Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tinh sạch và đánh giá ảnh hưởng của hợp chất prodigiosin từ chủng Serratia marcescens đến mạng lưới nội chất tế bào

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng như tiềm năng ứng dụng Prodigiosin từ Serratia marcescens trong phát triển thuốc. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu chuyên sâu nào về ảnh hưởng của Pg lên mạng lưới nội chất trong tế bào, cũng như sự đáp ứng của tế bào trong môi trường có chứa Pg.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tinh sạch và đánh giá ảnh hưởng của hợp chất prodigiosin từ chủng Serratia marcescens đến mạng lưới nội chất tế bào

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Lệ TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA HỢP CHẤT PRODIGIOSIN TỪ CHỦNG Serratia marcescens ĐẾN MẠNG LƯỚI NỘI CHẤT TẾ BÀO LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Lệ TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA HỢP CHẤT PRODIGIOSIN TỪ CHỦNG Serratia marcescens ĐẾN MẠNG LƯỚI NỘI CHẤT TẾ BÀO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh Hà Nội – 2020
LỜI CAM ĐOAN Luận văn “Tinh sạch và đánh giá ảnh hƣởng của hợp chất prodigiosin từ chủng Serratia marcescens đến mạng lƣới nội chất tế bào” là do tôi thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh. Tôi xincam đoan tất cả các kết quả trong luận văn là hoàn toàn chính xác, trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trên bất kì công trình nào khác. Hà Nội, ngày 05 tháng 01 năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Lệ
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành công trình nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh, cán bộ phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - thầy hƣớng dẫn khoa học, ngƣời đã định hƣớng và tận tâm hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Đồng thời, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm và các thầy cô, cán bộ Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Khoa học và Công nghệ đã tham gia giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt hai năm học tập và nghiên cứu tại Học viện.Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong suốt hai năm học vừa qua. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnhchia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiên tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành khoá luận của mình. Hà Nội, ngày 05 tháng 01năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Lệ
BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATF6 Activating Transcription Factor – 6 (yếu tố dịch mã) DTT Dithiothreitol ER Endoplasmic Reticulum (Lƣới nội chất) 1 H – NRM Proton Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hƣởng từ hạt nhân) HPLC High Performance Liquid Chromatography (phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao) IRE1 Inositol Requiring Enzyme 1 mTOR mammakian Target Of Rapamycin MTT 3 – (4 ,5 – dimethyl – 2 – thiazolyl) – 2,5 – diphenyl – 2H – tetrazolium bromide NA Nutrient agar (môi trƣờng thạch dinh dƣỡng) NB Nutrient borth (môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng) Pg Prodigiosin PERK PKR – like Endoplasmic Reticulum kinase (một loại protein màng lƣới nội chất mang hoạt tính kinaza) RNase Endoribonuclease ROS Reactive oxygen species (các gốc oxy hóa tự do trong tế bào) SD Synthetic destrose TLC Thin Layer Chromatography (phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng)
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Serratia marcescensVTCC 910027 ........ 3 Hình 1.2 Các gen tham gia sinh tổng hợp prodigiosin ở một số chủng vi khuẩn. ................................................................................................................. 5 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử prodigiosin gồm ba vòng pyrol đặc trƣng ............... 6 Hình 1.4 Các con đƣờng truyền tín hiệu của phản ứng cuộn gập protein ........ 16 Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn Prodigiosin ........................................................ 24 Hình 3.1. Bình chiết tế bào bằng hệ dung môi ethyl acetate + 1% HCl (A) và acetone (B) ........................................................................................................ 29 Hình 3.2 Bình rửa dịch chiết Pg trong acetone rửa bằng ethylacetate và nƣớc lần 1 (A) và lần 3 (B) ........................................................................................ 30 Hình 3.3. Bản TLC mẫu dịch chiết chủng S. marcescens VTCC 910027 bằng hai dung môi acetone và acetate + 1% HCl ...................................................... 31 Hình 3.4 Kết quả TLC dịch chiết Pg bằng các hệ dung môi khác nhau ........... 32 Hình 3.5 Kết quả TLC mẫu Pg tinh chế bằng hệ dung môi toluen và ethyl acetate tỷ lệ lần lƣợt 9:1 (A), 4:1 (B) và 7:3 (C) với cùng thể tích ................... 34 Hình 3.6 Các phân đoạn đặc trƣng của mẫu tinh sạch từ S. marcescens VTCC 910027 lần 1 (A) và lần 2 (B) ........................................................................... 35 Hình 3.7. Kết quả TLC prodigiosin tinh sạch lần 1 (A): LC1 – Dịch lên cột; 1, 2, 3 – phân đoạn sau tinh sạch; và lần 2 (B), 1, 2 – phân đoạn tinh sạch; C – Pg chuẩn. ........................................................................................................... 36 Hình 3.8 Kết quả chạy HPLC của dịch chiết Prodigiosin từ chủng Serratia marcescensVTCC 910026 (A) Pg chuẩn (B).................................................... 36 Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của mẫu Prodigiosin tinh sạch .............................. 37 Hình 3.10. Phổ 1H NMR ................................................................................... 38
Hình 3.11 Cơ chế kích hoạt stress lƣới nội chất của tế bào .............................. 39 Hình 3.12 Biểu đồ hoạt tính β – galactosidase.................................................. 40 Hình 3.13 Điện di đồ phân tích RNA tổng số của các mẫu thí nghiệm bổ sung hàm lƣợng Pg khác nhau. Giếng 1: ĐC (-); Giếng 2: ĐC (+); Giếng 3: Hàm lƣợng Pg 0.2 μg/ml ............................................................................................ 41 Hình 3.14Điện di đồ phân tích sự có mặt của mRNA Hac1s. 1 – maker; 2 , 3 , 4 – hàm lƣợng Pg 0,1 g /ml, 0,15 g /ml và 0,2 g /ml; 5 ĐC (+) DTT; 6 ĐC (-) knock out Ire1............................................................................................... 41 Hình 3.15. Hàm lƣợng Pg đo đƣợc bằng đếm mật độ điểm ảnh....................... 42
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Serratia marcescens VÀ HỢP CHẤT PRODIGIOSIN .................................................................................................. 3 1.1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens .................................................................. 3 1.1.1.1 Đặc điểm ................................................................................................ 3 1.1.1.2 Sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens .............................. 4 1.1.2 Nguồn gốc, đặc điểm của prodigiosin....................................................... 5 1.1.3 Tinh sạch và xác định cấu trúc của prodigiosin ........................................ 6 1.1.4 Hoạt tính sinh học của prodigiosin ........................................................... 7 1.1.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm ....................................................... 7 1.1.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của prodigiosin ................................. 8 1.1.5 Ứng dụng của prodigiosin ........................................................................ 10 1.1.5.1 Ứng dụng của prodigiosin trong công nghệ thực phẩm........................ 10 1.1.5.2 Ứng dụng của prodigiosin trong phát triển thuốc ................................. 11 1.1.6 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescens ở Việt Nam . 12 1.1.7 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescens trên thế giới . 12 1.2 ẢNH HƢỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƢỚI NỘI CHẤT ... 14 1.2.1. Mạng lƣới nội chất và hiện tƣợng ER stress ........................................... 14 1.2.2 Stress lƣới nội chất ở tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae .......... 17 1.2.3. Ảnh hƣởng của Prodigiosin lên mạng lƣới nội chất ............................... 19 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 21 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU................................................................................ 21
2.1.1 Nguyên liệu .............................................................................................. 21 2.1.2 Hoá chất.................................................................................................... 21 2.1.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy và đệm ...................................................... 21 2.1.4 Trang thiết bị ............................................................................................ 22 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................................................. 22 2.2.1. Hoạt hóa Serratia marcescens ................................................................ 22 2.2.2. Hoạt hóa chủng nấm men KMY 1516 .................................................... 23 2.2.3 Lựa chọn hệ dung môi tách chiết prodigiosin .......................................... 23 2.2.4 Xây dựng đƣờng chuẩn prodigiosin dựa trên mật độ quang.................... 24 2.2.5 Tinh chế prodigiosin bằng phƣơng pháp sắc ký ...................................... 25 2.2.5.1 Phƣơng pháp sắc ký cột ........................................................................ 25 2.2.5.2 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng .............................................................. 25 2.2.5.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp ........................................................... 26 2.2.6 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của prodigiosin lên mạng lƣới nội chất tế bào.......................................................................................................... 27 2.2.6.1 Phƣơng pháp xác định hoạt tính β – galactosidase ............................... 27 2.2.6.2 Phƣơng pháp tách chiết, tạo thƣ viện cDNA và đọc trình tự mRNA tổng số ............................................................................................................... 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 29 3.1 HỆ DUNG MÔI THÍCH HỢP ĐỂ TÁCH CHIẾT PRODIGIOSIN .......... 29 3.2 XÁC ĐỊNH HỆ DUNG MÔI THÍCH HỢP ĐỂ TINH SẠCH PRODIGIOSIN ................................................................................................ 32 3.2.1 Lựa chọn hệ dung môi thích hợp ............................................................. 32 3.2.2 Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp ........................................................... 33 3.3 TINH SẠCH PRODIGIOSIN QUA CỘT SILICAGEL ............................ 34
3.3.1 Tinh sạch .................................................................................................. 34 3.3.2 Xác định độ sạch của Pg bằng HPLC ...................................................... 36 3.3.3 Xác định độ sạch prodigiosin bằng phổ 1H .............................................. 37 3.4 XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƢỚI NỘI CHẤT TẾ BÀO ........................................................................................ 38 3.4.1 Ảnh hƣởng của Prodigiosin đến protein màng Ire1 ................................. 38 3.4.2 Xác định hàm lƣợng của Hac1 mRNA .................................................... 40 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 44 4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................ 44 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 45
1 MỞ ĐẦU Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp điều trị ung thƣ đã và đang đƣợc sử dụng trên thế giới nhƣ: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp nội tiết, liệu pháp miễn dịch, liệu pháp tế bào gốc, điều trị cá thể hóa, điều trị hƣớng đích, Tuy nhiên, mỗi phƣơng pháp đều tồn tại những tác dụng phụ nhất định. Để ngăn chặn sự phát triển và lây lan của khối u, hóa trị là biện pháp hiệu quả cả ở giai đoạn sớm và giai đoạn muộn của ung thƣ. Việc nghiên cứu phát triển các thuốc chống ung thƣ mới với giá thành rẻ đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học. Prodigiosin (Pg) là chất chuyển hóa thứ cấp có màu đỏ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, ức chế miễn dịch và ngăn cản sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng nhƣ tiềm năng ứng dụng Prodigiosin từ Serratia marcescens trong phát triển thuốc.Tuy nhiên, ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu chuyên sâu nào về ảnh hƣởng của Pg lên mạng lƣới nội chất trong tế bào, cũng nhƣ sự đáp ứng của tế bào trong môi trƣờng có chứa Pg. Chính vì vậy tôi lựa chọn đề tài luận văn “Tinh sạch và đánh giá ảnh hƣởng của hợp chất Prodigiosin từ chủng Serratia marcescens đến mạng lƣới nội chất tế bào”.Nghiên cứu này đƣợc tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.02- 2018.332. Đề tài luận văn này nhằm mục đích sản xuất, tinh sạch đƣợc prodigiosin từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens có độ tinh sạch cao, đánh giá ảnh hƣởng của Pg này đến lƣới nội chất tế bào. Trong các nghiên cứu trƣớc đây, chúng tôi đã đánh giá hoạt tính sinh học của Pg tách chiết từ chủng Serratia marcescens, kết quả cho thấy Pg gây độc dòng tế bào ung thƣ phổi LU – 1 với giá trị IC50 = 1,5 g/mL. Bằng cách tiếp cận nghiên cứu cơ chế phân tử tác động của Pg đối với lƣới nội chất tế bào nấm men chúng tôi sẽ tìm đƣợc cơ chế phân tử của Pg đối với tế bào ung thƣ và tế bào thƣờng. Việc sử dụng sinh vật mô hình là nấm men Saccharomyces cerevisiae sẽ mang lại khả năng thành công cao hơn bởi hơn 40% trình tự gen bảo tồn ở nấm men đƣợc dự đoán là có mặt trong hệ gen
2 ngƣời, các cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào ở nấm men hoặc trong các tế bào khối u tồn tại tƣơng tự với nhiều hơn hoặc ít hơn các chức năng trong tế bào con ngƣời.Các kết quả nghiên cứu này sẽ góp phần hiểu rõ cơ chế tác động của Pg đến tế bào nấm men, từ đó có cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ảnh hƣởng của Pg đến tế bào động vật. Toàn bộ thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Serratia marcescens VÀ HỢP CHẤT PRODIGIOSIN 1.1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens 1.1.1.1 Đặc điểm Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae.“Chúng có mặt ở trong đất, nƣớc, thực vật và trong cơ thể động vật.Trong các loài vi khuẩn thì S. marcescens là loài có khả năng sinh tổng hợp Pg đƣợc biết đến sớm nhất và đƣợc tìm hiểu từ rất sớm. Trong mƣời loài Serratia thì chỉ có ba loài có khả năng sinh tổng hợp Pg là S. plymuthica, S. rubidaea và một số nhóm S. marcescens. S. marcescens hô hấp tùy tiện, do đó nó có thể sinh Pg cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí.Tuy nhiên, sắc tố đỏ chỉ xuất hiện trong một phần nhỏ của dịch nuôi cấy riêng biệt của các chủng S. marcescens. Mỗi chủng có khả năng sảnxuất sắc tố khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ môi trƣờng nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH, cacbon, nitơ và các muối vô cơ.Chủng vi khuẩnSerratia marcescenskhi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng (NA)có màu đỏ, tròn, lồi, bề mặt bóng (hình 1.1). Hình 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Serratia marcescensVTCC 910027
4 1.1.1.2 Sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens Khả năng sản xuất Pg của S. marcescens tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy, nguồn cacbon, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ. “Chủng S. marcescens sinh Pg trong môi trƣờng pH axit ở nhiệt độ 28oC và làm môi trƣờng chuyển sang màu đỏ (Hình 1.1). Ở nhiệt độ 37oC,S. marcescens không sinh sắc tố đỏ.” Sinh tổng hợp Pg bởi S. marcescens MSK1 đƣợc cảm ứng chỉ bởi methionine hoặc cysteine với sự có mặt của glucose. “Sinh tổng hợp Pg đƣợc tối ƣu đạt năng suất cao nhất trong môi trƣờng chứa 0,45 manose, 0,01% methionine, 0,03% cysteine và 0,1% amonium chloride, pH 8 ở 28oC dƣới điều kiện nuôi lắc 120 vòng/ phút trong 24 giờ [1].” Shahitha và Poornima (2012)đã sử dụng các môi trƣờng khác nhau và các nhiệt độ khác nhau để nghiên cứu sinh tổng hợp Pg từ S. marcescens.“Sinh tổng hợp Pg cao nhất đƣợc quan sát thấy ở môi trƣờng bột hạt lạc (37,6mg/ml) và môi trƣờng bột hạt vừng (16,5mg/ml)khi so sánh với môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng (NB) (0,51mg/ml) và môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng có bổ sung glycerol (0,3mg/ml) ở 28oC, môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng có bổ sung maltose (1,82mg/ml). Trong số dầu khác nhau, dầu lạc cho năng suất sắc tố cao (2,72mg/ml)[2].” Môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng có bổ sung glycerol đƣợc chọn là môi trƣờng tổng hợp tốt nhất.”Hiệu quả của các thành phần môi trƣờng và các thông số quá trình khác nhau nhƣ nguồn cacbon và nitơ, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi lắc và các chất bổ sung khác đã đƣợc khảo sát. Hàm lƣợng Pg lớn nhất đƣợc sinh tổng hợp ở 25oC, pH 7 và thời gian nuôi lắc 48 giờ. Bổ sung thêmmôi trƣờng với maltose và peptone cho năng suất Pg cao nhất. Ngoài ra, việc bổ sung thêm các chất nhƣ muối sắt, phosphat vô cơ cũng cho các kết quả khả quan”[3].” ChủngS. marcescens sinh tổng hợp Pg tốt nhất ở nhiệt độ28oC hoặc 30oC,“thỉnh thoảng chúng sinh tổng hợp Pg ở nhiệt độ thấp hơn nhƣ ở 25oC [3].” Thời gian nuôi cấy các chủng S. marcescens sinh tổng hợp Pg tối ƣu ngắn nhất “có thể là 24 giờ nhƣ S. marcescens MSK1[1], 48 giờ nhƣ S.
5 marcescens[3]; S. marcescens S11[4]; 36 giờ nhƣ S. marcescens MBB05[5]; dài hơn là 72 giờ nhƣ S. marcescens SU – 10 [6], S. marcescens[7], có thể tới 84 giờ nhƣ S. marcescens SR1[8].” Với các thành phần môi trƣờng và các yếu tố nuôi cầy tối ƣu,“các chủng S. marcescens đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau cho năng suất sinh tổng hợp Pg khác nhau. Chẳng hạn chủng S. marcescens 1,84527 mg/l [7], chủng S. marcescens SR1 là 0,7651g/l [8].” Pg đƣợc tổng hợp thông qua hai con đƣờng bao gồm: MBC (4- Methoxy-2,2'-bipyrrole-5-carboxaldehyde) và MAP (2 – methyl – 3 – n – amylpyrrole) [9].Có hơn 30 gen liên quan đến sinh tổng hợp Pg ở vi khuẩn Serratia sp. ATCC 39006,điều này cho thấy lợi thế sản xuất Pg của chúng so với các vi sinh vật sản xuất Pg khác. Mỗi chủng vi khuẩn mang các gen tham gia vào quá tình sinh tổng hợp Pg khác nhau (hình 1.2). Hình 1.2 Các gen tham gia sinh tổng hợp prodigiosin ở một số chủng vi khuẩn[10]. 1.1.2 Nguồn gốc, đặc điểm của prodigiosin Prodigiosin (Pg, PubChem CID: 5351169),“là chất chuyển hóa thứ cấp có màu đỏ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, ức chế miễn dịch và chống ung thƣ[11,12]đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn Serratia marcescens, Rubidaea, Vibrio psychroerythrous, gazogenes, Pseudomonas magneslorubra, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra[13,14]. Trong đó S. marcescens có hiệu suất sản xuất Pg cao nhất và đƣợc nghiên cứu rộng rãi tại
6 nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Pg đóng vai trò nhƣ một chất chuyển hóa thứ cấp của S. marcescens, chức năng của nó đối với vi khuẩn vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ. Một số nghiên cứu cho rằng Pg liên quan đến hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm, ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất và tăng cƣờng sự bám dính vi khuẩn lên các bề mặt dẫn tới tăng cƣờng phát tán vi khuẩn.” Ba thành viên của nhóm“prodiginine bao gồm prodigiosin, undecylprodigiosin (UP) và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG HCl), có đặc tính ức chế miễn dịch và tác động đến tự chết tế bào ung thƣin vitro và in vivo. Hiệu ứng độc tế bào của chúng là do sự hiện diện của nhóm thế C – 6 methoxy. Vòng A – pyrolđóng một vai trò quan trọng trong cả hai hoạt động nuclease và độc tế bào của Pg [15].” Nhóm sắc tố prodiginine đƣợc đặc trƣng bởi cấu trúc ba vòng pyrol[16]. Cấu trúc hóa học của Pg đã đƣợc làm sáng tỏ bởi nhóm nghiên cứu của Wasserman (1960) và Hlden (1962)[10].” Hình 1.3 Cấu trúc phân tử prodigiosin gồm ba vòng pyrol đặc trƣng[17]. Pg“đƣợc báo cáo là có đƣờng cong quang phổ khác nhau ở pH axit và kiềm. Trong môi trƣờng axit, Pg có màu đỏ, đƣờng cong quang phổ từ 510 - 535 nm(đỉnh phổ). Trong môi trƣờng kiềm Pg biểu hiện màu cam, đỉnh phổ 470 nm. Pg không tan trong nƣớc, tan trong alcohol, ete, methanol, acetone, chloroform, DMSO và dễ bị phân hủy bởi ánh sáng.” 1.1.3 Tinh sạch và xác định cấu trúc của prodigiosin Có nhiều phƣơng pháp chiết và tinh sạch prodigiosin khác nhau.“Song và cộng sự (2006) đã chiết và tinh sạch Pg từ chủng S. marcescens sp. KH –
7 95 từ chất hấp phụ bên trong sử dụng methanol đã axit hóa và tách pha với nƣớc và chloroform. Tiếp theo, chất đƣợc tinh sạch bằng sắc ký silica gel và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [18].Chất tinh khiết Pg đƣợc nhận dạng cấu trúc bằng phân tích NMR.” Ramina và Samira (2009) đã tinh sạch prodigiosin từ dịch chiết thô chủng S. marcescens UCP1549 bằng phƣơng pháp sắc ký cột sử dụng hệ dung môi chloroform :methanol tỷ lệ 9:1.“Pg đƣợc tinh chế qua cột sắc ký (50x1cm) sử dụng silica gel làm chất hấp phụ. Sau đó đƣợc hòa vào chloroform (100ml), rồi loại dung môi bằng cô quay. Sản phẩm đƣợc nhận dạng bằng đo quang phổ UV ở bƣớc sóng 700 - 200nm trong 95% ethanol và sau đó khối phổ sử dụng methanol. Kết quả đo khốiphổ cho thấy khối lƣợng phân tử của Pg từ chủng S. marcescens đƣợc tách chiết bằng acetone và ethyl acetate, tinh chế bằng dung môi hữu cơ và sắc ký lớp mỏng TLClà 324 Da [19].” Sắc“tố đỏ từ chủng S. marcescens SU – 10hòa tan trong nƣớc và đƣợcchiết bằng ethanol và HCl (9,5:0,5) hay với acetone và ethyl acetate (1:1). Pg đƣợc tiếp tục tinh sạch bằng dung môi hữu cơ và sắc ký lớp mỏng TLC. Hệ dung môi ethanol: HCl đƣợc cho là có hiệu quả nhất để chiết Pg[6]. Pg đã đƣợc tinh sạch bằng sắc ký silica gel và đƣợc phân tích bằng H - NMR quang phổ.” 1.1.4 Hoạt tính sinh học của prodigiosin 1.1.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Hoạt tính kháng sinh của Pg đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1946.“Pg có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm mà không hề ảnh hƣởng đến tế bào bình thƣờng khác [20, 21]. Năm 1969, Gerber cho rằng Pg không có hoạt tính kháng các vi khuẩn Gram âm nhƣ Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris và vi nấm Candida albicans, Trichoderma koningi, Penicillium notatum [9].Tuy nhiên, sau này Pg đƣợc công bố là có có tác dụng ức chế đối với Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumonia
8 nhƣng hoạt tính kháng vi khuẩn gram dƣơng cao hơn vi khuẩn gram âm [22]. Trong khi tỉ lệ kháng kháng sinh thông thƣờng (aminoglycoside, chloramphenicol, lincosamide, macrolide, quinolone, tetracycline) của Staphylococcus aureus kháng oxacillin ngày càng tăng thì Pg đƣợc chứng minh là có hiệu quả ức chế đối với chủng vi khuẩn gây bệnh này, hơn cả kháng sinh tiêu chuẩn [16]. Do đó, Pg là một sản phẩm tự nhiên có tiềm năng ứng dụng cao trong điều trị nhiễm khuẩn.” Cơ chế kháng khuẩn của Pg đƣợc lý giải bằng khả năng chui qua màng, xâm nhập vào trong tế bào và ức chế các enzyme DNA gygase, topoisomerase I, II và IV, ức chế tổng hợp vật chất di truyền trong tế bào vi khuẩn chủ [9, 23]. 1.1.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Prodigiosin Pg đƣợc biết là gây ra apoptosis trong một loạt các dòng tế bào ung thƣ.“Pg đã đƣợc thử nghiệm chống lại hơn 60 dòng tế bào ung thƣ với giá trị IC50 trung bình là 2,1 μM. Chúng kích hoạt apoptosis trong các loại tế bào ác tính khác nhau nhƣng có độc tính thấp trên các tế bào bình thƣờng[24]. Pggây ratự thực bào mạnh mẽ trong các dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời bao gồm ung thƣ bạch cầu, ung thƣ máu, ung thƣ vú, ung thƣ đại trực tràng và ung thƣdạ dày[25].Pg có thể ức chế tín hiệu Wnt/β-cateninvà kích hoạt hoạt động chống ung thƣ trong tế bào ung thƣ vú và có thể kích hoạt lại hoạt động phiên mã phụ thuộc họ p53 trong các tế bào ung thƣ ruột kết thiếu p53[14, 26].” Khả năng“kháng ung thƣ của Pg đƣợc nghiên cứu trên tế bào ung thƣ cổ tử cung bằng phân tích 3 – (4 ,5 – dimethyl – 2 – thiazolyl) – 2,5 – diphenyl – 2H – tetrazolium bromide (MTT) và neutral red uptake (NRU) cho thấy hàmlƣợng Pg càng tăng thì càng làm giảm tỷ lệ phát triển của dòng tế bào HeLa – 299.Kết quả này cho thấy Pg có hoạt tính kháng ung thƣ biểu mô cổ tử cung ở ngƣời [27].” Yongze Liu“và cộng sự đã tiến hành điều trị tế bào ung thƣ biểu mô vòm họng ở ngƣời bằng Pg, kết quả cho thấy prodigiosin có thể ức chế sự tăng sinh, di cƣ và xâm lấn của các tế bào ung thƣ biểu mô vòm họng [23].Pg cũng đã đƣợc xác định là một chất gây cảm ứng tự thực bào trong các tế bào
9 ung thƣ biểu mô khoang miệng [25]. Năm 2010, Kavitha và cộng sự đã công bố Pg có hoạt tính chống ung thƣ và hoạt tính tự chết mạnh đối với các tế bào ung thƣ biểu mô cổ tử cung HeLa – 299[28]. Pg tách chiết từ chủng S. marcescens SER1 có khả năng ức chế tế bào ung thƣ kháng thuốc nhƣ MDR1, BCRP và MRP2[29].” Cơ chế gây apoptosis của Pg hiện nay vẫn đang đƣợc làm sáng tỏ. Trong mô hình in vivo Pg đã đƣợc chứng minh nhắm đích các tế bào ung thƣ một cách độc lập với p53 trong khi p53ít hoặc không có tác dụng đối với tế bào bình thƣờng. Ngoài ra, Pg có tác dụng ở các tế bào ung thƣ với kiểu hình đa kháng thuốc và các khiếm khuyết trong con đƣờng tự chết tế bào [30]. Pg liên kết với miền BH3 trong một số họ protein BCL – 2đóng vai trò quan trọng trong việc tự chết tế bào.“Đặc biệt, kết quả của Hosseini và cộng sự năm 2013 cho thấy Pg có một ái lực lớn đối với MCL – 1, một thành phần chống sự tự chết của họ protein BCL – 2. Trong các tế bào khối u ác tính, các tác giả chứng minh rằng Pg kích hoạt con đƣờng tự chết ty thể bằng cách phá vỡ phức hợp MCL – 1/BAK [31].” Pg“từ chủng S. marcescens B – 1231 ức chế miễn dịch qua trung gian tế bào lympho T nhƣ concanavalin – A, gây tăng sinh tế bào, đáp ứng tế bào lympho hỗn hợp, gây ra đáp ứng kháng thể phụ thuộc T ở các nồng độ không độc.Tuy nhiên, Pg không ảnh hƣởng đến chức năng miễn dịch qua trung gian tế bào lympho B nhƣ tăng sinh tế bào và sản xuất kháng thể đa dòng ở các nồng độ tƣơng tự. Prodiogiosin không gây chết đối với tế bào lympho trong ống nghiệm ở nồng độ 10 và 30 mg/kg thể trọngvà cũng không cho thấy độc tính với cơ quan bạch huyết trong cơ thể ở liều lƣợng trên[32].” Những tác động của dịch nuôi chứa Pg từ chủng S. marcescens 2170 (CS – 2170) đến sự sống sót của các dòng tế bào ung thƣ máu khác nhau (Jurkat, NSO, Hl-60 và Ramos) và các dòng lành tính (NIH 3T3 và MDCK) đã đƣợc nghiên cứu.“Sử dụng thử nghiệm MTT cho thấy có sự giảm nhanh chóng (4 giờ) về số lƣợng các tế bào sống. Kết luận từ mô hình phân mảnh DNA, nhuộm Hoechst và phân tích sự biểu hiện phosphatidylbởi FACS cho thấy hiệu ứng độc tế bào này là do quá trình tự chết. Sự tự chết này bị chặn lại
10 khi sử dụng chất ức chế capase Z – VAD cho thấy có sự tham gia của capase. Sự tham gia của Pg trong quá trình tự chết này còn đƣợc tác giả chứng minh bằng thí nghiệm sử dụng chủng đột biến S. marcescens (OF, WF và 933) không sinh tổng hợp Pg qua phân tích quang phổ của Pg phân lập từ S. marcescens. Những kết quả này chỉ ra rằng Pg là một thể ức chế miễn dịch, gây ra tự chết trong tế bào ung thƣ tạo máu và không có độc tính đáng kể đối với tế bào lành tính. Do đó Pg có khả năng sử dụng để điều trị ung thƣ[33].” Pg đã đƣợc chứng minh là gây ra các stress trong tế bào nhƣ tổn thƣơng DNA bằng cách ức chế topoisomerase I và II, thay đổi pH nội bào bằng điều chỉnh nồng độ H+/ Cl-, ức chế chu kỳ tế bào bằng cách điều chỉnh lại p21WAF/CIP1và stress lƣới nội chất[22], tất cả điều này có thể dẫn tới apoptosis. Sam M.R. và Pourpak R.S.cho rằng cơ chế làm chết tế bào ung thƣ của Pgbao gồm: cảm ứng phụ thuộc caspase, kích hoạt các con đƣờng protein kinase và khởi phát chu kỳ tế bào. Prodigiosin có nguồn gốc từ Serratia marcescens có thể làm tăng nồng độ caspase – 3trong các tế bào ung thƣ bạch cầu cấp tính.Ở tế bào ung thƣ gan HepG2, nồng độ caspase – 3có thể tăng đến 330% sau 48 giờ xử lý với Pg [14, 34].Shu –YuCheng và cộng sự đã tiến hành điều tra cơ chế gây chết tế bào của Pg trong u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma multiforme), kết quả cho thấy rõ ràng Pg làm giảm đáng kể khả năng sống sót của tế bào và khả năng hình thành tế bào thần kinh của các dòng tế bào glioblastoma ở ngƣời U87MG và GBM8401.Hơn nữa, Pg với tín hiệu huỳnh quang đã đƣợc phát hiện trong mạng lƣới nội chất và đƣợc tìm thấy để gây ra stress quá mức. Những phát hiện này đã đƣợc xác nhận bằng cách quan sát sự hình thành punctaLC3 và nhuộm màu cam acridine. Pg gây ra cái chết tế bào bằng cách kích hoạt con đƣờng JNK và giảm con đƣờng AKT/mTOR trong các tế bào glioblastoma [22]. 1.1.5 Ứng dụng của prodigiosin 1.1.5.1 Ứng dụng của prodigiosin trong công nghệ thực phẩm Ngày nay, nhu cầu về chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên ngày càng cao. Với ƣu điểm về tốc độ sinh trƣởng nhanh, thời gian thế hệ ngắn, vi sinh vật là một trong các nguồn sản suất sắc tố nhanh và hiệu quả nhất. Trong