Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương ở các vùng núi đá vôi và khai thác khoáng sản tại Thái Nguyên

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương; nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương ở các vùng núi đá vôi và khai thác khoáng sản tại Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ THỊ HIỀN TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH ỨC CHẾ VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Ở CÁC VÙNG NÚI ĐÁ VÔI VÀ KHAI THÁC KHOÁNG SẢN TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái nguyên 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ THỊ HIỀN TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH ỨC CHẾ VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Ở CÁC VÙNG NÚI ĐÁ VÔI VÀ KHAI THÁC KHOÁNG SẢN TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS. Nguyễn Xuân Vũ 2.TS. Nguyễn Mạnh Tuấn Thái Nguyên 2019
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai công bố trước đây. Thái Nguyên, tháng 3 năm 2019 Tác giả Đỗ Thị Hiền
ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông lâm- Đại học Thái Nguyên. Để hoàn thành được luận văn này em đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể. Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Xuân Vũ và TS. Nguyễn Mạnh Tuấn, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn em rất tận tình trong quá trình thực hiện đề tài, giúp em vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Đỗ Bích Duệ cán bộ tại bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Trần Văn Phùng - Viện trưởng Viện Khoa học Sự sống cùng các cán bộ nghiên cứu của viện đã tạo điều kiện cho em được thực tập và hoàn thành đề tài này. Em xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, trang bị kiến thức và tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập. Cuối cùng em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn!
iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN VSV : Vi sinh vật CKS : Chất kháng sinh KTCC : Khuẩn ti cơ chất KTKS : Khuẩn ty khí sinh MT : Môi trường DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid ISP : International Streptomyces Project TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) MRSA : Staphylococcus aureus kháng methicillin
iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn ................. 25 Bảng 3.2. Đặc điểm nuôi cấy của chủng P5-1 trên các loại môi trường nuôi cấy ở 28oC sau 21 ngày .....................................................................................29 Bảng 3.3. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn ......................31 Bảng 3.4. Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở nồng độ muối khác nhau .............33 Bảng 3.5. Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn P5-1 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau .................................................................................................33 Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở các điều kiện pH khác nhau.................... 34 Bảng 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng P5-1 trên các môi trường lên men khác nhau ..........................................................................................................35 Bảng 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 theo thời gian lên men .....................37 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra giá trị MIC ....................................................................38 Bảng 3.10. Kết quả Search Blast các trình tự tương đồng gen 16S- rRNA của chủng P5-1 trên GenBank. .................................................................................41
v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Các dạng khuẩn lạc xạ khuẩn . ....................................................................5 Hình 3.1. Số lượng các chủng xạ khuẩn phân lập ức chế sinh trưởng các chủng vi khuẩn kiểm định ......................................................................................27 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập sử dụng phương pháp cấy chấm điểm. ........................................................................................28 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của chủng P5-1 trên các môi trường .........................30 Hình 3.4 Xạ khuẩn sinh trưởng trên môi trường bổ sung các nguồn cacbon. ..........32 Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn P5-1 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau .................................................................................................34 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng P5-1 trên các môi trường lên men khác nhau ..........................................................................................................36 Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn chủng P5-1 trong môi trường Gause I theo thời gian lên men. ............................................................................................37 Hình 3.8. Kháng sinh thô thu được từ dịch lên men chủng P5-1. .............................38 Hình 3.9. Kết quả MIC chủng P5-1 với các chủng vi khuẩn kiểm định. ..................39 Hình 3.10. Kết quả điện di DNA tổng số của chủng xạ khuẩn P5-1 trên gel agarose 1% ............................................................................................................40 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen mã hóa 16S- rRNA chủng P5-1 trên gel agarose 1% ..............................................................40 Hình 3.12. Cây phân loại của chủng P5-1 và một số chủng xạ khuẩn......................42
vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ..................................................................................... v MỤC LỤC .................................................................................................................. vi MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 2 3. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................. 3 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. ................................................................... 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4 1.1 Tổng quan về xạ khuẩn ......................................................................................... 4 1.1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn ....................................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ...................................................................... 5 1.2. Phân loại xạ khuẩn ............................................................................................... 7 1.2.1. Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy ................................... 7 1.2.2. Phân loại theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa. ........................................................ 8 1.2.3. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp phân tích tự gene 16S-rRNA .............. 8 1.3. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn ...................................................... 9 1.3.1. Khái niệm về chất kháng sinh ........................................................................... 9 1.3.2. Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn....................................................... 10 1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh. .............................................. 13 1.4.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh trên thế giới ........................ 13 1.4.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh trong nước .......................... 14 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 16 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................... 16 2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 16
vii 2.3. Vật liệu ............................................................................................................... 16 2.3.1. Nguồn xạ khuẩn .............................................................................................. 16 2.3.2. Vi sinh vật kiểm định ...................................................................................... 16 2.3.3. Môi trường phân lập và nuôi cấy .................................................................... 17 2.3.4. Hóa chất và thiết bị ......................................................................................... 18 2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 18 2.4.1. Phân lập và nuôi cấy xạ khuẩn . ...................................................................... 18 2.4.2. Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ................................................. 19 2.4.3. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn ............................. 19 2.4.4. Lựa chọn môi trường lên men tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh cho chủng xạ khuẩn nghiên cứu. ................................................................................................ 20 2.4.5. Phương pháp lên men, tách kháng sinh thô cho chủng xạ khuẩn nghiên cứu. ............................................................................................................................ 21 2.4.6. Phương pháp xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sinh trưởng vi khuẩn kiểm định (MIC90) .......................................................................................... 21 2.4.7. Phương pháp định danh và phân loại chủng loại ............................................ 22 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 25 3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ mẫu đất .... 25 3.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn P5-1. .................... 28 3.2.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn P5-1. ................ 28 3.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh lí - sinh hóa .............................................. 31 3.3. Kết quả nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp kháng sinh cho chủng P5-1 ....................................................................................... 35 3.3.1. Kết quả lựa chọn môi trường lên men thích hợp. ........................................... 35 3.3.2. Kết quả xác định thời gian lên men tối ưu. ..................................................... 36 3.4. Kết quả đánh giá nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế 90% vi khuẩn kiểm định (MIC90) ...................................................................................................................... 38 3.5 Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn P5-1 bằng phương pháp sinh học phân tử. ....... 39 3.5.1. Kết quả tách DNA tổng số .............................................................................. 39 3.5.2. Kết quả nhân gene mã hóa 16S-rRNA bằng phản ứng PCR .......................... 40
viii 3.5.3. Kết quả giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA ................................................. 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 43 1. KẾT LUẬN ........................................................................................................... 43 2. ĐỀ NGHỊ .............................................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44 PHỤ LỤC
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Chất kháng sinh (Antibiotic) là những chất được chiết xuất từ các vi sinh vật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Chất kháng sinh (CKS) là một nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại. Nhờ chất kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các bệnh nhiễm trùng. CKS có hoạt tính kháng lại các vi sinh vật (VSV) gây bệnh như: vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh cho thực vật và động vật. Ngoài ra, CKS còn đóng vai trò rất quan trọng trong một số lĩnh vực khác như chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, và đặc biệt là trong bảo vệ thực vật. Các VSV mẫn cảm với CKS ở những mức độ khác nhau, đa số các vi khuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn gram âm. Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ sinh học cũng được coi là một trong những ngành hàng đầu thế giới. Trong đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh sản xuất kháng sinh phục vụ đời sống con người đang có những phát triển vượt bậc. Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình. Cho đến nay đã phát hiện được khoảng 17.000 chất kháng sinh có nguồn gốc từ VSV và khoảng 30.000 chất kháng sinh bán tổng hợp, nhưng chỉ có 1-2% chất kháng sinh trong tổng số này là có đủ tiêu chuẩn sử dụng trong y học. Trong số các VSV có khả năng sinh chất kháng sinh thì xạ khuẩn là nhóm có tiềm năng lớn chiếm tới 80% số chất kháng sinh đã được mô tả [3]. Ngày nay, với sự xuất hiện của các VSV kháng kháng sinh, chúng là nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp của hàng loạt các bệnh nhiễm khuẩn như viêm phổi, viêm phế quản, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết, nhiễm khuẩn vết mổ... Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các kháng sinh mới, cùng với tình trạng sử dụng kháng sinh tự do làm cho chúng ta đang phải đối mặt với hiện tượng "kháng kháng sinh''. Sự xuất hiện các vi khuẩn đa kháng thuốc (MDR) như Staphylococcus aureus, Enterococcus... tạo thành một vấn đề nghiêm trọng trong môi trường bệnh viện, đòi hỏi phải có kháng sinh mới với hoạt
2 động phổ rộng [28]. Các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do vi khuẩn đã trở nên kháng thuốc kháng sinh thông thường và trở thành một vấn đề lớn trên toàn cầu trong thế kỷ 21 [20]. Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là tác nhân gây bệnh cho một loạt các bệnh nhiễm trùng như nhọt, viêm phổi, viêm tủy xương, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn huyết,...và đã phát triển đề kháng với phần lớn các kháng sinh thông thường [29]. Vào năm 2001, theo Tổ chức y tế thế giới (WHO), việc kê đơn và lạm dụng kháng sinh quá mức đã dẫn đến sự kháng thuốc của nhiều mầm bệnh [43]. Ngày nay, các chủng kháng thuốc mới xuất hiện nhanh hơn, trong khi tốc độ phát hiện ra kháng sinh mới đã giảm đáng kể. Hiện nay, nhiều nhà khoa học đang nghiên cứu các loại thuốc mới ức chế sinh trưởng các chủng vi khuẩn gây bệnh, chủ yếu có nguồn gốc xạ khuẩn [43,33]. Streptomyces là một nguồn tiềm năng thuộc nhóm xạ khuẩn, sản sinh đa dạng các loại kháng sinh khác nhau, với hơn 80% kháng sinh được biết trên thị trường có nguồn gốc từ chi Streptomyces [27]. Xạ khuẩn phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác.. các yếu tố như: độ ẩm, thành phần của đất, mức độ canh tác, thảm thực vật, độ pH môi trường...ảnh hưởng đến hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn. Thái nguyên là một tỉnh có các vùng đất khai thác khoáng sản, vùng núi đá vôi tập chung nhiều loại VSV, trong đó có xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh. Ngoài ra các hoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trường đất, nước và qua đó có thể sẽ ảnh hưởng đến hệ VSV đất ở những khu vực này mà hiện vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương ở các vùng núi đá vôi và khai thác khoáng sản tại Thái Nguyên". 2. Mục tiêu nghiên cứu * Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương. * Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng.
3 3. Đối tượng nghiên cứu Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương được phân lập từ mẫu đất ở một số vùng trong tỉnh Thái Nguyên. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. Phát hiện các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế vi khuẩn gram dương góp phần làm rõ hơn vai trò quan trọng của xạ khuẩn trong việc sinh kháng sinh, định hướng tiếp tục nghiên cứu tìm ra các loại kháng sinh mới; trên cơ sở tạo ra các CKS mới giúp phục vụ cho nghiên cứu và chữa bệnh góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về xạ khuẩn 1.1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các VSV khác không sinh trưởng được. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN cao hơn 55% . Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn [26]. Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Theo Waksman, trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [42]. Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất. Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ ẩm, thành phần của đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Ngoài ra sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính, kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8- 7,5. Xạ khuẩn thường tập chung ở những nơi đất giàu hữu cơ, khoáng và lớp bề mặt có nhiều mùn. Chúng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ 28- 30oC, độ ẩm khoảng 40-55%. Những nơi có nồng độ pH kiềm, axit thường ít xạ khuẩn, đặc biệt nơi đất quá kiềm lại càng ít xạ khuẩn. Tuy nhiên nhiều loài xạ khuẩn đã được phân lập ở các môi trường khắc nghiệt như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh được phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0 0C [22] và Nocardiopis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH 9,5- 10 [31]. Một trong những đặc tính quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60-70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS. Cho tới nay khoảng hơn 8000 CKS hiện biết trên thế giới thì có 80% là do xạ khuẩn sinh ra [3].
5 Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều CKS có giá trị dùng trong y học như: getamixin, vacomixin.. Ngoài ra, xạ khuẩn còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như: proteaza, amylaza, xenluloza, một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người và động vật [6]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn * Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Ở trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh, đường kính khuẩn lạc trung bình 0,5-2 mm. Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Do đó mới có tên gọi là xạ khuẩn (Actinomycetes, tiếng Hy Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”). Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, nâu, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng, màu sắc của khuẩn lạc là một trong những đặc điểm phân loại quan trọng [1]. Hình 1.1. Các dạng khuẩn lạc xạ khuẩn [5]. (http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm) Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc, kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý, nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc
6 vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính lớn, dễ quan sát bằng mắt thường. Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn sinh trưởng thành 2 hướng tạo thành khuẩn ti cơ chất (substrate mycelium) và khuẩn ti khí sinh (aerial mycelium). Khuẩn ti cơ chất (KTCC) sinh trưởng cắm sâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn. Đường kính KTCC thay đổi từ 0,2m-0,3m, khuẩn ti không có vách ngăn và không bị đứt đoạn. Tùy vào loại môi trường mà KTCC có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước, có sắc tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ. KTCC sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh (KTKS). KTKS có chức năng chính là sinh sản. * Đặc điểm cấu tạo của xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 - 120A0, khi già có thể đạt tới 150 - 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit. Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào. Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính : Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
7 Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic (m - ADP) và glyxin. Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic. Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic, arabinose và galactose. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol). Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45% [8]. Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [2]. Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.1.2. Phân loại xạ khuẩn 1.2.1. Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Dựa theo cách phân loại này các chủng xạ khuẩn thường được nuôi
8 trên các môi trường dinh dưỡng trong điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp, sau đó quan sát các đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn như hình dạng, màu sắc của bào tử, khả năng sinh sắc tố, sinh melanin...đồng thời ghi chép kết quả và chụp mẫu. Trước kia, nhiều loại xạ khuẩn được phân chia tùy theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như màu của khuẩn ti cơ chất (KTCC), khuẩn ti khí sinh (KTKS), sắc tố tan; sự có mặt của KTCC, hình dạng và kết cấu mặt bào tử; đặc điểm cuống sinh bào tử và sự phân đốt của khuẩn ti. Tuy nhiên, do xạ khuẩn không bền vững về mặt di truyền, trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về mặt hình thái hoặc có những loài khác nhau lại có thể giống nhau về mặt hình thái. Do đó để phân loại chính xác hơn, bổ sung cho việc nghiên cứu phân loại, người ta sử dụng thêm các phương pháp phân loại bằng sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử [15,42]. 1.2.2. Phân loại theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Khi phân loại xạ khuẩn người ta thường sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng. Ngoài ra còn các chỉ tiêu khác cũng được xác định như pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối, tính chất đối kháng và mẫn cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất khác đặc trưng của xạ khuẩn. Tuy nhiên, do xạ khuẩn thường xuất hiện nhiều biến dị nên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường có giá trị thấp về mặt phân loại. 1.2.3. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp phân tích tự gene 16S-rRNA Tất cả các loài VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ các ribosome. Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hoá rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng.. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 phương pháp chính đó là lai giữa DNA- DNA, lai giữa RNA- RNA và phân tích trình tự gene mã hóa 16S-rRNA. Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rRNA có mặt trong tất cả các
9 sinh vật, thực hiện cùng một chức năng là cấu thành nên ribosome, bộ máy tổng hợp protein của tế bào. Có kích thước vừa phải (1500 bp) để tiến hành các nghiên cứu phả hệ. Là một trong những cao phân tử xuất hiện sớm nhất trong lịch sử tiến hóa. Cấu trúc của rRNA thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói cách khác các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá. Mặc dù mang tính bảo thủ cao, các gen mã hóa cho rRNA cũng chứa những vùng có mức độ bảo thủ thấp hơn, dễ có sự sai khác giữa các loài sinh vật khác nhau. Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho rRNA, các nhà khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, bao gồm cả các vùng biến đổi. So sánh sự khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi. Trong các loại rRNA, thì 16S-rRNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn, vì gene mã hóa 16S-rRNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho các nghiên cứu phân loại, gene mã hóa 5S-rRNA có kích thước khoảng 120 bp, dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại, gene mã hóa 23S- rRNA cũng là một gene tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gene này tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn [30]. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S-rRNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S-rRNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [34]. 1.3. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn 1.3.1. Khái niệm về chất kháng sinh Chất kháng sinh (Antibiotic) là những chất được chiết xuất từ các vi sinh vật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. CKS là một chất hóa học có hoạt tính kháng lại các VSV như: vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh ở
10 động vật và thực vật. Các VSV mẫn cảm với CKS ở những mức độ khác nhau, đa số các vi khuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn gram âm. 1.3.2. Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.3.2.1. Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS. Cho tới nay khoảng hơn 8000 CKS hiện biết trên thế giới thì có 80% là do xạ khuẩn sinh ra [3]. Trong quá trình tiến hóa, tính đối kháng là cơ chế bảo vệ trong đấu tranh sinh tồn của loài. Riêng đối với xạ khuẩn tính đối kháng thể hiện khá rõ rệt. Đa số các CKS có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng rộng, kìm hãm và ức chế được nhiều loại VSV khác nhau. Xạ khuẩn thường tạo ra các sản phẩm trao đổi chất của mình để ức chế hoặc tạo điều kiện không thuận lợi cho sự sinh trưởng của VSV khác. Thông thường các CKS có thể hình thành theo các cơ chế sau: CKS được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như CKS cloramphenicol, các CKS thuộc nhóm nucleozit). CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau (như các CKS lincomicin, novobiocin). Đối với kháng sinh được tạo ra bằng con đường polime hóa bao gồm: + Các chất là dẫn xuất của polipeptid, được tạo thành bằng cách trùng hợp các axit amin: bacitracin, polymycin. Mạch polipeptid được tạo thành có thể được biến đổi trong các phản ứng tiếp theo. + Các chất được tạo thành từ đơn vị acetat và propionat thì theo con đường tổng hợp axit béo: CKS nhóm macrolit, tetracilin, rifamicin. + CKS được hình thành theo con đường tổng hợp các hợp chất izopreonit từ các đơn vị acetat… + Đối với các chất aminoglucozid thì tạo thành bằng con đường trùng hợp các phân tử đường, axit amin và các rượu amin mạch vòng. Có rất nhiều CKS hiện nay đang sử dụng được sinh ra bởi xạ khuẩn như: