Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN VĂN THÀNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở

MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH

CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN VĂN THÀNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở

MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH

CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 8. 42. 02. 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN XUÂN VŨ

Thái Nguyên - 2020

i

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu khả năng

tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens” là trung thực, được thực hiện tại Khoa Công

nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm- Đại học Thái

Nguyên. Ngoài ra, trong bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã

được trích dẫn rõ ràng và được phép công bố.

Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung khác

trong đề tài của mình.

Học viên

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được

sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn

T.S Nguyễn Xuân Vũ đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình

thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực

phẩm cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn

thành đề tài nghiên cứu này.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,

người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực

hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

Học Viên

iii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

viết tắt (cả tiếng Anh và tiếng Việt)

CT Công thức

LSD Least Singnificant Difference Test – Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa

Coeficient of Variation – Hệ số biến động CV

MT Môi trường

TN Thí nghiệm

AS Acetosyringone

LB Left border- ranh giới trái

RB Right border-ranh giới phải

MS Murashige Skoog

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019 ............................................... 9

Bảng 1.2. Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019 ............................................................... 9

Bảng 2.1. Danh mục giống nghiên cứu ...................................................................... 19

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của NaOCl 3% tới hiệu quả khử trùng mẫu

(sau 7 ngày nuôi cấy) .................................................................................................. 29

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo

của một số giống lúa ................................................................................................... 30

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹo ở một số giống lúa

(sau 14 ngày) ............................................................................................................... 33

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi một số giống lúa ............ 34

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh ở một số giống lúa ............. 35

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen GUS

của một số giống lúa ................................................................................................... 37

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen ở một số

giống lúa ...................................................................................................................... 39

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen GUS

của một số giống lúa ................................................................................................... 40

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen .................. 42

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen ......... 43

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc mô sẹo

chuyển gen .................................................................................................................. 44

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2018 [16] ........................ 6

Hình 1.2. Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018 ................................................... 7

Hình 1.3. Vi khuẩn A. tumefaciens ............................................................................ 10

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ...................... 10

Hình 1.5. Cấu trúc Ti-plasmid .................................................................................... 11

Hình 1.6. Cấu trúc T-DNA ......................................................................................... 12

Hình 1.7. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens ................ 13

Hình 2.1. T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen

điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải). ............ 20

Hình 3.1. Mô sẹo tái sinh trên môi trường N6 (A) và MS (B)

ở giống lúa Bao thai sau 7 ngày nuôi cấy. .................................................................. 31

Hình 3.2. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa

(sau 14 ngày). A- Nếp 87; B- Bao thai; C- Khang dân; D- Đoàn kết .................... 33

Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa

(sau 28 ngày). A-Đoàn kết; B- Nếp 87 ; C-Khang dân; D- Bao thai ......................... 34

Hình 3.4. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa

(sau 28 ngày). A-Nếp 87; B- Đoàn kết; C-Khang dân; D- Bao thai ......................... 35

Hình 3.5. Biểu hiện gen GUS ở mô sẹo 3 ngày tuổi của giống Khang dân (A),

Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D). ................................................................. 38

Hình 3.6. Biểu hiện gen GUS ở nồng độ AS 100 µM ở giống Khang dân (A),

Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D). ................................................................. 40

Hình 3.7. Biểu hiện gen GUS sau 3 phút lây nhiễm với vi khuẩn ở giống

Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D). ....................................... 41

Hình 3.8. Biểu hiện gen GUS sau 3 ngày đồng nuôi cấy ở giống Khang dân (A),

Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D). ................................................................. 43

Hình 3.9. Chọn lọc tế bào chuyển gen trên môi trường hygromycin 10mg/l (A),

15 mg/l (B), 20 mg/l (C) và 25 mg/l (D) .................................................................... 44

vi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ................................................. iii

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... iv

DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. v

MỤC LỤC .......................................................................................................... vi

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1

2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................ 3

3. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 3

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .......................................................... 3

4.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................... 3

4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 3

Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4

1.1. Vai trò của cây lúa ........................................................................................ 4

1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới ........................................ 5

1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới ....................................... 5

1.2.2. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới .................................................................... 6

1.3. Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam ........................................... 7

1.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam. ...................................................... 7

1.3.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam ..................................................................... 8

1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật .. 10

1.4.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens .............................. 10

1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA ........................................... 11

1.4.3. Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật ........... 12

1.5. Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua

vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu .................................... 14

1.5.1. Gen gusA .......................................................................................................... 14

1.5.2. Gen bar .............................................................................................................. 14

vii

1.6. Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa ...................................................... 14

1.6.1. Phương pháp vi tiêm ......................................................................................... 14

1.6.2. Chuyển gen bằng xung điện .............................................................................. 15

1.6.3. Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) ........................................................... 15

1.6.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen ........................................................................ 15

1.7. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens ............................................ 16

1.8. Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây lúa trên thế giới và Việt Nam ..... 16

1.9. Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cây lúa trên thế giới

và Việt Nam ....................................................................................................... 17

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 19

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................ 19

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 19

2.1.2. Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu .......................................................... 19

2.1.3. Thiết bị sử dụng ................................................................................................ 20

2.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ................................................................... 20

2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ......................................................... 21

2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa ........ 21

2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng

chuyển gen ở một số giống lúa ................................................................................... 23

2.4. Điều kiện bố trí thí nghiệm .......................................................................... 26

2.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá. ................................................................. 26

2.5.1. Các chỉ tiêu theo dõi ......................................................................................... 26

2.5.2. Các chỉ tiêu đánh giá ......................................................................................... 26

2.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 27

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 29

3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh invitro của một số giống lúa ............. 29

3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy ........ 29

3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo ....................... 30

3.1.3. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa ................. 32

3.1.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa ............... 33

viii

3.1.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa

Việt Nam ..................................................................................................................... 35

3.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen................................................. 36

3.2.1. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến hiệu quả biến nạp gen ................................... 36

3.2.2. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen ............................. 38

3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống lúa ...... 39

3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen ......................... 41

3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen .................. 42

3.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc chuyển gen ........ 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 45

1. Kết luận ......................................................................................................... 45

2. Kiến nghị ....................................................................................................... 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 47

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lương thực chính quan trọng

hàng đầu của con người, cung cấp từ 60 đến 70% calories [25]. Trên thế giới, cây lúa

nước được xếp vào vị trí thứ 2 sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng.Việt Nam

một đất nước đã gắn liền với nền văn minh lúa nước, cây lúa có vai trò đặc biệt quan

trọng, trong sản xuất lương thực, đóng góp sản lượng cao nhất (60%) và được canh

tác với diện tích 4.126,4 nghìn ha, với quy mô giảm qua các năm, phân tán, manh

mún do sự phát triển của công nghiệp hoá. Hiện nay, diện tích đất nông nghiệp bình

quân/hộ chỉ vào khoảng 0,46 ha và trung bình được chia thành 2,83 mảnh [7]. Trong

khi dân số đang không ngừng tăng lên, việc tạo ra bộ giống có năng suất cao, chất

lượng tốt là yêu cầu cấp thiết trong giai đoạn hiện nay. Các giống lúa đột biến dựa

trên việc sử dụng tác nhân đột biến làm biến đổi bộ gen cho kích thước hạt dài, giá trị

dinh dưỡng, năng suất cao, đồng thời tạo ra cây lúa kháng thuốc diệt cỏ đồng hợp tử,

nhạy cảm với nhiệt độ thấp, đặc biệt là ở giai đoạn non. Việc tạo ra các giống lúa có

khả năng chống chịu được với điều kiện bất lợi ngoại cảnh đặc biệt là hạn hán có ý

nghĩa quan trọng đối với việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định

an ninh lương thực quốc gia.

Sự phát triển của công nghệ sinh học cho phép chọn tạo ra những giống cây

trồng, vật nuôi mới phù hợp với mục đích sử dụng. Việc chỉnh sửa bộ gen cũng có

thể được sử dụng để sửa đổi gen lúa tạo ra các giống lúa an toàn và từ đó tăng giá trị

trong mỗi sản phẩm lúa gạo. Việt Nam khí hậu ôn hòa, đất đai phì nhiêu, điều kiện tự

nhiên phù hợp với phát triển nền nông nghiệp lúa nước, diện tích đồng bằng ven

sông lớn như đồng bằng sông Cửu Long 4.081,63 ha và đồng bằng Sông Hồng

2.126,3ha [7]. Lượng mưa trung bình vào khoảng 700 – 5000mm,…là những thế

mạnh giúp chúng ta phát triển lĩnh vực nông nghiệp. Thế nhưng, khi đi sâu vào thực

tế, gạo Việt Nam vẫn còn tồn đọng một số hạn chế nhất định bên cạnh những ưu

điểm vang danh bấy lâu.

Hiện nay, phương pháp dùng để chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm [19, 30]. Tuy nhiên, có nhiều

2

công trình nghiên cứu báo cáo việc biến nạp gen thành công vào lúa nhờ vi khuẩn A.

tumefaciens. Chan et al (1992) là những người đầu tiên chuyển gen vào callus lúa

mặc dù khi đó không thu được cây chuyển gen [9]. Đến năm 1993, nhóm nghiên cứu

này đã tạo ra được cây lúa japonica chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A. tumefaciens

bằng cách nuôi cấy phôi non. Hiện nay, biến nạp gen vào lúa nhờ vi khuẩn A.

tumefaciens là phương pháp được lựa chọn sử dụng hơn cả, do số bản sao của gen

biến nạp được chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bền vững [20]. Đặc biệt,

phương pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng chuyển được đoạn DNA có

kích thước lớn và chi phí thấp.

Các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phương pháp lai

tạo nên hiệu quả đạt được không thực sự cao. Một số ứng dụng mới trong chọn giống

cây trồng nhờ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến... tuy đã đạt được một số kết quả

nhất định nhưng vẫn có những hạn chế. Phương pháp chuyển gen ra đời được ví như

“chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà

chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi

chúng được kết hợp với nhau. Với hướng nghiên cứu này, các gen quy định những

tính trạng quan tâm được chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra cácgiống lúa mang

các đặc tính như mong muốn của con người.

Những năm gần đây, ngành lúa gạo của Việt Nam gặp nhiều khó khăn cả về

điều kiện khí hậu, giá và thị trường xuất khẩu. Bên cạnh đó, các thách thức về biến

đổi khí hậu, thiếu hụt nguồn nước, thoái hóa đất,…đang ngày càng hiện rõ. Duy trì

sản lượng lúa gạo lớn là một chính sách đã được áp dụng từ lâu. Nghị quyết

63/2009/NQ-CP về đảm bảo an ninh lương thực quốc gia yêu cầu duy trì sản lượng

lúa 41-42 triệu tấn đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu khoảng 4

triệu tấn gạo/năm. Đây là một chính sách sản lượng nhằm hướng tới hai mục tiêu an

ninh lương thực trong nước và xuất khẩu với một chỉ tiêu cứng nhắc. Chính sách

khuyến khích sản lượng cao dẫn đến nhiều hệ quả bất lợi cho nông dân trồng lúa.

Chính vì vậy, hướng tiếp cận nghiên cứu nguồn gen lúa gạo Việt Nam phục vụ cho

công tác bảo tồn đa dạng sinh học nguồn gen ngành lúa được lưu giữ trong phòng thí

nghiệm cũng như ngoài thực địa dùng làm nguyên liệu ban đầu để tuyển chọn và

phát triển thương mại phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu. Vì vậy,

3

các nghiên cứu phải đặt trong hệ thống khép kín, tương tác lẫn nhau từ khâu điều tra,

xác định, phân loại, chọn, tạo giống, tới kỹ thuật nuôi trồng và định hướng thị trường

tiêu thụ sản phẩm tập trung và bền vững. Nhằm tận dụng và phát triển nguồn gen lúa

của Việt Nam chưa được khai thác một cách hợp lý và khoa học. Việc nghiên cứu

khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phục vụ cho công tác tạo giống lúa chuyển

gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất là cần thiết.

Xuất phát từ những vấn đề trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả

năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.

2. Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy

trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phục vụ cho công

tác tạo giống lúa chuyển gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất.

3. Đối tượng nghiên cứu

Một số giống lúa : Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

Đề tài tạo cơ sở lý luận cho việc nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số

giống lúa, xây dựng và hoàn thiện được quy trình nghiên cứu chuyển gen của một số

giống lúa Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Phân tích, đánh giá những mặt thuận lợi, tiềm năng lợi thế và hạn chế để tiếp

cận hướng nghiên cứu, kỹ thuật tái sinh, kỹ thuật nhân nhanh bằng phương pháp in

vitro cho sự phát triển của từng giai đoạn đảm bảo ý nghĩa thực tiễn là bảo tồn và

phát triển nguồn gen lúa gạo Việt Nam.

Việc nghiên cứu nguồn gen lúa gạo Việt Nam phục vụ cho công tác bảo

tồn đa dạng sinh học nguồn gen được lưu giữ trong phòng thí nghiệm cũng như

ngoài thực địa dùng làm nguyên liệu ban đầu để tuyển chọn và phát triển

thương mại phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu.

4

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vai trò của cây lúa

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng được trồng chủ yếu ở Châu

Á, đặc biệt là khu vực Đông Nam Á trong đó có Việt Nam. Lúa gạo là nguồn lương

thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới. Sản lượng lúa gia tăng trong thời

gian qua đã mang lại sự an sinh cho con người, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là

nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu. Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương

thực chính, khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế

bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn. Ở Việt Nam hiện nay

mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao, khoảng 120 kg/người/năm. Tuy

nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng đến lúa gạo hoặc các sản

phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực

chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ

khác nhau. Lượng lúa được sản xuất ra và mức tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực

Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn 1,5 tỷ dân sống nhờ lúa gạo,

chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này theo ước đoán đã tăng lên gần gấp đôi.

Lúa là cây trồng thân thiết, lâu đời nhất của nhân dân ta và nhiều dân tộc khác

trên thế giới, đặt biệt là các dân tộc ở Châu Á. Mặc dù năng suất lúa ở các nước Châu

Á còn thấp nhưng do diện tích sản xuất lớn nên Châu Á vẫn là nguồn đóng góp rất

quan trọng cho sản lượng lúa trên thế giới (trên 90%). Các quốc gia dẫn đầu về sản

lượng lúa theo thứ tự là Trung Quốc, Ấn Độ, Indoniesia, Bangladesh, Việt Nam,

Thái Lan và Myanmar tất cả đều nằm ở Châu Á. Như vậy, có thể nói Châu Á là vựa

lúa quan trọng nhất thế giới. Gạo là thức ăn giàu dinh dưỡng. So với lúa mì, gạo có

thành phần tinh bột và protein hơi thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do

chứa nhiều chất béo hơn. Ngoài ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều

calo hơn lúa mì do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì. Giả sử một người

trung bình cần 3200 calo mỗi ngày thì một hecta lúa có thể nuôi 2055 người/ngày

hoặc 5,63 người/năm, trong khi lúa mì chỉ nuôi được 3,67 người /năm, bắp 5,3

người/năm. Hơn nữa, trong gạo lại có chứa nhiều acid amin, thiết yếu như: Lysine,

Threonine, Methionine, Tryptophan… hơn hẳn lúa mì. Đối với một số quốc gia như

Việt Nam, Thái Lan, Miến Điện (Myanmar), Ai Cập lúa gạo chiếm một vị trí quan

5

trọng trong nền kinh tế quốc dân, không phải chỉ là nguồn lương thực mà còn là

nguồn thu ngoại tệ để đổi lấy thiết bị, vật tư cần thiết cho sự phát triển của đất nước.

Điều này chỉ rõ vị trí của lúa gạo trong cơ cấu lương thực thế giới và trong đời sống

kinh tế quốc tế.

Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước cổ

xưa nhất thế giới. Nông nghiệp trồng lúa vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia,

vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước. Dân số nước ta đến nay hơn 90 triệu

người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng lao động trong nghề

trồng lúa chiếm khoảng 70% lực lượng lao động cả nước. Điều đó cho thấy lĩnh vực

nông nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực lượng lao động cả nước, đóng vai trò

rất lớn trong nền kinh tế quốc dân. Bên cạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa còn

thể hiện rõ ở diện tích canh tác trong tổng diện tích đất nông nghiệp cũng như tổng

diện tích trồng cây lương thực. Ngành trồng trọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác

trong khi đó lúa giữ vị trí độc tôn, gần 85% diện tích lương thực. Theo số liệu sơ bộ

của Tổng cục Hải quan, tính chung cả năm 2019 cả nước xuất khẩu 6,37 triệu tấn

gạo, tương đương 2,81 tỷ USD, tăng 4,1% về lượng nhưng giảm 8,4% về kim ngạch

so với năm 2018. Giá xuất khẩu đạt 440,7 USD/tấn, giảm 12,1%. Kết quả báo cáo

tổng kết 7 tháng đầu năm 2020, Việt Nam xuất khẩu khoảng 3,9 triệu tấn gạo, đạt

kim ngạch 1,9 tỉ USD, tăng 10,9% về giá trị so với cùng kỳ năm trước. Đặc biệt là

giá gạo xuất khẩu của Việt Nam tăng cao, vượt Thái Lan, Ấn Độ và Pakistan. Đây là

lần thứ 2 Việt Nam có thể trở lại vị trí xuất khẩu gạo số 1 thế giới.

1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới

1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới

* Nghiên cứu tái sinh invitro và chuyển gen

Tái sinh cây từ mô sẹo được thông báo lần đầu tiên ở loài cây ngũ cốc bởi

Tamaoki và Ullstrup năm 1958. Cho đến nay mô sẹo đã được tạo ra từ các mô lúa

khác nhau như lát cắt thân, hoa non, bao phấn, tiểu bào tử, đỉnh rễ, bao lá mầm, trụ

dưới lá mầm, hạt trưởng thành. Hiện nay, hạt trưởng thành và hạt non (phôi non)

được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu nhiều nhất vì các vật liệu này cho mô sẹo có tỷ

lệ tái sinh cây cao hơn.

Năm 1985, tái sinh cây từ phôi trưởng thành ở các giống lúa Japonica được

thông báo bởi Fujimura và cộng sự [17]. Tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các giống lúa

6

indica từ phôi non được thông báo bởi Koetije và cộng sự năm 1989 nhiều nghiên

cứu cũng chỉ ra rằng các giống lúa Indica có sự khác nhau đáng kể về phản ứng

tạo mô sẹo và tái sinh cây. Do đó, để cải thiện hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây,

cần thiết tối ưu hóa môi trường cho các giống lúa indica.

Lin và Zhang (2005) đã tối ưu hóa môi trường và các điều kiện nuôi cấy

phục vụ biến nạp gen cho hiệu quả cao ở các giống lúa indica [26].

Lin và Zhang đã chỉ ra rằng nguyên nhân chính thu được tỷ lệ biến nạp thành

công thấp ở các giống lúa indica (so với các giống lúa japonica) có thể do hiệu quả

tái sinh của các giống lúa indica thấp hơn. Họ đã tìm ra được hai môi trường mới để

cấy chuyển, phân hóa mô sẹo và sử dụng quy trình tái sinh cây để biến nạp cho các

giống lúa indica.

Hiei và cộng sự (2008) đã tối ưu hóa quy trình biến nạp cho các giống lúa

indica bằng Agrobacterium tumerfaciens sử dụng phôi non của hạt non sau thu phấn

8-12 ngày. Quy trình đã được áp dụng để biến nạp thành công với hiệu quả cao (trên

7 dòng/phôi) cho các giống lúa indica IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64, IR72, Xin

Qing Ai 1, Nan Jin 11 và Suewon 258 [20].

1.2.2. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới

Theo cơ quan FAO tại Rome, sản xuất lúa thế giới trong 2018 tương đối thuận

lợi đạt đến 782 triệu tấn, tăng 1,6% so với năm 2017, mặc dù điều kiện khí hậu bất

thường xảy ra tại nhiều nơi, với diện tích trồng toàn cầu khoảng 168 triệu ha.

Hình 1.1. Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2018 [16]

7

Hình 1.2. Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018

Châu Á, sản xuất lúa đứng đầu châu lục chiếm gần 90,7% tổng sản ngạch thế

giới hay đạt đến 594,7 triệu tấn.

Ở Châu Phi, sản xuất 22,6 triệu tấn, hay 3,4% mặc dù gặp hạn hán và ngập lụt

tại vài nơi ở Burkina Faso, Gambia, Niger, Tanzania và Madagascar.

Ở Châu Mỹ, sản xuất lúa đạt đến 33,8 triệu tấn, Brazil là nước sản xuất lúa lơn

nhất của vùng, năm 2018 với sản lượng 11,3 triệu tấn.

Ở Châu Âu, sản xuất trong 2018 khoảng 3,6 triệu tấn lúa. Hai nước trồng lúa

lớn của Châu Âu là Ý và Tây Ban Nha.

Châu Úc, năm 2018 Sản ngạch lúa thu hoạch đạt đến 815.964 tấn.

1.3. Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam

1.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam.

1.3.1.1. Chọn tạo giống bằng lai hữu tính

Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (2015) nghiên cứu giống lúa nếp N31 có

năng suất, chất lượng tốt và thời gian sinh trưởng ngắn ngày được chọn tạo bằng

phương pháp lai hữu tính giữa tổ hợp lai hai giống nếp DT22 và giống nếp N87-2

(N98) [2].

8

1.3.1.2. Chọn tạo giống bằng công nghệ tế bào

* Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro

Phan Thị Hương và cộng sự (2014) đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh

của bảy giống lúa bao gồm BM9630, NV1, NV2, NV3, J02 (thuộc nhóm japonica),

Hương Cốm và BC15 (thuộc nhóm indica) [4]. Tỷ lệ tạo mô sẹo

của các giống lúa nghiên cứu trong khoảng 72-98%; trong đó, giống Hương cốm,

NV1 và J02 có tỷ lệ tạo mô sẹo trên 90% (tương ứng 97%, 92% và 98%). Môi

trường tạo mô sẹo thích hợp đối với giống Hương cốm và các giống japonica là môi

trường muối N6 + vitamin B5 + 3 mg/l 2,4-D + 100 mg/l myo-inositol + 500 mg/l L-

proline + 500 mg/l L-glutamin + 300 mg/l casein hydrolysate + 30 g/l sucrose.

1.3.1.3. Nghiên cứu chuyển gen

Nguyễn Thị Hồng Châu và cộng sự (2003) đã thực hiện chuyển gen vào giống

lúa C71 thông qua A.tumerfaciens. Nhóm tác giả đã sử dụng môi trường MS làm

nền, cho tất cả các giai đoạn nuôi cấy, chuyển gen và tái sinh. Gen được chuyển gồm

3 gen là CryIA(b), CryIA(c) (gen mã hóa cho protein độc tố trừ sâu của vi khuẩn Bt

và gen Xa21 – gen kháng bệnh bạc lá). Vật liệu là giống lúa C71. Kết quả cho thấy tỷ

lệ tạo callus của giống lúa C71 khoảng 92%. Tỷ lệ biến nạp gen CryIA(c) đạt 6,6%.

Tác giả cũng cho rằng khả năng tái sinh của lúa indica là thấp hơn so với japonica.

Thời gian cho cây chuyển gen mất từ 4,5 đến 5 tháng [1].

Ngoài kết quả tổng hợp ở trên, còn nhiều công trình khác nghiên cứu về công

nghệ nuôi cấy mô tế bào lúa và chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn.

1.3.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam

Việt Nam có truyền thống trồng lúa lâu đời, lúa gạo là một lương thực quan

trọng và chủ yếu nhất đối với người dân Việt Nam, lúa gạo ngoài dùng làm lương

thực cho người, thức ăn cho vật nuôi còn dùng để chế biến các sản phẩm khác… Đặc

biệt với một nước dân số đông tới khoảng trên 90 triệu người, việc tự sản xuất lúa là

rất quan trọng. Việt Nam có điều kiện tự nhiên thích hợp cho cây lúa có 2 vựa lúa

chính là đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long. Diện tích sản xuất lúa

được xếp hạng 5 và xuất khẩu gạo đứng thứ 3 trên thế giới, gạo Việt Nam đã được

xuất khẩu sang gần 160 quốc gia và vùng lãnh thổ, chiếm 15% thị phần gạo toàn cầu

và cũng bước đầu thâm nhập được các thị trường có yêu cầu chất lượng cao, như:

Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, EU,…

9

- Về gieo trồng:

Diện tích gieo trồng các vụ lúa ở nước ta từ năm 2015 đến năm 2019 có sự thay

đổi qua các năm, được thể hiện qua Bảng 1.1.

Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019

Năm Tổng diện tích (Nghìn ha)

Diện tích lúa Đông xuân (Nghìn ha) 3168,0 Diện tích lúa Hè thu (Nghìn ha) 2869,1 Diện tích lúa Mùa (Nghìn ha) 1790,9 7828,0 2015

3128,9 2872,9 1735, 7737,1 2016

3117,1 2876,7 1711,4 7705,2 2017

3120,1 2785,0 1683,3 7570,4 2018

3120 2010 1621,9 6751,9 2019

(Nguồn: Tổng cục Thống kê, 2019)[7]

Nhìn chung từ năm 2015 đến năm 2019, tổng diện tích gieo trồng ở nước ta có

xu hướng giảm đi, do nhiều nơi người dân chuyển đổi dần từ trồng lúa sang trồng

các cây nông nghiệp (điều, cao su, tiêu,...) cho giá trị kinh tế cao hơn; một số địa

phương cũng phải ưu tiên dành đất nông nghiệp cho phát triển công nghiệp, kết

cấu hạ tầng và đô thị hóa. Điều này làm ảnh hưởng rất lớn đến vấn đề an ninh

lương thực quốc gia.

- Về thu hoạch

Sản lượng lúa thu hoạch thay đổi qua các năm từ 2015 – 2019 và được trình

bày tại bảng 1.2:

Bảng 1.2. Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019

Năm Sản lượng lúa Mùa (Nghìn tấn) Tổng sản lượng (Nghìn tấn)

Sản lượng lúa Đông Xuân (Nghìn tấn) 21091,7 Sản lượng lúa Hè Thu (Nghìn tấn) 15341,3 8658,0 45091,0 2015

19646,6 15232,1 8286,4 43165,1 2016

19415,8 15461,2 7861,9 42738,9 2017

20603,0 15111,3 8264,9 43979,2 2018

20470,0 10950,0 8090,0 43450,0 2019

(Nguồn Tổng cục Thống kê, 2019) [7]

10

Từ năm 2015 đến năm 2019, sản lượng lúa các mùa vụ sụt giảm qua các năm,

chỉ có năm 2018 là sản lượng có tăng so với năm 2017. Nguyên nhân là do diện tích

gieo trồng bị thu hẹp dần, người dân dần chuyển sang loại nông sản cho thu nhập cao

hơn. Điều này đã ảnh hưởng rất lớn đến tình hình xuất khẩu gạo của Việt Nam.

1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật

1.4.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens

Hình 1.3. Vi khuẩn A. tumefaciens

A.tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2,5-3,0 x 0,7-

0,8µm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn hiếu khí,

nhuộm màu gram âm (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn. A.tumefaciens là loài vi khuẩn

gây ra bệnh khối u hình chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Chỉ rất

ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u

hình chop [1].

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

11

1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA

- Ti-plasmid

Hình 1.5. Cấu trúc Ti-plasmid

Plasmid là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5kb), dạng vòng, nằm

độc lập trong tế bào chất. Plasmid có khả năng sao chép độc lập, không phụ thuộc

vào sự sao chép DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn.

Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A. tumefaciens gây độc, có

kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở

nhiệt độ dưới 300C. Bằng phương pháp lai DNA-DNA và lập bản đồ chuỗi kép dị hợp,

người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng. Trong đó, vùng T-DNA

(transferred DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u

còn hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong

Agrobacterium [1], [8].

Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng cần thiết cho quá trình chuyển gen ở

thực vật. Thứ nhất, vùng T-DNA là vùng được chuyển vào thực vật nhờ quá trình tiếp

hợp giữa A. tumefaciens và thực vật ở những chỗ có vết thương. Hiện nay trong kỹ

thuật chuyển gen cây trồng, người ta lợi dụng vùng T-DNA đã mang đoạn gen cần

chuyển vào thực vật. Thứ hai, vùng vir là vùng gây độc cho thực vật nên không được

chuyển vào bộ gen của cây trồng, mà nó đóng vai trò hỗ trợ cho quá trình chuyển T-

DNA vào trong tế bào thực vật.

12

- T-DNA

T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho

sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị trí

của T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left

Border).

Ở Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng

một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-DNA là một

đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá

những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u

như tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

auxin và cytokinine. Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA vùng được

nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng

vir. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir là một loạt các protein đặc

hiệu như virE2, virB, virD, virD2 [1], [8]..

Hình 1.6. Cấu trúc T-DNA

1.4.3. Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật

Các tế bào cây khi bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn

như: acetosyringon (As), alpha hydroxy-acetosyringon... Dưới tác dụng của các hợp chất

này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-DNA vào tế

bào thực vật. Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB.

Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt

động và tăng cường biểu hiện. Sự tiếp xúc của A.tumerfaciens với các hợp chất giải

phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid được hoạt

hóa và phiên mã [1], [8]..

13

Hình 1.7. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens

Khi A.tumerfaciens gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc As

tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương

tác với As và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm

của gen virG .

Sau đó protein virG đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, C, D và E

không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virG. Các sản phẩm của

operon virD mã hóa một loại endonuclease tạo ra vết cắt trên Ti-plasmid tại hai trật tự

biên 25bp. Từ đó một mạch đơn T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay

thế vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo chiều 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt

của trật tự biên phải. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương

tác giữa protein VirD2 với một hoặc hai protein do gen VirC mã hóa. Còn protein

VirE2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra, để làm cho nó ổn định trong quá

trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Còn gen VirB mã hóa cho các protein hình

thành nên một cầu nối cho T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật [1], [8]..

14

1.5. Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi

khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu

1.5.1. Gen gusA

Gen gusA: chỉ thị nhuộm màu mô tế bào thông qua phản ứng oxy hóa cơ

chất X-Gluc không màu thành màu xanh lam dưới tác dụng xúc tác của β-

Glucuronidase (gus).

Gen gusA lần đầu tiên được phân lập từ E. coli. -glucuronidase thường được sử

dụng để làm chỉ thị chọn lọc để nhận biết cây chuyển gen bởi ưu điểm dễ nhận biết

thông qua nhuộm màu, phản ứng có độ nhạy và độ ổn định cao. Hoạt tính gus trong tế

bào, dịch chiết, cặn tế bào còn có thể định lượng được thông qua phản ứng xúc tác cơ

chất huỳnh quang MUG (4-methylumbelliferyl -D-Glucuronide) và đo bằng RE-Mini

150 Fluometer (Schimadzu; Columbia) với chất chuẩn là MU (4-methylumbelliferone,

Sigma) ở bước sóng 360 và 460 nm [1].

1.5.2. Gen bar

Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ dòng vi khuẩn Streptomyses hygroscopicus,

là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có

tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT) là hoạt chất chính của thuốc

trừ cỏ như Bialaphos, Finale, Buster, Harvest và Basta. Glufosinate là hợp chất tự

nhiên được phân lập từ 2 loài nấm Streptomyces, ức chế hoạt tính của enzyme tổng

hợp glutamin, enzyme cần thiết cho sự tạo thành glutamin và độc tính ammonia.

Việc sử dụng glufosinate dẫn đến làm giảm hàm lượng glutamin và làm tăng

ammonia trong mô thực vật. Điều này làm cho quá trình quang hợp ngừng và cây

chết sau này [1].

1.6. Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa

Ngoài phương pháp biến nạp gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens,

các phương pháp biến nạp gen trực tiếp cũng đã được ứng dụng nhiều trong chuyển

gen vào lúa, cụ thể:

1.6.1. Phương pháp vi tiêm

Các nhà nghiên cứu sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng

nhỏ DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn. Phương pháp này

15

có ưu điểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác vị trí đã xác định và có thể

quan sát được. Phương pháp này cần thiết bị có độ chính xác cao, các thao tác thực

hiện cần chính xác và thành thạo.

1.6.2. Chuyển gen bằng xung điện

Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực mạnh. Khi đặt

các tế bào trần trong điện trường, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh

thay đổi, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng dẫn tới sự hình thành lỗ

hổng trên màng tế bào. Một loạt các lỗ hổng trên màng tế bào được hình thành, DNA sẽ

đi vào tế bào qua các lỗ hổng. Một số tế bào thực vật có thể tiếp thụ DNA nhờ xung điện

mà không cần xử lý trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. Zang và cộng sự,

(1988) đưa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần nhờ sử dụng phương pháp xung điện [37].

Năm 1989, Shimamoto và cộng sự đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên

ở lúa Japonica cũng sử dụng phương pháp chuyển gen qua xung điện [34].

1.6.3. Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)

Phương pháp này lần đầu tiên được Z. Luo và Ray Wu và các cộng sự ở trường

Đại học Cornell (Mỹ) đề xuất năm 1988 trên cây lúa. Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy

(quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ này mầm hình thành ống phấn. Lúc này tiêm gen

mong muốn theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình

thành hợp tử có mang gen chuyển vào. Phương pháp này khá thành công đặc biệt

trên cây lúa và bông [38].

1.6.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen

Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou và cs,

(1991) và được cải tiến bởi Cao và cs, (1992); Li và cs, (1992) [8, 12, 25]. Sau đó kỹ

thuật này đã được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa Japonica.

Cheng và cs (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen

vào lúa Japonica sử dụng súng bắn gen. khi sử dụng súng bắn gen tạo áp lực đẩy viên

đạn được làm bằng kim loại đã được bọc plasmid mang gen thiết kế, có kích thước

khoảng 1µm, với vận tốc 130m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên

trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ. Hiệu quả

chuyển gen lúa thông qua phương pháp này cũng khá cao [10].

16

1.7. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens

Phạm Thu Hằng và cộng sự đã đã tiến hành thiết kế cấu trúc biểu hiện gen

CaMV35S:OsNAC1:Nos (liên quan đến tính chịu hạn) và chuyển vào giống lúa

J02(Oryza sativa L. japonica) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sự có

mặt của cấu trúc biểu hiện gen trong cây chuyển gen được kiểm tra bằng PCR với

các cặp mồi đặc hiệu. Nhóm tác giả đã thu được các dòng lúa chuyển gen T0 có

mang cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1. Kết quả thu được là tiền đề cho việc nghiên

cứu chức năng gen OsNAC1 ở lúa, từ đó hướng tới tạo ra các giống cây trồng chuyển

gen OsNAC1 có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn của môi trường.

Nhóm tác giả Hoàng Thị Giang và cộng sự (2015) [5] tại Viện Di truyền Nông

nghiệp Việt Nam đã cải tiến thành công quy trình chuyển gen vào giống lúa

Taichung 65 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với hiệu suất chuyển

gen cao. Kết quả thí nghiệm cho thấy sử dụng đĩa petri có gờ cao 15mm và phơi mẫu

không chỉ làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo từ phôi mà còn tăng kích thước và chất lượng

mô sẹo dùng cho quá trình chuyển gen. Dịch khuẩn với mật độ OD600nm = 0,1 là tối

ưu với tần số biểu hiện gen GUS ở mô sẹo cao (81,25%) và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp. Ở

giai đoạn chọn lọc sau lây nhiễm, mô sẹo phát triển tốt hơn khi tiến hành phơi mẫu

và sử dụng đĩa petri có gờ cao 15mm. Phân tích sự có mặt của promoter R4 cho thấy

tỷ lệ cây tái sinh mang cấu trúc gen biến nạp cao (90,24%). Đánh giá sự biểu hiện

của gen GUS ở cây lúa chuyển gen đã chứng tỏ sự hoạt động mạnh của promoter R4,

điều khiển quá trình phiên mã, dẫn tới tổng hợp enzym GUS. Kết quả phân tích cây

chuyển gen ở thế hệ T1 đã chứng minh sự di truyền ổn định của gen biến nạp sang

thế hệ sau [5].

1.8. Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây lúa trên thế giới và Việt Nam

Trong sự hình thành và phát triển bệnh đạo ôn ở lúa, gen MPG1 đóng vai trò

quan trọng, liên quan đến tính gây bệnh được biểu hiện trong suốt quá trình hình

thành vòi áp, quá trình phát triển triệu chứng và hình thành bào tử. Do vậy, việc ức

chế biểu hiện của gen MPG1 có thể khiến nấm đạo ôn không gây được bệnh trên lúa.

Trên cơ sở đó, Bộ môn CNSH Thực vật - Khoa CNSH - Học viện Nông nghiệp Việt

Nam đã nghiên cứu và thiết kế vector mang miRNA nhân tạo ức chế đặc hiệu sự biểu

17

hiện của gen MPG1 [6]. Việc chuyển thành công cấu trúc miRNA này vào cây lúa sẽ

tạo ra giống lúa có khả năng kháng được nhiều chủng nấm đạo ôn. Trong quá trình

chuyển gen vào cây lúa bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, phôi lúa trưởng

thành thường được sử dụng làm vật liệu chuyển gen do đây là vật liệu sẵn có và dễ

thao tác hơn so với các loại vật liệu khác [3, 13, 21, 29, 32, 33]. Tuy nhiên khả năng

cảm ứng mô sẹo từ và tái sinh cây từ callus lúa không cao và bị ảnh hưởng bởi rất

nhiều yếu tố như kiểu gen, thành phần môi trường, phương pháp và điều kiện nuôi

cấy [35]. Khả năng cảm ứng mô sẹo và tái sinh cây của các giống thuộc loài phụ

japonica cao hơn so với các giống thuộc loài phụ indica [31]. Nghiên cứu này được

tiến hành nhằm chọn được các giống lúa có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây cao

từ vật liệu ban đầu là phôi trưởng thành trong bảy giống lúa khảo sát đang được

trồng phổ biến tại Việt Nam nhằm phục vụ chuyển cấu trúc miRNA nhân tạo ức chế

đặc hiệu sự biểu hiện của gen MPG1 giúp kháng nấm đạo ôn do nấm Magnaporthe

grisea gây ra.

1.9. Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cây lúa trên thế giới

và Việt Nam

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính của Việt

Nam. Hiện nay, trên thế giới việc xác định chức năng gen ở cây lúa rất được chú

trọng và giữ một vai trò quan trọng trong nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu

ứng dụng. Bằng phương pháp nghiên cứu chức năng gen có thể khám phá ra được

các gen kiểm soát những đặc điểm nông sinh học quan trọng như năng suất, chất

lượng hạt, tính chống chịu strees sinh học và phi sinh học, hiệu quả sử dụng dinh

dưỡng. Thành công trong kỹ thuật chuyển gen lua mở đường cho các nghiên cứu

theo hướng chức năng gen.

Trước đây, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens không

được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm [18, 30]. Nhưng trong những năm gần

đây có nhiều công trình nghiên cứu báo cáo việc biến nạp gen thành công vào lúa

nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Chan cs. (1992) là những người đầu tiên chuyển gen

vào callus lúa mặc dù khi đó không thu được cây chuyển gen. Đến năm 1993, nhóm

nghiên cứu này đã thu được cây lúa japonica chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A.

18

tumefaciens bằng cách nuôi cấy phôi non [9]. Hiện nay, phương pháp biến nạp gen

vào lúa nhờ vi khuẩn A. tumefaciens là phương pháp được lựa chọn sử dụng hơn cả,

do số bản sao của gen biến nạp được chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bền

vững [20]. Đặc biệt, phương pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng

chuyển được đoạn ADN có kích thước lớn và chi phí thấp. Một trong những công

trình nghiên cứu đánh dấu bước tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử

dụng A. tumefaciens là công trình của Hiei cs. (1994) [19]. Nhóm nghiên cứu này đã

xây dựng được quy trình chuyển gen hiệu quả cho một số giống lúa nhóm japonica

như Tsukinohikari, Asanohikari và Koshihikari. Từ đó, kỹ thuật này được áp dụng

rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Giống lúa Taichung 65

được xem là giống mô hình đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu về di truyền ở

cây lúa. Cho đến nay đã có nhiều thể đột biến phục vụ nghiên cứu được phát triển

trên nền di truyền của Taichung 65 như: các thể đột biến phôi nhỏ re (Hong cs.,

1995) [21], các thể đột biến phôi lớn ge (Hong cs., 1995), các thể đột biến không có

chồi shl (Satoh cs., 1999) [28]; các thể đột biến không có rễ bên lrt, một số thể đột

biến không có rễ bất định crl (Inukai cs., 2005) [23], thể đột biến không có rễ mầm

ral (Enrico cs., 2003) [15],... Do các thể đột biến này đều có chung nền di truyền với

giống lúa Taichung 65, nên việc xây dựng một quy trình chuyển gen hiệu quả áp

dụng cho Taichung 65 là đặc biệt quan trọng cho các nghiên cứu gen dựa trên những

thể đột biến này, góp phần thúc đẩy quá trình nghiên cứu cơbản và ứng dụng ở lúa.

Trong nghiên cứu biến nạp gen vào Taichung 65 từ callus phôi hóa, nhóm nghiên

cứu của Yara cs. (2001) [36] đã sử dụng nền môi trường cơ bản N6 cho nuôi cấy và

đạt được tỷ lệ chuyển gen là 4,6%. Mới đây, Chopita cs. (2014) [11] đã công bố

nghiên cứu về chức năng của gen OSB2 liên quan đến sự điều hòa sinh tổng hợp

anthocyanin ở cây lúa bằng cách gây siêu biểu hiện gen OSB2 trong giống Taichung

65. Nhóm nghiên cứu cũng đã áp dụng phương pháp biến nạp thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens từ callus phôi hóa và chọn lọc callus chuyển gen lần lượt trên hai môi

trường dinh dưỡng có bổ sung hygromycin với lượng tăng từ 15 - 30 mg/l, cho tỷ lệ

mẫu callus biểu hiện gen GUS 7,59%.

19

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là hạt chín của 4 giống lúa thuần được trồng phổ biến ở

các tỉnh miền núi phía Bắc.

Bảng 2.1. Danh mục giống nghiên cứu

STT Tên giống Loài phụ Nguồn gốc

Đoàn kết Indica Trung tâm Tài nguyên di truyền Thực vật 1

Bao thai Indica Trung tâm Tài nguyên di truyền Thực vật 2

Nếp 87 Indica Trung tâm Tài nguyên di truyền Thực vật 3

Khang dân Indica Công ty giống cây trồng Thái Bình 4

2.1.2. Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu

2.1.2.1. Hóa chất thiết bị sử dụng:

- NaClO, cồn, tween.

- Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường MS

(Murashige & Skoog, 1962), N6; các chất kích thích sinh trưởng: BAP (Duchefa), NAA

(Trung quốc), Acetoseringone (Sigma), L-pyroglutamic (Duchefa), L-asparagine

(Duchefa),...

- Kháng sinh: Rifamycin, spectomycin, cefotaxim, vancomycin, ticarcillin,...

- Hóa chất khác: Yeast tract, pepton, NaCl, agarose, sucrose,...

Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Cân điện tử

(Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản), tủ sấy Memmert

(Đức), tủ cấy vô trùng cấp II Airtech (Hàn Quốc), máy chuẩn pH Hanna HI2210

(Đức), tủ nuôi lắc LSI (Hàn Quốc), lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản), tủ lạnh Sanyo

(Nhật bản), micropipette,...

20

2.1.2.2. Vật liệu di truyền

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: AGL1, EHA105, GV3101,

LBA4404. Vector chuyển gen pCAMBIA3301 mang gen chỉ thị GUS được cung cấp

bởi phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ

Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

Nos ployA

35S

35S

bar

LacZ

gus

LB

RB

Hình 2.1. T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen

điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải)

Vector pCambia 3301 (hình 3.1) mang gen chọn lọc thực vật là gen bar, gen

chọn lọc vi khuẩn là gen kháng kanamycin(r), gen chỉ thị là gen gusA và gen này

được chia thành 2 exon là gus first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi

đoạn Intron Catalase, đoạn kết thúc chuỗi là NOS polyA, vị trí đa điểm là pUC18-

lacZa, dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S (Cauliflower Mosaic Virus) và

được quy định bởi trình tự CaMV35S polyA.

2.1.2.3. Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tái sinh in vitro và xây dựng quy trình chuyển gen ở một số giống lúa.

2.1.3. Thiết bị sử dụng

- Tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, cân phân tích, tủ sấy, máy đo pH và… một

số trang thiết bị khác tại Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm,

trường Đại học Nông Lâm –Đại học Thái Nguyên.

2.2. Địa điểm và thời gian tiến hành

- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử,

phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực

phẩm trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên

- Thời gian tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 1/2019 đến tháng

5/2019.

21

2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa

 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng NaOCl đến hiệu

quả vô trùng mẫu nuôi cấy.

Thí nghiệm được bố trí 4 công thức khác nhau:

Thời gian khử trùng Công thức Nồng độ NaOCl

10 3% CT1

3% CT2 15

3% CT3 20

3% CT4 25

Cách tiến hành: Hạt lúa được tách vỏ, sau đó hạt lúa được rửa bằng cồn 70˚C

trong 1 phút để sơ loại các mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng. Sau đó đổ cồn và

ngâm hạt vào dung dịch sodium hypochlorite 3% với thời gian khử trùng khác nhau.

Cuối cùng, rửa sạch mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi khử trùng

mẫu được gắp mẫu đặt lên giấy thấm đã được vô trùng, đợi khô. Cấy mẫu vào môi

trường mô sẹo tạo mô sẹo có chứa 2,4-D. Sau đó đưa vào phòng nuôi, tiến hành

theo dõi mẫu.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, mỗi

công thức nhắc lại 3 lần và mỗi công thức 100 mẫu.

Các chỉ tiêu theo dõi như sau: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ

mẫu chết.

 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng

tạo mô sẹo của một số giống lúa

Hạt sau khi khử trùng bằng NaClo được nuôi cấy tạo mô sẹo trên môi trường bổ

sung 2,4-D trên nền môi trường MS và N6 + 30g đường/l + 7g agar/l, pH 5,6. Các thí

nghiệm được bố trí theo công thức sau:

Công thức Môi trường nền

CT1 MS

CT2 N6

22

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 2 công thức, mỗi

công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo tạo thành, màu sắc mô sẹo và chất lượng mô sẹo

 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng tạo mô

sẹo ở một số giống lúa

Để xác định nồng độ 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo ở lúa, tiến hành thử

nghiệm một số nồng độ 2,4-D dựa trên nền môi trường xác định ở Thí nghiệm 2. Các

công thức thí nghiệm bao gồm:

Công thức Nồng độ 2,4-D

CT1 0 mg/l

CT2 1,0 mg/l

CT3 2,0 mg/l

CT4 3,0 mg/l

Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu,

3 lần nhắc lại.

Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu chết, hình thái mô sẹo

sau 14 ngày nuôi cấy.

 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi

Sau 28 ngày nuôi cấy mô sẹo có hình thái đồng đều trên môi trường 2,4-D được

chuyển sang môi trường tái sinh chồi bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau theo các

công thức thí nghiệm như sau:

Công thức Nồng độ BAP

CT1 0 mg/l

CT2 0,5 mg/l

CT3 1,0 mg/l

CT4 1,5 mg/l

CT5 2,0 mg/l

23

Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100

mẫu, 3 lần nhắc lại. Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu bật chồi, chất lượng chồi

sau 28 ngày nuôi cấy. Môi trường nền sử dụng MS/N6 + 30g/l đường + 7g/l agar,

pH 5,6.

 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi

Tương tự như BAP, kinetin được sử dụng để đánh giá khả năng tái sinh in vitro

ở các nồng độ khác nhau. Các công thức thí nghiệm bao gồm:

Công thức Nồng độ kinetin

CT1 0 mg/l

CT2 0,5 mg/l

CT3 1,0 mg/l

CT4 1,5 mg/l

CT5 2,0 mg/l

Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100

mẫu, 3 lần nhắc lại. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu bật chồi, chất lượng chồi

sau 28 ngày nuôi cấy. Môi trường nền sử dụng MS/N6 + 30g/l đường + 7g/l agar,

pH 5,6.

2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng chuyển

gen ở một số giống lúa

Để xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận gen ở giống lúa

Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87, thí nghiệm sử dụng gen chỉ thị GUS cho

các thí nghiệm ở nội dung nghiên cứu này.

 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận

gen GUS của một số giống lúa

Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường thích hợp đã được xác định ở Nội dung

1. Để xác định tuổi mô sẹo phù hợp cho chuyển gen, thí nghiệm tiến hành lây nhiễm

ở các giai đoạn mô sẹo khác nhau từ 3 đến 10 ngày tuổi. Các công thức bao gồm:

24

Tuổi mô sẹo Công thức

3 ngày tuối CT1

5 ngày tuổi CT2

7 ngày tuổi CT3

10 ngày tuổi CT4

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp, tỷ lệ mẫu GUS dương tính

(GUS+).

 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen GUS ở

một số giống lúa

Để lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở lúa, thí nghiệm tiến

hành biến nạp với 4 chủng vi khuẩn khác nhau bao gồm:

Công thức Chủng vi khuẩn

AGL1 CT1

EHA105 CT2

GV3101 CT3

LBA4404 CT4

Thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại, mỗi lần biến nạp 100 mô sẹo. Sau 14

ngày tiến hành đánh giá tỷ lệ mẫu sống sót và tỷ lệ mẫu mang gen GUS.

 Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringone (AS) đến

hiệu quả biến nạp gen GUS của một số giống lúa

Mô sẹo có độ tuổi phù hợp được lựa chọn ở thí nghiệm 6 sử dụng làm vật liệu

biến nạp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen môi trường biến nạp sẽ được bổ sung

chất acetosyringnone (AS) ở các nồng độ khác nhau:

Công thức Nồng độ AS

0 µM CT1

50 µM CT2

100 µM CT3

100 µM CT4

25

Sau biến nạp mô sẹo được đồng nuôi cấy trên môi trường đã chuẩn bị, mỗi đĩa

10 mô sẹo, nhiệt độ đồng nuôi cấy là 250C.

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+.

 Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu

quả biến nạp gen GUS

Sau khi lựa chọn được chủng vi khuẩn thích hợp, thí nghiệm tiến hành xác định

thời gian lây nhiễm mô sẹo với vi khuẩn. Các công thức thí nghiệm gồm:

Công thức Thời gian lây nhiễm

CT1 1 phút

CT2 2 phút

CT3 3 phút

CT4 4 phút

CT5 5 phút

Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+.

 Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến

hiệu quả biến nạp gen GUS của một số giống lúa

Thời gian đồng nuôi cấy mẫu được thử nghiệm với 5 công thức gồm:

Công thức Thời gian đồng nuôi cấy

CT1 1 ngày

CT2 2 ngày

CT3 3 ngày

CT4 4 ngày

CT5 5 ngày

Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+.

- Đánh giá sự biểu hiện gen GUS:

Sau khi lây nhiễm 3 ngày, mẫu cấy được nhuộm với dung dịch X-gluc (Phụ

lục 4) và được ủ 48h ở 370C. Sau đó rửa mẫu với ethanol 96% để loại diệp lục tố

và ghi nhận sự biểu hiện của gen gus. Khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa

26

thí nghiệm được đánh giá thông qua sự biểu hiện tạm thời của gen gus theo phương

pháp của Hiei Y và cs, 2008) [27].

 Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến đến hiệu quả chọn

lọc chuyển gen

Thời gian nuôi cấy được thử nghiệm với 5 công thức:

Công thức Nồng độ Hygromycin

CT1 5 mh/l

CT2 10 mh/l

CT3 15 mh/l

CT4 20 mh/l

CT5 25 mh/l

Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mô sẹo sống, mô sẹo chết.

2.4. Điều kiện bố trí thí nghiệm

Các bình nuôi cấy in vitro được đặt trong phòng nuôi cấy với các điều kiện như:

- Số giờ chiếu sáng: 10h - 12h/ ngày

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25°C ± 2°C

- Độ ẩm: 60- 70%

- Cường độ chiếu sáng: 2000 – 2500 lux

2.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá.

2.5.1. Các chỉ tiêu theo dõi

- Thời gian theo dõi:

+ Đối với thí nghiệm vào mẫu: tiến hành theo dõi số mẫu nhiễm, số mẫu

chết, số mẫu sống.

+ Đối với thí nghiệm tạo mô sẹo: theo dõi số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số

mẫu tạo mô sẹo.

+ Đối với thí nghiệm tái sinh chồi theo dõi sau 2 tuần và 4 tuần.

2.5.2. Các chỉ tiêu đánh giá

- Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu:

Số mẫu chết sau biến nạp Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100 Tổng số mẫu biến nạp

27

Số mẫu sống sau biến nạp Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100 Tổng số mẫu biến nạp

- Chỉ tiêu theo dõi mô sẹo:

Số mẫu tạo mô sẹo Tỷ lệ mô sẹo (%) = x 100 Tổng số mẫu nuôi cấy

- Chỉ tiêu theo dõi chồi:

Số mẫu tái sinh chồi Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = x 100 Tổng số mẫu nuôi cấy

Số mẫu chết sau biến nạp Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100 Tổng số mẫu biến nạp

- Tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sau biến nạp:

Số mẫu sống sau biến nạp Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100 Tổng số mẫu biến nạp

Khả năng tiếp nhận gen được đánh giá dựa trên tổng số mẫu có biểu hiện màu

xanh chàm trong tổng số mẫu kiểm tra và được tính toán theo công thức sau:

Số mẫu GUS+ Tỷ lệ mẫu biều hiện gen x 100 GUS (%) = Tổng số mẫu nhuộm

Mức độ biểu hiện của gen GUS được đánh giá dựa trên vùng biểu hiện và độ

đậm của màu xanh chàm. Trong đó:

+++: màu xanh đậm, vùng biểu hiện rộng

++: màu xanh nhạt và vùng biểu hiện trung bình

+: màu xanh nhạt, vùng biểu hiện hẹp

2.6. Phương pháp xử lý số liệu

- Các số liệu tính toán bằng phần mềm Excel 2010.

- Quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính theo chương trình

IRRISTART 4.0.

28

Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác

giữa giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (Least

Significant Different) ở độ tin cậy 95%.

- Kiểm tra độ biến động của các thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu

chuẩn CV.

29

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh invitro của một số giống lúa

3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy

Để đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy cần đảm bảo các chỉ tiêu sau: tỷ lệ nhiễm

thấp, tốc độ sinh trưởng tốt. Vì vậy, mô thực vật trước khi đưa vào nuôi cấy cần phải

trải qua giai đoạn khử trùng để đảm bảo yêu cầu vô trùng trong nuôi cấy mô. Chọn

phương pháp khử trùng thích hợp đóng vai trò quan trọng khi bắt đầu bất kỳ một hệ

thống nuôi cấy mô nào, có ý nghĩa quyết định tới hiệu quả nuôi cấy mô. Thí nghiệm

này thực hiện trên 4 giống cho kết quả như sau:

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của NaOCl 3% tới hiệu quả khử trùng mẫu

(sau 7 ngày nuôi cấy)

Giống CT Thời gian (phút) Tổng số mẫu cấy (hạt) Tỷ lệ nhiễm (%)

Đoàn kết 1 2 3 4 100 100 100 100 10 15 20 25

CV% LSD05

Bao thai 1 2 3 4 100 100 100 100 10 15 20 25

CV% LSD05

Khang dân 1 2 3 4 100 100 100 100 10 15 20 25

CV% LSD05

Nếp 87 1 2 3 4 100 100 100 100 10 15 20 25

Tỷ lệ không nhiễm (%) 51 60 75 81 3,3 4,4 47 56 73 84 3,9 5,0 45 62 71 87 4,1 5,3 42 50 63 92 9,6 11 49 40 25 19 53 43 27 16 55 38 29 12 58 50 37 8 CV% LSD05

30

Qua các số liệu thu được ở bảng 3.1 ta thấy: Dung dịch NaOCl có tác dụng tốt

trong việc tiêu diệt nấm và vi khuẩn. Sau 1 tuần nuôi cấy tỷ lệ mẫu không nhiễm dao

động từ 42% đến 92%. Các công thức thí nghiệm sử dụng thời gian khử trùng khác

nhau cho tỷ lệ mẫu sống khác nhau, trong đó thời gian khử trùng mẫu tốt nhất là 25

phút (CT4), tỷ lệ mẫu không nhiễm dao động từ 81 đến 92% tùy từng giống: Đoàn

kết 81%; Bao thai 84%; Khang dân 87%; Nếp 87 92% (Bảng 3.1). Thời gian khử

trùng ngắn hơn cho tỷ lệ mẫu nhiễm cao ở tất cả các giống. Kết quả này chứng tỏ sử

dụng NaOCl 3% khử trùng 25 phút cho hiệu quả vô trùng tốt ở lúa.

3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo

Mẫu sau khi khử trùng được cảm ứng tạo mô sẹo trên hai môi trường khác

nhau là MS và N6. Kết quả tạo mô sẹo được thể hiện trong bảng 3.2.

Qua bảng 3.2 cho thấy môi trường có ảnh hưởng đến khả năng tạo mô sẹo của

các giống lúa khác nhau. Cả 4 giống lúa Khang Dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87

đều có khả năng tạo mô sẹo tốt trên môi trường MS với tỷ lệ lần lượt đạt 45,3%;

59,3%; 54,3% và 44,6%, mô sẹo có màu vàng, độ đồng đều cao. Tỷ lệ tạo mô sẹo

của cả 4 giống thấp hơn trên môi trường N6 đạt 35,6%; 33,6, 18,6 và 28,3%, mô sẹo

có màu vàng nhạt, kếu cấu lỏng lẻo, độ đồng đều thấp.

Mô sẹo của cả 3 giống lúa này được tạo trên môi trường MS đều có màu vàng,

chất lượng mô sẹo tốt. Mô sẹo được tạo trên môi trường N6 có màu vàng nhạt, chất

lượng mô sẹo kém (Bảng 3.2 và hình 3.1).

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng

tạo mô sẹo của một số giống lúa

Chất lượng Số Giống CT Môi trường Tỷ lệ mô sẹo (%) mẫu mô sẹo

1 300 MS 45,3 Tốt

2 300 N6 35,6 Kém Khang

CV% 4,5 dân

2,61 LSD05

1 300 MS 59,3 Tốt

2 300 N6 33,6 Kém Bao thai

CV% 2,7

31

Chất lượng Số Giống CT Môi trường Tỷ lệ mô sẹo (%) mô sẹo mẫu

1,30 LSD05

300 MS 1 54,3 Tốt

300 N6 2 18,6 Kém Đoàn kết CV% 5,1

1,30 LSD05

300 MS 1 44,6 Tốt

300 N6 2 28,3 Kém Nếp 87 CV% 6,1

2,30 LSD05

A. môi trường N6 B. môi trường MS

Hình 3.1. Mô sẹo tái sinh trên môi trường N6 (A) và MS (B)

ở giống lúa Bao thai sau 7 ngày nuôi cấy.

Kết quả nghiên cứu của Z. Rahman và cs (2010) cho thấy, các giống lúa khác

nhau cho khả năng tạo mô sẹo trên các môi trường khác nhau. Ông tiến hành nghiên

cứu khả năng tạo mô sẹo của giống lúa Taipei và MR81 trên 2 loại môi trường là N6,

MS và môi trường B5 và thu được kết quả MR81 có khả năng tạo mô sẹo tốt hơn

trên môi trường MS nhưng giống lúa Taipei cho tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trường N6

cao hơn. Theo kết quả của Võ Thị Minh Tuyển (2010) trên các giống lúa: MT508-

IRBB5, MT508-IRBB7, MT508-IRBB62 cũng cho tỷ lệ tạo mô sẹo ở môi trường

MS tương ứng là 4,2%; 4,7 và 5,3% .

32

Kết luận trên cũng trùng với kết luận của tác giả Obert và cộng sự (2004) chỉ

khác là nguồn gen ông sử dụng là giống lúa Japonica. Ông đã nuôi cấy bao phấn lúa

tạo mô sẹo trên 4 môi trường khác nhau (Mo, N6, MS, N&N).

Thí nghiệm của ông cũng cho thấy trên môi trường MS cho tỷ lệ tạo mô sẹo

cao nhất (12%) . Tương tự, Herath và cộng sự (2007) cũng làm thí nghiệm về các

môi trường tạo mô sẹo trên giống lúa Japonica, tác giả cũng rút ra kết luận là môi

trường MS với nguồn cacbon là sucrose là 0,5% cho tỷ lệ tạo mô sẹo (29,4%) cao

hơn môi trường B5 và N6 ở giống lúa Japonica.

Từ kết quả nghiên cứu trên, môi trường MS sẽ được sử dụng phục vụ cho các

thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.

3.1.3. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa

Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng tạo mô sẹo có sự khác biệt trên môi

trường 2,4-D. Ở nồng độ 1,0 mg/l 2,4-D các giống có tỷ lệ mô sẹo dao động từ 78

đến 88%. Tỷ lệ mô sẹo tăng lên đáng kể trên môi trường 2,0 mg/l 2,4-D, dao động từ

78 đến 92%. Tuy nhiên tỷ lệ này giảm ở nồng độ 3,0 mg/l 2,4-D. Kết quả nghiên cứu

cũng cho thấy khả năng tạo mô sẹo có sự khác nhau giữa các giống. Trong khi giống

Đoàn Kết cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao ở nồng độ 1,0 mg/l (88%), các giống còn lại cho

tỷ lệ tạo mô sẹo cao ở nồng độ 2,0 mg/l, lần lượt là Nếp 87 (92%), Khang Dân

(91%), Bao Thai (82%) (Bảng 3.3, hình 3.2).

Khả năng tái sinh mô sẹo ở lúa phụ thuộc chủ yếu vào môi trường nuôi cấy và

bản chất di truyền của giống. Cao Lệ Quyên và cộng sự (2008) nghiên cứu khả năng

tái sinh mô sẹo của 59 giống lúa trên môi trường MS cho thấy có 32 giống có khả

năng hình thành mô sẹo, dao động từ 30 đến 98% trên môi trường MS bổ sung 2,0

mg/l 2,4-D và 19 giống lúa không tái sinh mô sẹo trên các loại môi trưởng thử

nghiệm. Tương tự, Phan Thị Thu Hiền và cộng sự (2012) nghiên cứu khả năng tạo

mô sẹo của 31 giống lúa nương thu thập tại khu vực miền núi phía Bắc trên các môi

trường khác nhau cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo dao động từ 28,3 đến 85%. Phan Thị

Hương và cộng sự (2014) nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo của 7 giống lúa, trong đó

có 5 giống thuộc loài phụ japonica và 2 giống indica. Kết quả cho thấy tỷ lệ tái sinh

mô sẹo dao động từ 53 đến 86,7% trên môi trường MS bổ sung 2-3,0 mg/l 2,4-D. Từ

33

các kết quả nghiên cứu trên cho thấy ở nồng độ 1,0 mg/l 2,4-D là phù hợp để tạo mô

sẹo ở giống lúa Đoàn kết. Các giống còn lại bao gồm Bao Thai, Khang Dân, Nếp 87

cho tỷ lệ mô sẹo cao ở nồng độ 2,0 mg/l 2,4-D.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹo

ở một số giống lúa (sau 14 ngày)

Giống

Bao thai Đoàn kết Khang dân Nếp 87 2,4-D Số

(mg/l) mẫu

Tỷ lệ % Tỷ lệ % Tỷ lệ % Tỷ lệ % Hình thái mô sẹo

0 100 0 Hình thái mô sẹo - 0 Hình thái mô sẹo - 0 Hình thái mô sẹo - 0 -

1,0 100 78a + 88a +++ 86a ++ 80a +++

2,0 100 82b ++ 78b ++ 91b ++ 92c +++

3,0 100 81b ++ 63c + 85a +++ 85b ++

Hình 3.2. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa

(sau 14 ngày). A- Nếp 87; B- Bao thai; C- Khang dân; D- Đoàn kết

3.1.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa

Để đánh giá khả năng tái sinh cây in vitro, mô sẹo màu vàng tươi, kích thước

đồng đều được chuyển sang môi trường bổ sung BAP ở các nồng độ từ 0,5 đến 1,5

mg/l. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tái sinh chồi thay đổi trên môi trường có

nồng độ BAP dao động từ 46 đến 79% đối với giống lúa Bao Thai, 45 đến 78% ở

34

giống Đoàn Kết, 34 - 79% ở giống Khang Dân và 36 đến 83% đối với giống lúa Nếp

87. Các giống lúa đều có tỷ lệ tái sinh tốt nhất ở nồng độ BAP 1,0 mg/l sau 28 ngày

nuôi cấy, dao động từ 78 đến 83%. Số chồi/cụm mô sẹo dao động từ 4,3 đến 11,3

chồi. Trong đó giống lúa Nếp 87 có số chồi/cụm mô sẹo cao nhất (11,3 chồi), tiếp

đến là giống Đoàn kết (6,6 chồi), Khang dân (5,2 chồi), Bao Thai (4,3 chồi) (Bảng

3.4, Hình 3.3).

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi một số giống lúa

Giống

BAP (mg/l)

Tỷ lệ % Tỷ lệ % Tỷ lệ % Tỷ lệ %

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Bao thai Số chồi/cụm mô sẹo 0 1,3 4,3 3,6 3,5 0 46a 79c 74c 56b Đoàn kết Số chồi/cụm mô sẹo 0 2,3 6,6 4,3 4,2 0 45a 78c 64b 66b Khang dân Số chồi/cụm mô sẹo 0 2,3 5,2 4,3 3,3 0 34a 79d 56b 64c Nếp 87 Số chồi/cụm mô sẹo - 3,4 11,3 5,3 2,3 0 36a 83d 74c 65b

Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa

(sau 28 ngày). A-Đoàn kết; B- Nếp 87 ; C-Khang dân; D- Bao thai

35

3.1.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa Việt Nam

Tương tự như BAP, thí nghiệm cũng tiến hành đánh giá ảnh hưởng của kinetin

ở các nồng độ từ 0,5 đến 2,0 mg/l. Kết quả cho thấy, sau 28 ngày nuôi cấy mô sẹo có

khả năng tái sinh cây ở môi trường bổ sung kinetin ở các nồng độ từ 0,5 đến 2,0

mg/l. Tuy nhiên tỷ lệ tái sinh cây in vitro có sự khác nhau ở các nồng độ kinetin.

Nhìn chung cả 4 giống lúa đều có tỷ lệ tái sinh cao nhất ở nồng độ kinetin 1,5 mg/l,

dao động từ 58 đến 70%. Trong đó giống Nếp 87 có tỷ lệ tái sinh cao nhất (70%),

tiếp đến là các giống Bao Thai (63%), Đoàn Kết (62%) và Khang Dân (58%). Số

chồi trung bình từ 7,9 đến 11,2 chồi/cụm mô sẹo ở nồng độ kinetin 1,5 mg/l tùy từng

giống (Bảng 3.5, Hình 3.4).

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh ở một số giống lúa

Giống

Nếp 87

Kinetin (mg/l)

Tỷ lệ % Tỷ lệ % Tỷ lệ % Tỷ lệ %

0 0,5 1,0 1,5 2,0 Bao thai Số chồi/cụm mô sẹo - 7,3 10,2 9,2 9,8 0 43a 56c 63d 49b Đoàn kết Số chồi/cụm mô sẹo - 4,9 7,6 7,9 8,8 0 31a 45b 62d 51c Khang dân Số chồi/cụm mô sẹo - 9,3 8,2 11,2 7,2 0 17a 21b 58d 31c 0 36a 61b 70c 67d Số chồi/cụm mô sẹo - 6,3 8,4 9,8 6,7

Hình 3.4. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa

(sau 28 ngày). A-Nếp 87; B- Đoàn kết; C-Khang dân; D- Bao thai

36

Nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng tái sinh in vitro ở lúa phụ thuộc vào giống

và chất kích thích sinh trưởng (Cao Lệ Quyên, 2008, Phan Thị Hương, 2014). Từ kết

quả nghiên cứu tái sinh in vitro của 7 giống lúa Phan Thị Hương và cộng sự kết luận

rằng BAP có khả năng tái sinh tốt hơn kinetin. Trên môi trường bổ sung 3,0 mg/l

BAP toàn bộ (100%) mô sẹo có khả năng tái sinh cây, số chồi/cụm mô sẹo từ 13,67

đến 16,33 chồi. Trong khi đó trên môi trường kinetin tỷ lệ mô sẹo tái sinh chỉ đạt từ

2,67 đến 11,67%, số chồi/cụm mô sẹo chỉ đạt 0,1-0,3 chồi tùy từng giống (Phan Thị

Hương và cs, 2014). Để nâng cao khả năng tái sinh, một số công bố cho rằng có thể

sử dụng kết hợp các chất kích thích sinh trưởng như 2,4-D, NAA với BAP và kinetin.

Mannan và cộng sự (2013) cho rằng cần phải bổ sung 2,4-D vào môi trường tái sinh

đối với các giống lúa Kalijira và Chinigura, BR29, IR64. Phan Thị Hương và cộng

sự (2014) bổ sung NAA vào môi trường tái sinh cho hiệu quả cao đối với giống J02

và Hương cốm.

Hiệu quả chuyển gen ở cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng phụ thuộc vào

nhiều yếu tố, trong đó hệ thống tái sinh in vitro tạo cây hoàn chỉnh có vai trò quyết

định. Để thu được cây chuyển gen thông thường phải qua nhiều giai đoạnn nuôi cấy

và chọn lọc các tế bào mang gen bằng các kháng sinh như hygromycin, kanamycin,

glufosinate.. vì vậy giống có khả năng tái sinh cây tốt, tỷ lệ chồi tái sinh cao sẽ tăng

tỷ lệ chọn lọc được chồi chuyển gen. Do đó việc xác định được các yếu tố ảnh hưởng

đến khả năng tái sinh in vitro và lựa chọn được vật liệu tái sinh tốt có ý nghĩa rất

quan trọng trong nghiên cứu chuyển gen ở cây lúa.

Từ kết quả nghiên cứu tái sinh ở 4 giống lúa Bao Thai, Đoàn kết, Khang dân và

Nếp 87 cho thấy, các giống đều có khả năng tái sinh tốt trên môi trường BAP và

kinetin. Môi trường tái sinh bổ sung 1,0 mg/l BAP cho hiệu quả tái sinh tốt hơn các

môi trường còn lại. Tuy nhiên, để nâng cao hơn nữa hiệu quả tái sinh ở các giống lúa

trên có thể tiến hành thử nghiệm kết hợp BAP, kinetin và NAA ở giai đoạn tái sinh

từ đó tối ưu quy trình tái sinh in vitro phục vụ cho các nghiên cứu chuyển gen.

3.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen

3.2.1. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến hiệu quả biến nạp gen

Để xác định được tuổi mô sẹo thích hợp sử dụng cho biến nạp gen, đề tài tiến

hành thử nghiệm các độ tuổi mô sẹo từ 3 đến 7 ngày tuổi ở cả 4 giống lúa Khang

dân, Bao thai, Đoàn kết, Nếp 87 sử dụng gen chỉ thị GUS. Sau 14 ngày nuôi cấy,

37

mẫu biến nạp được nhuộm để kiểm tra biểu hiện của gen GUS thông qua chỉ thị màu

xanh lục.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận

gen GUS của một số giống lúa

Tỷ lệ Tuổi Số mẫu Tỷ lệ mô Số mẫu mẫu Công mô biến sẹo sống nhuộm Mức độ Giống nhuộm thức sẹo nạp sau biến gus biểu hiện gus+ (ngày) (mẫu) nạp (%) (mẫu) (%)

66,6c 57,5c + 40 1 3 100

67,2b 92,5a ++ 40 2 5 100 Khang

73,9a 91,6a +++ 40 3 7 100 dân

68,8b 86,7b ++ 40 4 10 100

68,3d 86,7b + 40 1 3 100

71,7c 95,0a ++ 40 2 5 100 Bao Thai 76,7b 74,2c +++ 40 3 7 100

82,8a 70,0d ++ 40 4 10 100

66,2c 66,7c ++ 40 1 3 100

67,2c 74,2b +++ 40 2 5 100 Đoàn kêt 73,3b 83,3a +++ 40 3 7 100

77,8a 72,5b ++ 40 4 10 100

57,2d 68,7c + 40 1 3 100

67,2c 84,3b ++ 40 2 5 100 Nếp 87 73,3a 91,6a +++ 40 3 7 100

70,8b 83,3b +++ 40 4 10 100

Ghi chú: +++: màu xanh đậm, vùng biểu hiện rộng; ++: màu xanh nhạt và vùng

biểu hiện trung bình; +: màu xanh nhạt, vùng biểu hiện hẹp. Các chữ cái a, b, c, d, e

khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức với

mức ý nghĩa α<0,05 từ kết quả phân hạng Duncan.

38

A B D C

Hình 3.5. Biểu hiện gen GUS ở mô sẹo 3 ngày tuổi của giống Khang dân (A),

Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D).

Qua bảng 3.6 cho thấy khi độ tuổi mô sẹo tăng thì tỷ lệ sống sau biến nạp của

mô sẹo cũng tăng ở cả 4 giống. Tỷ lệ mô sẹo sống thấp nhất ở 3 ngày tuổi (giống

Khang dân 66,6%, Bao thai 68,3%, Đoàn kết 67,2% và giống Nếp 87 là 57,2%). Tỷ

lệ mô sẹo sống tăng lên ở giai đoạn 7-10 ngày tuổi, dao động từ 73,3 đến 77,8%.

Trong đó giống Đoàn kết có tỷ lệ mô sẹo sống cao nhất (77,8%), các giống Nếp 87,

Khang dân, Bao thai lần lượt đạt 73,3%; 73,9% và 76,8%.

Để kiểm tra hiệu quả biến nạp gen ở các công thức, 40 mẫu mô sẹo được nhuộn

để kiểm tra biểu hiện của gen GUS. Kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu biểu hiện gen GUS

(GUS+) thay đổi theo độ tuổi của mô sẹo và giống. Ở cả 4 giống tỷ lệ GUS+ cao nhất

ở giai đoạn mô sẹo 5-7 ngày tuối, dao động từ 83,3 đến 95%, mức độ biểu hiện gen

tốt (+++) (Bảng 3.6, hình 3.5), trong đó giống Bao thai và Khang dân có tỷ lệ GUS+

cao nhất ở mô sẹo 5 ngày tuổi, lần lượt đạt 95% và 92,5%, mức độ biểu hiện gen tốt

(+++). Giống Đoàn kết và Nếp 87 cho tỷ lệ GUS+ cao nhất ở giai đoạn mô sẹo 7

ngày tuổi đạt 83,3 và 91,6% (Bảng 3.6).

3.2.2. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen

Chủng vi khuẩn có vai trò quan trọng trong chuyển gen. Mỗi chủng vi khuẩn

thường được sử dụng để chuyển gen ở một hoặc một nhóm cây trồng nhất định. Việc

xác định chủng vi khuẩn thích hợp sẽ làm tăng hiệu quả biến nạp gen ở cây lúa.

Trong nghiên cứu này 4 chủng vi khuẩn bao gồm: AGL1, EHA105, GV3101,

LBA4404 được đánh giá thông qua gen chỉ thị GUS ở cả 4 giống lúa nghiên cứu.

Mô sẹo ở giai đoạn 5 ngày tuổi được lây nhiễm với các chủng vi khuẩn khác

nhau. Kết quả thu được ở bảng 3.7 cho thấy: sau 14 ngày biến nạp, tỷ lệ mẫu sống và

hiệu quả chuyển gen thông qua chỉ thị GUS có sự khác biện ở các chủng vi khuẩn.

39

Cụ thể với chủng vi khuẩn AGL1, tỷ lệ mẫu sống dao động từ 73,3 đến 88,0%, hiệu

quả biến nạp từ 45,3 đến 61,3%. Chủng EHA105 cho tỷ lệ mẫu sống từ 73,3 đến

97,1%, GUS+ từ 78,6 đến 83,7%. Chủng GV3101 tỷ lệ mẫu sống từ 72,6 đến 84,3%,

hiệu quả biến nạp gen GUS 55,2 đến 81,3%. Chủng LBA4404 tỷ lệ mẫu sống từ

89,9% đến 95,7%, hiệu quả biến nạp gen GUS 84,3 đến 91,7% (Bảng 3.7). Nhìn

chung chủng vi khuẩn EHA105 và LBA4404 cho tỷ lệ mẫu GUS+ cao hơn hai chủng

còn lại ở cả 4 giống lúa. Kết quả này chứng tỏ chủng vi khuẩn EHA105 và LBA4404

thích hợp cho chuyển gen ở cây lúa.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả

chuyển gen ở một số giống lúa

Giống

Bao thai Đoàn kết Nếp 87 Khang dân

Chủng vi khuẩn Số mẫu lây nhiễm

Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu sống (%)

150 73,3 57,3c 82,2 66,3c 76,1 45,3c 88,0 61,3d AGL1

150 93,6 83,7a 73,3 83,6b 85,3 78,6b 97,1 81,1b EHA105

150 84,3 60,6b 81,3 55,2d 72,6 76,7b 82,5 75,6c GV3101

150 89,9 84,3a 95,7 91,7a 96,4 90,1a 93,9 89,7a LBA4404

3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống lúa

Nồng độ AS có ảnh hưởng lớn tới hiệu quả biến nạp gen ở thực vật. Riêng đối với

lúa, các giống lúa khác nhau có phản ứng khác nhau với các nồng độ AS được bổ sung

trong môi trường đồng biến nạp [41].

Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.8 cho thấy nồng độ AS có tác động tích cực đối với

khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium ở giống lúa Khang dân, Bao thai,

Đoàn kết, Nếp 87. Tỷ lệ biến nạp gen đạt từ 18,3 đến 51,3% tùy theo từng giống lúa khi

bổ sung 50 đến 150 µM AS, cao hơn đáng kể so với khi không bổ sung chỉ đạt 11,6

đến 14,2% (Bảng 3.8). Môi trường biến nạp bổ sung AS 100µM cho hiệu quả cao

40

nhất ở cả 4 giống lúa với tỷ lệ từ 36,7 đến 51,3% thông qua gen chỉ thị GUS, mức độ

biểu hiện gen tốt (+++, hình 3.6). Khi nồng độ AS tăng lên hay giảm, đều làm giảm tỷ

lệ biến nạp gen.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen GUS

của một số giống lúa

Giống Công thức Nồng độ µM Mức độ biểu hiện Số mẫu nhuộm gus (mẫu)

Số mẫu biến nạp (mẫu) 60 60 60 60 1 2 3 4 0 50 100 150 40 40 40 40 Khang dân

CV% LSD05

Bao Thai 1 2 3 4 0 50 100 150 60 60 60 60 40 40 40 40

CV% LSD05

Đoàn kết 1 2 3 4 0 50 100 150 60 60 60 60 40 40 40 40

CV% LSD05

Nếp 87 1 2 3 4 0 50 100 150 60 60 60 60 40 40 40 40 + + +++ ++ + ++ +++ ++ + + +++ ++ + ++ ++ +++

Tỷ lệ mẫu nhuộm gus+ (%) 11,6d 26,7b 36,7a 18,3c 7,4 1,44 14,2d 36,7b 45a 31,7c 6,3 1,63 23,3c 29,2b 41,7a 29,0b 6,2 1,43 13,3d 33,2b 51,3a 26,0c 4,3 2,4 CV% LSD05

Ghi chú: +++: màu xanh đậm, vùng biểu hiện rộng; ++: màu xanh nhạt và vùng biểu

hiện trung bình; +: màu xanh nhạt, vùng biểu hiện hẹp. Các chữ cái a, b, c, d, e khác

nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức với mức

ý nghĩa α<0,05 từ kết quả phân hạng Duncan.

41

C B D A

Hình 3.6. Biểu hiện gen GUS ở nồng độ AS 100 µM ở giống Khang dân (A),

Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D).

3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen

Thời gian lây nhiễm mô sẹo với vi khuẩn Agrobacterium tumefacien được tiến

hành ở cả 4 giống lúa sử dụng chủng LBA4404 và gen chỉ thị GUS. Vi khuẩn sau khi

hòa loãng với môi trường biến nạp được lây nhiễm với mô sẹo trong khoảng thời

gian từ 1 đến 5 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian biến nạp càng dài tỷ lệ

mô sẹo chết càng cao. Tỷ lệ mô sẹo sống cao trong khoảng thời gian từ 1 đến 3 phút,

dao động từ 83,9 đến 97,3% sau đó giảm dần khi tăng thời gian biến nạp trên 4 phút,

tỷ mẫu sống chỉ đạt 47,3 đến 82,3% (Bảng 3.9). Hiệu quả biến nạp gen GUS cao

nhất khi lây nhiễm khoảng 3 phút, tỷ lệ GUS+ đạt 90,2 đến 94,2% tùy từng giống lúa

(Bảng 3.9, hình 3.7). Kết quả nghiên cứu này cho thấy thời gian lây nhiễm thích hợp

ở các giống lúa Khang dân, Đoàn kết, Bao thai và Nếp 87 khoảng 3 phút.

A C D B

Hình 3.7. Biểu hiện gen GUS sau 3 phút lây nhiễm với vi khuẩn ở giống Khang

dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D).

42

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen

Giống

Bao thai Đoàn kết Nếp 87 Khang dân

Thời gian Số mẫu lây nhiễm

Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu)

1 phút 150 89,6 42,3d 97,3 43,6e 86,3 23,3d 96,3 31,2e

2 phút 150 91,6 53,7c 87,7 48,3d 97,2 89,7a 95,7 97,3a

3 phút 150 83,9 91,3a 92,9 89,7a 92,3 90,2a 89,3 94,2b

4 phút 150 75,2 83,3b 82,3 77,3b 84,7 75,3b 69,3 87,7c

5 phút 150 65,1 84,7b 78,9 69,6c 77,3 39,2c 47,3 55,3d

Ghi chú: a, b, c là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-

way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,01

3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen

Thời gian đồng nuôi cấy là thời gian sau khi mẫu được lây nhiễm với vi khuẩn

tiếp tục được nuôi trên môi trường đặc có bổ sung chất dẫn dụ AS để kích thích vi

khuẩn xâm nhiễm vào tế bào mô. Thời gian đồng nuôi cấy từ 1 đến 5 ngày, sau đó

mẫu được chuyển sang môi trường loại bỏ vi khuẩn và chọn lọc tế bào chuyển gen.

Hiệu quả chuyển gen được xác đinh thông qua gen chỉ thị GUS.

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ GUS+ cao nhất dao động từ 78,2 đến 90,8%

sau 3 ngày đồng nuôi cấy. Trong đó giống Nếp 87 có tỷ lệ GUS+ đạt 90,8%, các

giống Khang dân, Bao Thai và Đoàn kết lần lượt đạt 80,3; 78,2 và 87,3% (Bảng 3.10,

hình 3.8). Tuy nhiên kết quả cũng cho thấy tỷ lệ mẫu chết giảm mạnh ở các ngày

đồng nuôi cấy thứ 4 và 5. Điều này chứng tỏ thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày cho hiệu

quả chuyển gen cao ở các giống lúa nghiên cứu.

43

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen

Giống Thời Số Khang dân Bao thai Đoàn kết Nếp 87 gian mẫu Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ đống lây mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu nuôi nhiễm sống GUS+ sống GUS+ sống GUS+ sống GUS+ cấy (%) (mẫu) (%) (mẫu) (%) (mẫu) (%) (mẫu)

1 ngày 150 96,7 26,5e 92,4 46,5d 97,2 33,7d 98,0 43,1e

2 ngày 150 95,7 48,7d 98,7 68,7c 94,3 57,9c 96,3 78,3c

3 ngày 150 92,3 80,3a 91,3 78,2a 89,1 87,3a 95,6 90,8a

4 ngày 150 84,7 75,6b 86,7 73,1b 76,5 77,4b 88,7 84,5b

5 ngày 150 74,1 57,3c 44,2 67,2c 65,8 77,2b 76,6 70,5d

Ghi chú: a, b, c là các nhóm khác nhau có ý nghĩa theo phương pháp phân tích one-

way ANOVA của Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,01

A B C D

Hình 3.8. Biểu hiện gen GUS sau 3 ngày đồng nuôi cấy ở giống Khang dân (A),

Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D).

3.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc chuyển gen

Để chọn lọc tế bào chuyển gen, mô sẹo sau khi biến nạp được chuyển sang môi

trường chọn lọc tế bào mang gen. Mẫu mô sẹo được chọn lọc trên môi trường có

chứa chất chọn lọc hygromycin ở các nồng độ khác nhau. Sau 28 ngày chọn lọc tỷ lệ

mô sẹo kháng hygromycin được thống kê ở bảng 3.11. Kết quả cho thấy ở nồng độ

hygromycin thấp (5 mg/l) tỷ lệ mô sẹo sống sót cao (78 đến 96,3%, bảng 3.10 và

hình 3.9). Tỷ lệ mô sẹo kháng hygromycin giảm dần khi tăng nồng độ từ 10 đến

44

25mg/l. Ở nộng độ cao (25mg/l) tỷ lệ mô sẹo sống sót rất ít (4,1 đến 14,5%, Bảng

3.11, hình 3.9). Tỷ lệ kháng từ 20,7 đến 28,7% ở nồng độ hygromycin 20 mg/l có thể

là nồng độ thích hợp để chọn lọc tế bào chuyển gen ở giống lúa Khang dân, Bao thai,

Đoàn kết và Nếp 87.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả

chọn lọc mô sẹo chuyển gen

Tỷ lệ kháng hygromycin ở các giống lúa Nồng độ Số mẫu

hygromycin chọn lọc Bao thai Đoàn kết Nếp 87 Khang dân

5 mg/l 90 86,7 96,3 82,1 78,0

10 mg/l 90 75,7 47,6 64,3 66,3

15 mg/l 90 52,3 42,1 29,7 35,6

20 mg/l 90 20,7 25,4 26,2 28,7

25 mg/l 90 4,1 14,5 5,2 6,6

(A)

(B)

(C)

(D)

Hình 3.9. Chọn lọc tế bào chuyển gen trên môi trường hygromycin

10mg/l (A), 15 mg/l (B), 20 mg/l (C) và 25 mg/l (D)

45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Từ các kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro và khả năng chuyển gen của

4 giống lúa Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87 cho thấy:

 Về khả năng tái sinh in vitro

- Nồng độ NaOCl 3% thích hợp để khử trùng hạt lúa trong thời gian 25 phút. Tỷ

lệ khử trùng mẫu từ 81 đến 92% tùy từng giống: Đoàn kết 81%; Bao thai 84%;

Khang dân 87%; Nếp 87 92%

- Môi trường MS + 30g đường/l + 7g agar/lít + 2mg 2,4-D/l, pH 5,6 cho tỷ lệ tạo mô

sẹo cao nhất ở cả 4 giống lúa từ 78 đến 92%. Trong đó Nếp 87 (92%), Khang Dân

(91%), Bao Thai (82%), Đoàn kết (78 %). Mô sẹo có màu vàng, độ đồng đều cao.

- Khả năng tái sinh in vitro từ mô sẹo trên môi trường MS cơ bản + 100 mg/l

myoinostol + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar bổ sung 1,5 mg/l kinetin cho tỷ lệ tái sinh

chồi cao nhất ở giống Nếp 87 (70%), tiếp đến là các giống Bao Thai (63%), Đoàn

Kết (62%) và Khang Dân (58%).

- Khả năng tái sinh in vitro từ mô sẹo trên môi trường MS cơ bản + 100 mg/l

myoinostol + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar bổ sung 1,0 mg/l BAP cho tỷ lệ tái sinh chồi

cao nhất ở giống Nếp 87 (83%), tiếp đến là các giống Khang dân (79%), Bao Thai

(79%), Đoàn Kết (78%).

 Về khả năng chuyển gen

- Mô sẹo sau 3 ngày tuổi thích hợp cho chuyển gen ở cả 4 giống lúa Bao thai,

Khang dân, Đoàn kết và Nếp 87

- Chủng vi khuẩn LBA4404 cho hiệu quả chuyển gen tốt nhất ở các giống lúa

nghiên cứu. Tỷ lệ mẫu sống từ 89,9% đến 95,7%, hiệu quả biến nạp gen GUS 84,3

đến 91,7%

- Môi trường biến nạp bổ sung AS 100µM cho hiệu quả cao nhất ở cả 4 giống lúa

với tỷ lệ từ 36,7 đến 51,3%, mức độ biểu hiện gen tốt.

- Hiệu quả biến nạp gen GUS cao nhất khi lây nhiễm khoảng 3 phút, tỷ lệ GUS+

đạt 90,2 đến 94,2%.

46

- Thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày cho tỷ lệ GUS+ cao nhất dao động từ 78,2 đến

90,8%. Trong đó giống Nếp 87 có tỷ lệ GUS+ đạt 95,6%, các giống Khang dân, Bao

Thai và Đoàn kết lần lượt đạt 80,3; 78,2 và 87,3%.

- Nồng độ hygromycin 20mg/l thích hợp để chọn lọc tế bào chuyển gen ở giống

lúa Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87, hiệu quả chọn lọc 20,7 đến 28,7%.

2. Kiến nghị

- Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tiếp nhận gen

và tiến hành chuyển gen vào các giống lúa nghiên cứu.

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tài liệu tiếng việt

1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, (1997), Công nghệ sinh học thực vật

cải tiến giống cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp 72-74.

2. Nguyễn Thị Hồng Châu, Nguyễn Phương Thảo, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội

(2003) Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens vào giống lúa C71.

Tạp chí CNSH, 1(2): 219-226.

3. Nguyễn Xuân Dũng (2015). Kết quả nghiên cứu chọn tạo giống lúa nếp thoem

và ngắn ngày N31. Hội thảo quốc gia về khoa học cây trồng lần thứ 2.

4. Phan Thị Thu Hiền, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2017). Quy trình chuyển

gen ex vitro vào đoạn thân mía thông qua Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí

Công nghệ Sinh học 15 (4A): 1-8, 2017.

5. Phan Thị Hương (2014). Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lúa. Tạp chí

Khoa học và Phát triển 2014, tập 12, số 8: 1249-1257.

6. Hoàng Thị Giang và cộng sự (2015), Hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống

lúa taichung 65 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Khoa

học và Phát triển 2015, tập 13, số 5: 764-773.

7. Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Tràng Hiếu, Phan Thị Hương, Nguyễn Thị

Thuỳ Linh (2013). Thiết kế vector mang miRNA nhân tạo ức chế đặc hiệu sự

biểu hiện của gen MPG1 ở nấm đạo ôn (Magnaporthe grisea) gây bệnh trên lúa.

Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, tập 11, số 6: 857-867.

8. Nguyễn Đức Thành, (2003), Chuyển gen ở thực vật, Nhà xuất bản khoa học và

kỹ thuật.

9. Tổng cục thống kê (2018): https://www.gso.gov.vn.

II. Tài liệu Tiếng Anh

10. Cao, Duan, McElroy, D. and Wu, R. 1992. Regeneration of herbicide resistant

transgenic rice plants following microprojectile-mediated transformation of

suspension culture cells. Plant Cell Reproduction 11:586-591.

48

11. Chan M.T., Lee T.M., Chang H.H. (1992). Transformation of indica rice (Oryza

sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Physiol., 33: 577-583.

12. Cheng M, Fry JE, Pang SZ, Zhou HP, Hironaka CM, Duncan DR, Conner TW,

Wan YC (1997). Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium

tumefaciens. Plant Physiol 1997, 115:971-980.

13. Chopita Sakulsingharoj, Poonsri Inta, Roypim Sukkasem, Saengtong

Pongjaroenkit, Srimek Chowpongpang, Varaporn Sangtong (2014).

Overexpression of OSB2 gene in transgenic rice up-regulated expression of

structural genes in anthocyanin biosynthesis pathway. Thai J. Genet., 7(3): 173-

182.

14. Christou P., Ford, T.L. and Kofron, M. 1991. Production of transgenic rice

(Oryza sativa L.) plants from agronomically important indica and japonica

varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into

immature zygotic embryos. Bio/Technology 9:957- 962.

15. Datta, K., Tu, J.M., oliva, N., Ona, L., Velazhahan, R., Mew, T.W.,

Muthukrishnan, S. & Datta, S.K. (2001). Enhanced resistance to sheath blight by

consititutive expression of infection-related rice chitinase in transgenic elite

indica rice cultivars. Plant Sci. 160, 405-414.

16. Diah Rachmawati1,2, Hiroyuki Anzai1,* (2006). Studies on callus induction,

plant regeneration and transformation of Javanica rice cultivars. Plant

Biotechnology 23, 521–524.

17. Enrico Scarpella, Saskia Rueb and Annemarie H. Meijer (2003). The

RADICLELESS1 gene is required for vascular pattern formation in rice.

Development, 130: 645-658.

18. FAOSTAT | © FAO Statistics Division 2014| 07 February 2014.

19. Fujimura T, Sakurai M, Akagi H, Negishi T, Hirose A (1985) Regeneration of

rice plants from protoplasts. Plant Tissue Culture Lett 2:74–75.

20. Gould, J., Devery, M., Heeegawa, O., Ulian, E.C., Peterson, G. and Smith, R.H.

(1991) Transformation of Zea mays L. using Agrobacterium tumefaciens and the

shoot apex. Plant Physiol. 95, 426-434.

49

21. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. (1994). Efficient transformation of

rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the

boundaries of the T- DNA. Plant J., 6: 271-282.

22. Hiei Y., Komari T. (2008). Agrobacterium-mediated transformation of rice using

immature embryos or calli induced from mature seed. Nat Protocols, 3: 824-834.

23. Hong, S.-W., Aoki, T., Kitano, H., Datoh, H. and Bagato, Y. (1995). Phenotylic

diversity of 188 rice embryo mutants. Dev. Genetics 16, 298-310.

24. Hoa T.T.C., Bahagiawati A. and Hodges T.K. (1999). Agrobacterium - mediated

transfomation of Indica rice cultivars grown in Vietnam.

Omonrice, 7: 70-79.

25. Inukai Y., Sakamoto T., Ueguchi-Tanaka M., Shibata Y., Gomi K., Umemura, I.,

Hasegawa Y., Ashikari M., Kitano H., and Matsuoka M. (2005). Crown

rootless1, which is essential for crown root formation in rice, is a target of an

AUXIN RESPONSE FACTOR in auxin signaling. Plant Cell, 17:1387-1396.

26. Juliano BO (2003). Rice chemistry and quality. Manila Philippines: Philippine

Rice Research Institute.

27. Li, X.-Q., Liu, C.-N., Ritchie, S.W., Peng, J.-Y., Gelvin, S.B. and Hodges, T.K.

(1992) Factors influencing Agrobacteriummediated transient expression of gusA

in rice. Plant Mo/. Biol. 20, 1037-1048.

28. Y J Lin, Qifa Zhang (2005). Optimising the tissue culture conditions for high

efficiency transformation of indica rice. Plan Cell Rep. 2005 jan; 23(8);540-7.

29. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue culture. Physiol Plant 1962, 15: 473-497.

30. Namiko Satoh, Soon-Kwan hong, Asuka Nishimura, Makoto Matsuoka, Hidemi

Kitano and Yasuo Nagato (1999). Initiation of shoot qpical meristem in rice:

characterization of four SHOOTLESS genes. Development 126. 3629-3636

(1999).

31. Ozawa K. (2009). Establishment of a high efficiency Agrobacterium - mediated

transformation system of rice (Oryza sativa L.). Plant Science 176: 522-527

50

32. Rained, D. M., Bottino, P., Gordon, M. P. and Nester, E. W. (1990)

Agrobecterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa L.)

Bio/Techno/ogy, 8, 33-38.

33. Ramesh, T., Snehalatha, Y., Sankar, K. and Qamar Qureshi (2009). Food habits

and prey selection of tiger and leopard in Mudumalai Tiger Reserve, tamil Nadu,

India. J. Sci. Trans. Environ. Technology 2(3): 170-181.

34. Z.Rahman, Z. A.Seman, S.Roowi, N.Basirun and S. Subramaniam (2010).

Production of transgenic Indica rice (Oryza sativa L.) Cv. MR 81 via particle

bombardment system. Emir. J. Food Agric. 2010. 22 (5): 353-366.

35. Prasad B.D., Jha S. and Chattoo B.B. (2008). Transgenic indica rice expressing

Mirabilis jalapa antimicrobial protein (Mj-AMP2) shows enhanced resistance to

the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Plant

Science 175: 364-371.

36. Shimamoto K, Terada R, Izawa T, Fujimoto H. Fertile transgenic rice plants

regenerated from transformed protoplasts. Nature 1989; 338 (6212):274–6.

37. Verma Rohit, Yatan Pal Singh Balhara, Chandra Shekhar Gupta (2011). Gender

differences in stress response: Role of developmental and biological

determinants. Industrial Psychiatry Journal, Volume: 20, 4-10.

38. Asanori Yara, Motoyasu Otani, kensuke Kusumi, Osamu Matsuda, Takiko

Shimada and Koh IBA (2001). Production of Transgenic Japonica Rice (Oryza

sativa) Cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium – Mediated Method. Plant

Biotecnology, 18(4), 305-310.

39. Zhang HM, Yang H, Rech EL, Gold TJ, Davis AS, Mulligan BJ, Cocking EC,

Davey MR (1988). Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated

plasmid uptake into protoplast. Plant Cell Rep 7: 379–383 (1988).

40. Zhong-xun Luo and Ray Wu (1989). A Simple Method for the Transformation of

Rice Via the Pollen-Tube Pathway. Plant Molecular Biology Reporter Volume

7(1) 1989 : 69-77.

PHỤ LỤC 1

MỘT SỐ HÌNH ẢNH MÔ TẢ QUÁ TRÌNH TÁI SINH CÂY LÚA

IN VITRO

PHỤ LỤC 2

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

 Môi trường N6

Lượng lấy STT Thành phần g/l (ml)

56,6 KNO3

9,26 NH4NO3 1 N6 Macro 20x 8,00 50 KH2 PO4

3,70 MgSO4.7H2O

3,32 CaCl2.2H2O

4,40 MnSO4.4H2O

1,60 H3 BO3 2 N6 Micro 1000X 1 1,50 ZnSO4.7H2O

KI 0.80

2,78 FeSO4.7H2O 3 10 FeSO4 EDTA Iron 100x 3,72 Na2EDTA

Myo-inositol 10

Glycine 200 4 N6 Vitamins 100x(mg/l) 10 Thiamine-HCl 100

Nicotinic acid 50

 Môi trường MS

g/l Lượng lấy STT Thành phần (20x) (ml)

1 20 1900 KNO3

2 20 1650 NH4NO3

3 10 170 KH2 PO4

4 10 370 MgSO4.7H2O

5 10 440 CaCl2.2H2O

27,8 FeSO4.7H2O 6 10 37,3 Na2EDTA

0,3 H3 BO3

0,76 MnSO4.H2O

0,2 ZnSO4.7H2O

7 KI 10 0,075

0,025 Na2MoO4.2H2O

0,0025 CuSO4

0,0025 CoCl2.6H2O

Myo-inositol 10

Nicotinic acid 0,1 8 20 Pyridoxin-HCl 0,1

Thiamin-HCl 1

PHỤ LỤC 3

MÔI TRƯỜNG NUÔI VI KHUẨN YEP

Khối lượng (g/l) Thành phần

Bacto-peptone 10

Yeast-extract 5

NaCl 5

Agar 12

PHỤ LỤC 4

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG X – GLUC (100ml)

Hoá chất Lượng lấy

0,0165g K3(Fe(CN)6

0,211g K4(FeCN)6

X - Gluc 100mg

115 mM Na3PO4