Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phân loại một số loài cá thuộc giống cá bỗng (Spinibarbus) ở Việt Nam dựa trên gen ty thể (COI, 16S rRNA)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:80

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định chỉ thị mã vạch phân tử (DNA barcoding marker) cho một số loài thuộc giống cá Bỗng (Spinibarbus) dựa trên phân tích hai gen ty thể: cytochrome c oxidase subunit I (COI) và 16S rRN. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu phân loại một số loài cá thuộc giống cá bỗng (Spinibarbus) ở Việt Nam dựa trên gen ty thể (COI, 16S rRNA)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------------------------------- NGU N TH TH INH NGHI N C U PH N OẠI TS O I C THU C GI NG C NG SPINIBARBUS VI T NA A TR N G N T TH (COI, 16S rRNA) UẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------------------------------- NGU N TH TH INH NGHI N C U PH N OẠI TS O I C THU C GI NG C NG SPINIBARBUS VI T NA A TR N G N T TH COI, 16S rRNA) Chuyên ngành: CÔNG NGH SINH HỌC ã số: 60 42 02 01 UẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG ẪN KHOA HỌC TS KI TH PHƯ NG OANH THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
i ỜI CẢ N Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến TS. Kim Th Phương Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người cô đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, chỉ bảo và giúp đỡ nhiệt tình của tập th cán bộ Phòng Hệ gen học môi trường - Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, c ng các cán bộ của các phòng ban khác, thuộc Viện Nghiên c u hệ Gen đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi c ng xin chân thành cảm ơn nhà ngư loại học TS. Nguy n Văn Hảo và TS. Nguy n Th iệu Phương thuộc Viện Nghiên c u Nuôi tr ng Thủy sản I c ng anh H nốt - người dân tộc Vân Kiều đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong việc thu thập và phân loại hình thái các mẫu cá nghiên c u. Cuối c ng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và tập th lớp Cao học Công nghệ sinh học K6B đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Th i Ngu n ng 17 tháng 11 năm 2015 H viên Nguy n Th Th y inh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ii ỜI CA ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được trình bày dựa trên kết quả nghiên c u khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của chuyên môn của TS. Kim Th Phương Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u hệ Gen, c ng với sự hướng dẫn k thuật của các cán bộ trong phòng Hệ gen học môi trường. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực, không sao chép t bất c tài liệu, công trình nghiên c u của người khác mà không chỉ rõ ngu n tham khảo. Tôi xin ch u trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đ ng nhà trường. Thái Nguyên, ngày 17 tháng 11 năm 2015 H viên Nguy n Th Th y inh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iii C C ỜI CẢ N ........................................................................................................................ i ỜI CA ĐOAN ................................................................................................................ ii C C ............................................................................................................................. iii ANH C C C K HI U C C CH VI T TẮT .......................................... v ANH C C C ẢNG ............................................................................................... vi ANH C C C H NH ............................................................................................... vii Đ U ................................................................................................................................. 1 Chương 1: T NG QUAN T I I U ........................................................................... 3 1.1. T ng quan về giống cá ng ...................................................................................... 3 1.1.1. V tr phân loại và phân bố.............................................................................. 3 1.1.2. Đ c đi m sinh học ............................................................................................. 4 1.1.3. Giá tr kinh tế...................................................................................................... 5 1.2. Nghiên c u phân loại cá .............................................................................................. 5 1.2.1. Khái niệm về hệ thống phân loại cá ............................................................. 5 1.2.2. Đ c đi m hình thái thường d ng trong phân loại cá................................ 6 1.2.3. Phân loại học phân t trong phân loại cá.................................................... 6 1.2.4. Tình hình nghiên c u phân loại cá Việt Nam ........................................ 9 1.3. Đ c đi m hệ gen ty th và vai trò của gen ty th trong phân loại phân t .... 11 1.3.1. Đ c đi m hệ gen ty th .................................................................................. 11 1.3.2. S d ng gen ty th trong phân loại phân t ............................................. 12 1.3.3. Hệ gen ty th của một số loài thuộc giống cá ng Spinibarbus).... 12 Chương 2: VẬT I U V PHƯ NG PH P NGHI N C U .......................... 14 2.1. Vật liệu ........................................................................................................................... 14 2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................................... 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iv 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................. 15 2.1.3. Thiết b , d ng c nghiên c u ....................................................................... 16 2.2. Phương pháp nghiên c u ........................................................................................... 17 2.2.1. Phương pháp nghiên c u hình thái ............................................................. 17 2.2.2. Phương pháp nghiên c u sinh học phân t ............................................... 17 Chương 3: K T QUẢ NGHI N C U V THẢO UẬN.................................. 27 3.1. Kết quả phân loại về m t hình thái.......................................................................... 27 3.2. Kết quả tách chiết N t ng số .............................................................................. 28 3.3. Kết quả khuếch đại gen 16S rRN và COI b ng k thuật PCR...................... 29 3.4. Kết quả tinh sạch sản ph m PCR............................................................................. 30 3.5. Kết quả giải trình tự gen ............................................................................................ 31 3.5.1. Kết quả giải mã đoạn gen 16S rRN của ba mẫu cá nghiên c u ..... 31 3.5.2. Kết quả giải mã đoạn gen COI của ba mẫu cá nghiên c u ................. 34 3.6. Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa trên đoạn gen 16S rRN và COI .................................................................................... 38 3.6.1. Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa trên đoạn gen 16S rRN ......................................................................... 38 3.6.2. Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa trên đoạn gen COI ...................................................................................... 43 3.7. Đánh giá t nh hiệu quả của N barcoding s d ng đ phân loại giống cá ng Spinibarbus) ............................................................................................... 48 K T UẬN V KI N NGH ....................................................................................... 49 T I I U THA KHẢO .............................................................................................. 50 PH C ............................................................................................................................. 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
v ANH C C C K HI U C C CH VI T TẮT COI Cytochrome c Oxidase subunit I DNA Deoxyribonucleic Acid bp basepair dNTP deoxynucleotide triphosphate ddNTP dideoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene-Diamine-Tetra-Acetic acid epp eppendorf EtBr Ethidium Bromide Kb Kilobase K2P Kimura 2-Parameter mM milliMol ML Maximum Likelihood MP Maximum Parsimony mtDNA mitochondrial DNA ng nanogram NJ Neighbour Joining OD Opitical Density PCR Polymerase Chain Reaction pmol picomol Primer F Primer Forward Primer R Primer Reverse SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris base-Acetic acid-EDTA µl microliter Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vi ANH C C C ẢNG ảng 2.1: Các hóa chất được s d ng ................................................................. 15 ảng 2.2: Các thiết b , d ng c được s d ng .................................................... 16 ảng 2.3: Các c p m i s d ng trong nghiên c u .............................................. 19 ảng 2.4: Thành phần phản ng PCR ................................................................. 22 ảng 3.1: ảng kết quả xác đ nh n ng độ và O 260/280 N t ng số của các mẫu cá nghiên c u ............................................................................... 28 ảng 3.2: ảng kết quả xác đ nh n ng độ và O 260/280 sản ph m PCR của các mẫu cá nghiên c u sau khi đã được tinh sạch ............................... 30 ảng 3.3: ảng thống kê một phần kết quả L ST đối với đoạn gen 16S rRN của ba mẫu nghiên c u.............................................................. 32 ảng 3.4: ảng thống kê một phần kết quả L ST đối với đoạn gen COI của ba mẫu nghiên c u ........................................................................ 35 ảng 3.5: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền một số node trên cây phát sinh chủng loại Hình 3.4 cho sự phân tách rõ các loài trong c ng một giống ............................................................. 41 ảng 3.6: Khoảng cách di truyền K2P gi a các loài cá nghiên c u và 4 loài thuộc giống cá ng đã được đ nh danh trên Gen ank t bộ d liệu trình tự đoạn gen 16S rRNA ......................................................... 42 ảng 3.7: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền một số node trên cây phát sinh chủng loại Hình 3.5 cho sự phân tách rõ các loài trong c ng một giống ............................................................. 46 ảng 3.8: Khoảng cách di truyền K2P gi a các loài cá nghiên c u và 4 loài thuộc giống cá ng đã được đ nh danh trên Gen ank t bộ d liệu trình tự đoạn gen COI ................................................................... 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vii ANH C C C H NH Hình 1.1: Sự phân bố của giống cá ng Spinibarbus) [26]. .............................. 4 Hình 1.2: Đ c đi m hình thái đ c trưng của giống cá ng ................................. 4 Hình 2.1: Các mẫu cá s d ng trong nghiên c u ................................................ 14 Hình 2.2: Sơ đ thiết kế m i khuếch đại hai đoạn gen 16S rRN và COI ........ 20 Hình 2.3: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen 16S rRN b ng phản ng PCR ..................................................................................... 22 Hình 2.4: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen COI b ng phản ng PCR...... 23 Hình 3.1: Kết quả điện di ki m tra sản ph m tách N t ng số trên gel agarose 0,8% ........................................................................................ 28 Hình 3.2: Kết quả điện di ki m tra sản ph m PCR trên gel agarose ,8 ......... 29 Hình 3.3: Kết quả điện di ki m tra sản ph m PCR sau khi đã tinh sạch ............ 31 Hình 3.4: Cây phát sinh chủng loại NJ xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen 16S rRN của 3 mẫu cá nghiên c u và 4 loài cá khác thuộc họ cá Chép ................................................................................. 39 Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại NJ xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen COI của 3 mẫu cá nghiên c u và 4 loài cá khác thuộc họ cá Chép ....... 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1 Đ U 1. h n tài Giống cá ng (Spinibarbus là một trong nh ng giống cá thuộc họ cá Chép Cyprinidae). Các loài cá thuộc giống cá ng phân bố chủ yếu các sông lớn ph a nam Trung Quốc, ph a bắc Việt Nam và Lào. Theo kết quả nghiên c u gần đây, Việt Nam giống cá ng hiện có 13 loài, trong đó có 3 loài mới phát hiện có khả năng là loài mới. Việt Nam, cá ng được mệnh danh là một trong 5 loại cá vua của sông suối Tây ắc rất được ưa chuộng, cho thấy giá tr kinh tế cao của cá ng nói riêng c ng như các loài thuộc giống cá ng nói chung. Giống cá ng là một trong nh ng giống cá qu hiếm, một số loài thuộc giống cá ng hiện nay được ghi trong sách Đỏ Việt Nam, có nguy cơ tuyệt chủng m c độ V và đ ng thời n m trong danh sách đỏ có nguy cơ tuyệt chủng của IUCN International Union for Conservation of Nature). Trước thực tế một số loài thuộc giống cá ng có hình thái bên ngoài tương đối giống nhau, nếu chỉ dựa vào đ c đi m hình thái s g p khó khăn khi phân loại cấp độ loài ho c mẫu phân loại có k ch thước nhỏ. Hơn n a, một số loài thuộc giống cá ng mới được phát hiện, xét về m t hình thái có khả năng là loài mới cần được kh ng đ nh lại m c độ phân t . Nh m cung cấp ngu n d liệu về m t di truyền, h trợ việc nhận dạng một số loài cá thuộc giống cá ng và kh ng đ nh lại một số loài được cho là loài mới thuộc giống cá ng được phát hiện Việt Nam. Chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên u h n i t số ài thu giống ng (Spinibarbus ở Việt Na ựa trên gen ty thể COI 16S rRNA . 2. tiêu a tài Xác đ nh chỉ th mã vạch phân t N barcoding marker) cho một số loài thuộc giống cá ng Spinibarbus dựa trên phân t ch hai gen ty th : cytochrome c oxidase subunit I (COI) và 16S rRN . 3. Đối tư ng và h vi nghiên u Một số loài được phân loại sơ bộ về m t hình thái thuộc giống cá ng (Spinibarbus) ho c được đánh giá có mối quan hệ di truyền rất gần g i với giống cá ng được thu thập tại sông Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Tr , bao g m: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2  Cá ng nguy n Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n)  Cá Chầy đất Spinibarbus hollandi Oshima, 1919)  Cá Cầy (Paraspinibarbus macracanthus) Loài cá Cầy (Paraspinibarbus macracanthus về m t hình thái được phân loại thuộc giống cá ng Spinibarbus b i Pellegrin và Chevey vào năm 1936 với tên khoa học là Spinibarbus macracanthus. Đến năm 1989, dựa trên sự khác biệt về đ c đi m hình thái của loài cá Cầy với các loài cá thuộc giống Spinibarbus nên loài cá Cầy đã được phân loại lại và được tách thuộc một giống riêng với tên gọi Paraspinibarbus trong họ cá Chép Cyprinidae) [21]. 4. N i ung nghiên u  Phân lập và xác đ nh một phần trình tự của hai gen ty th COI, 16S rRN 3 loài cá : cá ng nguy n (Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n), cá Chầy đất Spinibarbus hollandi Oshima, 1919 , cá Cầy Parapinibarbus macracanthus).  Phân t ch gen ty th COI và 16S rRNA nh m xác đ nh chỉ th mã vạch phân t N barcoding marker d ng đ phân biệt loài trong giống Spinibarbus. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3 Chương 1 T NG QUAN T I I U 1.1. T ng uan v giống ng 1.1.1. V tr h n i và h n ố  Ngành động vật có dây sống Chordata) Lớp cá Xương (Actinopterygii) ộ cá Chép Cypriniformes) Họ cá Chép Cyprinidae) Phân họ cá ng Barbinae) Giống cá ng Spinibarbus) Theo d liệu trên ish ase, giống cá ng hiện có 11 loài [25]. Việt Nam, trong khuôn kh dự án ảo t n và phát tri n ngu n lợi thủy sản v ng cao High RCS được thực hiện Đakrông, tỉnh Quảng Tr b i Viện Nghiên c u Nuôi tr ng Thủy sản I, giống cá ng được phát hiện có 13 loài, trong đó có 1 loài đã được thống kê trên ish ase và ba loài có khả năng là loài mới đã được phân loại sơ bộ về m t hình thái bao g m: cá ulu (Spinibarbus hoenoti sp.n), cá ng nguy n (Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n) và cá ng vây đen (Spinibarbus nigripinnis sp.n) [12]. Đối với ba loài cá mới được phát hiện, cần có nh ng nghiên c u về m t di truyền đ kh ng đ nh đây là cá loài mới.  Nhìn chung, các loài thuộc giống cá ng sống trung và thượng lưu các sông lớn ph a nam Trung Quốc, ph a bắc Việt Nam và Lào. Sự phân bố của giống cá ng được th hiện Hình 1.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 H nh 1 1: Sự phân bố của giống cá ng Spinibarbus) [26]. Việt Nam, các loài thuộc giống cá ng thường sống trung và thượng lưu các con sông lớn các tỉnh ph a bắc Việt Nam như sông H ng Yên ái tr lên , sông Lam Nghệ n hay sông Trà Khúc Quảng Ngãi , 1.1.2. Đ iể sinh h  Xét về m t hình thái, đ c đi m chung nhất của tất cả các loài thuộc giống cá ng được s d ng đ phân biệt giống cá ng với các giống cá khác thuộc họ cá Chép Cyprinidae) là chúng đều có gai ngược ph a trước vây lưng và vây hậu môn có 5 tia phân nhánh Hình 1.2 . H nh 1 2: Đ c đi m hình thái đ c trưng của giống cá ng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5  : Giống cá ng thường sống v ng nước chảy và trong. Đây là giống cá ưa nước sạch, do đó ngu n nước trong ao ho c b nuôi cá phải liên t c được lưu thông [14].  ă : Th c ăn chủ yếu của các loài thuộc giống cá ng là các loài động vật không xương sống, ấu tr ng, côn tr ng trư ng thành, giun t tơ, giáp xác, tôm, ốc, hến,  : Nhìn chung, các loài thuộc giống cá ng thành th c muộn, nuôi khoảng 1 năm mới bắt đầu sinh đ và t lệ sống thấp v d như cá ng khoảng 3 -4 . Đây là khó khăn lớn nhất trong việc phát tri n nuôi các loài cá thuộc giống cá ng [9]. 1.1.3. Gi tr inh t Nhìn chung, các loài thuộc giống cá ng giàu giá tr dinh dưỡng, chất lượng th t thơm ngon, do vậy giá tr về m t kinh tế của giống cá ng là rất cao. Hiện nay, các loài cá thuộc giống cá ng nước ta đang được m rộng nghiên c u và chuy n giao công nghệ nhân giống và nuôi cá đ tr thành các loài cá thương ph m. Đi n hình là mô hình nuôi cá ng được phát tri n trong nh ng năm gần đây một số tỉnh miền núi như: Hà Giang, Yên ái, Hòa ình, Thanh Hóa. Theo c c Thủy sản Hòa ình, cá ng hiện nay là một trong nh ng đối tượng nuôi l ng ch nh của tỉnh, m i năm có th cung cấp ra th trường 5-6 tấn cá thương ph m [9]. 1.2. Nghiên u h n i 1.2.1. Kh i niệ v hệ thống h n i Hệ thống phân loại cá là một hệ thống g m các cấp phân loại t thấp đến cao theo th tự sau: loài, giống, họ, bộ, lớp, ngành, giới. Theo đó, loài được xem là cấp phân loại cơ bản nhất. các hệ thống phân loại cá hiện nay, ngoài các cấp phân loại ch nh k trên, chúng ta có th g p các cấp phân loại ph như: ngành ph , lớp ph , bộ ph , họ ph , loài ph . T một loài có th chia ra làm hai hay nhiều loài ph . Loài ph là tập hợp của nhiều cá th có nhiều đ c đi m phân loại giống nhau và c ng phân bố một v ng đ a l nhất đ nh. Gi a các loài ph trong c ng một loài s có một vài sai khác phân loại [7]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6 Trên thế giới có hai hệ thống phân loại cá được s d ng ph biến là: hệ thống phân loại cá của Lindberg 1971 và hệ thống của schmeyer 1998 . Tuy nhiên hệ thống phân loại cá của Eschmeyer (1998) được s d ng ph biến, vì các tác giả này đã dựa trên nh ng nghiên c u mới nhất về giải phẫu, sinh l , sinh hóa, di truyền, đ sắp xếp các loài cá vào hệ thống phân loại. Ch nh vì thế, hệ thống phân loại cá này v a mang t nh hiện đại, v a có độ tin cậy cao hơn. 1.2.2. Đ iể h nh th i thư ng ng tr ng h n i   Đếm tia vi của các vi như: vi lưng, vi hậu môn, vi ngực, vi b ng  Đếm v y:  V y đường bên: Đếm tất cả nh ng v y có ống cảm giác t sau l mang đến gốc của các tia vi đuôi.  V y trên đường bên: Đếm nh ng v y thuộc hàng v y n m bên trên của đường bên.  V y quanh cuống đuôi: Đếm nh ng v y quanh phần cuống đuôi.   Đo các chỉ tiêu thuộc về chiều dài như: Chiều dài toàn thân cá, chiều dài cá bỏ đuôi, chiều dài đầu, chiều dài mõm, chiều dài cuống đuôi, chiều dài tia dài nhất của vây đuôi, chiều dài tia gi a vây đuôi.  Đo các chỉ tiêu thuộc về chiều cao và khoảng cách như: Chiều cao thân, chiều cao đầu qua gi a mắt, chiều cao đầu qua bờ trước và bờ sau của mắt, chiều cao cuống đuôi, đường k nh mắt, khoảng cách gi a hai mắt.   Quan sát hình dạng toàn thân và hình dạng của các cơ quan trên cơ th cá.  Quan sát màu sắc toàn thân và màu sắc của các cơ quan trên cơ th cá [7]. 1.2.3. Ph n ih h n t tr ng h n i Phân loại học phân t molecular taxonomy là phương pháp phân loại các loài sinh vật dựa trên các d liệu m c độ phân t N , protein [37]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7 ựa trên các kết quả phân t ch, so sánh trình tự N ho c protein của sinh vật, hệ thống phân loại của nhiều họ sinh vật đã được sắp xếp lại. Năm 2 8, Cooper và cộng sự đã công bố nghiên c u sự phát sinh loài của họ cá Pomacentridae thuộc bộ cá Perciformes). N t ng số của tất cả 1 4 loài thuộc tất cả các giống n m trong họ cá Pomacentridae và 1 loài ngoài nhóm t các họ cá khác thuộc bộ cá Perciformes bao g m họ cá Cichlidae, Embiotocidae và Labridae) đã được tách chiết. Sau đó ba đoạn gen nhân g m: rag1 9 3 bp , rag2 8 2 bp , bmp4 553 bp và ba đoạn gen ty th g m: 12S rRN 1 27 bp , 16S rRN 598 bp , N 3 4 8 bp được khuếch đại và giải trình tự. D liệu trình tự các gen thu được được d ng đ xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Maximum Likelihood ML và Maximum Parsimony (MP) b ng cách s d ng phần mềm Mr ayes v3.1.2, Garli v .951 và PAUP* v4.0b10. Kết quả cây phân loại cho thấy có 5 nhánh ch nh trong họ cá Pomacentridae được tạo ra trên cây phân loại với 5 họ ph , bao g m: Stegastinae, Lepidozyginae, Chrominae, Abuderdufinae và Pomacentrinae. Kết quả phân t ch số liệu ML và ayesian cho thấy các loài trong nhánh lớn chủ yếu là các loài cá lớn, các loài cá ăn sinh vật đáy thuộc 9 giống [22]. Năm 2 12, Costa và cộng sự đã s d ng DNA barcoding đ xây dựng một hệ thống cấp bậc cho các loài cá bi n Portugal, thông qua việc phân t ch v ng trình tự gen COI- 5P của 1 2 loài cá được nhận dạng về m t hình thái. Các mẫu cá thu thập được tách N t ng số t mô th t. Sau đó, khuếch đại b ng phản ng PCR v ng gen COI 652 bp . Tất cả sản ph m PCR được tinh sạch và được đọc trình tự t cả m i xuôi và m i ngược. Kết quả xác đ nh trình tự được dóng hàng s d ng MEGA v4.1 và đưa lên GenBank và OL (Barcode of Life Data Systems). Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên phương pháp Neighbour Joining (NJ) với giá tr bootstrap 1 lần và khoảng cách di truyền được t nh toán theo thuật toán Kimura 2-Parameter K2P được s d ng đ phân t ch sự phát sinh loài. Kết quả phân t ch cây phát sinh chủng loại cho thấy 1 2 loài cá nghiên c u thuộc 79 giống, 54 họ và 22 bộ; khoảng cách di truyền trung bình trong c ng loài và khoảng cách di truyền trung bình khác loài được t nh theo thuật toán K2P tương ng là ,32 và 8,84%. Tất cả các mẫu đã được sắp xếp thành 5 cấp độ khác nhau -E), theo độ tin cậy và sự ph hợp gi a nhận dạng hình thái loài c ng chu n đoán tương ng dựa trên N barcoding của chúng, cấp độ chiếm 73,5 bao g m các loài được nhận dạng rõ ràng về m t hình thái, cấp độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8 chiếm 7,8% g m các thành phần trong nhóm ph hợp với sự phân loại dựa trên N barcoding nhưng còn cần sự kh ng đ nh lại của nh ng nghiên c u tiếp theo, còn lại là các loài nhận dạng với các cấp độ thấp của độ tin cậy cấp độ C đến chiếm 18,7% [23]. Với nh ng đ c t nh hình thái th hiện một cách không rõ ràng trong mô tả cấp độ loài sinh vật, thông tin trình tự N có nh ng đóng góp quan trọng trong việc chu n đoán đ c t nh của loài. một số t các loài chưa được phân loại rõ, thông tin t N có th coi như căn c đ mô tả trong phân loại. o đó, phương pháp phân loại phân t kết hợp với phương pháp phân loại truyền thống trong việc xác đ nh và mô tả một loài sinh vật, đ c biệt là các loài mới được xem là rất cần thiết [27]. Năm 2 3, Paul Hebert, nhà nghiên c u tại Đại học Guelph Ontario, Canada đã đề xuất khái niệm N barcoding mã vạch N như là một cách đ xác đ nh loài thông qua việc so sánh các trình tự một đoạn N ngắn (DNA barcoding t một mẫu chưa biết với một thư viện các trình tự DNA của các loài đã biết. Điều này cho phép đ nh danh một sinh vật tại bất kỳ giai đoạn phát tri n nào t một mẫu mô rất nhỏ, dạng tươi ho c dạng bảo t n trong nhiều năm trước [1]. T khái niệm này có th thấy N barcoding đóng vai trò như một công c mang t nh ng d ng cao h trợ hiệu quả cho công tác phân loại sinh vật. Cá, d liệu di truyền s d ng k thuật N barcoding đã và đang được b sung và s d ng một cách có hiệu quả trong việc nhận dạng và xác đ nh loài mới. Năm 2 11, Zhang đã s d ng một đoạn gen COI có k ch thước 652 bp làm N barcoding đ nhận dạng các loài cá bi n Trung Quốc. Đầu tiên, 329 mẫu thuộc 1 loài, bảo quản trong c n 7 được tách chiết N t ng số. Sau đó một đoạn v ng 5 trên gen ty th COI được khuếch đại b ng phản ng PCR, sản ph m PCR sau đó được s d ng đ xác đ nh trình tự. Trình tự giải mã được dóng hàng s d ng phần mềm S QSC P v2.5, sự sai khác của trình tự được t nh theo thuật toán Kimura 2-Parameter (K2P). Cây NJ được tạo ra dựa trên khoảng cách K2P s d ng phần mềm M G . Việc lựa chọn các nhóm phân loại, phân t ch sự phát sinh loài được tiến hành b ng P UP* v4.0b10 s d ng phương pháp MP với bootstrap 1 lần, kết quả đã phân loại 121 loài cá, các loài khác nhau c ng được nhận dạng cấp độ giống [47]. C ng trong thời gian Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9 này Gao và cộng sự đã s d ng một đoạn gen COI 6 9 bp đ h trợ cho phân loại hình thái một loài cá mới thuộc bộ cá Perciformes Trung Quốc. Năm 2 13, Zhu và cộng sự c ng đã s d ng một đoạn gen COI có k ch thước khoảng 650 bp làm N barcoding đ nhận dạng các loài thuộc giống cá Chana [48]. 1.2.4. T nh h nh nghiên u h n i ở Việt Na Thành phần khu hệ cá Việt Nam rất đa dạng và phong phú. o đó, nhiều nghiên c u liên quan đến phân loại cá, đánh giá sự đa dạng của thành phần các loài cá trong theo khu vực đ a l nước ta đã được thực hiện trong suốt thời gian qua: Năm 2 8, Mai Viết Văn và cộng sự đã nghiên c u thành phần loài cá phân bố Sóc Trăng- ạc Liêu. Kết quả đã phát hiện 239 loài cá thuộc 146 giống, 68 họ, 18 bộ. ộ cá Vược Perciformes chiếm số lượng loài lớn nhất với 126 loài chiếm 52,72 , trong đó họ cá Khế Carangidae là họ có số lượng thành phần loài phong phú nhất [16]. Năm 2 11-2012, Hoàng nh Tuấn và Nguy n Xuân Huấn đã công bố danh m c thành phần loài cá của 2 xã a Nam và a Xa, huyện a Tơ, tỉnh Quảng Ngãi, là đ a phận có nhiều sông lớn chảy qua. Kết quả phân t ch số liệu đã xác đ nh bộ cá Chép Cypriniformes là bộ đa dạng nhất với 4 họ chiếm 23,5 và 27 loài chiếm 62,8 [15]. Năm 2 11, ương Văn Long đã xác đ nh thành phần loài cá của lưu vực sông H ng, thuộc đ a phận thành phố Hưng Yên, huyện Kim Động, tỉnh Hưng Yên. Kết quả bước đầu xác đ nh được 51 loài cá, thuộc 47 giống, 24 họ và 1 bộ. Trong đó, bộ cá Chép có số lượng loài lớn nhất chiếm 29, 2 [8]. Năm 2 13, Nguy n Th iệu Phương và cộng sự nghiên c u khu hệ cá sông Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Tr trong khuôn kh dự án ảo t n và Phát tri n ngu n lợi thủy sản v ng cao, cho thấy có 84 loài cá, thuộc 52 giống, 17 họ và 7 bộ khu vực này. Trong đó, cấu trúc taxon bậc họ thì bộ cá Vược Perciformes) nhiều nhất với 7 họ chiếm 36,85 , cấu trúc taxon bậc giống và bậc loài thì nhiều nhất là bộ cá Chép Cypriniformes với 39 giống chiếm 65 và 78 loài chiếm 73,15 [12]. Các nghiên c u đánh giá sự đa dạng của thành phần các loài cá, không chỉ d ng lại việc phân loại, thống kê thành phần các loài cá đã được mô tả, so sánh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10 và đánh giá sự đa dạng của các họ cá, bộ cá đ a đi m nghiên c u. Các nghiên c u còn phát hiện ra các loài cá mới, b sung ngu n d liệu quan trọng làm phong phú thêm cho sự đa dạng thành phần các loài cá của khu hệ cá Việt Nam: Năm 2 7, Nguy n H u ực và cộng sự đã công bố phát hiện một loài cá mới thuộc phân giống Spinibarbichthys Oshima, 1926 thuộc giống Spinibarbus và được đ t tên khoa học là Spinibarbus maensis [11]. Năm 2 12 Nguy n Văn Hảo và V Th H ng Nguyên đã mô tả một loài mới thuộc giống cá ng Spinibarbus Oshima được phát hiện tỉnh Tuyên Quang [4]. Năm 2 13, Nguy n H u ực và cộng sự đã phát hiện loài cá mới Acheilognathus nguyenvanhaoi sp.n, thuộc giống Acheilognathus Bleeker, 1859 n m trong họ cá Chép [2]. C ng trong thời gian này, Nguy n Văn Hảo và cộng sự đã mô tả 3 loài cá mới thuộc giống cá ng Spinibarbus) được phát hiện tỉnh Quảng Tr bao g m: cá ulu (S.hoenoti sp.n), cá ng nguy n (S.nguyenhuuduci sp.n) và cá ng vây đen (S.nigripinnis sp.n) dựa trên các đ c đi m về m t hình thái [5]. Năm 2 15, Nguy n Văn Hảo và cộng sự đã dựa vào các đ c đi m hình thái phát hiện 3 loài cá mới trong giống Silurus bao g m: S.caobangensis sp.n, S.langsonensis sp.n, S.dakrongensis sp.n. Kết quả thu được đã nâng số loài trong giống Silurus nước ta lên 5 loài [3]. ên cạnh đó, các nghiên c u phân t ch các đ c đi m hình thái và đ c đi m di truyền đ c trưng cho t ng loài cá, nh m h trợ cho việc nhận dạng, đ nh danh các loài cá nước ta c ng được tập trung nghiên c u: Năm 2 13, Hà Phước H ng và H Kim Lợi đã nghiên c u hình thái đá tai cơ quan tiếp nhận âm thanh và cân b ng của cá của 26 loài họ cá Chép (Cyprinidae cho thấy có th dựa vào các đ c đi m riêng biệt của t ng loại đá tai đ h trợ cho đ nh danh loài [6]. Năm 2 14, Đ ng V Hà Quyên và cộng sự đã phân loại một số loài cá nước ngọt đ ng b ng sông C u Long dựa vào đ c đi m hình thái và s d ng trình tự gen 16S rRNA (khoảng 6 bp của hệ gen ty th nh m xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá nghiên c u đ ki m ch ng kết quả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
11 phân loại dựa vào hình thái. Cây phân loại cho thấy sự đ ng dạng của các giống cá nghiên c u, tuy nhiên, có sự khác biệt trình tự gen 16S rRN gi a các loài trong nghiên c u và loài tương ng trên GenBank [13]. 1.3. Đ iể hệ gen ty thể và vai tr a gen ty thể tr ng h n i h nt 1.3.1. Đ iể hệ gen ty thể Hệ gen ty th mt N bao g m các N mã hóa cho các protein riêng chỉ có trong ty th , và chúng c ng được nhân lên trong ch nh ty th . Hệ gen ty th ch a các nhóm gen mang t nh n đ nh cao, có hệ số đột biến thấp, sản ph m của chúng có t nh bảo t n ch c năng nghiêm ng t và bảo thủ qua các thế hệ như các gen sao mã các rRN riboxom . N ty th mã hóa cho 2 rRN chỉ có duy nhất trong ribosome của ty th , 2 đến 35 tRN cần cho quá trình vận chuy n trong ty th , và 13 protein ti u đơn v của ph c hợp trong ty th có liên quan đến chu i hô hấp và sự t ng hợp TP . Hệ gen ty th có k ch thước đa dạng, v d : nấm men Saccharomyces cerevisiae là 78 kb, nấm mốc Neurospora crassa là 6 kb, cá ng Spinibarbus denticulatus là 16,5 kb, tất cả các tế bào động vật đều có ch a N ty th , N ty th có tốc độ thay đ i nhanh, chúng cung cấp nh ng sai khác quan trọng trong trình tự mt N gi a các loài. Tốc độ tiến hóa của mt N là nhanh hơn t 5 đến 1 lần genome nhân b i vì ty th không có enzyme s a ch a các sai sót trong quá trình tái bản, hay nh ng sai hỏng đối với phân t N . ng cách đó, mt N có cấp độ thay đ i trình tự nucleotide và cấp độ thay đ i axit amin trong protein mã hóa s cao. động vật có vú, mt N tiến hóa rất nhanh chóng trong giới hạn các nucleotide thay đ i, nhưng sự sắp xếp không gian của các gen và k ch thước của genome là khá n đ nh gi a các loài [28]. Một số gen ty th được ng d ng nhiều có th k đến như: gen cytochrome c oxidase subunit I COI và gen 16S rRNA. COI (hay COX1) là một v ng gen mã hóa cho protein có m t với nhiều bản sao trong m i tế bào. Hiệu quả s d ng gen COI đ phân biệt nhiều mẫu động vật có c ng t tiên được ghi nhận tốt, thậm ch hiệu suất s d ng cao ngay cả với các mẫu đã được lưu gi qua thời gian dài. Nhiều nghiên c u cho thấy COI giúp phân biệt được khoảng 98 các loài với nhau [10]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn