Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất polysaccharide từ hạt cây me (Tamarindus indica L.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:93

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài luận văn: “Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L.)” được nghiên cứu nhằm đánh giá đầy đủ tác dụng cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất TSP tiềm năng trên mô hình in vitro.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất polysaccharide từ hạt cây me (Tamarindus indica L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Văn Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT CÂY ME (Tamarindus indica L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Văn Ngọc NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT ME (Tamarindus indica L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Mai Phương Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Hồng Minh Hà Nội - 2021
1 MỞ ĐẦU Loãng xương đang là căn bệnh phổ biến toàn cầu. Loãng xương làm tăng tính dòn của xương dẫn đến dễ bị gãy, vì thế ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, cuộc sống của mỗi cá nhân và cả cộng đồng xã hội. Tổ chức y tế thế giới đang rất quan tâm và mong muốn cải thiện được tình trạng này, nhằm nâng cao sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của con người. Tỷ lệ người bị loãng xương đang ngày một tăng lên ở cả các nước phát triển và đang phát triển, đặc biệt là với những người có tuổi. Các số liệu thống kê cho thấy khoảng trên 200 triệu người trên toàn thế giới bị bệnh này và khoảng 2,8 triệu người Việt Nam đang mắc phải bệnh loãng xương. Loãng xương xảy ra do sự mất cân bằng giữa sự mất xương và sự hình thành xương, trong đó sự hình thành xương xảy ra chậm hơn sự mất xương. Vì vậy, các nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các chất có hoạt tính làm tăng sự hình thành xương hoặc làm giảm sự mất xương để điều trị loãng xương đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm. Phần lớn các thuốc trên thị trường là các tác nhân làm giảm sự mất xương. Trong khi đó, chỉ có rất ít chất có khả năng cảm ứng làm tăng sự tạo xương. Thêm vào đó, việc sử dụng các thuốc hóa học hiện nay để xử lý loãng xương có một số hạn chế về hiệu quả cũng như gây phản ứng phụ khi sử dụng lâu dài. Do đó, việc phát hiện và sử dụng những chất tự nhiên có khả năng cảm ứng tái tạo xương mới, ít gây phản ứng phụ để xử lý bệnh loãng xương và duy trì độ bền của xương là hướng nghiên cứu mới, có nhiều tiềm năng ứng dụng để điều trị bệnh loãng xương cũng như các bệnh liên quan khác. Theo thống kê của Viện Dược liệu thì nước ta có khoảng 4000 loài thực vật được dùng làm thuốc ở các mức độ khác nhau. Các số liệu trên đây cho thấy tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam rất phong phú, có thể sử dụng như nguồn nguyên liệu tiềm năng trong các nghiên cứu sàng lọc nhằm tìm ra những hợp chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có các chất có tác dụng cảm ứng tái tạo xương mới và hiệu quả.
2 Cây me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhưng được phân bố rộng rãi trên toàn thế giới ở trên 50 quốc gia và cũng được trồng phổ biến ở Việt Nam. Polysaccharide từ hạt me (TSP) có nhiều hoạt tính sinh học quý và được ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. TSP có khả năng chống oxy hóa, hạ cholesterol, giảm khả năng xơ vữa thành mạch máu. TSP cũng có thể sử dụng như là một chất làm đặc và ổn định, làm tác nhân gel hóa, làm chất làm ổn định nước đá tinh thể và thay thế tinh bột vì nó có tính chất tương tự như tinh bột nhưng ổn định hơn. TSP đã được thử nghiệm có hiệu quả trong điều trị bệnh về tiêu hóa và được sử dụng làm chất mang thuốc chữa bệnh đại tràng. Liên quan đến hướng nghiên cứu về tác dụng lên bảo vệ xương, các hợp chất tách chiết từ hạt me cũng đã được chứng minh là có tác dụng tích cực đối với một số bệnh xương khớp. Ngoài ra, các hợp chất polysaccharide tự nhiên từ quả me cũng đang được nghiên cứu theo hướng tạo vật liệu sinh học scaffold ứng dụng trong y dược. Mặc dù các công trình công bố đã chứng tỏ TSP và các dẫn xuất của nó có nhiều hoạt tính sinh học quý, có khả năng ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưng các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của TSP và các dẫn xuất của nó đối với quá trình biệt hóa tế bào tạo xương vẫn còn thiếu vắng. Cho đến nay, chưa có công trình nào nghiên cứu một cách toàn diện và đầy đủ ảnh hưởng của TSP và các dẫn xuất của nó, đặc biệt là dẫn suất sulphate, đến quá trình tái tạo xương (TTX). Xuất phát từ những tồn tại chung, xu hướng nghiên cứu hiện nay, cũng như để góp phần khai thác nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú của nước ta, chúng tôi thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L.)” nhằm đánh giá đầy đủ tác dụng cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất TSP tiềm năng trên mô hình in vitro.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÃNG XƯƠNG 1.1.1. Lịch sử, định nghĩa, và phân loại loãng xương 1.1.1.1. Lịch sử bệnh loãng xương Loãng xương được xác định xuất hiện từ thời Ai Cập cổ đại năm 990 – TCN khi tìm thấy các xác ướp có bướu ở người hạ cấp. Thế kỷ 18, bác sĩ phẫu thuật người Anh John Hunter đã phát hiện ra rằng khi xương mới được đặt trong cơ thể, xương cũ sẽ bị phân hủy hoặc được tái hấp thụ. Quá trình phân hủy hay tái hấp thu này được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong bệnh loãng xương. Năm 1830, nhà nghiên cứu bệnh học người Pháp Jean Lobstein nhận thấy rằng xương của một số bệnh nhân bị thủng lỗ lớn hơn thông thường và ông đã đặt ra thuật ngữ loãng xương (xương xốp) để mô tả sự thay đổi của xương người. Bình thường Loãng xương Hình 1.1. Cấu trúc mô xương người bình thường so với người loãng xương [1]
4 Mặc dù có lịch sử lâu đời nhưng định nghĩa bệnh loãng xương mới chỉ được Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO) chính thức đưa ra vào năm 1991 tại Thụy Sĩ và tiếp tục hoàn thiện cập nhật vào năm 2001[1]. Loãng xương được định nghĩa là một tình trạng rối loạn chuyển hóa của bộ xương làm giảm sức mạnh của xương dẫn đến làm tăng nguy cơ gãy xương. Sức mạnh của xương được phản ánh thông qua hai yếu tố: khối lượng xương và chất lượng xương [2]. Đo mật độ xương sẽ cho ta biết lượng chất khoáng trong 1 đơn vị diện tích hoặc thể tích của xương. Còn chất lượng xương được đánh giá bởi các thông số: cấu trúc của xương, tốc độ chuyển hóa của xương, độ khoáng hóa, mức độ tổn thương tích lũy, tính chất của các chất cơ bản của xương. 1.1.1.2. Phân loại bệnh loãng xương Dựa vào các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển hóa xương, loãng xương có thể được phân thành hai nhóm chính là loãng xương nguyên phát (type 1 và type 2) do tuổi tác hoặc tình trạng mãn kinh và loãng xương thứ phát do một số bệnh mạn tính hoặc liên quan đến sử dụng một số loại thuốc… 1.1.2. Cơ chế và các phương pháp điều trị bệnh loãng xương 1.1.2.1. Cơ chế Loãng xương xuất phát từ sự mất cân đối giữa hai hoạt động tạo xương và hủy xương mà cụ thể là lượng xương bị đào thải nhiều hơn lượng xương mới thay. Ở cấp độ phân tử, mô xương được cấu thành từ tế bào tạo xương (osteoblast), tế bào hủy xương (osteoclast) và nhóm một số tế bào khác. Những tế bào này tương tác với một số chất khoáng, protein, hormone và các phân tử khác để nuôi dưỡng xương, liên tục đục bỏ xương cũ thay bằng xương mới. Tế bào tạo xương (osteoblast) có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell – MSC) có tác động thay đổi đến cấu trúc xương, tạo những lớp xương góp phần tạo lực của xương. Những tế bào này khi đặt trong điều kiện thích hợp có thể chuyển hóa thành tế bào xương nhưng trong
5 điều kiện khác chúng cũng có thể trở thành tế bào cơ, mỡ hoặc sụn. Tế bào hủy xương (osteoclast) là những tế bào xuất phát từ tế bào tạo máu có chức năng đục bỏ xương cũ hay xương bị tổn hại qua một quá trình phân hủy chất khoáng. Trong điều kiện bình thương, chức năng của tế bào hủy xương và tế bào tạo xương hoạt động mức độ tương đương nhau và tín hiệu của loại tế bào này ảnh hưởng đến loại tế bào kia. Trong cơ thể con người, mô xương được cấu thành từ trong bụng mẹ và được làm mới duy trì sự phát triển qua hai quá trình là modelling và remodelling. Hai quá trình này xảy ra với những cơ chế riêng biệt để biệt hóa các nhóm tế bào xương, giúp đạt được sự tạo thành xương hoặc làm mới xương. Hai quá trình này, phối hợp nhau trong quá trình phát triển xương để định dạng xương thích hợp, duy trì nồng độ huyết thanh của các ion và sửa chữa các vùng cấu trúc xương bị tổn thương. Hình 1.2. Quá trình remodel [3]
6 Quá trình remodel là quá trình chu chuyển xương từ lúc còn nhỏ đến trước khi trưởng thành (18-20 tuổi). Chức năng của quá trình là hoàn chỉnh khối xương làm cho xương thay đổi kích thước hình dạng và tăng trưởng. Trong quá trình này, hai hoạt động tạo và hủy xương xảy ra một cách độc lập tại một vị trí, hoạt động tạo xương diễn ra mạnh hơn hủy xương. Quá trình remodel là quá trình diễn ra liên tục, suốt đời, nhưng tốc độ xảy ra giảm dần theo tuổi tác. Chức năng của quá trình là duy trì mật độ xương, phân hủy những mảng xương cũ hay xương bị tổn hại và thay thế bằng những mảng xương mới. Remodel là quá trình rất cần thiết để duy trì lực của xương. Quá trình này luôn xảy ra theo trình tự gồm: hoạt hóa (activation), hủy xương (resorption), trung gian (reversal), hình thành xương (bone formation) và khoáng hóa (mineralization). Quá trình remodel được bắt đầu khi các tế bào hủy xương (osteoclast) được biệt hóa và hoạt động để loại bỏ xương già, xương hỏng bằng cách hấp thu các chất khoáng để lại những lỗ hổng trên bề mặt xương. Tế bào đơn nhân (monocuclear cells) thu dọn các mảnh vụn được thải ra trong hoạt động hủy xương và chuẩn bị bề mặt đã được phục hồi trước khi tế bào tạo xương (osteoblast) sửa chữa xương bị tổn hại. Tiếp theo, tế bào tạo xương tổng hợp các thành phần hữu cơ và vô cơ của xương, thay thế phần xương đã bị hấp thụ thông qua quá trình biệt hóa tế bào tạo xương (osteoblast differentiation). Sự khoáng hóa xương (mineralization) và sự biệt hóa của một số tế bào tạo xương thành tế bào xương (osteocytes) là giai đoạn cuối để hoàn thành quá trình tái mô hình [4]. Trong quá trình remodel, hai hoạt động tạo và hủy xương diễn ra trên bề mặt xương với tốc độ 2-10% xương hằng năm. Trước khi bước vào giai đoạn trưởng thành hoạt động tạo xương diễn ra tương đương hoạt động hủy xương, do đó mật độ xương đạt mức độ cao ở độ tuổi 20-30. Sau khi đạt mức tối đa, xương bắt đầu suy giảm với tốc độ khác nhau theo độ tuổi. Sau thời kỳ mãn kinh vài năm ở nữ và sau 50 tuổi ở nam, hoạt động hủy xương lấn át hoạt động tạo xương, tỷ lệ hủy xương và tạo xương mất cân bằng mà cụ thể là sự hình thành xương ít hơn sự hấp thụ xương, sẽ gây mất cân bằng nội mô xương
7 và dẫn đến tình trạng cơ thể bắt đầu mất xương, mật độ xương, trọng lượng và độ cứng của xương giảm dẫn đến tình trạng loãng xương. Trong quá trình remodel, một số protein và các nhân tố như osterix (OSX), COX2 và Runx2 tham gia vào quá trình làm tăng sự biểu hiện của alkaline phosphatase (ALP), osteopontin (OPN) và osteocalcin (OSC). Đây là những nhân tố quyết định sự tạo ra tế bào xương trưởng thành (mature osteoblast) (Hình 1.3). Tế bào gốc trung mô từ tủy xương (MSC) đến thời điểm này đã được chứng minh là dòng tế bào gốc đa năng, với khả năng biệt hóa giới hạn trong các dòng tế bào thuộc lớp trung mô như tế bào xương, sụn, và mỡ. Tuy nhiên, một số thí nghiệm khác cũng cho thấy rằng dòng tế bào gốc này cũng có khả năng biệt hóa thành tế bào gan, tế bào tim, tế bào thần kinh nhưng quá trình biệt hóa rất nhiều giai đoạn và có tỉ lệ thành công thấp. Hình 1.3. Sơ đồ quá trình phát triển biệt hóa tế bào gốc (MSC) thành tế bào tạo xương [5]
8 Quá trình biệt hóa tế bào xương trưởng thành từ tế bào gốc MSC trải qua 4 giai đoạn được chỉ ra trong hình 1.3. Bắt đầu của quá trình là từ tế bào gốc ở tủy – MSC (1), trải qua giai đoạn tăng sinh - proliferation (2) để trở thành tiền tế bào xương – pre-osteoblast (3) và qua giai đoạn khoáng hóa (mineralization) để trở thành tế bào xương trưởng thành – mature osteoblast (4) [2]. 1.1.2.2. Các phương pháp điều trị loãng xương Kiểm soát loãng xương có thể không dùng thuốc bao gồm việc cung cấp đủ canxi và vitamin D, tập thể dục tăng cân, cai thuốc lá, hạn chế uống rượu / caffein và các kỹ thuật phòng ngừa bị ngã. Trong trường hợp phải điều trị loãng xương dùng thuốc thì định hướng hiên nay tập trung vào hai hướng là:  Ức chế sự hấp thụ xương bởi tế bào hủy xương (osteoclast)  Làm gia tăng các nhân tố tái tạo xương (TTX) thông qua biệt hóa các tế bào tạo xương (osteoblast differntiation). Hiệu quả điều trị của thuốc phụ thuộc vào tuổi tác, giới tính và sức khỏe của bệnh nhân. Các chất ức chế đang được sử dụng là bisphosphonates, chất chủ vận/ đối kháng estrogen [EAAs], estrogen, calcitonin và denosumab). Bisphosphonates vẫn là lựa chọn điều trị hàng đầu và tiết kiệm chi phí nhất cho bệnh loãng xương, nhưng ngày càng có nhiều lo ngại về tính an toàn lâu dài của chúng. Tuy nhiên, không phải tất cả các loại thuốc điều trị loãng xương đều được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) chấp thuận để điều trị loãng xương. Thuốc điều trị đầu tay cho hầu hết bệnh nhân có nguy cơ gãy xương cao bao gồm alendronate, risedronate, zoledronic acid và denosumab. Đối với những người không thể sử dụng liệu pháp uống và có nguy cơ gãy xương cao, nên sử dụng teriparatide, denosumab hoặc axit zoledronic. Đối với nam giới bị loãng xương, điều trị đầu tay là dung thuốc bisphosphonates [6].
9 Hầu hết những liệu pháp điều trị loãng xương hiện nay tập trung vào giải pháp làm giảm sự mất xương nhưng không khôi phục lại được khối lượng xương đã bị mất và độ cứng của xương, liệu pháp làm gia tăng TTX còn ít được đề cập đến [6]. Vì vậy, hướng nghiên cứu và ứng dụng những nhân tố (factor) kích thích TTX để phục hồi một phần khối lượng xương đã bị mất, sửa chữa sự mất cân bằng các đặc điểm vi cấu trúc xương xốp do loãng xương nhờ đó làm tăng độ cứng của xương và kết hợp giữa các nhân tố kìm hãm sự mất xương với kích thích TTX đang là hướng nghiên cứu mới và đầy triển vọng cho điều trị loãng xương. Sử dụng các chất có khả năng cảm ứng TTX, người ta có thể tạo vật liệu sinh học mới ở dạng “giá đỡ” ba chiều (3D scaffold) có khả năng điều trị bệnh [6]. Vật liệu này là một khuôn ngoại bào nhân tạo với nhiều lỗ xốp và có khả năng phân hủy sinh học, bao gồm các tế bào nuôi cấy, các phân tử tín hiệu (các nhân tố tăng trưởng hay chất TTX) và khuôn 3D. Các tế bào và phân tử tín hiệu sẽ được cấy vào khuôn 3D scaffold và sau đó được đưa vào vùng xương cần ghép để cảm ứng sự tăng trưởng và sản sinh xương mới. Sau khi scaffold được đưa vào cơ thể, tế bào sẽ bám dính, phân chia, biệt hóa, di chuyển vào các lỗ scaffold, đồng thời tiết ra các thành phần nền ngoại bào cần thiết để tạo mô và tổ chức hình thành mô khỏe mạnh bình thường [7]. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu loãng xương trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trong các nghiên cứu đã được công bố, hợp chất berberine được nghiên cứu khá nhiều và đã được chứng minh là có thể làm giảm loãng xương bằng cách ức chế hoạt tính của tế bào hấp thụ xương osteoclast và kích thích biệt hóa tế bào tạo xương osteoblast. Li và cs., [8] đã chứng minh rằng berberine làm ngăn chặn sự suy giảm mật độ khoáng hóa xương in vivo và in vitro bằng cách ức chế sự hấp thụ xương bởi tế bào hấp thụ xương osteoclast. Ngoài ra, berberine còn cảm ứng sự chết tế bào hấp thụ xương osteoclast theo con đường apoptosis. Nhóm nghiên cứu sau đó cũng đã chứng minh rằng berberine có thể ngăn chặn sự mất xương ở những người bị loãng xương do
10 sự già hóa [9]. Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của berberine đến quá trình biệt hóa tế bào tạo xương (osteoblast differentiation), Lee và cs., [10] đã cho thấy berberine làm tăng sự hình thành xương (bone formation) thông qua việc hoạt hóa nhân tố phiên mã chính trong quá trình tạo xương (Runx2) bởi protein p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), từ đó chứng minh berberine có thể là nhân tố tiềm năng để điều trị các rối loạn liên quan đến bao gồm loãng xương, xương. Nghiên cứu của Han và cs., [11] đã chỉ ra hợp chất dẫn xuất của berberine (berberine bioisostere Q8) có thể cảm ứng biệt hóa tế bào tạo xương in vitro. Trong một nghiên cứu khác với hợp chất từ quả me, Sundaram và cs., [12] đã chứng tỏ hiệu quả chống viêm khớp của dịch chiết hạt me (tamarind seed extract- TSE). TSE đóng vai trò là một nhân tố ức chế sự thoái hóa sụn, phân hủy xương và kháng viêm. Nghiên cứu của Sanyasi và cs., [13] đã mô tả và xác định một hydrogel mới đóng vai trò là một vật liệu cho kỹ nghệ mô xương (bone tissue engineering), trong đó carboxyl methyl tamarind polysaccharide là một polymer bán tổng hợp từ quả me. Nhóm tác giả chứng minh rằng vật liệu này là thích hợp cho sự bám dính, sự sinh trưởng một cách hiệu quả các tế bào tiền tạo xương (bone precursor cells). Gần đây, nhóm nghiên cứu này đã tìm ra một vật liệu mới được tổng hợp từ polysaccharide tự nhiên có nguồn gốc từ bột quả me được gắn với acrylic acid (AA) là TKP – AA có tiềm năng sử dụng như là vật liệu sinh học scaffold và cho kỹ nghệ mô xương với giá thành thấp. Lĩnh vực thiết kế chế tạo vật liệu sinh học scaffold sử dụng kỹ thuật in 3D (3D printing) đã được sử dụng nhiều trên thế giới. Kỹ thuật in 3D đã được sử dụng rộng rãi cho việc chế tạo "giá đỡ" ứng dụng trong y học và tái tạo mô hay kỹ nghệ mô tế bào (TE). TE là một công nghệ đầy triển vọng cho việc gia tăng tái tạo và sửa chữa những sai sót của mô bởi sự tương tác giữa tế bào, “giá đỡ” (scaffold) và tương thích những nhân tố tăng trưởng trên bề mặt “giá đỡ”. Những đặc điểm này giúp cho vật liệu nhân tạo tương tự như mô tự nhiên. Do đó, tế bào dễ dàng bám dính và tăng sinh trên vật liệu 3D.
11 Nguyên lý chung cho việc chế tạo vật liệu 3D scaffold để điều trị bệnh về xương là tạo vật liệu giá đỡ 3D (chất nền) mang các yếu tố bổ sung để giúp cho tế bào xương có thể phát triển và biệt hóa. Sau đó, chất tự nhiên có hoạt tính cảm ứng TTX được gắn trên chất nền sẽ cảm ứng tế bào xương, kích thích quá trình biệt hóa tế bào, hình thành xương mới. Tuy nhiên, nhiều vật liệu giá đỡ 3D không có khả năng tự hủy trong cơ thể sau khi đã hình thành tế bào xương mới do đó bệnh nhân cần phải thực hiện lại phẫu thuật nhằm đem vật liệu đó ra khỏi cơ thể. Các nghiên cứu theo hướng này đang được tiến hành mạnh mẽ nhằm khắc phục nhược điểm này bằng cách sử dụng chất nền sinh học và hướng tới ứng dụng điều trị Hàng loạt các nghiên cứu trên các đối tượng thực vật khác nhau đã cho thấy triển vọng của việc phát hiện các chất tự nhiên có hoạt tính TTX từ thực vật [14,15,16]. Tuy nhiên, các nghiên cứu theo hướng này còn chưa nhiều và còn thiếu vắng các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng ở mức phân tử cũng như những đánh giá đầy đủ trên mô hình in vivo nhằm mục đích ứng dụng trong điều trị hay tạo vật liệu cho TE. 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật rất phong phú, chứa đựng kho tàng vô giá các hoạt chất có hoạt tính sinh học và dược lý. Rất nhiều loài thực vật được sử dụng như là nguồn dược liệu quí trong nhân dân để chữa trị bệnh với tính an toàn và hiệu quả cao, trong đó có những loại cây được sử dụng lâu đời để điều trị các bệnh về xương khớp như Mimosa pudica L., Solanum procumbens, Piper lolot. Đây chính là nguồn nguyên liệu phong phú và tiềm năng để cung cấp các chất có hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu tìm ra các hoạt chất mới có hoạt tính cảm ứng TTX tiềm năng, có thể ứng dụng và ít tác dụng phụ cho điều trị loãng xương và các bệnh xương khớp đang là vấn đề còn mới mẻ và cũng nhận được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Hướng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có khả năng ứng dụng trong điều trị loãng xương mới chỉ được thực hiện trên mô hình in vivo. Trong khi đó, các nghiên cứu trên mô hình in vitro còn rất hạn chế. Nhóm nghiên cứu của trường Đại học Tôn Đức Thắng đã tiến hành
12 khảo sát tác dụng của cao xương cá sấu hoa cà trên mô học xương đùi chuột nhắt trắng bị gây loãng xương cảm ứng bởi prednison (corticoid). Chuột thí nghiệm bị loãng xương sau đó được điều trị bằng alendronat (5 mg/kg) hay cao xương cá sấu hoa cà ở cả hai liều uống 1.89 g/kg và 3.77 g/kg trong 4 tuần. Kết quả cho thấy, việc sử dụng cao xương cá sấu hoa cà có tác dụng làm giảm thiểu các khuyết hỏng do prednison gây ra trong cấu trúc xương, làm tăng sự hiện diện của các tế bào xương (cốt bào, hay osteocyte cells) ở khu vực bị loãng xương, phục hồi lại sự hiện diện của các nguyên bào xương (tế bào tạo xương, hay osteoblast cells) tại những vị trí mà xương bị thiếu hụt. Điều này chứng tỏ quá trình khôi phục xương đang diễn ra để lặp lại sự cần bằng trong quá trình tái cấu trúc xương [16]. Tuy nhiên, nghiên cứu này chưa đi sâu tìm hiểu cơ chế và đường hướng phân tử của cao xương cá sấu hoa cà đối với sự TTX. Có thể thấy, phần lớn các nghiên cứu hiện nay sử dụng mô hình gây loãng xương in vivo trên chuột do phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở Việt Nam so với các mô hình in vivo trên các động vật khác trên thế giới. Tuy nhiên, việc sử dụng mô hình in vivo trên chuột cũng còn nhiều hạn chế trong các nghiên cứu sàng lọc cũng như nghiên cứu cơ chế phân tử. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Tô Thanh Thúy, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội lại tập trung theo hướng phát triển, chuyển hóa xương trên mô hình cá medaka và zebrafish và sàng lọc các thuốc và hợp chất tự nhiên có tác dụng đến chuyển hóa xương và chống loãng xương [17,18]. Nhóm nghiên cứu sử dụng mô hình cá chuyển gen rankl:HSE:CFP mang cấu trúc gen chuyển bao gồm một promoter cảm ứng nhiệt điều khiển hai chiều đồng thời gen rankl (receptor activator of niclear factor kappa-β ligand) và gen mã hóa cho protein chỉ thị huỳnh quang CFP (complement factor properdin) để sàng lọc các hoạt chất chống loãng xương. Ấu trùng cá này khi bị sốc nhiệt sẽ biểu hiện Rankl ngoại sinh làm tế bào hấp thụ xương hình thành và hoạt động, gây ra sự phá hủy mô xương đang được khoáng hóa tạo ra kiểu hình giống loãng xương ở giai đoạn phát triển rất sớm. Trong một nghiên cứu gần đây, ấu trùng cá medaka chuyển gen mô phỏng bệnh loãng xương được điều trị bằng hai loại thuốc là etidronate và alendronate (hai loại biphosphonates thông dụng để điều trị bệnh loãng xương trên người). Sử dụng
13 các kỹ thuật hình ảnh, các kết quả cho thấy tác dụng ức chế hoạt tính của tế bào hấp thụ xương một cách có hiệu quả và phụ thuộc nồng độ, làm duy trì và phục hồi độ toàn vẹn xương. Nhóm tác giả đã kết luận mô hình cá medaka là phù hợp để nghiên cứu sàng lọc thuốc chống loãng xương in vivo [18]. Tuy vậy, cơ chế phân tử của thuốc cần sàng lọc (chất cần nghiên cứu) đối với bệnh loãng xương vẫn chưa được thực hiện trên mô hình cá này. Như vậy, có thể thấy rằng các nghiên cứu trong nước đối với các chất có khả năng TTX, đặc biệt là trên các chất tự nhiên còn rất hạn chế và chưa được đầu tư nghiên cứu chuyên sâu. Với tamarind seed polysaccharide (TSP) và dẫn suất dạng sulfate của nó (TSPS), nhóm nghiên cứu của Bùi Ngọc Tân và cs., [19, 20] đã nghiên cứu chiết tách và bước đầu xác định thành phần hóa học của TSP từ quả me. Sau đó, nhóm nghiên cứu này cũng đã tổng hợp dẫn suất TSPS và đánh giá một số hoạt tính sinh học của dẫn suất thu được. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu về các hoạt tính sinh học, đặc biệt là hoạt tính cảm ứng TTX của các dẫn suất sulfate này vẫn chưa được thực hiện. 1.2 TỔNG QUAN VỀ POLYSACCHARIDE TỪ QUẢ ME 1.2.1 Giới thiệu về cây me Cây me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhưng được phân bố rộng rãi trên toàn thế giới ở trên 50 quốc gia và cũng được trồng phổ biến ở Việt Nam. Cây me được sử dụng như một loại thảo dược tại nhiều quốc gia trên thế giới như Ấn Độ và Châu Phi [21].
14 Hình 1.4. Cây me (Tamarindus indica L.) Các bộ phận của cây me được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau trong lĩnh vực thực phẩm hay dược phẩm. Cây me cao 15 đến 30 m, tán cây rộng, nhiều lá. Lá cây me có dạng kép lông chim chẵn, dài từ 8 cm đến 10 cm, gồm 10 đến 20 đôi lá chét thuôn không cân xứng, chóp lõm, dài 20 mm, rộng 2mm. Hoa trắng nhạt có những vệt đỏ hay trắng, mọc thành chùm đơn ở kẽ lá hay thành chùy tận cùng. Quả dài mọc thõng xuống, hơi dẹt, dài 7-12 cm, rộng 25 mm, dày 10 mm. Vỏ quả ngoài mỏng, cứng, giòn, màu hung đỏ, vỏ quả giữa có xơ, vị chua, sau khi loại hết xơ, thịt thì phần hạt ở giữa có màu nâu nhạt hay vàng nhạt. Quả chứa 3-5 hạt dẹt, nhẵn màu nâu đỏ, bóng. Mùa quả vào tháng 10-11. Các bộ phận của cây me như quả, hạt, lá, hoa và vỏ cây me đều được sử dụng với mục đích hóa học thực vật và dược phẩm. Lá và hoa me có thể được sử dụng như một loại rau trong bữa ăn truyền thống của nhiều dân tộc. Đặc biệt, quả me và hạt me đã được nhiều tác giả nghiên cứu về thành phần và tác dụng trong hóa học thực vật và dược phẩm. Trong quả me có chứa chủ yếu hơn 10% acid hữu cơ (9,4% acid citric, 1,55% acid tactric, 0,45% acid malic), kali bitactrat 3,25%, đường 12,5%, gồm 4,70%, pectin 6,25%. Ngoài ra còn có 34,35% xơ, nước 27,55%. Trong hạt có glucose, xylan, protein, chất béo, muối vô cơ. Trong đời sống quả me được sử dụng theo mùa vụ, như làm thực phẩm, tạo hương vị, gia vị trong món cà ri, súp và
15 cũng là thành phần chính trong một số loại nước ép và đồ uống. Người ta có thể dùng quả me để ăn trực tiếp hoặc thêm vào trong đồ uống và cũng có thể chế biến thành mứt, kẹo. Nước quả me là loại đồ uống bổ dưỡng, được nhiều nước trên thế giới sử dụng và có nhiều cách thức chế biến khác nhau. Tại một số quốc gia châu Phi, nước quả me được trộn với tro gỗ để trung hòa vị chua của acid tartaric. Tuy nhiên phương pháp phổ biến nhất là thêm đường để tạo vị ngọt cho đồ uống. Phần lớn sản phẩm đồ uống có nước me được sản xuất thương mại. Đôi khi nước quả me được cho vào trong đồ uống có cồn [22]. Trong y học, theo đông y quả me có vị chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng. Vỏ cây me có vị chát, có tác dụng làm săn da, dùng làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh về tiêu hóa (kiết lỵ, ỉa chảy..) và nấu nước để ngậm chữa viêm lợi [21]. Lá me có tác dụng giải độc, trị bệnh ngoài da, lá me thường được dùng để nấu nước tắm cho trẻ em đề phòng bệnh ngoài da vào mùa hè. Thịt me, lá và hoa được kết hợp với nhau trong nhiều bài thuốc đông y để đắp vào các khớp bị đau. Theo kinh nghiệm dân gian các bộ phận của cây me còn có tác dụng như: Quả me có tác dụng chữa triệu chứng nôn nghén, chán ăn ở phụ nữ mang thai, điều trị nôn mửa, đầy hơi và khó tiêu; chữa cảm lạnh. Hạt me có tác dụng tẩy giun, lá me có tác dụng chữa rôm sảy, mẩn ngứa, vỏ cây me có tác dụng chữa táo, phòng và chữa viêm lợi, viêm nha chu. Hạt me rang được coi là một loại gia vị đặc biệt trong thực phẩm [21]. Theo y học phương Tây, quả me được sử dụng như một phương thuốc lợi tiểu điều trị chứng rối loạn mật, vàng da và tiêu chảy, giúp hệ thần kinh hoạt động tốt (hàm lượng thiamin 29%), thiamin là một loại vitamin B có vai trò quan trọng trong các hoạt động của dây thần kinh và cơ bắp. Me là một nguồn cung cấp vi chất cho cơ thể như Mg2+, Ca2+. Quả me là một trong những nguồn cung cấp chất xơ cao nhất trong các loại trái cây, giúp ngăn ngừa táo bón (hàm lượng chất xơ 20%). Chất xơ có tác dụng điều hòa nhu động ruột và được coi như một loại thuốc nhuận tràng tự nhiên và không gây tác dụng phụ. Quả me có thành phần kali cao gấp hai lần lượng kali trong chuối. Do đó, quả me có tác dụng kiểm soát huyết áp tốt không kém gì chuối.
16 Nước me giúp ổn định huyết áp bằng cách kiểm soát các tác động của natri trong cơ thể, tránh để tình trạng lượng natri tăng cao làm cho huyết áp tăng [22]. Quả me cũng được biết đến như một loại thuốc chữa bệnh thiếu máu (hàm lượng sắt 2,8%). Vì vậy, đây cũng là loại trái cây rất tốt cho phụ nữ mang thai. Giúp kiểm soát mức cholesterol (hàm lượng niacin 1,2%). Me chứa khá nhiều chất niacin, một loại vitamin B rất quan trọng với sức khỏe. Chất này có thể giúp giảm cholesterol xấu và tăng lượng cholesterol tốt trong cơ thể. Thành phần của me bao gồm chất riboflavin sẽ giúp chuyển hóa carbohydrate trong cơ thể thành năng lượng cho nên có thể cung cấp năng lượng mà không gây béo (hàm lượng riboflavin 9%). Quả me có tác dụng hỗ trợ cơ chế đông máu (hàm lượng calcium 7%). Quả me là một trong những loại trái cây giàu canxi. Canxi (với sự giúp đỡ của vitamin K) đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình đông máu. Vì vậy, quả me được coi là loại quả có tác dụng ổn định cơ chế đông máu. Quả me cũng có tác dụng giảm sốt và bảo vệ chống lại cảm lạnh (dùng thịt quả me đun với nước dùng để uống). Quả me giúp cơ thể tiêu hóa thức ăn, vỏ của hạt me là một phương thuốc hiệu quả chống tiêu chảy và bệnh lỵ. Mặc dù đã có nhiều tác giả đã công bố về các ứng dụng đa dạng của cây me và được đưa vào sử dụng trong cuộc sống. Tuy nhiên cây me vẫn còn có rất nhiều tiềm năng giá trị sử dụng khác nữa bởi vậy cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về giá trị của cây me đặc biệt là trong lĩnh vực dinh dưỡng và dược phẩm [22]. 1.2.2. Cấu trúc hóa học của TSP Theo Joseph và cs. [22] polysaccharide phân lập được từ quả me thuộc lớp chất xyloglucan, có liên kết -(1-4)-D-glucoside là mạch chính, tại vị trí C6 là liên kết với -D-xylopyranose và liên kết với -D-galactopyranose-(1- 2)--Dxylopyranose. Chuỗi này đƣợc lập lại nhiều đơn vị theo dạng XXXG, bao gồm ba nhóm đơn vị bị xylosyl hóa glucopyranose (X) và được phân cách bằng một glucopyranose (G), và có thể một vài nhóm xylose được liên kết với galactopyranose (L) theo Hình 1.5.
17 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học xyloglucan của tamarind seed polysaccharide (TSP) Gần đây, cấu trúc của TSP được mô tả có dạng heptasaccharide (Glc4Xyl3, theo kiểu XXXG), octasaccharide (Glc4Xyl3Gal, theo kiểu XXLG), và monosaccharide (Glc4Xyl3Gal2, theo kiểu XLLG) đã được đề cập. Nhiều tính chất của xyloglucan (khả năng tạo gel, độ tan…) phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, một số polysaccharide có trọng lượng phân tử nhỏ đều có các hoạt tính sinh học quý giá và được sử dụng trong y học. TSP chiết trong nước có dạng gel và kết tủa trong dung môi hữu cơ, TSP có trọng lượng phân tử từ 700–2500 kDa. TSP chiếm khoảng 65% thành phần hạt me phụ thuộc vào nguồn gốc. TSP được sử dụng để kiểm soát liều lượng thuốc và không gây bất kỳ phản ứng phụ nào, có thể tạo khuôn với natri alginate để làm bao cho viên thuốc. Người ta đã tạo dẫn chất sulfate hóa và cetyl hóa của polysaccharide để làm tăng khả năng chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định. Gần đây, TSP đã được xác định là chất không gây ung thư, là chất kết dính có nguồn gốc tự nhiên, và là chất mang có khả năng giữ thuốc cao [22].
18 1.2.3. Phân lập TSP từ hạt me TSP có thể được phân lập bằng các kỹ thuật khác nhau thông qua phương pháp hóa học, phương pháp enzyme sử dụng protease và kết hợp của protease với siêu âm cường độ cao. Trong phương pháp hóa học, bột hạt ngâm nước được đun sôi trong nước. Sau đó, chất nhầy được lọc và thêm vào một lượng acetone bằng nhau để kết tủa polysaccharide, sau đó được cô đặc và sấy khô. Trong phương pháp enzyme, bột nhân trộn với ethanol được xử lý bằng protease. Sau đó, dung dịch được ly tâm và phần nổi phía trên được thêm vào ethanol để kết tủa, sau đó được tách ra và làm khô. Độ tinh khiết của TSP có thể được xác định bởi sự vắng mặt của protein. TSP có thể biến tính tạo thành kết tủa không hòa tan, do đó làm cho việc tách TSP trở nên khó khăn hơn. Vì thế, loại bỏ các protein là mục tiêu chính trong tất cả các các phương pháp phân lập TSP [22]. 1.2.4. Ứng dụng của polysaccharide từ quả me Polysaccharide chiết xuất từ hạt me đã được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, có thể ứng dụng trong dược phẩm. Ví dụ, hoạt tính kháng u và kích thích miễn dịch của polysaccharide PST001 được phân lập từ hạt me (T. indica) đã được Aravind và cs., công bố [23]. Kết quả thu được đã chỉ ra rằng PST001 ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Hơn nữa, độc tính của PST001, khả năng làm giảm khối u và điều hòa miễn dịch cũng được đánh giá trong các nghiên cứu in vivo. Các tác giả đã cho thấy PST001 làm giảm đáng kể khối u và cải thiện mạnh mẽ hoạt động điều hòa miễn dịch [23]. Hơn nữa, TSP này cũng đã được đánh giá các đặc tính hóa học, bao gồm độ ẩm, độ tro, pH, hàm lượng khoáng chất, khả năng giữ nước, tính chất vi lượng, hàm lượng đường tổng số, hàm lượng sulphate, protein và axit uronic [23]. Ngoài ra, gần đây TSP này cũng được đánh giá về ảnh hưởng của nó lên quá trình tiêu hóa và lên men in vitro, ảnh hưởng đến thành phần hệ vi sinh vật đường ruột [24]. Do TSP là một polymerđa chức năng, có nhiều đặc tính lý hóa đặc biệt như đóng vai trò của chất ổn định, chất làm đặc, chất kết dính, chất làm chậm giải phóng, chất điều chỉnh chất tạo huyền phù, chất tăng độ nhớt, chất tạo