Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát hoạt tính ức chế tế bào ung thư dạ dày của một số rau xanh Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:83

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu chung của đề tài "Khảo sát hoạt tính ức chế tế bào ung thư dạ dày của một số rau xanh Việt Nam" là sàng lọc và đánh giá được hoạt tính ức chế sinh trưởng và tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của một loại rau ăn trên mô hình thí nghiệm In-vitro.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát hoạt tính ức chế tế bào ung thư dạ dày của một số rau xanh Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thanh Quang KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA MỘT SỐ RAU XANH VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VÕ THANH SANG Tp. Hồ Chí Minh – 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin được cam đoan đề tài “Khảo sát hoạt tính ức chế tế bào ung thư dạ dày của một số rau xanh Việt Nam” được tiến hành công khai, dựa trên sự cố gắng nổ lực của bản thân dưới sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy TS. Võ Thanh Sang và sự hỗ trợ từ các phòng thí nghiệm của trường Đại học Văn Lang cũng như trường Đại học Nguyễn Tất Thành. Các số liệu nghiên cứu và kết quả trong đề tài là trung thực và hoàn toàn không sao chép hoặc sử dụng kết quả của bất kỳ đề tài nghiên cứu nào tương tự. Nếu phát hiện có sự sao chép kết quả của đề tài khác, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tp. Hồ Chí Minh, Ngày tháng năm 2020 Tác giả Nguyễn Thanh Quang
LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ này, trước tiên tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ Thanh Sang, người thầy đã định hướng, trực tiếp dẫn dắt và cố vấn cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học. Thầy cũng là người đã cho tôi rất nhiều bài học cả về chuyên môn lẫn cách làm việc thông qua các đề tài, dự án của mình và giúp tôi định hướng phát triển trong sự nghiệp. Một lần nữa tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy bằng tất cả tấm lòng và sự biết ơn của mình. Bên cạnh đó, tôi xin phép được gửi đến quý Thầy/Cô là Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình truyền đạt cho tôi các kiến thức chuyên môn hữu ích cũng như hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và làm luận văn. Tôi cũng đồng thời xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS. Lê Thị Kim Oanh, Trưởng khoa Công nghệ, trường Đại học Văn Lang, TS. Vũ Thị Quyền, Trưởng ngành Công nghệ Sinh học, khoa Công nghệ, trường Đại học Văn Lang cùng các anh chị là đồng nghiệp, là các Giảng viên, Nghiên cứu viên của trường Đại học Văn Lang và trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã luôn tạo điều kiện giúp tôi vượt qua những ngày tháng khó khăn trong công tác cũng như trong quá trình thực hiện luận văn. Ngoài ra, tôi chân thành gửi lời cám ơn đến các bạn sinh viên của trường Đại học Văn Lang và trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã luôn đồng hành bên cạnh, ủng hộ, động viên và hỗ trợ tôi hết mình trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn Thạc sĩ một cách hiệu quả nhất. Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến ba và mẹ của tôi, người đã đồng hành cùng tôi vượt qua bao lần vấp ngã để có được thành quả ngày hôm nay. Con xin cám ơn ba mẹ. Tôi xin chân thành cám ơn tất cả mọi người./.
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CÁM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ......................................................................................................... 1 DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... 4 DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... 6 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 7 Lý do chọn đề tài ............................................................................................ 7 Mục tiêu của đề tài ......................................................................................... 7 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 8 Phạm vi nghiên cứu........................................................................................ 8 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................... 8 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 9 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ DẠ DÀY ............................................... 9 1.1.1. Giới thiệu ung thư dạ dày ................................................................. 9 1.1.2. Tác động của ung thư dạ dày ............................................................ 9 1.1.3. Đặc điểm và phân loại bệnh............................................................ 10 1.1.4. Các liệu pháp cho việc chữa trị....................................................... 11 1.1.5. Khuyến nghị .................................................................................... 11 1.2. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH APOPTOSIS CỦA TẾ BÀO .......... 12 1.3. SỰ OXY HÓA VÀ CÁC CHẤT KHÁNG OXY HÓA ....................... 13 1.3.1. Sự oxy hóa ...................................................................................... 13 1.3.2. Gốc tự do......................................................................................... 14 1.3.3. Stress oxy hóa và các bệnh ở người................................................ 14 1.3.4. Các chất kháng oxy hóa .................................................................. 15 1
1.4. CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC............................................................. 16 1.5. CÁC LOẠI RAU XANH TRONG NGHIÊN CỨU ............................. 18 1.5.1. Rau sam ........................................................................................... 18 1.5.2. Rau diếp cá...................................................................................... 20 1.5.3. Rau nhút .......................................................................................... 21 1.6. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ............................ 23 1.6.1. Các nghiên cứu ngoài nước ............................................................ 23 1.6.2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................. 24 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU CHUNG ............................................... 26 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU .......................................................................... 27 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 27 2.3.1. Tách chiết ........................................................................................ 27 2.3.2. Xác định độ ẩm mẫu ....................................................................... 28 2.3.3. Xác định hàm lượng tro toàn phần ................................................. 29 2.3.4. Định lượng hợp chất phenol trong cao chiết .................................. 29 2.3.5. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa thông qua quét gốc DPPH........ 30 2.3.6. Khảo sát khả năng bắt gốc tự do bằng phương pháp ABTS+ ......... 31 2.3.7. Khảo sát độc tính của cao chiết lên tế bào ...................................... 32 2.3.8. Khảo sát hình thái tế bào ung thư ................................................... 33 2.3.9. Khảo sát về khả năng ức chế di chuyển của tế bào ung thư ........... 34 2.3.10. Đánh giá mức biểu hiện gene của các phân thử tính hiệu bằng Realtime PCR............................................................................................ 34 2.3.11. Xử lý số liệu .................................................................................. 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 36 2
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT CÁC LOẠI RAU ....................................... 36 3.2. KẾT QUẢ VỀ ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT PHENOLIC TỔNG TRONG CAO ETHANOL TỪ CÁC LOẠI RAU ...................................... 37 3.3. KẾT QUẢ SÀNG LỌC VỀ HOẠT TÍNH TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA CAO ETHANOL TỪ CÁC LOẠI RAU .................. 38 3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HÀM LƯỢNG PHENOLIC TỔNG TRONG CÁC CAO PHÂN ĐOẠN RAU NHÚT ....................................... 41 3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA CÁC CAO PHÂN ĐOẠN RAU NHÚT .................. 43 3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÌNH THÁI TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA RAU NHÚT .............................................................. 46 3.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ DI CHUYỂN CỦA TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA RAU NHÚT ........................... 48 3.8. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ SỰ THAY ĐỔI CÁC TÍN HIỆU NỘI BÀO LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG CHẾT TẾ BÀO APOPTOSIS CỦA RAU NHÚT ........................................................................................ 49 3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT ETHANOL VÀ CAO PHÂN ĐOẠN EtOAc TỪ RAU NHÚT ...................................................................................................................... 51 3.9.1. Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH ............................................. 51 3.9.2. Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS+ ............................................ 54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 57 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 57 4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 58 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 70 3
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các con đường tín hiệu liên quan đến hoạt hóa apoptosis [6] ..................12 Hình 1.2. Phân loại và cấu trúc hóa học của những nhóm chính của hợp chất phenolic .....................................................................................................................17 Hình 1.3. Rau sam (nguồn internet) ..........................................................................18 Hình 1.4. Rau diếp cá (nguồn internet) .....................................................................20 Hình 1.5. Rau nhút (nguồn internet) .........................................................................22 Hình 3.1. Đường chuẩn axit galic .............................................................................37 Hình 3.2. Hàm lượng phenolic tổng của các loại rau................................................38 Hình 3.3A. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau nhút ...........39 Hình 3.3B. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau sam ............39 Hình 3.3C. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau diếp cá .......40 Hình 3.4. Giá trị IC50 đối với hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của các loại rau ..............................................................................................................................40 Hình 3.5. Hàm lượng phenolic tổng trong các cao phân đoạn của rau nhút .............42 Hình 3.6A. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn hexan từ rau nhút ............................................................................................................................44 Hình 3.6B. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn CH2Cl2 từ rau nhút ......................................................................................................................44 Hình 3.6C. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn EtOAc từ rau nhút ......................................................................................................................45 Hình 3.6D. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn n-butanol từ rau nhút ......................................................................................................................45 Hình 3.7. Giá trị IC50 đối với hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của các cao phân đoạn từ rau nhút ................................................................................................46 Hình 3.8A. Hình thái tế bào ung thư dạ dày trước và sau khi xử lý cao phân đoạn EtOAc rau nhút .........................................................................................................47 4
Hình 3.8B. Hình thái tế bào ung thư dạ dày trước và sau khi xử lý cao phân đoạn EtOAc rau nhút khi được nhuộm với chất chỉ thị huỳnh quang calcein-AM ...........47 Hình 3.9. Hoạt tính ức chế di chuyển của cao phân đoạn EtOAc từ rau nhút đối với tế bào ung thư dạ dày ................................................................................................49 Hình 3.10. Khả năng hoạt hóa các gene tham gia con đường apoptosis của cao phân đoạn EtOAc từ rau nhút trên dòng tế bào ung thư dạ dày.........................................50 Hình 3.11A. Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của vitamin C ............................52 Hình 3.11B. Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của cao tổng ethanol rau nhút ...52 Hình 3.11C. Hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của cao phân đoạn EtOAc rau nhút ............................................................................................................................53 Hình 3.12. Giá trị IC50 đối với hoạt tính trung hòa gốc tự do DPPH của vitamin C, cao tổng ethanol và cao phân đoạn EtOAC rau nhút ................................................53 Hình 3.13A. Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ của vitamin C ..........................54 Hình 3.13B. Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ của cao tổng ethanol rau nhút ..54 Hình 3.13C. Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ của cao phân đoạn EtOAc rau nhút ............................................................................................................................55 Hình 3.14. Giá trị IC50 đối với hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ của vitamin C, cao tổng ethanol và cao phân đoạn EtOAC rau nhút ................................................55 5
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao và Vitamin C bằng phương pháp DPPH ..........................................................................................31 Bảng 2.2. Bố trí thí nhgiệm khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao và Vitamin C bằng phương pháp ABTS+ ........................................................................................32 Bảng 3.1. Kết quả thu nhận cao chiết từ các loại rau ................................................36 Bảng 3.2. Kết quả thu nhận cao phân đoạn từ rau nhút ............................................42 6
MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Ung thư dạ dày hiện đang xếp vào loại ung thư phổ biến thứ tư và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong liên quan đến ung thư trên toàn thế giới. Xu hướng gia tăng bệnh chủ yếu tập trung ở các nước châu Á và các vùng miền có thu nhập thấp. Cho đến nay, hiệu quả điều trị ung thư dạ dày không mấy khả quan và tỷ lệ sống trung bình trong nhóm này vẫn còn dưới một năm. Ung thư dạ dày là một bệnh phức tạp, đòi hỏi sự theo dõi và nghiên cứu liên tục về phòng ngừa, phát hiện sớm và các phác đồ điều trị mới. Hiện nay, một số phương pháp đã được sử dụng cho điều trị ung thư dạ dày, tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, đáp ứng với điều trị là rất yếu và gây ra nhiều tác dụng phụ. Vì vậy, việc tìm kiếm phương pháp mới để hỗ trợ chữa trị ung thư là điều cần thiết cần phải liên tục nghiên cứu. Xuất phát từ thực trạng đó, nhiều nghiên cứu trên cây thuốc và bài thuốc từ các hợp chất thiên nhiên mang lại tiềm năng lớn cho nhu cầu trị liệu ung thư lâu dài và an toàn. Vì vậy, các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược đang được khuyến khích để sử dụng nhằm phòng và hỗ trợ điều trị bệnh, trong đó có ung thư dạ dày. Đặc biệt, Việt Nam được biết đến với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú và đa dạng. Từ lâu, nhiều cây cỏ và rau xanh đã được sử dụng trong dân gian để phòng và hỗ trợ kiểm soát bệnh, trong đó có ung thư dạ dày. Tuy nhiên, cơ sở khoa học cho việc chứng minh cơ chế hoạt động của các dược liệu đó trong các bài thuốc dân gian đối với ung thư dạ dày vẫn còn chưa rõ ràng. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài luận văn “Khảo sát hoạt tính ức chế tế bào ung thư dạ dày của một số rau xanh Việt Nam” được triển khai thực hiện. Mục tiêu của đề tài  Mục tiêu chung - Sàng lọc và đánh giá được hoạt tính ức chế sinh trưởng và tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của một loại rau ăn trên mô hình thí nghiệm In-vitro.  Mục tiêu cụ thể - Sàng lọc một loại rau và cao phân đoạn của nó có hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày. 7
- Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao tổng và cao phân đoạn được sàng lọc. - Khảo sát khả năng tiêu diệt và ức chế di chuyển tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn được sàng lọc. Đối tượng nghiên cứu - Rau sam, rau diếp cá, rau nhút. - Tế bào ung thư dạ dày BGC-823 có nguồn gốc từ ngân hàng tế bào Học viện Khoa học Trung Quốc, Thượng Hải, Trung Quốc. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu trên 3 đối tượng rau ăn hàng ngày là rau sam, rau diếp cá và rau nhút được bán tại các cửa hàng rau sạch đạt tiêu chuẩn Việt Gap trên địa bàn quận 7, Tp. Hồ Chí Minh. - Mô hình khảo sát hoạt tính kháng ung thư là mô hình In-vitro. - Thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm của trường Đại học Nguyễn Tất Thành và trường Đại học Văn Lang Tp. Hồ Chí Minh. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Nghiên cứu này sẽ giúp chúng ta thấy được vai trò có lợi của một số loại rau đối với việc ức chế sự sinh trưởng và tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày, từ đó nhận thấy được vai trò và tác dụng của các loại rau ăn hàng ngày đối với việc phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư dạ dày. Kết quả nghiên cứu sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn và nghiên cứu lâm sàng để tiến đến sản xuất ứng dụng phục vụ nhu cầu cộng đồng trong việc phòng ngừa ung thư dạ dày. 8
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ DẠ DÀY 1.1.1. Giới thiệu ung thư dạ dày Ung thư dạ dày là một căn bệnh hiểm nghèo gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người bệnh trên toàn cầu. Ung thư dạ dày hiện đang xếp vào loại ung thư phổ biến thứ tư và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong liên quan đến ung thư trên toàn thế giới [1]. Mặc dù tỷ lệ tử vong đang có xu hướng giảm do chế độ dinh dưỡng được cải thiện, sự bảo quản thực phẩm tốt, sự phòng ngừa bệnh tốt hơn, sự chẩn đoán và điều trị sớm hơn, nhưng bệnh này vẫn có xu hướng diễn tiến theo chiều hướng xấu. Cho đến nay, ung thư dạ dày thường được chẩn đoán ở giai đoạn tiến triển của bệnh. Về cơ bản, phương thức điều trị phổ biến vẫn là phẫu thuật cắt bỏ bằng hóa trị bổ trợ hoặc hóa trị trong các trường hợp thích hợp, giúp cải thiện khả năng sống sót [2]. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị ung thư dạ dày không mấy khả quan và tỷ lệ sống trung bình trong nhóm này vẫn còn dưới một năm [3]. Ung thư dạ dày là một bệnh phức tạp, đòi hỏi sự theo dõi và nghiên cứu liên tục về phòng ngừa, phát hiện sớm và các phác đồ điều trị mới. Sự phân bố ung thư dạ dày thay đổi đáng kể giữa các khu vực địa lý. Đặc biệt, các quốc gia châu Á chiếm phần lớn các trường hợp trên thế giới [4]. Ngay cả trong các khu vực có tỷ lệ người mắc bệnh cao, đa số người mắc bệnh là những người có thu nhập thấp [5]. Các yếu tố như môi trường và chế độ dinh dưỡng có liên quan đến sự phát triển của bệnh. Những thực phẩm được bảo quản bằng muối nitrat, thực phẩm hun khói hoặc ngâm giấm có liên quan đến việc tăng nguy cơ phát triển ung thư dạ dày [6]. Nhiễm trùng niêm mạc mãn tính do vi khuẩn Helicobacter pylori cũng được xem là nguyên nhân quan trọng gây ra ung thư dạ dày [7]. 1.1.2. Tác động của ung thư dạ dày Theo thống kê, 73% các trường hợp ung thư dạ dày được chẩn đoán ở các nước châu Á và gần 50% các trường hợp trên thế giới được phát hiện ở Trung Quốc [4]. Châu Âu chiếm thêm 15% và Trung và Nam Mỹ có 7% các 9
trường hợp mắc ung thư dạ dày [8]. Đặc biệt, tỷ lệ mắc bệnh ở nam giới cao gấp đôi phụ nữ và tỷ lệ mắc bệnh tăng theo độ tuổi. Ngay cả trong cùng một khu vực địa lý, một số nhóm dân tộc có nguy cơ mắc bệnh cao hơn đáng kể. Ở Hoa Kỳ, người gốc Tây Ban Nha, người Mỹ gốc Phi và người Mỹ bản địa thường bị ảnh hưởng nhiều hơn người Mỹ da trắng [9]. Tuy nhiên, tình trạng kinh tế xã hội cũng ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ mắc bệnh ung thư dạ dày. Tỷ lệ mắc ung thư dạ dày có thể được phân chia thêm theo vị trí của nó trong dạ dày như ung thư tại phần xa của dạ dày (noncardia) và ung thư phát sinh ở khu vực gần tim [10]. Sự phân biệt giữa bệnh tim và bệnh noncardia rất quan trọng vì có biểu hiện gần giống nhau nhưng có nguyên nhân khác nhau. Nhìn chung, các quốc gia kém phát triển có tỷ lệ bệnh ung thư dạ dày cao hơn các nước phát triển. Trong tất cả các quốc gia bị ảnh hưởng, ung thư dạ dày noncardia có nhiều khả năng ảnh hưởng đến những người thuộc nhóm thu nhập thấp [5]. Tương tự, nguy cơ nhiễm Helicobacter pylori có liên quan đến tình trạng thu nhập thấp, tình trạng quá tải và mất vệ sinh [10]. 1.1.3. Đặc điểm và phân loại bệnh Một số hệ thống phân loại dùng để xác định ung thư dạ dày nhưng thường được sử dụng nhất là phân loại Lauren. Phân loại Lauren được định nghĩa theo hai loại bao gồm loại ruột và loại khuếch tán [11]. Mỗi phân nhóm đại diện cho các đặc điểm lâm sàng và dịch tễ khác nhau. Có rất ít trường hợp ung thư dạ dày hiển thị các đặc điểm của cả hai loại trên. Sự khác biệt về hình thái giữa hai loại có liên quan đến các phân tử bám dính nội bào. Khuếch đại gene là một kiểu biểu hiện thường xuyên của sự thay đổi gene trong ung thư dạ dày. Sự biểu hiện quá mức protein như vậy có thể được phát hiện bởi phân tích hóa mô miễn dịch. Khuếch đại của thụ thể liên quan yếu tố tăng trưởng biểu bì 2 (HER2) được thấy trong các khối u đại trực tràng, phổi, dạ dày và buồng trứng [12]. Trong ung thư dạ dày, biểu hiện quá mức HER2 được báo cáo ở 7-34% của khối u, đặc biệt là ở ngã ba thực quản dạ dày và trong các tổn thương đường ruột [13]. Sự biểu hiện quá mức của yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR) đã được chứng minh là một dấu hiệu cho dấu hiệu xấu 10
trong ung thư dạ dày [14]. Biểu hiện của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu A (VEGFA) và thụ thể của nó được nhận thấy trong khoảng 40% trường hợp ung thư dạ dày và tăng biểu hiện của VEGFA có liên quan đến sự tiến triển của bệnh [15]. Các protein trên là mục tiêu cho việc lựa chọn các liệu pháp trị liệu nhằm kiểm soát ung thư dạ dày. 1.1.4. Các liệu pháp cho việc chữa trị Tùy thuộc vào kích thước và vị trí của khối u nguyên phát, phương pháp trị liệu có thể là phẫu thuật cắt bỏ toàn bộ hoặc một phần. Trong đó, liệu pháp hóa trị đã được sử dụng trong trường hợp di căn. Mặc dù nhiều liệu pháp tiếp cận trực tiếp đến các “targets” đã được nghiên cứu, nhưng chỉ có hai phương pháp đã được phê duyệt để sử dụng tại Hoa Kỳ dựa trên các thử nghiệm lâm. Sự ức chế HER2 đã được thử nghiệm như một liệu pháp cho một số bệnh ung thư. Bên cạnh đó, trastuzumab được tạo ra như một kháng thể đơn dòng nhắm vào HER2 và do đó ức chế tín hiệu qua trung gian HER2 và ngăn chặn sự phân tách của các domain ngoại bào của nó [16]. Một nghiên cứu quốc tế gần đây ở giai đoạn III đã đánh giá tính hiệu quả của trastuzumab. Bệnh nhân được điều trị bằng trastuzumab kết hợp với hóa trị liệu đã cải thiện hơn tình trạng bệnh so với chỉ dùng hóa trị [17]. 1.1.5. Khuyến nghị Ung thư dạ dày vẫn là mối đe dọa đáng kể đối với sức khỏe toàn cầu. Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh có xu hướng giảm trong nhiều thập kỷ qua, nhưng vẫn còn nhiều chỗ cần cải thiện liên quan đến việc phòng ngừa, phát hiện, can thiệp sớm và điều trị để kéo dài sự sống. Đặc biệt đối với các trường hợp như đột biến “the E-cadherin gene” và tiền sử gia đình mắc bệnh ung thư dạ dày, việc sàng lọc để phát hiện nguy cơ bệnh sớm đã được khuyến nghị [18]. Thêm vào đó, việc sàng lọc và điều trị thường xuyên đối với những đối tượng nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori là điều cần thiết để phòng ngừa sự tiến triển của ung thư. 11
1.2. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH APOPTOSIS CỦA TẾ BÀO Apoptosis là một dạng chết tế bào đặc biệt thể hiện qua các đặc điểm hình thái và sinh hóa, bao gồm màng tế bào bị phá vỡ, sự ngưng tụ chất nhiễm sắc, sự phân mảnh DNA bộ gene và sự kích hoạt các phân tử tín hiệu thực bào trên bề mặt tế bào. Tế bào đang trải qua quá trình apoptosis khác với tế bào chết do hoại tử. Hình 1.1. Các con đường tín hiệu liên quan đến hoạt hóa apoptosis [6] Các tế bào hoại tử thường được hệ thống miễn dịch nhận ra là một tín hiệu nguy hiểm; ngược lại, chết theo kiểu apoptosis là một quá trình có trật tự được thiết lập theo chương trình chết của tế bào. Apoptosis rất quan trọng trong việc duy trì chức năng của hầu hết các hệ thống trong cơ thể người lớn. Do đó, rối loạn điều hòa các quá trình truyền tín hiệu apoptosis thường dẫn đến những 12
hậu quả nghiêm trọng, chẳng hạn như các bệnh thoái hóa thần kinh, ung thư hoặc tự miễn dịch [19-23]. Hai con đường chính dẫn đến quá trình apoptosis trong hệ thống động vật có vú được biết đến, bao gồm con đường ngoại sinh và nội sinh (Hình 1.1) [24]. Con đường ngoại sinh hoạt động thông qua các thụ thể chuyên biệt kiểm soát quá trình chết tế bào. Con đường ngoại sinh phụ thuộc vào việc gắn các chất trung gian ngoại sinh thích hợp vào các thụ thể ở bề mặt tế bào. Tín hiệu apoptosis được bắt đầu khi các thụ thể chuyên biệt ở bề mặt tế bào tương tác với một “ligand”, tạo ra một đường chuyền tín hiệu từ màng vào bên trong tế bào. Các thụ thể này có thể kích hoạt các tín hiệu nội bào trong vòng vài giây sau khi liên kết với ligand và dẫn đến cái chết của tế bào trong vài giờ. Ba cặp ligand/thụ thể chết tế bào chính đã được mô tả, gồm: (1) Fas và ligand Fas (FasL) (Fas còn được gọi là Apo-1 hoặc CD95; FasL còn được gọi là CD178 hoặc CD95L); (2) thụ thể (DR4 và DR5) và ligand gây chết apoptosis liên quan đến TNF (TRAIL, còn được gọi là Apo2L); và (3) TNFα và thụ thể TNF (TNF- R1) [25-29]. Ngược lại, con đường nội sinh thì liên quan đến sự hoạt hóa các tín hiệu từ bên trong tế bào, liên quan đến ty thể, gây ra một chuỗi hoạt hóa các phân tử tín hiệu caspase như caspase-3, caspase-8, caspase-9, cuối cùng dẫn đến apoptosis. Quá trình hoạt hóa apoptosis bị ngăn chặn bởi các thành viên chống apoptosis thuộc họ Bcl-2. Họ Bcl-2 thường được chia thành hai phân nhóm nhỏ dựa trên vai trò của chúng trong quá trình chết theo chương trình tế bào: một nhóm ức chế quá trình chết và nhóm còn lại hoạt hóa quá trình chết. Nhóm ức chế apoptosis bao gồm Bcl-2, Bcl-xL61, Bcl-w 62, Bcl-B 63, A1 64 và Mcl-1 65. Nhóm hoạt hóa con đường apoptosis gồm Bax 66, Bak 67, 68, Bcl-xs61 Bok 69 và Bcl-GL 70 [30-34]. 1.3. SỰ OXY HÓA VÀ CÁC CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.3.1. Sự oxy hóa Sự oxy hóa là sự mất đi các điện tử hoặc sự tăng trạng thái oxy hóa gây ra bởi một phân tử, nguyên tử, hoặc ion. Chất có khả năng oxy hóa các chất 13
khác (làm cho chúng mất các điện tử) được gọi là chất oxy hóa. Chất có khả năng khử chất khác (làm cho chúng nhận các điện tử) được gọi là chất khử. Chúng chuyển điện tử cho một chất khác, và do đó tự nó bị oxy hóa. Trong quá trình oxy hóa, các nhân tố khử thường nhường điện tử và thông thường nhường hydro hoặc oxy [35]. 1.3.2. Gốc tự do Gốc tự do (free radical) là một phân tử có thể tồn tại độc lập, có một điện tử chưa ghép đôi. Chính một điện tử chưa ghép đôi này đã tạo nên một số tính chất đặc trưng ở hầu hết các loại gốc tự do. Có nhiều gốc tự do kém ổn định và có khả năng phản ứng rất mạnh. Chúng có thể cho hoặc nhận điện tử từ các phân tử khác, do vậy, chúng có thể vừa hoạt động như một chất khử hoặc một chất oxy hóa [36]. Các gốc tự do chứa oxygen (ROS) và gốc tự do chứa nitrogen (RNS) là quan trọng nhất trong nhiều trạng thái bệnh lý, bao gồm: gốc hydroxyl, gốc anion superoxide, gốc hydrogen peroxide, oxygen nguyên tử, hypochlorite, gốc nitric oxide, và gốc peroxynitrite. Đây là những gốc có khả năng phản ứng rất cao, có thể ở trong nhân hoặc màng tế bào, gây tổn hại đến các đại phân tử sinh học như DNA, Protein, Lipid, Carbohydrate. Chúng tấn công các đại phân tử dẫn đến tổn thương tế bào và phá vỡ cân bằng nội môi. Tất cả các phân tử trong cơ thể đều có thể là mục tiêu của gốc tự do, trong đó, protein, axit nucleic và lipid là dễ bị tấn công và gây ra nhiều bệnh khác nhau như ung thư, tiểu đường, tim mạch, thần kinh, lão hóa... 1.3.3. Stress oxy hóa và các bệnh ở người Stress oxy hóa là một thuật ngữ dùng để chỉ tình trạng tổn hại do sự oxy hóa diễn ra có sự mất cân bằng giữa tốc độ tạo gốc tự do và tốc độ tạo các chất bảo vệ kháng oxy hóa [37]. Stress oxy hóa làm tổn hại nhiều đại phân tử sinh học như axit nucleic, protein, lipid. Stress oxy hóa trong thời gian ngắn có thể diễn ra trong mô bị tổn thương do sự chấn thương, nhiễm trùng, bỏng nhiệt, độc tố hoặc do tập thể dục quá sức. Các mô này sinh ra các enzyme như xanthine oxidase, lipogenase, cyclo-oxygenase, hoạt hóa các quá trình thực bào, giải phóng các ion tự do, các ion đồng, hoặc phá vỡ các chuỗi vận chuyển điện tử của quá trình phosphoryl hóa - oxy hóa và tạo ra ROS lượng lớn. 14
Giai đoạn khởi phát, tăng sinh và phát triển của bệnh ung thư, hoặc các tác dụng phụ của quá trình hóa trị và xạ trị đều có liên quan đến sự mất cân bằng giữa ROS và hệ thống phòng vệ kháng oxy hóa. ROS có liên quan đến các biến chứng của đái tháo đường, các bệnh về mắt ở người lớn tuổi, và các bệnh do thoái hóa thần kinh như bệnh Parkinson [38]. Người ta cho rằng, stress oxy hóa là nguyên nhân gây nên chứng xơ vữa động mạch, các bệnh về viêm, một số bệnh ung thư và quá trình lão hóa. Ngày nay, người ta biết được stress oxy hóa là một trong các nguyên nhân chính gây ra các bệnh về viêm như: viêm khớp, viêm mạch, viêm cầu thận, lupus ban đỏ, các triệu chứng của bệnh hô hấp ở người lớn, bệnh thiếu máu cục bộ (bệnh tim, đột quỵ, thiếu máu cục bộ ở ruột), hội chứng suy giảm miễn dịch (AIDS), bệnh khí thủng, cấy ghép nội tạng, viêm loét dạ dày, tăng huyết áp và tiền sản giật, rối loạn thần kinh (Alzheimer, Parkinson, teo cơ), nghiện rượu, các bệnh liên quan đến hút thuốc lá, và nhiều bệnh khác. Khi bị stress oxy hóa quá mức có thể dẫn đến sự oxy hóa các lipid và protein, dẫn đến những thay đổi trong cấu trúc và chức năng của chúng [39]. 1.3.4. Các chất kháng oxy hóa Chất kháng oxy hóa là những chất có khả năng nhường điện tử cho các chất oxy hóa, các gốc tự do, trung hòa gốc tự do. Các chất kháng oxy hóa ngăn chặn sự hư hại của tế bào thông qua việc làm chậm hoặc ức chế quá trình oxy hóa. Cơ thể có một số cơ chế chống lại quá trình oxy hóa thông qua việc sản xuất các chất kháng oxy hóa nội sinh hoặc chất kháng oxy hóa ngoại sinh được cung cấp từ thực phẩm [40]. Các chất kháng oxy hóa của cơ thể được cung cấp bởi 2 nguồn: nội sinh và các loại thực phẩm, dược phẩm bổ sung. Các chất kháng oxy hóa nội sinh bao gồm các enzyme kháng oxy hóa và chất kháng oxy hóa có phân tử lượng thấp. Các enzyme kháng oxy hóa thuộc bốn họ chính: Superoxyde dismutase (SOD), Glutathione peroxydase (GPx), Glutathione reductase (GRx) và catalase (CAT). SOD xúc tác cho quá trình phân giải gốc superperoxyde (O2●) thành H2O2 và H2O2 tiếp tục được chuyển đổi thành nước và oxy dưới tác dụng của catalase (CAT) hoặc các enzyme thuộc họ peroxydase như glutathione peroxydase (GPx). Nhóm các chất kháng oxy 15
hóa có phân tử lượng thấp bao gồm các chất kháng oxy hóa được tạo ra từ các quá trình chuyển hóa trong cơ thể như lipoid axit, glutathione, L-ariginine, coenzyme Q10, uric axit [41]. Các chất kháng oxy hóa được cung cấp từ bên ngoài thông qua nguồn thực phẩm và dược phẩm. Các chất kháng oxy hóa thông dụng được biết từ nguồn này như ascrobic axit, glutathione, tocopherols và tocotrienols, các hợp chất phenolics, astaxanthin, licopen, carotenoit…[42]. Việc tiêu thụ những chất kháng oxy hóa tự nhiên này sẽ góp phần đáng kể trong việc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể, góp phần cải thiện sức khỏe và phòng ngừa nhiều bệnh tật. 1.4. CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC Các hợp chất phenolic từ thực vật rất phổ biến và nằm trong hầu hết các mô thực vật đóng góp đáng kể vào sinh lý thực vật. Chúng đóng vai trò then chốt trong sự hình thành sắc tố, sự tăng trưởng, sinh sản, và kháng bệnh [43]. Hoạt chất phenolic tạo thành nhóm lớn và phân bố rộng trong giới thực vật. Cho đến nay, khoảng 8000 cấu trúc khác nhau của chúng đã được báo cáo và định danh. Hợp chất phenolic là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và đa dạng từ các hợp chất đơn giản như các axit phenolic cho đến những cao phân tử như tanin. Chúng có thể được phân chia thành 10 lớp khác nhau dựa trên cấu trúc hóa học đơn giản của chúng (Hình 1.2). Dẫn xuất phenolic và flavonoid là những hợp chất quan trọng có trọng lượng phân tử nhỏ và phổ biến nhất. Axit phenolic là hợp chất có phân tử nhỏ chẳng hạn như axit caffeic, vanillin, và axit coumaric [44]. Flavonoid hình thành nên nhóm lớn nhất chiếm đến hơn một nửa của các hợp chất phenolic. Sự đa dạng ở các nhóm thế tại vòng C trong cấu trúc của chúng dẫn đến sự phân loại nhiều nhóm chính như flavonols, flavones, flavanones, flavanols, isoflavones, và anthocyanidins. Trong khi flavonoid có trọng lượng phân tử nhỏ thì tanin lại có trọng lượng phân tử trung bình và cao (∼30,000 Da) và được hydro hóa hơn [45]. Những đặc điểm này góp phần hình thành phức hợp với carbohydrate và protein không tan làm cho nó có vị đắng và chát. Tanin được phân chia làm hai nhóm hóa học chính bao gồm tanin thủy phân và tanin ngưng tụ. Ngược với nhóm chất dinh dưỡng, chẳng hạn như vitamin và khoáng chất, hợp chất phenolic thực vật không cần thiết cho sự sinh 16
trưởng, phát triển, và sinh sản của cơ thể sống, vì vậy chúng thường không được xem như là chất dinh dưỡng. Tuy nhiên, nhiều bằng chứng thuyết phục về lâm sàng và dịch tễ cho thấy một số hợp chất phenolic hay thực vật giàu phenolic làm giảm đáng kể nguy cơ mắc bệnh mãn tính như bệnh tim mạch, ung thư, lão hóa, tiểu đường, và thoái hóa thần kinh [46]. Hình 1.2. Phân loại và cấu trúc hóa học của những nhóm chính của hợp chất phenolic 17