Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng Soybean mosaic virus

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:51

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng Soybean mosaic virus được thực hiện với mục tiêu nhằm tạo được dòng cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV ở giống đậu tương DT84. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng Soybean mosaic virus

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC N T NG N N TR RN G NG Đ TƯ NG T 4 TẠ NG N G N NG N R LU N ĂN T Ạ Ĩ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 5 / 2015 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NG T N NG N N TR RN G NG Đ TƯ NG T 4 TẠ NG NG N NG N R Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LU N VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC N ọ : GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên – 5/2015 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấ đ Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao, lại dễ trồng. Ngoài ra trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất nhằm tăng năng suất của các giống cây trồng khác. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nước, trong đó 65% ở miền Bắc và 35% ở miền Nam. Hiện nay năng suất và sản lượng đậu tương vẫn còn thấp và còn phải nhập khẩu từ các nước khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc [53]. Bên cạnh những yếu tố như hạn hán, kĩ thuật canh tác thì nguyên nhân bệnh do côn trùng, do vi khuẩn và virus gây ra cũng ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất, chất lượng đậu tương. Hiện nay người ta đã xác định được khoảng 30 loại bệnh hại ở cây đậu tương, trong đó có các bệnh do nhiễm virus gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất đậu tương [13]. Bệnh khảm lá đậu tương là bệnh hại xuất hiện phổ biến ở cây đậu tương do Soybean mosaic virus (SMV) thuộc nhóm Potyvirus gây ra. Đậu tương bị nhiễm SMV ở thời điểm trước khi ra hoa năng suất có thể giảm tới 40% và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [35]. SMV có thể lan truyền trong quần thể đậu tương do rệp, hoặc do cơ học. Hiện nay, những biện pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan truyền của SMV chỉ có tính chất phòng bệnh mà không thể chống lại triệt để. Tuy nhiên, nhờ ứng dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) người ta đã tạo ra cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus bằng cách đưa ch nh gen của virus gây bệnh vào hệ gen của cây chủ. Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống cây trồng chuyển gen kháng được các loại bệnh virus khác nhau đã được tạo ra, như cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus), cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV). Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 Xuất phát từ những l do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây chuyển gen kháng Soybean mosaic virus”. 2. ục t êu ê c u Tạo được dòng cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV ở giống đậu tương DT84. 3. Nộ du ê c u Nghiên cứu lây nhiễm A. tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mô nách lá mầm hạt chín của giống đậu tương DT84. Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi; Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Xác định hiệu suất chuyển gen. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5 ươ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. C đậu tươ 1.1.1. iá tr dinh dư ng c a đậu tương Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng 38-40%, lipid từ 18-20%, giàu vitamin và muối khoáng. Đậu tương là loại hạt duy nhất mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả protein và lipid. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các loại protein thực vật. Hàm lượng protein cao hơn cả ở cá, thịt và cao gấp hai lần hàm lượng protein có trong các loại đậu đỗ khác [14]. Hàm lượng các axit amin có chứa lưu huỳnh như methionin, sistein,… của đậu tương rất gần với hàm lượng của các chất này của trứng. Hàm lượng của cazein, đặc biệt là của lizin rất cao, gần gấp rưỡi trứng. Vì thế mà khi nói giá trị của protein ở đậu tương cao là nói hàm lượng lớn của nó cả sự đầy đủ và cân đối của các loại axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ tiêu hóa hơn thịt và không có các thành phần tạo nên cholesteron. Không có các dạng axit uric… Ngày nay, người ta mới biết thêm nó có chứa chất lexithin, có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm tr nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể. Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi đây là cây cung cấp dầu thực vật. Hiện nay các nước có mức sống cao người ta lại ưa chuộng dầu thực vật hơn mỡ động vật. Lipid của đậu tương chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm ngon. Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ vữa động mạch [14]. Trong đậu tương còn có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1 và B2, ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C… và Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6 các loại muối khoáng khác [14]. Do đó mà từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ăn bằng các phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên men… như làm giá, sữa đậu nành, xì dầu… cho đến các sản phẩm cao cấp như đậu tương, socola- đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt nhân tạo… ngay như ở nước ta, từ hàng ngàn năm nay đậu tương đã được cung cấp như một phần nhu cầu chất đạm cho người và gia súc, thông qua các món ăn cổ truyền được chế biến từ đậu tương, phần nào tạo ra được sự cân bằng dinh dưỡng trong khẩu phẩn thức ăn cho người dân. Đậu tương có thể chế biến thành giò, chả cho người ăn chay. Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là hạt đậu tương đen, có tác dụng tốt cho tim mạch, gan, thận, dạ dày và ruột, làm thức ăn tốt cho người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp, mới ốm dậy hoặc do lao động quá sức. Các chất lexithin và cazein có trong đậu tương có thể dùng riêng hoặc phối hợp để làm thuốc bổ dưỡng. Bột đậu tương sau khi đã ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp. Thân lá cây đậu tương có thể dùng làm thức ăn gia súc gia cầm rất tốt. Ở nhiều nước phát triển người ta còn dùng đậu tương vào các ngành công nghiệp khác như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không. Đậu tương còn có khả năng t ch lũy chất đạm của khí trời để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ sự cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần ở bộ rễ. Trong điều kiện thuận lợi, các vi khuẩn nốt sần này có thể t ch lũy được một lượng đạm tương đương từ 20- 25 kg ure/ha. Do vậy có thể nói mỗi nốt sần như một “nhà máy đạm tý hon”, bởi vậy nên trồng đậu tương không những tốn t phân đạm mà còn làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực trong việc cải tạo bồi dưỡng đất [14]. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7 1.1.2. Đặc đ sinh học Cây đậu tương (Glycine max (L) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), có nguồn gốc từ cây đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis) dạng thân leo, sống hàng năm được phát hiện ở Trung Quốc, Nhật Bản, và Triều Tiên. Chúng có rất nhiều chủng khác nhau, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới [14]. Rễ cây đậu tương khác với rễ cây hoà thảo là có rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2. Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, kh hậu và kỹ thuật trồng [14]. Trong điều kiện đất chua quá hoặc kiềm quá nốt sần hình thành kém. pH thích hợp cho sự hình thành của nốt sần là 6-7, vì vậy việc lựa chọn đất trồng đậu tương th ch hợp rất quan trọng. Điều kiện dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của nốt sần. Nhìn chung bón đầy đủ NPK thì nốt sần phát triển mạnh, bón P2O5 có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của nốt sần, còn hiệu quả kali không rõ lắm. Bón đạm không thích hợp ức chế sự hình thành và phát triển của nốt sần. Nốt sần ở rễ đậu tương thường tập trung ở tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có. Nốt sần đóng vai trò chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho cây. Lượng đạm cung cấp cho cây khá lớn khoảng 30-60 kg/ha. Nốt sần có thể dài l cm, đường kính 5 - 6 mm, mới hình thành có màu trắng sữa, khi tốt nhất có màu hồng. Quan hệ giữa vi sinh vật nốt sần với cây đậu tương là mối quan hệ cộng sinh: cây cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động, ngược lại vi khuẩn lại tổng hợp nitơ tự do của không khí chuyển sang dạng đạm hữu cơ cây có thể sử dụng được [14]. Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông nhỏ. Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8 nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của hoa sau này. Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi còn non thân có màu t m thì hoa có màu t m đỏ. Thân có trung bình 14-15 lóng, các lóng ở ph a dưới thường ngắn, các lóng ở ph a trên thường dài (vì những lóng phía trên phát triển từ ngày 35-40 trở đi vào lúc cây đang sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài). Tuỳ theo giống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3 - 10 cm. Cây đậu tương trong vụ hè thường có lóng dài hơn vụ xuân và vụ đông. Chiều dài của lóng góp phần quyết định chiều cao của thân. Thân cây đậu tương thường cao từ 0,3 m - 1,0 m. Những giống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc. Những giống thân to thường là thân đứng và có nhiều hạt và chống được gió bão. Toàn thân có một lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá. Thực tế cũng có giống không có lông tơ. Những giống có mật độ lông tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn và chịu rét khoẻ. Ngược lại những giống không có lông tơ thường sinh trưởng không bình thường, sức chống chịu kém. Thân có lông tơ nhiều ít dài ngắn, dày thưa là một đặc điểm phân biệt giữa các giống với nhau. Từ lúc mọc đến khi cây có 5 lá thật (3 lá kép) khoảng 25-30 ngày sau khi gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường [14]. Về quá trình phát triển của cây đậu tương, khi cây đã có 6-7 lá thật (4-5 lá kép) thân bắt đầu phát triển mạnh, tốc độ mạnh nhất vào lúc ra hoa rộ. Sự khác biệt của cây đậu tương với cây trồng khác là khi cây ra hoa rộ lại là lúc thân cành phát triển mạnh nhất. Đây là giai đoạn 2 quá trình sinh trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực cạnh tranh nhau dẫn đến khủng hoảng thiếu dinh dưỡng, cho nên cần phải cung cấp đầy đủ dinh dưỡng trước khi vào thời kỳ này và tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển thuận lợi. Trong kỹ thuật chăm sóc ta phải xới vun kết hợp với bón thúc phân cho đậu tương vào giai đoạn 3-5 lá kép, lúc cây có đầy đủ hoa thì sinh trưởng chậm dần rồi dừng hẳn. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9 Cây đậu tương có 3 loại lá: lá mầm, lá nguyên, lá kép. Lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh. Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi cây mầm, khi hết chất dinh dưỡng lá mầm khô héo đi, cho nên trong kỹ thuật trồng đậu tương nên làm đất tơi nhỏ và chọn hạt to cây sẽ mọc khoẻ, sinh trưởng tốt. Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau. Lá đơn to màu xanh bóng là biểu hiện cây sinh trưởng tốt. Lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống có khả năng chịu rét. Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không bình thường. Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá kép mọc so le, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu. Cũng có giống khi quả chín lá vẫn giữ được màu xanh, những giống này thích hợp trồng làm thức ăn gia súc. Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ. Lá có nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu hạn khoẻ nhưng thường cho năng suất thấp. Những giống lá to chống chịu hạn kém nhưng thường cho năng suất cao hơn. Nếu 2 lá kép đầu to và dày thường biểu hiện giống có khả năng chống chịu rét. Số lượng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá to hay nhỏ chi phối rất lớn đến năng suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng. Các lá nằm cạnh chùm hoa nào giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa ấy. Nếu vì điều kiện nào đó làm cho lá bị úa vàng thì quả ở vị tr đó thường bị rụng hoặc lép. Các nhà chọn giống đậu tương đưa ra cơ sở để nâng cao năng suất đậu tương là tăng cường quá trình quang hợp và muốn quang hợp với hiệu quả cao thì phải chọn những cây có bộ lá nhỏ, dày, thế lá đứng và lá có dạng hình trứng. Số lá nhiều to khoẻ nhất vào thời kỳ đang ra hoa rộ. Khi phiến lá phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi là biểu hiện cây sinh trưởng khoẻ có khả năng cho năng suất cao [14] Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc của hoa thay đổi tuỳ theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. Đa phần các giống có hoa màu tím và tím nhạt. Các giống đậu tương có hoa màu trắng Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10 thường có tỷ lệ dầu cao hơn các giống màu tím. Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1-10 hoa và thường có 3-5 hoa. Hoa đậu tương ra nhiều nhưng tỷ lệ rụng rất cao khoảng 30% có khi lên tới 80% [14]. Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy. Đài hoa có màu xanh, nhiều bông. Các cánh hoa vươn ra khỏi lá đài từ ngày hôm trước và việc thụ phấn xẩy ra vào sáng ngày hôm sau lúc 8-9 giờ sáng trước khi nụ hoặc hoa chưa nở hoàn toàn. Mùa hè hoa thường nở sớm hơn mùa đông và thời gian nở hoa rất ngắn sáng nở chiều tàn. Hoa đậu tương thường thụ phấn trước khi hoa nở và là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chiếm trung bình 0,5 - 1%. Thời gian bắt đầu ra hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống và thời tiết khác nhau. Giống chín sớm sau mọc trên dưới 30 ngày đã ra hoa và giống chín muộn 45-50 ngày mới ra hoa. Thời gian ra hoa dài hay ngắn theo giống và theo thời vụ. Có những giống thời gian ra hoa chỉ kéo dài 10-15 ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 10 sau khi hoa bắt đầu nở. Hoa trong đợt rộ mới tạo quả nhiều, còn trước và sau đợt hoa rộ thì tỷ lệ đậu quả thấp. Điều kiện thích hợp cho sự nở hoa là ở nhiệt độ 25-28oC, ẩm độ không khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80%. Căn cứ vào phương thức ra hoa người ta chia các giống đậu tương làm 2 nhóm: (i) Nhóm ra hoa hữu hạn: Thuộc những giống sinh trưởng hữu hạn, hướng ra hoa theo trình tự từ trên xuống dưới và từ ngoài vào trong. Những giống này thường cây thấp ra hoa tập trung, quả và hạt đồng đều. (ii) Nhóm ra hoa vô hạn: Thuộc những giống sinh trưởng vô hạn, có hướng ra hoa theo trình tự từ dưới lên trên và từ trong ra ngoài. Những giống này thường ra hoa rất phân tán, quả chín không tập trung và phẩm chất hạt không đồng đều. Trong thực tế, những giống hoa tập trung nếu gặp điều kiện bất thuận, hoa sẽ rụng nhiều nên thất thu nặng. Còn những giống thời gian ra hoa dài tuy quả chín không tập trung nhưng nếu bị rụng vào một đợt thì hoa sẽ ra tiếp đợt sau nên không thất thu nặng. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
11 Số quả biến động từ 2 đến 20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới 400 quả trên một cây. Một quả chứa từ 1 tới 5 hạt, nhưng hầu hết các giống quả thường từ 2 đến 3 hạt. Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài từ 2 tới 7 cm hoặc hơn. Quả có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc đen. Màu sắc quả phụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, màu sắc của lông, sự có mặt của các sắc tố antocyanin. Lúc quả non có màu xanh nhiều lông (có khả năng quang hợp do có diệp lục) khi ch n có màu nâu. Hoa đậu tương ra nhiều nhưng tỷ lệ đậu quả thấp 20-30%. Ví dụ trong vụ xuân 1 cây có thể có 120 hoa nhưng chỉ đậu 30-40 quả là cao, trên một chùm 5-8 hoa chỉ đậu 2- 3 quả. Những đốt ở phía gốc thường quả ít hoặc không có quả, từ đốt thứ 5-6 trở lên tỷ lệ đậu quả cao và quả chắc nhiều. Trên cành thường từ đốt 2-3 trở lên mới có quả chắc, những quả trên đầu cành thường lép nhiều. Sau khi hoa nở được 2 ngày thì cánh hoa héo và rụng, ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 sau hoa nở đã hình thành quả và 7 -8 ngày sau là thấy nhân quả xuất hiện. Trong 18 ngày đầu quả lớn rất nhanh sau đó chậm dần, vỏ dày lên và chuyển từ màu xanh sang màu vàng. Hạt lớn nhanh trong vòng 30-35 ngày sau khi hình thành quả. Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: Hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt vv... Hạt to nhỏ khác nhau tuỳ theo giống, khối lượng một nghìn hạt thay đổi từ 20-400g trung bình từ l00g-200g. Rốn hạt của các giống khác nhau thì có màu sắc và hình dạng khác nhau, đây là một biểu hiện đặc trưng của các giống [14]. 1.1.3. T uất đậu tươ t ê t v ệt N Hiện nay có 45% diện tích trồng đậu tương và 55% sản lượng đậu tương của thế giới nằm ở Mỹ. Nước Mỹ sản xuất 75 triệu tấn đậu tương năm 2000, trong đó hơn một phần ba được xuất khẩu. Các nước sản xuất đậu tương lớn khác là Brazil, Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ. Phần lớn sản lượng đậu tương của Mỹ hoặc để nuôi gia súc, hoặc để xuất khẩu, mặc dù tiêu thụ đậu tương ở Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
12 người trên đất nước này đang tăng lên. Dầu đậu tương chiếm tới 80% lượng dầu ăn được tiêu thụ ở Mỹ [66]. Theo ước tính của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng sản lượng đậu tương thế giới năm 2011/12 đạt 236,03 triệu tấn, giảm 28,71 triệu tấn so với sản lượng 264,74 triệu tấn do sản lượng giảm ở Brazil (-10,00 triệu tấn), ở Mỹ (-7,44 triệu tấn), ở Achentina (-8,00 triệu tấn), ở Trung Quốc (-1,60 triệu tấn), ở Ấn Độ (-1,2 triệu tấn) và ở Paragoay (-4,37 triệu tấn). Sản lượng đậu tương năm 2011/12 ước tính đạt (đơn vị: triệu tấn): Brazil 65,50; Mỹ 83,17; Achentina 41,00; Trung Quốc 13,50; ấn Độ 11,00; Paragoay 4,00; Canađa 4,25 và các nước khác 13,61.Tổng xuất khẩu đậu tương trên thế giới năm 2011/12 ước đạt 90,54 triệu tấn, giảm so với 92,64 triệu tấn của năm 2010/11. Trong đó, xuất khẩu của các nước ước tính đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 36,70; Mỹ 36,74; Achentina 7,80; Paragoay 3,10; Canađa 2,80 và các nước khác 3,40 [54]. Tổng sản lượng đậu tương thế giới năm 2012- 2013 dự báo đạt 260,46 triệu tấn, điều chỉnh giảm 6,70 triệu tấn (-2,51%) so với dự báo đưa ra hồi tháng 7/2012, song tăng 24,43 triệu tấn (+10,35%) so với sản lượng 236,03 triệu tấn của năm 2011- 2012, trong đó sản lượng của mỹ sẽ tiếp tục giảm 9,91 triệu tấn (- 11,91%). Sản lượng đậu tương năm 2012- 2013 của các nước dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 81,00; Mỹ 73,27; Achentina 55,00; Trung Quốc 12,60; ấn Độ 11,40; Paragoay 8,10; Canađa 4,50 và các nước khác 14,59. Tổng xuất khẩu đậu tương trên thế giới trong năm 2012- 2013 dự báo đạt 93,97 triệu tấn, tăng so với 90,54 triệu tấn của năm 2011- 2012. Xuất khẩu đậu tương của các nước trong năm 2012- 2013 dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 37,60; Mỹ 30,21; Achentina 13,50; Paragoay 5,40; Canađa 3,00 và các nước khác 4,26. (Oilseeds: World Markets and Trade, August 2012) NVT [54]. Theo dự báo của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng sản lượng đậu tương thế giới năm 2012/13 sẽ đạt 258,13 triệu tấn, điều chỉnh giảm 2,33 triệu tấn (-0,89%) so với dự báo hồi tháng 8/2012, song tăng 21,04 triệu tấn (+8,88%) so với 237,09 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
13 triệu tấn của năm 2011/12. Diện t ch đậu tương toàn cầu dự báo đạt 108,12 triệu ha, tăng so với 102,10 triệu ha của năm 2011/12; năng suất đậu tương dự báo sẽ đạt bình quân 2,39 tấn/ha, tăng so với 2,32 tấn/ha của năm 2011/12. Sản lượng đậu tương năm 2012/13 của các nước dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 81,00; Mỹ 71,69; Achentina 55,00; Trung Quốc 12,60; ấn Độ 11,40; Paragoay 8,10; Canađa 4,40 và các nước khác 13,94 [54]. Mặc dù có lịch sử phát triển lâu đời ở nước ta, nhưng trải qua một thời gian dài cây đậu tương vẫn chiếm một vị trí rất khiêm tốn trong nền sản xuất nông nghiệp nước ta. Năm 1976, diện t ch đậu tương chỉ đạt gần 40 ngàn ha, năng suất 5,2 tạ/ha, sản lượng 20,7 ngàn tấn. Năm 1995 có diện tích lớn nhất đạt 121,1 ngàn ha, năng suất 10,3 tạ/ha, sản lượng 125,5 ngàn tấn [65]. Trong những năm gần đây do điều kiện thời tiết không thuận lợi đã khiến sản lượng đậu tương nước ta giảm đáng kể cụ thể năm 2013 giảm 3% so với năm 2012, xuống còn 168 nghìn tấn. Mưa bão nặng nề và kéo dài suốt năm đã khiến năng suất cây trồng và diện t ch thu hoạch đậu tương (Bảng 1.1 và Hình 1.4). Quy mô sản xuất nhỏ lẻ so với các loại cây trồng khác ch nh là nguyên nhân khiến ngành đậu tương vẫn không đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước. Tổ chức USDA dự báo nếu điều kiện thời tiết thuận lợi, diện t ch gieo trồng đậu tương năm 2013 và 2014 lần lượt đạt 120 nghìn và 130 nghìn héc-ta, với mức sản lượng tăng nhẹ khoảng 176 và 192 nghìn tấn. Khả năng cạnh tranh của đậu tương so với ngô vẫn còn thấp do sản lượng t nh trên mỗi héc-ta trồng đậu tương thấp hơn so với trồng ngô. Khu vực trồng đậu tương ch nh tập trung ở vùng Đồng bằng sông Hồng, miền Bắc nước ta [65]. Theo USDA, sản lượng đậu tương trong những năm tới sẽ tăng và đạt được mục tiêu mà Ch nh phủ đã đề ra trong Quy hoạch Tổng thể cho ngành hạt có dầu là 350 nghìn héc-ta diện t ch trồng trọt và 700 nghìn tấn sản lượng vào năm 2020. Tuy nhiên, năng suất nhìn chung vẫn còn thấp và việc mở rộng diện t ch trồng trọt của ngành chưa cao, trong đó nguyên nhân ch nh là khả năng cạnh tranh của cây đậu tương. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
14 Bảng 1.1. n n ng ản lượng đậ ương 11-2015 [65] 2011 2012 2013 2014* 2015* Diện t ch (nghìn ha) 181,1 119,6 117,8 120 130 Năngsuất (tấn/ha) 1,47 1,45 1,43 1,47 1,48 Tổng sản lượng(nghìn tấn) 266,9 173,7 168,4 176,4 192,4 N uồ : Tổ ụ T ố ê V ệt N m (GSO), B N ệ v P tt N t ,* ố ệu USD Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu d báo 1.1. Diện t ch trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015) [65] 1.2. Bệ d SMV t ê c đậu tươ 1.2.1. Bệnh khảm trên cây đậu tương Soybean mosaic virus (SMV) là nhân tố biotic gây bệnh khảm ở cây đậu tương, xảy ra ở tất cả các vùng sản xuất đậu tương trên thế giới. Triệu chứng biểu hiện bệnh do SMV là khác nhau với từng vật chủ, chủng virus, tuổi cây nhiễm và môi trường. Giống nhiễm nặng nhất thì còi cọc yếu ớt đôi khi bị lùn, Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
15 không có lông, và không có hạt. Lá chét mọc lên có màu xanh đậm, nhạt sau đó có thể bị nổi rộp hoặc phồng lên, đặc biệt dọc theo gân chính lá. Lá chính của một số giống có thể thấy các vùng hoại tử tổn thương, tiếp theo là hiện tượng vàng lá và rụng lá. Các triệu chứng trên lá này gần giống các triệu chứng khi đậu tương bị ngộ độc thuốc diệt cỏ 2,4D. Hạt giống từ cây bị nhiễm bệnh có thể bị đốm nâu hoặc đen, tùy thuộc vào màu sắc rốn hạt. Hạt có thể nhỏ hơn và nảy mầm kém hơn so với hạt của cây không bị nhiễm. Những vết lốm đốm không thể hiện sự có mặt của virus cũng như không phải tất cả các hạt đều chứa virus và không phải tất cả các hạt từ cây nhiễm virus đều lốm đốm. Bệnh khảm đậu tương lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đã có mặt hầu hết ở các vùng trồng đậu tương trên thế giới [35]. Việt Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc Bộ, khu vực đồng bằng Sông Hồng và Tây Nguyên [2], [11]. SMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, thậm chí một số trường hợp tổn thất có thể lên đến 94% tổng sản lượng đậu tương. Những cây bị nhiễm SMV thường sinh trưởng chậm, hình thái lá, thân, quả bị biến dạng, khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn sẽ làm giảm sản lượng và chất lượng hạt [35], [36]. SMV là một hình que cong queo gồm chuỗi RNA đơn. Nhiều chủng virus đã được xác định dựa trên các phản ứng trên một tập hợp các giống khác nhau. Tại hoa kỳ, SMV được phân loại thành 9 chủng và các chủng hiện nay đã được biết từ G1 đến G7, G7a, và C14. Có thể có các chủng khác tồn tại, đặc biệt ở Trung Quốc và Nhật Bản [65]. SMV có thể lan truyền trong quần thể đậu tương nhờ rệp và hiện nay người ta biết đến t nhất có 32 loài rệp thuộc 15 chi khác nhau truyền SMV một cách không ổn định. Kết quả cây bị nhiễm bệnh do lan truyền qua hạt đóng một vai trò quan trọng trong nghiên cứu bệnh về SMV. Những cây như vậy là nguồn Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
16 truyền chính cho SMV. Trong hầu hết các giống đậu tương, sự lan truyền bệnh qua hạt ở một vài giống trong khi ở các giống khác có thể lên đến 75% [65] 1.2.2. Đặc điểm c a SMV SMV sinh ra ở thể vùi trong tế bào cây bệnh. Thể vùi có dạng hình múi khế hay hình chong chóng [11]. Thời gian tồn tại của virus trong cây bệnh là 2-5 ngày, nhiệt độ mất hoạt tính là 55-700C. Khi bị chiếu tia cực tím virus bị mất hoạt tính trong hai giờ. Nhiệt độ thích hợp để virus nhân lên trong tế bào cây bệnh là 21-260C. SMV có thể tồn tại và lan truyền qua hạt giống. Trong hạt giống virus có thể tồn tại được hai năm. Ngoài ra, virus có thể lan truyền trong quần thể đậu tương qua loài rệp Aphis. SMV có phạm vi ký chủ rộng và gây hại trên 30 loài cây trồng đặc biệt là những cây họ đậu. Bệnh phát triển mạnh trên những cây đậu tương trồng vào vụ đông vào giai đoạn cây ra hoa và hình thành quả. Bệnh gây hại nặng ở những ruộng đậu tương chăm sóc kém, bón nhiều đạm hoặc bón phân không cân đối. Khi bị bệnh lá đậu tương thường có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá nhăn nheo, mép lá cong xuống, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại, phát triển chậm. Lá non ở ngọn khảm lá mạnh và biến dạng. Số lượng nốt sần trên cây bệnh thường giảm so với cây khoẻ nên vai trò cố định đạm giảm, rễ cây bệnh thường bị thối đen. Ở những giống mẫn cảm cây có thể chết. Bệnh gây hại trên quả làm quả thường lép, vỏ mầu nâu, nhăn nheo biến dạng, sần sùi và có vị đắng. Cây bị nhiễm bệnh thể hiện triệu chứng rõ nhất ở nhiệt độ 10-200 còn dưới 150C và trên 300C cây thường mất triệu chứng [11], [49], [58]. SMV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae gây bệnh khảm lá đậu tương, được phát hiện lần đầu tiên bởi Clinton (1915), Gardener và Kendrick (1921) tại Hoa Kỳ. Chúng có dạng hình sợi mềm với chiều dài khoảng 750nm, đường kính khoảng 11-15nm [48]. Hệ gen của SMV là RNA dạng sợi đơn dương, phân tử lượng 3,25 x 106 kDa, tổng k ch thước bộ gen khoảng 10,4 Kb. Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polypeptid: P1 Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
17 proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-pro), Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6 kDa protein 2 (6K2), Protein liên kết hệ gen virus (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Capsid protein (CP). Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa cho 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polipeptid và được mô phỏng theo sơ đồ ở hình 1.2. Hình 1.2. Cấu trúc hệ gen của SMV [48] HC-Pro: là thành phần trợ giúp và protease; CI: là protein hình trụ; NIb là RNA polymerase phụ thu c RNA; P1, P3, và NIa là protease; CP: là protein vỏ c a virus; VPg: là protein liên kết Hạt SMV được tạo thành từ khoảng 2000 tiểu đơn vị tạo nên lớp vỏ protein (coat protein) sắp xếp theo kiểu xoắn ốc xung quanh hệ gen RNA virus [16]. Gen CP ở SMV có k ch thước 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm 804 nucleotide mã hóa 267 amino acid, và từ amino acid thứ 33 đến 264 trong CP được gọi là vùng Poty- coat [37]. Trong nghiên cứu của Lò Thị Mai Thu (2014), trình tự đoạn gen CP phân lập từ SMV dòng SL1 và SL2 có k ch thước 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid và vùng Poty- coat của protein có 208 amino acid [16]. 1.3. ng ng ậ RNAi ong o đậ ương ng n ng 1.3.1. Cơ chế ức chế gen c a RNAi Năm 1998, hai nhà khoa học Mỹ là Andrew Fire và Craig Mello đã công bố phát hiện của họ về một cơ chế có thể làm suy biến RNA thông tin (mRNA) được sao mã từ một gen xác định và họ gọi đó là “RNA can thiệp”. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
18 Cơ chế này được kích hoạt khi các phân tử RNA kép (dsRNA) xuất hiện trong tế bào. Khi đó chuỗi dsRNA kích hoạt “cỗ máy” sinh hoá, làm suy biến các phân tử mRNA được sao mã di truyền từ ADN không biểu hiện được chức năng giải mã, cho ra chuỗi protein tương ứng. Đặc biệt, can thiệp RNA với chuỗi dsRNA ngắn trực tiếp có thể thực hiện trong các tế bào động vật có vú mà không gây nên các hiệu ứng không đặc hiệu. Từ đó, các ứng dụng của công nghệ RNAi có thể được sử dụng để xác định và đánh giá chức năng của hàng ngàn gene trong hệ gen có tiềm năng tham gia vào các kiểu hình của bệnh. Mặt khác, công nghệ RNAi sẽ cung cấp một phương tiện hiệu quả để ngăn chặn biểu hiện của một gen cụ thể có liên quan đến bệnh tật [25]. Hình 1.3 mô tả cơ chế RNAi phân hủy RNA. Các phần tử quan trọng tham dự vào cơ chế can thiệp RNA này là hai enzymes, Dicer và Argonaute, và những RNA k ch thước nhỏ (si RNA) được tạo ra từ RNA sợi đôi (ds RNA). Khi có sự xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA vào tế bào, Dicer lập tức cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotides, gọi là siRNA có tiêu hao một phân tử ATP. Sau khi bị cắt ngắn bởi Dicer, chuỗi kép RNA can thiệp được tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục liên kết với Argonaute. Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA này xảy ra trong phức hệ RISC (RNA-induced silencing complex), trong đó có chứa Argounaute và Helicase. Phức hệ RISC sau đó thu nhận các phân tử phiên mã mRNA của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA lúc này đang có mặt trong phức hệ RISC. Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base tương đồng với trình tự của siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA. Phức hệ RISC sẽ cắt mRNA, làm phân tách phân tử mRNA mà không giải mã nên không có protein nào được tổng hợp hay nói cách khác làm cho RNA bị suy thoái [63]. Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
19 1.3. Cơ chế RNAi phân hủy RNA [55]. RNAi đóng vai trò rất quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhiễm của các virus vào cơ thể vật chủ, đặc biệt là các sinh vật bậc thấp. Bên cạnh đó RNAi còn đưa ra nhiều ứng dụng thú vị trong kỹ thuật gen tạo ra những cơ hội mới trong nghiên cứu sinh học y dược, kỹ thuật gen và chăm sóc sức khỏe. Khám phá ra RNAi không chỉ cung cấp cho chúng ta một công cụ thí nghiệm mạnh mẽ mới để nghiên cứu chức năng của các gene mà còn có nhiều tiềm năng trong những ứng dụng tương lai của can thiệp RNA trong y học, sinh học... Dựa vào hoạt động của cơ chế RNAi, có thể tiến hành thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng ức chế hoạt động của gen ngoại lai, nhằm tạo giống cây chuyển gen kháng bệnh virus hữu hiệu. 1.3.2. Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens được ứng dụng rộng rãi để chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng do nhiều đặc t nh ưu việt của hệ thống chuyển gen này. A.tumefaciens là loài vi khuẩn đất, gram (-), gây bệnh ung thư ở thực vật, chủ yếu lấy nhiễm thực vật qua các vết thương [11]. Có thể Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
20 truyền bệnh từ loài này sang loài khác. Thực vật bị thương sẽ ứa ra một hợp chất amino acid, trong đó đường và acid vô cơ là những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động. A.tumefaciens có khả năng chuyển một đoạn DNA từ Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) vào tế bào thực vật. Ti plasmid - một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử bằng 3-5% so với trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Ti plasmid có k ch thước khoảng 200 kb, trong tế bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập gồm 4 vùng tương đồng: A, B, C và D. Ti plasmid không được dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen do một số nhược điểm: có k ch thước lớn, mang các gen gây khối u, không thể tự nhân lên… Vì vậy, các nhà khoa học đã cải tiến Ti plasmid, cắt bỏ hầu hết các gen không cần thiết và thay vào đó là các gen chỉ thị cho chọn lọc, gen đánh dấu và các promoter thích hợp để Ti plasmid có thể nhân lên và biểu hiện trong E.coli, A.tumefaciens và tế bào thực vật. Các vector được sử dụng có hiệu quả trong chuyển gen thông qua A.tumefaciens là: vector liên hợp và vector nhị thể. Vector (cointegrate) liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau: i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli; ii) Gen chỉ thị có t nh kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1], [12] . Hệ vector nhị thể (binary vector) đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA. Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn