Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chiết suất hoạt chất từ cây gai xanh (Boehmeria nivea L. Gaud) và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC

NGHIÊN CỨU CHIẾT SUẤT HOẠT CHẤT

TỪ CÂY GAI XANH (Boehmeria nivea L.Gaud)

VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM

BẢO VỆ SỨC KHỎE

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC

NGHIÊN CỨU CHIẾT SUẤT HOẠT CHẤT

TỪ CÂY GAI XANH (Boehmeria nivea L.Gaud)

VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM

BẢO VỆ SỨC KHỎE Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Văn Chí

Thái Nguyên - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được

sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS.Trần Văn Chí đã

luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành

luận văn này.

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến ThS. Lưu Hồng Sơn cùng các cán bộ, các bạn

sinh viên Khoa Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông

Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Em xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Sinh Huỳnh, chủ nhiệm đề tài

“Nghiên cứu công nghệ chế biến một số sản phẩm từ cây gai xanh tại tỉnh Cao

Bằng”, của sở Khoa học và công nghệ tỉnh Cao Bằng năm 2018, giám đốc công ty

cổ phẩn giống và chăn nuôi Cao Bằng đã giúp đỡ em trong quá trình thực tập và

nghiên cứu, cũng như hỗ trợ kinh phí để thực hiện luận văn.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,

người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực

hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2019

Học Viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hồng Ngọc

ii

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i

MỤC LỤC ................................................................................................................... ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... v

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vii

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết ........................................................................................................... 1

1.1. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2

1.1.1. Mục tiêu chung .................................................................................................. 2

1.1.2. Mục tiêu cụ thể .................................................................................................. 2

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................................. 2

1.2.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................................. 2

1.2.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................... 2

Chương 1 .................................................................................................................... 3

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU .................. 3

1.1. Cơ sở khoa học ..................................................................................................... 3

1.1.1. Tổng quan về cây gai xanh ........................................................................ 3

1.1.2. Các hoạt chất sinh học trong cây gai xanh và tính chất của chúng ................. 5

1.1.3. Tổng quan về gốc tự do và các chất chống oxi hóa .......................................... 6

1.1.4. Định nghĩa thực phẩm chức năng ................................................................ 7

1.1.5. Đặc điểm và tác dụng của thực phẩm chức năng .......................................... 8

1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh ..................................... 8

1.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh tại Việt Nam ........... 8

1.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh trên thế giới ............ 9

Chương 2 .................................................................................................................. 12

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 12

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................... 12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 12

iii

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 12

2.1.2.1. Phạm vi nội dung .................................................................................. 12

2.1.2.2. Phạm vi không gian nghiên cứu: ............................................................ 12

2.1.2.3. Vật liệu, hoá chất và thiết bị sử dụng ...................................................... 12

2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 13

2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 13

2.3.1. Phân tích, thử nghiệm hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong cây gai

xanh .................................................................................................................. 13

2.3.1.1. Xác định hàm lượng flavonoid tổng số bằng phương pháp cân ................ 13

2.3.1.2. Phương pháp xác định hoạt động chống oxy hóa tế bào ........................... 14

2.3.2. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai ........................ 15

2.3.3. Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn ................................................... 19

2.3.4. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai .............. 19

2.3.4.1. Nghiên cứu, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất trà túi lọc từ lá Gai .. 19

2.3.4.2. Nghiên cứu, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất cao từ rễ (củ) Gai: ... 26

2.3.4.3. Phương pháp phân tích chỉ tiêu chất lượng các sản phẩm thu được .......... 27

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 28

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 29

3.1. Kết quả nghiên cứu một số hoạt chất sinh học trong dịch chiết lá và củ gai ..... 29

3.1.1. Kết quả phân tích hoạt chất sinh học trong một số bộ phận cây gai xanh ...... 29

3.1.2. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá gai ........................... 30

3.2. Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai ............................................. 32

3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết suất. ............................................ 33

3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết suất. .......................................................... 33

3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết suất ............................................................ 34

3.2.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi .............................................. 35

3.2.5. Kết quả tối ưu các điều kiện chiết suất dịch củ gai. .................................... 36

3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến chất lượng sản phẩm. .......................... 39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

3.2.7. Kết quả phân tích hàm lượng flavonoid trong cao củ gai ........................... 39

iv

3.3. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của một số hoạt chất sinh học của

cây gai xanh; ............................................................................................................. 40

3.4. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai ...... 42

3.4.1. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc ......................... 42

3.4.1.1.Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu .............................. 42

3.4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình sản xuất 43

3.4.1.3 Quy trình sản xuất .................................................................................. 46

3.4.1.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm trà túi lọc từ lá gai ................... 47

3.4.2. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất cao củ gai ........................ 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 50

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO. .............................................................. 51

I. Tài liệu tiếng Việt: ................................................................................................. 51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

II. Tài liệu tiếng Anh: ................................................................................................ 51

v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CT : Công thức

IFIC : Hiệp hội thông tin thực phẩm quốc tế

DPPH : 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

HPLC : High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký

lỏng hiệu năng cao

LB : Luria Bertani

ROS : Reactive oxygen species - Gốc tự do oxy hóa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

SSR : Simple sequence repeat - Chuỗi lặp lại đơn giản

vi

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu ............................................................. 18

Bảng 2.2. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng hoạt chất

sinh học của cao củ gai .............................................................................................. 18

Bảng 3.1. Bảng kết quả phân tích các hoạt chất sinh học trong một số bộ phận của

cây gai xanh ............................................................................................................... 29

Bảng 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết được thể hiện qua giá trị IC50 .... 32

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng flavonoid ..................... 33

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số ........... 34

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số ............ 34

Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hàm

lượng flavonoid tổng số ............................................................................................ 35

Bảng 3.7: Ma trận thực nghiệm Box-Behken ba yếu tố chiết củ Gai ....................... 36

Bảng 3.9. Kết quả của ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến chất lượng sản

phẩm ................................................................................................................ 39

Bảng 3.8: Phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết suất từ củ Gai ............ 37

Bảng 3.10. Kết quả phân tích hàm lượng flavonoid trong cao củ gai ...................... 40

Bảng 3.11. Đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết lá gai kháng E. coli, B. subtilis

và S. aureus ............................................................................................................... 41

Bảng 3.12. Bảng kết quả phân tích một số chỉ tiêu từ lá và rễ của cây gai xanh ...... 42

Bảng 3.13. Kết quả đánh giá cảm quan nhiệt độ đến quá trình sấy .......................... 43

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của thời gian sấy .................................................................. 44

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu .................................................. 45

Bảng 3.16. Tỷ lệ nguyên liệu phụ bổ sung vào trong sản phẩm ............................... 45

Bảng 3.17. Kết quả đánh giá chất lượng sản phẩm ................................................... 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Bảng 3.18. Kết quả đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật ...................................................... 48

vii

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cây gai xanh và củ của cây gai xanh .......................................................... 3

Hình 2.1. Phản ứng khử gốc DPPH .......................................................................... 14

Hình 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá gai .......................................... 31

Hình 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của Acid ascorbic ............................................. 31

Hình 3.3. Bề mặt đáp ứng hàm lượng flavonoid ....................................................... 38

Hình 3.4. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu hàm lượng flavonoid trong dịch chiết . 38

Hình 3.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá gai với vi khuẩn lần lượt

A: Escherichia coli, B: Bacillus subtilis, C: Staphylococcus. aureus và D: Đối

chứng dương Ampicillin, đối chứng âm nước cất. ................................................... 40

Hình 3.6. Khả năng kháng khuẩn của cao củ gai đối với Bacillus subtilis và

Escherichia coli ......................................................................................................... 42

Hình 3.7. Sơ đồ quy trình sản xuất trà túi lọc lá gai ................................................. 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.8. Quy trình sản xuất cao củ gai .................................................................... 48

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết

Cây gai xanh - Boehmeria nivea (L.) Gaud đã được sử dụng từ 5.000 - 3.300

trước công nguyên trong các loại vải xác ướp ở Ai Cập. Nó được trồng như một loại

cây lấy sợi ở nhiều quốc gia bao gồm Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Philippines,

Ấn Độ và Hàn Quốc. Phần vỏ ngoài của thân cây gai xanh chứa hàm lượng chất xơ

cao, khi thu hoạch chủ yếu đã và đang được sử đụng để sản suất vải sợi. Ngoài ra

trong thành phần chất xơ này có hoạt chất với khả năng chống vi khuẩn, côn trùng

tấn công và nấm mốc [12].

Ở Hàn Quốc đã có rất nhiều nghiên cứu về việc sử dụng cây gai xanh trong

thực phẩm, chẳng hạn như nhiều loại bánh gạo truyền thống của Hàn Quốc [12].

Đặc biệt, phần lá của cây gai xanh rất giàu các yếu tố dinh dưỡng như khoáng chất,

protein, vitamin, và nhiều chất hoạt tính sinh học khác nhau [18].

Trong thuốc thảo dược truyền thống của Trung Quốc đã sử dụng rễ của cây

gai xanh để điều trị cảm lạnh thông thường, phù nề, sốt, nhiễm trùng đường tiết

niệu, viêm thận và an thai rất tốt [12].

Những nghiên cứu trước đây đã tìm thấy các hợp chất quý có trong cây gai

xanh như alkaloids, lignans, flavon, terpenoids và glycosides và axit behenic, axit

ursolic, β- sitosterol, cholesterol, kiwiionoside, rutin, uracil, quercetin, α-amyrin,

nonacosanol, emodin, emodin-8-O-β-glucoside, physcion, polydatin, catechin,

epicatechin và epicatechin gallate [12].

Theo dược lý hiện đại, lá gai có chlorogenic acid, flavonoid rhoifolin,

apogenin. Trong đó chlorogenic acid có tác dụng diệt nấm, vi khuẩn và chống oxy

hóa mạnh gấp 10 lần vitamin E. Nó phong tỏa nhóm “tự do”, ngăn chặn sự oxy hóa

lipoprotein LDL, là khởi điểm của xơ động mạch để dẫn tới cao huyết áp và nhồi

máu cơ tim.

Các báo cáo đã chỉ ra rằng các chất chiết xuất từ rễ cây gai xanh đã biểu hiện

các hoạt động bảo vệ gan chống lại các tổn thương gan do CCl4 gây ra và các tác

dụng chống oxy hóa trên FeCl2-ascorbate gây ra lipid peroxid hóa trong gan

homogenate [12]. Trong nghiên cứu Xiaoning Wang và cs đã chỉ ra rằng chiết xuất

2

Boehmeria nivea (L.) Gaud có thể ngăn ngừa thoái hóa thần kinh dẫn đến bệnh

Alzheimer [23].

Mặc dù cây gai xanh có rất nhiều công dụng đối với sức khỏe con người đặc

biệt là từ phần lá và củ của cây, nhưng hiện nay vẫn chưa có một quy trình cụ thể trong

sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng từ lá gai và củ gai. Do đó, tôi tiến hành

thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết suất hoạt chất từ cây gai xanh (Boehmeria nivea

L. Gaud) và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

2.1. Mục tiêu chung

Nghiên cứu chiết suất hoạt chất từ cây gai xanh (Boehmeria nivea L. Gaud)

và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng.

2.2. Mục tiêu cụ thể

- Nghiên cứu thành phần hoạt chất sinh học có trong nguyên liệu lá và củ gai;

- Tối ưu hóa quy trình chiết suất một số hoạt chất có hoạt tính sinh học cao từ

lá và củ gai;

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của lá và củ cây gai xanh;

- Quy trình nghiên cứu sản xuất sản phẩm trà túi lọc lá gai, cao củ gai và

đánh giá chất lượng sản phẩm.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1. Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp thêm các thông tin khoa học về cây gai xanh; quy trình hoàn

thiện sản phẩm thực phẩm chức năng từ củ gai và lá gai.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ chiết suất được hợp chất sinh học, từ đó xây

dựng hoàn thiện quy trình sản xuất thực phẩm chức năng từ lá gai và cao củ gai tạo

sản phẩm có tác dụng tốt đối với sức khỏe của người sử dụng.

3

Chương 1

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1. Cơ sở khoa học

1.1.1. Tổng quan về cây gai xanh [1],[2],[7],[11]

Hình 1.1. Cây gai xanh và củ của cây gai xanh[2]

Mô tả thực vật

Tên khoa học: Boehmeria nivea (L.) Gaud

Tên đồng nghĩa : Urtica nivea L.

Tên khác: Gai tuyết, gai làm bánh (Kinh), trữ ma, bâu pán (Tày), co pán

(Thái), chiểu đủ (Dao)

Tên nước ngoài: Ramie grass, China grass, chinese silk – plant (Anh); ramie,

ramie blanche, ramie de Chine, ortle de Chine argentee, ortie à feuilles blanches (Pháp)

Họ : Gai (Urticaceae)

Cây nhỏ, cao 1 – 2m. Thân cứng hóa gỗ ở gốc. Cành màu đỏ nhạt, phủ nhiều

lông sát. Lá mọc so le, hình trái xoan hoặc hình trứng, gốc tròn hay hình tim, đầu

thuôn nhọn, dài 7 – 15 cm, rộng 4 – 8 cm, lúc non phủ nhiều lông mềm ở cả hai

4

mặt, lúc già thì mặt trên nhẵn màu lục sẫm, mặt dưới lông trở thành trắng bạc, mép

có răng hình tam giác, gân gốc 3, cuống lá mảnh, màu đỏ, có lông mềm, lá kèm

hình dải nhọn, dễ rụng.

Cụm hoa cùng gốc hay khác gốc, ngắn hơn lá, mọc ở kẽ lá, xếp thành chùy

đơn ở hoa cái hay hợp lại với nhau ở hoa cái và hoa đực, có khi tạo thành những

túm dày đặc; cụm hoa đực nhiều hoa, nụ hình cầu có lông lởm chởm, lá dài 4, nhị 4,

nhụy lép có dạng quả lê; cụm hoa cái hình cầu, mang nhiều hoa, bao hoa màu lục

nhạt, hình trứng có lông, bầu giẹp, hình trái xoan, hơi có cánh.

Quả bế, hình quả lê, có nhiều lông, hạt có dấu.

Mùa hoa quả: tháng 11 – 1.

Phân bố khắp cả nước, tuy nhiên phát hiện nhiều tại các vùng đồng bằng,

miền núi của miền Bắc Việt Nam như: Cao Bằng, Lào Cai, Quảng Ninh, Thái

Nguyên, Lạng Sơn, Hà Tây, Hà Nội.

Chi Boehmeria Jacq gồm 75 loài, phân bố rải rác khắp các vùng miền nhiệt

đới và cận nhiệt đới bắc bán cầu. Ở châu Á có 15 loài, trong đó Việt Nam có

khoảng 10 loài. Gai là cây trồng tương đối phổ biến trong nhân dân để lấy lá làm

bánh và rễ củ làm thuốc. Gai còn phân bố ở nhiều nước khác như Ấn Độ, Thái Lan,

Lào, Trung Quốc, Campuchia và Nhật Bản.

Gai thuộc loại cây ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng, sinh trưởng phát triển nhanh

trong mùa mưa ẩm, đến mùa đông có hiện tượng rụng lá, hơi tàn lụi. Cây ra hoa

hàng năm. Chưa quan sát được cây con mọc từ hạt. Song, gai lại có khả năng tái

sinh vô tính khỏe bằng cách tái sinh cây chồi sau khi chặt và từ các đoạn thân, cành

đem giâm xuống đất.

Bộ phận dùng

Rễ củ gai thường gọi là trử ma căn. Rễ thu hái quanh năm, tốt nhất là vào mùa

hạ hay mùa thu. Đào rễ rửa sạch đất cát, cắt bỏ rễ con, để nguyên hay thái phiến,

dùng tươi hay phơi, sấy khô, Rễ hình trụ, thường cong queo dài 5 – 10 cm, đường

kính 0,5 – 1,5 cm, mặt ngoài nâu sẫm, có những nếp nhăn dọc và sẹo của dễ con, dễ

nẻ, vết bẻ màu vàng có xơ, không mùi, vị nhạt.

5

Lá gai dùng làm bánh hoặc nấu nước uống thanh nhiệt, giải cảm, ngoài ra hàm

lượng protein trong lá rất cao được ứng dụng trực tiếp làm thức ăn gia súc để cung

cấp hàm lượng đạm thực vật cho vật nuôi…

Thân gai: Hàng năm, các nhà máy dệt của Việt Nam phải nhập khẩu hàng vạn

tấn sợi gai để sản xuất vải. Ngoài ứng dụng thân cây gai xanh để sản xuất vải may

mặc, nó còn được ứng dụng tạo sợi đan lưới đánh cá và là cơ chất lý tưởng để nuôi

trồng và sản xuất nấm ăn.

Năng suất thân gai tươi thường 40 - 60 tấn/ha, cho 1.000 - 1.600 kg sợi khô và

500 - 1.200 kg sợi đã loại chất keo. Ở Philippin thu được 2.000 kg sợi khô/ha trong

năm đầu và 3.500 kg sợi khô trong các năm tiếp theo. Các diện tích gai ở nhiều nước

thường sau 7 - 20 năm mới phải phá đi để trồng lại. Gai trồng để làm thức ăn gia súc,

năng suất lá có thể đến 300 tấn tươi hay 42 tấn khô với 14 lần cắt trong 1 năm. Năng

suất phụ thuộc nhiều vào tính chất thổ nhưỡng, cách chăm sóc và trồng giống.

1.1.2. Các hoạt chất sinh học trong cây gai xanh và tính chất của chúng

Lá cây gai xanh cũng thường được sử dụng trong các biện pháp dân gian như

một thuốc lợi tiểu và chống sốt, và đã được cho là có tính chất hepatoprotective,

chống oxy hóa, và chống viêm [12]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng lá gai

chứa kiwiionoside, rutin, uracil, axit 3-hydroxy-4-methoxy-benzoic, cholesterol, α-

amyrin, nonacosanol, emodin, emodin-8-O-β-glucoside, physcion, polydatin,

catechin , kali nitrat, β-sitosterol, epicatechin và epicatechin gallate.

Hơn nữa, lá của B. nivea chứa một lượng lớn các hợp chất phenolic, có khả

năng ức chế men chuyển đổi angiotensin I. Trong rễ của loài B. tricuspis có một số

epicatechin dimers như (-) - epiafzelechin - (-) - epicatechin-4,8 (hoặc 6) -dimer, và

(-) - epicatechin - (-) epicatechin- 4,8- (hoặc 6) –dimer, trong số đó epicatechin,

epicatechin gallate, và rutin là các hợp chất polyphenolic được gọi là flavonoid,

được biết đến với đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u, chống vi

khuẩn, chống virus và chống dị ứng [12].

Rễ gai chứa acid chlorogenic, acid protocatechuic, acid cafeic, acid quinic,

rhoifolin 0,7%, apigenin, rhoifolin khi thủy phân cho apigenin, glucose, rhamnose.

Ngoài ra, còn chứa β- sitosterol, daucosterol và acid 19α hydroxyl ursolic (CA, 126,

1997, 291739). Các polysaccharide thành phần chủ yếu gồm D- galctose , L –

6

rhamnose, D –arabinose, D – mannose, và D – galacturonic Me – ester. Bên cạnh

polysaccharid, còn có một số oligosaccharid và monosaccharide. Các

monosaccharide trong rễ cây là erythrose, heptose và một lượng nhỏ D – galactose,

L – arabinose, acid D- galacturonic, melibiose, glucose và fructose, các

polysaccharide, một số oligo saccharid và monosaccharide. Các pectin với thành

phẩn chủ yếu là acid D – galacuronic và dẫn chất mentyl ester của chúng, cùng với

đường L – rhamnose, D – galactose, L – arabinose, L – fructose, D – glucose, D –

manose và D – Xylose, các hemicelluloses với thành phần chính là glucomannan [11].

1.1.3. Tổng quan về gốc tự do và các chất chống oxi hóa

1.1.3.1. Giới thiệu về gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử hay phân tử mất đi một điện tử ở lớp vỏ ngoài

cùng. Do thiếu một điện tử nên các phân tử hay nguyên tử này trở nên không ổn

định và dễ dàng phản ứng với các phân tử/nguyên tử lân cận khác để trở nên bền

vững, kết quả tạo ra một loạt gốc tự do mới [15].

-•) hydroxyl (OH•), peroxyl (ROO•), lipid peroxyl (LOO•); và từ

Phân loại: gốc tự do được tạo ra từ nguyên tử oxy (reactive oxygen species – ROS)

như superoxide (O2

•). Ngoài ra các phân tử không phải là gốc tự do như hydroperoxide

nguyên tử nitơ (Reactive nitrogen species) như nitric oxide (NO•) và nitrogen

dioxide (NO2

(H2O2), ozon (O3), oxy phân tử (O2), axit hypochoric (HOCl), axit nitric (HNO2),

chúng được gọi những chất oxi hóa do dễ dàng tạo ra các phản ứng sinh gốc tự do

trong tế bào [15].

Gốc tự do nội sinh được tạo ra từ các phản ứng enzyme trong tế bào liên

quan đến hoạt động hô hấp, thực bào, tổng hợp prostaglandin và hoạt động chuyển

hóa của hệ enzyme cytochrome P450. Các trường hợp sinh ra gốc tự do nội sinh

như hoạt động của tế bào miễn dịch, viêm, căng thẳng, tập thể dục quá sức, thiếu

máu cục bộ, nhiễm trùng, ung thư và lão hóa. Ngược lại gốc tự do sinh ra không

liên quan đến hoạt động của các enzyme mà do phản ứng của oxy với các hợp chất

hữu cơ hoặc do các phản ứng phophoryl hóa xảy ra ở ty thể gọi là gốc tự do ngoại

sinh. Nguồn gốc của các gốc tự do ngoại sinh từ không khí, nước bị ô nhiễm, khói

thuốc, rượu, kim loại nặng (Cd, Hg, Pb, Fe, As), thuốc kháng sinh (gentamycin,

7

bleomycine), thuốc ức chế miễn dịch (cyclosporine, tacrolimus), thịt hun khói, dầu

mỡ cháy, phóng xạ [15].

Vai trò của gốc tự do: Ở mức thấp và vừa, gốc tự do là nguồn cung cấp năng

lượng cho cơ thể, tạo ra các chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần sản xuất

axit béo không bão hòa có tác dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường miễn dịch.

Tuy nhiên ở nồng độ cao nó sẽ gây ra sự phá hủy cấu trúc tế bào và là nguyên nhân

của các bệnh mạn tính và thoái hóa như ung thư, hen, lão hóa, rối loạn miễn dịch,

tim mạch và thoái hóa tế bào thần kinh (Alzheimer, Parkinson), trầm cảm, thoái hóa

khớp [15].

1.1.3.2. Các chất chống oxi hóa

Khi gốc tự do bị dư thừa cơ thể có cơ chế bảo vệ bằng cách sản sinh ra các

chất để trung hòa các gốc tự do gọi là các chất chống oxi hóa. Chất chống oxi hóa

gồm enzyme chống oxi hóa tương ứng với các gốc tự do như superoxide dismutase

(SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) và glutathione reductase

(GRx); các chất chống oxi hóa không có hoạt tính enzyme gồm chất chống oxi hóa

chuyển hóa (còn được gọi là chất chống oxi hóa nội sinh được sinh ra bởi quá trình

chuyển hóa trong cơ thể như axit lipoid, glutathione, L-ariginine, coenzyme Q10,

melatonin, acid uric, bilirubin, …) và chất chống oxi hóa dinh dưỡng (là chất chống

oxi hóa ngoại sinh không được sản xuất trong cơ thể phải cung cấp từ thực phẩm

hay bổ sung như vitamin E, vitamin C, carotenoids, flavonoid, omega-3, omega-6,

các nguyên tố: manganm kẽm, selen) [16].

1.1.4. Định nghĩa thực phẩm chức năng

 Tại Mỹ: Thực phẩm chức năng (thực phẩm bảo vệ sức khỏe): là thực phẩm

mang đến nhiều lợi ích cho sức khỏe, là bất cứ thực phẩm nào được thay đổi thành

phần qua chế biến hoặc có các thành phần của thực phẩm có lợi cho sức khỏe ngoài

thành phần dinh dưỡng truyền thống của nó.

 Hiệp hội thông tin thực phẩm quốc tế (IFIC):

Thực phẩm chức năng là thực phẩm mang đến những lợi ích cho sức khỏe

vượt xa hơn cơ bản.

 Tại Úc: Thực phẩm chức năng là thực phẩm:

- Có tác dụng đối với sức khỏe hơn là các chất dinh dưỡng thông thường.

8

- Gần giống như các TP truyền thống nhưng nó được chế biến để cho mục

đích ăn kiêng hoặc tăng cường các chất dinh dưỡng để nâng cao vai trò sinh lí của

chúng khi bị giảm dự trữ.

- Được chế biến, sản xuất theo công thức chứ không phải các thực phẩm có

sẵn trong tự nhiên.

 Bộ Y tế Việt Nam: thông tư số 08/TT-BYT ngày 23/08/2004 về việc

“Hướng dẫn việc quản lí các sản phẩm thực phẩm chức năng” đã đưa ra định nghĩa:

Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận

trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể sự thoải mái, tăng sức đề

kháng và giảm nguy cơ gây bệnh [8].

1.1.5. Đặc điểm và tác dụng của thực phẩm chức năng

 Đặc điểm:

- Là thực phẩm - không phải thuốc

- Là thực phẩm không giàu calo

- Đầy đủ, cân đối các chất dinh dưỡng (được thiết kế theo nhu cầu dinh dưỡng

của cơ thể).

- Là dinh dưỡng tế bào (có khả năng cung cấp dinh dưỡng trực tiếp cho tế bào

và giúp tế bào giải độc, kháng gốc tự do, hỗ trợ chu trình chuyển hóa tế bào)

1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh

1.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh tại Việt Nam

Ở Việt Nam từ xưa tới nay, cây gai xanh được khai thác theo 2 hướng chủ yếu

là cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất sợi và làm dược liệu theo y học

cổ truyền. Bên cạnh đó nhiều địa phương sử dụng lá Gai để làm bánh, nhiều nơi tạo

thành thương hiệu của vùng, miền mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân như

Hải Dương, Hàm Yên (Tuyên Quang), Cao Bằng.

Các công trình nghiên cứu liên quan đến cây gai xanh phải kể đến: Năm 2008,

tác giả Tạ Kim Chính và cộng sự thuộc trung tâm nghiên cứu sản xuất các chế phẩm

sinh học đã có đề tài nghiên cứu phát triển cây gai xanh (Boehmeria nivea L.Gaud)

trên đất dốc rừng đầu nguồn sông Đà, góp phần bảo vệ môi trường và xoá đói giảm

nghèo cho vùng di dân lòng hồ ở Sơn La đã đem đến những ý nghĩa lớn trong phát

triển kinh tế [9].

9

Năm 2016, ThS. Trần Đức Hảo, Viện nghiên cứu bông và phát triển nông

nghiệp Nha Hố đã chủ trì thực hiện nhiệm vụ quỹ gen “Khai thác và phát triển

nguồn gen các giống gai xanh (Boehmeria nivea L. Gaudich) Phú Yên và Thanh

Hóa”, nhằm phát triển 2 giống gai xanh có nguồn gốc từ những nơi này, chất lượng

tốt, cùng với các quy trình kỹ thuật trồng và chăm sóc để phục vụ sản xuất [10].

Tuy nhiên các nghiên cứu chuyên sâu về tác dụng dược lý của cây gai xanh

chủ yếu được công bố bởi các báo cáo khoa học nước ngoài. Trong nước, cây gai

xanh chủ yếu được ghi chép trong các bản ghi chép của y học cổ truyền và sử dụng

theo kinh nghiệm dân gian. Cây được khai thác lấy lá và củ, có vị ngọt, tính hàn,

không độc, có tác dụng tả nhiệt, tán ứ, chữa đơn độc, thông tiểu, chữa sang lở.

Trong tác phẩm “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Giáo sư Đỗ Tất Lợi

do Nhà xuất bản Y học phát hành, được Hội đồng chứng chỉ (khoa học) tối cao Liên

Xô công nhận, cây gai xanh được giới thiệu như một vị thuốc an thai, lợi tiểu. Thực

tế, từ xa xưa nhân dân ta đã biết sử dụng và truyền bá kinh nghiệm trong dân gian

việc dùng cây gai xanh để làm thuốc an thai và chữa sa dạ con. Vị thuốc cây gai xanh

hiện được bán nhiều nơi tại các hiệu thuốc đông y trên toàn quốc ở dạng phơi khô, có

thể đã sơ chế hoặc ở dạng thô [2]. Trên thị trường cũng xuất hiện những sản phẩm

đóng gói nhỏ, lẻ có chứa thành phần là lá hoặc củ gai kết hợp với nhiều loại dược liệu

khác, dễ dàng trong quá trình sử dụng, bảo quản và vận chuyển. Giá thành lá Gai khô

hiện nay khoảng 20.000 VNĐ/Kg, thay đổi tùy địa phương và thị trường.

1.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng cây gai xanh trên thế giới

Cây gai xanh – Boehmeria nivea (L.) Gaud là loại thực vật tự nhiên rất phổ

biến tại nhiều nước Châu Á. Người Trung Quốc, Nhật Bản đã biết sử dụng cây gai

xanh làm sợi từ rất lâu đời. Từ khoảng 3000-5000 năm trước Công nguyên tại Ai

Cập, cây gai xanh đã được biết tới như một mặt hàng xuất khẩu và các nước như

Guatemala, Brazil và Nam Mỹ đã nghiên cứu khả năng tận dụng nguồn lá gai giàu

protein làm thức ăn chăn nuôi. Việc sử dụng lá gai cho chăn nuôi trâu bò, cừu, lợn

là hoàn toàn khả thi cho dù là hình thức lá tươi hay dạng bột.

Việc sử dụng các sản phẩm phụ của ngành công nghiệp dệt may có nguồn

gốc từ lá gai làm thức ăn cho gia súc đã gợi ý cho nhiều nhóm nghiên cứu tìm cách

khai thác và tăng số lượng sinh khối của cây gai xanh. Các bộ phận cây như lá, hạt,

10

ngọn, thân cây sau khi chiết suất để tạo sợi, đều được sử dụng làm thức ăn cho động

vật với mức độ dinh dưỡng có thể chấp nhận được. Phụ phẩm từ lá cho thấy lượng

protein hay vật chất khô lên tới 20%.

Năm 2010, G. Contò và cộng sự đã đánh giá về mức độ dinh dưỡng và thành

phần hóa học của lá và ngọn cây lá Gai, là những phần không được sử dụng cho quá

trình sản xuất sợi, phát hiện trong khối lượng khô của mẫu lá Gai có chứa protein

thô với hàm lượng 17,00 ± 1,52% ở lá, 15,25 ± 0,77% ở ngọn và 11,79 ± 3,32%

tính trên toàn bộ cây. Phát hiện này góp phần mở ra những hướng phát triển mới,

tránh lãng phí những sản phẩm truyền thống của cây gai xanh [13].

Năm 2011, Xiao YingTian và cộng sự sử dụng dịch chiết lá Gai xanh và thử

nghiệm trên 05 nhóm chuột mang thai qua đường uống với nồng độ thay đổi từ 2g-

32g/kg/ngày, nhóm đối chứng âm sử dụng nước cất và đối chứng dương sử dụng

vitamin A, đồng thời cho tiếp xúc với 2 dòng tế bào là dòng tế bào phôi và dòng tế

bào 3T3 (nguyên bào sợi). Kết quả cho thấy các tiêu chí về khối lượng cơ thể bào

thai, mức tăng trọng lượng cơ thể chuột mẹ, khối lượng tim, gan, thận, kiểm tra mô

học trong các nhóm thí nghiệm không có sự khác biệt. Giá trị IC50 (ức chế 50%)

giữa dòng tế bào phôi và dòng tế bào 3T3 là tương đương, tuy nhiên khả năng sống

sót của phôi sẽ có thể bị ảnh hưởng khi nồng độ dịch chiết Gai xanh tăng cao. Phát

hiện này bổ sung những thông tin thực nghiệm khoa học cho quá trình đánh giá độ

an toàn của cây gai xanh khi sử dụng cho cơ thể động vật bậc cao, đặc biệt trong

những trường hợp sử dụng để điều trị xảy thai [21].

Tại Hàn Quốc, lá hoặc rễ cây gai xanh được sử dụng kết hợp với những thành

phần dược liệu khác làm đồ uống cho người và tạo thành sản phẩm được lưu thông

trên thị trường. Tuy rằng công thức phối trộn không được công bố do vấn đề thương

hiệu và bản quyền nhưng trong thành phần phối trộn có chứa lá Gai hoặc dịch chiết

lá Gai và có thể được bổ sung nhiều canxi. Những sản phẩm này được biết là có ích

trong quá trình trao đổi lipid và kiểm soát chức năng tiêu hóa. Năm 2012, Heejeong

Lee và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa công thức bánh mỳ có sử dụng bột lá Gai

và thời gian bảo quản của bánh mỳ với sự phơi nhiễm với tia gamma. Sự khác nhau

về lượng bột lá Gai tạo ra sự khác biệt về mùi vị, hình thức, màu sắc, độ ẩm và chất

lượng nói chung của sản phẩm bánh mỳ. Trong quá trình bảo quản, những mẫu

11

bánh mỳ có bột lá Gai sau khi chiếu tia gamma cho thấy sự phát triển của tế bào vi

sinh vật thấp hơn. Những thông tin mới phát hiện về mặt thực phẩm và dược phẩm

cho thấy cây gai xanh có nhiều tiềm năng hơn so với việc khai thác lấy sợi truyền

thống [14],[25],[26].

Năm 2013, Touming Liu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về marker SSR

(simple sequence repeat) nhằm làm sáng tỏ thêm những hiểu biết về di truyền ở cây

lá Gai. Tổng số 24 giống Gai xanh với 100 marker SSR đã được nghiên cứu. Trong

đó 98 marker được khuếch đại thành công và xác định được 81 marker ở dạng đa

hình, có từ 2- 6 alleles trong 24 giống Gai này. Những hiểu biết về SSR có thể được

sử dụng để phát triển bản đồ di truyền và bản đồ vật lý, bản đồ các locus của tính

trạng, nghiên cứu về đa dạng di truyền, lập bản đồ liên kết và xác nhận giống cây

trồng, từ đó có thể nghiên cứu về các gene có liên quan tới tính trạng có ích trong

quá trình tạo sợi ở cây lá Gai [21].

Năm 2016, Sana Ullah và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của các loại phân

bón tới sự sinh trưởng, năng suất và chất lượng sợi phục vụ cho công nghiệp sợi.

Cùng thời điểm Tan XF và cộng sự đã nghiên cứu hợp chất mới MgAl-layered

double hydroxides composite từ gốc của cây gai xanh, có khả năng loại bỏ các chất

tinh thể tím trong dung dịch lỏng. Ngoài ra cây lá Gai còn được biết tới với khả

năng kích thích Receptor Gamma trong tế bào C2C12 từ đó làm tăng khả năng hấp

thụ glucose [17].

Những nghiên cứu này cho thấy cây gai xanh có tiềm năm phát triển theo

nhiều hướng, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp dệt may, công nghệ thức ăn

chăn nuôi, phục vụ nghiên cứu cơ bản và phát triển dược liệu, thực phẩm và thực

phẩm chức năng.

Thị trường và giá các sản phẩm từ cây gai xanh trên thế giới

Các sản phẩm cây gai xanh trên thị trường thế giới rất đa dạng và phong phú.

Theo Alibaba một trang web thương mại điện tử, đấu giá trực tuyến uy tín trên thế

giới. Thì có nhiều sản phẩm từ cây gai xanh được rao bán trên đây. Hầu hết các sản

phẩm từ cây gai xanh được bán với giá trên 10 USD/ kg (220.000 đồng/ kg). Như

củ rễ cây do công ty Shaanxi Fuheng Biotechnology (Trung Quốc) 12,3 – 18,8

USD/ kg (270.000 – 414.000 đồng/ kg), lá cây do Xian Sciyu Biotech (Trung quốc)

giá 9 – 50 USD/ Kg. Hay công ty Xian Lucky Clover Biotech (Trung Quốc) 10 – 20

USD/ Kg [27].

12

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Lá và rễ (củ) cây gai xanh được thu mua tại xã Cao Bình, Huyện Hòa An,

Tỉnh Cao Bằng

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu

2.1.2.1. Phạm vi nội dung

Đề tài nghiên cứu về thành phần các hoạt chất sinh học, khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết từ lá và rễ cây gai xanh từ đó nghiên cứu xây dựng hoàn thiện

quy trình sản xuất thực phẩm chức năng từ cao củ gai.

2.1.2.2. Phạm vi không gian nghiên cứu:

Nghiên cứu chiết suất hoạt chất sinh học từ cây gai xanh Boehmeria nivea

(L.) Gaud và ứng dụng sản xuất một số thực phẩm bảo vệ sức khỏe ở quy mô phòng

thí nghiệm.

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 08/2018 đến tháng 8/2019.

2.1.2.3. Vật liệu, hoá chất và thiết bị sử dụng

Vật liệu:

Cây gai xanh tươi (Boehmeria nivea (L.) Gaud) được thu mua tại xã Hưng

Đạo, Huyện Hòa An, Tỉnh Cao Bằng.

Nguyên liệu được rửa sạch, sau đó đem đi sấy ở nhiệt độ 60oC đến độ ẩm

dưới 10%. Tiến hành bảo quản quản trong túi PE đặt trong hộp nhựa kín, lưu trữ ở

nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng và ẩm.

Hóa chất, thiết bị:

Các hóa chất và môi trường được sử dụng trong thí nghiệm: 1,1-Diphenyl-2-

picrylhydrazyl (DPPH); ethanol (EtOH) của Merck – Đức (dạng tinh khiết),

methanol (MeOH) và môi trường Luria Bertani (trypton: 10 g/L (Đức); NaCl: 10

g/L (Trung Quốc); yeast extract: 5 g/L (Ấn Độ) và agar: 15 g/L (Việt Nam)

(Sambrook, 2001) được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) và

Bacillus subtilis (B. subtilis). Vi sinh vật được sử dụng để khảo sát hoạt tính kháng

13

khuẩn gồm 2 dòng vi khuẩn đại diện gram âm - E. coli và vi khuẩn gram dương - B.

subtilis được cung cấp bởi phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ vi sinh – Viện

Khoa học sự sống. Hai dòng vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường Luria

Bertani (LB) ở 37oC trong 24 giờ.

Thiết bị: Máy đo quang phổ, tủ sấy, cân điện tử, máy soxlet, tủ cấy, tủ ấm.

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần các chất có hoạt tính sinh học trong

nguyên liệu lá gai và củ gai;

- Nội dung 2: Tối ưu hóa quy trình chiết suất một số hoạt chất có hoạt tính

sinh học cao từ lá và củ gai;

- Nội dung 3: Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của một số hoạt chất sinh

học của cây gai xanh;

- Nội dung 4: Hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai

 Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất cao củ gai;

 Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc từ lá gai;

 Phân tích các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm thu được.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phân tích, thử nghiệm hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong cây

gai xanh

- Các hoạt chất flavonoid, Chlorogenic acid, Apogenin được xác định bằng

phương pháp sắc ký trên thiết bị HPLC. Các hoạt động chống oxy hóa được thực

hiện thông qua phương pháp khử gốc tự do DPPH. Cụ thể như sau:

2.3.1.1. Xác định hàm lượng flavonoid tổng số bằng phương pháp cân

Cân chính xác 2g bột cây gai xanh chiết trong bình Soxhlet bằng este dầu

hỏa để loại clorophyl (trong 2 giờ). Sau đó lấy túi chứa bột cây gai xanh ra để ở

nhiệt độ phòng cho bay hết dung môi rồi chiết kiệt flavonoid bằng ethanol 70%, cất

thu hồi ethanol, còn dịch chiết nước để nguội loại bỏ tanin bằng thuộc da hoặc

gelatin 3% cho tới khi không còn xuất hiện kết tủa. Chiết lấy kiệt flavonoid bằng

ethylacetat, bốc hơi dung môi rồi sấy cặn tới khối lượng không đổi, đem cân. Hàm

lượng flavonoid tổng số trong mẫu thử được tính theo công thức [5].

14

Trong đó:

X: % khối lượng flavonoid tổng số

b: Là khối lượng cặn thu được (g)

a: Là khối lượng mẫu đem phân tích khô tuyệt đối (g)

2.3.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa tế bào

DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng loại bỏ

gốc tự do và các nhóm cho hydro, phương pháp này cũng được sử dụng để định

lượng các chất oxy hóa trong hệ thống sinh học phức tạp ngày nay. Những electron

lẻ có trong gốc tự do DPPH cho sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517 nm và hợp

chất này có màu tím. Khi các electron lẻ này kết hợp với hydro của chất kháng oxy

hóa để hình thành dạng DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang vàng tương

ứng với lượng electron kết hợp với DPPH. Vì vậy, khả năng làm sạch gốc tự do của

một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517 nm của phản

ứng DPPH có giá trị càng thấp và ngược lại.

Hình 2.1. Phản ứng khử gốc DPPH

Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và

Shieh (2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Bột chiết được pha loãng trong 50

% ethanol và trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3ml. Sau đó, thêm 1ml

dung dịch DPPH 0,1 mM (pha trong ethanol 99,5%) vào hỗn hợp, lắc đều và giữ

hỗn hợp trong. Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau:

Khả năng khử gốc tự do

DPPH (%) = 100 × (ACT –ASP)/ACT.

15

Trong đó,

ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dung dịch chiết;

ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dung dịch chiết.

Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dung dịch chiết khử được 50% gốc

tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do

DPPH càng cao [6].

2.3.2. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi tới hàm lượng flavonoid

Có nhiều dung môi được sử dụng cho quá trình chiết suất như ethanol, n –

Hexan, ete dầu hỏa,… trong thí nghiệm này ta sử dụng dung môi là Ethanol vì đây

là dung môi có khả năng hòa tan được nhiều hoạt chất trong củ gainhư flavonoid,

steroid, …. Ethanol là dung môi an toàn, không độc, không ảnh hưởng xấu tới chất

lượng sản phẩm, không ăn mòn thiết bị, dễ bay hơi nên dễ tách ra khỏi thiết bị cô

đặc và là dung môi rất phổ biến, dễ kiếm.

Chúng tôi tiến hành quá trình trích ly theo phương pháp ngâm kết hợp với

phương pháp lôi cuốn hơi nước bằng thiết bị Soxlet. Để đánh giá ảnh hưởng của

nồng độ dung môi chiết đến hiệu suất trích ly. Phương pháp tiến hành:

Cân 100g củ gai sau đó trích ly ở các nồng độ ethanol như sau:

Công thức Nồng độ ethanol (%) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)

CT1 CT2 CT3 60% 70 % 80%

Trích ly ở cùng điều kiện:

 Thời gian chiết là 60 phút.

 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu : 10/1.

 Nhiệt độ là 70ºC.

Kết thúc quá trình trích ly, xác định chỉ tiêu:

 Hàm lượng flavonoid.

Tiến hành trích ly trong các điều kiện nồng độ ethanol khác nhau, xác định

hàm lượng dịch chiết. Dựa vào kết quả ta sẽ tìm được nồng độ trích ly thích hợp và

sử dụng kết quả cho thí nghiệm tiếp theo.

16

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết tới hàm lượng flavonoid.

Để xác định nhiệt độ chiết chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các khoảng thời

gian khác nhau lần lượt là 75, 90, 105 phút. Các công thức thí nghiệm được bố trí

như sau:

Cân 100g củ Gai

Trích ly ở các khoảng thời gian

75 phút 90 phút 105 phút

Dịch chiết

Phân tích

Các điều kiện trích ly

 Nồng độ ethanol đã được tối ưu ở thí nghiệm 2.

 Thời gian là 60 phút.

 Nhiệt độ là 70ºC.

 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 10/1.

Kết thúc quá trình trích ly, xác định chỉ tiêu:

 Hàm lượng flavonoid.

Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lưa chọn được thời gian trích ly tốt nhất.

Kết quả của thí nghiệm 3 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Công thức Thời gian trích ly (phút) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)

CT1 CT2 CT3 75 phút 90 phút 105 phút

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly tới hàm lượng flavonoid.

- Để xác định nhiệt độ trích ly, chúng tối tiến hành với các nhiệt độ trích ly

khác nhau, sản xuất theo quy trình với các thông số đã tối ưu ở trên.

17

- Thí nghiệm được tiến hành như sau:

Củ gai sau khi được xử lý, cắt thành miếng nhỏ đem cân 100g đem trích ly ở

các nhiệt độ khác nhau như sau:

Công thức Nhiệt độ trích ly (ºC) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)

CT1 CT2 CT3 65 70 75

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu so với dung môi chiết

suất tới hàm lượng flavonoid.

- Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất trích

ly, ta tiến hành thí nghiệm với các công thức sau:

Cân 100g củ Gai

Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

10/1 15/1 20/1

Dịch chiết

Phân tích

Các điều kiện trích ly:

 Nồng độ ethanol đã được tối ưu ở thí nghiệm 2.

 Thời gian trích ly đã được tối ưu ở thí nghiệm 3.

 Nhiệt độ trích ly là 70ºC.

Kết thúc quá trình trích ly, xác định chỉ tiêu: Hàm lượng flavonoid.

Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lựa chọn được nồng độ dung môi tốt nhất.

Kết quả của thí nghiệm 4 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu ảnh hưởng rất lớn đến khả năng trích ly các hợp

chất hòa tan trong củ Gai. Nếu chọn tỷ lệ này phù hợp thì sẽ chiết tách được tối đa

các chất và hiệu quả trích ly cao.

Trích ly ở cùng các điều kiện:

 Nồng độ ethanol trích ly đã được tối ưu ở thí nghiệm 2.

18

 Thời gian trích ly đã được tối ưu ở thí nghiệm 3.

 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đã được tối ưu ở thí nghiệm 4. Kết thúc quá trình trích ly, xác định chỉ tiêu: Hàm lượng flavonoid.

Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lưa chọn được nhiệt độ trích ly tốt nhất.

Kết quả của thí nghiệm 5 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo Flavonoid

được chiết từ cây gai xanh bằng dung môi ethanol 60; 70; 80%. Nhiệt độ chiết là 65, 70, 75°C trong các khoảng thời gian 75, 90, 105 phút với tỷ lệ dung môi:

Nguyên liệu lần lượt là 10:1; 15:1; 20:1 (v/w). Sau khi tiến hành khảo sát các đơn

nhân tố, chúng tôi lựa chọn 03 yếu tố là các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm

lượng flavonoid tổng số trong cao củ gai để đánh giá khả năng ảnh hưởng của

chúng, chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của

Box - Behnken với ba yếu tố, ba cấp độ [3].

Bảng 2.1. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu

Biến độc lập

Nhiệt độ chiết suất (ºC) Nồng độ dung môi (%) Thời gian chiết tách (phút) Ký tự mã hóa A B C Các cấp độ của biến 0 a2 b2 c2 -1 a1 b1 c1 1 a3 b3 c3

Bảng 2.2. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng hoạt

chất sinh học của cao củ gai

TN

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Biến mã hóa B -1 -1 1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 C 0 0 0 0 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0

19

Biến phụ thuộc: Y (Hàm lượng hoạt chất sinh học trong dịch chiết)

Dựa vào kết quả thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho cao có

hàm lượng hoạt chất sinh học Flavonoid là cao nhất.

2.3.3. Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn

Khảo sát khả năng kháng một số loại vi khuẩn gây bệnh ở người như

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis của dịch chiết từ lá Gai.

Chuẩn bị môi trường: Cân 38g môi trường (MPA) pha với 1000ml nước cất,

đun sôi cho tan hết Agar, chia ra thành các bình tam giác 250ml, hấp khử trùng ở

121ºC trong 15 phút. Để thạch nguội xuống khoảng 40 - 45ºC, đổ 25ml môi trường

vào đĩa, dùng que cấy trang trải đều vi khuẩn lên bề mặt thạch. Khi bề mặt thạch

khô thì sử dụng khoanh giấy thấm, đường kính khoảng 6mm. Chuẩn bị các đĩa môi

trường và đánh số thứ tự trên mỗi đĩa. Chuẩn bị các ống vi khuẩn đã tiệt trùng. Tiến

hành pha loãng vi khuẩn đạt nồng độ 106 tế bào/ml.

Dùng tăm bông cấy các vi khuẩn từ ống dịch khuẩn pha loãng vào các đĩa môi

trường đã đánh dấu. Sau đó dùng micropipette hút 50 l dịch chiết lá gai lên giấy

thấm, trong đó có một giấy thấm chứa mẫu đối chứng là nước. Nuôi vi khuẩn ở

37 C trong 12 – 24 giờ và quan sát vòng kháng khuẩn [4].

Tính kết quả:

Đo vòng kháng khuẩn và tính toán khả năng kháng khuẩn của dịch chiết.

Giá trị trung bình đường kính vòng kháng khuẩn = D - d

+ > 4mm: hoạt tính mạnh (+++)

+ 3 – 4mm: hoạt tính trung bình (++)

+ < 3mm: hoạt tính kháng yếu (+)

+ 0 mm: không kháng khuẩn (-)

Trong đó:

- D là đường kính vòng kháng khuẩn,

- d: đường kính khoanh giấy

2.3.4. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai

2.3.4.1. Nghiên cứu, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất trà túi lọc từ lá Gai

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy nguyên liệu

Nhiệt độ sấy ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và nhiệt độ ảnh hưởng đến tỉ

lệ chất tan chiết được. Do đó ta cần xác định nhiệt độ sấy lá gai tốt nhất để vừa giảm

20

thời gian từ đó giảm chi phí, vừa đáp ứng yêu cầu tạo sản phẩm có chất lượng tốt.

Dựa vào điều kiện thiết bị sấy và nguyên liệu ban đầu: Nhiệt độ sấy thử nghiệm 50,

60, 70, 80, 90 ( C)

Bảng 2.3. Công thức thí nghiệm nhiệt độ sấy nguyên liệu

Chỉ tiêu đánh giá: Điểm đánh giá cảm quan màu, mùi, vị và trạng thái của trà.

Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Nhiệt độ (ºC) 50 60 70 80 90

Lượng ẩm giảm, thay đổi kích thước, giảm khối lượng, tỉ trọng, tăng độ giòn. Xảy

ra phản ứng oxy hóa làm biến đổi màu chlorophyll, các hợp chất pholyphenol, trong

nguyên liệu bị oxy hóa tạo màu nâu cho sản phẩm [11].

Bảng 2.4. Bảng cho điểm đánh giá cảm quan nhiệt độ sấy nguyên liệu

ĐIỂM MÔ TẢ

0

1

2

3

4

Tiến hành cho điểm các công thức bằng phương pháp đánh giá cảm quan.

5 Màu nâu đen hay màu lạ, có vị hoặc vị cháy khét, mùi lạ, khó chịu hoặc có mùi cháy khét. Màu nâu hoặc vàng nhạt, ngọt gắt hoặc rất nhạt, mùi lạ hơi khó chịu, mùi hơi cháy khét. Màu vàng rơm rất nhạy hay rất đậm, vị ngọt hơi gắt hoặc hơi nhạt, hậu vị nhẹ hoặc gắt, mùi lá còn tươi, mùi hơi gắt. Màu vàng, vị hơi ngọt, hậu vị nhẹ hoặc hơi gắt, mùi thơm lá gai thoảng nhẹ. Màu vàng rơm đặc trưng, vị ngọt vừa, vị hơi chát, hậu vị tốt, thơm mùi lá gai nhẹ. Màu vàng rơm đặc trưng, vị ngọt, vị hài hòa, hậu vị tốt, thơm mùi lá gai đặc trưng.

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến sản

phẩm sau khi nghiền

Sau khi xác định được thời gian sấy thích hợp, sử dụng nguyên liệu đã được

xử lý ở thí nghiệm trên đem đi nghiền nhỏ với các kích thước khác nhau, sau đó sử

dụng sàng để phân loại. Đóng vào túi lọc chuyên dùng 2g/ túi và pha vào nước sôi

với khoảng thời gian 5 phút sau đó tiến hành đánh giá cảm quan.

21

Mục đích: Làm giảm kích thước nguyên liệu đến kích thước nhỏ nhất định, tạo

điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly đồng thời không ảnh hưởng đến giá trị cảm

quan của nước trà sau này (độ đục…). Nguyên liệu rửa sạch, sấy khô, sử dụng máy

xay nghiền nhỏ nguyên liệu... Chỉ tiêu theo dõi: giá trị cảm quan và tỉ lệ chất tan

chiết được tốt nhất.

Nguyên liệu

Sấy khô

Nghiền nhỏ

Phân tích đánh giá cảm quan

d ≤ 0,5 0.5 < d ≤ 1 d ≥ 1 mm

Hình 2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước nguyên liệu

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu tỉ lệ phối trộn nguyên liệu bổ sung

Mục đích: Thêm thành phần Lạc tiên, Cỏ ngọt, Hoa nhài với tỉ lệ thích hợp

làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm.

Thực hiện: Phối trộn các nguyên liệu theo các tỉ lệ thích hợp để chọn lấy một

công thức tốt nhất giúp tăng giá trị của sản phẩm.

Với nguyên liệu chính lá gai, bổ sung thêm Lạc tiên, Cỏ ngọt và hoa nhài

1,4g/0,2g/0,2g/0,2g; 1,5g/0,2g/0,2g/0,1g; 1,6g/0,1g/0,2g/0,1g; 1,6g/0,2g/0,2g/0g là

tương ứng với CT1, CT2, CT3, CT4 thực hiện với 3 lần lặp lại.

22

Lá Gai

Xử lý

Phối trộn

CT2 CT3 CT4 CT1

Đánh giá cảm quan quaquan

Trích ly

Hình 2.2.Sơ đồ thí nghiệm khảo sát tỉ lệ phối trộn lạc tiên, cỏ ngọt

và hoa nhài

Bảng 2.5. Công thức thí nghiệm khảo sát hàm lượng nguyên liệu bổ sung:

Cỏ Ngọt, Cam Thảo

Công Thành phần Lạc tiên Thành phần Cỏ ngọt Thành phần Hoa Nhài

thức (g) (g) (g)

CT1 0,2 0,2 0,2

CT2 0,2 0,2 0,1

CT3 0,1 0,2 0,1

Thực hiện: Xử lý nguyên liệu: lá gai, lạc tiên, cỏ ngọt và hoa nhài rửa sạch,

CT4 0,2 0,2 0

sấy khô, nghiền nhỏ. Cân 2g nguyên liệu gồm lá gai, lạc tiên, cỏ ngọt và hoa nhài

với hàm lượng bổ sung như bảng bố trí thí nghiệm trên. Trích ly với 120ml nước sôi

trong 5 phút, tiến hành đánh giá cảm quan dịch trà vừa thu được. Tiến hành thực

hiện lặp lại 3 lần mỗi nghiệm thức và ghi lại kết quả với các chỉ tiêu đánh giá.

Chỉ tiêu đánh giá: Điểm đánh giá màu sắc, mùi, vị và trạng thái của trà

23

Bảng 2.6. Bảng cho điểm đánh giá cảm quan tỉ lệ phối trộn nguyên liệu bổ sung

Điểm Chỉ tiêu

5 Trong sáng, màu vàng nâu 4 Trong sáng, màu vàng nâu, 3 Đạt tiêu chuẩn, kỹ 2 Màu vàng nhạt, không 1 Màu nhạt

sáng đặc đặc trưng sản thuật theo đặc trưng cho hoặc Màu

trưng cho sản phẩm yêu cầu sản phẩm nâu sắc

phẩm đậm

Thơm tự nhiên, hài hòa Thơm tự nhiên,ấn tượng Đạt tiêu chuẩn yêu Kém thơm, có mùi lạ Lộ rõ mùi lạ

hấp dẫn, dễ hài hòa hấp cầu kỹ thuật, hoặc mùi do hoặc

chịu đặc dẫn, đặc trưng có mùi thơm khuyết tật, mùi do Mùi

trưng. Không sản phẩm khuyết không đặc

có mùi, vị lạ tật trưng sản

phẩm

Ngọt dễ chịu Ngọt dễ chịu Đạt tiêu Vị nhạt Không

đặc trưng cho đặc trưng cho chuẩn yêu không đặc có vị, vị

sản phẩm, sản phẩm, hài cầu kỹ thuật, trưng, vị lạ và lạ hay Vị ngon hấp dẫn, hòa không có ngọt dễ chịu vị do khuyết vị khó

hài hòa mùi khuyết tật và không có tật uống

và vị mùi vị lạ

Nước pha hấp Nước pha Đạt tiêu Nước bị đục, Nước

dẫn, không có tương đối hấp chuẩn theo không đặc đục,

cặn lơ lửng dẫn, không có yêu cầu kỹ trưng cho sản nhiều Trạng

cặn thuật, không phẩm, có cặn cặn lơ thái

cặn không lửng

bị đục

Tiến hành cho điểm cảm quan các công thức bằng phương pháp đánh giá cảm quan.

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ của nước pha trà và

thời gian đến hiệu quả trích ly gói trà

Mục đích: Tìm được nhiệt độ và thời gian pha trà thích hợp cho chất lượng

cảm quan tốt nhất.

24

Thực hiện: Thí nghiệm với công thức phối trộn đã tìm được ở thí nghiệm 3 với

nhiệt độ nước gồm 70oC, 80oC, 90oC và 100oC tương ứng với CT1, CT2, CT3, CT4

Nguyên liệu

Trích ly

70ºC 80ºC 90ºC 100ºC

Phân tích đánh giá cảm quan

và thực hiện lặp lại 3 lần.

Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ trích ly trà

Cân 2g nguyên liệu gồm lá gai, lạc tiên, cỏ ngọt và hoa nhài với tỉ lệ nguyên

liệu bổ sung như thí nghiệm 3. Tiến hành pha trà ở các nhiệt độ trên.

Bảng 2.7. Công thức thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nước trích ly trà

Công thức Nhiệt độ nước pha trà (ºC)

CT1 70

CT2 80

CT3 90

CT4 100

Chỉ tiêu đánh giá: Điểm đánh giá cảm quan màu, mùi, vị và trạng thái của trà.

Bảng 2.8. Công thức thí nghiệm khảo sát thời gian trích ly gói trà

Công thức Thời gian pha trà (phút)

CT1 4

CT2 5

CT3 6

CT4 7

25

Mục đích: Tìm được thời gian pha trà thích hợp nhất để sản phẩm cho màu

sắc và hương vị thơm ngon, làm cơ sở khuyên cáo người tiêu dùng.

Thực hiện: Thí nghiệm các gói trà túi lọc có trọng lượng 2g/gói đã biết được

thông số ở các thí nghiệm 3, 4 với thời gian lần lượt 4, 5, 6, 7 phút tương ứng CT1,

CT2, CT3, CT4 và lặp lại 3 lần.

Trích ly gói trà với khoảng 120ml/gói, nước pha theo nhiệt độ cho cảm quan

tốt nhất ở thí nghiệm 4 trên.

Bảng 2.9. Bảng cho điểm đánh giá cảm quan màu sắc, mùi, vị

và trạng thái của trà

Chỉ tiêu 2 1 5 4

Màu nhạt hoặc nâu đậm Màu sắc Màu vàng nhạt, không đặc trưng cho sản phẩm Điểm 3 Đạt tiêu chuẩn, kỹ thuật theo yêu cầu

Lộ rõ mùi lạ hoặc mùi do khuyết tật

Trong sáng, màu vàng nâu, đặc trưng sản phẩm Thơm tự nhiên, ấn tượng hài hòa hấp dẫn, đặc trưng sản phẩm Mùi Kém thơm, có mùi lạ hoặc mùi do khuyết tật, không đặc trưng sản phẩm Đạt tiêu chuẩn yêu cầu kỹ thuật, có mùi thơm đặc trưng cho sản phẩm

Không có vị, vị lạ hay vị khó uống

Ngọt dễ chịu đặc trưng cho sản phẩm, hài hòa không có khuyết tật Vị nhạt không đặc trưng, vị lạ và vị do khuyết tật Vị Trong sáng, màu vàng nâu sáng đặc trưng cho sản phẩm Thơm tự nhiên, gây ấn tượng hài hòa hấp dẫn, dễ chịu đặc trưng cho sản phẩm. Không có mùi lạ hoặc mùi do khuyết tật, mùi thơm mạnh và bền Ngọt dễ chịu đặc trưng cho sản phẩm, ngon hấp dẫn, hài hòa mùi và vị

Nước đục, nhiều cặn lơ lửng Trạng thái

Đạt tiêu chuẩn yêu cầu kỹ thuật, ngọt dễ chịu và không có mùi vị lạ hay có khuyết tật Đạt tiêu chuẩn theo yêu cầu kỹ thuật, không cặn Nước pha hấp dẫn, sống động không có cặn bẩn lơ lửng Nước pha tương đối hấp dẫn, không có cặn bẩn lơ lửng Nước bị đục, không đặc trưng cho sản phẩm, có cặn bẩn lơ lửng

26

bẩn lơ lửng không bị đục

Chỉ tiêu đánh giá: Điểm đánh giá cảm quan màu, mùi, vị, trạng thái của trà.

Tiến hành thực hiện lặp lại 3 lần với mỗi công thức và ghi kết quả đánh giá

cảm quan.

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm trà túi lọc từ lá gai.

2.3.4.2. Nghiên cứu, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất cao từ rễ (củ) Gai:

Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai mục 2.3.2 được sử dụng.

Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình cô đặc dịch

chiết củ Gai.

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến chất lượng của sản phẩm, hiệu suất của

quá trình cô đặc. Khi nhiệt độ cao, sản sinh ra các chất độc, gây màu và mùi khét,

làm giảm chất lượng của sản phẩm. Nếu nhiệt độ cô đặc thấp thì hiệu suất cô đặc

thấp, thời gian cô đặc lâu và mất đi một số hoạt chất.

Thí nghiệm được tiến hành như sau:

Dịch chiết củ Gai

Cô đặc

60ºC 65ºC 70ºC 75ºC

Cao củ Gai

Tiến hành cô đặc đến khi lượng cao đạt tỷ lệ 1g nguyên liệu được 0,2ml cao

lỏng thì dừng lại và tính thời gian cô đặc ở các giá trị nhiệt độ trên. Sau đó đem cao

thành phẩm đi xác định hàm lượng flavonoid. Từ đó sẽ chọn được nhiệt độ cô đặc

phù hợp, tối ưu nhất và sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

- Phân tích chất lượng sản phẩm

Thí nghiệm 10: Phân tích hàm lượng flavonoid trong sản phẩm

Sản phẩm cao lỏng củ gai được đem đi phân tích xác định hàm lượng

flavonoid.

27

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm cao củ gai.

2.3.4.3. Phương pháp phân tích chỉ tiêu chất lượng các sản phẩm thu được

 Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy khô tới khối lượng không đổi

Nguyên tắc: Sấy mẫu đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105oC. Dưới tác dụng

của nhiệt độ sấy làm bay hơi ẩm tự do và liên kết có trong mẫu. Độ ẩm của mẫu

được tính dựa vào khối lượng giảm đi của mẫu trong quá trình sấy.

Công thức tính:

Trong đó:

W: Độ ẩm (%)

m1: Khối lượng mẫu và chén sứ trước khi sấy (g)

m2: Khối lượng mẫu và chén sứ sau khi sấy (g)

m0: Khối lượng của chén sứ (g)

 Phân tích chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm TPCN từ cao củ gai

Thí nghiệm 11: Xây dựng chỉ tiêu cảm quan cho sản phẩm dịch chiết tổng từ củ gai

STT Tên chỉ tiêu Yêu cầu của TCVN Sản phẩm cao củ gai

1 Màu Màu đặc trưng cho SP

2 Mùi Thơm đặc trưng cho SP

3 Vị Đặc trưng cho SP

Thí nghiệm 12: Xác định chỉ tiêu về vi sinh vật tổng số

Tên chỉ tiêu Sản phẩm cao củ gai

Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g)

E. Coli (CFU/g)

Coliform (CFU/g)

Tổng số bào tử nấm (bào tử/g)

Độc tố vi nấm (µg/kg)

- Tổng số vi sinh vật hiếu khí xác định bằng phương pháp TCVN 4884:2005

- E. Coli được xác định bằng phương pháp TCVN 6846:2007

28

- Coliform được xác định bằng phương pháp TCVN 4882:2007

- Tổng số bào tử nấm được xác định bằng phương pháp TCVN 4993:1989

- Độc tố vi nấm được xác định bằng phương pháp TCVN 7596:2007

Thí nghiệm 13: Xác định chỉ tiêu về hàm lượng một số kim loại nặng độc hại

Tên chỉ tiêu Sản phẩm

As

Pb

Cd

Hg

- As được xác định bằng phương pháp TCCS 03:2014

- Cd được xác định bằng phương pháp TCCS 06:2014

- Pb được xác định bằng phương pháp TCCS 06:2014

- Hg được xác định bằng phương pháp TCCS 09:2014

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được tính toán và xử lý bằng Excel và phân tích bằng phần mềm SPSS 20.

29

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả nghiên cứu một số hoạt chất sinh học trong nguyên liệu lá gai và

củ gai

3.1.1. Kết quả phân tích hoạt chất sinh học trong một số bộ phận cây gai xanh

Dựa trên những nghiên cứu của các tác giả đi trước tôi tiến hành phân tích

các hoạt chất sinh học từ một số bộ phận của cây gai xanh, các chỉ tiêu được phân

tích tại viện khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên và được kết quả được trình

bày bảng 3.1.

Bảng 3.1. Bảng kết quả phân tích các hoạt chất sinh học trong một số bộ phận

của cây gai xanh

STT Chỉ tiêu phân tích Lá tươi (100 g) Lá khô (100g)

Flavonoid rhoifolin (mg)

Iod (mg) Selen (mg)

Protein (g) 1 Chất béo (g) 2 Chất xơ (g) 3 Vitamin B1 (mg) 4 Vitamin B2 (mg) 5 Vitamin B3 (mg) 6 Vitamin B5 (mg) 7 Vitamin B6 (mg) 8 9 Vitamin B7 (mg) 10 Vitamin B9 (mg) 11 Vitamin B12 (mg) 12 Axit clorogenic (mg) 13 Axit protocatechuic (mg) 14 Axit cafeic (mg) 15 Axit quinic (mg) 16 17 Apogenin (mg) 18 Sắt (mg) 19 Kẽm (mg) 20 Đồng (mg) 21 22 23 Mangan (mg) 24 Molybden (mg) 25 Cobal (mg) 26 Crom (mg) 3,41 0,52 3,10 0,20 0,30 0,26 0,39 0,14 0,07 0,15 0,21 0,11 0,14 0,09 0,05 1,32 2,13 150 0,34 779 23 34 1,64 0,6 0,3 0,24 17,12 2,42 15,4 0,24 0,32 0,29 0,42 0,17 0,09 0,18 0,26 0,12 0,18 0,15 0,08 3,61 7,4 755 1,52 3.759 112 151 1,64 1,79 1,51 1,12 Rễ (củ gai) (100g) 8,60 0,42 2,91 0,70 0,90 0,57 0,64 0,21 0,04 0,28 0,16 16,5 1,45 0,52 0,43 35,12 54,23 150 0,33 2.214 114 68 3,46 2,74 4,93 4,72

30

Theo kinh nghiệm dân gian, thời điểm hái lá thông thường lớn hơn hoặc

khoảng 90 ngày sau khi trồng và khoảng 60 ngày sau khi cắt bỏ gốc cũ là lá có độ

dày, không quá già, màu xanh, kích thước lá khoảng 10 – 15cm..., thích hợp nhất

cho quá trình hái lá. Như vậy, nguyên liệu lá gai có độ ẩm cao, trong thành phần

chất khô có hàm lượng tro và polyphenol tổng khá cao, chứng tỏ lá Gai có những

tính chất quý, vừa cung cấp khoáng chất vừa cung cấp các hoạt chất chống oxy hóa

tự nhiên, kháng khuẩn, rất tốt để sản xuất các sản phẩm có lợi cho sức khỏe người

sử dụng.

Năm 2010, G. Contò và cộng sự đã đánh giá về mức độ dinh dưỡng và thành

phần hóa học của lá và ngọn cây lá Gai, là những phần không được sử dụng cho quá

trình sản xuất sợi, phát hiện trong khối lượng khô của mẫu lá Gai có chứa protein

thô với hàm lượng 17,00 ± 1,52% ở lá, 15,25 ± 0,77% ở ngọn và 11,79 ± 3,32%

tính trên toàn bộ cây. Theo Tài nguyên Thực vật trong 100g cây gai xanh có chứa:

nước, protein 85,3g, chất béo 0,5g, carbohydrates 5,4g, chất xơ 3,1g, tro 2g, vitamin

A (beta caroten) 1,15mg, B1 (thiamine) 0,2mg, 0,39mg vitamin B5, 0,3mg

pyridoxine, 0,1mg folic acid, 30mg vitamin C, 333mg vitamin E, 0,8mg vitamin K,

498,6mcg biotin, 0,5mcg choline, 17,4mg kali, 334mg canxi, 481mg magiê, 57mg

sodium, 80mg photpho, 71mg chlorine, 150mg sắt, 1,64mg mangan, 779mg đồng,

76mcg selenium, 0,3mg kẽm…Theo kết quả phân tích trên cây gai xanh Cao Bằng

thì các thành phần có lợi đều cao hơn hoặc bằng so với các công bố trước đây đối

với cây gai xanh, đã chứng minh được cây gai xanh Cao Bằng có giá trị dược liệu

cao so với trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Ngoài ra còn phát hiện Flavonoid

rhoifolin và Apogenin là thành phần quan trọng ở lá của cây gai xanh. Dựa trên kết

quả trên cho thấy với mẫu lá khô quy trình xử lý tốt, thất thoát hỏng không nhiều.

3.1.2. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá gai

Hoạt tính chống oxy hóa gần đây được quan tâm nhiều hơn bởi nó như một

chìa khóa vạn năng cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học khác. Các chất chống oxy

hóa được biết đến như vitamin E, vitamin C, lycopen, resveratrol, và một số chất

trao đổi thứ cấp khác trong cây. Các chất này được bổ sung vào dược phẩm và thực

phẩm chức năng có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, phòng và

điều trị các bệnh do gốc tự do sinh ra như tiểu đường, tim mạch, alzheimer, ung

31

thư….Các chất chống oxy hóa nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng do đặc

điểm lý hóa của chúng như thân thiện với cơ thể, bền nhiệt … các chất này thường

có bản chất là các polyphenon. Theo như tài liệu đã công bố của tác giả Dong Gu

Lee (2015), cây gai xanh rất giàu polyphenon và cũng có hoạt tính chống oxy hóa

tương đối cao. Do vậy chúng tôi tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa nhằm tìm

kiếm các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa mới có nguồn gốc thực vật. DPPH là

gốc tự do có màu tím hấp thụ cực đại ở bước sóng 517 nm nó đại diện cho các gốc

tự do có bản chất hóa học. Chất thử có khả năng khử gốc tự do này nghĩa là chúng

làm mất màu DPPH, quan sát khả năng làm mất màu DPPH của chất thử nhiều hay

ít để có thể đánh giá mức độ chống oxy hóa của chất thử. Ở đây chúng tôi tiến hành

thử khả năng bẫy gốc tự do DPPH của dịch chiết lá cây gai xanh. Kết quả được chỉ

ra sau đây.

Hình 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết lá gai

Hình 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của Acid ascorbic

32

Dựa vào phương trình tuyến tính biểu diễn hoạt tính chống oxy hóa (%) theo

nồng độ của cao chiết và chất đối chiếu, suy ra giá trị IC50. Kết quả trình bày trong

bảng 3.2.

Bảng 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết được thể hiện qua giá trị IC50

Nồng độ cao chiết

Cao chiết Phương trình hồi quy R2 ức chế 50% DPPH

(IC50) (µg/ml)

592,644 y = 0,076x + 4,959 R2 = 0,993 Lá gai

7,34 y = 6,8954x – 0,596 R2 = 0,9918 Acid ascorbic

Kết quả cho thấy dịch chiết lá gai tại nồng độ 592,644 µg/ml có khả năng

làm giảm 50% gốc tự do 0,5 mM DPPH. So với giá tri ̣IC50 của vitamin C là

7,34μg/ml, dịch chiết lá gai thể hiện khả năng bắt gốc tự do 592,644μg/ml. So sánh

với nghiên cứu được trình bày trong báo cáo của Youn Ri Lee và cộng sự 2009

trong nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng chống oxy hóa của lá cây gai

xanh giá trị IC50 688,424 µg/ml [24]. Như vậy dịch chiết lá gai có tiềm năng sử

dụng làm chất chống oxy hóa tự nhiên.

3.2.Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai

Qua kết quả phân tích bảng 3.1. hàm lượng flavonoid trong rễ(củ) gai đạt

hàm lượng 35,12mg/100g cao nhất trong các bộ phận của cây gai xanh. Các nghiên

cứu đã xác định thành phần hóa học chính trong cây gai xanh là flavonoid, apigenin,

axit hữu cơ và nhiều thành phần dinh dưỡng khác như khoáng chất, protein, vitamin

[16]. Trong đó nhóm flavonoid rất được quan tâm nghiên cứu. Flavonoid từ cây gai

xanh được biết đến với đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u, chống vi

khuẩn, chống virus và chống dị ứng [12].

Việc chiết suất flavonoid từ cây gai xanh chịu ảnh hưởng bởi dung môi, nhiệt

độ, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu.Vì vậy, mục đích của nghiên cứu

này là nhằm tối ưu hóa quá trình chiết suất flavonoid tổng số từ cây gai xanh Cao

Bằng. chúng tôi tiến hành sử dụng củ gai để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo

trong đó tập trung tối ưu hóa quá trình chiết suất cao củ gai.

33

3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết suất.

Ethanol có khả năng chiết xuất hết thành phần của nguyên liệu cao hơn nước.

Vì vậy dung môi được sử dụng trong việc chiết tách dịch cây gai xanh là ethanol.

Tiến hành nghiên cứu với các nồng độ khác nhau là 60%, 70%, 80%. Sau đó tiến

hành phân tích hàm lượng flavonoid tổng số trong dịch chiết. kết quả thu được về

hàm lượng flavonoid được thể hiện ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng flavonoid

CT Nồng độ ethanol (%) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)

CT1 60 15,64a ± 0,43

CT2 70 17,88b ± 0,48

CT3 80 18,04b ± 0,21

Ghi chú: các chữ trong cùng 1 cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.

Qua kết quả ở bảng 3.3 ta thấy khi trích ly ở các nồng độ ethanol khác nhau

cho hàm lượng flavonoid khác nhau và hàm lượng này tăng lên khi chiết ở nồng độ

ethanol từ 60% đến 80%. Flavonoid cao nhất tại nồng độ ethanol 80% tương ứng

với hàm lượng flavonoid 18,04mg/100g. Hàm lượng flavonoid thu được thấp nhất ở

60% (15,64mg/100g). Khi trích ly ở nồng độ ethanol thấp quá thì khả năng trích ly

flavonoid sẽ đạt hiệu quả không cao, nồng độ cao quá thì có xu hướng giảm đi.

Ethanol có khả năng hòa tan tốt các thành phần trong củ Gai: flavonoid thuộc

nhóm flavon, favavon, flavanol… Độ tan của chúng không giống nhau ở các nồng

độ khác nhau. Ở nồng độ 70% và 80% không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê ở

mức α = 0,05. Lưu Hồng Sơn (2017) [3], khi nghiên cứu tối ưu hóa flavonoid từ

cây chè dây Cao Bằng nhận thấy, nồng độ ethanol 70% cho hàm lượng flavonoid

cao nhất. Nồng độ ethanol thích hợp để thực hiện quá trình trích ly flavonoid trong

củ gai là 70%, kết quả này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết suất.

Sau khi tìm được nồng độ ethanol thích hợp trong quá trình chiết suất

flavonoid từ cây gai xanh chúng tôi tiến hành nghiên cứu với các khoảng thời gian

chiết suất là 75, 90 và 105 phút. Sau đó tiến hành phân tích hàm lượng flavonoid

tổng số. Kết quả thu được về hàm lượng flavonoid được thể hiện ở bảng 3.4.

34

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số

CT Thời gian (phút) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)

CT1 75 16,16a ± 0,22

CT2 90 17,90b ± 0,22

CT3 105 18,30b ± 0,14

Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thông kê ở mức α < 0,05

Từ kết quả ở bảng 3.4 cho ta thấy, thời gian chiết suất có ảnh hưởng đến

hàm lượng flavonoid. Nhìn chung khi tăng thời gian chiết suất, hàm lượng

flavonoid thu được tăng. Hàm lượng flavonoid thu được ở CT2 và CT3 cao hơn so

với CT1, nhưng giữa CT2 và CT3 lại không có sự khác biết ở mức ý nghĩa α =

0.05, mặc dù khoảng cách thời gian giữa các CT là 15 phút.

Từ nhận xét trên, để giảm thời gian sản xuất, tiết kiệm được chi phí, chúng

tôi lựa chọn thời gian để chiết suất flavonoid tổng số là 90 phút.

3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết suất

Trong quá trình trích ly, nhiệt độ là một yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng

flavonoid. Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng, cứ tăng 10ºC thì tốc độ phản ứng

tăng từ 2 – 4 lần. Tuy nhiên nhiệt độ cao làm cho các chất giảm hàm lượng và bị phân

hủy, biến đổi thành những chất độc có thể gây hại cho cơ thể con người. Nhiệt độ thấp

sẽ làm chậm quá trình trích ly và quá trình trích ly sẽ kéo dài mất rất nhiều thời gian, độ

ẩm của sản phẩm sẽ cao và tạo điều kiện gây hư hỏng sản phẩm. Vì vậy cần phải tìm ra

nhiệt độ trích ly thích hợp cho quá trình tạo ra sản phẩm cao củ gai. Thí nghiệm được

tiến hành như thí nghiệm 3 mục 2.3.2 và thu được kết quả sau:

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng flavonoid tổng số

CT Nhiệt độ (ºC) Hàm lượng flavonoid (mg/100g)

CT1 65ºC 22,87a ± 0,43

CT2 70ºC 23,31ª ± 0,29

CT3 75ºC 24,13a ± 0,46

Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thông kê ở mức α < 0,05

35

Qua kết quả ở bảng 3.5 cho ta thấy trích ly ở các khoảng nhiệt độ khác nhau

cho hàm lượng flavonoid khác nhau. Khi tăng nhiệt độ chiết suất từ 65ºC tới 70ºC

thì hàm lượng flavonoid thu được tăng mạnh, tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nhiệt độ

lên tới 75ºC thì hàm lượng flavonoid thu được thay đổi không đáng kể và có xu

hướng giảm đi. Theo Spigno và đồng tác giả (2007) [16], nhiệt độ trích ly tác động

đến khả năng hòa tan, tốc độ truyền khối và sự ổn định của các hợp chất

polyphenol. Từ kết quả trên, để tránh ảnh hưởng đến sự ổn định của hợp chất

flavonoid của dịch chiết củ gai nhiệt độ tối ưu cho quá trình chiết suất được lựa

chọn là 70ºC. Kết quả này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi

Hàm lượng dung môi ít hay nhiều cũng ảnh hưởng tới các chất cần trích ly

và hiệu suất của quá trình trích ly. Nếu lượng dung môi ít sẽ không đủ cho quá trình

hòa tan các hợp chất, chiết rút các cấu tử ra ngoài môi trường ít và chỉ làm đủ ướt

nguyên liệu. Nếu dùng lượng dung môi lớn sẽ gây lãng phí, tốn kém dung môi, chi

phí cao. Thí nghiệm này tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung

môi/nguyên liệu đến hàm lượng flavonoid thu được và tìm ra tỷ lệ tốt nhất cho quá

trình trích ly.

Thí nghiệm được tiến hành như thí nghiệm 4 trong mục 2.3.2 và kết quả

được trình bày ở bảng 3.6:

Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi đến

hàm lượng flavonoid tổng số

Công thức

Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi (g/ml)

CT1 CT2 1/10 1/15

CT3 Hàm lượng flavonoid (mg/100g) 18,95a ± 0,38 21,61b ± 0,63 23,11ª ± 0,60 1/20

Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α < 0,05

Dựa vào kết quả ở bảng 3.6 ta thấy, khi thay đổi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

thì hiệu quả chiết suất flavonoid cũng thay đổi và đều khác nhau giữa cả 3 công

36

thức nghiên cứu. Hàm lượng flavonoid thu được cao nhất ở CT3 là 23,11mg/100g

và thấp nhất ở CT1 là 18,95mg/100g.

Dựa theo kết quả phân tích, để đảm bảo cho quá trình trích ly đạt được hiệu

suất cao và tiết kiệm được lượng dung môi em lựa chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu

là 15/1 làm kết quả sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2.5. Kết quả tối ưu các điều kiện chiết suất dịch củ gai.

Trên cơ sở khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá tình trích ly củ gai em

nhận thấy nồng độ dung môi ethanol, thời gian chiết tách và tỷ lệ dung môi/nguyên

liệu là những yếu tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình chiết suất củ gai. Sử dụng

phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box – Behnken với ba

biến ba cấp độ được sử dụng trong nghiên cứu.

Các số liệu thu được từ dịch chiết củ gai được xử lí trên phần mềm Design –

Expert 7 (Stat – Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA được dùng để đánh giá hàm

lượng flavonoid thu được.

Bảng 3.7: Ma trận thực nghiệm Box-Behken ba yếu tố chiết củ Gai

TN

A (ethanol) 60 80 60 80 60 80 60 80 70 70 70 70 70 70 70 70 70 Biến thực B (thời gian) 60 60 120 120 90 90 90 90 60 120 60 120 90 90 90 90 90 C (tỷ lệ dung môi) 15 15 15 15 10 10 20 20 10 10 20 20 15 15 15 15 15 Hàm lượng flavonoid tổng số (mg/100g) 17,76 18,03 17,37 20,26 19,06 21,0 20,14 22,5 21,2 19,54 20,69 22,36 24,18 24,2 24,21 24,16 24,19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

37

Tiến hành giải bài toán tối ưu theo phương pháp “hàm mong đợi”. Sử dụng

phần mềm Design – Expert 7 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của

ba yếu tố mà tại đó hàm lượng flavonoid trong cao củ gai đạt được hàm lượng cao

nhất. Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy các số liệu thực nghiệm, thu được mô

hình đa thức bậc hai thể hiện được hàm lượng flavonoid đạt được:

Y = + 24,39 + 0,93*A + 0,36*B + 0,74 *C + 0,66*A*B + 0,1*A*C +

0,58*B*C – 3,03*A2 – 3,01*B2 - 0.69*C2

Hay Y = + 24,39 + 0,93*ethanol + 0,36*thời gian + 0,74 *tỷ lệ dung môi +

0,66*ethanol*thời gian + 0,1*ethanol*tỷ lệ dung môi + 0,58*thời gian*tỷ lệ dung

môi – 3,03*ethanol² - 3,01*thời gian² - 0,69*tỷ lệ dung môi²

Trong đó Y là hàm lượng flavonoid trong dịch chiết thu được.

Để đánh giá mô hình chúng tôi sử dụng phân tích ANOVA. Kết quả phân

tích ANOVA được thể hiện qua bảng sau:

Bảng 3.8: Phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết suất từ củ Gai

100,72

Model

9

11,19

69,90

< 0,0001

A

6,96

1

6,96

43,45

< 0,0001

B

1,02

1

1,02

6,34

0,0003

C

4,34

1

4,34

27,09

0,00399

AB

1,72

1

1,72

10,72

0,0012

AC

0,044

1

0,044

0,28

0,0136

BC

1,36

1

1,36

8,48

0,0615

A²

38,60

1

38,6

241,1

< 0,0001

B²

38,03

1

38,03

237,53

< 0,0001

C²

1,98

1

1,98

12,35

0,0098

Residual

1,12

7

0,16

Lack of Fit

0,32

3

0,11

0,52

0.69

Sai số

0,81

4

0,20

SS tổng số

101.84

16

DF Chuẩn F Giá trị p Nguồn SS MS

SS: Tổng phương sai; DF:Bậc tự do; MS: Trung bình phương sai; Chuẩn

F: Chuẩn Fisher; Residual: Phần dư; “Lack of Fit”: Chuẩn đánh giá độ không

tương thích của mô hình với thực nghiệm.

38

Kiểm tra sự có ý nghĩa và sự tương thích của mô hình được tiến hành bằng

phân tích bảng. Từ kết quả phân tích ANOVA ta thấy giá trị xác suất của mô hình

P-value <0,0001 < 0,05 đo đó mô hình được lựa chọn để giải thích cho kết quả của

thí nghiệm.

(a) (b) (c)

Hình 3.3. Bề mặt đáp ứng hàm lượng flavonoid

a. Mô hình tương tác giữa nồng độ ethanol và thời gian.

b. Mô hình tương tác giữa nồng độ ethanol và tỷ lệ dung môi.

c. Mô hình tương tác giữa thời gian và tỷ lệ dung môi.

Hình 3.4. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu hàm lượng flavonoid trong dịch chiết

Sử dụng phương pháp “hàm kì vọng” để tối ưu hóa hàm lượng flavonoid thu

được bằng phần mềm Design-Expert 7. Phương án tốt nhất được dự đoán nồng độ

ethanol là 71,80%, thời gian là 92,06 phút, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 18,04/1.

39

Khi đó hàm lượng flavonoid thu được đạt 24,7206 mg/100g. Kết quả thử nghiệm

cho kết quả tương ứng cho thấy mô hình có độ tương thích cao.

3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến chất lượng sản phẩm.

Quá trình cô đặc là quá trình làm giảm lượng dung môi có trong dung dịch

trích ly, làm giảm hàm lượng hợp chất có trong dịch chiết, tạo được cấu trúc cho sản

phẩm. Nhiệt độ cô đặc là yếu tố ảnh hưởng lớn tới chất lượng sản phẩm và quá trình

cô đặc. Nếu nhiệt độ cô đặc cao thì sẽ làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, tạo

ra các chất không mong muốn, phản ứng cháy sẽ làm cho sản phẩm có mùi khét, vị

đắng chất lượng sản phẩm kém. Nhiệt độ thấp thì thời gian cô đặc sẽ kéo dài. Thí

nghiệm được tiến hành như mục thí nghiệm 9 trong mục 2.3.4.2 và kết quả được thể

hiện như bảng sau:

Bảng 3.9. Kết quả của ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến chất lượng sản phẩm

Nhiệt độ (ºC)

Hàm lượng flavonoid (mg/100g)

CT

CT1 CT2 CT3 CT4 60 65 70 75 23,65ª ± 0,56 23,36ª ± 0,62 23,12ª ± 0,67 22,38a ± 0,65

Ghi chú: các chữ trong cùng một cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa thống

kê ở mức α = 0,05

Qua bảng 3.9 cho thấy: quá trình cô đặc ở các giá trị nhiệt độ khác nhau thì

cho ra hàm lượng flavonoid khác nhau. Hàm lượng flavonoid giảm dần khi tăng

nhiệt độ. Hàm lượng cao nhất đạt 23,65mg/100g ở nhiệt độ 60ºC. thấp nhất ở nhiệt

độ 75ºC là 22,38mg/100g. Điều này có thể giải thích bởi vì nhiệt độ càng cao thì tốc

độ phản ứng càng cao nên thời gian cô đặc nhanh hơn. Tuy nhiên nhiệt độ gây biến

tính flavonoid dẫn đến hàm lượng thu được thấp hơn. Mặt khác ở công thức nhiệt

độ 60ºC, 65ºC và 70ºC hàm lượng flavonoid thu được không có sự sai khác có ý

nghĩa thống kê ở mức α = 0,05. Vì vậy, lựa chọn nhiệt độ 70ºC là nhiệt độ của quá

trình cô đặc.

3.2.7. Kết quả phân tích hàm lượng flavonoid trong cao củ gai

Cao lỏng củ gai là sản phẩm có dược tính cao, tốt cho sức khỏe con người,

cao có màu nâu đỏ, dạng lỏng hơi sánh, khả năng hòa tan tốt, khi tan trong dung

40

môi cao có màu nâu đỏ ố vàng đặc trưng của củ gai. Tiến hành thí nghiệm phân tích

chất lượng cao thành phẩm như thí nghiệm 10 trong mục 2.3.4.2 và kết quả được

thể hiện như bảng sau:

Bảng 3.10. Kết quả phân tích hàm lượng flavonoid trong cao củ gai

Mẫu Cao lỏng củ gai Hàm lượng flavonoid (mg/100ml cao) 115,6

Từ bảng 3.10 ta thấy, sau quá trình khảo sát và tối ưu các điều kiện chiết suất

cao củ Gai thì hàm lượng flavonoid đạt dc là 115,6 mg/100 ml. Sản phẩm có cảm

quan tốt.

3.3. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của một số hoạt chất sinh học

của cây gai xanh;

3.3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá gai

Thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch trích ly từ lá

gai, dịch chiết này chứa các hợp chất polyphenol, flavonoid trong đó có

Chlorogenic acid là một loại tanin, có tác dụng diệt nấm, diệt khuẩn, được thử

nghiệm để đánh giá hiệu quả kháng lại 3 loại vi khuẩn Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis bằng phương pháp tạo vòng kháng khuẩn

trên môi trường đĩa thạch. Thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của

dịch trích lá gai thu được kết quả vòng kháng khuẩn như sau:

Hình 3.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá gai với vi khuẩn lần

lượt A: Escherichia coli, B: Bacillus subtilis, C: Staphylococcus. aureus và D:

Đối chứng dương Ampicillin, đối chứng âm nước cất.

41

Bảng 3.11. Đường kính vòng vô khuẩn của cao chiết lá gai kháng E. coli, B.

subtilis và S. aureus

Hoạt tính kháng khuẩn

STT Vi khuẩn

Hiệu số đường kính vòng kháng khuẩn D-d (mm) Hoạt tính kháng của dịch trích

1 Escherichia coli 4 (++)

2 Staphylococcus aureus 7 (+++)

3 Bacillus subtilis 9 (+++)

Vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis là các

tác nhân gây một số bệnh phổ biến ở người như các bệnh về đường ruột, tiêu hóa,

ngộ độc thực phẩm, bệnh ngoài da, suy giảm hệ miễn dịch.

Qua thí nghiệm này ta có thể thấy được lá gai có thể kháng lại các loại vi

khuẩn như trực khuẩn gram (-): Escherichia coli,trực khuẩn gram (+) Bacillus

subtilis, tụ cầu khuẩn gram (+) Staphylococcus aureus, với đường kính vòng kháng

khuẩn của dịch chiết tác động lên mỗi loại vi sinh vật là khác nhau.

Khả năng kháng khuẩn của dịch trích lá gai đối với chủng Bacillus subtilis là cao

nhất với kết quả vòng kháng khuẩn là 9 mm và thấp nhất là chủng Escherichia coli

với 4 mm. Đối với chủng Staphylococcus aureus vòng kháng khuẩn là 7mm.

3.3.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của cao củ gai

Tiến hành thí nghiệm với 2 đối tượng là: Bacillus subtilis, Escherichia coli.

Thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.3. Dung dịch chiết suất có các hàm lượng:

200, 150, 100, 75, 50µg.

Sau thời gian theo dõi kết quả: cho thấy cao củ gai có khả năng kháng khuẩn

đối với Bacillus subtilis, Escherichia coli. So sánh với đối chứng âm là nước cất vô

trùng, đối chứng dương là kháng sinh Penicllin 30µg cho thấy tính kháng khuẩn của

cao củ gai tốt.

42

Hình 3.6. Khả năng kháng khuẩn của cao củ gai đối với Bacillus subtilis và Escherichia coli

Trong đó:

(1). Cao củ gai ở nồng độ 200µg/ml (2). Cao củ gai ở nồng độ 150µg/ml (3). Cao củ gai ở nồng độ 100µg/ml (4). Cao củ gai ở nồng độ 75µg/ml (5). Cao củ gai ở nồng độ 50µg/ml (6). Đối chứng âm – nước cất (7). Đối chứng dương – kháng sinh Penicillin 30 µg

3.4. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc và cao củ gai

3.4.1. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc

3.4.1.1.Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu

Trong thí nghiệm phân tích một số thành phần hóa học có trong củ gai

chúng tôi tiến hành phân tích xác định hàm lượng flavonoid như mục 2.3.1.1 và độ

ẩm như mục 2.3.4.3.

Bảng 3.12. Bảng kết quả phân tích một số chỉ tiêu từ lá và rễ của cây gai xanh

STT Chỉ tiêu phân tích Lá gai tươi

Độ ẩm (%) 1 80,69

Tro (%) 2 3.3

3 Hàm lượng chất khô hòa tan (ºBx) 19.3

4 Polyphenol tổng 13,35%.

43

Dựa vào bảng kết quả trên ta có độ ẩm của nguyên liệu lá Gai là 80.69%, của

rễ (củ) gai là 86%. Hàm lượng chất khô lá chiếm 19.3%. Hàm lượng tro toàn phần

trong lá gai 3.3%. Hàm lượng polyphenol tổng 13,35%.

Theo kinh nghiệm dân gian, thời điểm hái lá thông thường lớn hơn hoặc

khoảng 90 ngày sau khi trồng và khoảng 60 ngày sau khi cắt bỏ gốc cũ là lá có độ

dày, không quá già, màu xanh, kích thước lá khoảng 10 – 15cm..., thích hợp nhất

cho quá trình hái lá. Như vậy, nguyên liệu lá gai có độ ẩm cao, trong thành phần

chất khô có hàm lượng tro và polyphenol tổng khá cao, chứng tỏ lá gai có những

tính chất quý, vừa cung cấp khoáng chất vừa cung cấp các hoạt chất chống oxy hóa

tự nhiên, kháng khuẩn, rất tốt để sản xuất các sản phẩm có lợi cho sức khỏe người

sử dụng.

3.4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình sản xuất

- Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy

Mục đích của quá trình sấy nhằm đưa độ ẩm của nguyên liệu về độ ẩm an

toàn để bảo quản sản phẩm, nhiệt độ cũng là yếu tố làm biết đổi các thành phần hóa

học sẽ bị biến đổi và giảm đi. Nếu sấy ở nhiệt độ quá thấp sẽ tốn thời gian và không

tạo được hương vị tốt cho sản phẩm. Sấy ở nhiệt độ cao tốc độ sấy nhanh hơn. Cứ

tăng 10oC thì tốc độ phản ứng tăng từ 2 – 4 lần. Tuy nhiên nhiệt độ cao gây ảnh

hưởng chất lượng sản phẩm.Để lựa chọn nhiệt độ sấy thích hợp và không ảnh

hưởng nhiều đến chất lượng nguyên liệu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 4 công

thức ở các nhiệt độ sấy khác nhau lần lượt 50°C, 60°C, 70°C, 80°C. Kết quả nghiên

cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy được trình bày ở bảng 3.12 dưới đây.

Bảng 3.13. Kết quả đánh giá cảm quan nhiệt độ đến quá trình sấy

Điểm chất lượng

CT Điểm TB Điểm HSCTL Nhiệt độ (oC) Vị Mùi

50 60 70 80 CT1 CT2 CT3 CT4 Màu sắc 3,57a 3,28a 3,85a 4,00a 4,00a 4,28a 2,85b 3,25ab 3,27b 2,76c 2,83bc 2,33c Trang thái 4,20a 4,00a 3,25b 2,33c 14,90 20,28 12,64 10,16 14,89 16,36 12,57 10,03

Ghi chú: các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở

mức ý nghĩa ≤ 0,05

44

Dựa vào bảng 3.13 ta thấy được nhiệt độ sấy nguyên liệu là yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của sản phẩm trà. Trong đó với công thức sấy ở 60ºC là tối ưu nhất cho quá trình sấy. Nhiệt độ sấy thấp hơn (50ºC), thời gian sấy kéo dài. Nhiệt độ sấy cao (70ºC, 80ºC) làm cho trà bị cháy khét, tính chất cảm quan sản phẩm giảm, màu sắc nhạt hơn và hương vị không được tốt các thành phần trong lá bị biến đổi do nhiệt độ cao, không còn thích hợp cho sản phẩm trà.

Sau khi đã có kết quả điểm cảm quan có thể nhận thấy với sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê của điểm cảm quan chất lượng sản phẩm ở các công thức khác nhau và với công thức 60ºC là công thức cho diểm cảm quan cao nhất so với những công thức còn lại. Vì vậy, công thức 60ºC là công thức tốt nhất được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

- Ảnh hưởng của thời gian sấy

Dựa trên kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy ở mục 3.4.2.1

chúng tôi tiến hành chọn nhiệt độ sấy là 60oC để xác định thời gian sấy.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của thời gian sấy

Thời Điểm chất lượng

gian Điểm Điểm HSCTL CT Màu sấy TB Mùi Vị Trang thái sắc (phút)

15 3,86b 3,86b 3,43b 3,28b CT1 14,43 14,34

30 4,00a 4,00a 4,14a 4,28a CT2 16,42 16,45

45 3,50b 3,36b 3,40b 3,28b CT3 13,78 13,57

60 3,72b 3,00b 3,57b 3,14c CT4 13,43 13,15

Dựa vào bảng 3.14 cho thấy thời gian sấy khác nhau thì hàm lượng flavonoid

cũng khác nhau. Khi sấy trong 30 phút thì hàm lượng flavonoid thu được cao nhất

là 36,05 %. Khi tăng thời gian sấy từ 45 – 60 phút hàm lượng flavonoid giảm dần từ

32,78% xuống 31,83%. Kết quả đánh giá cảm quan theo TCVN 3215 – 79 cho thấy

thời gian sấy trong 30 phút có tính chất cảm quan cao về cả màu sắc, mùi, vị, và

trang thái so với các công thức còn lại. Thời gian sấy thấp thì các phản ứng tạo mùi

chưa cao, màu sắc chưa đặc trưng cho sản phẩm. Nếu thời gian sấy cao, nguyên liệu

bị biến tính ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Vì vậy chúng tôi tiến hành lựa

chọn thời gian sấy nguyên liệu là 30 phút.

45

- Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu

Việc nghiền nguyên liệu có tác dụng làm tăng các hoạt chất sinh học của gai,

nếu nguyên liệu được nghiền quá nhỏ thì khi pha bột trà sẽ bị lọt qua túi lọc làm vẩn

đục trà. Tiến hành thí nghiệm như thí kết quả thu được trình bày trong bảng 3.14.

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu

Kích thước (mm) Cảm quan

1 < d ≤ 1 Dịch trà bị vẩn đục, có màu vàng nâu đậm.

1 < d ≤ 3 Dịch trà trong, có màu vàng nâu.

d ≥ 3 mm Dịch trà trong, có màu vàng nâu nhạt.

Dựa bảng 3.15 cho thấy mẫu với kích thước 1 < d ≤ 1 cho dịch trà vẩn đục

do bột trà quá nhỏ nên trong quá trình pha trà bột bị khuếch tán ra ngoài điều này

làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm. Khi tăng kích thước nguyên liệu 1mm < d

≤ 3 mm, dịch trà khi pha dịch nước trong và màu vàng hấp dẫn. Vì vậy, từ kết quả

trên chúng tôi lựa chọn kích thước của lá gai là 1mm< d ≤ 3mm.

- Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ phối trộn các nguyên liệu phụ bổ sung

Tỉ lệ phối trộn có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng cảm quan thực phẩm,

nguyên liệu bổ sung giúp cho sản phẩm tạo thành có hương thơm, dễ chịu, dễ

uống…, vì vậy tỉ lệ phối trộn các nguyên liệu có vai trò quan trọng để đạt chỉ tiêu

về các giá trị cảm quan, đáp ứng phù hợp với nhu cầu người sử dụng. Sau khi

nguyên liệu bổ sung được nghiền đến kích thước 1< d ≤ 3mm, chúng tôi tiến hành

thí nghiệm để xác định được loại nguyên liệu bổ sung vào quá trình phối chế. Kết

quả được đánh giá thông qua các chỉ tiêu chất lượng cảm quan của sản phẩm trà lá

gai túi lọc và được trình bày trong bảng 3.16.

Bảng 3.16. Tỷ lệ nguyên liệu phụ bổ sung vào trong sản phẩm

Điểm chất lượng Công thức Điểm HSTL Màu sắc

Vị Mùi Trạng thái

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 Tỉ lệ phối trộn lá gai/Lạc tiên/Cỏ Ngọt/Hoa nhài (g) 1,4g/0,2g/0,2g/0,2g 1,5g/0,2g/0,2g/0,1g 1,6g/0,1g/0,2g/0,1g 1,6g/0,2g/0,2g/0g Điểm trung bình 2,00b 2,33b 2,67ab 9,00 8,86 2,67ab 2,67b 2,00b 8,96 9,34 4,33a 4,73a 4,65a 18,21 18,08 3,50ab 4,33a 4,20b 15,36 14,33 2,00c 2,00c 4,50a 3,33b

(Ghi chú: các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở

mức ý nghĩa ≤ 0,05)

46

Dựa vào bảng 3.16 ta thấy: Ở các công thức khác nhau cho chất lượng cảm

quan về màu sắc mùi vị trạng thái khác nhau. Cụ thể chúng tôi tiến hành đánh giá

với 4 công thức như trên nhận thấy chất lượng cảm quan đạt cao nhất là ở công thức

thứ 3 và đạt chất lượng thấp ở công thức 1. Vì thế để tạo ra sản phẩm cho chất

lượng cảm quan tốt chúng tôi lựa chọn công thức 3 với tỉ lệ phối trộn nguyên liệu là

1,6g/0,1g/0,2g/0,1g để tiếp tục các quá trình tiếp theo.

3.4.1.3 Quy trình sản xuất

 Quy trình sản xuất trà túi lọc lá gai

Trên cơ sở các thông số công nghệ thu được từ các thí nghiệm trên, chúng tôi

đưa ra quy trình công nghệ sản xuất trà túi lọc như sau:

Nguyên liệu

Làm sạch

Sấy khô (60oC, 30 phút )

Nghiền nhỏ (1 < d ≤ 3)

Rây

Phối trộn (1,6g/0,1g/0,2g/0,1g)

Thành phẩm Đóng gói (2g/túi)

Hình 3.7. Sơ đồ quy trình sản xuất trà túi lọc lá gai

47

 Thuyết minh quy trình:

- Nguyên liệu:

Cây gai xanh được thu mua tại xã Cao Bằng. Ngoài ra, các nguyên liệu bổ

sung như lạc tiên, cỏ ngọt, hoa nhài được thu mua tại các hiệu thuốc Bắc trên địa

bàn thành phố Thái Nguyên. Lạc tiên, hoa nhài, cỏ ngọt đều được làm sạch loại bỏ bụi bẩn và tạp chất sau đó đem đi sấy khô ở nhiệt độ 80oC trong 30 phút thì đem đi

nghiền nhỏ tới kích thước 1 < d ≤ 3mm.

- Rây:

Gai sau khi nghiền nhỏ được sàng qua rây có ф =3 mm thu được bột gai.

Phần không lọt sàng rây lại được đưa vào máy nghiền lại.

- Phối trộn:

Bột gai thu được trong công đoạn rây được đem đi phối chế với các nguyên

liệu bổ sung đã được sấy khô cùng điều kiện nhiệt độ và thời gian giống gai. Tỷ lệ

bột nghiền lần lượt là gai/lạc tiên /cỏ ngọt/hoa nhài: (1,6g/0,1g/0,2g/0,1g). Sau đó

phải trộn đều để tạo sự đồng đều của trà thành phẩm. Đây là khâu rất quan trọng

quyết định tới màu sắc, vị của trà.

- Đóng gói:

Sau khi phối chế, bột nghiền gai/lạc tiên/cỏ ngọt được đóng gói trong túi lọc

chuyên dụng loại 2g/túi máy hàn túi dập chân của Trung Quốc. Túi lọc được làm

bằng loại giấy lọc đặc biệt chuyên dùng để bao gói thực phẩm, không hàn nhiệt, có

độ thẩm thấu nhanh, không ảnh hưởng tới hương vị của trà, không gây hại cho

người tiên dùng.Tiếp đó, túi trà túi lọc được đóng vào các túi bao bì tráng thiếc (20

túi lọc/gói) đóng hộp.

3.4.1.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm trà túi lọc từ lá gai

Sản phẩm trà túi lọc lá gai cho sản phẩm có chất lượng cao giúp an thần,

dễ ngủ. Để đánh giá được chất lượng của sản phẩm, chúng tôi tiến hành phân

tích các thành phần hóa học có trong sản phẩm gai trà túi lọc thể hiện quả ở

bảng 3.16 dưới đây:

Bảng 3.17. Kết quả đánh giá chất lượng sản phẩm

STT 1 2 Chỉ tiêu chất lượng Độ ẩm Chất lượng cảm quan Kết quả 8,5% Khá

48

Trong quá trình bảo quản độ ẩm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm,độ ẩm

quá cao sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật, nấm men, nấm mốc… phát triển gây hư

hỏng sản phẩm. Từ kết quả phân tích ở bảng 3.17 ta thấy, độ ẩm của sản phẩm là

8,5% phù hợp với quy định, đây là độ ẩm thuận lợi trong quá trình bảo quản.

Tiêu chuẩn giới hạn vi sinh vật, nấm mốc trong trà túi lọc lá gai là bắt buộc đối với

sản phẩm trà túi lọc khi đưa sản phẩm ra thị trường. Tiến hành thí nghiệm theo mục

2.3.4.3 kết quả thu được trình bày qua bảng 3.17:

Bảng 3.18. Kết quả đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật

Tên chỉ tiêu Kết quả

2,5.104 0,5.103 Mức tối đa TCVN 7975 - 2008 1.106 1.104 Tổng số vsv hiếu khí Nấm men, nấm mốc

Qua bảng 3.18 cho thấy chỉ tiêu vi sinh vật đạt yêu cầu theo quy định

ban hành. 3.4.2. Kết quả nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất cao củ gai

Củ gai

Làm sạch

Cắt khúc (2 – 4 cm)

Trích ly 92,06 phút, tỷ lệ 18,04/1, nồng độ 71,80% C2H5OH 70% Cô đặc 70oC (cô quay chân không) 9

Tá dược Sản phẩm

Hình 3.8. Quy trình sản xuất cao củ gai

49

 Thuyết minh quy trình:

Thuyết minh quy trình:

- Nguyên liệu: củ gai tươi.

- Sơ chế: củ gai được rửa sạch bằng nước, cho củ gai vào chậu nước to

ngâm khoảng 15 – 20 phút để làm giảm lực liên kết giữa các tạp chất bám ở củ gai

sau đó dùng giáp sắt cọ rửa cho đến khi loại bỏ được hết các tạp chất bẩn bám trên

củ. Để cho ráo nước dùng dao chặt thành các miếng nhỏ. Củ gai sau khi được chặt

thái thành miếng nhỏ cân khoảng 100g củ ngâm với ethanol 70% trong 90 phút.

- Trích ly: củ gai sau khi ngâm với ethanol 71,80% theo tỷ lệ 18,04/1 trong

thời gian 92,06 phút ở nhiệt độ 70ºC, sau đó đem lọc thu được dịch chiết đầu, bã

được tiếp tục đưa vào thiết bị Soxhlet trong 15 phút thu được dịch chiết 2. Gộp dịch

chiết đầu và 2 thu được hỗn hợp dịch chiết củ gai.

- Cô đặc: dịch chiết được đưa đi cô đặc ở nhiệt độ 70ºC cho đến khi đạt

được hàm lượng flavonoid yêu cầu và bổ sung tá dược (rượu ngô, đường màu và

đường lactose).

- Sản phẩm: sản phẩm cao lỏng được cho vào bình kín (bình kín đã được

thanh trùng ở 121ºC trong vòng 15 – 20 phút) và tránh ánh sáng.

50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Trong dược liệu cây gai xanh Cao Bằng phần lá gai và củ gai có nhiều

hoạt chất sinh học quý, cụ thể Axit clorogenic trong lá khô và rễ (củ gai) lần lượt là

0,11mg và 16,5mg; Flavonoid rhoifolin 3,61mg và 35,12mg; Apogenin 7,4mg và

54,23mg trên 100g nguyên liệu.

- Dịch chiết lá gai tại nồng độ 592,644 µg/ml có khả năng làm giảm 50%

gốc tự do 0,5 mM DPPH. Như vậy dịch chiết lá gai có tiềm năng sử dụng làm chất

chống oxy hóa tự nhiên.

2. Điều kiện chiết suất thích hợp để thu được hàm lượng flavonoid được xác

định như sau: nồng độ ethanol 70%, thời gian là 90 phút, tỷ lệ dung môi/ nguyên

liệu là 15/1, nhiệt độ là 80ºC. Chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo

thiết kế thí nghiệm của Box-Behnken với ba biến ba cấp độ cho phương án tốt nhất

được dự đoán nồng độ ethanol 71,80%, thời gian 92,06 phút, tỷ lệ dung môi/nguyên

liệu là 18,04/1, khi đó hàm lượng flavonoid tổng số đạt 24,7206 mg; xác định được

nhiệt độ cô đặc cao là 70ºC. Kết quả kiểm tra bằng thực nghiệm có độ tương thích

cao. Kết quả của chúng tôi đã tìm ra được điều kiện tối ưu để chiết suất flavonoid

cho hàm lượng cao nhất.

3. Dịch chiết lá gai có khả năng kháng một số loại vi khuẩn như trực khuẩn

gram (-): Escherichia coli, trực khuẩn gram (+) Bacillus subtilis, tụ cầu khuẩn gram

(+) Staphylococcus aureus, với đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết tác

động lên mỗi loại vi sinh vật là khác nhau. Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá

gai đối với chủng Bacillus subtilis là cao nhất với kết quả vòng kháng khuẩn là 9

mm và thấp nhất là chủng Escherichia coli với 4 mm. Đối với chủng

Staphylococcus aureus vòng kháng khuẩn là 7mm.

- Xác định được thành phần flavonoid trong cao củ gai là 115,6mg/100 ml,

khả năng kháng khuẩn trên 2 đối tượng VSV: Bacillus subtili và Escherichia coli.

4. Hoàn thiện quy trình sản xuất trà túi lọc lá gai và cao củ gai.

KIẾN NGHỊ

- Nghiên cứu sâu hơn về các hoạt tính sinh học có trong lá gai và củ gai.

51

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO.

I. Tài liệu tiếng Việt:

1. Đỗ Huy Ích ( 1990), Cây thuốc và động vật làm thuốc, NXB Khoa học và kỹ

thuật

2. Đỗ Tất Lợi ( 2004). Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y Học

3. Lưu Hồng Sơn và Đtg (2017),” Tối ưu hóa quá trình chiết suất Flavonoid từ

chè dây Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học và công nghệ 171(11): 15 – 19.

4. Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hòa, (2005), Vi sinh vật Y học, Nxb Đại học

quốc gia Hà Nội.

5. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa

học cây thuốc, Nxb Y học.

6. Nguyễn Thị Huyền ( 2017), ”Khả năng chống oxy hóa in vitro của dịch chiết lá

ca cao ( Theobroma cacao) và thử nghiệm hạn chế oxy hóa lipid trên cơ thịt cá

bớp”, Tạp chí khoa học nông nghiệp Việt Nam, tập 15, số 2: 214 – 224

7. Quyết định 4664/QĐ – BYT ngày 07/11/2014. Về việc ban hành bộ tranh cây

thuốc sử dụng trong cơ sở khám bệnh, chữa bệnh bằng y học cổ truyền

8. Thông tư 08/2014/TT- BYT, Ngày 23 tháng 08 năm 2004, Bộ Y tế.

9. Tạ Kim Chỉnh; Nguyễn Đức Khảm; Nguyễn Hà Chi; Nguyễn Thúy Hằng,

(2008), Nghiên cứu phát triển cây gai xanh (Boehmeria nivea L.Gaud) trên đất

dốc rừng đầu nguồn sông Đà, góp phần bảo vệ môi trường và xoá đói giảm

nghèo cho vùng di dân lòng hồ ở Sơn La, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ.

10. Trần Đức Hảo (2016), Khai thác và phát triển nguồn gen các giống gai xanh

(Boehmeria nivea L. Gaudich) Phú Yên và Thanh Hóa; Viện nghiên cứu bông

và phát triển nông nghiệp Nha Hố.

II. Tài liệu tiếng Anh:

11. A. Pérez (2013), Boehmeria nivea(L.) Gaud., Pastos y Forrajes, Vol. 36, No. 4,

October-December, 404-408, 2013.

12. Dong Gu Lee (2015), “Quantitative Analysis of the Flavonoid Content in the

Leaves of Boehmeria nivea and Related Commercial Products”, Natural

Product Sciences, 21(1) : 66-70.

52

13.G. Contò, F. Carfì and V. Pace (2011), ”Chemical Composition and Nutritive

Value of Ramie Plant [Boehmeria nivea (L.) Gaud] and Its By-Products from

the Textile Industry as Feed for Ruminants”, Journal of Agricultural Science

and Technology A1 (2011) 641-646

14. Heejeong Lee and Nami Joo (2012), ”Optimization of Pan Bread Prepared with

Ramie Powder and Preservation of Optimized Pan Bread Treated by Gamma

Irradiation during Storage”, Prev Nutr Food Sci, Vol 28, No 4.

15. Lien Ai Pham Huy, Hua He, Chuong Pham Huy (2008). Review article: Free

radicals, antioxidants in disease and health. International journal of

Biomedical science: vol 4 (2), 89-96.13. Parkavi, V., et al (2012),

Antibacterial Activity of Aerial Parts of Imperatacylindrica (L.) Beauv.

International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research. 4(3):

209-212.

16. Nuengchamnong N, Krittasilp K, Ingkaninan K, (2009). Rapid screening and

identification of antioxidants in aqueous extracts of Houttuynia cordata using

LC-ESI-MS coupled with DPPH assay. Food Chem; 117: 750-756.

17. Sana Ullah, Lijun Liu, Sumera Anwar, Xu Tuo, Shahbaz Khan, Bo Wang and

Dingxiang Peng (2016), Effects of Fertilization on Ramie (Boehmeria nivea

L.) Growth, Yield and Fiber Quality, MDPI 8,887.

18. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM (1999), Analysis of total

phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of

FolinCiocalteu reagent. In: Packer L, editor. Oxidants and Antioxidants, pp

152–178.

19. Spigno G. Tramelli, L. De Faveri, D.M. (2007). ”Effccts of extraction time,

temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape

marc phenolics”, Journal of Food Engineering, 81, pp. 200-208.

20. Tian Xiao Ying, Min Xu, Bin Deng, Kelvin Sze-Yin Leung, King Fai Cheng et

al (2011), ”The effects of Boehmeria nivea (L.) Gaud. on embryonic

development: In vivo and in vitro studies”, Journal of Ethnopharmacology.

21. Touming Liu (2013), Development and Characterization of 1,827 Expressed

Sequence Tag-Derived Simple Sequence Repeat Markers for Ramie

53

(Boehmeria nivea L. Gaud), PLoS One.

22. Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H, (2011). Phytochemical

screening and Extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia.

1(1): 98-106.

23. Xiaoning Wang (2015), “Protective Effects of Ramie (Boehmeria nivea) against

Oxidative Stress in C6 Glial Cells”, Korean J. Plant Res. 28(6):675-

681(2015).

24. Youn Ri Lee et al (2009), “Chemical Composition and Antioxidant Activity of

Ramie Leaf (Boehmeria nivea L.)”, Food Science and Biotechnology, Volume

18 Number 5 (2009.10).

Website:

25. http://www.buykorea.org/product-details/ramie-tea--3016831.html

26. http://www.buykorea.org/product-details/Brown-Rice-Ramie-Tea--

3016832.html

27. https://www.alibaba.com/showroom/ramie-powder.html

54

PHỤ LỤC 1: Bảng cho điểm đánh giá cảm quan

Điểm Chỉ tiêu

1 Màu nâu đậm kém sáng.

Màu sắc 3 Đạt tiêu chuẩn theo yêu cầu kỹ thuật 2 Màu vàng nhạt, không đặc trưng cho sản phẩm 5 Trong sáng, màu vàng nâu sáng đặc trưng cho sản phẩm. 4 Trong sáng, màu vàng nâu, đặc trưng cho sản phẩm

Lộ rõ mùi lạ hoặc mùi do khuyết tật

Thơm tự nhiên, gây ấn tượng khá hài hòa hấp dẫn, đặc trưng cho sản phẩm Kém thơm, lộ mùi lạ hoặc mùi do khuyết tật, không đặc trưng cho sản phẩm Mùi Đạt tiêu chuẩn theo yêu cầu kỹ thuật, có mùi thơm đặc trưng cho sản phẩm

Thơm tự nhiên, gây ấn tượng hài hòa hấp dẫn, dễ chịu đặc trưng cho sản phẩm. Không có mùi lạ hoặc mùi do khuyết tật, mùi thơm mạnh và bền

Không có vị, vị lạ hay vị do các khuyết tật khác gây khó uống Vị

Ngọt dễ chịu đặc trưng cho sản phẩm, ngon hấp dẫn. Hài hòa vị và mùi Vị nhạt không đặc trưng cho sản phẩm, vị lạ và vị do các khuyết tật khác Ngọt dễ chịu đặc trưng cho sản phẩm, khá hài hòa vị và mùi, không có vị lạ hay khuyết tật Đạt tiêu chuẩn theo yêu cầu kỹ thuật, ngọt dễ chịu và không có vị lạ hay khuyết tật

Nước bị đục tối, nhiều cặn bẩn lơ lửng

Trang thái Nước pha phải sống động và hấp dẫn, không có cặn bẩn lơ lửng Nước pha tương đối sống động và hấp dẫn, không có cặp bẩn lơ lửng

Nước bị đục, không đặc trưng cho sản phẩm, có cặn, bẩn lơ lửng Đạt tiêu chuẩn theo yêu cầu kỹ thuật, không có cặn bẩn lơ lửng, không bị đục

(TCVN 3218-1993, Bộ Khoa học - Công nghệ và Môi trường, số 212/QĐ ngày

12/5/1993)

55

PHỤ LỤC 2: Kết quả xử lý số liệu tối ưu hóa quy trình chiết suất Flavonoid từ củ gai

Sig.

df1

df2

.

2

.

1.1 Nồng độ Ethanol Test of Homogeneity of Variances Flavonoid Levene Statistic . ANOVA Flavonoid

df

Mean Square F

Sig.

Sum of Squares

2 3 5

3.478 .157

22.131

.016

Between Groups 6.956 .471 Within Groups 7.427 Total Multiple Comparisons Dependent Variable: Flavonoid

Sig.

(I) Nongdo

(J) Nongdo

Std. Error

Mean Difference (I-J)

60.00

LSD

70.00

80.00

70.00 80.00 60.00 80.00 60.00 70.00 80.00 80.00

-2.14000* -2.40500* 2.14000* -.26500 2.40500* .26500 -2.40500* -.26500

.39642 .39642 .39642 .39642 .39642 .39642 .39642 .39642

.012 .009 .012 .552 .009 .552 .015 .751

95% Confidence Interval Lower Bound -3.4016 -3.6666 .8784 -1.5266 1.1434 -.9966 -3.9378 -1.7978

Upper Bound -.8784 -1.1434 3.4016 .9966 3.6666 1.5266 -.8722 1.2678

60.00 70.00

Nongdo N

Dunnett t (2- sided)b *. The mean difference is significant at the 0.05 level. b. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Flavonoid

Duncana

60.00 70.00 80.00 Sig.

2 2 2

Subset for alpha = 0.05 2 1 15.6400 17.7800 18.0450 .552 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.

56

Sig.

df1

df2

.

2

.

1.2 Thời gian Test of Homogeneity of Variances Flavonoid Levene Statistic . ANOVA Flavonoid

df

Mean Square F

Sig.

Sum of Squares

2 3 5

1.909 .130

14.640

.028

Between Groups 3.818 .391 Within Groups 4.209 Total Multiple Comparisons Dependent Variable: Flavonoid

Sig.

(I) Thoigian

(J) Thoigian

Std. Error

Mean Difference (I-J)

75.00

LSD

90.00

105.00

90.00 105.00 75.00 105.00 75.00 90.00 105.00 105.00

-1.74000* -1.64000* 1.74000* .10000 1.64000* -.10000 -1.64000* .10000

.36111 .36111 .36111 .36111 .36111 .36111 .36111 .36111

.017 .020 .017 .800 .020 .800 .033 .947

95% Confidence Interval Lower Bound -2.8892 -2.7892 .5908 -1.0492 .4908 -1.2492 -3.0362 -1.2962

Upper Bound -.5908 -.4908 2.8892 1.2492 2.7892 1.0492 -.2438 1.4962

75.00 90.00

Thoigian N

Dunnett t (2- sided)b *. The mean difference is significant at the 0.05 level. b. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Flavonoid

Duncana

75.00 105.00 90.00 Sig.

2 2 2

Subset for alpha = 0.05 2 1 16.1600 17.8000 17.9000 .800 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.

57

Sig.

df2

df1

.

2

.

1.3. Nhiệt độ Test of Homogeneity of Variances Flavonoid Levene Statistic . ANOVA Flavonoid

df

Mean Square F

Sig.

Sum of Squares

2 3 5

.812 .164

4.952

.112

Between Groups 1.624 .492 Within Groups 2.116 Total Multiple Comparisons Dependent Variable: Flavonoid

Sig.

Std. Error

(J) Nhietdo

(I) Nhietdo

Mean Difference (I-J)

65.00

LSD

70.00

75.00

-1.25500 -.43500 1.25500 .82000 .43500 -.82000 -.43500 .82000

.40499 .40499 .40499 .40499 .40499 .40499 .40499 .40499

70.00 75.00 65.00 75.00 65.00 70.00 75.00 75.00

.053 .361 .053 .136 .361 .136 .531 .215

95% Confidence Interval Lower Bound -2.5439 -1.7239 -.0339 -.4689 -.8539 -2.1089 -2.0009 -.7459

65.00 70.00

Upper Bound .0339 .8539 2.5439 2.1089 1.7239 .4689 1.1309 Dunnett t (2- sided)a 2.3859 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Flavonoid

Nhietdo N

Duncana

65.00 75.00 70.00 Sig.

2 2 2

Subset for alpha = 0.05 1 22.8750 23.3100 24.1300 .054

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.

58

Sig.

df2

df1

.

2

.

1.4. Dung môi/nguyên liệu Test of Homogeneity of Variances Flavonoid Levene Statistic . ANOVA Flavonoid

df

Mean Square F

Sig.

Sum of Squares

2 3 5

.921 18.675

8.877 .307

28.928

.011

Sig. 95% Confidence

Between Groups 17.754 Within Groups Total Multiple Comparisons Dependent Variable: Flavonoid (I) Tyledungmoi

(J) Tyledungmoi Std. Error Mean Difference (I-J)

Interval Lower Bound

10.00

.8971 LSD 15.00

20.00

Upper Bound -2.66000* .55396 .017 -4.4229 -.8971 -4.16000* .55396 .005 -5.9229 -2.3971 2.66000* .55396 .017 4.4229 .55396 .073 -3.2629 .2629 -1.50000 4.16000* .55396 .005 2.3971 5.9229 1.50000 .55396 .073 -.2629 3.2629 -4.16000* .55396 .008 -6.3019 -2.0181 -1.50000 .55396 .118 -3.6419 .6419 15.00 20.00 10.00 20.00 10.00 15.00 20.00 20.00 10.00 15.00

Dunnett t (2- sided)b *. The mean difference is significant at the 0.05 level. b. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Flavonoid

Tyledungmoi N

Duncana

10.00 15.00 20.00 Sig. 2 2 2 Subset for alpha = 0.05 1 18.9500 1.000 2 21.6100 23.1100 .073

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.