Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:65

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm chọn tạo được các dòng tế bào có khả năng phát triển sinh khối với tốc độ nhanh và giữ đươc khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. Kết quả của luận văn sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm cải thiện khả năng tổng hợp các chất thứ cấp của tế bào dừa cạn ở điều kiện in vitro.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN “NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.) CỦA VIỆT NAM” LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN “NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.) CỦA VIỆT NAM” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 6020114 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC Hƣớng dẫn 1 : TS. Trần Mỹ Linh Hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Tƣờng Vân Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả 1
LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Trần Mỹ Linh – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST), TS. Nguyễn Tƣờng Vân – Viện Công nghệ sinh học, VAST và ThS. Nguyễn Chi Mai - Viện Hóa sinh biển, VAST đã tận tình hƣớng dẫn, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn Nhiệm vụ HTQT cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số QTBY01.05/18-19 do TS. Trần Mỹ Linh làm chủ nhiệm đã hỗ trợ trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Học viện Khoa học và Công nghệ, VAST đã hết lòng truyền đạt kiến thức cho tôi xong suốt hai năm học vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ thuộc Phòng Nghiên cứu Tài nguyên sinh vật – Viện Hóa sinh biển, VAST đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Thanh Huyền 2
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... 1 LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 2 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... 5 DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................... 6 DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... 7 MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 8 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 10 1.1. Giới thiệu chung về dừa cạn ........................................................................... 10 1.1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố ..................................................................... 10 1.1.2. Giá trị y học ................................................................................................. 11 1.2. Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro ............................................................ 12 1.2.1. Các xu hƣớng trong sản xuất chất thứ cấp in vitro ...................................... 13 1.2.2. Các yếu tố chính ảnh hƣởng nuôi cấy mô và tế bào cây thuốc in vitro....... 16 1.2.3. Nuôi nhân chồi in vitro ................................................................................ 19 1.2.4. Nuôi cấy mô sẹo và tế bào huyền phù ......................................................... 20 1.3. Nuôi cấy mô cây dừa cạn để tăng cƣờng sx chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 23 1.4. Những thách thức trong sản xuất chất thứ cấp in vitro ...................................... 26 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 27 2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 27 2.1.1. Các giống thực vật nghiên cứu ........................................................................ 27 2.1.2. Các môi trƣờng dùng cho nghiên cứu ............................................................. 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 28 2.2.1. Khử trùng và nảy mầm hạt .............................................................................. 28 2.2.2. Tạo nguồn vật liệu bằng phƣơng pháp nhân nhanh chồi in vitro ................... 28 2.2.3. Thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo từ đoạn thân dừa cạn .................................. 28 2.2.3.1. Tối ƣu hóa loại và nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng lên khả năng tạo mô sẹo.............................................................................................................................. 28 2.2.3.2. Đánh giá ảnh hƣởng của ví trí và kích thƣớc đoạn thân đến hình thành mô sẹo.............................................................................................................................. 29 3
2.2.3.3. Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân ................................................................. 29 2.2.3.4. So sánh khả năng tạo mô sẹo giữa các giống dừa cạn thu thập tại Việt Nam30 2.2.4. Tối ƣu hóa môi trƣờng nhân nhanh mô sẹo dừa cạn ....................................... 30 2.2.5. Phát triển điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn .......................... 30 2.2.6. Đánh giá ảnh hƣởng của ánh sáng và nhiệt độ lên sự phát triển của tế bào huyền phù dừa cạn..................................................................................................... 31 2.2.7. Tách chiết và định lƣợng alkaloid tổng số ........................................... 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 33 3.1. Nghiên cứu tạo mô sẹo phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào huyền phù từ các vật liệu ban đầu khác nhau của hai giống dừa cạn .......................................................... 33 3.1.1 Đánh giá khả năng nảy mầm hạt dừa cạn trong điều kiện in vitro .................. 33 3.1.2. Đánh giá khả năng nhân chồi in vitro của dừa cạn ......................................... 33 3.1.3. Nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ các vật liệu nuôi cấy in vitro .................. 35 3.1.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của đoạn lóng thân đến khả năng hình thành mô sẹo 39 3.1.5. Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân dùng trong thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo39 3.1.5. Đánh giá khả năng hình thành mô sẹo ở hai giống dừa cạn QN02 và H01 từ đoạn thân thứ 3, kích thƣớc 0,3cm ............................................................................ 41 3.2. Nghiên cứu phát triển tế bào huyền phù dừa cạn ............................................... 43 3.2.1. Phát triển môi trƣờng nhân nhanh mô sẹo, bảo toàn khả năng sinh tổng hợp alkaloid ...................................................................................................................... 43 3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ tế bào ban đầu đến sự phát triển của tế bào dừa cạn nuôi lỏng .................................................................................................................... 47 3.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và ánh sáng lên tốc độ phát triển của tế bào ............ 49 3.2.4. So sánh khả năng nhân nhanh của tế bào huyền phù của hai giống dừa cạn QN02 và H01 ............................................................................................................ 51 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 54 4.1. Kết luận .............................................................................................................. 54 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 55 4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic axit 2,4-D Axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic B5 Môi trƣờng nuôi cấy của Gamborg (1968) BAP 6-benzyladenine CT Công thức DDW Nƣớc cất hai lần (double distilled water) DW Trọng lƣợng khô – dry weight IAA Indole Acetic acid IBA Indole-3-butyric acid Kin Kinetin LS Môi trƣờng nuôi cấy của Linsmaier và Skoog (1965) MS Môi trƣờng nuôi cấy của Murashige và Skoog (1962) N6 Môi trƣờng nuôi cấy của Chu và cs (1975) NAA α-Naphthaleneacetic acid TDZ Thidiazuron 5
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thông tin ký hiệu mẫu dừa cạn ...................................................... 27 Bảng 2.2: Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy mô ...................................... 27 Bảng 3.1. Tỷ lệ tạo mô sẹo của các đoạn lóng thân lên môi trƣờng CT2 ...... 36 Bảng 3.2 A. Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn giống QN02 thử nghiệm trên các công thức của môi trƣờng nhân nhanh tế bào ........................................... 45 Bảng 3.2 B. Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn giống H01 thử nghiệm trên các công thức của môi trƣờng nhân nhanh tế bào ................................................. 45 Bảng 3.3. Sự tăng trƣởng của tế bào dừa cạn QN02 sau 27 ngày nuôi cấy ... 48 Bảng 3.4. Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn thử nghiệm trong môi trƣờng lỏng CT4 nhân nhanh tế bào huyền phù trong thí nghiệm cấy chuyển tế bào từ môi trƣờng đặc CT3 sang môi trƣờng lỏng CT4 .................................................... 51 6
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây dừa cạn .................................................................................... 10 Hình 2.1. Lựa chọn đoạn thân trong thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo ở dừa cạn ................................................................................................................... 29 Hình 3.1. Hạt dừa cạn nảy mầm sau 1 tuần gieo hạt ...................................... 33 Hình 3.2. Hình ảnh thí nghiệm nhân chồi dừa cạn tạo nguyên liệu cho TN tạo mô sẹo ............................................................................................................. 34 Hình 3.3. Mô sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát triển trên môi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L IAA ......................... 35 Hình 3.4. Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát triển trên môi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L NAA ........ 37 Hình 3.5. Mô sẹo dừa cạn H01 sau 4 tuần phát triển trên môi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau ...................................................... 38 Hình 3.6. Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 sau 4 tuần phát triển trên môi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau .............................. 38 Hình 3.7. Một số hình ảnh thí nghiệm tối ƣu vị trí đoạn lóng thân trong thí nghiệm tạo mô sẹo sau 4 tuần đặt trên môi trƣờng tạo mô sẹo. A: đoạn 1; B: đoạn 2; C: đoạn 3 ............................................................................................ 39 Hình 3.8. Hình ảnh thí nghiệm tối ƣu kích thƣớc đoạn thân trong TN tạo mô sẹo.................................................................................................................... 40 Hình 3.9. Mô sẹo dừa cạn trên môi trƣờng CT2 chứa 1,5 mg/L 2,4-D ......... 41 Hình 3.10. Tốc độ nhân sinh khối của tế bào dừa cạn QN02 và H01 ........... 47 Hình 3.11. Hình ảnh tế bào dừa cạn QN02 phát triển trên môi trƣờng CT3-547 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát triển của tế bào dừa cạn ..... 50 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của ánh sáng đến sự phát triển của tế bào huyền phù dừa cạn. A. tế bào nuôi trong tối; B. tế bào nuôi ngoài ánh sáng ................... 50 Hình 3.14. Hình ảnh tế bào huyền phù dừa cạn QN02 nuôi lỏng tại thời điểm A: 1 ngày; B: 3 ngày; C: 5 ngày; D: 7 ngày; E: 10 ngày; F: 14 ngày ............. 52 7
MỞ ĐẦU Từ lâu thực vật luôn là nguồn cung cấp một số lƣợng khổng lồ các hợp chất hóa học có hoạt tính và đƣợc dùng làm thuốc. Các hợp chất hoạt tính sinh học đƣợc chiết xuất từ thực vật có thể đƣợc sử dụng nhƣ thuốc điều trị bệnh, thực phẩm chức năng, thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm, thuốc nhuộm, chất tạo hƣơng vị và mỹ phẩm. Hiện có khoảng 25–28% thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật, hơn 60% thuốc điều trị ung thƣ trực tiếp hoặc gián tiếp từ thực vật và có nhiều loại không có sản phẩm tổng hợp hoặc bán tổng hợp thay thế. Vì thế nguồn sinh khối thực vật đang ngày một tăng cao và những nghiên cứu nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính dƣợc học là đòi hỏi cấp bách.. Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã có những bƣớc phát triển vƣợt bậc, là một phƣơng pháp thay thế thích hợp trong việc tạo các nguồn sinh khối ở quy mô khác nhau không phụ thuộc vào mùa vụ. Ngoài ra, việc nuôi cấy mô tế bào còn có thể tiến hành ở bất cứ nơi nào trong điều kiện vô trùng và không phải sử dụng các chất bảo vệ thực vật độc hại. Một trong những tiến bộ đáng kể trong kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật chính là tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào không bị biệt hóa) của thực vật để nghiên cứu các hoạt tính sinh học và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp có giá trị. Nuôi cấy tế bào huyền phù còn là một trong những giải pháp để cải thiện khó khăn khi nồng độ các chất trao đổi thứ cấp trong cây thấp và đã đƣợc phát triển thành công nhƣ chất artemisinin (phân lập từ cây thanh hao hoa vàng, có tác dụng chữa sốt rét) và chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ cây thông đỏ, có tác dụng chữa ung thƣ). Cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) G. Don) là cây dƣợc liệu, chứa nhiều chất thứ cấp khác nhau trong đó có nhóm chất terpenoid alkaloid có nhân indole (TIA) nhƣ vinblastine và vincristine để điều trị một số bệnh ung thƣ nguy hiểm nhƣ bệnh bạch cầu, ung thƣ hạch bạch huyết 8
(lymphosarcoma), ung thƣ biểu mô rau (choriokarsinoma), u nguyên bào thần kinh, ung thƣ vú, ung thƣ phổi, bệnh Hodgkin, các khối u dạng Wilkin và ung thƣ tế bào lƣới. Trên thực tế nhu cầu về các alkaloid ngày một tăng, nhƣng quá trình sản xuất những hợp chất này vẫn gặp nhiều khó khăn do hai hợp chất này chỉ có mặt trong cây dừa cạn với hàm lƣợng rất thấp, khoảng 0,0002- 0,0005% tổng hàm lƣợng alkaloid trong cây và phụ thuộc vào giống và các cơ quan khác nhau của cây. Vì thế, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro để phát triển sinh khối và sau đó là điều khiển sinh tổng hợp các chất thứ cấp có giá trị đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt ở cây dừa cạn, tuy nhiên kết quả vẫn còn hạn chế và phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy bao gồm vật liệu, điều kiện nuôi cấy… Trong khuôn khổ luận văn này, nghiên cứu sẽ tập trung “ Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam” nhằm chọn tạo đƣợc các dòng tế bào có khả năng phát triển sinh khối với tốc độ nhanh và giữ đƣơc khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. Kết quả của luận văn sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm cải thiện khả năng tổng hợp các chất thứ cấp của tế bào dừa cạn ở điều kiện in vitro. Để đạt đƣợc mục tiêu, các công việc cụ thể sẽ đƣợc tiến hành nhƣ sau: 1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của vật liệu, môi trƣờng, chất kích thích sinh trƣởng khác nhau đến khả năng hình thành mô sẹo của 02 giống dừa cạn của Việt Nam. 2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào từ mô sẹo dừa cạn đã đƣợc chọn lọc. 9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về dừa cạn 1.1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L) G. Don, tên thƣờng gọi là dừa cạn hoặc bông dừa hay trƣờng xuân hoa là một loài thực vật thân thảo thuộc chi Catharanthus, họ Trúc đào (Apocynaceae). Chi Catharanthus gồm 8 loài, trong đó 7 loài có nguồn gốc từ bán đảo Madagascar (C. coriaceus, C. lanceus, C. longifolius, C. ovalis, C. roseus, C. scitulus, C. trichophyllus) và 1 loài C. pusillus từ Ấn Độ. Loài Catharanthus roseus (L) G. Don (dừa cạn) đƣợc du nhập vào Việt Nam, phân bố ở nhiều vùng, trải dài từ Bắc vào Nam [1]. Loài cây này chủ yếu đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới, ở những vùng lạnh cây đƣợc trồng vào mùa hè vì không chịu đƣợc lạnh. Hình 1.1: Cây dừa cạn (Nguồn: http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/195) Dừa cạn là dạng cây thƣờng xanh hoặc cây thân thảo, cao tới 80 cm đến 1 m và hoa nở liên tục quanh năm với hoa màu hồng, tím hoặc trắng [2]. Lá cây có hình từ bầu dục đến thuôn, dài từ 2,5- 9,0 cm và rộng từ 1- 3,5 cm, không có lông, màu xanh bóng với một gân ở giữa màu nhạt và cuống lá ngắn khoảng 1-1,8 cm và đƣợc sắp xếp theo cặp đối diện. Hai giống C. roseus phổ biến nhất đƣợc đặt tên dựa trên màu hoa, bao gồm một giống hoa màu hồng Rosel và một giống hoa màu trắng Alba. Hoa có nhiều màu từ màu trắng đến hồng đậm với hoa gồm 5 cánh mỏng, tiểu nhụy gắn với phần trên 10
của ống vành, tâm bì rời ở noãn sào với năm cánh giống thùy hoa. Quả là một cặp nang dài khoảng 2-4 cm và rộng 3 mm. Dừa cạn C. roseus là một loài khác biệt với hầu hết các loài khác trong họ ở khả năng tự tƣơng thích. Tuy nhiên, quá trình tự thụ phấn trong hoa thƣờng không xảy ra ở cây dừa cạn vì sự tách biệt vật lý giữa nhụy và bao phấn, một hiện tƣợng đƣợc gọi là herkogamy ngƣợc, khi nhụy bị thấp xuống dƣới mức bao phấn [3]. Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tƣơng đối đặc trƣng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh miền Trung nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên. Ngoài ra dừa cạn còn xuất hiện ở các đảo nhƣ Cô Tô, Côn Đảo và Phú Quốc [1]. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần nhƣ thuần loại trên các bãi cát dƣới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. 1.1.2. Giá trị y học Catharanthus roseus đƣợc coi là một nhà máy sản xuất đến 130 terpenoid indole alkaloids (TIAs) khác nhau, trong đó có nhiều chất có hoạt tính dƣợc học quan trọng đƣợc dùng trong điều trị ung thƣ, tiểu đƣờng, cao huyết áp, dị ứng, táo bón và nhiều bệnh đƣờng ruột. Trong đó, vinblastine là hợp chất đã đƣợc FDA (Food and Drug Administration) của Mỹ phê duyệt vào năm 1965 và trở thành một thành phần chính của phƣơng pháp hóa trị liệu trong điều trị nhiều loại ung thƣ nhƣ bạch cầu, bàng quang, tinh hoàn, các u bạch huyết, ung thƣ vú, ung thƣ phổi tế bào nhỏ…, đƣợc bán trên thị trƣờng hơn 40 năm nay. Ngoài ra, vincristine và vinblastine còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn [4]. Một hợp chất khác của nhóm TIA là ajmalicin đƣợc sử dụng làm chất chống cao huyết áp, hợp chất vindoline đƣợc nghiên cứu ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đƣờng [5]. Khi nghiên cứu để phát hiện các chất có hoạt tính hạ đƣờng huyết từ cây dừa cạn của Việt Nam, Nguyen và cs [6] đã 11
phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 9 hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme glucosidase từ cây và rễ dừa cạn thu hái tại Hoài Nhơn, Bình Định, trong đó có 2 chất lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài này. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 9 dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời, gồm ung thƣ gan (Hep- G2), ung thƣ biểu mô (KB), ung thƣ phổi (LU-1), ung thƣ vú (MCF-7), melanoma cancer ung thƣ sắc tố (SK-Mel2), ung thƣ bạch cầu cấp tính (HL60), ung thƣ buồng trứng (SW626), ung thƣ tuyến tiền liệt (LNCaP) và ung thƣ ruột kết (HT-29) đã có những kết quả nhất định. Mặc dù có vai trò quan trong nhƣng cấu trúc phức tạp của vinblastine và vincristine làm cho việc tổng hợp hóa học các chất này rất khó khăn. Dừa cạn cũng đƣợc dùng phổ biến trong các bài thuốc Đông y để trị cao huyết áp, trị bệnh tiểu đƣờng, tiêu hóa kém, lỵ thông tiểu tiện, bệnh đi tiểu đỏ và ít... Một số trƣờng hợp còn dùng để trị ung thƣ máu, ung thƣ phổi [7]. Trƣớc đây, nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tƣơng đối dồi dào. Trƣớc năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1-3 tấn/năm. Những năm gần đây, lƣợng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thƣờng xuyên hơn, nhƣng chủ yếu là từ cây trồng tại Phú Yên. 1.2. Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc bắt đầu từ đầu thế kỷ 20. Trong những năm 1940 và 1960, những tiến bộ công nghệ đã dẫn đến sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế thực vật nhằm nghiên cứu hoạt động của tế bào (bao gồm tế bào học, dinh dƣỡng, chuyển hóa, quá trình phát sinh hình thái, hình thành phôi và bệnh học), tạo ra cây sạch bệnh và điều kiện lƣu trữ tế bào và nhân giống vô tính. Từ những năm 1960, quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi trong nhiều loại tế bào thực vật và nhiều ứng dụng mới đã đƣợc phát triển, cải thiện đáng kể cho quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Hiện nay, việc nuôi cấy tế bào thực vật trở thành công cụ hiệu quả để sản xuất quy mô lớn các chất chuyển hóa thứ 12
cấp dùng trong chăm sóc sức khỏe cho con ngƣời (ví dụ, thuốc chống ung thƣ) [8]. Những ƣu điểm chính của hệ thống nuôi cấy mô tế bào so với trồng trọt ngoài tự nhiên bao gồm: các hợp chất thực vật đƣợc lựa chọn có thể đƣợc tạo liên tục không phụ thuộc các yếu tố bên ngoài nhƣ mùa vụ, điều kiện đất đai và khí hậu; các tế bào nuôi cấy không bị đe dọa bởi sự tấn công của vi sinh vật hoặc côn trùng; các tế bào của bất kỳ loài thực vật nào thậm chí là những loài quý hiếm hoặc có nguy cơ tuyệt chủng có thể dễ dàng duy trì để tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp; và quá trình sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp có thể điều khiển nhằm giảm chi phí và cải thiện năng suất. 1.2.1. Các xu hướng trong sản xuất chất thứ cấp in vitro Nuôi cấy in vitro liên quan đến việc sản xuất các tế bào, mô và cơ quan mới đơn thuần từ phân bào, do đó tạo ra các tế bào, mô và cơ quan, có cùng gen di truyền của cây mẹ. Việc sử dụng các kỹ thuật in vitro để tạo ra các chất thứ cấp, đặc biệt là các chất có hoạt tính dƣợc học có những ƣu điểm chính nhƣ không bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện môi trƣờng bên ngoài và các điều kiện nuôi cấy đƣợc kiểm soát trong phòng nuôi cấy; việc sinh tổng hợp chất thứ cấp có khả năng cải thiện bằng cách tạo ra các quy trình đặc thù cho từng bƣớc để tăng tốc tích lũy sinh khối tƣơi và tăng nồng độ chất trong các mô; có thể sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ; các chất thứ cấp đƣợc tạo ra trong điều kiện vô trùng và có rất ít rủi ro bị nhiễm bởi các hợp chất độc hại không mong muốn. Các chất thứ cấp đƣợc sản xuất in vitro bắt đầu bằng việc đƣa các vật liệu ban đầu từ các loài cây thuốc mong muốn vào trong nuôi cấy. Vật liệu ban đầu đƣợc khử trùng bề mặt và nuôi cấy trong điều kiện in vitro, sử dụng môi trƣờng nuôi cấy đã đƣợc tối ƣu hóa trong các điều kiện vật lý đƣợc kiểm soát cho từng giai đoạn khác nhau. Môi trƣờng nuôi cấy chứa các nguồn dinh dƣỡng cần thiết cho việc phát triển của tế bào nhƣ đƣờng, vì thƣờng bị hạn 13
chế trong trong điều kiện thiếu ánh sáng và CO2 nồng độ thấp; các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, đƣợc sử dụng để kiểm soát sự phát triển của mô và để kích thích sự gia tăng sinh khối thực vật và hàm lƣợng chất thứ cấp; các chất bổ sung khác nhƣ axit amin, vitamin, than hoạt tính, chất chống oxy hóa và các chất khác tùy thuộc vào loài cụ thể. Các vật liệu ban đầu cho việc nuôi cấy thƣờng là các chồi mang mô phân sinh, các mảnh lá non và các mô phù hợp khác, đƣợc khử trùng bề mặt (vô trùng) để loại bỏ vi sinh vật sử dụng cồn 70% hoặc natri hypochlorite. Tiếp theo, các vật liệu ban đầu đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy phù hợp để bắt đầu thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro. Khởi đầu của hệ thống có thể là tạo mô sẹo từ các các mô phân sinh, tạo cây hoàn chỉnh, tạo chồi hoặc chỉ là tạo rễ in vitro. Một vài vật liệu ban đầu nhƣ mảnh lá, có thêm một một số giai đoạn đƣợc gọi là organogenesis để biến các dạng tế bào chuyên biệt thành các tế bào có khả năng phân bào và phát triển mô sẹo (indirect organogenesis) hoặc chồi và chồi trực tiếp từ mô ban đầu (direct organogenesis). Sau khi thiết lập thành công giai đoạn khởi đầu nuôi cấy in vitro, không bị nhiễm với vi khuẩn và nấm, các giai đoạn tiếp theo bao gồm quá trình nhân các tế bào, mô, chồi và rễ. Các giai đoạn này rất quan trọng, có tính quyết định về hiệu quả kinh tế của quá trình, chủ yếu là do càng nhiều tế bào và mô đƣợc sản xuất, năng suất của các chất thứ cấp mục tiêu càng cao. Việc nuôi cấy in vitro của các loài cây thuốc có thể giúp sản xuất cây dƣợc liệu theo nhiều phƣơng thức khác nhau nhƣ : i) vi nhân giống trên các dòng vô tính quy mô lớn với chất lƣợng di truyền ổn định và nồng độ chất thứ cấp cao và nhân giống các loài khó nhân giống bằng các phƣơng pháp thông thƣờng, chẳng hạn nhƣ cây có chu kỳ sinh trƣởng dài hoặc bị nhiễm bệnh, ví dụ virus và vi khuẩn nếu nhân bằng phƣơng pháp vô tính thông thƣờng; ii) sử dụng elicitor (sinh học hoặc phi sinh học áp dụng để kích thích sản xuất các chất thứ cấp) để kích thích các mô trong điều kiện in vitro để sản 14
xuất chất thứ cấp mục tiêu; iii) biến đổi gen của cây thuốc để sản xuất chất thứ cấp trong các mô cụ thể, nhằm cải thiện hiệu quả sản xuất sinh khối, tế bào và do đó, chất thứ cấp từ các loài hiếm hoặc khó phát triển trong tự nhiên, hoặc các chất ở nồng độ thấp trong các loài ban đầu đƣợc cải thiện hiệu quả hơn. Quá trình vi nhân giống có thể góp phần vào việc sản xuất thuốc thảo dƣợc và các sản phẩm thông thƣờng sử dụng hợp chất thứ cấp đƣợc chiết xuất từ cây thuốc. Các kỹ thuật vi nhân giống in vitro đẩy nhanh quá trình sản xuất cây vô tính từ giống có khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp tốt hơn và có thể phát triển tốt hơn trong điều kiện tự nhiên. Mặc dù hai phƣơng thức còn lại cũng có thể dẫn đến việc sản xuất các loại thuốc thảo dƣợc, nhƣng đƣợc ứng dụng chủ yếu để sản xuất các chất thứ cấp có giá trị cao vì chi phí của các kỹ thuật liên quan tƣơng đối đắt đỏ [9]. Dùng các chất elicitor là một phƣơng tiện có thể thúc đẩy những khó khăn khác nhau liên quan đến việc sản xuất quy mô lớn của hầu hết các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học quan trọng từ thực vật, nuôi cấy mô biệt hóa và không biệt hóa bằng cách áp dụng nồng độ thấp của các yếu tố sinh học và phi sinh học đã đƣợc tiến hành rộng rãi. Một vài hợp chất hóa học thƣờng đƣợc sử dụng là salicylic axit, metyl salicylat, axit bezoic, chitosan, v.v. có ảnh hƣởng đến sản xuất các hợp chất phenolic và kích hoạt các enzym liên quan đến chống chịu trong thực vật [10]. Đối với tạo cây thuốc biến đổi gen, hiện đang có nhiều yêu cầu về an toàn sinh học liên quan đến việc trồng cây dƣợc liệu chuyển gen ngoài tự nhiên và nhận thức của ngƣời tiêu dùng [9]. Do vậy, các mô chuyển gen in vitro sẽ chỉ có nghĩa là để tạo ra sinh khối cho việc chiết xuất các hợp chất hóa học tinh khiết (nhƣ ở cây không chuyển gen). Các dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp hiếm, nhƣ vincristine và vinblastine đã đƣợc tạo ra. Các tế bào mô sẹo của cây thuốc lá chuyển gen sẽ đóng vai trò là nơi để sản xuất các chất mong 15
muốn. Các tế bào phát triển rất nhanh này sẽ cho phép tăng khả năng sinh tổng hợp chất thứ cấp theo cấp số nhân. Tế bào cây thuốc lá đƣợc lựa chọn vì đây là các tế bào dễ dàng tiến hành biến đổi gen và cho phép điều khiển quá trình phát triển sinh khối. Ngoài ra, cây thuốc lá biến đổi gen đã đƣợc dùng để sản xuất các loại chất có hoạt tính khác nhau nhƣ vắc-xin, hormone và kháng thể [11]. 1.2.2. Các yếu tố chính ảnh hưởng nuôi cấy mô và tế bào cây thuốc in vitro Kiểu gen là yếu tố có ảnh hƣởng trực tiếp đối với việc sản xuất sinh khối thực vật và chất thứ cấp. Các giống có hàm lƣợng chất thứ cấp cao là lựa chọn đầu tiên cho việc sử dụng nuôi cấy mô. Ví dụ nhƣ cây gai Ấn độ (Pilocarpus microphyllus) có hàm lƣợng pilocarpin, một alkaloid có vai trò tăng cƣờng hoạt động của hệ thần kinh giao cảm, nằm trong khoảng từ 16,3 đến 235,9 µg/g lá khô tùy thuộc vào giống [12], có sự chênh lệch đến 14,5 lần về hàm lƣợng pilocarpin. Tuy nhiên, các kiểu gen quý của cây dƣợc liệu có hàm lƣợng chất có hoạt tính cao còn hạn chế và cần phải có những nghiên cứu chi tiết đối với các giống ở từng vùng địa lý khác nhau. Việc sử dụng các kiểu gen có hàm lƣợng chất thứ cấp tự nhiên cao là điều kiện cần thiết để đảm bảo hiệu quả trong nuôi cấy in vitro cây thuốc do chi phí của hệ thống nuôi cấy thƣờng cao hơn so với các kỹ thuật thông thƣờng khác. Bên cạnh đó, vì nuôi cấy in vitro dựa trên nguyên phân, các kiểu gen sinh tổng hợp các chất có hoạt tính cao sẽ dẫn đến hàm lƣợng chất mong muốn cao hơn đáng kể trong cây hoặc các mô đƣợc nuôi cấy. Tuy nhiên, ngay cùng với một kiểu gen thì trong điều kiện phát triển ngoài tự nhiên quần thể cây thƣờng có nhiều biến động về di truyền, dẫn đến biến động về sinh khối và hàm lƣợng chất trao đổi thứ cấp [13]. Do đó, điều cần thiết là phải nghiên cứu tƣơng tác giữa kiểu gen và môi trƣờng, để tạo ra điều kiện nuôi trồng tốt nhất, kể cả với hệ thống nuôi cấy in vitro. Trong điều kiện nuôi trồng ngoài tự nhiên, yếu tố nội sinh nhƣ kiểu gen, loại cơ quan và tuổi 16
mô, đồng hồ sinh học; và các yếu tố ngoại sinh, chẳng hạn nhƣ chu kỳ quang, cƣờng độ chiếu sáng và bƣớc sóng, nhiệt độ, nguồn nƣớc, loại đất và thành phần không khí, có thể riêng rẽ hoặc phối hợp ảnh hƣởng đến cả thành phần và nồng độ của một chất thứ cấp đơn lẻ hoặc nhiều chất khác nhau [14,15]. Những yếu tố tƣơng tự cũng có thể ảnh hƣởng đến hình thành các chất thứ cấp có hoạt tính trong nuôi cấy in vitro. Ví dụ, Kapoor và cs [16] cho biết chỉ cần một thay đổi một yếu tố là chất lƣợng ánh sáng đã có ảnh hƣởng đến tích lũy sinh khối, tốc độ sinh trƣởng và nồng độ của hợp chất phenolic Salidroside trong cây rễ vàng Rhodiola imbricata. Dƣới tác động của ánh sáng đỏ, mô sẹo có chỉ số tăng trƣởng cao nhất (2,97) và nồng độ phenolic tổng số và Salidroside lại cao nhất dƣới ánh sáng xanh sau 21 ngày nuôi cấy. Trong trƣờng hợp này, nuôi cấy mô sẹo để phát triển sinh khối cần ánh sáng trắng và sau đó để tăng cƣờng sinh tổng hợp chất mong muốn sẽ chuyển đổi sang ánh sáng xanh. Các yếu tố khác có thể đƣợc vì thế cũng cần đƣợc tối ƣu hóa để cải thiện quá trình nuôi cấy, chẳng hạn nhƣ kết hợp ánh sáng xanh /trắng với tỷ lệ thích hợp có thể cải thiện đồng thời việc tăng sinh khối và sinh tổng hợp chất thứ cấp. Điều khiển các yếu tố môi trƣờng trong nuôi cấy mô tế bào in vitro để tăng cƣờng sinh khối và theo sinh tổng hợp chất thứ cấp là một ƣu việt của hệ thống này vì không phụ thuộc vào mùa vụ trong năm và trong điều kiện vô trùng. Tuy nhiên, nhƣợc điểm chính nằm ở chi phí sản xuất cao, vì thế cần phải đƣợc bù đắp bằng hệ thống nuôi cấy đƣợc thiết kế phù hợp. Các yếu tố chính đƣợc sử dụng để tính năng suất thu nhận các chất thứ cấp trong điều kiện in vitro chính là khối lƣợng sinh khối tƣơi hoặc khô và nồng độ chất kèm theo, diện tích dùng cho nuôi cấy (bình nuôi hoặc bioreactor) và thời gian cần thiết để có hoàn thành 1 chu kỳ sản xuất. Các yếu tố khác, nhƣ thể tích môi trƣờng nuôi cấy, cũng có thể đƣợc sử dụng trong công thức này. Tuy nhiên, môi trƣờng nuôi cấy thƣờng chiếm chƣa đến 5% tổng chi phí. 17
Diện tích cần dùng cho nuôi cấy in vitro thay đổi tùy theo loại và kích cỡ bình, hiệu quả tạo sinh khối và hệ thống sử dụng. Các hệ thống thông thƣờng bao gồm môi trƣờng bán rắn, chứa agar hoặc môi trƣờng lỏng, có khuấy trộn không liên tục hoặc trong hệ thống bioreactor ngập tạm thời (TIB). Việc sử dụng TIB đƣợc cho gia tăng tích lũy sinh khối tốt hơn so với nuôi cấy trên môi trƣờng bán rắn [17, 18]. Các yếu tố phi sinh học, chẳng hạn nhƣ nhiệt độ, ánh sáng cƣờng độ, thời gian chiếu sáng và bƣớc sóng, độ ẩm tƣơng đối và thành phần không khí quyển trong bình nuôi cũng ảnh hƣởng mạnh đến sự tích lũy sinh khối tƣơi và khô, nồng độ chất trong sinh khối và thời gian nuôi. Những đặc điểm trên cũng phụ thuộc vào từng loài cây thuốc cần nuôi cấy. Môi trƣờng nuôi cấy và các thành phần dinh dƣỡng, chẳng hạn nhƣ lƣợng nƣớc và áp suất của môi trƣờng nuôi cấy, dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, carbohydrate, vitamin và axit amin, và các chất kích thích sinh trƣởng thuộc các nhóm khác nhau nhƣ auxin, cytokinin [19], gibberellin, jasmonate và salicylate [20] cũng ảnh hƣởng sâu sắc đến các đặc điểm này. Các yếu tố ảnh hƣởng khác là loại, cƣờng độ và thời gian tƣơng tác với các elicitor, đƣợc sử dụng để kích thích sinh tổng hợp và tăng nồng độ PDMC vào cuối chu kỳ tăng trƣởng hoặc tích lũy sinh khối thực vật [21]. Elicitor là các chất hóa học đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy, là bức xạ ion hóa hoặc các yếu tố vật lý khác áp dụng cho các tế bào và mô, hoặc thậm chí đồng nuôi cấy mô thực vật với các vi sinh vật nào đó [22] hoặc áp dụng các điều kiện môi trƣờng bất lợi, chẳng hạn nhƣ nhiệt độ cao hoặc thấp trong một thời gian nhất định. Trong số các chất elicitor hóa học đƣợc áp dụng cho môi trƣờng nuôi cấy, có cả các chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ axit salicylic và jasmonic [23], chitosan [24], chiết xuất từ vi sinh vật [25] và các dạng phân tử thế hệ mới khác [26]. Trong số các yếu tố vật lý, bức xạ cực tím đã đƣợc sử dụng 18