Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L.)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:59

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L.) nhằm cung cấp các thông tin về promoter chuyên biệt hạt phấn để phục vụ cho công tác nghiên cứu, chọn tạo giống cây trồng 0thích ứng với biến đổi khí hậu. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƯƠNG KIM OANH PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ CÂY LÚA (Oryza sativa L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƯƠNG KIM OANH PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ CÂY LÚA (Oryza sativa L.) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Tiến Dũng Thái Nguyên – 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi và nhóm nghiên cứu được sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Tiến Dũng. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình. Thái Nguyên, ngày 02 tháng 11 năm 2019 Học viên Trương Kim Oanh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên và các thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm đã truyền dạy kiến thức và kỹ năng cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu của mình. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp cùng tập thể lớp Công nghệ sinh học K25, nhóm sinh viên trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, những người đã luôn sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 02 tháng 11 năm 2019 Học viên Trương Kim Oanh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2 1.3. Ý nghĩa của luận văn .................................................................................. 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Vai trò của cây lúa...................................................................................... 3 1.2.Tổng quan về promoter ............................................................................... 5 1.2.1. Khái niệm về promoter............................................................................ 5 1.2.2. Phân loại promoter .................................................................................. 6 1.2.3. Điều hòa gene ở sinh vật nhân chuẩn ..................................................... 8 1.2.4. Ứng dụng promoter trong công nghệ gene thực vật ............................. 13 1.2.5. Vai trò của yếu tố điều hòa Cis ............................................................. 15 1.3. Vai trò hạt phấn trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng thích ứng với biến đổi khí hậu ............................................................................................... 16 1.4. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium ...................... 18 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21 2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ............................................................... 21 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: .......................................................................... 21 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 21 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 21 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 21 2.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 21 2.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu ..................................................... 21 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 21 2.3.2. Hóa chất................................................................................................. 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
iv 2.3.3. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 23 2.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 23 2.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn............... 23 2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng promoter chuyên biệt hạt phấn và thiết kế vector chuyển gene. ......................................................................................... 23 2.4.3. Nội dung 3: Đánh giá hoạt động của promoter trên cây mô hình Arabidopsis...................................................................................................... 23 2.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 23 2.5.1. Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn ................................... 23 2.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 24 2.5.3. Phương pháp khuyếch đại DNA tổng số bằng kỹ thuật PCR ..................... 25 2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ................................................. 26 2.5.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter ................................. 26 2.5.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến ............... 27 2.5.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp ....................................... 27 2.5.8. Phương pháp tách chiết plasmid ........................................................... 28 2.5.9. Phương pháp định lượng DNA ............................................................. 29 2.5.10. Phương pháp xác định trình tự ............................................................ 30 2.5.11. Thiết kế vector biểu hiện GUS ............................................................ 30 2.5.12. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium ................................ 31 2.5.13. Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis ................................ 32 2.5.14. Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter ............................... 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 34 3.1. Sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn lúa ................................................... 34 3.2. Tách dòng và thiết kế vector .................................................................... 36 3.3. Kết quả nghiên cứu chuyển gene và phân tích biểu hiện gen GUS ......... 38 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 42 4.1. Kết luận .................................................................................................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
v 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 43 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ CaMV Cauliflower mosaic virus ARN pol RNA polymerases TF Transcription factor TBP TATA box binding protein CRE Cis regulatory element IME Intron mediate enhancement ARF Auxin response factors Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi . 16 Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 22 Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR ...................................................... 25 Bảng 2.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid ......................................... 28 Bảng 3.1. Các gene chuyên biệt hạt phấn lúa và vùng promoter tương ứng trong nghiên cứu.............................................................................................. 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thái hoa và hạt phấn Arabidopsis trong điều kiện stress nhiệt độ cao. ............................................................................................................. 18 Hình 2.1. Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dòng .... 27 Hình 2.2. Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR ................ 31 Hình 3.1. Bản đồ nhiệt thể hiện mức độ biểu hiện của các gene RMP ở hạt phấn.. ............................................................................................................... 36 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR201 và vector chuyển gene pKGWFS7 .................................................................................. 38 Hình 3.3. Cấu trúc vector chuyển gene mang promoter RMP ........................ 38 Hình 3.4. Kết quả phân tích cây chuyển gene bằng PCR với cặp mồi GUS- F/GUS-R.......................................................................................................... 39 Hình 3.5. Biểu hiện của gene GUS ở cụm hoa cây chuyển gene ................... 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, khoa học kĩ thuật phát triển vượt bậc gắn liền với đời sống con người, hiện diện trong mọi lĩnh vực với mục đích nâng cao chất lượng cuộc sống. Công nghệ sinh học ra đời đánh dấu bước tiến mới nhất trong nỗ lực lâu dài chinh phục tự nhiên của con người trước những biến đổi khí hậu diễn biến bất thường như nắng nóng, lạnh, lũ lụt, hạn hán diễn ra với mức độ ngày càng thường xuyên và gay gắt hơn, ảnh hưởng nghiêm trọng đến con người và sinh vật trên Trái Đất. Nước ta là một nước nông nghiệp truyền thống, vì vậy việc phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học được tập trung chủ yếu vào nông – lâm – ngư nghiệp, với mục đích đưa nền nông nghiệp nước ta trở thành nền nông nghiệp hiện đại, ứng dụng khoa học kĩ thuật vào sản xuất để tăng chất lượng, năng suất sản phẩm, giảm thiểu sức lao động của con người. Một trong những đối tượng nghiên cứu nhiều nhất của Công nghệ sinh học ứng dụng trong nông nghiệp là cây lúa – loại cây có tầm quan trọng trong phát triển sản xuất nông nghiệp. Nhiều nghiên cứu cho thấy hạt phấn – chính là mục tiêu cho nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng thích ứng với biến đổi khí hậu. Hạt phấn là cơ quan sinh sản quan trọng của cây trồng, liên quan trực tiếp đến năng suất. Hạt phấn thường rất nhạy cảm với điều kiện ngoại cảnh của môi trường, đặc biệt là nhiệt độ. Quá trình hình thành và phát triển của hạt phấn được kiểm soát bởi nhiều gene với các vai trò khác nhau. Kết quả phân tích cơ sở dữ liệu microarry từ các mẫu lúa đã xác định được 1080 gene biểu hiện chuyên biệt cho hạt phấn, trong đó có 410 gene biểu hiện ở giai đoạn đầu hình thành bào tử (early-microspore) và 672 gene ở giai đoạn hạt phấn trưởng thành (late pollen). Đến nay đã có nhiều gene liên quan đến quá trình phát triển của hạt phấn lúa được xác định và đánh giá như OsSCP, OsCP1, OSIPA [40]. Promoter là trình tự nucleotide nằm trước gene phía đầu 5’ tính từ điểm khởi đầu phiên mã (TTS), đóng vai trò quan trọng trong việc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2 điều khiển hoạt động phiên mã của gene để tổng hợp protein, nó được xem như một trong những yếu tố chủ đạo trong nghiên cứu biểu hiện gene. Vì vậy việc phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong công tác nghiên cứu và chọn tạo giống tăng khả năng chống chịu stress của môi trường. Xuất phát từ những lý do trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L.)". 1.2. Mục đích nghiên cứu Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L.) nhằm cung cấp các thông tin về promoter chuyên biệt hạt phấn để phục vụ cho công tác nghiên cứu, chọn tạo giống cây trồng thích ứng với biến đổi khí hậu. 1.3. Ý nghĩa của luận văn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài tạo cơ sở lý luận cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa chịu hạn trong sản xuất, phục vụ nghiên cứu chọn tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gene lúa chịu hạn ở mức phân tử bằng cách điều khiển gene liên quan đến hạt phấn dựa trên các thông tin về promoter chuyên biệt hạt phấn. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L) góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao, có khả năng thích ứng với stress của môi trường, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng khô hạn và cơ cấu sản xuất lúa chịu stress như nắng nóng, nhiệt độ cao ở Việt Nam. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vai trò của cây lúa Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng có khả năng thích nghi rất tốt với điều kiện khí hậu khô nóng rất khắc nghiệt được trồng chủ yếu ở Châu Á, đặc biệt là khu vực Đông Nam Á trong đó có Việt Nam. Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới [25]. Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại an ninh lương thực cho con nguời, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu. Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương thực chính, khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn. Bangladesh và Thái Lan có mức tiêu thụ gạo cao nhất vào những năm 1960 (tương đương 180 kg/người/năm), đến năm 1988 giảm xuống còn khoảng 150 kg. Ở Việt Nam hiện nay mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao, khoảng 120 kg/người/năm. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng đến lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất ra và mức tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á. Lúa là cây trồng thân thiết, lâu đời nhất của nhân dân ta và nhiều dân tộc khác trên thế giới, đặt biệt là các dân tộc ở Châu Á. Mặc dù năng suất lúa ở các nước Châu Á còn thấp nhưng do diện tích sản xuất lớn nên Châu Á vẫn là nguồn đóng góp rất quan trọng cho sản lượng lúa trên thế giới (trên 90%). Các quốc gia dẫn đầu về sản lượng lúa theo thứ tự là Trung Quốc, Ấn Độ, Indoniesia, Bangladesh, Việt Nam, Thái Lan và Myanmar, tất cả đều nằm ở Châu Á. Như vậy, có thể nói Châu Á là vựa lúa quan trọng nhất thế giới. Gạo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
4 là thức ăn giàu dinh dưỡng. So với lúa mì, gạo có thành phần tinh bột và protein thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chất béo hơn. Ngoài ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo hơn lúa mì do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì. Giả sử một người trung bình cần 3200 calo mỗi ngày thì một hecta lúa có thể nuôi 2055 người/ngày hoặc 5,63 người/năm, trong khi lúa mì chỉ nuôi được 3,67 người /năm, bắp 5,3 người/năm. Hơn nữa, trong gạo lại có chứa nhiều acid amin, thiết yếu như: Lysine, Threonine, Methionine, Tryptophan… hơn hẳn lúa mì. Đối với một số quốc gia như Việt Nam, Thái Lan, Miến Điện (Myanmar), Ai Cập lúa gạo chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, không phải chỉ là nguồn lương thực mà còn là nguồn thu ngoại tệ để đổi lấy thiết bị, vật tư cần thiết cho sự phát triển của đất nước. Điều này chỉ rõ vị trí của lúa gạo trong cơ cấu lương thực thế giới và trong đời sống kinh tế quốc tế. Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước cổ xưa nhất thế giới. Nông nghiệp trồng lúa vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước. Dân số nước ta đến nay hơn 90 triệu người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng lao động trong nghề trồng lúa chiếm khoảng 70% lực lượng lao động cả nước. Điều đó cho thấy lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực lượng lao động cả nước, đóng vai trò rất lớn trong nền kinh tế quốc dân. Bên cạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa còn thể hiện rõ ở diện tích canh tác trong tổng diện tích đất nông nghiệp cũng như tổng diện tích trồng cây lương thực. Ngành trồng trọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác trong khi đó lúa giữ vị trí độc tôn, gần 85% diện tích lương thực. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, diện tích trồng lúa khoảng 7,8 triệu ha tập trung ở 2 vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Cửu Long (5,29 triệu ha) và đồng bằng sông Hồng (2,51 triệu ha) với sản lượng lúa cả năm 2014 ước tính đạt 44,84 triệu tấn, năng suất bình quân đạt 57,4 tạ/ha [2]. Như vậy bên cạnh sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
5 thu hút về nguồn lực con người thì sự thu hút nguồn lực đất đai cũng lại khẳng định rõ vị trí của lúa gạo trong nền kinh tế quốc dân. Trong những năm gần đây, Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng năm đứng thứ 5 trên thế giới, nhưng lại là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 thế giới hiện nay với sản lượng gạo xuất khẩu bình quân trên dưới 4 triệu tấn/năm. Thái Lan luôn là nước xuất khẩu gạo dẫn đầu thế giới, cao hơn Việt Nam cả về số lượng và giá trị, do có thị trường truyền thống rộng hơn và chất lượng gạo cao hơn. Mỹ, Ấn Độ, Pakistan cũng là những nước xuất khẩu gạo quan trọng, sau Việt Nam. Hiện nay, Việt Nam đứng hàng thứ 6 thế giới về diện tích gieo trồng lúa. Hạt gạo Việt Nam chẳng những đủ bảo đảm yêu cầu về an ninh lương thực trong nước mà còn góp phần rất quan trọng trong thị trường lúa gạo thế giới [2]. 1.2.Tổng quan về promoter 1.2.1. Khái niệm về promoter Promoter là trình tự nucleotide cần thiết để ARN pol bám vào khởi động quá trình phiên mã. Trình tự này nằm ngay trước vị trí (+1) ở các hệ gene của prokaryotes (sinh vật nhân sơ). Trong khi đó promoter ở hệ gene của eukaryotes (sinh vật nhân chuẩn) thường gồm vị trí nhận biết bởi ARN pol và các trình tự đặc biệt nhận biết bởi yếu tố phiên mã. Đó là do phiên mã trên gene của sinh vật nhân sơ có thể xảy ra ngay khi một mình ARN pol bám vào promoter trong khi điều này hầu như không xảy ra với các gene của sinh vật nhân chuẩn [6]. Trình tự cơ bản của promoter (code promoter) thường gồm các nucleotide ở vị trí -10 đến vài nucleotide sau +1 đối với gene ở sinh vật nhân sơ hoặc gồm các nucleotide ở vị trí - 40 đến + 20 đối với gene của sinh vật nhân chuẩn. Hầu hết các trình tự gene sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn đều có chứa một đoạn ngắn giàu A- T gọi là hộp TATA. Hộp TATA thường ở vị trí - 10 ở promoter sinh vật nhân sơ nhưng phân bố ở vị trí - 25 ở promoter sinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
6 vật nhân chuẩn. Khi promoter chỉ có trình tự cơ bản thì mức độ phiên mã xảy ra rất thấp, tuy nhiên sẽ tăng lên rất nhiều khi có thêm trình tự nằm phía trước trình tự cơ bản. Trình tự thứ hai này thường nằm ở vị trí - 35 đối với gene sinh vật nhân sơ, hoặc vị trí - 70 đến - 90 ở gene sinh vật nhân chuẩn [6]. Promoter của gene ở sinh vật nhân chuẩn mã hóa cho protein được nhận biết bởi ARN pol II khi mà hầu hết các yếu tố phiên mã đã có mặt ở promoter. Phiên mã ở sinh vật nhân chuẩn cũng đòi hỏi các trình tự tăng cường enhancer đặc thù cho từng gene hoặc nhóm gene, có thể nằm phía trước, sau hoặc ngay trong gene để tăng cường mức độ phiên mã trên promoter [6]. 1.2.2. Phân loại promoter a. Promoter không đặc hiệu Promoter không đặc hiệu hay còn gọi là promoter cơ định (constitutive promoter) tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gene ở tất cả hoặc hầu như tất cả các loại mô khác nhau trong tất cả hay hầu như mọi giai đoạn phát triển của sinh vật. CaMV35S promoter điều khiển sự biểu hiện ARN 35S được phân lập từ virut khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus – CaMV) là một ví dụ điển hình của nhóm promoter này. CaMV là một pararetrovirus của các thực vật thuộc họ cải. Hệ gene của virus này là một phân tử DNA vòng sợi kép có kích thước 8kb với ba quãng ngắt là sợi đơn, hai bản phiên mã mARN chính (19S và 35S) và sáu khung đọc mở được mã hóa bởi DNA. Sự phiên mã xảy ra từ tiểu nhiễm sắc thể vòng và không tiếp hợp trong nhân của tế bào thực vật và DNA virion được tổng hợp trong tế bào chất thông qua sự phiên mã ngược của mARN 35S. CaMV35S promoter là trình tự có kích thước vào khoảng 350 bp nằm ở phía đầu của mARN 35S ( -343 đến +8, với vị trí Cap ở +1), trong đó khoảng 250 bp gối lên 3% đoạn kết thúc của gene V1, khung đọc mở cuối cùng trong 6 khung đọc mở lớn. Có 3 vùng trên promoter, promoter trung tâm chứa hộp TATA (vị trí từ - 46 đến +8) và hai vùng chính khác có chức năng tăng cường. Vùng A (- 90 đến – 46) chủ yếu cần cho biểu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
7 hiện ở rễ và vùng B (- 343 đến – 90) cần cho biểu hiện ở lá [14], [28], [30]. Tiểu vùng của vùng B (B1 đến B5) có thể được nhận dạng dựa trên những tương tác khác biệt với những nhân tố phiên mã khác nhau. Tuy nhiên, vùng B hoàn chỉnh cho phép biểu hiện đa dạng hơn so với trường hợp kết hợp các tiểu vùng. Vai trò của các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc gây bệnh của CaMV mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây [36], [46]. Các nghiên cứu cho thấy việc loại bỏ hộp TATA làm mất khả năng gây nhiễm. Hai vùng tăng cường tách biệt liên quan đến khả năng gây nhiễm đã được xác định là (- 207 đến – 150) và (- 95 đến – 56). Vùng tăng cường thậm chí có thể hoạt động theo hướng ngược chiều [4]. b. Promoter đặc hiệu Promoter đặc hiệu chuyên biệt (specific promoter) với các yếu tố Cis chuyên biệt điều khiển gene hoạt động ở mẫu mô nhất định. Sự biểu hiện đặc hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của gene giới hạn ở một hoặc một vài mô (hạn chế về không gian – spatial limitation) hoặc ở một vài giai đoạn phát triển (đặc hiệu thời gian – temporal limitation). Cần nhấn mạnh rằng không có một promoter hoàn toàn đặc hiệu: các promoter dường như hoạt động ở một số mô, trong khi ở một số mô khác không hoặc chỉ hoạt động yếu. Hiện tượng này được biết đến là sự biểu hiện yếu. Promoter đặc hiệu mô (tissue specific promoter): Các loại promoter đặc hiệu mô chỉ điều khiển biểu hiện gene ở những mô nhất định, ví dụ promoter đặc hiệu rễ [18], promoter đặc hiệu bó mạch thực vật, promoter đặc hiệu hoa. Thuộc nhóm promoter này có promoter điều khiển biểu hiện gene mã hóa sucrose synthase. Sucrose synthase là một trong những enzyme quan trọng tham gia vào mọi hoạt động sống của tế bào. Ở lúa, người ta đã phát hiện được ba gene cùng mã hóa cho sucrose synthase (Rsuc 1, Rsuc2, Rsuc3) [48]. Tuy nhiên mức độ biểu hiện của các gene này ở các mô là khác nhau. Gene Rsuc2 không có tính đặc hiệu mô cao. Gene Rsuc3 đặc hiệu cao ở hạt [31]. Chỉ có gene Rsuc1 biểu hiện đặc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
8 hiệu ở bó mạch, rễ, mầm. Kích thước của gene Rsuc1 là 8167 bp, trong đó kích thước của vùng 5’ tương đối lớn, chiếm khoảng 3kp. Promoter của Rsuc1 chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp TATA, hộp CCAAT…và các trình tự đặc hiệu, quyết định sự biểu hiện gene đặc hiệu bó mạch như hộp ASL, hộp GAGA…[47]. c. Promoter cảm ứng Là promoter cảm ứng với môi trường (environmentally inducible promoter) chỉ điều khiển gene hoạt động trong các điều kiện nhất định. Chẳng hạn trong các điều kiện cực đoan (stress) như hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, oxy hóa cao, nồng độ muối quá cao…các gene chống chịu thường biểu hiện với tốc độ rất nhanh. Vì vậy vấn đề khởi động sự phiên mã cũng như cấu trúc promoter của chúng và các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gene thông qua việc nhận biết và hoạt hóa quá trình khởi động phiên mã được đặc biệt quan tâm [4]. Để nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sàng lọc promoter theo các hướng điều khiển khác nhau tùy mục đích nghiên cứu, bao gồm: (i) promoter cảm ứng (inducible promoter) chỉ điều khiển gene hoạt động trong điều kiện nhất định; (ii) promoter cơ định (constitutive promoter) điều khiển gene hoạt động liên tục ở tất cả các mẫu mô; (iii) Promoter chuyên biệt (specific promoter) điều khiển gene hoạt động ở mẫu mô nhất định. Trong số các nhóm trên, promoter cơ định như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng phổ biến nhất [17]. Tuy nhiên những promoter này thường tạo ra kiểu hình không mong muốn do hoạt động không định hướng của gene gây ra. Vì thế để khắc phục điều này các nhà khoa học có xu hướng sử dụng các promoter chuyên biệt để điều khiển các gene ở các mô, bộ phận theo chủ đích [35]. 1.2.3. Điều hòa gene ở sinh vật nhân chuẩn Hoạt động của gene chịu sự kiểm soát của những cơ chế, ta gọi đó là sự điều hòa gene. Những hệ thống điều hòa của các sinh vật nhân sơ và sinh vật Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
9 nhân chuẩn có phần nào khác nhau. Nguyên lý chung của sự điều hòa là sự tổng hợp của một mARN nào đó xảy ra khi sản phẩm của gene là cần thiết và nó bị kìm hãm khi sản phẩm này là không cần thiết, gọi là cơ chế điều hòa mở - đóng. Ở các sinh vật nhân chuẩn thì sự đóng hoàn toàn của một gene là hết sức phổ biến [8]. Tế bào sinh vật nhân chuẩn gồm có hai kiểu phổ biến là những đơn bào sống tự do như nấm men, tảo và những tế bào ở trong mô có tổ chức. Nhóm sau khác với nhóm trước và khác với sinh vật nhân sơ ở chỗ môi trường của các tế bào trong mô thường không có biến đổi lớn theo thời gian. Khi đã biệt hóa, các tế bào ổn định và sản sinh ra những chất nhất định hoặc với tốc độ không đổi hoặc phản ứng thích hợp với những thay đổi của môi trường như hormone và sự thay đổi nhiệt độ. Những sinh vật nhân chuẩn đơn bào sống tự do và các sinh vật nhân sơ thì chung các đặc điểm điều hòa nhất định mặc dù tổ chức hệ gene khác nhau. Nói chung, sự điều hòa gene ở sinh vật nhân chuẩn có một số điểm sai khác đáng chú ý so với sinh vật nhân sơ. Thứ nhất, ở sinh vật nhân chuẩn thường chỉ có kiểu polypeptide đơn được dịch mã từ một phân tử mARN hoàn chỉnh, mARN đa gene chỉ có ở sinh vật nhân sơ, do vậy mà những kiểu operon bắt gặp ở sinh vật nhân sơ không tìm thấy ở sinh vật nhân chuẩn. Thứ hai, DNA của sinh vật nhân chuẩn liên kết với các histon tạo thành chất nhiễm sắc và với nhiều protein phi histon, chỉ có một phần nhỏ là DNA trần, khác với ở sinh vật nhân sơ, một vài protein có mặt trong nhiễm sắc thể cuộn gập nhưng hầu hết lại tự do. Vì vậy mà những yếu tố điều hòa có thể tác động trực tiếp lên DNA sinh vật nhân sơ lại không thể xảy ra trên sinh vật nhân chuẩn. Thứ ba, một phần đáng kể DNA của sinh vật nhân chuẩn bao gồm những đoạn ngắn nucleotitde được lặp lại hàng trăm đến hàng triệu lần, một số ít đoạn được lặp lại nối tiếp, nhưng đa số các đoạn lặp lại là không nối tiếp (phân tán). Trong khi đó ở sinh vật nhân sơ chỉ chứa một vài đoạn lặp lại không kể các gene rARN, tARN và một số đoạn nhất định của các gene khởi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
10 đầu. Thứ tư, một phần lớn các đoạn base ở sinh vật nhân chuẩn không được dịch mã, gọi là các intron. Thứ năm, các sinh vật nhân chuẩn có những cơ chế nhằm sắp xếp lại các đoạn DNA nhất định theo một cách có kiểm soát và để làm tăng số lượng bản sao của các gene đặc trưng khi cần thiết, điều này thì ít có ở sinh vật nhân sơ. Thứ sáu, mối tương quan giữa các base và các acid amine thường không đồng tuyến tính ở sinh vật nhân chuẩn, các intron có mặt ở hầu hết các gene và ARN thì thường phải được biến đổi trước khi bắt đầu dịch mã. Thứ bảy là ở sinh vật nhân chuẩn ARN được tổng hợp trong nhân và phải được vận chuyển qua màng nhân ra tế bào chất để sử dụng và điều này thì không xảy ra ở sinh vật nhân sơ [8]. Điều hòa biểu hiện gene ở sinh vật nhân chuẩn là quá trình điều hòa phiên mã và điều hòa dịch mã với các bước cơ bản sau: 1. Tổng hợp ARN tiền thân 2. Cải biến sau phiên mã 3. Phân giải mARN 4. Tổng hợp protein 5. Cải biến sau dịch mã 6. Hướng đích và vận chuyển 7. Phân giải protein Điều hòa phiên mã ARN pol xúc tác cho quá trình phiên mã nhưng sự hoạt động của enzyme này chịu sự phụ thuộc của một số nhân tố khác, trong đó có một số loại protein đặc biệt gọi là nhân tố phiên mã, thuật ngữ tiếng Anh là “transcription factor” (TF). Đoạn DNA tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gene, có cấu trúc gồm hai phần đối xứng nhau, được gọi là trình tự cis. Trình tự này nằm ở phần điều hành, là nơi tiếp nhận các protein điều hoà (nhân tố trans). Đặc điểm cấu tạo chung của nhân tố trans là chúng bao gồm hai vùng cấu trúc: vùng chịu trách nhiệm gắn nhân tố trans vào trình tự cis và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn