Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống CYP264B1 để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:72

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực với mục tiêu nhằm nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống CYP264B1; ứng dụng hệ xúc tác này để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống CYP264B1 để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------------------- TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------------------- TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÝ THỊ BÍCH THỦY THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dƣới đây là do tôi và nhóm cộng sự nghiên cứu tại phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 5 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015. Thái Nguyên, ngày…. tháng …..năm 201… Học viên Trần Thị Mai Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Lý Thị Bích Thủy – Nghiên cứu viên phòng Sinh hóa thực vật – Viên Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa chất và thiết bị trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn tại phòng. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN. Đoàn Hữu Thanh và các cô chú, anh chị cán bộ phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo trong nhà trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập. Tôi cũng xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đã cung cấp kinh phí để chúng tôi thực hiện nghiên cứu này trong đề tài mã số 106-NN.02-2013.57. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những ngƣời đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Bằng tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày…. tháng …..năm 201… Học viên Trần Thị Mai Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích µg Micro gram µM Micromol µl Microlit AdR Adrenodoxin reductase Adx Adrenodoxin APS Amonium persulphate bp Base pair CYP Cytochrome P450 CPR Cytochrcome P450 reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate FAD Flavin adenin dinucleotid Fdx Ferredoxin FdR Ferredoxin reductase Fldx Flavodoxin FMN Flavin mononucleotide GCMS Gas chromatography mass spectometry HPLC High pressure liquid chromatography IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside kDa Kilo dalton KppG Kali phosphate glycerol LB Lysogeny broth Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
NMR Nuclear Magnetic Resonance NADH Nicotinamide adenine dinucleotide NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PCB Polychlorinate biphenyl PCR Polymerase chain reaction SDS – PAGE Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresis TB Terrific Broth TLC Thin layer chromatography v/p Vòng/phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... II MỤC LỤC .....................................................................................................................V DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................VII DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................... IX MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................3 1.1 Cytochrome P450 ........................................................................................... 3 1.1.1 Định nghĩa và phân loại...................................................................... 3 1.1.2 Cấu trúc của cytochrome P450 ........................................................... 5 1.1.3. Cơ chế xúc tác của cytochrome P450 ............................................... 8 1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450 ........................................................ 8 1.2 Nghiên cứu về CYP264B1 ............................................................................. 10 1.3 Hợp chất sesquiterpene .................................................................................. 13 1.3.1 Định nghĩa và nguồn gốc.................................................................... 13 1.3.2 Phân loại sesquiterpene ...................................................................... 13 1.3.3 Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene .............................................. 15 1.4 Hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450 ...... 16 1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene trên thế giới và ở Việt Nam ........................................................................... 19 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 20 2. 1 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 20 2.1.1 Vật liệu ............................................................................................... 20 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................. 21 2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 22 2.1.4 Dung dịch và đệm.............................................................................. 22 2.1.5 Môi trƣờng .......................................................................................... 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................ 24 2.2.1 Nuôi cấy E.coli ................................................................................... 24 2.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
nhiệt .................................................................................................. 24 2.2.3 Kiểm tra sự có mặt của gene CYP264B1, AdR và Adx .................... 25 2.2.4 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene ...................................................... 27 2.2.5. Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone ....................................... 30 2.2.6 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu ............................. 30 2.2.7 Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene ....................................... 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 34 3.1 Nhân dòng plasmid pETC4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa CYP264B1, AdR và Adx............................................................................... 34 3.2 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene .................................................................. 35 3.2.1 Khả năng biểu hiện gene CYP264B1 ................................................. 35 3.2.2 Khả năng biểu hiện của Adx .............................................................. 36 3.3 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx .................................................................... 38 3.4 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu ......................................... 39 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng lên khả năng chuyển hóa cơ chất..39 3.4.2 Ảnh hƣởng của mật độ tế bào lên khả năng chuyển hóa cơ chất ....... 41 3.4.3 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa cơ chất ............... 42 3.4.4 Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng chuyển hóa cơ chất ............ 44 3.4.5 Lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa .......................... 45 3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene ................................................................................................. 47 3.5.1 Kết quả chuyển hóa longipinene ........................................................ 48 3.5.2 Kết quả chuyển hóa isolongifolene .................................................... 50 3.5.3 Tinh sạch và nhận dạng sản phẩm chuyển hóa .................................. 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................................................ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 55 PHỤ LỤC ......................................................................................................................60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Nội dung Trang 1.1 Cách gọi tên enzyme P450 3 Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome 5 1.2 P450 1.3 Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam 7 1.4 Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450 8 Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase 10 1.5 GeoA trên cụm 2 gene của myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56 1.6 Cấu trúc của nhóm sắt-lƣu huỳnh 11 1.7 Cấu trúc nhóm FAD 12 1.8 Một số sesquiterpene phổ biến 13 1.9 Một số Sesquiterpene mạch thẳng 14 1.10 Một số sequiterpene mạch vòng đơn 14 1.11 Một số sesquiterpene đa vòng 15 2.1 Plasmid pET C4AA 20 2.2 Sơ đồ nghiên cứu đề tài 24 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR colony 34 3.2 Cấu trúc đa gene trên vector pETC4AA 35 Phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng 400-500 nm của dịch 36 3.3 chiết tế bào C43DE3/pETC4AA sau 24 giờ cảm ứng 3.4 Kết quả điện di protein ngoại bào 37 Phân tích khả năng biểu hiện Adx với kháng thể đặc hiệu 38 3.5 bằng kỹ thuật Western blot. Sắc ký đồ HPLC phân tích kết quả chuyển hóa nootkatone 39 3.6 bằng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA 3.7 Chuyển hóa glycerol bởi tế bào vi sinh vật 43 3.8 Cấu trúc của longipinene và isolongifolene 47 3.9 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3.10 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene 50 Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa longipinene (a) và cấu 51 3.11 trúc dự đoán bởi GCMS (b) Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa isolongifolene (a) và cấu 52 3.12 trúc dự đoán bởi GCMS (b) 3.13 Cấu trúc phân tử của 15-hydroxy longipinene 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Nội dung Trang 2.1 Danh sách thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 21 2.2 Danh sách các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 22 Danh sách các dung dịch và đệm chính sử dụng trong thí nghiệm 22 2.3 2.4 Danh sách các môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm 23 2.5 Thành phần phản ứng PCR 26 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 26 2.7 Thành phần gel co và gel tách 29 2.8 Bố trí thí nghiệm xác định môi trƣờng tối ƣu 31 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả 40 3.1 năng chuyển hóa cơ chất Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ tế bào đến khả năng 42 3.2 chuyển hóa cơ chất Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng 44 3.3 chuyển hóa cơ chất Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng 45 3.4 chuyển hóa cơ chất 3.5 Kết quả lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene phổ biến ở thực vật, có công thức phân tử là C15H24. Các dẫn xuất oxy hóa của chúng thƣờng có hoạt tính sinh dƣợc học, tính chất hƣơng liệu hoặc là chất trung gian để tổng hợp các hợp chất có giá trị [11]. Tuy nhiên, trong tự nhiên các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thƣờng tồn tại với hàm lƣợng rất nhỏ so với tiền chất sesquiterpene của chúng. Việt Nam là một quốc gia có hệ thực vật phong phú và đa dạng nên việc khai thác nguồn sesquiterpenes từ cây cỏ trong nƣớc có ý nghĩa rất thiết thực. Để tạo ra những dẫn xuất oxy hóa có giá trị, phản ứng oxy hóa chọn lọc bằng con đƣờng hóa học thƣờng đòi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí cao và tạo ra nhiều chất thải độc hại ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Ngƣợc lại, các chất xúc tác sinh học, đặc biệt là enzyme cytochrome P450 (CYP/P450) có thể thực hiện phản ứng này ở điều kiện nhẹ nhàng [47]. Tuy nhiên, để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner [13]. Để khắc phục điều này, xu hƣớng nghiên cứu gần đây về P450 là tạo ra hệ xúc tác tế bào từ vi sinh vật tái tổ hợp mang đồng thời gene mã hóa P450 và các redox partner của nó. Giải pháp này có lợi thế là có thể tận dụng nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện chức năng chuyển hóa cơ chất trong môi trƣờng tự nhiên nên bền vững và không đòi hỏi quá trình tinh sạch tốn k m. Trong nghiên cứu trƣớc, CYP264B1 - một enzyme cytochrome P450 có nguồn gốc từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum Soce56 đã đƣợc phát hiện có khả năng chuyển hóa nhiều hợp chất sesquiterpenes. Hệ thống vận chuyển điện tử cho enzyme này cũng đã đƣợc xác định, bao gồm NADPH và 2 protein vận chuyển điện tử là AdR (Adrenodoxin reductase) và Adx (Adrenodoxin). Đặc biệt, CYP264B1 có khả năng hydroxyl hoá chọn lọc một số hợp chất (nootkatone và / - ionone) ở vị trí mà cho đến nay rất khó thực hiện đƣợc bởi các quá trình chuyển hóa sinh học khác. Các dẫn xuất này đều có tính chất thú vị hơn so với các chất ban đầu 1
nhƣ tăng hoạt tính kìm hãm sự phát triển của một số dòng tế bào ung thƣ (dẫn xuất của nootkatone), hay có thể sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp carotenoids (dẫn xuất của / -ionone) [26]. Vì vậy, CYP264B1 có tiềm năng rất lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene thành các dẫn xuất có đặc tính sinh học mới. Nhằm mục đích xây dựng hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp để chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene, nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh hóa thực vật - Viện Công nghệ sinh học đã thiết kế vector tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho CYP264B1 và 2 redox partner của nó, đƣợc điều khiển bởi promoter T7. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng h c c c i i h ên h h ng ch nh h ch i n 2. Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống CYP264B1. - Ứng dụng hệ xúc tác này để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu sử dụng h xúc tác t chuy n h cơ ch t + Nhân dòng plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene bằng kỹ thuật PCR colony và giải trình tự gene. + Kiểm tra khả năng biểu hiện gene bằng phƣơng pháp đo nồng độ CYP264B1 và kiểm tra khả năng biểu hiện Adx bằng phƣơng pháp western blot. + Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone bằng phƣơng pháp HPLC. + Tối ƣu điều kiện chuyển hóa nootkatone. - Tách chi t và nhận dạng sản phẩm chuy n hóa + Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene và phân tích sản phẩm chuyển hóa bằng kỹ thuật GCMS. + Tinh sạch sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký cột selicagel. + Nhận dạng cấu trúc sản phẩm bằng kỹ thuật NMR. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cytochrome P450 1.1.1 Định nghĩ v hân ại * Định nghĩ Cytochrome P450 (thƣờng viết tắt là CYP hay P450) thuộc họ enzyme monooxygenease có nhóm heme - thiolate trong trung tâm hoạt động, hấp thụ bƣớc sóng cực đại rất điển hình ở 450 nm khi chúng ở trạng thái khử và tạo phức hợp với CO (cacbon monooxit) [13]. P450 có mặt trong hầu hết các sinh vật, từ eukaryote đến prokaryote, thậm chí cả ở virus [20]. P450 xúc tác phản ứng oxy hóa khử nhiều loại hợp chất nội sinh và ngoại sinh. Số lƣợng P450 cao nhất ở thực vật, ở ngƣời có 57 enzyme P450 [13]. E.coli không có enzyme P450 nào. Tên gọi của các enzyme cytochrome P450 đƣợc quy định bởi chữ CYP, theo sau nó là một số thứ tự Ả Rập chỉ họ gen, tiếp đó là một chữ cái viết hoa chỉ phân họ và một số Ả Rập chỉ một gen riêng biệt. Ví dụ: CYP106A2, CYP264B1, CYP260A1. Hình 1.1. Cách gọi tên enzyme P450 * Phân loại Hiện nay đã có hơn 11000 P450 khác nhau đã đƣợc tách dòng từ động vật, thực vật, vi nấm, vi khuẩn và những động vật bậc cao khác [33]. 3
Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner. Do P450 rất đa dạng trong tự nhiên nên các redox partner của chúng cũng rất phong phú. Dựa vào các kiểu redox protein tham gia vào chu i vận chuyển điện tử, Hannemann và cộng sự đã phân loại P450 thành 10 nhóm khác nhau. - Nhóm 1: bao gồm hầu hết hệ thống P450 ở vi khuẩn và ở ty thể của tế bào nhân chuẩn. Hệ thống thuộc nhóm này gồm 3 protein riêng biệt: một enzyme reductase (FdR) chứa nhóm ngoại FAD có vai trò chuyển điện tử từ NAD(P)H cho thành viên thứ 2 là một ferredoxin (Fdx) chứa cụm sắt - lƣu huỳnh, đến lƣợt ferredoxin lại chuyển điện tử đến enzyme cytochrome P450 để enzyme này thực hiện chức năng xúc tác. - Nhóm 2: bao gồm một enzyme cytochrome P450 và một cytochrome P450 reductase (CPR) phụ thuộc NADPH của mạng lƣới nội chất. CPR là một enzyme chứa 2 nhóm ngoại FAD và FMN có vai trò chuyển điện tử từ NADPH tới P450. - Nhóm 3: mới chỉ tìm thấy duy nhất ở vi khuẩn Citrobacter braakii. Hệ thống này bao gồm một Flavodoxin (Fldx) chứa nhóm ngoại FMN và một enzyme cytochrome cytochrome mới là P450cin. - Nhóm 4: đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn cổ Sulfolobus solfataricus, bao gồm một Fdx và một enzyme có tên gọi 2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase. - Nhóm 5: bao gồm một enzyme reductase phụ thuộc NAD(P)H và một enzyme cytochrome P450 dung hợp với ferredoxin (Fdx-P450). - Nhóm 6: bao gồm một enzyme flavoprotein reductase phụ thuộc NAD(P)H và một protein dung hợp flavodoxin-P450 (Fldx-P450). - Nhóm 7: bao gồm một enzyme phthalate oxygenase dung hợp với P450 (PFOR-P450). - Nhóm 8: bao gồm 1 enzyme P450 dung hợp với protein vận chuyển điện tử tƣơng tự ở tế bào nhân chuẩn là diflavin reductase (CPR-P450). - Nhóm 9: bao gồm một enzyme nitric oxide reductase (P450nor) sử dụng NADH làm chất cho điện tử. P450nor xúc tác phản ứng phụ thuộc vào và không phụ thuộc vào các protein vận chuyển điện tử khác. 4
- Nhóm 10: bao gồm các P450 không phụ thuộc vào protein vận chuyển điện tử nhƣ: allene oxide synthase, fatty acid hydroperoxide lyase, divinyl ether synthase, prostacyclin synthase và thromboxane synthase [13]. Hình 1.2. Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome P450 ở microsome (A),mitochondria (B), vi khuẩn (C) và (D). Trong đó: CPR: NADPH-P450 reductase FDX: ferredoxin FDR:NAD(P)H-ferredoxin ADX: Adrenodoxin reductase RH: Cơ chất ADR: NADPH - ROH: Sản phẩm. adrenodoxin reductase 1.1.2 c củ cytochrome P450 P450 là một họ enzyme gồm nhiều isozyme có khối lƣợng phân tử khoảng 45- 60 kDa, trong phân tử có chứa một nhân heme ở dạng Fe protoporphyrin IX và một chu i polypeptide. Cấu trúc bậc I của P450 cho thấy trình tự amino acid trong phân tử của m i chu i isozyme thƣờng có thể khác nhau rất nhiều (có trƣờng hợp khác đến 70%), hơn nữa đoạn amino acid đầu N thƣờng không giống nhau giữa các P450. Sự khác biệt về trình tự amino acid của các isozyme trong cùng loài dao động từ 30% đến hơn 95%. M i isozyme đƣợc mã hóa bởi một gene riêng biệt và sự khác biệt về trình tự amino acid trong phân tử là do trình tự của các nucleotide trong gene mã hóa protein quy định [6]. Đến nay ngƣời ta đã biết đƣợc 1200 cấu trúc bậc I của P450. Các trình tự amino acid của các P450 cũng nhƣ trình tự của các nucleotide mã hóa chúng đƣợc 5
lƣu trong GenBank. Trung tâm hoạt động của P450 chứa Fe protoporphyrin IX, liên kết bởi lực hydro kỵ nƣớc. Vị trí thứ 5 của vòng porphyrin liên kết với aminothiol thƣờng của gốc cysteine. Vị trí thứ 6 gắn với một phân tử nƣớc có khả năng trao đổi. Mặc dù có sự khác biệt về trình tự amino acid nhƣng một số cấu trúc đƣợc bảo toàn ở tất cả các isozyme, ví dụ nhƣ gốc cysteine gắn với heme bao giờ cũng ở gần đầu carboxyl. Trong số những cytochrome đã đƣợc tách chiết, cytochrome P450cam là enzyme P450 đầu tiên đƣợc mô tả cấu trúc bậc I một cách hoàn chỉnh bởi Poulos và cộng sự [2]. Hình dạng tổng thể của P450cam tƣơng tự nhƣ một hình lăng trụ tam giác với đƣờng kính cực đại khoảng 60 Ǻ. Hình 1.3. Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam Vùng liên kết hem đƣợc mô tả bằng màu đen. Một nguyên tử sắt hình cầu ở trung tâm của heme Cấu trúc bậc II của P450 cũng đã đƣợc nghiên cứu, kết quả cho thấy cả chu i -helix và phiến β đều tồn tại trong phân tử enzyme này. Sự khác biệt trong cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của P450 là nguyên nhân cho sự đặc hiệu cơ chất của các isozyme. Vào đầu những năm 1990, ngƣời ta đã xác định đƣợc cấu trúc của một số enyme cytochrome P450 gồm có P450BM3 (CYP102), P450terp (CYP108), P450eryF (CYP107) và P450nor (CYP55) [6]. Cho đến nay những chuyên gia nghiên cứu cấu trúc tinh thể đã xác định đƣợc cấu trúc của một số P450 của vi khuẩn. Mặc dù sự tƣơng đồng về trình tự của các enzyme P450 thuộc cùng một phân 6
họ chỉ dƣới 20%, nhƣng các enzyme này lại có sự tƣơng đồng lớn về phƣơng thức cuộn xoắn và hình học. Nhìn chung, có khoảng 13 chu i xoắn và 4 phiến β trong một phân tử protein P450. Cấu trúc trung tâm bảo thủ của P450 đƣợc tạo nên bởi 1 bó gồm 4 chu i xoắn xung quanh nhân heme (3 chu i xoắn song song là D, L, I- helix và một chu i xoắn ngƣợc là E-helix). Nhóm heme định vị giữa chu i I-helix xa và một chu i L-helix gần và liên kết với phân tử cystein liền kề tạo thành một vùng khoanh chứa đoạn trình tự amino acid bảo thủ của P450 là FxxGx(H/R)xCxG. Phân tử cystein liền kề là tuyệt đối bảo thủ và nằm trên liên kết “thứ năm” của nguyên tử sắt. Đặc biệt, phân tử cysterin tạo thành 2 liên kết hydrogen với các bộ nhóm amide gần kề [9]. Chu i xoắn dài I-helix tạo thành 1 bức tƣờng giữa khoang chứa nhóm hem và trình tự amino acid tín hiệu (A/G)-Gx(E/D)T tập trung ở giữa các chu i xoắn. Chu i xoắn I-helix cũng chứa phân tử threonine có tính bảo thủ cao định vị ở trung tâm hoạt động và đƣợc tin rằng có tham gia vào quá trình xúc tác [13], [29], [17]. Dựa vào trình tự amino acid của các thành viên của nhóm CYP2 và P450cam, Gotoh và cộng sự đã cho rằng có 6 vùng tham gia vào việc nhận biết cơ chất. Các vùng protein này đƣợc xem là rất linh hoạt và chuyển động theo sự liên kết với cơ chất trƣớc khi sẵn sàng cho phản ứng xúc tác [36], [9]. Hình 1.4. Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450 Trong đó: nguyên tử sắt (III) protoporphyrin-IX liên kết với một phối tử cysteine ở gần 7
1.1.3 ơ ch c c củ cytochrome P450 Có hơn 20 phản ứng khác nhau đƣợc xúc tác bởi các enzyme P450 nhƣ phản ứng hydroxyl hóa liên kết C-H, N-dealkyl hóa, N-hydroxyl hóa, O-dealkyl hóa, S- oxy hóa và epoxy hóa. Trong đó, phản ứng phổ biến nhất đƣợc thực hiện bởi các enzyme này là phản ứng monooxy hóa: một nguyên tử oxy đƣợc chuyển vào cơ chất (RH) và nguyên tử oxy còn lại đƣợc khử thành nƣớc [28]. RH + O2 + NAD(P)H + H+→ ROH + H2O + NAD(P)+ Ngoài phân tử oxi, hệ thống enzyme này còn cần có NAD(P)H cung cấp H2 cho phản ứng. Cơ chế của phản ứng này đƣợc Coon và cộng sự đã tìm ra và mô tả chi tiết vào năm 1979 [29]. Cơ chất muốn chuyển hóa đƣợc cần phải gắn vào enzyme P450 (ở dạng oxi hóa) tạo thành một h n hợp enzyme - cơ chất. Sau đó một điện tử từ pyridine nucleotide dạng khử đƣợc chuyển đến hợp chất này nhờ phân tử cytochrome P450 – reductase. Phức hệ enzyme cơ chất bị khử này lại gắn với một phân tử oxi và tiếp nhận điện tử thứ hai. Qua sự chuyển điện tử (e-) nội phân tử, phân tử oxi đƣợc hoạt hóa sau khi một phân tử nƣớc tách ra thì nguyên tử oxi thứ hai đƣợc gắn vào cơ chất. Sau đó là sự tái lập lại cytochrome P450 dạng oxi hóa. 1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450 Hiện nay, các enzyme P450 đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu về nhiều lĩnh vực: hóa sinh, y dƣợc học, sinh lý học, hóa học nội bào, công nghệ sinh học và môi trƣờng. Bộ gen của con ngƣời có 57 gen mã hóa cho P450, trong đó hơn một phần tƣ các enzyme này tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất xenobiotics, P450 còn tham gia vào quá trình tổng hợp sterol, vitamin, acid béo và eicosanoids. Chính vì vậy, P450 có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dƣợc phẩm đặc biệt là trong nghiên cứu chế tạo thuốc chữa bệnh. Ngoài ra, P450 còn xúc tác cho phản ứng hydroxyl hóa các hydrocarbon béo, các hợp chất có khối lƣợng phân tử lớn hơn và phức tạp hơn nhƣ hydrocarbons polyaromatic (PAHs); các hợp chất halogen nhƣ polychlorinated biphenyls 8
(PCBs), chất thải từ thuốc nổ quân sự và thuốc diệt cỏ [45]. Nhiều loại P450 còn đƣợc nghiên cứu phục vụ cho các ứng dụng xử lý sinh học. Do khả năng thực hiện nhiều phản ứng khác nhau trên nhiều nhóm cơ chất khác nhau, đặc biệt là khả năng oxy hóa chọn lọc ở các vị trí allyl, liên kết đôi hoặc thậm chí cả ở liên kết C-H không đƣợc hoạt hóa và rất khó thực hiện bởi xúc tác hóa học, nên cytochrome P450 có tiềm năng ứng dụng to lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất tự nhiên thành các sản phẩm có giá trị [7]. Ngoài ra, P450 có thể ứng dụng trong xử lý môi trƣờng để chuyển hóa các chất độc hại thành các chất thân thiện hơn hay ứng dụng để tạo các biosensor nhằm phát hiện sự có mặt của một chất nào đó trong mẫu nghiên cứu. Trên thực tế, P450 đƣợc ứng dụng nhiều nhất để sản xuất thuốc, vitamin, hƣơng liệu, nƣớc hoa hay thuốc trừ sâu. Chẳng hạn, P450 đã đƣợc ứng dụng thành công ở qui mô công nghiệp trong việc sản xuất pravastatin - thuốc có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol, dùng để điều trị cho những bệnh nhân bị xơ vữa động mạnh. Pravastatin đƣợc chuyển hóa từ compactin bởi CYP105A3 thông qua sự hydroxyl hóa carbon ở vị trí 6β. Một ví dụ khác nữa là ứng dụng của P450 trong sản xuất cortisol từ 11-deoxycortisol bởi P450 qua phản ứng hydroxyl hóa ở vị trí 11-β, đã đƣợc sản xuất bởi công ty Schering AG (Germany) ở qui mô công nghiệp [39]. Trong chuyển hóa các hợp chất terpene, sự thêm vào bộ khung carbon một hoặc một vài nhóm hydroxyl làm thay đổi đáng kể các tính chất nhƣ khả năng hòa tan, hoạt tính sinh học hay tăng đặc tính mùi của hợp chất đó. Chẳng hạn một dạng đột biến của P450cam có thể xúc tác phản ứng oxi hóa monoterpene (þ)-a-pinene thành (þ)-cis-verbenol hoặc h n hợp của (þ)-verbenone và (þ)-cis-verbenol. Verbenol và verbenone là các pheromones hoạt động chống lại rất nhiều loại bọ cánh cứng do đó có thể sử dụng trong chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp. Sinh tổng hợp sesquiterpene albaflavenone có hoạt tính kháng sinh đƣợc thực hiện bởi (CYP170A1) qua hai bƣớc oxy hóa allyl hợp chất epi-isozizaene [51]. Sự hydroxyl hóa chọn lọc „regio‟ valencene ở vị trí allyl C2 bởi CYP109B1 tạo ra nootkatone, một hợp chất có giá trị trong công nghiệp thực phẩm và hƣơng liệu. 9