Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:68

Thêm vào BST

Báo xấu

64
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.) được thực hiện với mục tiêu nhằm tạo ra một sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo C. militaris có chất lượng tốt, gần giống với tự nhiên. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN HỮU DŨNG NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) TRÊN GIÁ THỂ TẰM DÂU (Bombyx mori L.)”. CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. BÙI VĂN THẮNG, Hà Nội, 2020
i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập tại trƣờng Đại học Lâm nghiệp, đƣợc sự đồng ý của nhà trƣờng, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, tôi đã thực hiện luận văn tốt nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)”. Để hoàn thành tốt bài luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ tận tình của cá nhân và tập thể. Trƣớc tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS. Bùi Văn Thắng, giảng viên trƣờng Đại học Lâm nghiệp, ngƣời đã hƣớng dẫn, chỉ bảo chu đáo, tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện nghiên cứu đề tài khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo và các thầy cô giáo giảng dạy trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã dạy bảo, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học vừa qua. Bài luận văn tốt nghiệp là một trong những dấu mốc quan trọng đánh dấu sự trƣởng thành và kết quả tổng kết đào tạo một học viên. Sau khi học về chuyên ngành Công nghệ sinh học tại trƣờng Đại học Lâm nghiệp. Với nội dung nghiên cứu tôi đã rất nỗ lực và cố gắng áp dụng những gì đã và đang đƣợc học đƣa vào thực hiện đề tài. Mặc dù đã cố gắng nhƣng do trình độ và thời gian có hạn nên luận văn không tránh khỏi những thiếu sót, kính mong thầy cô bạn đọc đóng góp ý kiến để bài luận văn của tôi đƣợc hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 9 năm 2020 Sinh viên thực hiện Nguyễn Hữu Dũng
ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................i MỤC LỤC ..............................................................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................iv DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... v Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................................... 3 1.1. Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo ..................................................... 3 1.1.1.Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo ......................................................... 3 1.1.2. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo ................................................ 4 1.1.3 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của Đông trùng hạ thảo vào cơ thể côn trùng ................................................................................................................. 5 1.1.4. Sự lây nhiễm của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào cơ thể côn trùng ................................................................................................................. 5 1.1.5. Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo.......................................................... 7 1.1.6. Thành phần hóa học trong nấm Đông trùng hạ thảo ............................... 8 1.1.7. Giá trị dƣợc liệu của nấm Cordyceps militaris ..................................... 11 1.1.8. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo .............. 13 1.1.9. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi trồng nấm Cordyceps militari.. 21 1.2. Giới thiệu về tằm dâu .............................................................................. 23 Chƣơng 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU27 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................ 27 2.1.1 Mục tiêu tổng quát ................................................................................. 27 2.1.2 Mục tiêu cụ thể ...................................................................................... 27 2.2. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 27 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................... 27 2.2.2. Hoá chất và thiết bị ............................................................................... 27
iii 2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 28 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 28 2.4.1. Phƣơng pháp gây nhiễm nấm vào giá thể con tằm ............................... 28 2.4.2. Nghiên cứu thời gian nuôi tối phù hợp cho phát triển hệ sợi trong con tằm. 30 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 34 3.1. Kết quả gây nhiễm nấm vào con tằm....................................................... 34 3.1.1. Gây nhiễm bằng phƣơng pháp tiêm...................................................... 34 3.1.2. Gây nhiễm bằng phƣơng pháp phun bề mặt ......................................... 36 3.2. Ảnh hƣởng thời gian nuôi tối đến phát triển mầm quả thể nấm............... 38 3.3. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi trồng đến phát triển quả thể nấm ............ 42 3.3.1. Ảnh hƣởng độ ẩm phòng nuôi đến phát triển quả thể nấm ................... 42 3.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phòng nuôi đến phát triển quả thể nấm.......... 43 3.3.3. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến phát triển quả thể nấm ............................................................................................ 45 3.4. Ảnh hƣởng của phƣơng thức nuôi trồng đến phát triển quả thể nấm ....... 48 3.5. Kết quả phân tích hoạt chất Adenosine và Cordycepin trên giá thể tằm . 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………...……….53 PHỤ LỤC
iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo ......................................................... 7 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm và ăn lan hệ sợi trên con tằm bằng phƣơng pháp tiêm. ................................................................... 35 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm và ăn lan hệ sợi trên con tằm bằng phƣơng pháp phun bề mặt ....................................................... 37 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng thời gian nuôi tối đến phát triển mầm quả thể nấm............ 40 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến phát triển quả thể nấm. .............................. 43 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến phát triển quả thể nấm............................. 44 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến phát triển quả thể nấm. ................................................................................................. 47 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của cách gây nhiễm và phƣơng thức nuôi đến phát triển quả thể nấm. ................................................................................................................ 49 Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lƣợng Adenosine và Cordycepin trong nấm đông trùng hạ thảo nuôi trồng trên giá thể tằm nguyên con. .......................................... 51
v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Đông trùng hạ thảo C. militaris ngoài tự nhiên. (Nguồn: Biological Resource Center, NITE – NBRC). ......................................................................... 4 Hình 1.2. Công thức của một số nucleotid trong Đông trùng hạ thảo ................... 10 Hình 1.3. Vòng đời tằm dâu.................................................................................. 25 Hình 2.1: Lây nhiễm nấm vào tằm bằng phƣơng pháp tiêm. A - tiêm dung dịch giống nấm vào phần đầu; B- đặt con tằm sau tiêm nằm ngang trên giấy thấm; C- đặt con tằm sau tiêm vào ống nhựa đen. ............................................................... 29 Hình 2.2: Lây nhiễm nấm vào tằm bằng phƣơng pháp phun dịch giống nấm lên thân con tằm.......................................................................................................... 30 Hình 3.1. Con tằm bị nhiễm với 150 µl dung dịch giống nấm sau 10 ngày gây nhiễm, nuôi tối, nhiệt độ phòng nuôi 22OC, độ ẩm 60%. A: Con tằm sau gây nhiễm đặt đứng trong ống nhựa đen; B: Con tằm sau gây nhiễm đặt nằm ngang trên giấy thấm vô trùng. ........................................................................................ 35 Hình 3.2. Con tằm bị nhiễm với thể tích dung dịch giống nấm khác nhau sau 10 ngày gây nhiễm, nuôi tối, nhiệt độ phòng nuôi 22OC, độ ẩm 60%. ...................... 38 Hình 3.3. Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 5 ngày và chuyển sang nuôi sáng. A: nuôi tối 5 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày. ........................................................... 40 Hình 3.4. Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 9 ngày và chuyển sang nuôi sáng. A: nuôi tối 9 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày. ........................................................... 41 Hình 3.5. Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 12 ngày và chuyển sang nuôi sáng. A: nuôi tối 12 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày. ......................................................... 41 Hình 3.6. Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 15 ngày và chuyển sang nuôi sáng. A: nuôi tối 15 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày. ......................................................... 41 Hình 3.7. Quả thể nấm phát triển trên con tằm nuôi ở các điều kiện nuôi độ ẩm khác nhau. A- độ ẩm 80%; B- độ ẩm 85%; C- độ ẩm 90% và D- độ ẩm 95%. .... 43
vi Hình 3.8. Quả thể nấm phát triển trên con tằm nuôi ở các điều kiện nhiệt độ nuôi khác nhau. A- nhiệt độ phòng nuôi 18OC; B- nhiệt độ phòng nuôi 20OC; C- nhiệt độ phòng nuôi 22OC và D- nhiệt độ phòng nuôi 25OC.......................................... 45 Hình 3.9. Quả thể nấm phát triển trên con tằm nuôi ở các điều kiện cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85%. .. 47 Hình 3.10. Quả thể nấm phát triển trên con tằm nuôi đặt nằm ngang trên giấy thấm sau 40 ngày chiếu sáng ở các điều kiện: cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85%. A- gây nhiễm nấm bằng cách phun dịch giống nấm trên bề mặt con tằm; B- gây nhiễm nấm bằng cách tiêm dịch giống nấm vào phần đầu con tằm. ................................................ 49 Hình 3.11. Quả thể nấm phát triển trên tằm nuôi đặt thẳng đứng trong ống nhựa đen sau 40 ngày chiếu sáng ở các điều kiện: cƣờng độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85%. ........................................ 50 Hình 3.12. Nấm đông trùng hạ thảo trên tằm nguyên con tƣơi thu hoạch (A) và nấm đông trùng hạ thảo trên tằm nguyên con khô đƣợc sấy bằng phƣơng pháp sấy thăng hoa (B). ....................................................................................................... 50
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, tình hình gia tăng các loại bệnh hiểm nghèo đang là mối lo ngại của các quốc gia trên trế giới. Các nhà khoa học đang dày công nghiên cứu, tìm ra các liệu pháp hữu hiệu để giải quyết vấn đề trên. Con ngƣời đang dần chuyển hƣớng từ việc sử dụng các loại thuốc đƣợc tổng hợp hóa học sang ƣu tiên sử dụng các loại thực phẩm chức năng, các loại thuốc có nguồn gốc hữu cơ từ thiên nhiên. Và các loài nấm dƣợc liệu là đối tƣợng đƣợc chú ý nhiều nhất vì sự đa dạng về các hợp chất sinh học mà chúng chứa trong sinh khối. Từ xƣa, con ngƣời đã biết sử dụng một số loại nấm bổ sung trong các phƣơng thuốc cổ truyền để chữa bệnh cũng nhƣ bồi bổ sức khỏe, nhƣ nấm linh chi, nấm lim xanh, nấm tuyết (mộc nhĩ trắng), v.v, và đặc biệt là nấm Đông trùng hạ thảo. Nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps là loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trƣởng thành của một số loài côn trùng. Hơn 400 phân loài nấm thuộc chi Cordyceps đã tìm thấy và mô tả, tuy nhiên chỉ có khoảng 36 loài đƣợc nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo để sản xuất quả thể (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006). Trong số những loài này, chỉ có loài C. militaris đã đƣợc trồng thành công ở quy mô lớn và có chứa nhiều các chất có hoạt chất sinh học (Li et al, 2006). Loài nấm C. militaris, phân bố ở vùng núi có độ cao từ 2.000 - 3.000 m so với mực nƣớc biển, có chứa hàm lƣợng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể nhƣ: cordycepin, mannitol, cordypolysaccarid, superoxide dismutise và nhiều thành phần hoạt chất quý khác. Nhờ các hợp chất sinh học giá trị này nên loại nấm C. militaris đƣợc quan tâm nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt là các công trình nghiên cứu về lâm sàng, nhƣ: nghiên cứu kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thƣ máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C. et al.,2005), ung thƣ phổi, ung thƣ vú (Ahn Y.J. et al., 2001). Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J.X et al., 2001), sự
2 lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005). Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E and Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S et al., 2005), Nấm này có khả năng duy trì tốt chức năng thận, phổi, chống lão hóa, điều hòa giấc ngủ, viêm phế quản mãn tính (Das et al., 2010). Hai loài C. militaris và C. sinensis hiện nay đang đƣợc nghiên cứu rất nhiều về nuôi trồng, lên men, chiết xuất và sản xuất các dƣợc chất; do có giá tri dƣợc liệu và giá tri kinh tế cao (Liu et al., 2001; Li et al., 2006). Loài C. sinensis là một loại nấm dƣợc liệu có phân bố rất hạn chế trong tƣ nhiên và đến nay chƣa có công trình nào báo cáo nuôi cấy thành công nên rất khan hiếm. Loài C. militaris chứa các hợp chất sinh học tƣơng tự nhƣ loài C.sinensis, nhƣng dễ dàng nuôi trồng trong môi trƣờng nhân tạo (Li et al. 1995; Dong et al., 2012). Do giá tri dƣợc liệu, giá trị kinh tế cao nên hiện nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nuôi trồng loài nấm C. militaris đã đƣợc công bố và áp dụng vào sản xuất. Tuy nhiên, hầu hết các công trình công bố là nuôi trồng nấm C. militaris trên môi trƣờng tổng hợp bổ sung bột nhộng tằm, pepton, cao nấm men hoặc nuôi cấy trên ký chủ nhộng tằm. Với mong muốn, tạo ra một sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo C. militaris có chất lƣợng tốt, gần giống với tự nhiên; chúng tôi tiến hành đề tài hiên cứu: “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)”.
3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.1. Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo Trong lịch sử phát triển của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo (nấm ĐTHT) là một loại thuốc quý đƣợc sử dụng từ hàng ngàn năm trƣớc và chỉ dùng cho các bậc vua chúa. Theo đông y Trung Quốc, loại nấm này có tác dụng hỗ trợ chữa nhiều bệnh nhƣ bệnh về phổi, về thận, đổ mồ hôi trộm, đau lƣng, yếu sinh lý. v.v. Chính vì vậy, nấm Đông trùng hạ thảo đƣợc ngƣời Trung Quốc xem nhƣ nhân sâm (Theo Sách y học cổ truyền Trung Quốc). Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) là chỉ các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trƣởng thành của một số loài côn trùng. Vào mùa đông, sâu non, sâu trƣởng thành của một số loài nằm dƣới đất hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết. Giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh phát triển ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhƣng gốc vẫn dính liền vào thân sâu. Vì mùa đông nấm ký sinh trên côn trùng, mùa hạ mọc thành quả thể nấm nên có tên Đông trùng hạ thảo. Để thu hoạch nấm ngƣời ta thƣờng đào lấy cả xác sâu và nấm để làm thuốc. Ngày nay, hiệu quả sử dụng của các chất dinh dƣỡng trong nấm Đông trùng hạ thảo đã đƣợc khoa học chứng minh. Nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu, điều tra và thu thập nấm Đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên, nuôi trồng để làm nguyên liệu sản xuất ra thực phẩm chức năng phục vụ cho con ngƣời. Cordyceps militaris là loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps. Loài này đƣợc Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris (Kobayasi, 1982).
4 Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae về số lƣợng loài và phổ ký chủ. Ƣớc tính có hơn 400 loài trong chi này (Mains, 1958; Kobayasi et al, 1982; Stensrud et al., 2005). Nấm C. militaris thuộc giới Nấm, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps và loài C. militaris. Tên khoa học Cordyceps militaris (L.) Fr. (1818) (Kobayasi, 1982). Nấm Đông trùng hạ thảo C. militaris là loài nấm ký sinh trên sâu bƣớm, quả thể có màu cam, chiều dài 8 - 10 cm. Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng, quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa. Các nang bào tử dài từ 300 - 510 µm, bề rộng 4 µm. Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích thƣớc 3,5 - 6 1 – 1,5 µm. Các bào tử nang này trong điều kiện ngh o dinh dƣỡng s đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp. Nấm này có phân bố rộng, ở Bắc M , châu Âu và châu Á (Paul et al, 2008). Hình 1.1. Đông trùng hạ thảo C. militaris ngoài tự nhiên. (Nguồn: Biological Resource Center, NITE – NBRC). 1.1.2. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy đƣợc vào mùa hè, ở vùng núi cao trên 4.000 m nhƣ cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc và Vân Nam, v.v. Theo các nhà khoa học thì chi nấm Cordyceps có tới 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông trùng hạ thảo. Các loài nấm này phân bố rộng ở châu Á với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á và châu Úc. Tuy nhiên, cho đến nay ngƣời ta mới chỉ nghiên
5 cứu nhiều 2 loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dƣợc liệu tốt với con ngƣời. 1.1.3 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của Đông trùng hạ thảo vào cơ thể côn trùng Vào mùa đông, bào tử nấm ĐTHT có trong đất s dính vào bên ngoài sâu hay nhộng của các loài bƣớm khác nhau. Sau đó bào tử nấm s nảy mầm thành ống có các thể bám. Các ống này s tiết các enzyme kitanase, lipase, protease phá hủy vỏ ngoài ký chủ, xâm nhập vào mô bên trong cơ thể. Trong cơ thể ký chủ, hệ sợi nấm hút chất dinh dƣỡng và phát triển mạnh m chiếm toàn bộ cơ thể, gây chết ký chủ, vỏ cứng lại để bảo vệ sợi nấm. Đến mùa hè, hệ sợi nấm s nảy chồi, s làm nứt vỏ kitin của sâu, rồi phát triển thành quả thể. Quả thể sinh sản hình thành bào tử trong các túi bào tử. Sau đó túi bào tử nứt ra, bào tử phóng thích ra môi trƣờng. Đến mùa đông, trứng côn trùng nở thành sâu, nhộng, ngẫu nhiên bị bào tử xâm nhập.Vòng đời cứ thế tiếp tục (Kobayasi et al, 1982; Kamble et al, 2012). Qủa thể nấm C. militaris thƣờng có màu vàng nhạt hoặc màu da cam (Zheng et al., 2011). 1.1.4. Sự lây nhiễm của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào cơ thể côn trùng Theo Bách khoa toàn thƣ thì nấm Cordyceps lây nhiễm vào cơ thể sâu đến nay vẫn chƣa rõ nguyên nhân. Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dƣỡng trong cơ thể sâu. Đến một giai đoạn nhất định, nấm phát triển thành quả thể nấm (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử. Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính: (1) Giai đoạn xâm nhập Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh
6 mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tƣơng ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ dày nhƣ Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, Naxetylglucosaminidase, cenlulase. Các enzyme này đƣợc tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay trong một loài (Nguyễn Lân Dũng et al., 2006) Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein). Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai trò không kém phần quan trọng. Nhƣng quan trọng hơn nhất là enzym phân hủy protein (protease) và enzyme phân hủy kitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng. (2) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm. Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn. Khi hệ sợ nấm đƣợc hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp nơi theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lƣu thông máu. Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập. Nấm thƣờng xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp. Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài. Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết (Pramer D., 1965) (3) Giai đoạn sinh trƣởng của nấm sau khi vật chủ chết Ở bên trong cơ thể côn trùng, sợi nấm sinh trƣởng và nhân lên nhanh chóng. Một số loài nấm tiếp tục sinh trƣởng ở dạng sợi nấm. Hệ thống miễn dịch của ký chủ côn trùng sử dụng cơ chế thực bào và tiết ra các hợp chất đối kháng (nhƣ quinine và melanine). Đầu tiên, cơ thể côn trùng phải xác định cơ thể ngoại
7 lai và tạo ra phản ứng miễn dịch. Tuy nhiên, nấm ký sinh côn trùng phát triển rất nhanh thông qua việc tái sản xuất nhanh chóng sợi nấm làm áp đảo hệ thống miễn dịch của côn trùng. Hơn thế nữa nấm còn tạo ra các dạng độc tố và một số công cụ tấn công khác để giết chết côn trùng, chính những độc tố và công cụ tấn công này đã phá hủy cơ chế kháng của ký chủ. Hầu hết các nấm bất toàn (inperfect fungi) thƣờng tạo ra độc tố và giết chết côn trùng trong một thời gian ngắn hơn là nấm có giai đoạn sinh sản hữu tính. Trong giai đoạn đầu độc ký chủ, một số loài nấm bất toàn giết chết ký chủ trƣớc khi gây hại toàn bộ cơ thể côn trùng và trên cơ thể côn trùng quan sát thấy rất ít sợi nấm (Trần Ngọc Lân, 2008). 1.1.5. Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo Bảng 1.1. Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis Cordyceps militaris Giới Nấm Nấm Ngành Ascomycota Ascomycota Lớp Ascomycestes Sordariomycetes Bộ Hypocreales Hypocreales Chi Cordyceps Cordyceps Loài Sinensis militaris Tên khoa học Cordyceps sinensis Cordyceps militaris Hai loài nấm C. sinensis và C. militaris hiện nay đang đƣợc nghiên cứu rất nhiều về nuôi trồng, lên men, chiết xuất và sản xuất các thực phẩm chức năng do có giá tri dƣợc liệu và giá tri kinh tế cao (Liu et al., 2001; Li et al., 2006). Nấm đông trùng hạ thảo Ophiocordyceps sinensis (hay còn gọi là C. sinensis) là một loại nấm dƣợc liệu có phân bố rất hạn chế trong tự nhiên và đƣợc nuôi dƣỡng trong điều kiện hoang dã, loài nấm này hiện tại vẫn chƣa đƣợc nuôi trồng thành công trong môi trƣờng nhân tạo, do đó sản lƣợng nấm thu đƣợc không đáp ứng đủ nhu cầu của thị trƣờng (Li et al., 2006; Stone
8 2008; Zhang et al., 2012). Loài đông trùng hạ thảo C. militaris (thƣờng đƣợc gọi nấm cam sâu bƣớm), chứa các hợp chất hóa học tƣơng tự nhƣ của C. sinensis, nhƣng có thể dễ dàng nuôi trồng trong môi trƣờng nhân tạo (Li et al., 1995; Dong et al., 2012). Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về quy trình nuôi trồng nấm C.militaris nhằm thay thế cho loài C. sinensis và có nhiều nghiên cứu quan trọng về gen, nhu cầu dinh dƣỡng, môi trƣờng nuôi cấy, các đặc tính sinh hóa và dƣợc lý của nấm C. militaris. Gần đây, bộ gen hoàn chỉnh của C. militaris cũng đƣợc giải trình tự làm cơ sở cho nhiều nghiên cứu sâu hơn về loại nấm này (Zheng et al., 2011). Có hơn 400 phân loài Cordyceps đã tìm thấy và mô tả, tuy nhiên chỉ có khoảng 36 loài đƣợc nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo để sản xuất quả thể (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006). Duy nhất loài C. militaris đã đƣợc trồng ở quy mô lớn do nó có dƣợc tính rất tốt và có thời gian sản xuất ngắn (Li et al., 2006). 1.1.6. Thành phần hóa học trong nấm Đông trùng hạ thảo Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C. militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành phần nhƣ protein chiếm 40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học chất quan trọng (Shih et al., 2007). Acid amin Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả thể nấm C. militaris có chứa lƣợng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm). Khối lƣợng acid amin mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15 - 15,06 mg/g (đối với quả thể) và 0,36 - 2,99 mg/g (đối với sinh khối). Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g),
9 arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g). Số liệu phân tích của Chang và ctv. (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001). cid b o Theo kết quả nghiên của Hur (2008) thì quả thể nấm C. militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lƣợng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối. Lƣợng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối. denosine và cordycepin Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dƣợc tính cao của nấm C. militaris. Adenosine trong quả thể chiếm 0,18% và trong sinh khối nấm chiếm 0,06% . Hợp chất cordycepin trong quả thể có hàm lƣợng cao gấp 3 lần so với sinh khối (Huang et al., 2006). Polysaccharide Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 đƣợc tách chiết nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đƣờng monosaccharide: mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thƣơng gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất. Một số monosaccharid có trong nấm đông trùng hạ thảo nhƣ rhamnose, ribose, arabinose, glucose, mannitol, fructose… (Yan et al., 2008). - Các nucleotid: Nucleotid là một trong những thành phần có hoạt tính trong nấm đông trùng hạ thảo, trong đó các hoạt chất adenosin, cordycepin đƣợc sử dụng là các hoạt chất để đánh giá chất lƣợng của đông trùng hạ thảo. Ngoài ra trong đông trùng hạ thảo còn nhiều loại nucleotid khác nhƣ uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosin (cấu trúc này đƣợc đƣa vào các hợp chất có hoạt tính
10 antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân đã bị nhiễm HIV nhƣ didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt chất này chƣa tìm thấy đƣợc ở trong các dƣợc liệu khác trong tự nhiên. Công thức hóa học Cordycepin Công thức hóa học Adenosin Công thức hóa học Guanosin công thức hóa học Cytidin Công thức hóa học Thymidin Công thức hóa học Uridin Hình 1.2. Công thức của một số nucleotid trong Đông trùng hạ thảo - Các sterol Các phytosterol trong nấm đông trùng hạ thảo (cholesterol, campesterol, β sitosterol) đóng vai trò quan trọng trong điều trị, phòng chống ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt và ung thƣ trực tràng (Choi et al., 2007). - Các nhóm hoạt chất khác
11 Đông trùng hạ thảo có chứa các loại acid amin thiết yếu nhƣ acid glutamic, acid aspartic, arginin…và các hợp chất kiểu polyamin là cadaverin, spermidin, spermin…, các cyclodipeptid nhƣ cordycedipeptid A. Các hợp chất này có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus và vi khuẩn. Theo kết quả nghiên cứu của Filipa et al., 2013, chiết xuất methanol của C. militaris đã đƣợc thử nghiệm về tính chất chống oxy hoá, kháng khuẩn, chống nấm và chống tăng sinh ở các dòng tế bào khối u ở ngƣời. Mannitol (2,01 g / 100 g) và trehalose (24,71 g / 100 g) là các loại đƣờng tự do trong C. militaris. Các axit béo không bão hòa (68,87%) chiếm ƣu thế hơn các axit béo bão hòa (23,40%) và δ-tocopherol là dạng duy nhất của vitamin E đƣợc phát hiện (55,86 μg / 100 g). Các axit hữu cơ đƣợc tìm thấy trong nấm này là axit oxalic, citric và fumaric (lần lƣợt là 0,33, 7,97 và 0,13 g / 100 g). Chiết xuất methanol của C. militaris đã ức chế lipid peroxidation, làm giảm sự phát triển của các gốc tự do. Chiết xuất này cũng cho thấy tính kháng khuẩn và chống nấm mạnh. Cuối cùng, chất chiết xuất từ C. militaris có thể ức chế sự gia tăng các tế bào ung thƣ biểu mô tế bào ung thƣ ngƣời (MCF-7, ung thƣ vú), NCI-H460 (non-small lung), HCT-15 (đại tràng) và heLa (cổ tử cung). 1.1.7. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris Các hợp chất dƣợc liệu của nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong điều tri bệnh và nâng cao sức khỏe con ngƣời, do đó loài nấm này có giá tri kinh tế cao. Nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên. Vì vậy, việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều tri bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đề cấp thiết. - C c h p chất chống ung thƣ: Hợp chất cordycepin (3′- deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thƣ, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch (Shonkor et al., 2010).
12 - Hoạt tính kh ng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs- CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và tạo phức ở nồng đô (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85% (Fengyao et al., 2011). - Tăng số lƣ ng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi dùng chế phẩm từ Cordycepsmilitaris, số lƣợng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và hình dạng bình thƣờng tăng. Hiệu quả này đƣợc duy tr thậm ch sau 2 tuần ngƣng sử dụng chế phẩm. Lƣợng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lƣợng tinh dịch và chất lƣợng tinh trùng ở lợn (Lin et al., 2007). - Hạn chế virus c m: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều tri cúm A. Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào (Yuko et al., 2007). - Kh ng khu n kh ng nấm và kh ng ung thƣ: C.militaris protein (CMP) tách chiết từ nấm có kích thƣớc 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7- 9. Protein này ức chế nấm Fusariumoxysporum và gây độc đối với tế bào ung thƣ bàng quan (Byung-Tae et al., 2009). Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium. Các hợp chất dẫn xuất từ nấm đƣợc mong đợi ứng dụng trong việc điều tri các bệnh nhiễm khuẩn đƣờng ruột. Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đƣờng thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do đó đƣợc hy vọng s ứng dụng đƣợc nhƣ một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều tri các bệnh về miễn dịch (Seulmee et al., 2009). - Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin.
13 Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tƣơng tự nhƣ các enzym fibrinolytic mạnh khác nhƣ nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn s làm một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang đƣợc sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở ngƣời (Jae-Sung et al., 2006). - Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris (CMWE) đƣợc thử nghiệm về tác dụng kiểm soát lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxide), việc phóng thích yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW 264,7. Các đại thực bào đƣợc xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE làm giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết. Những kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào (Wol-Soon et al., 2010). - C c ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc dù nấm Cordyceps sinensis đƣợc sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên các ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tƣơng tự nhau. Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris có thể đƣợc sử dụng trong các trƣờng hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt (Das et al., 2010; Mizuno, 1999). 1.1.8. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 1.1.8.1. Trên thế giới Có rất nhiều nghiên cứu về Đông trùng hạ thảo (C. militaris) đã đƣợc nghiên cứu và đăng trên nhiều tạp chí uy tín. Tuy nhiên, điểm giống nhau là hầu hết các nhà khoa học đều cho rằng phần dƣợc tính của nấm đông trùng hạ thảo (C. militaris) chủ yếu có trong quả thể nấm và có rất ít hoặc không có trong cơ thể ký chủ.