Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:73

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là lựa chọn và xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy CoQ10 cao; xây dựng phương pháp tách chiết CoQ10 nhằm định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Đoàn Thị Bắc NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Đoàn Thị Bắc NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: TS. Lê Thị Nhi Công Hướng dẫn 2: TS. Tạ Thu Hằng Hà Nội, 2020
i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Đoàn Thị Bắc
ii Lời cảm ơn Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Lê Thị Nhi Công, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS. Tạ Thu Hằng, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng, là những người thầy đã dành cho tôi những ý tưởng quý báu, cũng như sự hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Liên và các anh chị trong Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tận tình chỉ dạy, tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học và Công nghệ cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và Phát triển Vùng đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian để học tập trong thời gian công tác ở Viện, tôi đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình từ Phòng Công nghệ sinh học Nông nghiệp nơi tôi đang công tác, sự giúp đỡ nhiệt tình và động viên của các anh, chị, em đồng nghiệp, nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quí báu đó. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người thân trong gia đình và những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả Đoàn Thị Bắc
iii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Chữ viết Tiếng anh Tiếng việt tắt, kí hiệu Bchl Bacteriochlorophyll Sắc tố diệp lục vi khuẩn CoQ Coenzyme Q CoQ10 Coenzyme Q with chain Coenzyme Q với chuỗi containing 10 isoprene subunits isoprene có chứa 10 tiểu đơn vị HPLC High-performance liquid Sắc kí lỏng hiệu năng chromatography cao OD Optical Density Mật độ quang TCL Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng VKQH Vi khuẩn quang hợp VKTQH Vi khuẩn tía quang hợp
iv Danh mục các bảng Bảng 1.1. Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) của một số loại thực phẩm........ 7 Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hàm lượng Coenzyme Q10 của các chủng ......... 28 Bảng 3.2. So sánh khả năng sử dụng một số nguồn C của các chủng lựa chọn với Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408................ 31 Bảng 3.3. Hàm lượng CoQ10 của các chủng VKTQH tích lũy trên môi trường nuôi cấy khác nhau .......................................................................................... 42
v Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1. Chuỗi vận chuyển điện tử ................................................................ 4 Hình 1.2. Hình ảnh quang phổ của vi khuẩn tía quang hợp ............................ 13 Hình 3.1. Khả năng sinh trưởng các chủng vi khuẩn tía quan hợp trên môi trường DSMZ 27 sau khi hoạt hóa .................................................................. 27 Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng thể hiện sự có mặt của Coenzyme Q10 .............. 28 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng FO2 (A, B) và của chủng DQ4 (C, D) .................................................................................... 30 Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại chủng FO2 và DQ4 dựa vào so sánh trình tự gen 16S rRNA ............................................................................................. 32 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn ......................................................................................... 34 Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn .................................................................................... 35 Hình 3.7. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn ......................................................................... 36 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn ......................................................................................... 37 Hình 3.9. Ảnh hưởng của NaCl đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn ......................................................................................... 39 Hình 3.10. Phương pháp thu nhận CoQ10 từ 2 chủng FO2 và DQ4 .............. 40
vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10 ................................................. 3 1.1.1. Cấu tạo của Coenzyme Q10 .................................................................. 3 1.1.2. Đặc tính của Coenzyme Q10 ................................................................. 3 1.1.2.1. Đặc tính lý hóa ..................................................................................... 3 1.1.2.2. Đặc tính sinh học trong cơ thể sinh vật.............................................. 4 1.1.3.1. Tổng hợp hóa học ................................................................................ 5 1.1.3.2. Coenzyme từ động vật và thực vật..................................................... 6 1.1.3.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật ............................................................. 7 1.1.4. Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 .............. 8 1.1.5. Ứng dụng của Coenzyme Q10 ............................................................ 10 1.1.5.1. Ứng dụng trong y học........................................................................ 10 1.1.5.2. Trong mỹ phẩm.................................................................................. 11 1.2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SẢN XUẤT COENZYME Q10 ................ 11 1.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp............................................ 11 1.2.2. Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp ...................................... 12 1.2.3. Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp ......................................................................................................... 13 1.2.4. Các nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp.................................................................................................... 15 1.2.4.1. Nghiên cứu trên thế giới về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp .................................................................................... 15 1.2.4.2. Nghiên cứu trong nước về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp .................................................................................... 16
vii CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 18 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC .... 18 2.1.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................... 18 2.1.2. Các thiết bị máy móc ............................................................................ 18 2.1.3. Hóa chất ................................................................................................. 19 2.1.4. Thành phần môi trường nuôi cấy ........................................................ 19 2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................... 20 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 20 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp ........................................................................................ 20 2.3.2. Phương pháp xác định Coenzyme Q10 từ các chủng vi khuẩn tía quang hợp ......................................................................................................... 20 2.3.3. Phương pháp xác định các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp ........................................................................................ 22 2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng và xác định các đặc điểm hình thái..................................................................................................................... 22 2.3.3.2.Phương pháp xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon.... 22 2.3.3.3 Phương pháp phân tích gene mã hóa 16S rRNA ............................. 23 2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn ........................................................................ 23 2.3.5.Xây dựng phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 từ các chủng lựa chọn................................................................................................................... 25 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................... 25 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 26 3.1. TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VKTQH CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CAO ................................................................................................................... 26
viii 3.1.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy Coenzyme Q10 cao ......................................................................................... 26 3.1.1.1.Hoạt hóa và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp.................................................................................................... 26 3.1.1.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tích lũy Coenzyme Q10 cao ......................................................................................... 27 3.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn ....... 29 3.1.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào ........................... 29 3.1.2.2 Khả năng sử dụng các nguồn carbon ................................................ 31 3.1.2.3. Xác định trịnh tự gene 16S rRNA của các chủng lựa chọn ........... 32 3.2. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA 2 CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN.............. 33 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn ......................................................................................... 33 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn..................................................................................................... 35 3.2.3. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn ........................................................................ 36 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 2 chủng lựa chọn ... 37 3.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng của 2 chủng lựa chọn................................................................................................................... 38 3.3. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN ................. 39 CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 44 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................ 44 4.2. KIẾN NGHỊ........................................................................................ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 45
1 MỞ ĐẦU Coenzyme Q10 hay còn được gọi là ubiquinone (ubidecarenone hoặc CoQ10) là một trong ba Coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử ở màng tế bào của sinh vật nhân sơ và lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân chuẩn. CoQ10 có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp ATP – năng lượng sinh học của cơ thể sống. Ngoài ra, CoQ10 còn có tính chất chống oxy hóa mạnh và có khả năng trung hòa các gốc tự do, vì vậy CoQ10 ngày càng được ứng dụng rộng rãi làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe; được đưa vào mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, chống lão hóa để giúp cơ thể trẻ hóa; được ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng cường hệ thống miễn dịch … Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên và đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để tổng hợp CoQ10 như: lên men, tổng hợp sinh học, tổng hợp hóa học hoặc tách chiết từ mô động vật và thực vật. Đối với quá trình tổng hợp hóa học vẫn bị nhược điểm là các chất hóa học sử dụng có thể gây độc ra môi trường. CoQ10 có thể được thu nhận từ động vật và thực vật, tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không thể tách chiết ở qui mô công nghiệp và chi phí rất cao. Vì vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp sinh học được sử dụng rất nhiều hiện nay, có thể đem lại hiệu quả thương mại, đặc biệt sản phẩm CoQ10 rất an toàn cho người sử dụng, đồng thời giá thành lại rẻ nhất. CoQ10 có thể được tổng hợp thông qua quá trình lên men nhờ các vi khuẩn (Agrobacterium tumefaciens, Paracoccus denitrificans, Rhizobium radiobacter, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sulfidophilus, Rhodopseudomonas palustris …), nấm mốc và nấm men (Asperillus, Bullera, Bulleromyces, Cyptococcus, Fellomyces, Kockovaella, Rhodoturola, Sporobolomyces, Utilago). Trong số các vi khuẩn này, vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) là nguồn vi sinh vật lý tưởng để thu nhận CoQ10 vì chúng có khả năng tổng hợp, tích luỹ hàm lượng ubiquinone cao hơn các vi sinh vật khác, đặc biệt cho sản phẩm chủ yếu là CoQ10. Bên cạnh đó, VKTQH có thể nuôi
2 cấy dễ dàng bằng môi trường đơn giản dưới ánh sáng mặt trời. Vì vậy, đây có thể là nguồn tiềm năng thu nhận một lượng lớn các chất có tác dụng sinh học, đặc biệt là CoQ10. VKTQH có rất nhiều loài và khả năng tích lũy CoQ10 sẽ khác nhau phụ thuộc vào sự sinh trưởng cũng như điều kiện nuôi cấy của các loài. Ở tế bào VKTQH, CoQ10 nằm trong vùng kỵ nước của lớp màng phospholipid của màng tế bào, do đó điều cần thiết là phá vỡ màng tế bào để chiết xuất thành phần này. Phương thức phá vỡ màng tế bào VKTQH sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của việc chiết xuất CoQ10. Một số phương pháp chiết xuất CoQ10 đã được thực hiện với hiệu quả khác nhau và chủ yếu phù hợp cho quy mô phòng thí nghiệm. Các nghiên cứu về tác động của một số yếu tố như nhiệt độ, ánh sáng, độ pH và nồng độ muối ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của VKTQH cũng như khả năng tích lũy CoQ10 của VKTQH chưa được công bố nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam”. *Mục tiêu nghiên cứu: - Lựa chọn và xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy CoQ10 cao. - Xây dựng phương pháp tách chiết CoQ10 nhằm định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng *Nội dung nghiên cứu - Tuyển chọn và đánh giá đặc điểm sinh học của 1-2 chủng VKTQH có khả năng tích lũy CoQ10 cao - Khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho việc sinh trưởng của các chủng lựa chọn - Xây dựng phương pháp tách chiết CoQ10 từ các chủng VKTQH lựa chọn
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10 1.1.1. Cấu tạo của Coenzyme Q10 Coenzyme Q10 (CoQ10) có công thức phân tử C59H90O4, trọng lượng phân tử 863,34 g/mol. CoQ10 có cấu trúc dạng chuỗi dài nằm trên màng sinh chất của tế bào vi khuẩn và màng trong ty thể của tế bào sinh vật nhân thực [1]. Đầu của CoQ10 là đầu quinone, nó có chức năng chuyển giao điện tử. Đuôi của CoQ10 là một chuỗi isoprenoid dài, giúp cho các phân tử CoQ10 có thể khuếch tán dễ dàng trong lớp màng lipid [2]. Coenzyme Q có thể tồn tại dưới 3 trạng thái: dạng khử ubiquinol (CoQH2), dạng trung gian (CoQH •), và dạng ôxi hóa ubiquinone (CoQ) [2]. 1.1.2. Đặc tính của Coenzyme Q10 1.1.2.1. Đặc tính lý hóa  Tính chất vật lý CoQ10 là một chất tinh thể dạng bột có màu vàng đến màu cam, không mùi, không vị. Nhiệt độ nóng chảy của CoQ10 từ 48 -52 oC, tương đối ổn định ở 37 oC [3] và nó bị nhiệt phân (pyrolysis) từ từ khi bị đun lên ở nhiệt độ 120 oC hoặc cao hơn. Molyneux (2006) cho rằng CoQ10 bị nhạy cảm với ánh sáng và bị phân hủy gần như hoàn toàn sau 24 giờ tiếp xúc với ánh sáng (bao gồm ánh sáng huỳnh quang). Hàm lượng CoQ10 không bị thay đổi khi được gói trong giấy bạc do tránh khỏi sự tác động của ánh sáng. Vì vậy, trong quá trình tách chiết CoQ10 cần bảo vệ mẫu tránh tiếp xúc với ánh sáng và định lượng CoQ10 có thể được tiến hành trong điều kiện ánh sáng bình thường của phòng thí nghiệm với thời gian không quá 2 giờ [1]. CoQ10 được bảo vệ tốt nhất khi tạo phức với β – cylodextrin, hàm lượng CoQ10 bị tổn thất chỉ khoảng 20 % khi có sự kết hợp chiếu sáng UV và ở nhiệt độ cao [4, 5].  Tính chất hóa học: CoQ10 là một hợp chất kị nước, tan trong chất béo và các dung môi phân cực, có những tính chất tương tự như vitamin [6, 7]. Nó rất dễ tan trong
4 chloroform và carbontetra chloride, tan tự do trong dioxane, ether và hexane, tan một phần trong acetone, hầu như không tan trong nước, methanol và ethanol. CoQ10 kỵ với các tác nhân oxy hóa mạnh, khi tiếp xúc với các hợp chất kiềm tính CoQ10 có thể tạo ra ubichromenol, là một dạng sản phẩm phân hủy. 1.1.2.2.Đặc tính sinh học trong cơ thể sinh vật  Vận chuyển điện tử và cung cấp năng lượng CoQ10 được xác định chủ yếu nằm ở lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân chuẩn và màng plasma của sinh vật nhân sơ. CoQ10 đóng vai trò chính trong việc chuyển điện tử giữa các phức hợp hô hấp của chuỗi vận chuyển điện tử, nằm trong màng trong ty thể, mà sản phẩm cuối cùng là adenosine triphosphate (ATP). Quá trình này thường được gọi là sự hô hấp. Hình 1.1. Chuỗi vận chuyển điện tử [8] Cả dạng khử (quinol) và dạng ôxi hóa (quinone) của Coenzyme Q có thể di chuyển dễ dàng trong lớp màng lipid. Trong chuỗi hô hấp, CoQ10 chịu trách nhiệm vận chuyển điện tử từ phức hợp protein I (NADH dehydrogenase) đến phức hợp protein II (succinate dehydrogenase) và từ phức hợp II đến phức hợp III (phức hợp bc1) [9] . Khi nhận các electron từ cả phức I và phức II, nó
5 vẫn ở dạng khử là ubiquinol và sau khi chuyển các electron sang phức III, nó trở lại dạng oxy hóa thành ubiquinone [8] (Hình 1.1). Chính sự khuếch tán của CoQ cùng với Cytochrome C trong lớp màng ti thể đã đóng vai trò quan trọng trong việc luân chuyển các điện tử đến các phức hợp kế nhau trong chuỗi chuyển điện tử [2]. Các cơ quan đòi hỏi nhu cầu năng lượng cao hơn như não, tim, thận và gan có hàm lượng CoQ10 cao hơn.  Chức năng chống oxy hóa CoQ10 là chất chống oxy hóa hòa tan lipid duy nhất được tìm thấy ở người và nó tập trung vào hầu hết mọi màng, từ màng ty thể đến màng lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) [9]. Nhờ tính hòa tan này CoQ10 có thể bảo vệ lipoprotein và lipid khỏi sự peroxy hóa và tổn thương oxy hóa [10]. CoQ10 có thể kết hợp cùng với các chất chống oxy hóa khác, chẳng hạn như vitamin C và vitamin E để chống lại tác hại của các gốc tự do phát sinh từ các phản ứng trong ty thể tạo ra năng lượng [11]. CoQ10 có khả năng dọn dẹp gốc tự do trong cơ thể sống kém hiệu quả hơn so với các vitamin. Tuy nhiên CoQ10 lại là một chất chống oxy hóa có khả năng tái tạo vitamin E [12]. CoQ10 còn có chức năng bảo vệ màng tế bào, protein và các acid nucleic (DNA, RNA) khỏi quá trình oxy hóa bằng cách trực tiếp ngăn cản tia UV, làm sạch các gốc tự do hoặc gián tiếp bằng cách tái tạo thành α- tocopherol [13, 14]. CoQ10 cũng ức chế collagenase - một loại enzyme phá hủy các mô liên kết của da [8], trao đổi các proton và Ca 2+ qua màng sinh học [15]. CoQ10 có vai trò trong các quá trình sinh lý khác, bao gồm quá trình hình thành liên kết disulfide, oxy hóa sulfide, chuyển hóa pyrimidine [16]. 1.1.3. Nguồn thu Coenzyme Q10 CoQ10 được sản xuất từ 3 nguồn thu: từ vi sinh vật (tổng hợp sinh học), các mô động vật và thực vật, tổng hợp từ các chất hóa học (tổng hợp hóa học). 1.1.3.1. Tổng hợp hóa học CoQ10 có thể tổng hợp theo một số con đường bán tổng hợp [17]. Phương pháp này sử dụng solanesol một chất nền khởi đầu cho quá trình tổng
6 hợp chuỗi mạch nhánh isoprene liên kết với dẫn xuất quinone, sau đó được chuyển đổi thành CoQ10. Solanesol có thể được tổng hợp hoặc dễ dàng thu được bằng cách chiết xuất từ lá thuốc lá hoặc khoai tây [18, 19]. Mu và cộng sự (2011) đã tiến hành tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp hóa học một cách đơn giản và hiệu quả thông qua hợp chất (2'E) -1- (3-methyl- 4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2,3,4,5-tetramethoxybenzene là tiền thân của vòng quinone. Hợp chất này là chất trung gian quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide solanesyl [18]. Tuy nhiên, việc sản xuất theo phương pháp này thường trải qua nhiều bước và tốn kém rất nhiều chi phí liên quan đến các phản ứng xúc tác năng lượng cao do sử dụng chất nền đắt tiền và gây ra nhiều ảnh hưởng tới môi trường bởi các chất thải hóa học được tạo ra nhiều từ quá trình sản xuất [18]. Vì vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 vẫn được cải tiến để ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. 1.1.3.2. Coenzyme từ động vật và thực vật CoQ10 có trong nhiều loại thực phẩm nhưng với hàm lượng ít, nhưng hàm lượng CoQ10 đặc biệt cao trong các loại nội tạng như tim, gan, thận, cũng như thịt bò, dầu đậu nành. CoQ10 lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick Crane (USA) năm 1957 [20]. Một số loài có chất béo như cá thu, cá trích là những nguồn tài nguyên có chứa hàm lượng dầu và CoQ10 cao trong mô cơ của chúng [8, 21]. Ngoài ra, CoQ10 cũng có trong cây thuốc lá (360 μg/g CoQ10), lúa (600 μg/g), các loại quả và các loại rau củ (nhiều nhất là trong bông cải xanh, rau bina, dầu đậu nành, cải dầu, dầu cọ, các loại hạt và cây họ đậu) [22, 23]. Mặc dù có thể thu nhận CoQ10 từ động vật và thực vật tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không thể chiết tách ở quy mô công nghiệp do hiệu suất thấp và chi phí cao. Đây là lí do chính khiến cho các nghiên cứu về CoQ10 từ động vật và thực vật bị hạn chế.
7 Bảng 1.1. Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) của một số loại thực phẩm [24] Thịt & Cá Rau củ quả Dầu và các loại hạt Tuần lộc 157,9 Trái bơ 9,5 Dầu ô liu (EV) 114-160 Tim bò 113,3 Cây cải dầu 6,7- Dầu đậu phộng 77 (Hoa) 7,4 Tim lợn 118,1-282 Bông cải 5,9- Dầu hạt cải 63,5-73,4 xanh 8,6 Gan gà 116,2- Khoai lang 3,0- Đậu phộng (rang) 26,7 132,2 3,6 Tim cá trích 120,0- Cây me 3,6 Hạt hồ trăn (rang) 20,1 148,4 chua Tim cá thu 105,5- Ớt ngọt 3,3 Quả óc chó 19,0 109,8 (nguyên) 1.1.3.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật Cho đến gần đây, sản xuất CoQ10 dựa trên quá trình lên men vi sinh vật được coi là phương pháp khả thi vì khả năng sản xuất các chất đồng phân tự nhiên mạnh về mặt sinh học của CoQ10 với chi phí giảm so với phương pháp tổng hợp hóa học [25, 26].  Coenzyme Q10 từ nấm men và nấm mốc Một số loại nấm men đã được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp Coenzyme Q10 như Cryptococcus laurentii, Trichosporon sp., Sporobolomyces salmonicolor, và R. sphaeroides và các loại nấm men khác như Candida, Rhodotorula và Saitoella [25, 37]. Các loài nấm men như Sporidiobolus johnsonii, tích lũy CoQ10 nội bào từ 0,8 đến 3,3 μg/g khối lượng tế bào khô [28]. Schizosaccharomyces pombe cũng là một loại nấm phổ biến để sản xuất protein và CoQ10 [29]. Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên cứu về các điều kiện tối ưu quá trình sản xuất CoQ10 [30]. Trong một số loài
8 nấm mốc như Neurospora crassa và Aspergillus fumigatus cũng sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp [31].  Coenzyme Q10 từ vi khuẩn Các vi khuẩn sinh tổng hợp CoQ10 nhiều chủ yếu tập trung ở các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Paracoccus denitrificans và Rhodopseudomonas sphaeroides [25, 26, 27, 32]. Agrobacterium tumefaciens cho thấy năng suất tổng hợp CoQ10 cao nhất [26]. 1.1.4. Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết Coenzyme Q10  Tách chiết bằng phương pháp cơ học Có thể dùng các phương pháp như siêu âm hoặc dùng áp suất để phá vỡ tế bào và thu nhận CoQ10. Tian (2010) tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens 1.2554 theo quy trình: sinh khối sau ly tâm bổ sung đệm 2 mM Tris HCl (pH 7,5), tiến hành siêu âm (12 giây on, 10 giây off) năng lượng sóng siêu âm 500W, tổng thời gian siêu âm 12 phút [33]. Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), sử dụng biện pháp cơ học để tách chiết CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides như sau: các tế bào thô được trộn với 5 mL nước cất và bị phá vỡ ở các áp suất khác nhau (5,5; 16,5; 27,5 hoặc 38,5 MPa) bằng cách sử dụng máy đồng nhất hóa cao (Constant, England) [34].  Tách chiết bằng phương pháp nhiệt độ Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), tách chiết CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides như sau: các tế bào ướt (0,5 g DCW) được trộn đều với nước cất (2 mL) và để đông lạnh ở -75 oC trong 30 phút, sau đó được làm nóng ở 100 oC trong 30 phút, thêm 5 ml HCl 4N vào dung dịch mẫu. Hỗn hợp được lắc votex trong 20 phút ở 30 oC, sau đó được chiết xuất với 28 ml hỗn hợp n-propanol và hexane (tỷ lệ thể tích = 3: 5) và lắc đều trong 5 phút ở 40 oC. Mẫu chiết sau đó được hòa tan trong ethanol 95 %. Dung dịch mẫu (10 mL) là được xử lý bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng của CoQ10 [34].
9  Tách chiết bằng phương pháp sử dụng các chất hóa học Ranadive và cộng sự (2011) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng Sporidiobolus johnsonii ATCC 20490. 20 ml dịch nuôi được ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 20 phút để thu sinh khối. Để chiết CoQ10, sinh khối được bổ sung 20 ml 100 % ethanol lắc trong nước 60 oC trong 3 giờ. Tế bào được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm và thu dịch, ethanol được chiết lại với 20 ml n-hexane. Thu lấy pha n-hexane có chứa CoQ10, cô đặc tới 1 ml và đưa vào sắc ký để định lượng [35]. Narendra và cộng sự (2012) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ Saccharomyces cerevisiae như sau: sinh khối ướt tế bào được ủ với ethanol tỷ lệ (1:5) ở 60 oC trong 1 giờ. Chiết xuất lặp lại 3 lần bằng n-hexane [30]. Theo Nguyễn Bá Kiên và cộng sự (2010), CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides đột biến được thu nhận theo phương pháp sau: 10 g sinh khối ướt được hòa trong 70 ml methanol, ủ 55 oC trong 5 phút. Bổ sung 140 ml chloroform và khuấy ở 30 oC trong 20 phút, sau đó được lọc qua giấy lọc (Whatman no.1). Bổ sung NaCl (0,58 %, w/v) bằng 1/5 so với thể tích dịch lọc. Dịch lọc và dung dịch muối NaCl được đảo trộn, để yên, thu pha dưới, làm khô và hòa tan lại trong ethanol [36]. Thitima Rujiralai và cộng sự (2014) đã nghiên cứu phương pháp chiết xuất Coenzyme Q10 (CoQ10) từ Artemia. 1 g Artemia tươi được ủ với acid axetic 75 % ở (30 ± 2) oC trong 24 giờ, sau đó là ba lần chiết liên tiếp với hỗn hợp 5 ml hexane và 5 ml ethanol, sau đó phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao được kiểm chứng với máy dò mảng diode [37].  Tách chiết bằng phương pháp sử dụng enzyme Theo Ha và cộng sự (2007b), khi thực hiện với chủng Agrobacterium tumefaciens KCCM 10413 sinh khối được bổ sung dung dịch ly giải tế bào Cellytic B, ủ 30 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi propanol và n-hexane (3:5) vào dịch ly giải tế bào và khuấy mạnh. Chiết thu pha trên sau đó đem cô đặc, hòa tan trong ethanol [38].
10 Zahiri và cộng sự (2006) đã lựa chọn Lysozym thường thủy phân liên kết β (1-4) glucosid của các peptidoglucan để tạo ra độ cứng cho tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Lysozym thường được liên kết với EDTA để tạo phức với canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysacarit và phá hủy tế bào đặc biệt là vỏ tế bào vi khuẩn gram âm. Nhóm nghiên cứu tách CoQ10 từ các tế bào E. coli tái tổ hợp theo phương pháp sau: sinh khối sau ly tâm bổ sung dung dịch ly giải tế bào [sucrose 8 %, Triton X-100 5%, Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), EDTA 50 mM (pH 8.0) và 1 mg/ml lysozyme] ủ 37 oC trong 30 phút. Bổ sung n-hexane: n-propanol (5:3) (tỉ lệ 1: 2 so với dịch nuôi), thu pha trên, lặp lại bước chiết 2 lần. Cô đặc, và hòa tan sản phẩm trong ethanol [39]. Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013) cũng xử lý enzyme để phá vỡ tế bào bằng cách: khi được rửa hai lần bằng nước cất, các tế bào ướt (0,5 g DCW) được hòa tan trong 450 µl dung dịch Cell Lytic B, trộn với 50 µl dung dịch lysozyme (10 mg/mL), sau đó được ủ trong 20 phút 25 oC để gây ra ly giải tế bào. Sau khi phá vỡ tế bào, CoQ10 được chiết xuất bằng hỗn hợp 25 ml n- propanol và hexane (tỷ lệ thể tích = 3: 5). Thời gian chiết là 5 phút ở nhiệt độ 40 oC. Lượng CoQ10 trong mẫu được đo bằng HPLC [34]. 1.1.5. Ứng dụng của Coenzyme Q10 1.1.5.1. Ứng dụng trong y học Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sử dụng CoQ10 có chức năng cải thiện chức năng tim mạch thông qua việc tăng cường sản xuất năng lượng, co bóp cơ tim, hoạt động chống oxy hóa và ngăn chặn quá trình oxy hóa lipoprotein mật độ thấp [6, 40]. Việc điều trị với CoQ10 cải thiện đáng kể chức năng cơ tim mà không có tác dụng phụ hoặc tương tác thuốc [41]. Điều trị bằng CoQ10 làm giảm các thay đổi sinh lý bệnh tế bào liên quan đến rối loạn chức năng ty thể ở bệnh nhân Parkinson PD [42], làm giảm các biểu hiện stress oxy hóa ở bệnh nhân Huntington [43], bảo vệ thần kinh với việc điều trị các tổn thương gây ra bởi rối loạn chức năng ty thể trong biểu hiện bệnh Alzheimer (AD), có liên quan đến tổn thương oxy hóa gây ra bởi rối loạn chức năng ty thể [44, 45].