Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phân lập - nhân giống và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) ở Việt Nam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:116

Thêm vào BST

Báo xấu

84
lượt xem 28
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm định danh được những chủng giống nấm Đông trùng hạ thảo thu nhận ngoài tự nhiên Việt Nam để nuôi trồng cho năng suất quả thể cao và hàm lượng các hoạt chất Cordycepin, Adenosine tốt, sẽ góp phần thúc đẩy sản xuất những loài nấm này tại Công ty Cổ Phần Dược Thảo Thiên Phúc cũng như ở Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phân lập - nhân giống và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP - NHÂN GIỐNG VÀ NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM Hà Nội, 2019
i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của Hội đồng khoa học. Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2020 Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Hồng
ii LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành trong chương trình đào tạo nghiên cứu sinh khóa 26A của trường Đại học Lâm nghiệp. Đ hoàn thành được Luận văn này, trước hết tôi xin chân thành cảm ơn tập th Ban lãnh đạo Viện, các th y cô giáo của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp và Ban Giám đốc Công ty Cổ ph n Dược thảo Thiên Phúc đã tạo đi u kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện Luận văn này. Đặc biệt, tôi xin g i lời biết ơn sâu s c đến TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm đã tận tình hướng d n tôi ngay nh ng ngày đ u b t tay vào nghiên cứu đ tôi hoàn thành tốt Đ tài nghiên cứu. Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ kinh phí của Dự án thuộc Quỹ đổi mới Công nghệ Quốc gia - Bộ Khoa học & Công nghệ tài trợ: “Hoàn thiện, nâng cấp quy trình sản xuất và phát tri n sản phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa Cordyceps militaris”, do PGS.TS. Lê Minh S t, Công ty Cổ ph n Dược thảo Thiên Phúc làm chủ nhiệm. Cuối c ng, tôi xin g i lời cảm ơn tới gia đình, bạn b và người thân đã luôn luôn kh ch lệ, động viên và tạo mọi đi u kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành Luận văn này. Tuy đã cố g ng đ hoàn thiện Luận văn, song kinh nghiệm của tôi c n hạn chế, vì vậy Luận văn không tránh khỏi nh ng thiếu sót, k nh mong các qu th y cô đóng góp kiến đ Luận văn của tôi được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! à Nội, ngày29 tháng 5 năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Hồng
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................. vi DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................... ix ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1 Phần I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 2 1.1. Tổng quan chung v Cordyceps militaris ............................................. 2 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu ......................................................................... 2 1.1.2. Phân loại ........................................................................................ 2 1.1.3. Đặc điểm và phân bố của Cordyceps militairs ............................... 3 1.1.4. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris ............................... 4 1.1.5. Các hoạt chất chính trong nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ................................................................................................... 5 1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt Nam và trên thế giới ......................................................................... 7 1.2.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên thế giới ............................................................................... 7 1.2.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt Nam. ................................................................................ 9 1.3. Các phương pháp định danh nấm ....................................................... 10 1.3.1. Phương pháp định danh thông qua hình thái................................ 10 1.3.2. Phương pháp định danh bằng phân tử ......................................... 11 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát tri n của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris.............................................................. 15
iv 1.4.1. Yếu tố giống ................................................................................. 15 1.4.2. Yếu tố dinh dưỡng ........................................................................ 15 1.4.3. Các yếu tố môi trường .................................................................. 17 Phần 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................... 18 2.1.1. Mục tiêu tổng quát ....................................................................... 18 2.1.2. Mục tiêu cụ thể ............................................................................. 18 2.2. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu ....................................... 18 2.2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu .................................................... 18 2.2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................... 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 19 2.3.1. Phương pháp thu thập và định danh loài nấmCordyceps militaris. ...19 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris ................................................................................ 22 2.3.3. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấm Cordyceps militaris. ............................................................................... 23 2.3.4. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp phù hợp với Cordyceps militaris bản địa................................................ 24 2.4. Nguyên liệu,hóa chất, thiết bị ............................................................. 27 2.5. Phương pháp thu thập và x lý số liệu ................................................ 27 Phần 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 28 3.1. Kết quả thu thập và định danh loài nấm Cordyceps militaris .............. 28 3.1.1. Kết quả điều tra thu thập mẫu tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai ..... 28 3.1.2. Kết quả định danh loài nấm Cordyceps militaris bằng phân tử .... 37 3.2. Kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris ....................... 51 3.3. Kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấm Cordyceps militaris ............ 54 3.3.1. Nhân giống cấp 1 trên môi trường thạch ...................................... 54 3.3.2. Nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng........................................ 63
v 3.4. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp ph hợp với Cordyceps militaris bản địa. ................................................................ 73 KẾT LUẬN ............................................................................................... 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 102
vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ APS Acidic polysaccharide C Cacbon CMWE Dịch chiết từ quả th nấm Cordyceps militaris C.militaris Cordyceps militaris CNSH Công nghệ sinh học Cu Đồng ddNTP Dideoxynucleotide ĐTHT Đông tr ng hạ thảo FAME Fatty Acid Methyl Ester IL-6 Interleukin-6 ITS Internal Transcribed Spacer LPS Lipopolysaccharide PCR Polemerase Chain Reaction PDA Potato Dextro Agar PGA Potato Glucose Agar rRNA ARN riboxom Se Selen SSU Small Subunit TNHH Trách nhiệm h u hạn TNF - α yếu tố hoại t khối u α VQG Vườn quốc gia Zn Kẽm
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành ph n phản ứng PCR .................................................................. 221 Bảng 2.2. Công thức phối trộn 3 loại môi trường nuôi cấy sợi nấm C.militaris .... 255 Bảng 2.3. Công thức phối trộn 3 loại môi trường nuôi cấy sợi nấm C.militaris .... 255 Bảng 3.1. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM1 với các trình tự tương đồng ở GeneBank ........................................................................................ 37 Bảng 3.2. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM2 với các trình tự tương đồng ở GeneBank ........................................................................................ 39 Bảng 3.3. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM13 với các trình tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 41 Bảng 3.4. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM18 với các trình tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 43 Bảng 3.5. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM28 với các trình tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 44 Bảng 3.6. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM29 với các trình tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 46 Bảng 3.7. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM32 với các trình tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 47 Bảng 3.8. Mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM34 với các trình tự tương đồng ở GeneBank .................................................................................... 49 Bảng 3.9. Kết quả phân lập m u nấm Codyceps militaris thu ngoài tự nhiên ......... 50 Bảng 3.10. Đường k nh sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trên môi trường cơ bản PGA................................................................................................ 55 Bảng 3.11. Đường k nh sinh trưởng của các hệ sợ nấm Cordyceps militaris ở các đi u kiện nhiệt độ khác nhau ................................................................................. 57 Bảng 3.12. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thành ph n môi trường đến khả năng tạo sinh khối nấm trong môi trường dịch th .......................................................... 62 Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ l c đến khả năng tạo sinh khối nấm trong môi trường dịch lỏng ............................................................................ 69
viii Bảng 3.14. Kết quả ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng hình thành và phát tri n quả th ........................................................................................................... 71 Bảng 3.15. Kết quả nghiên cứu đặc đi m sinh trưởng của hệ sợi khi nuôi cấy trên môi trường C2 ....................................................................................................... 76 Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của nguồn Nito đến khả năng hình thành và phát tri n quả th ........................................................................................................... 79 Bảng 3.17. Kết quả nghiên cứu đặc đi m sinh trưởng của hệ sợi khi nuôi cấy trên môi trường N2 ....................................................................................................... 83 Bảng 3.18. Kết quả ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng và phát tri n quả th Cordyceps militaris ........................................................................... 81 Bảng 3.19. kết quả nghiên cứu đặc đi m quả th khi chiếu sáng ở cường độ 700 lux .. 87 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng hình thành và phát tri n quả th Cordyceps militaris ........................................................................... 89 Bảng 3.21. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày .. 90 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng hình thành và phát tri n quả th Cordyceps militaris................................................................................................ 92 Bảng 3.23. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm 80% và 90% đến sinh trưởng của quả th ............................................................................................................ 93 Bảng 3.24. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành và phát tri n quả th Cordyceps militaris................................................................................................ 96 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của quả th ........................... 97
ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Hình ảnh m u nấm CM1 thu ngoài tự nhiên ......................................... 299 Hình 3.2. Hình ảnh m u nấm CM2 thu ngoài tự nhiên ......................................... 309 Hình 3.3. Hình ảnh m u nấm CM5 thu ngoài tự nhiên ........................................... 30 Hình 3.4. Hình ảnh m u nấm CM7 thu ngoài tự nhiên ........................................... 31 Hình 3.5. Hình ảnh m u nấm CM13 thu ngoài tự nhiên ......................................... 31 Hình 3.6. Hình ảnh m u nấm CM14 thu ngoài tự nhiên ......................................... 32 Hình 3.7. Hình ảnh m u nấm CM18 ngoài tự nhiên ............................................... 33 Hình 3.8. Hình ảnh m u nấm CM24 thu ngoài tự nhiên ......................................... 33 Hình 3.9. Hình ảnh m u nấm CM28 ngoài tự nhiên ............................................... 35 Hình 3.10. Hình ảnh m u nấm CM29 thu ngoài tự nhiên ....................................... 36 Hình 3.11. Hình ảnh m u nấm CM32 ngoài tự nhiên ............................................. 36 Hình 3.12. Hình ảnh m u nấm CM34 ngoài tự nhiên ............................................. 37 Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM1 trên BLAST NCBI ............... 38 Hình 3.14. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM1 ............................................... 39 Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM2 trên BLAST NCBI ............... 40 Hình 3.16. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM2 ............................................... 40 Hình 3.17. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM7 ............................................... 40 Hình.3.18. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM13 trên BLAST NCBI ............. 41 Hình 3.19. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM13 ............................................. 42 Hình 3.20. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM18 trên BLAST NCBI ............. 42 Hình 3.21. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM18 ............................................. 44 Hình 3.22. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM28 trên BLAST NCBI ............. 45 Hình 3.23. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM28 ............................................. 46 Hình 3.24. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM29 trên BLAST NCBI ............. 47 Hình 3.25. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM29 ............................................. 48 Hình 3.26. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM32 trên BLAST NCBI ............. 49 Hình 3.27. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM32 ............................................. 49 Hình 3.28. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM34 trên BLAST NCBI ............. 50
x Hình 3.29. Sơ đồ cây di truy n đối với chủng CM34 ............................................. 51 Hình 3.30. M u CM2 và CM13 sau 10 ngày phân lập ........................................... 51 Hình 3.31. Hình ảnh các m u nấm ngoài tự nhiên sau 10 ngày phân lập ................ 52 Hình 3.32. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường Hansen . 55 Hình 3.33. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trườngCzapek-Dox .... 56 Hình 3.34. Hình ảnh m u CM1 sau 7 ngày nuôi cấy và m u CM7 sau 15 ngày nuôi cấy . 58 Hình 3.35. Hình ảnh các m u nấm sau 7 ngày nhân giống trên môi trường PGA ... 58 Hình 3.36. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nhân giống trên môi trường PGA . 59 Hình 3.37. Hình ảnh m u nấm CM1 ...................................................................... 61 Hình 3.38. Hình ảnh m u nấm CM2 ...................................................................... 60 Hình 3.39. Hình ảnh m u nấm CM7 ...................................................................... 60 Hình 3.40. Hình ảnh các m u nấm sau 15 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 25oC .............. 61 Hình 3.41. Hình ảnh m u CM1 trên môi trường M1(A) và môi trường M2(B) ...... 65 Hình 3.42. Hình ảnh các m u được nuôi cấy trên môi trường M1 sau 7 ngày l c dịch ...... 66 Hình 3.43. Hình ảnh các m u được nuôi cấy trên môi trường M2 sau 7 ngày l c dịch ...... 67 Hình 3.44. Hình ảnh các m u được nuôi cấy trên môi trường M3 sau 7 ngày l c dịch ...... 68 Hình 3.45. Hình ảnh các m u khi l c ở tốc độ 100 vòng/phút ................................ 70 Hình 3.46. Hình ảnh các m u khi l c ở tốc độ 150 vòng/phút ................................ 71 Hình 3.47. Hình ảnh các m u khi l c ở tốc độ 200 vòng/phút ................................ 70 Hình 3.48. Hình ảnh các m u sau khi ươm sợi trên môi trường C2 ........................ 75 Hình 3.49. Hình ảnh m u nấm CM29 và CM32 sau 63 ngày và 56 ngày nuôi trồng trên môi trường C1 ................................................................................................ 76 Hình 3.50. Hình ảnh m u nấm CM29 và CM32 sau 63 ngày và 56 ngày nuôi trồng trên môi trường C3 ................................................................................................ 76 Hình 3.51. Hình ảnh m u CM1 sau 25 ngày nuôi cấy (A)và 57 ngày nuôi cấy (B) trên môi trường C2 ................................................................................................ 78 Hình 3.52. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trên môi trường C2 ..................... 79 Hình 3.53. Hình ảnh các m u sau khi ươm sợi trên môi trường N2 ............................ 81 Hình 3.54. Hình ảnh m u nấm CM18 và CM29 sau 59 ngày và 63 ngày nuôi trồng trên môi trường N1 ................................................................................................................ 82
xi Hình 3.55. Hình ảnh m u nấm CM13 và CM32 sau 63 ngày và 64 ngày nuôi trồng trên môi trường N3 ................................................................................................................ 82 Hình 3.56. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trên môi trường N2 ...................... 840 Hình 3.57. Hình ảnh m u CM29 sau 55 ngày nuôi cấy ở môi trường N2 .................. 81 Hình 3.58. Hình ảnh m u CM29 sau 56 ngày nuôi cấy ở cường độ ánh sáng 500 lux.... 86 Hình 3.59. Hình ảnh các m u nấm sau khi nuôi trồng ở cường độ 700 lux ............... 88 Hình 3.60. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp ở thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày ......................................................................................................... 91 Hình 3.61. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trong độ ẩm 80% ............................ 90 Hình 3.62. Hình ảnh các m u sau khi nuôi trồng trong độ ẩm 90% ............................ 95 Hình 3.63. Hình ảnh m u CM18 sau khi hệ sợi ăn lan k n b mặt cơ chất (A) và sau khi nuôi sáng 3 ngày (B) ở nhiệt độ 22oC ......................................................................... 96 Hình 3.64. Hình ảnh m u CM32 ở nhiệt độ 22oC - 24oC sau 50 và 52 ngày nuôi trồng . 98 Hình 3.65. Hình ảnh m u CM1, CM29, CM34 ở nhiệt độ 22oC và 24oC sau khi nuôi trồng trên giá th tổng hợp .......................................................................................... 99 Hình 3.66. Hình ảnhm u CM13 sau khi nuôi trồng 58 ngày ở nhiệt độ 22oC và 24oC......... 99 Hình 3.67. Hình ảnh m u CM7 sau khi nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp ở nhiệt độ 22oC và 24oC......................................................................................................................... 100
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đông tr ng hạ thảo là một loài nấm dược liệu qu hiếm từ lâu đã được cả thế giới biết đến. Nhi u nghiên cứu khoa học đã chứng minh Cordycep militaris có các thành ph n hóa học ch nh có giá trị dinh dưỡng và dược t nh như: cordycepin, adenosine, cordycepic acid, polysaccharides, superoxide dismutase (SOD), acid béo, các sterol và các hoạt chất có tác dụng sinh học khác như acid amin, protein, vitamin (A, B1, B3, B6, B12, ...) và nguyên tố vi lượng (Zn, Se, Cu, ...). Các bằng chứng khoa học cũng đã xác nhận hiệu quả của Cordycep militaris như: cải thiện hệ miễn dịch, chống lão hóa, chống mệt mỏi, tiêu diệt tế bào ung thư, vi rút và vi khuẩn, hỗ trợ hệ tim mạch, cải thiện sự đ kháng insulin trên bệnh nhân ti u đường, giảm cân và có th s dụng trong mỹ phẩm, .... Ch nh vì vậy, nhu c u các sản phẩm từ Cordycep militaris trong nước hiện nay ước t nh đạt 300 tỷ đồng và đang ngày càng gia tăng, trong đó trên 70% là các sản phẩm nhập khẩu. Trong khi đó, thị trường tiêu thụ các sản phẩm từ Cordycep militaris trên thế giới hiện nay đạt mức 10.000 tấn/năm, tương đương khoảng 100 tỷ đô la Mỹ/năm. Việc Đông tr ng hạ thảo tự nhiên d n trở nên khan hiếm đã thúc đẩy nhi u nghiên cứu hướng đến việc nuôi trồng Đông tr ng hạ thảo nhân tạo. Cordyceps militaris hiện được s dụng như nguồn Đông tr ng hạ thảo có th nuôi cấy nhân tạo đ tạo ra quả th , đáp ứng nhu c u s dụng ngày càng gia tăng trong nước và trên thế giới với ch ph hợp l . Ở Việt Nam có nhi u chủng nấm Đông tr ng hạ thảo (Cordyceps militaris) mọc tự nhiên ở các v ng sinh thái khác nhau, tuy vậy việc phân lập, nhân giống và định danh loài cũng như nuôi trồng chủng cho năng suất quả th cao, chất lượng hoạt t nh tốt c n hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đ tài “Phân lập - nhân giống và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) ở Việt Nam” với mục đ ch định danh được nh ng chủng giống nấm Đông tr ng hạ thảo thu nhận ngoài tự nhiên Việt Nam đ nuôi trồng cho năng suất quả th cao và hàm lượng các hoạt chất Cordycepin, Adenosine tốt, sẽ góp ph n thúc đẩy sản xuất nh ng loài nấm này tại Công ty Cổ Ph n Dược Thảo Thiên Phúc cũng như ở Việt Nam.
2 Phần I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan chung về Cordyceps militaris 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu Nấm đông tr ng hạ thảo được xem là rất quý hiếm. Nh ng câu truyện mang tính th n thoại và truy n thuyết liên quan đến loài nấm này được lưu truy n trong nhi u thiên niên kỷ. Hiện nay, các ghi nhận v thời gian phát hiện đ u tiên loài nấm này chưa được thống nhất. Theo Das (2009) thì nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps được biết đến từ nh ng năm 2000 trước công nguyên. Nhưng theo Holliday và cộng sự (cs.) (2004) tổng hợp từ nhi u nguồn tài liệu ghi nhận đ u tiên v nấm đông trùng hạ thảo được thực hiện tại Trung Quốc vào năm 620 sau công nguyên, vào tri u đại nhà Đường. Sự ghi nhận này đã làm rõ bản chất sinh học từ nh ng câu truyện huy n thoại và truy n thuyết v đông tr ng hạ thảo. Đông tr ng hạ thảo là một sinh vật tồn tại hàng năm được chuy n một cách th n bí từ động vật sang thực vật vào m a h và sau đó lại từ thực vật chuy n sang động vật vào m a đông. Tiếp sau đó có nhi u công trình được xuất bản với nội dung v loài nấm đông tr ng hạ thảo này của các học giả xứ Tây Tạng từ thế kỷ 15 đến thế kỷ 18, trong đó có công trình đ u tiên được cho là có cơ sở khoa học tin cậy nhất mô tả v nấm đông tr ng hạ thảo của Wu-Yiluo năm 1757, trong cuốn sách Dược đi n, dưới tri u đại Thanh. Theo sau các học giả xứ Tây Tạng, việc phát hiện ra giá trị của đông trùng hạ thảo thuộc v nh ng người chăn b trên núi Hymalaya ở Tây Tạng cũ và Nepal, họ thấy rằng nh ng chú bò gặm cỏ ăn phải cây nấm đông trùng hạ thảo vào m a xuân đã trở nên cuồng nhiệt, b đực luôn tìm và theo sát bò cái (Holliday J. và cs, 2004) 1.1.2. Phân loại Chi nấm Cordyceps đã được thu m u và định loại trên 400 loài khác nhau. Theo hệ thống phân loại truy n thống, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae (Sung J.H. và cs, 2007).
3 Phân loại nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris: Giới : Fungi Ngành: Ascomycota Phân ngành: Ascomycotina Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipataceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps militaris. 1.1.3. Đặc điểm và phân bố của Cordyceps militairs Nấm Đông tr ng hạ thảo là các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng, lớp nhện. Vào m a Đông nấm xâm nhiễm, k sinh vào cơ th côn trùng và làm cho côn trùng chết và nấm tồn tại trong cơ th côn trùng dạng hệ sợi và là giai đoạn vô t nh. Đến mùa Hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, hợi sợi nấm vô tính tiến hành giao phối và chuy n giai đoạn h u tính, hình thành cây nấm (chất đệm) là cơ quan chứa bào t vô tính và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc v n dính li n vào thân sâu. Chính vì vậy mà nấm có tên gọi Đông tr ng hạ thảo (Phạm Quang Thu và cs, 2013). Nấm đông tr ng hạ thảo thường phát hiện vào mùa hè ở một số cao nguyên có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt bi n; đó là các v ng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Cam Túc, Vân Nam... Đây ch nh là nguồn đông tr ng hạ thảo tự nhiên (Nguyễn Mậu Tuấn và cs, 2013). Ngoài ra còn phát hiện tại các vùng núi cao thuộc Ấn Độ, Nepal, Bhutan. Hiện nay, khoảng hơn 400 loài đã được tìm thấy, trong đó có khoảng 90 loài được phát hiện ở Trung Quốc (Zhou X. và cs, 2009). Tại Việt Nam, đông tr ng hạ thảo cũng đã được phát hiện tại nhi u địa đi m khác nhau. Năm 2009, Phạm Quang Thu và cs đã phát hiện 3 chủng là Cordyceps nutans Pat. tại khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên T - Sơn Động - B c Giang, Cordyceps gunni Berk. tại vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc, Cordyceps militaris Link. tại vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai. Năm 2009, Đái Duy Ban và cộng sự cũng công bố phát hiện mới của mình v loài đông trùng
4 hạ thảo l n đ u tiên được tìm thấy ở Việt Nam đó là loài đông tr ng hạ thảo có tên là Isaria cerambycidae. Năm 2010, Phạm Thị Thùy Viện phát hiện được 2 giống là Cordyceps nutans ở Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) và Cordyceps militaris ở Vũ Quang (Hà Tĩnh). 1.1.4. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris Các hợp chất dược liệu của loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong đi u trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá trị kinh tế cao. Nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên. Do đó, việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và đi u trị bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đ cấp thiết. Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin (3′-deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt t nh kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, đi u h a miễn dịch (Shonkor et al, 2010). oạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có t nh kháng DPPH, hoạt t nh kh và tạo phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85% (Fengyao et al., 2011). Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi d ng chế phẩm từ Cordyceps militaris, số lượng tinh tr ng tăng, số ph n trăm tinh tr ng di động và hình dạng bình thường tăng . Hiệu quả này được duy trì thậm ch sau 2 tu n ngưng s dụng chế phẩm. Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian s dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh tr ng ở lợn (Lin et al, 2007). ạn chế vius cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy m m có khả năng ứng dụng trong đi u trị cúm A. Chất này góp ph n đi u h a hoạt động miễn dịch của các đại thực bào (Yuko et al, 2007). Kháng khuẩn kháng nấm và kháng ung thư: C. militaris: protein (CMP) tách chiết từ nấm có k ch thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt t nh trong khoảng pH 7-9. Protein này ức chế nấm Fusariumoxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng quan (Byung-Tae et al, 2009). Hợp chất cordycepin c n cho thấy khả năng
5 kháng vi khuẩn Clostridium. Các hợp chất d n xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc đi u trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột (Young-Joonet al., 2000). Cordycepin ngăn sự bi u hiện của gen T2D chịu trách nhiệm đi u h a bệnh ti u đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất đi u h a miễn dịch d ng trong đi u trị các bệnh v miễn dịch (Seulmee et al., 2009). Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt t nh g n fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin. Enzyme này có khả năng s dụng trong đi u trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme này có th sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế h u hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được s dụng cho bệnh tim lão hóa ở người (Jae-Sung et al., 2006). Tính kháng viêm: Đ xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ quả th nấm Cordyceps militaris (CMWE) được th nghiệm v tác dụng ki m soát lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm k ch th ch việc sản xuất nitric oxide), việc phóng th ch yếu tố hoại t khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW 264,7. Các đại thực bào được x l với nồng độ khác nhau của CMWE làm giảm đáng k LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết. Nh ng kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào (Wol et al., 2010). Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc d nấm Cordyceps sinensis được s dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên các ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tương tự nhau. Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris có th được s dụng trong các trường hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt (Mizuno, 1999; Das et al., 2010). 1.1.5. Các hoạt chất chính trong nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Theo số liệu nghiên cứu v thành ph n hóa học của th quả nấm C.militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành ph n như protein chiếm 40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam),
6 vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), cordycepic acid (11,8%), polychaccaride (30%) (Shih et al, 2007) Acid amin: Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả th nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g trong quả th và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm). Khối lượng acid amin mỗi loại trong quả th và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15-15,06 mg/g và 0,36-2,99 mg/g. Thành ph n acid amin của mỗi loại trong quả th bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) in the fruiting body. Số liệu phân t ch của Chang và cộng sự (2001) cho thấy ph n lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001). Acid béo: Quả th nấm Cordyceps militaris chứa nhi u acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trongquả th và 21,5% trong sinh khối. Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả th và 33,0% trong sinh khối (Hur, 2008) Adenosine và cordycepin: Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược t nh cao của nấm Cordyceps militaris. Adenosine chiếm 0,18% trong quả th và 0,06% trong sinh khối nấm. Đối với hợp chất cordycepin, trong quả th có hàm lượng cao gấp 3 l n so với sinh khối (0,97% so với 0,36%) (Hyun et al, 2008). Polysaccharide: Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành ph n từ các đơn phân là các đường monosaccharide, mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng li u d ng chiết xuất. Yan và cộng sự cho rằng tác dụng này có th do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm (Yan et al, 2008)
7 1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt Nam và trên thế giới 1.2.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên thế giới Các công trình nghiên cứu trên thế giới v loại nấm này chứng minh được công dụng vượt trội của nấm đông tr ng hạ thảo là một nguồn dược liệu quý. Nh ng năm g n đây, rất nhi u tính chất dược lý của loài nấm này được nghiên cứu một cánh khoa học và đã được công bố trên các tạp ch chuyên ngành như: Năm 2004, Yoo H.S và cs công bố: Dịch chiết từ th quả Cordyceps militaris có tác dụng chống ung thư, hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu mới bằng cách giảm sự bi u hiện của bFGF, một trong nh ng nhân tố kích thích quá trình này. Do có vai trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có th ngăn chặn được quá trình di căn và sự phát tri n của tế bào ung thư. Ngoài ra, dịch chiết nấm Đông tr ng hạ thảo còn có tác dụng kìm hãm sự phát tri n của tế bào ung thư vú, ung thư phổi (Ahn Y.J. và cs, 2001). Mặt khác, dịch chiết bằng nước ấm nấm Cordyceps militaris có tác dụng kìm hãm sự phát tri n của dòng tế bào ung thư máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết của các tế bào thông qua sự hoạt hoá enzym caspase-3 (Lee H. Và cs, 2006). Năm 2005, công trình nghiên cứu của Won S.Y và Park E.H. cho thấy Cordyceps militaris có tác dụng chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy. Ahn Y.J. và cs (2000) cho rằng nấm Đông tr ng hạ thảo có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát tri n của một số virut, vi khuẩn và nấm. Ngoài ra nấm Đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipit, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004). Vì vậy, việc nuôi trồng loài nấm quý hiếm này đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ quy mô phòng thí nghiệm thu sinh khối sợi nấm, tới quy mô lớn hơn là thu quả th nấm. Nuôi trồng quả th nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris được tiến hành ở nhi u nước trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ... Tại
8 Trung Quốc có các trang trại lớn chuyên nuôi trồng loài nấm này ở các tỉnh: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tô... Chỉ tính một trang trại nuôi trồng loài nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một năm thu được 100000 kg sản phẩm. Sản phẩm nấm đông tr ng hạ thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhi u nước trên thế giới k cả các nước phương Tây và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm (Phạm Quang Thu, 2013). Patcharaporn Wongsa (2005) tại Thái Lan đã nghiên cứu phân lập và sự sinh trưởng của hệ sợi, hình thành bào t chồi của nấm Cordyceps unilateralis ký sinh kiến. Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast Extract Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (Malt Extract Agar) được d ng đ phân lập và nuôi cấy hệ sợi. Tại Hàn Quốc, Jae Sung Kim và cs (2006), đã s dụng nhộng tằm đ nuôi trồng th quả nấm Cordyceps militaris. Nhộng tằm được đựng trong các lọ nuôi cấy, kh trùng ở 12oC trong thời gian 90 phút, đ nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi nấm ăn k n toàn bộ giá th trong đi u kiện nhiệt độ 20-250C, cường độ ánh sáng 500-700 lux đã hình thành m m th quả. Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành ph n như sau: 40 g/l t đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O. Duck-Hyun Cho và cs (2003), đã tiến hành nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi của 3 chủng ký hiệu là CHO-7208; CHO-7845; CHO-7846 của loài Cordyceps militaris trên môi trường dinh dưỡng và quá trình hình thành th quả nấm Cordyceps militaris với giá th là sâu non loài Allomyrina dichotoma Linnaeus. Kết quả cho thấy sự sinh trưởng của hệ sợi của các chủng khác nhau là khác nhau trong nuôi cấy thu n khiết. Chỉ có 2 chủng CHO- 7208 và CHO-7846 hình thành th quả khi s dụng sâu non Allomyrina dichotoma Linnaeus làm giá th . Chi u dài của th quả đạt 51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy. Tại thành phố Hayward, bang California, Mỹ, Công ty công nghệ sinh học BIOKEN đã nuôi trồng quy mô công nghiệp loài nấm Cordyceps militaris. Sản phẩm được tiêu thụ trong nước và thị trường quốc tế.