L. Tại nồng độ này cả 3

dịch chiết vẫn còn cho ra kết quả đường huyết cao hơn so với đối chứng glibenclamide

10 mg/kg, đặc biệt là dịch chiết EMC90 đóng vai trò tiềm năng trong việc điều hòa

đường huyết vẫn còn cao hơn đối chứng glibenclamide khoảng 1,39 lần. Tại nồng độ

81

200 mg/kg dịch chiết EMC90 có chỉ số đường huyết (mmol/L) tương tự so với đối

chứng glibenclamide 10 mg/kg và đạt được chỉ số tương đồng với nhóm chuột bình

thường (hình 3.21). Có thể thấy được Muntingia calabura có tiềm năng trong việc

điều hòa đường huyết trên chuột thông qua dịch chiết EMC90 tại 200 mg/kg.

So với các nghiên cứu trước đó thì Muntingia calabura có khả năng điều hòa

đường huyết ở mức trung bình. Trong báo cáo của Joy và Kuttan (1999) dịch chiết

methanol 75% từ cây Picrorrhiza kurroa tại nồng độ 150 mg/kg cho khả năng điều

hòa đường huyết (5,58±0,19 mmol/L) tốt với dịch chiết EMC90 tại nồng độ 200

mg/kg.

Người ta phát hiện ra rằng các loại thuốc được sử dụng trong bệnh tiểu đường

ở người cũng có một hoạt động chống oxy hoá đáng kể. Có thể những chất chiết xuất

này có thể làm giảm tác động của sự giải phóng chất gây viêm cytokine trong suốt

thời kỳ tiểu đường có thể là một trong những tác nhân gây ra sự rối loạn chức năng

mô và gây cản trở hoạt động của insulin (Saghizadeh và ctv, 1996).

Dựa và kết quả định tính định lượng cũng như một số nghiên cứu khác có thể

phần nào giải thích khả năng điều hòa đường huyết của Muntingia calabura là do hợp

chất polyphenol. Polyphenol có thể ảnh hưởng đến đường huyết thông qua các cơ chế

khác nhau, bao gồm sự ức chế sự hấp thụ glucose trong ruột. Trong một báo cáo của

Matsui và ctv (2002), nhóm đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết của

polyphenol với nguồn đường được sử dụng là mantose mà không sử dụng sucrose

hoặc glucose. Điều này cho thấy những ảnh hưởng của polyphenol là do ức chế

enzyme α-glucosidase trong niêm mạc ruột. Sự ức chế α-amylase và sucrase ở chuột

khi dùng catechin ở liều khoảng 50 mg/kg cũng được quan sát thấy trong nghiên cứu

trên. Sự ức chế glycosidase đường ruột và vận chuyển glucose bằng polyphenol đã

được nhắc tới trong nghiên cứu của Matsui và ctv (2001). Quercetin được biết là có

hoạt động chống tiểu đường mạnh, nghiên cứu của Rizvi và Mishra (2009) cho thấy

quercetin có khả năng bảo vệ bệnh nhân trong giai đoạn stress oxi hóa khỏi các biến

82

chứng của bệnh tiểu đường. Ngoài ra nhóm hợp chất saponin còn làm gián đoạn việc

vận chuyển glucose từ dạ dày tới ruột non (Dembinska và ctv, 2008).

3.8. Khả năng trị tiêu chảy trên mô hình castor oil

Để đánh giá được hiệu quả trị tiêu chảy của lá cây Muntingia calabura, 3 loại

dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC được sử dụng. Dựa vào các dấu hiệu lâm sàng

về thời gian và lượng phân tiêu chảy của các nhóm thử và nhóm đối chứng tiêu chảy

từ đó suy ra được tỷ lệ ức chế tiêu chảy. Kết quả được trình bày ở hình 3.22 và hình

3.23

Tỷ lệ ức ức chế tiêu chảy (%)

%

100

80

b

b

a a a a

60

40

c cd cd d d

20

0

750 mg/kg

500 mg/kg

250 mg/kg

EMC70

EMC90

AMC

Loperamide 3 mg/kg

e

Hình 3.22. Tỷ lệ ức chế tiêu chảy

Kết quả trên cho thấy, ở nồng độ dịch chiết càng cao thì khả năng ức chế tiêu

chảy càng tăng. Ở nồng độ 750 mg/kg, các con chuột có tỷ lệ tiêu chảy tương đương

với đối chứng loperamide 3 mg/kg (hình 3.22). Từ nồng độ 750 mg/kg xuống 500

mg/kg thì tỷ lệ ức chế tiêu chảy EMC70 giảm mạnh từ 79,99±5,41% xuống còn

51,17±2,03%. EMC90 tuy có khả năng điều hòa đường huyết tốt nhưng lại cho kết

quả không thật sự tốt cũng như là kém nhất trong trong số 3 loại dịch chiết về khả

năng điều trị tiêu chảy, cụ thể là tại nồng độ 750 mg/kg nhóm chuột uống dịch EMC90

có tỷ lệ ức chế tiêu chảy là 43,11±8,00% kém khoảng 1,86 lần so với nhóm được

83

uống dịch EMC70, con số này tiếp tục giảm mạnh xuống còn 18,93±9,46% tại nồng

độ 250 mg/kg nhỏ hơn gấp 2,23 lần so với dịch EMC70 ở cùng nồng độ. Nhóm uống

dịch chiết AMC gần như không có sự thay đổi tỷ lệ ức chế tiêu chảy đáng kể ở cả 3

nồng độ, ở nồng độ 250 mg/kg và 500 mg/kg, nhóm uống dịch chiết AMC cho kết

quả tương đương với tỷ lệ ức chế tiêu chảy của dịch EMC70 tại cùng nồng độ và

đồng thời cũng thấp hơn đối chứng loperamide 3mg/kg.

Thời gian tiêu chảy

a

a

a

ab

bc

cd

cd

cd

fg

de

ef

cd

g

g

g

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

750 mg/kg

500 mg/kg

250 mg/kg

EMC70

EMC90

AMC

Loperamide 3 mg/kg

Tiêu chảy

Phút

Hình 3.23. Thời gian tiêu chảy

Thời gian tiêu chảy giữa các nghiệm thức được thể hiện ở hình 3.23, nhìn

chung thời gian càng tăng khi tăng nồng độ các dịch chiết trong đó EMC70 tiếp tục

thể hiện tiềm năng điều trị tiêu chảy tốt ở nồng độ 750 mg/kg. Kết quả thực nghiệm

cho thấy thời gian bắt đầu xuất hiện những triệu chứng tiêu chảy ở EMC70 lâu hơn

cũng như thời gian kéo dài triệu chứng bệnh ngắn hơn so với nhóm đối chứng chỉ

uống DMSO 1% khoảng 43,25%.

Tuy sự ức chế tiêu chảy của dịch chiết AMC cho khả năng ức chế thấp hơn

so với EMC70 nhưng khi xét về thời gian xảy ra tiêu chảy thì AMC cho thời gian

biểu hiện tiêu chảy tương đương với EMC70 tại cả ba nồng độ 250 mg/kg, 500 mg/kg

và 750 mg/kg (hình 3.23).

84

Dịch chiết EMC70 tại nồng độ 250 mg/kg cho khả năng điều trị tiêu chảy

tương đương với dịch chiết ethanol của cây Paederia foetida L. (tỷ lệ ức chế 40,52

%) ở cùng nồng độ trong nghiên cứu của Afroz và ctv (2006), nhưng thời gian bắt

đầu tiêu chảy của dịch chiết ethanol từ cây Paederia foetida L. lại ngắn hơn

(49.67±6.31 phút) so với EMC70 thí nghiệm được so sánh trên cùng mô hình castor

oil. Trong nghiên cứu của Asish và ctv (1999) dịch chiết ethanol của cây Punica

granatum cũng có khả năng ức chế tiêu chảy khá tốt khi tại nồng độ 600 mg/kg khả

năng ức chế lên tới 75,40 % trong khi với dịch chiết EMC70 để đạt được tỷ lệ ức chế

79,99±5,41% thì cần được chuột hấp thụ ở nồng độ 750 mg/kg. Trong nghiên cứu

của Dosso và ctv (2012) dịch chiết ethanol của cây Piliostigma reticulatum tại nồng

độ 500 mg/kg có tỷ lệ ức chế tiêu chảy 49,47% tương đương với dịch chiết AMC

48,46±1,27% cũng tại nồng độ 500 mg/kg.

Khả năng trị tiêu chảy của các hợp chất flavonoid đã được chứng minh là do

việc ức chế sự chuyển động của dịch ruột và làm cân bằng hệ điện giải K+ và Na+ (Di

Carlo và ctv, 2005). Những thí nghiệm trên mô hình động vật đã phần nào chỉ ra rằng

flavonoid có tác động chống lại sự đáp ứng tiết dịch ruột bao gồm các chất nhầy và

men tiêu hóa (Sanchez và ctv, 1997). Đồng thời các hợp chất này cũng đóng vai trò

ức chế sự giải phóng của hợp chất prostaglandin và autocoid vì vậy làm giảm nhu

động ruột từ đó dẫn tới việc ức chế tiêu chảy do castor oil gây ra (Vimala và ctv,

1997). Ngoài ra, tannin cũng làm ức chế sự tiết các hormon tiêu hóa (enterokrinin,

duokrinin) của niêm mạc ruột làm giảm bài tiết dịch ruột từ đó làm giảm nhu động

ruột dẫn tới ức chế quá trình tiêu chảy (Atta và Mouneir, 2005). Điều này cũng hợp

lý với kết quả định lượng hàm lượng tannin (bảng 3.3) trong đó hàm lượng tannin

cao nhất và thấp nhất lần lượt là EMC70 (4,98±1,12 mg CE/g) và EMC90 (0,78±0,17

mg CE/g). Điều này có thể giải thích nguyên nhân vì sao dịch chiết EMC70 có hàm

lượng flavonoid tổng số cao nhất (90,94±2,12 mg RE/g) trong số 2 loại dịch chiết còn

lại lại có thể cho kết quả điều trị tiêu chảy tốt nhất, tiếp sau đó là AMC (35,48±1,23

mg RE/g) cũng có kết quả trị liệu tiêu chảy tốt hơn so với EMC90 (20,25±1,39 mg

RE/g). Nhưng điều này cũng không đồng nghĩa với việc những dịch chiết từ bất kỳ

85

loại cây nào có chứa hàm lượng flavonoid cao cũng đều có khả năng trị tiêu chảy tốt,

chúng còn bị ảnh hưởng bởi từng nhóm hợp chất cụ thể trong cả nhóm flavonoid lớn,

mỗi một loại chất có tác động khác nhau cũng như việc điều hòa nhu động ruột khác

nhau trên từng cá thể cũng rất khác nhau. Chính vì vậy khi xét về khía cạnh trị liệu,

một hợp chất có khả năng trị liệu tốt đối với một nguyên nhân gây bệnh này nhưng

lại kém hơn so với một nguyên nhân gây bệnh khác; cụ thể là trong báo cáo của Afroz

và ctv (2006) dịch chiết ethanol của cây Paederia foetida tuy có khả năng ức chế tiêu

chảy trên mô hình magnesium sulphate rất tốt với khả năng ức chế lên tới 92,64%

trong khi đối với mô hình castor oil thì dịch chiết này chỉ có khả năng ức chế tiêu

chảy là 82,80% tại nồng độ 500 mg/kg, ở chiều ngược lại dịch chiết ethanol từ cây

Dalbergia lanceolaria trong nghiên cứu của Mujumdar và ctv (2005) có khả năng ức

chế tiêu chảy 62,09% trên mô hình castor oil và 57,50% trên mô hình magnesium

sulphate tại nồng độ 400 mg/kg.

3.9. Khả năng giải độc gan trên mô hình acetaminophen

Mô hình gây độc gan dựa trên cơ chế gây độc của acetaminophen khi có mặt

tác nhân gây độc acetaminophen trong cơ thể một phần sẽ được đào thải ra ngoài cơ

thể thông qua nước tiểu dưới dạng sulfate và glucuronide, phần còn lại đi vào gan và

được cytochrome P450 chuyển hóa acetaminophen thành chất gây độc N-acetyl-p-

benzoquinone imine (NAPQI). Các thành phần này bao gồm những chất độc và một

số các gốc oxi hóa tự do phá hủy tế bào gan làm men gan tăng cao, các chất có hoạt

tính sinh học trong nhóm silymarin và trong dịch chiết cây Muntingia calabura có

khả năng kích thích tế bào gan sản sinh ra glutathione để trung hòa các chất độc và

thải ra ngoài cơ thể thông qua việc kích thích tăng tổng hợp RNA polymerase I, các

chất có trong dịch chiết cũng đồng thời đóng vai trò là chất chống oxi hóa tốt giúp

ngăn chặn các tác nhân oxi hóa gây tổn thương tế bào gan.

ALT AST đóng vai trò quan trọng trong hoạt động trao đổi chất. Chúng xúc

tác phản ứng chuyển hóa L-alanine và L-aspartate thành pyruvate, oxaloacetate và L-

glutamate. AST hiện diện trong bào tương và ty thể của tế bào, AST còn có ở thận,

86

não, tụy, phổi, bạch cầu và hồng cầu. ALT hiện diện chủ yếu ở bào tương của tế bào

gan cho nên sự tăng ALT nhạy và đặc hiệu hơn AST trong việc chẩn đoán các bệnh

về gan. Chỉ số men gan ALT và AST tăng chứng tỏ tế bào gan bị tổn thương.

ALT

600.00

IU/L

a

a

500.00

400.00

a

300.00

b c c d d

200.00

100.00

0.00

15 mg/kg

25 mg/kg

50 mg/kg

EMC70 EMC90 AMC Sylimarin 15 mg/kg Độc Đối chứng

e f f g g g g g g g

Hình 3.24. Chỉ số men gan ALT của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70,

EMC90, AMC, sylimarin 15 mg/kg, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng

Kết quả dựa theo kết quả đo chỉ số đo men gan ALT cho thấy dịch chiết

EMC70 (48±9 U/I) tại nồng độ 50 mg/kg cho khả năng giải độc gan tương đương với

đối chứng sylimarin ở cùng nồng độ. Cũng tại nồng độ 50 mg/kg dịch chiết AMC

(91±9 U/I) cũng cho kết quả tốt sau dịch chiết EMC70 và cuối cùng là dịch chiết

EMC90.

Đối với kết quả chỉ số men gan AST của 3 dịch chiết từ lá cây Muntingia

calabura thì EMC70 tiếp tục làm giảm chỉ số men gan tốt nhất với 2 loại dịch chiết

còn lại nhưng vẫn thấp hơn so với đối chứng sylimarin tại cả 3 nồng độ. Tại nồng độ

50 mg/kg kết quả chỉ số men gan của nhóm chuột dùng dịch chiết EMC70 vẫn còn

cho chỉ số men gan AST cao hơn khoảng 1,75 lần so với đối chứng sylimarin cùng

nồng độ. Dịch chiết EMC90 cho kết quả không thực sự tốt trong việc điều trị tăng

men gan, tại nồng độ 25 mg/kg kết quả chỉ số men gan AST của dịch chiết EMC90

tương đương không có khác biệt về mặt thống kê so với nhóm chuột không điều trị.

87

AST

900.00

IU/L

800.00

700.00

a a a a a b

600.00

500.00

400.00

c d d

300.00

e e f

200.00

100.00

0.00

15 mg/kg

25 mg/kg

50 mg/kg

EMC70

EMC90 AMC

Sylimarin 15 mg/kg Độc Đối chứng

g g g h h h

EMC90, AMC, sylimarin 15 mg/kg, nhóm tăng men gan và nhóm chuột đối chứng

Hình 3.25. Chỉ số men gan AST của các nhóm chuột uống dịch chiết EMC70,

Nhìn chung, kết quả giải độc gan trên mô hình acetaminophen của EMC70

là tốt nhất, tiếp theo là AMC và cuối cùng là EMC90. Điều này cũng được giải thích

bởi kết quả định lượng phenolic và flavonoid khi đa số các thành phần có khả năng

giải độc gan là những thành phần cho khả năng chống oxi hóa tốt thuộc nhóm

phenolic và flavonoid trong khi kết quả định lượng phenolic và flavonoid của 3 loại

dịch chiết trong cây Muntingia calabura cũng theo thứ tự giảm dần là EMC70, AMC

và EMC90. So với các nghiên cứu khác, dịch chiết EMC70 có khả năng làm giảm chỉ

số men gan ALT (IU/L) khá tốt, tương đương với đối chứng sylimarin ở cùng nồng

độ 15 mg/kg. Trong khi dịch chiết methanol từ lá cây Adansonia digitata trong nghiên

cứu của Abeer và ctv (2016) để làm được điều này thì cần phải tăng nồng độ dịch

chiết lên 200 mg/kg.

Trong nghiên cứu của Yahya và ctv (2013) dịch chiết methanol của cây

Bauhinia purpurea tại nồng độ 25 mg/kg cho kết quả chỉ số ALT (IU/L) giảm khoảng

1,40 lần so với nhóm chuột gây độc với acetaminophen, còn đối với kết quả chỉ số

AST (IU/L) thì dịch chiết này cũng cho thấy khả năng làm giảm men gan lên tới 1,24

88

lần so với nhóm gây độc, trong khi EMC70 tại nồng độ 25 mg/kg cho hiệu quả giảm

men gan lên tới 3,89 lần đối với chỉ số ALT (IU/L) và giảm 2,62 lần đối với AST

(IU/L) so với nhóm chuột gây độc bằng acetaminophen. Dịch chiết chloroform (250

mg/kg) từ cây Ichnocarpus frutescens trong nghiên cứu của Deepak và ctv (2007)

cho kết quả bảo vệ gan với chỉ số men gan AST khá tốt so với dịch chiết AMC (50

mg/kg), đặc biệt là kết quả của cả 2 chỉ số men gan AST và ALT đều rất ổn định và

tương đương nhau, đối với cả dịch chiết methanol cũng cùng nghiên cứu trên.

Trong nghiên cứu của Majid và ctv (2015) cho rằng các hợp chất có khả năng

bảo vệ gan bao gồm curcumin (polyphenol), silymarin (flavonoid),

neoandrographolide, andrographolide (flavonoid), picroside (glycoside), kutkoside

(glycoside), và glycyrrhizin (glycoside), betalain (glycoside), phyllanthin (lignin),

hypophyllanthin (lignin). Đa số các nhóm hợp chất trên nằm trong phân nhóm

polyphenol, flavonoid và glycoside. Điều này phần nào giải thích được hoạt tính bảo

vệ gan của EMC70 là tốt nhất khi mà kết quả định lượng polyphenol và flavonoid chỉ

ra rằng dịch chiết EMC70 và AMC chiếm phần hơn, AMC dịch chiết giàu glucoside

có hoạt tính bảo vệ gan đứng sau EMC70 lại có hàm lượng trích ly dịch chiết tốt nhất

nhưng đa số hoạt tính sinh học đều thấp hơn so với EMC70. Điều này một lần nữa

cho thấy hàm lượng dịch chiết cao không quyết định tới hoạt tính sinh học của dịch

chiết đó trên cùng một cây. Hoạt tính sinh học chỉ chịu ảnh hưởng bởi số lượng các

hợp chất có hoạt tính sinh học được lôi kéo vào dung môi trích ly. Các hợp chất có

hoạt tính sinh học đa số thuộc nhóm polyphenol, flavonoid, chúng đồng thời cũng có

khả năng chống oxi hóa tốt. Trong trường hợp của sylimarin, hợp chất này thuộc

nhóm flavonoid, không những có khả năng bảo vệ gan bằng cách làm tăng chỉ số

glutathion ở gan giúp chúng gắn với những độc tố và đẩy chúng ra khỏi cơ thể mà

còn tạo ra một lớp bảo vệ chống oxi hóa góp phần bảo vệ và giúp gan tái tạo tốt hơn

(Nancy và ctv, 2014). Các nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học khác tồn tại bên trong

dịch chiết EMC70 và AMC cũng có cơ chế hoạt động tương tự hoặc theo một cách

khác nhưng nhìn chung, hoạt tính chống oxi hóa đóng góp một phần không nhỏ trong

89

việc tăng cường khả năng bảo vệ gan cũng như quyết định một số hoạt tính sinh học

của một số hợp chất.

3.10. Phân tích sắc kí HPLC-MS

Trong các hoạt tính sinh học khảo sát bao gồm hoạt tính kháng khuẩn, khả

năng điều hòa đường huyết, khả năng ức chế tiêu chảy và khả năng giải độc gan thì

dịch chiết EMC70 đều cho kết quả tốt nhất. Vì vậy, để có thể hiểu rõ hơn cũng như

giải thích được nguyên nhân dẫn đến kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của dịch

chiết EMC70 tốt nhất và dịch chiết này mang những nhóm hợp chất nào, có hoạt tính

sinh học ra sao. Dịch chiết EMC70 được tiến hành định tính một số hợp chất bằng

phương pháp sắc kí cao áp ghép khối phổ (HPLC/MS).

Các hợp chất được xác định nhờ phương pháp HPLC-MS được so sánh với

dữ liệu chuẩn trên phần mềm Bruker 4.0. Hướng tới một số chất trong cây được trình

bày trong bảng 3.14 bao gồm một số thành phần phenolic cũng như flavonoid trong

dịch chiết ethanol từ lá cây Muntingia calabura đã được xác định bằng HPLC-MS,

thiết bị phân tích TOF-time of Fly cho kết quả độ sai lệch Mass ± 0,005 Da. Sắc ký

đồ HPLC-MS của dịch chiết ethanol lá cây Muntingia calabura được trình bày ở hình

3.26

Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số hợp chất trong dịch chiết EMC70 từ cây

Muntingia calabura bằng phương pháp sắc ký HPLC-MC

Công thức Mũi Rt MS (m/z) Đơn vị Định danh phân tử

2 3,70 301,07 Chrysoeriol Da C16H13O6

3 3,90 331,08 3,8-Dimethylherbacetin Da C17H15O7

2,3-dihydroxy-4,3’,4’,5’- 4 4,00 363,15 Da C19H23O7 tetramethoxydihydrochalcone

5 323,06 Da 8-Methoxygalangin 4,40 C16H12NaO6

90

(2S)-7,8,3',4',5'- 10 11,10 333,14 Da C18H21O6 pentamethoxyflavan

Hình 3.26. Sắc ký đồ HPLC-MS dịch chiết EMC70 từ lá cây Muntingia calabura

Ở thời điểm Rt 3,70 phút xác định được m/z 301,07 so sánh với dữ liệu hướng

tới thành phần này là Chrysoeriol (Mahmood và ctv 2014).

Ở thời điểm Rt 3,90 phút xác định được m/z 331,08 so sánh với dữ liệu hướng

tới thành phần này là 3,8-Dimethylherbacetin (Mahmood và ctv 2014).

Ở thời điểm Rt 4,00 phút xác định được m/z 363,15 so sánh với dữ liệu hướng

tới thành phần này là 2,3-dihydroxy-4,3’,4’,5’-tetramethoxydihydrochalcone (Chen

và ctv 2007).

Ở thời điểm Rt 4,40 phút xác định được m/z 323,06 so sánh với dữ liệu hướng

tới thành phần này là 8-Methoxygalangin (Sufian và ctv 2013).

91

Ở thời điểm Rt 11,10 phút xác định được m/z 333,14 so sánh với dữ liệu

hướng tới thành phần này là (2S)-7,8,3',4',5'-pentamethoxyflavan (Chen và ctv 2007).

Tuy đã xác định được một số chất ở những thời điểm khác nhau nhưng tại

một số thời gian lưu khác không tìm được dữ liệu khối phổ MS tương tự để xác định.

Do đó những chất ở các thời điểm Rt khác đều không được định danh.

Chrysoeriol một flavonoid được cho là có khả năng giúp tế bào tạo xương

chống lại các tác nhân oxi hóa (Kim và ctv 2010). Chrysoeriol cùng với một số chất

chiết xuất khác thuộc nhóm flavonoid có khả năng bảo vệ gan bị nhiễm độc (Amani

và ctv 2006). Trong một nghiên cứu khác chrysoeriol còn có khả năng kháng khuẩn

khá tốt hơn hẳn so với capsaicin và dihydrocapsaicin trên 3 chủng vi khuẩn

Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus (Patrícia và ctv 2014).

Chrysoeriol còn cho thấy hiệu quả trong việc chữa trị bệnh liên quan tới mỡ trong

máu cũng như tác dụng tốt trong việc điều trị bệnh tiểu đường ở chuột gây ra bởi tác

nhân streptozotocin (Krishnan và ctv 2015).

8-Methoxygalangin (3,5,7-trihydroxy-8-methoxyflavone) được chiết xuất từ

phân đoạn petroleum ether của dịch chiết tổng methanol từ cây Muntingia calabura

có khả năng chống lại tế bào ung thư bạch cầu với IC50 = 40,53 ± 3,61(µg/ml) (Adila

và ctv 2013).

Qua một số nghiên cứu trước đó cũng như kết quả chạy HPLC/MS (bảng

3.36) có thể thấy Muntingia calabura có chứa một số hợp chất có hoạt tính sinh học

tốt và có tiềm năng trong việc điều trị một số bệnh như giảm đường huyết, giảm mở

trong máu, giải độc gan (Chrysoeriol), có tiềm năng trong điều trị ung thư bạch cầu

(3,5,7-trihydroxy-8-methoxyflavone), cũng như một số khả năng điều trị những bệnh

khác nhờ những nhóm hợp chất có trong lá cây nhưng chưa được nghiên cứu.

Từ những kết quả đã đạt được trong nghiên cứu này có thể thấy cây

Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa tốt đồng thời mang những hoạt tính

sinh học có lợi cho sức khỏe như khả năng điều hòa đường huyết, khả năng kháng

92

một số chủng vi sinh vật gây bệnh đường ruột, khả năng ức chế quá tiêu chảy cũng

như giúp giải độc gan bị nhiễm độc. Kết quả nghiên cứu cho thấy:

Cây Muntingia calabura có khả năng chống oxi hóa mạnh đặc biệt là đối với

dịch chiết EMC70 và EMC90. Từ đó, nhận thấy được mối liên hệ chặt chẽ giữa khả

năng chống oxi hóa và hàm lượng flavonoid có trong dịch chiết lá từ cây.

Xác định được mối liên hệ chặt chẽ giữa hàm lượng polyphenol tới khả năng

điều hòa đường huyết. Xác định được ảnh hưởng của flavonoid và tannin lên khả

năng điều trị tiêu chảy và hoạt tính bảo vệ gan đối với nhóm hợp chất polyphenol có

khả năng chống oxi hóa tốt.

Kết quả cũng xác định được chrysoeriol có trong dịch chiết EMC70, chính

thành phần này đã góp một phần quan trọng trong việc thể hiện những hoạt tính sinh

học như khả năng điều hòa đường huyết, khả năng chống oxi hóa và bảo vệ gan.

Kết quả nghiên cứu của luận văn cho thấy đa số các hoạt tính sinh học của

cây Muntingia calabura như điều hòa đường huyết, bảo vệ gan, kháng khuẩn chủ yếu

tập trung tại dịch chiết EMC70 mà chưa có tài liệu nào tại Việt Nam đề cập đến. Lá

cây Muntingia calabura có tiềm năng hỗ trợ phòng ngừa và hỗ trợ điều trị tiêu chảy

(chưa có nghiên cứu trong và ngoài nước đề cập tới khả năng này). Cây Muntingia

calabura là loài cây dễ trồng, dễ kiếm ở Việt Nam cũng như một nguồn nguyên liệu

rẻ tiền. Rõ ràng Muntingia calabura là một loại cây dược liệu có tiềm năng nhưng

chưa được biết đến nhiều.

Luận văn cũng mở ra một hướng mới trong việc nghiên cứu thêm một số tác

dụng sinh học khác của cây bên cạnh một số hoạt tính sinh học đã được nghiên cứu

trước đó. Từ đó lá cây Muntingia calabura hứa hẹn là một nguyên liệu tiềm năng

chữa được nhiều loại bệnh phục vụ sức khỏe cho người dân sử dụng loại lá cây này.

93

KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Kết quả định tính sơ bộ một số thành phần hóa học cho thấy dịch chiết có

nhiều nhóm hợp chất đều hiện diện trong cả dịch chiết EMC70 và EMC90 bao gồm

phenolic, flavonoid, tannin, triterpennoid. Dịch chiết AMC chứa phenolic, flavonoid,

saponin, tannin và amino acid.

Trong cả 3 kết quả định lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số và

tannin tổng số EMC70 đều có kết quả cao nhất trong tổng số 3 loại dịch chiết.

Khả năng chống oxi hóa của dịch chiết EMC70 ở phương pháp FRAP là cao

nhất. Ở phương pháp quét gốc tự do DPPH dịch chiết EMC70 và EMC90 cho kết quả

tương đương nhau.

Dịch chiết EMC70 có hoạt tính kháng khuẩn chống lại 6/9 chủng vi sinh vật

chỉ thị bao gồm E.coli-ETEC, Shigella flexneri, Shigella boydii, Staphylococcus

aureus, Listeria innocua và Listeria monocytogenes. Dịch chiết EMC90 có hoạt tính

kháng khuẩn chống lại 5/9 chủng vi sinh vật chỉ thị bao gồm E.coli-ETEC, Shigella

flexneri, Staphylococcus aureus, Listeria innocua và Listeria monocytogenes. Dịch

chiết AMC chỉ có khả năng kháng khuẩn đối với 2 chủng Listeria innocua và Listeria

monocytogenes.

Cả 3 loại dịch chiết EMC70 EMC90 và AMC ở nồng độ 3000 mg/kg là an

toàn trên chuột theo đường uống.

Khả năng điều hòa đường huyết của dịch chiết EMC90 là tốt nhất tại nồng

độ 200 mg/kg. Dịch chiết EMC70 và AMC tương đương nhau về khả năng điều hòa

đường huyết.

Tỷ lệ ức chế tiêu chảy của dịch chiết EMC70 là tốt nhất ở nồng độ 750 mg/kg,

tiếp theo là AMC. Dịch chiết EMC90 thể hiện tỷ lệ ức chế tiêu chảy thấp nhất.

Khả năng giải độc gan của dịch chiết EMC70 tại nồng độ 50 mg/kg là tốt

nhất, tiếp theo là dịch chiết AMC và EMC90.

94

Kết quả phân tích sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ (HPLC/MS) cho thấy sự

hiện diện của các hợp chất như chrysoeriol; 3,8-Dimethylherbacetin; 2,3-dihydroxy-

4,3’,4’,5’-tetramethoxydihydrochalcone; 8-Methoxygalangin và (2S)-7,8,3',4',5'-

pentamethoxyflavan. Trong đó chrysoeriol được cho là có tiềm năng trong đa số các

hoạt tính sinh học đã được nghiên cứu trước đó như hoạt tính kháng khuẩn, điều hòa

đường huyết và bảo vệ gan.

2. Kiến nghị

Khảo sát thêm một số hoạt tính sinh học khác như khả năng làm lành vết

thương, khả năng ức chế tế bào ung thư.

Định tính một số thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

ghép khối phổ HPLC/MS đối với các dịch chiết EMC90 và AMC.

Khảo sát các hoạt tính sinh học trên các hệ dung môi không phân cực như

acetylen, chloroform, ethyl acetate.

Sản xuất ra thực phẩm chức năng dùng trong thực phẩm.

95

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

Đỗ Trung Đàm (2003). Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp của thuốc,

NXB Y học.

Viện dược liệu – Bộ Y Tế (2006). Phương phá p nghiên cứu tác dụng dược

lý của thuốc từ dược thảo. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

Trần Văn Cường (2009). Phân lập, xác định đăc tính sinh học của E. coli, Salmonella gây tiêu chảy cho lợn sau cai sữa nuôi tại tỉnh Lào Cai và đề xuất biện pháp phòng trị. Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, thú y, trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội.

Hoàng Sầm và Hứa Văn Thao (2012). Hoạt tính sinh học của saponin với link: thư, TruongSinhThang. 17-11-2016, 17/08/2012, xem:

ung .

Nguyễn Thị Hiền và ctv (2010). Chất kháng khuẩn thực vật. Tiểu luận môn

công nghệ chế biến rau trái, Kỹ thuật hóa học. Đại học bách khoa TP.HCM.

Nguyễn Bạch Đằng, (2011). Cảnh giác với tiêu chảy cấp tính do Crytosporidium, Báo Sức khỏe và Đời sống, , http://suckhoedoisong.vn/bac-si-tra- loi/canh-giac-voi-tieu-chay-cap-tinh-do-crytosporidium-20111102101832590.htm

Nguyễn Thị Yến, (2011). Khi trẻ tiêu chảy do bất dung nạp lactose,

http://baosuckhoe.org/suc-khoe-tre-em/khi-tre-tieu-chay-do-bat-dung-nap- lastose.html.

Nguyễn Văn Mùi (2011). Thuốc tây gây tổn thương gan như thế nào? Viemgan [online). modified: July 1 2011 viewed 14 may 2017. Link:< http://www.viemgan.com.vn/thuoc-tay-gay-ton-thuong-gan-nhu-the-nao.html>.

Trần Anh Văn, (2011). Tiêu chảy cấp, , http://tailieu.vn/doc/tieu-chay-cap-

521216.html

Bùi Quỳnh Nga, (2012). Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn,

http://suckhoedoisong.vn/benh-thuong-gap/ngo-doc-thuc-an-do-vi-khuan- 20120616100120362.htm.

Duoclieu, (2012). Phổ khối lượng. www.duoclieu.org, modified july 29 2012.

viewed july 31 2017, link:< http://duoclieuvn.blogspot.com/2012/07/>.

96

Đỗ Minh Quang (2012). Sinh lý bệnh đại cương chức năng tiêu hóa, Trường

Đại học Y Dược TP.HCM.

Lê Anh, (2012). Tiêu chảy cấp do rotavirus, Báo Sức khỏe và Đời sống,

http://suckhoedoisong.vn/phong-benh/tieu-chay-cap-do-rotavirus- 20120617102428800.htm

Nguyễn Tiến Thắng (2012). Giáo trình Hóa sinh. (memo). Đại học công nghệ

TP.HCM.

Trần Quang Cảnh (2012). Tụ cầu khuẩn. Xetnghiemdakhoa.com. modified: link: viewed: 2012, 2015, jun 17 27

jun .

Võ Thành Hưng (2013). Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các

sản phẩm thủy sản, Luận án tốt nghiệp. Đai Học Nông Lâm, TP.HCM

Chang Tran (2014). Trực khuẩn lỵ (Shigella), Xetnghiemmau, 07-05-2014,

xem 17-06-2015, link: .

Hà Hiền ,2014. 5 nguyên nhân không ngờ gây bệnh tiêu chảy không ngờ, link:.

Nguyễn Vy (2015). 13 lợi ích tuyệt vời cho sức khỏe từ trái trứng cá, 24 giờ (online), sức khỏe đời sống viewed: may 21 2017, created: september 2 2015, from:< http://www.24h.com.vn/suc-khoe-doi-song/13-loi-ich-tuyet-voi-cho-suc-khoe-tu- trai-trung-ca-c62a731679.html>.

Nhật Linh (2015). Cây trứng cá và những lợi ích bất ngờ, Tiêu dùng, Đời sống – sức khỏe viewed: may 21 2017, created: december 3 2015, from:< http://tieudungplus.vn/cay-trung-ca-va-nhung-loi-ich-bat-ngo-5819.html>.

Lê Hoa (2016). Đường huyết và ngưỡng giá trị an toàn trong từng thời điểm. Bienchungtieuduong.vn [online). modified: Sep 30 2016, viewed may 17 2017. Link:< http://bienchungtieuduong.vn/bai-viet/thong-tin-benh/duong-huyet-va- nguong-gia-tri-an-toan-trong-tung-thoi-diem.html>.

97

Tài liệu Tiếng Anh

Saalmüller L. (1848). “On the fatty acids of castor oil”, Justus Liebigs Ann

Chem, 64, 108-126

Meyer H. (1890). “On the active component of castor oil”, Arch Exp Path

Pharmak, 28, 145-152.

Singleton VL, JA Rossi, Am. J. Enol. Vitic (1965) 16, 144–158

Low-Beer T.S, Read A.E. (1971). “Diarrhoea: mechanisms and treatment”,

Gut 12: 1021-1036.

Gaginella TS. and Phillips SF. (1975). Ricinoleic acid: Current view of an

ancient oil, Am J. Dig Dis, 20, 1171-1177.

Duke, J. A. 1985. Handbook of medicinal herbs. CRC Press, Inc., Boca

Raton, Fla.

Morton J. F., (1987). “Jamaica cherry” in Fruits of Warm Climates, J.

F.Morton, Ed., pp. 65–69, J.F. Morton, Miami, Fla, USA,.

Phillipson, J. D., and M. J. O’Neill, (1987). “New leads to the treatment of protozoal infections based on natural product molecules”. Acta Pharm Nord, (1):131– 144.

Schultz, J. C, (1988). Tannin-insect interactions, p. 553. In Hemingway R. W. and Karchesy J. J. (ed.), Chemistry and significance of condensed tannins. Plenum Press, New York, N.Y.

Dianzani M. U, G. Muzio, Biocca M. E. & Canuto R. A. (1991). Lipid

peroxidation in fatty liver induced by caffeine in rats. Int J Tissue React, 13, 79-85

Kaneda N, Pezzuto JM, Soejarto DD, Kinghorn AD, Farnsworth NR (1991) Plant anticancer agents, XLVIII. New cytotoxic flavanoids from Muntingia calabura roots. J Nat Prod 54: 196-206.

Scalbert. A, (1991). “Antimicrobial properties of tannins”. Phytochemistry,

30:3875–3883.

Rojas, A, Hernandez L., Pereda-Miranda R., and Mata R, (1992). “Screening for antimicrobial activity of crude drug extracts and pure natural products from Mexican medicinal plants”. J. Ethnopharmacol. 35:275–283.

Toda, M, Okubo S, Ikigai H, Suzuki T, Suzuki Y, Hara Y, and Shimamura T. (1992). “The protective activity of tea catechins against experimental infection by Vibrio cholerae O1”. Microbiol Immunol, (36):999–1001.

98

Kubo, I, Muroi H, and Himejima M, (1993). Combination effects of antifungal nagilactones against Candida albicans and two other fungi with phenylpropanoids. J. Nat. Prod. 56:220–226.

Taniguchi, M., and Kubo I, (1993). “Ethnobotanical drug discovery based on medicine men’s trials in the African savanna: screening of east African plants for antimicrobial activity II”. J. Nat. Prod. 56:1539–1546.

Estevez-Braun. A, Reyes R. Estevez-, Moujir L. M., Ravelo A. G., and Gonzalez A. G. (1994). “Antibiotic activity and absolute configuration of 8S- heptadeca-2(Z),9(Z)-diene-4,6-diyne-1,8-diol from Bupleurum salicifolium”. J. Nat. Prod. 57:1178–1182.

Atta-ur-Rahman and M. I. Choudhary, (1995). “Diterpenoid and steroidal

alkaloids”. Nat. Prod. Rep. 12:361–379.

Perrett, S., P. J. Whitfield, L. Sanderson, and A. Bartlett, (1995). “The plant molluscicide Millettia thonningii (Leguminosae) as a topical antischistosomal agent”. J. Ethnopharmacol. 47:49–54.

Cichewicz, R. H., and Thorpe P. A. (1996). “The antimicrobial properties of chile peppers (Capsicum species) and their uses in Mayan medicine”. J. Ethnopharmacol. 52:61–70.

Fernandez, M. A., M. D. Garcia, and M. T. Saenz, (1996). Antibacterial activity of the phenolic acids fraction of Scrophularia frutescens and Scrophularia sambucifolia. J. Ethnopharmacol. 53:11–14.

Haslam, E. (1996). “Natural polyphenols (vegetable tannins) as drugs:

possible modes of action”. J. Nat. Prod. 59:205–215.

Heaton K.W. (1997). “Meyers Scale”, Scandinavian Journal of

Gastroenterology. Bristol.

Sanchez De Medina, F., Galvez, J., Gonzalez, M., Zarzuelo, A., Barreli, K.E (1997). “Effects of quercetin an epithelial chloride secretion”. Life Sci, 67: 2049-2055

Vimala, R., Nagarajan, S., Alam, M., Susan, T., Joy, S (1997). “Anti- inflammatory and antipyretic activity of Michelia champaca Linn., (white variety), Ixora brachiata Roxb. And Rhynchosia cana (Willd.) D.C. flower extract”. Indian J Exp Biol., 35: 12, 1310-4

Zhang. Y, and Lewis K. (1997). “Fabatins: new antimicrobial plant

peptides”. FEMS Microbiol. Lett. 149:59–64.

99

Sun B, Jorge M. Silva Rd, Spranger I. (1998). Critical Factors of Vanillin

Assay for Catechins and Proanthocyanidins. J. Agric. Food Chem, 46, 4267−4274.

Woisky R. and Salatino A, (1998). “Analysis of propolis: some parameters

and procedures for chemical quality control”. J. Apic. Res. 37: 99-105.

Asish K. Das, Subhash C. Mandal, Sanjay K. Banerjee, Sanghamitra Sinha, J. Das, B.P. Saha, M. Pal. (1999) “Studies on antidiarrhoeal activity of Punica granatum seed extract in rats”. Journal of Ethnopharmacology, 68:205–208.

Jensen M., (1999).“Trees commonly cultivated in South East Asia: an illustrated field guide,” in FAO Corporate Document Repository, Craftsman Press, Bangkok, Thailand, 2nd edition.

Joy, K.L., and Kuttan, R.J. (1999). “Anti-diabetic activity of Picrorrhiza

kurroa extract”, Journal of Ethnopharmacology, 67:143-148.

Dong H, Haining RL, Thummel KE, Rettie AE, Nelson SD (2000). the bioactivation of in

“Involvement of human cytochrome P450 2D6 acetaminophen”. Drug Metab Dispos 28 (12): 1397–400.

Gunnell, V. Murray & K. Hawton ( 2000). Use of paracetamol (acetaminophen) for suicide and nonfatal poisoning: worldwide patterns of use and misuse. Suicide Life Threat Behav, 30, 313-26.

Atta M. -UR-Rahman, Choudhary I. & W.J Thomsen, (2000). Bioassay

Techniques for Durg development,. Harwood academic publishers.

Matsui T, Ueda T, Oki T, Sugita K, Terahara N, Matsumoto K (2001). Alpha- Glucosidase inhibitory action of natural acylated anthocyanins. 2. alpha-Glucosidase inhibition by isolated acylated anthocyanins. J Agric Food Chem; 49:1952-6.

Chun ML, Chien SC, Chien TC, Yu CL & Jen KL (2002). Molecular modeling of flavonoids that inhibits xanthine oxidase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 292,167-172.

Lee, Y.C., OH, S.W. and Hong H.D, (2002). “Antimicrobial characteristics

of edible medicinal herbs extracts”. Korean. J. Food Sci. Technol. 34, 700–709.

Matsui T, Ebuchi S, Kobayashi M, Fukui K, Sugita K, Terahara N, Matsumoto K (2002). “Anti-hyperglycemic effect of diacylated anthocyanin derived from Ipomoea batatas cultivar Ayamurasaki can be achieved through the alpha- glucosidase inhibitory action”. J Agric Food Chem; 50:7244-8.

Ogunleye, D.S. and S.F. Ibitoye (2003) Studies of antimicrobial activity and

chemical cosntituents of Ximenia americana. Trop. J. Pharm. Res., 2: 239-241.

100

Pretorius, J.C., S. Magama and P.C. Zeietsman (2003) Purification and idenfication of antibacterial compounds from Euclea crispa subsp. Crispa (Ebenaceae) leaves. South African J. Bot., 69: 186-192.

Su Bao-N, Park Eun J, Jose Schunke V, James G. Graham, Fernando C, Harry H.S. Fonga, John M. Pezzutoa, A. Douglas Kinghorn (2003). “Activity-guided isolation of the chemical constituents of Muntingia calabura using a quinone reductase induction assay”. Phytochemistry 63: 335–341.

Prince PS, Kamalakkannan N, Menon VP (2004) Antidiabetic and antihyperlipidaemic effect of alcoholic Syzigium cumini seeds in alloxan induced diabetic rats, J Ethnopharmacol (91) pp. 209– 213.

Atta, A., Mouneir, S (2005). “Evaluation of some medicinal plant extracts

for antidiarrhoeal activity”. Phytother Res. 19: 481-485.

Di Carlo, G., Autore, G., Izzo, AA., Maibline, P., Mascolo, N., Viola, P., Diumo, MV., Capasso., F (2005). “Inhibition of intestinal mobility and secretion by flavonoids in mice and rats: structure activity relationshps”. J Pharmacol., 45: 1054- 1059.

Kim, K.J., Do, J.R., Jo, J.H., Kim, Y.M., Kim, B.S., Lim, S.D. and Kang, S.N. (2005). “Antibacterial activity of Terminalia chebula Retz. Extract against food spoilage microorganisms”. Korean J. Food Sci. Technol. 37, 498–503.

Mujumdar A.M, Misar A.V,Upadhye A.S. (2005) “Antidiarrhoeal activity of lanceolaria”. Journal of the bark of Dalbergia

ethanol extract of Ethnopharmacology. 102, 213–216.

Afroz S, Alamgir M, M.T.H. Khan, S. Jabbar, N. Nahar, M.S.K. Choudhuri (2006). “Antidiarrhoeal activity of the ethanol extract of Paederia foetida Linn. (Rubiaceae)”. Journal of Ethnopharmacology. 105, 125–130.

Amani, S.Awaada, D.J.Maitlandb, G.A.Solimanc (2006). “Hepatoprotective activity of Schouwia thebica webb”. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 16(17):4624-4628.

Bowen R, (2006). Pathophysiology of Diarrhea,

http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/ digestion/smallgut/diarrhea.html

Cushnie TP, Lamb AJ (2006). Assessment of the antibacterial activity of resistant strains of Staphylococcus aureus.

galangin against 4-quinolone Phytomedicine. 13 (3): 187–191.

101

Gouni Berthold I and Krone W. (2006). “Diabetic ketoacidosis and

hyperosmolar hyperglycemic state”. Med Klin. 101(1):100-105.

Zakaria, A. Fatimah, A.M. Mat Iais, H. Zaiton, E.F.P. Henie, MR. Sulaiman (2006). “The in vitro antibacterial activity of Muntingia calabura extracts”. International Journal of Pharmacology. 2(4): 439-442.

Aibinu, Ibukun E, Odunayo R. Akinsulire, Tayo Adenipekun, Toyin Adelowotan and Tolu Odugbemi (2007) In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants Bryophyllum pinnatum and Kalanchoe crenata. Afr. J. Traditional. 4 (3): 338 – 344.

Chen JJ, Lee HH, Shih CD, Liao CH, Chen IS, Chou HT (2007) New dihydrochalcones and anti-platelet aggregation constituents from the leaves of Muntingia calabura. Planta Med 73: 572-577.

Zakaria Z.A, Mustapha S, Sulaiman M.R, Mat Jais A.M,·Somchit M.N, Abdullah F.C (2007). “The Antinociceptive Action of Aqueous Extract from Muntingia calabura Leaves: The Role of Opioid Receptors”. Med Princ Pract, 16(2):130–136.

Dembinska-Kiec A, Mykkänen O, Kiec-Wilk B, Mykkänen H (2008).

Antioxidant phytochemicals against type 2 diabetes. Br J Nutr; 99:109-17.

Juan Su, Peng Fu, Yunheng Shen, Chuan Zhang, Mingjin Liang, Runhui Liu, Huiliang Li, Weidong Zhan (2008) “Simultaneous analysis of flavonoids from Hypericum japonicum Thunb.ex Murray (Hypericaceae) by HPLC-DAD–ESI/MS, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. (46), pp.342–3.

Kanti Bhooshan Pandey and Syed ibrahim rizvi (2009). Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. Landes Bioscience. 2:5, 270-278.

Rizvi SI, Mishra M (2009). Anti-oxidant effect of quercetin on type 2 diabetic

erythrocytes. J Food Biochem; 33:404-15.

Belsare D .P., Pal S.C.,Kazi A .A., Kankate R.S.,Vanjari S.S (2010). “Evaluation of Antioxidant Activity of Chalcones and Flavonoids”. International Journal of ChemTech Research. Vol.2, No.2, pp 1080-1089.

Hediat M.H. Salama, Najat Marraiki (2010). Antimicrobial activity and phytochemical analyses of Polygonum aviculare L. (Polygonaceae), naturally growing in Egypt. Saudi Journal of Biological Sciences. 17:57–63.

102

Kim Young Ho, Lee Young Soon, Choi Eun Mi (2010). “Chrysoeriol isolated from Eurya cilliata leaves protects MC3T3-E1 cells against hydrogen peroxide- induced inhibition of osteoblastic differentiation”. Journal of applied toxicology, 30(7):666-673.

Premakumari K.B, Ayesha Siddiqua, Rokeya sultana,Vithya and Savitha (2010) Antioxidant activity and estimation of total phenolic content of Muntingia calabura by colorimetry. International Journal of ChemTech Research. Vol.2, No.1, pp 205-208.

Pál Perjési and Zsuzsanna Rozmer (2011). “Kinetic Analysis of Some Chalcones and Synthetic Chalcone Analogues on the Fenton-Reaction Initiated Deoxyribose Degradation Assay”. The Open Medicinal Chemistry Journal. 5:61-67.

Rahman M, Hasan N, Asish KD,Tozammal H, Rownak J, Afsana K, Mohammed R (2011). Effect of delonix regia leaf extract on glucose tolerance in glucoseinduced hyperglycemic mice. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8(1):34- 36.

Yusof MM, Teh LK, Zakaria ZA, Ahmat N (2011) Antinociceptive activity

of the fractionated extracts of Muntingia calabura. Planta Med 77: PF21.

Zakaria ZA, Mohamed AM, Jamil NSM, Rofiee MS, Hussain MK, Sulaiman MR, Teh LK, Salleh MZ (2011) In vitro antiproliferative and antioxidant activities of the extracts of Muntingia calabura leaves. Am J Chin Med 39: 1-18.

Zhang M, Swarts SG, Yin L, Liu C, Tian Y, Cao Y, Swarts M, Yang S, Zhang SB, Zhang K, Ju S, Olek DJ Jr, Schwartz L, Keng PC, Howell R, Zhang L, Okunieff P (2011) Antioxidant properties of quercetin Adv Exp Med Biol 701:283-9.

Akkol Esra Küpeli, Suntar Ipek, Tugce ¸ Fafal Erdogan , Hikmet Keles, Tuba Mert Gonenc¸Bijen Kivc (2012). Wound healing and anti-inflammatory properties of Ranunculus pedatus and Ranunculus constantinapolitanus: A comparative study. Journal of Ethnopharmacology, 139 (2):478–484.

Dosso K, N’guessan B.B, Bidie A.P., Gnangoran B.N, Méité S, N’guessan D, Yapo A.P., Ehilé E.E, (2012). “Antidiarrhoeal activity of an ethanol extract of the stem bark of piliostigma reticulatum (caesalpiniaceae) in rats”. Afr J Tradit Complement Altern Med. 9(2):242-249.

Nur Alam, Nusrat Jahan Bristi, Md. Rafiquzzaman (2012) . “Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity“. Saudi Pharmaceutical Journal.

103

Oliveira GA, Ferraz ER, Souza AO, Lourenço RA, Oliveira DP, Dorta DJ (2012) Evaluation of the mutagenic activity of chrysin, a flavonoid inhibitor of the aromatization process. J Toxicol Environ Health A. 75(16-17):1000-11.

Sani MH, Zakaria ZA, Balan T, The LK, Salleh MZ (2012). Antinociceptive activity of methanol extract of Muntingia calabura leaves and the mechanisms of action involved. Evid Based Comp Altern.

Sumalatha BV, Devprakash, Senthil Kumar GP, Tamizh Mani (2012). “Isolation of Flavonol of Tephrosia purpurea”. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 3(3): 105-110.

Tunaru S., Till F., Althoff R.M., Nüsing, Diener M. and Offermanns S. (2012). “Castor oil induces laxation and uterus contraction via ricinoleic acid activating prostaglandin EP3 receptors”, Proc Natl Acad Sci USA, 109 (23): 9179- 9184.

from the

Adila S. Sufian, Kalavathy Ramasamy, Norizan Ahmat, Zakaria Zainul A, Yusof M. Izwan M (2013). “Isolation and identification of antibacterial and cytotoxic compounds leaves of Muntingia calabura L”. Journal of Ethnopharmacology, 146(1):198-204

Amjad Khalil (2013). Antimicrobial activity of ethanol extracts of Ocimum

basilicum leaf from Saudi Arabia. Biotechnology. Saudi Arabia

Aruna Sindhe M, Yadav D. Bodke and Chandrashekar A, (2013). “Antioxidant and in vivo anti-hyperglycemic activity of Muntingia calabura L. leaves extracts”. Der Pharmacia Lettre, 5 (3): 427-435.

Balan T, Mohd Sani MH, Suppaiah V, Mohtarrudin N, Suhaili Z, Ahmad Z, Zakaria ZA (2013) Antiulcer activity of Muntingia calabura L. leaves involves the modulation of endogenous nitric oxide and nonprotein sulfhydryl compounds. Pharm Biol 52: 410-418.

Mayakrishnan, V., Veluswamy, S., Sundaram, K. S., Kannappan, P., Abdullah, N. (2013). Free radical scavenging potential of Lagenaria siceraria (Molina) Standl fruits extract. Asian Pacific journal of tropical medicine, 6(1), 20- 26.

Mohamad M. I Yusof, Salleh M. Z, Teh L K, Norizan A, Nik Fatini N A, and Zakaria Z A (2013). “Activity-Guided Isolation of Bioactive constituents with antinociceptive activity from Muntingia calabura L. leaves using the Formalin test”. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.

104

Radulovíc N.S, Blagojevi P.D., Stojanovi Radi Z.Z and Stojanovi N.M, (2013). “Antimicrobial Plant Metabolites: Structural Diversity and Mechanism of Action”. Current Medicinal Chemistry, 20, 932-952.

Sibi G,.Kalpana Kaushik, Kalegowda Dhananjaya, Kodagahally R, Ravikumar. Honnaiah Mallesha, (2013). “In vitro antimicrobial activity of Muntingia calabura fruit extracts against food borne pathogens”. Pharmacognosy Journal, 5(3):135-136.

Yahya F, Mamat SS, Kamarolzaman MF, Seyedan AA, Jakius KF, Mahmood ND, Shahril MS, Suhaili Z, Mohtarrudin N, Susanti D, Somchit MN, Teh LK, Salleh MZ, Zakaria ZA (2013). Hepatoprotective Activity of Methanolic Extract of Bauhinia purpurea Leaves against Paracetamol-Induced Hepatic Damage in Rats.

Patrícia L. A, Talita Nascimento, Natália Ramos, Girliane R. Silva, José Erick Galindo Gomes, Rosângela E. A. Falcão, Keila A. Moreira, Ana L. F. Porto, Tania M. S. Silva (2014). “Quantification, antioxidant and antimicrobial activity of phenolics isolated from different extracts of Capsicum frutescens (Pimenta Malagueta)”. Molecules, 19(4):5434-5447.

Seung-Kuk Yang, Hyun-Jung Kim and Se-Wook Oh (2014). “Antimicrobial activities of ethanol extracts of Rhus javanica and Terminalia chebula against Shigella species”. Journal of Food Safety.

Zakaria Zainul Amiruddin, Tavamani Balan, Velan Suppaiah, Syahida Ahmad, Fadzureena Jamaludin (2014). “Mechanism(s) of action involved in the gastroprotective activity of Muntingia calabura”. Journal of Ethnopharmacology 151, 1184–1193.

Krishnaveni M, Ragina banu C, Krishna kumari G, Kalaivani M (2015). “GCMS/MS analysis of Muntingia calabura stem and its antimicrobial effect”. World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, 4(8):812-817.

Krishnan Baskaran, Kodukkur Viswanathan Pugalendi, Ramalingam Saravanan (2015). “Antidiabetic and Antihyperlipidemic activity of Chrysoeriol in diabetic rats, role of HMG CoA reductase, LCAT and LPL: In vivo and in silico approaches”. Journal of Pharmacy Research, 9(9):597-605.

Abeer Hanafy, Hibah M. Aldawsari, Jihan M. Badr, Amany K. Ibrahim, and Seham El-Sayed Abdel-Hady (2016). Evaluation of Hepatoprotective Activity of Adansonia digitata Extract on Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in Rats.

PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU THÔ

Tiêu chuẩn dược liệu Tro toàn phần % 14,12 14,23 13,89 Tro tan trong nước % 3,54 3,12 4,22 Tro không tan trong acid % 8,38 8,05 8,37

7,62 6,94 7,36 7,31 0,34

Đường chuẩn rutin

y = 18.35x + 0.0071 R² = 0.9998

1.000

0.900

0.800

0.700

0.600

D O

0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.010

0.000

0.020

0.040

0.050

0.060

0.030

mg/ml

Hàm lượng cắn chiết Mẫu EMC70 EMC90 AMC 17,54 23,1 L1 18,86 20,12 L2 18,23 24,55 L3 22,59 18,21 TB 2,26 0,66 SD Định lượng Đường chuẩn rutin Kết quả đo quang

FLAVONOID EME70 0,1 mg/ml EME90 0,1 mg/ml AME 0,2 mg/ml 0,421 0,415 0,448 0,491 0,469 0,478 0,296 0,302 0,315

Đường chuẩn acid galic

y = 5.6232x - 0.014 R² = 0.9973

1.000

0.900

0.800

0.700

0.600

D O

0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

mg/ml

Đường chuẩn acid galic Kết quả đo quang

POLYPHENOL EME70 0,2 mg/ml EME90 0,05 mg/ml AME 0,5 mg/ml 0,634 0,640 0,641 0,490 0,501 0,491

Đường chuẩn catechin

y = 3.0584x - 0.0364 R² = 0.9939

D O

1.000 0.900 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

mg/ml

0,276 0,275 0,289 Đường chuẩn catechin Kết quả đo quang

TANNIN EME70 2,5 mg/ml EME90 7,5 mg/ml AME 2,5 mg/ml 0,268 0,196 0,164 0,224 0,161 0,132 0,433 0,271 0,301

(y-b)*H*10

a*C

Hàm lượng phenolic, flavonoid và tannin tổng số =

Với y= a*X + b là phương trình được dựng từ đường chuẩn H là hàm lượng cắn thu được (%) C là nồng độ dịch chiết thử nghiệm (mg/ml) Kết quả định lượng

EMC70

EMC90

AMC

Polyphenol (mg GAE/g) 119,97 120,68 121,67 43,12 43,57 42,77 60,71 59,84 61,52 Flavonoid (mg RE/g) 90,45 88,98 93,38 35,55 34,22 36,68 20,16 18,98 21,62 Tannin (mg CE/g) 6,21 4,71 4,02 0,97 0,74 0,64 4,49 2,94 3,23

Kết quả chống oxi hóa Quét gốc tự do DPPH Kết quả đo quang

Nồng độ EME70 EME90 AME

29,27 μg/ml 0,167 0,173 0,174 0,145 0,148 0,147 0,285 0,280 0,280 24,39 μg/ml 0,180 0,179 0,177 0,254 0,254 0,252 0,337 0,344 0,344 18,29 μg/ml 0,296 0,296 0,293 0,294 0,286 0,287 0,395 0,394 0,391 12,20 μg/ml 0,399 0,402 0,405 0,372 0,373 0,370 0,483 0,488 0,489 6,10 μg/ml 0,511 0,516 0,517 0,493 0,500 0,501 0,519 0,513 0,517

% ức chế I% EMC70 EMC90 AMC

29,27 μg/ml 74,96 74,06 73,91 78,26 77,81 77,96 57,27 58,02 58,02 24,39 mg/ml 73,01 73,16 73,46 61,92 61,92 62,22 49,48 48,43 48,43 18,29 μg/ml 55,62 55,62 56,07 55,92 57,12 56,97 40,78 40,93 41,38 12,20 μg/ml 40,18 39,73 39,28 44,23 44,08 44,53 27,59 26,84 26,69 6,10 μg/ml 23,39 22,64 22,49 26,09 25,04 24,89 22,19 23,09 22,49

50-b IC50 = a

Với y= a*X + b là phương trình được dựng từ đường chuẩn IC50

IC50 (μg/ml) EME70 EME90 AME Acid ascorbic

16,58 16,75 16,76 16,47 16,53 16,48 24,75 24,81 24,75 5,28 5,36 5,51

2

0,298 0,271 0,315 0,753 0,755 0,757 0,343 0,315 0,325

Phương pháp FRAP Kết quả đo quang FRAP EMC70 EMC90 AMC Acid ascorbic mg/ml 0,537 0,504 0,525 Tính toán y-b FRAP = a*C

Với: y= a*X + b là phương trình được dựng từ đường chuẩn C là nồng độ dịch chiết thử nghiệm (mg/ml) Chỉ số FRAP

μM Fe2+/ L EMC70 EMC90 AMC Acid ascorbic

5155 4825 5035 2765 2495 2935 3215 2935 3035 7315 7335 7355

Năng lực khử Kết quả đo quang

µg/ml Mẫu 20 30 40 50 60 70

AMC

EMC90

EMC70

Acid ascorbic

0,443 0,555 0,680 0,654 0,735 0,862 0,450 0,565 0,679 0,703 0,736 0,853 0,446 0,552 0,682 0,712 0,739 0,867 0,499 0,668 0,715 0,914 0,932 1,127 0,502 0,678 0,713 0,904 0,918 1,125 0,504 0,668 0,723 0,912 0,921 1,115 0,529 0,669 0,753 0,837 0,865 1,035 0,533 0,667 0,759 0,840 0,872 1,027 0,534 0,672 0,748 0,835 0,877 1,025 0,394 0,521 0,656 0,859 0,944 1,228 0,393 0,517 0,660 0,855 0,941 1,225 0,391 0,518 0,655 0,845 0,945 1,223

Hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của 3 loại dịch chiết EMC70

EMC70 Chủng

100 mg/ml 50 mg/ml Escherichia coli 25 mg/ml Enterotoxigenic E,coli-ETEC 11,5 11,5 10 7,5

8 12,5 12 11,5 9,5 8,5 17,5 16,5 17 9,5 8,5 7 7,5 7

11 10,5 10,5 7 7 7,5 8,5 10 8 Listeria monocytogenes Listeria innocua Salmonella typhi Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Shigella flexneri Shigella boydii 12,5 13,5 14 11 11,5 13 11 11,5 11

EMC90

Chủng

100 mg/ml EMC90 50 mg/ml 25 mg/ml Escherichia coli

8,5 8,5 9

Enterotoxigenic E,coli-ETEC 7,5 13 16 16,5 17 8 8,5 13 12,5 11 10,5 11

7 7 7,5 8 7,5 9 7,5 7,5

13 12,5 11,5 8,5 9 8,5 11,5 11 11,5 8 14,5 14,5 14 Listeria monocytogenes Listeria innocua Salmonella typhi Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Shigella flexneri Shigella boydii

AMC

AMC Chủng

100 mg/ml 50 mg/ml 25 mg/ml

14 15 10,5 11,5 11,5 15 12 11,5 12,5 8 9 8 Escherichia coli Enterotoxigenic E,coli-ETEC Listeria monocytogenes Listeria innocua Salmonella typhi Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Shigella flexneri Shigella boydii

Kháng sinh ciprofloxacin

125 µg/ml 250 µg/ml Chủng Escherichia coli

Enterotoxigenic E,coli-ETEC 19,5 20 20 23 22,5 24 9 8,5 9 Listeria monocytogenes Listeria innocua Salmonella typhi 500 µg/ml 13 25,5 12 12 12 13,5 27 12,5 12,5 12,5 13 25 12 11,5 13

12,5 11,5 12,5 12,5 12 12 13,5 13 13

Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Shigella flexneri Shigella boydii Điều hòa đường huyết Kết quả đường huyết chuột mg/dL

Nồng độ

100 mg/kg

150 mg/kg

200 mg/kg

Mẫu EMC70 EMC90 AMC EMC70 EMC90 AMC EMC70 EMC90 AMC

2 g/kg mg//dL 146 152 175 135 177 165 131 151 164 143 162 129 144 150 169 185 123 172 152 137 161 148 149 154 135 155 132 134 140 138 149 145 150 160 133 149 114 110 123 134 140 138 129 113 146 98 119 107 149 115 116 160 122 117 10 mg/kg Glibenclamide 96 101 115 108 105 110 180 170 176 185 169 167 87 102 97 100 99 113 Tăng đường Đối chứng

Kết quả đường huyết chuột mmol/L

mmol/L Nồng độ

100 mg/kg

150 mg/kg

200 mg/kg

Mẫu EMC70 EMC90 AMC EMC70 EMC90 AMC EMC70 EMC90 AMC

2 g/kg TB 8,10 8,44 9,71 7,49 9,82 9,16 8,79 7,27 8,38 9,10 7,94 8,99 7,16 8,14 7,99 8,33 9,38 10,27 6,83 9,55 8,72 8,44 7,60 8,94 8,21 8,27 8,55 8,33 7,49 8,60 7,33 7,44 7,77 7,66 7,71 8,27 8,05 8,33 8,88 7,38 8,27 8,20 6,33 6,11 6,83 7,44 7,77 7,66 7,02 7,16 6,27 8,10 5,44 6,60 5,94 6,59 8,27 6,38 6,44 8,88 6,77 6,49 7,21 10 mg/kg Glibenclamide 5,33 5,61 6,36 6,01 5,82 6,12 5,88 10,01 9,45 9,77 10,29 9,36 9,28 9,69 4,83 5,67 5,38 5,55 5,49 6,27 5,53 Tăng đường Đối chứng

Kết quả đo đường huyết trên mô hình chuột tiểu đường cấp tính của dịch chiết AMC ở nồng độ 100 mg/kg, 150 mg/kg và 200 mg/kg

100 mg/kg 200 mg/kg STT

1 2 7,99 8,33 150 mg/kg mmol/L 8,27 8,05 8,27 6,38

3 4 5 6 Trung bình 9,38 10,27 6,83 9,55 8,72±1,24ab 8,33 8,88 7,38 8,27 8,20±0,48bc 6,44 8,88 6,77 6,49 7,21±1,09ecd

100 mg/kg 200 mg/kg STT

Kết quả đo đường huyết trên mô hình chuột tiểu đường cấp tính của dịch chiết EMC70 ở nồng độ 100 mg/kg, 150 mg/kg và 200 mg/kg 150 mg/kg mmol/L 8,44 7,60 8,94 8,21 8,27 8,55 8,33±0,44b 8,10 8,44 9,71 7,49 9,82 9,16 8,79±0,93ab 1 2 3 4 5 6 Trung bình 6,33 6,11 6,83 7,44 7,77 7,66 7,02±0,71ed

Kết quả đo đường huyết trên mô hình chuột tiểu đường cấp tính của dịch chiết EMC90 ở nồng độ 100 mg/kg, 150 mg/kg và 200 mg/kg

200 mg/kg 100 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 7,27 8,38 9,10 7,94 8,99 7,16 8,14±0,83bc 150 mg/kg mmol/L 7,49 8,60 7,33 7,44 7,77 7,66 7,71±0,46bcd

7,16 6,27 8,10 5,44 6,60 5,94 6,59±0,94ef Kết quả đo đường huyết trên mô hình chuột tiểu đường cấp tính của nhóm chuột uống glibenclamide 10 mg/kg, nhóm tăng đường huyết và nhóm đối chứng

Tăng đường Đối chứng Glibenclamide 10 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 10,01 9,45 9,77 10,29 9,36 9,28 9,69±0,40a mmol/L 4,83 5,67 5,38 5,55 5,49 6,27 5,53±0,46f 5,33 5,61 6,36 6,01 5,82 6,12 5,88±0,37f

Khả năng điều trị tiêu chảy Kết quả lượng phân tiêu chảy

Nồng độ gram

750 mg/kg Mẫu EMC70 EMC90 AMC

500 mg/kg 0,201 0,215 0,115 0,563 0,442 0,581 0,427 0,352 0,312 0,399 Loperamide 0,175 0,166 0,204 Tiêu chảy EMC70 EMC90 AMC

250 mg/kg Loperamide 0,175 0,166 0,204 Tiêu chảy EMC70 EMC90 AMC

TB 0,177 0,503 0,354 0,182 0,816 0,831 0,892 0,930 0,819 1,020 0,885 0,432 0,414 0,454 0,428 0,550 0,533 0,591 0,556 0,543 0,527 0,456 0,449 0,448 0,475 0,452 0,182 0,816 0,831 0,892 0,930 0,819 1,020 0,885 0,511 0,482 0,501 0,418 0,512 0,641 0,591 0,607 0,738 0,775 0,781 0,811 0,717 0,502 0,459 0,677 0,603 0,559 0,633 0,572 0,182 0,816 0,831 0,892 0,930 0,819 1,020 0,885 Loperamide 0,175 0,166 0,204 Tiêu chảy

Khối lượng phân tiêu chảy của nhóm chuột uống dịch chiết EMC70 tại nồng độ 750 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg

750 mg/kg 250 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 0,201 0,215 0,115    0,177±0,054g 500 mg/kg Gram 0,414 0,454 0,428    0,432±0,020ef 0,482 0,501 0,418 0,512 0,641  0,511±0,081cde

Khối lượng phân tiêu chảy của nhóm chuột uống dịch chiết EMC90 tại nồng độ 750 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg.

750 mg/kg 250 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 0,563 0,442 0,581 0,427   0,503±0,080cd 500 mg/kg Gram 0,533 0,591 0,556 0,543 0,527  0,550±0,02c 0,591 0,607 0,738 0,775 0,781 0,811 0,717±0,095b

Khối lượng phân tiêu chảy của nhóm chuột uống dịch chiết AMC tại nồng độ 750 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg

250 mg/kg 750 mg/kg STT 500 mg/kg Gram

1 2 3 4 5 6 Trung bình 0,352 0,312 0,399    0,354±0,044f 0,449 0,448 0,475 0,452   0,456±0,013de 0,502 0,459 0,677 0,603 0,559 0,633 0,572±0,082c

Khối lượng phân tiêu chảy của nhóm chuột uống dịch chiết Loperamide tại nồng độ 3 mg/kg

Nhóm tiêu chảy Loperamide 3 mg/kg STT

Gram

1 2 3 4 5 6 Trung bình 0,175 0,166 0,204    0,182±0,020g 0,816 0,831 0,892 0,930 0,819 1,020 0,885±0,080a

Kết quả % ức chế tiêu chảy

Nồng độ

% ức chế

750 mg/kg Mẫu EMC70 EMC90 AMC

500 mg/kg 75,37 74,13 87,11 31,00 46,81 34,87 54,09 56,86 62,52 55,26 Loperamide 78,55 80,02 77,13 49,26 45,37 52,02 34,68 28,88 37,67 41,61 35,65 44,98 46,09 46,75 51,40 EMC70 EMC90 AMC

Loperamide 78,55 80,02 77,13

250 mg/kg EMC70 EMC90 AMC

TB 78,87 41,69 58,21 78,57 48,88 35,70 47,30 78,57 40,09 40,93 39,71 53,14 44,95 21,73 27,57 26,96 17,26 16,67 4,64 20,49 18,93 38,48 44,77 24,10 35,16 31,75 37,94 35,37 78,57 Loperamide 78,55 80,02 77,13

Kết quả thời gian tiêu chảy

Nồng độ Phút

Mẫu EMC70 EMC90 AMC 750 mg/kg

150 167 156 125 118 127 133 134 139 148 Loperamide 160 159 175 Tiêu chảy EMC70 TB 157,67 125,75 140,33 164,67 78 100 105 111 91,83 144,33 70 87 145 150 138 500 mg/kg

EMC90 AMC 98 115 110 123 120 127 132 145 125

70

Loperamide 160 159 175 Tiêu chảy EMC70 EMC90 AMC 87 144 125 135 121 119 72 87 80 91 250 mg/kg

113,20 132,25 164,67 78 100 105 111 91,83 128,80 97 109 113 115 97,67 95 112 119 127 105,17 164,67 78 100 105 111 91,83 Loperamide 160 159 175 Tiêu chảy 87 70

Thời gian tiêu chảy của nhóm chuột uống dịch chiết EMC70 tại nồng độ 750 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg

750 mg/kg 250 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 150 167 156    157,67±8,62a 500 mg/kg Phút 145 150 138    144,33±6,02b 144 125 135 121 119  128,80±10,50cd

Thời gian tiêu chảy của nhóm chuột uống dịch chiết EMC90 tại nồng độ 750 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg

750 mg/kg 250 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 125 118 127 133   125,75±6,18de 500 mg/kg Phút 98 115 110 123 120  113,20±9,8ef 72 80 97 109 113 115 97,67±18,08cd

Thời gian tiêu chảy của nhóm chuột uống dịch chiết AMC tại nồng độ 750 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg

750 mg/kg 250 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 134 139 148    140,33±7,09cd 500 mg/kg Phút 127 132 145 125   132,25±9,00cd 87 91 95 112 119 127 108,80±16,42fg

Thời gian tiêu chảy của nhóm chuột uống dịch chiết Loperamide tại nồng độ 3 mg/kg và nhóm chuột tiêu chảy

Nhóm tiêu chảy Loperamide 3 mg/kg STT

Phút

1 2 3 4 5 6 Trung bình 160 159 175    164,67±8,96a 87 70 78 100 105 111 91,83±16,12g

Bảo vệ gan Pha hóa chất Thuốc thử GOT (ASAT) IFF mod.liquiUV 50 ml Cho 10 ml SUB vào 40 ml BUF trộn đều Thuốc thử GPT (ALAT) IFF mod.liquiUV Cho 10 ml SUB vào 40 ml BUF trộn đều Thực hiện: Cho 200 µl mẫu thử vào 1000 µl thuốc thử tại 250C hoặc 100 µl mẫu vào 1000 µl thuốc thử tại 370C. Mẫu là huyết thanh chuột thu được bằng ly tâm 3000 vòng trong 5 phút hỗn hơp 0,2 ml máu chuột + 0,2 ml ACD. Tiến hành đo quang ở bước sóng 334 – 340 nm trên máy đo động học U-3900. Thông số điều chỉnh máy: Wavelength: 340 nm Scan time : 180 s Lamp change mode: Auto Lamp change wavelength 334 nm WI Lamp: on D2 Lamp: off Slit width: 2 nm PMT: Auto Path Length: 10 nm Kết quả chỉ số men gan

Nồng độ ALT (U/I) TB

Mẫu EMC70 EMC90 AMC

15 mg/kg Sylimarin 44 27 35 49 30 45

Độc

Đối chứng 38 176 211 188 205 198 230 201,33 305 322 349 330 352 298 326,00 230 232 277 259 251 270 253,17 38,33 434 509 420 480 515 443 466,83 33,50 40 38 30

33 22 AST (U/I)

EMC70 EMC90 AMC

Độc

392 371 428 405 448 377 403,50 805 756 790 743 684 797 762,50 475 501 455 527 550 549 509,50 Sylimarin 114 139 155 102 130 131 128,50 785 741 760 793 782 775 772,67 71,50 Đối chứng 74 83 71 59

77 65 ALT (U/I)

EMC70 EMC90 AMC

Sylimarin 37 33 20 25 39 45

Độc

Đối chứng 38 138 112 117 133 98 122 120,00 232 230 255 248 251 265 246,83 160 137 149 145 166 157 152,33 33,17 434 509 420 480 515 443 466,83 33,50 40 30 38 25 mg/kg 22 33 AST (U/I)

EMC70 EMC90 AMC

Độc

287 270 295 311 324 281 294,67 755 615 771 799 726 691 726,17 411 420 359 405 312 452 393,17 Sylimarin 133 107 129 111 138 107 120,83 785 741 760 793 782 775 772,67 71,50 Đối chứng 74 83 59 71

61 41 39 77 65 ALT (U/I) 46 55

EMC70 EMC90 AMC

96 105 87 18 35 27 85 31 91 39

Độc

43 47,50 182 225 204 223 192 187 202,17 90,67 80 28,33 Sylimarin 20 434 509 420 480 515 443 466,83 33,50 Đối chứng 38 40 38 30 50 mg/kg 22 33 AST (U/I)

EMC70 EMC90 AMC

Độc

235 221 195 209 189 201 208,33 647 703 680 643 720 591 664,00 307 322 256 331 310 288 302,33 Sylimarin 117 120 128 104 111 135 119,17 785 741 760 793 782 775 772,67 71,50 Đối chứng 74 65 77 83 59 71

Kết quả đo men gan (ALT) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống dịch chiết EMC70 tại nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg và 50 mg/kg từ cây Muntingia calabura

15 mg/kg 50 mg/kg STT

1 2 3 25 mg/kg ALT (IU/L) 138 112 117 176 211 188 43 39 55

4 5 6 Trung bình 205 198 230 201±19d 133 98 122 120±14f 46 41 61 47±9g

Kết quả đo men gan (AST) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống dịch chiết EMC70 tại nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg và 50 mg/kg từ cây Muntingia calabura

15 mg/kg 50 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 392 371 428 405 448 377 404±30d 25 mg/kg AST (IU/L) 287 270 295 311 324 281 295±20e 235 221 195 209 189 201 208±17f

Kết quả đo men gan (ALT) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống dịch chiết EMC90 tại nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg và 50 mg/kg từ cây Muntingia calabura

15 mg/kg 50 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 305 322 349 330 352 298 326±22b 25 mg/kg ALT (IU/L) 232 230 255 248 251 265 246±14c 182 225 204 223 192 187 202±18d

Kết quả đo men gan (AST) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống dịch chiết EMC90 tại nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg và 50 mg/kg từ cây Muntingia calabura

15 mg/kg 50 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 805 756 790 743 684 797 762±45a 25 mg/kg AST (IU/L) 755 615 771 799 726 691 726±66a 647 703 680 643 720 591 664±47b

Kết quả đo men gan (ALT) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống dịch chiết AMC tại nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg và 50 mg/kg từ cây Muntingia calabura

15 mg/kg 50 mg/kg STT

1 230 25 mg/kg ALT (IU/L) 160 80

2 3 4 5 6 Trung bình 232 277 259 251 270 253±19c 137 149 145 166 157 152±11e 96 105 87 85 91 90±9f

Kết quả đo men gan (AST) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống dịch chiết AMC tại nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg và 50 mg/kg từ cây Muntingia calabura

15 mg/kg 50 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 475 501 455 527 550 549 510±39c 25 mg/kg AST (IU/L) 411 420 359 405 312 452 393±50d 307 322 256 331 310 288 302±27e

Kết quả đo men gan (ALT) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống dịch chiết sylimarin tại nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg và 50 mg/kg từ cây Muntingia calabura

15 mg/kg 50 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 44 35 49 27 30 45 38±9g 25 mg/kg ALT (IU/L) 37 20 25 33 45 39 33±9g 20 27 35 18 31 39 28±8g

Kết quả đo men gan (AST) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống dịch chiết sylimarin tại nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg và 50 mg/kg từ cây Muntingia calabura

15 mg/kg 50 mg/kg STT

1 2 3 4 5 6 Trung bình 114 139 155 102 130 131 128±19g 25 mg/kg AST (IU/L) 133 107 129 111 138 107 121±14gh 117 120 128 104 111 135 119±11gh

Kết quả đo men gan (ALT) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống acetaminophen và nhóm đối chứng

Độc Đối chứng STT ALT (IU/L)

1 2 3 4 5 6 Trung bình 38 40 22 33 38 30 34±8g

434 509 420 480 515 443 467±40a Kết quả đo men gan (AST) trên mô hình acetaminophen của nhóm chuột uống acetaminophen và nhóm đối chứng chuột khỏe mạnh

Độc Đối chứng STT AST (IU/L)

1 2 3 4 5 6 Trung bình 785 741 760 793 782 775 773±19a 74 83 77 65 71 59 72±8h

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ

Hàm lượng cắn thu được

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

6

Error Mean Square

1.884978

Critical Value of t

3.70743

Least Significant Difference

4.156

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

A

22.590 3 AMC

B

18.210 3 EMC70

C

7.307 3 EMC90

Định lượng Tương quan Pearson

Pearson Correlation Coefficients, N = 9 Prob > |r| under H0: Rho=0

POL

FLA

TAN

POL

1.00000

0.91114

0.82256

0.0006

0.0065

FLA

0.91114

1.00000

0.56705

0.0006

0.1113

TAN

0.82256

0.56705

1.00000

0.0065

0.1113

Chống oxi hóa Tương quan Pearson giữa Khả năng chống oxi hóa quét gốc tự do DPPH với kết quả định lượng phenolic và flavonoid

Pearson Correlation Coefficients, N = 9 Prob > |r| under H0: Rho=0

CHONGOXIHOA

POLY FLAVON

CHONGOXIHOA

1.00000

-0.45667

-0.78111

Pearson Correlation Coefficients, N = 9 Prob > |r| under H0: Rho=0

CHONGOXIHOA

POLY FLAVON

0.2166

0.0129

POLY

-0.45667

1.00000

0.91114

0.2166

0.0006

FLAVON

-0.78111

0.91114

1.00000

0.0129

0.0006

Tương quan Pearson giữa Khả năng chống oxi hóa theo phuong pháp FRAP với kết quả định lượng phenolic và flavonoid

Pearson Correlation Coefficients, N = 9 Prob > |r| under H0: Rho=0

CHONGOXIHOA

POLY FLAVON

CHONGOXIHOA

1.00000

0.98537

0.93520

<.0001

0.0002

POLY

0.98537

1.00000

0.91114

<.0001

0.0006

FLAVON

0.93520

0.91114

1.00000

0.0002

0.0006

Tương quan Pearson giữa Khả năng chống oxi hóa theo năng lục khử với kết quả định lượng phenolic và flavonoid

Pearson Correlation Coefficients, N = 9 Prob > |r| under H0: Rho=0

CHONGOXIHOA

POLY FLAVON

CHONGOXIHOA

1.00000

0.61413

0.88228

0.0785

0.0016

POLY

0.61413

1.00000

0.91114

0.0785

0.0006

FLAVON

0.88228

0.91114

1.00000

Pearson Correlation Coefficients, N = 9 Prob > |r| under H0: Rho=0

CHONGOXIHOA

POLY FLAVON

0.0016

0.0006

Hoạt tính kháng khuẩn ETEC

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

547.0555556 273.5277778 393.88 <.0001

2

Error

4.1666667

0.6944444

6

Corrected Total

551.2222222

8

R-Square Coeff Var Root MSE DKKK Mean

0.992441 5.576208

0.833333

14.94444

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MAU

25.8333 3 Cipro

A

11.0000 3 EMC70

B

8.0000 3 EMC90

C

Các chủng vi sinh vật gây bệnh khác

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

530.7569444

40.8274573 207.94 <.0001

13

Error

4.3194444

0.1963384

22

Corrected Total 35

535.0763889

R-Square Coeff Var Root MSE HTKK Mean

0.991927 3.637772

0.443101

12.18056

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N SC

A

17.0000 3 S1C2

A

16.5000 3 S2C2

B

14.6667 3 S3C1

C

13.3333 3 S1C3

D

C

12.8333 3 S2C1

D

E

12.1667 3 S4C1

D

E

12.1667 3 S4C3

D

E

12.0000 3 S1C1

D

E

12.0000 3 S4C2

E

11.3333 3 S2C3

E

11.1667 3 S3C2

1.0000 3 S3C3

F S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC C1 S. aureus C2 L. innocua C3 L. monocytogenes Hoạt tính kháng khuẩn tổng

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

12

218.0256410

18.1688034

53.48 <.0001

Error

26

8.8333333

0.3397436

Corrected Total 38

226.8589744

R-Square Coeff Var Root MSE HTKK Mean

0.961062 4.587717

0.582875

12.70513

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A

17.0000 3 S1C3

A

16.5000 3 S2C3

B

14.6667 3 S3C2

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

B

14.3333 3 S2C5

C

B

13.3333 3 S1C4

C

D

12.8333 3 S2C2

C

D

E

12.0000 3 S1C2

D

E

11.8333 3 S1C5

E

11.3333 3 S2C4

E

11.1667 3 S3C3

E

11.1667 3 S1C6

E

11.0000 3 S1C1

F

8.0000 3 S2C1

S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC C1 ETEC C2 Listeria monocytogenes C3 Listeria innocua C4 Staphylococcus aureus C5 Shigella flexneri C6 Shigella boydii Nồng độ ức chế tối thiểu

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

27

626.4761905

23.2028219

69.61 <.0001

Error

56

18.6666667

0.3333333

Corrected Total 83

645.1428571

R-Square Coeff Var Root MSE HTKK Mean

0.971066 5.388603

0.577350

10.71429

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

A

17.0000 3 S1N1C3

A

16.5000 3 S2N1C3

B

14.6667 3 S3N1C2

C

B

14.3333 3 S2N1C5

C

D

13.3333 3 S1N1C4

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MAU

E

D

12.8333 3 S2N1C2

E

D

12.3333 3 S2N2C5

F

E G D

12.0000 3 S1N1C2

F

E G D

12.0000 3 S3N2C2

F

E G

11.8333 3 S1N1C5

F

F

G

11.3333 3 S2N1C4

F

G

11.1667 3 S3N1C3

F

G

11.1667 3 S1N1C6

F

G

11.0000 3 S1N1C1

G

10.8333 3 S2N2C2

G

10.6667 3 S1N2C4

H

8.8333 3 S1N2C2

H

8.8333 3 S1N2C5

H

8.6667 3 S2N3C5

H

8.6667 3 S2N2C1

H

I

8.3333 3 S1N2C1

H

I

8.3333 3 S3N3C2

H

I

8.1667 3 S2N3C2

H

I

8.0000 3 S2N1C1

H

I

7.6667 3 S2N2C4

I

7.1667 3 S2N3C1

I

7.1667 3 S1N3C2

I

7.1667 3 S1N3C4

S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC N1 50 mg/ml N2 25 mg/ml N3 12,5 mg/ml C1 ETEC C2 Listeria monocytogenes C3 Listeria innocua C4 Staphylococcus aureus C5 Shigella flexneri C6 Shigella boydii Khả năng trị tiểu đường

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

47

264.1286435

5.6197584

23.34 <.0001

Error

60

14.4440556

0.2407343

Corrected Total 107

278.5726991

R-Square Coeff Var Root MSE GLU Mean

0.948150 6.590204

0.490647

7.445093

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N SC

A

9.6933 6 S4C2

A

9.6933 6 S4C1

A

9.6933 6 S4C3

B

A

8.7867 6 S1C1

B

A

8.7250 6 S3C1

B

8.3350 6 S1C2

B

C

8.1967 6 S3C2

B

C

8.1400 6 S2C1

B

C

D

7.7150 6 S2C2

E

C

D

7.2050 6 S3C3

E

D

7.0233 6 S1C3

E

F

6.5850 6 S2C3

F

5.8750 6 S6C2

F

5.8750 6 S6C3

F

5.8750 6 S6C1

F

5.5317 6 S5C3

F

5.5317 6 S5C1

F

5.5317 6 S5C2

S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC C1 100 mg/kg C2 150 mg/kg C3 200 mg/kg S4C1 S4C2 S4C3 nhóm tiểu đường, S5C1 S5C2 S5C3 nhóm đối chứng, S6C1 S6C2 S6C3 Glibenclamid 10 mg/kg

Khả năng trị tiêu chảy Tỷ lệ ức chế tiêu chảy Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

31

29430.61500

949.37468

31.98 <.0001

Error

40

1187.55520

29.68888

Corrected Total 71

30618.17019

R-Square Coeff Var Root MSE TYLE Mean

0.961214 10.20938

5.448750

53.37004

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N SC

A

78.868

6 S1C1

A

78.569

6 S4C1

A

78.569

6 S4C2

A

78.569

6 S4C3

B

58.212

6 S3C1

C

48.883

6 S1C2

C

47.008

6 S3C2

D

C

41.407

6 S2C1

D

C

40.029

6 S1C3

D

36.027

6 S2C2

D

35.366

6 S3C3

18.932

6 S2C3

E S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC C1 750 mg/kg C2 500 mg/kg C3 250 mg/kg S4C1 S4C2 S4C3 loperamid 3 mg/kg Thời gian tiêu chảy Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

73167.34444

1876.08575

35.29 <.0001

Model

39

Error

50

2657.77778

53.15556

Corrected Total 89

75825.12222

R-Square Coeff Var Root MSE THOIGIAN Mean

0.964949 5.707321

7.290786

127.7444

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N SC

A

164.667 6 S4C2

A

164.667 6 S4C1

A

164.667 6 S4C3

B

A

157.667 6 S1C1

B

C

144.333 6 S1C2

D

C

140.333 6 S3C1

D

C

134.333 6 S3C2

D

C

129.833 6 S1C3

D

E

124.667 6 S2C1

F

E

112.667 6 S2C2

F

G

105.167 6 S3C3

F

G

97.667 6 S2C3

G

91.833 6 S5C1

G

91.833 6 S5C2

91.833 6 S5C3

G S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC C1 750 mg/kg C2 500 mg/kg C3 250 mg/kg S4C1 S4C2 S4C3 loperamid 3 mg/kg S5C1 S5C2 S5C3 nhóm tiêu chảy Khối lượng phân

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

39

5.79023204

0.14846749

92.57 <.0001

Error

50

0.08019378

0.00160388

Corrected Total 89

5.87042582

R-Square Coeff Var Root MSE PHAN Mean

0.986339 8.012176

0.040048

0.499844

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N SC

A

0.88467 6 S5C1

A

0.88467 6 S5C2

A

0.88467 6 S5C3

B

0.71717 6 S2C3

C

0.57217 6 S3C3

C

0.55100 6 S2C2

D

C

0.52617 6 S2C1

D

C

E

0.51100 6 S1C3

D

E

0.45783 6 S3C2

F

E

0.43200 6 S1C2

F

0.35433 6 S3C1

G

0.18167 6 S4C3

G

0.18167 6 S4C2

G

0.18167 6 S4C1

G

0.17700 6 S1C1

S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC C1 750 mg/kg C2 500 mg/kg C3 250 mg/kg S4C1 S4C2 S4C3 loperamid 3 mg/kg S5C1 S5C2 S5C3 nhóm tiêu chảy Giải độc gan ALT

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

47

2630791.889

55974.296 491.09 <.0001

Error

60

6838.778

113.980

Corrected Total 107

2637630.667

R-Square Coeff Var Root MSE ALT Mean

0.997407 5.902034

10.67612

180.8889

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N SC

A

466.83 6 S5C1

A

466.83 6 S5C2

A

466.83 6 S5C3

B

326.00 6 S2C1

C

253.17 6 S3C1

C

246.83 6 S2C2

D

202.17 6 S2C3

D

201.33 6 S1C1

E

152.33 6 S3C2

F

120.00 6 S1C2

F

90.67 6 S3C3

G

47.50 6 S1C3

G

38.33 6 S4C3

G

38.33 6 S4C1

G

38.33 6 S4C2

G

33.50 6 S6C1

G

33.50 6 S6C2

G

33.50 6 S6C3

S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC C1 15 mg/kg C2 25 mg/kg C3 50 mg/kg S4C1 S4C2 S4C3 Sylimarin 15 mg/kg S5C1 S5C2 S5C3 Tăng men gan S6C1 S6C2 S6C3 Đối chứng AST

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

47

8063183.102

171557.087 191.46 <.0001

Error

60

53761.889

896.031

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Corrected Total 107

8116944.991

R-Square Coeff Var Root MSE AST Mean

0.993377 7.502028

29.93378

399.0093

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N SC

A

772.67 6 S5C1

A

772.67 6 S5C2

A

772.67 6 S5C3

A

762.50 6 S2C1

A

726.17 6 S2C2

B

664.00 6 S2C3

C

509.50 6 S3C1

D

403.50 6 S1C1

D

393.17 6 S3C2

E

302.33 6 S3C3

E

294.67 6 S1C2

F

208.33 6 S1C3

G

128.50 6 S4C3

G

128.50 6 S4C1

G

128.50 6 S4C2

H

71.50 6 S6C1

H

71.50 6 S6C2

H

71.50 6 S6C3

S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC C1 15 mg/kg C2 25 mg/kg C3 50 mg/kg S4C1 S4C2 S4C3 Sylimarin 15 mg/kg S5C1 S5C2 S5C3 Tăng men gan S6C1 S6C2 S6C3 Đối chứng

HPLC/MS: SẮC KÝ ĐỒ DỊCH CHIẾT EMC70

Phạm Hữu Tuấn Email: huutuanpro93@yahoo.com Đt: 0909234159