Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Chiết tách và phân tích định lượng một số lignan từ loài dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:91

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung của Luận văn nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hàm lượng hoạt chất của các loài thuộc chi Balanophora ở nước ta nói chung và loài B. fungosa subsp. indica nói riêng mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn; vừa tạo cơ sở giải thích công dụng dân gian của loài này vừa tạo cơ sở để đánh giá hiệu quả kinh tế của nó. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Chiết tách và phân tích định lượng một số lignan từ loài dó đất (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ HOÀNG QUYÊN CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TỪ LOÀI DÓ ĐẤT (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ HOÀNG QUYÊN CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TỪ LOÀI DÓ ĐẤT (Balanophora fungosa subsp. indica (Arn.) B. Hansen) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Bùi Hữu Tài THÁI NGUYÊN - 2017
LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Bùi Hữu Tài - Viện Hóa sinh Biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tin tưởng giao đề tài, định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn thạc sĩ này. Em xin chân thành cảm ơn tới TS. Dương Nghĩa Bang, TS. Phạm Thế Chính cùng các thầy cô khoa Hóa học, Trường Đại Học Khoa Học - Đại Học Thái Nguyên đã tạo điều kiện , giúp đỡ em trong quá trình triển khai nghiên cứu thực hiện đề tài. Em xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các thầy, cô, cán bộ kĩ thuật viên Viện Hóa sinh Biển - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn em trong quá trình học tập, thực nghiệm và thực hiện đề tài. Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè lớp Cao học Khoá 2015 - 2017 đã giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Tác giả luận văn Trần Thị Hoàng Quyên a
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .....................................................................................................a MỤC LỤC .......................................................................................................... b DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... d DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... f DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... g ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 2 1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora và loài B. fungosa subsp indica ....... 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora ....................................................... 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật loài B. fungosa subsp indica ..................................... 3 1.2. Một số nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học chi Balanophora......... 5 1.3. Phương pháp sắc ký trong phân tích, phân lập các hợp chất hữu cơ ....... 10 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng.................................................................................... 11 1.3.2. Sắc ký cột .............................................................................................. 12 1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao..................................................................... 13 1.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ .......... 15 1.4.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ......... 16 1.4.1. Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ........... 17 Chương 2. THỰC NGHIỆM ........................................................................... 19 2.1. Nguyên liệu, hóa chất............................................................................... 19 2.2. Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu ................................................. 19 2.2.1. Phương pháp và thiết bị nghiên cứu chiết xuất và phân lập các hợp chất ..... 19 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập.......... 20 2.2.3. Thiết bị phân tích hàm lượng của hợp chất trong mẫu dược liệu ......... 20 2.3. Thu thập và xử lý mẫu loài B. fungosa subsp. indica .............................. 21 2.4. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất lignan từ loài B. fungosa subsp indica............................................................................................. 21 b
2.6. Phân tích hàm lượng một số chất phân lập trong mẫu thực vật khô ........ 23 2.6.1. Chuẩn bị mẫu .................................................................................................. 23 2.6.2. Khảo sát điều kiện phân tích ........................................................................... 23 2.6.3. Xây dựng đường chuẩn và định lượng hợp chất trong dịch chiết tổng........... 23 2.6.4. Xử lý số liệu .................................................................................................... 24 Chương 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................... 25 3.1. Mẫu thực vật............................................................................................. 25 3.2. Thông số vật lí của một số hợp chất phân lập được từ loài B. Fungosa subsp indica.............................................................................. 26 3.3. Biện giải cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ loài B. fungosa subsp. indica .............................................................................. 27 3.4. Phân tích hàm lượng một số hợp chất lignan trong loài B. fungosa subsp. indica............................................................................................ 44 KẾT LUẬN...................................................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 52 PHỤ LỤC ............................................................................................................ c
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora ................................... 3 Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica ............................ 4 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất BF1-BF4 từ loài B. fungosa subsp. indica ............................................................................... 22 Hình 3.1. Một số hình ảnh mẫu thu thập về loài B. fungosa subsp. indica .... 25 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF1 .... 27 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1 ..................................................... 29 Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 .................................................... 29 Hình 3.5. Phổ DEPT-135 của hợp chất BF1................................................... 30 Hình 3.6. Phổ HSQC của hợp chất BF1 ......................................................... 30 Hình 3.7. Phổ HMBC của hợp chất BF1 ........................................................ 31 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF2 .... 31 Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2...................................................... 33 Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2 .................................................. 33 Hình 3.11. Phổ HMQC của hợp chất BF2 ...................................................... 34 Hình 3.12. Phổ HMBC của hợp chất BF2 ...................................................... 34 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF3 .... 35 Hình 3.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3 ................................................... 38 Hình 3.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 .................................................. 38 Hình 3.16. Phổ HSQC của hợp chất BF3 ....................................................... 39 Hình 3.17. Phổ HMBC của hợp chất BF3 ...................................................... 39 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF4 .... 40 Hình 3.19. Phổ 1H-NMR của hợp chất BF4 ................................................... 42 Hình 3.20. Phổ 13C-NMR của hợp chất BF4 .................................................. 42 Hình 3.21. Phổ HSQC của hợp chất BF4 ....................................................... 43 d
Hình 3.22. Phổ HMBC của hợp chất BF4 ...................................................... 43 Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất lignan (BF1-BF4) từ loài B. fungosa subsp. indica ...................................................... 44 Hình 3.24. Phổ UV của các chất BF1 và BF3 ................................................ 45 Hình 3.25. Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết methanol loài B. fungosa subsp. indica ở điều kiện lựa chọn phân tích.............................. 45 Hình 3.26. Đường chuẩn định lượng của hợp chất BF1 ................................. 46 Hình 3.27. Đường chuẩn định lượng của hợp chất BF3 ................................. 49 e
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF1 và hợp chất tham khảo ......... 28 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF2 và hợp chất tham khảo BF1 ........ 32 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo ......... 37 Bảng 3.5. Phân tích HPLC của hợp chất BF1 ở các nồng độ khác nhau ....... 46 Bảng 3.6. Xác định giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) hợp chất BF1 .......................................................... 47 Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của phép phân tích hợp chất BF1 ............ 47 Bảng 3.8. Hàm lượng hợp chất BF1 trong dịch chiết methanol mẫu B. fungosa subsp. indica .................................................................... 48 Bảng 3.9. Phân tích HPLC của hợp chất BF3 ở các nồng độ khác nhau ....... 48 Bảng 3.10. Xác định giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) hợp chất BF3 .......................................................... 49 Bảng 3.11. Độ lặp lại và độ thu hồi của phép phân tích hợp chất BF3 .......... 49 Bảng 3.12. Hàm lượng hợp chất BF3 trong dịch chiết methanol mẫu B. fungosa subsp. indica .................................................................... 50 f
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ (Tiếng Anh) Viết đầy đủ (Tiếng Việt) 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Cô ̣ng hưởng từ ha ̣t nhân cacbon Resonance 13 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Cô ̣ng hưởng từ ha ̣t nhân proton Resonance CC Column chromatography Sắc kí cột DEPT Distortionless Enhancement Distortionless Enhancement by by Polarisation Transfer Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ESI-MS Electrospray Ionization Mass Phổ khố i lượng ion hóa phun Spectrometry mù điê ̣n EtOAc Ethyl acetate Etyl axetat HMBC Heteronuclear mutiple Bond Tương tác di ̣ha ̣t nhân qua Connectivity nhiề u liên kế t HPLC High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography HR-ESI- High Resolution Electrospray Phổ khối lượng phân giải cao MS Ionization Mass Spectrometry ion hóa phun mù điện HSQC Heteronuclear Single- Tương tác di ̣ha ̣t nhân qua 1 Quantum Coherence liên kế t LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng RP-18 Reserve phase C-18 Chất hấp phụ pha đảo C-18 TLC Thin layer chromatography Sắ c ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane Tetramethylsilane g
ĐẶT VẤN ĐỀ Cây thuốc và động vật làm thuốc đã và đang được nhiều dân tộc trên thế giới sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh khác nhau. Theo thống kê sơ bộ, ở một số nước châu Á và châu Phi, có tới 80 % dân số phụ thuộc vào y học cổ truyền trong việc chăm sóc sức khỏe cơ bản. Ở nhiều nước phát triển, từ 70 % đến 80 % dân số đã sử dụng các cây thuốc hoặc chế phẩm của nó. Các cây thuốc sử dụng trong dân gian đã dần được chứng minh bởi các nghiên cứu khoa học. Nó là một trong những cơ sở ban đầu của quá trình nghiên cứu phát triển thuốc và đã tạo ra nhiều loại thuốc Tây. Trong vài thập kỉ qua, dựa trên các bài thuốc dân gian, các dược liệu cổ truyền đóng vai trò là nguồn nguyên liệu cung cấp cho thuốc Tây với hơn 40% tổng các loại thuốc. Hơn nữa việc nghiên cứu hóa học của các loài cây thuốc có ý nghĩa vô cùng quan trọng nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất, lý giải công dụng ngăn ngừa bệnh đã được sử dụng trong các bài thuốc dân tộc, và phát hiện các hợp chất thể hiện hoạt tính giúp định hướng trong bào chế và phát hiện các thuốc mới. Bên cạnh đó, đánh giá hàm lượng hoạt chất trong dược liệu cũng là một yêu cầu quan trọng nhằm nâng cao giá trị sử dụng và hiệu quả kinh tế của dược liệu. Các dược liệu thuộc chi Balanophora (Dó đất) thường được biết đến với tên gọi ‘Tỏa dương’ hay ‘nấm ngọc cẩu’. Theo kinh nghiệm dân gian, công dụng của các loài thuộc chi Balanophora chủ yế là bổ dương, kích thích ăn ngon miệng, phục hồi sức khỏe nhanh …. Một số loài bị săn tìm ráo riết để phục vụ cho những bài thuốc tăng cường sinh lực nên có thể dẫn đến nguy cơ cạn kiệt, một số loài nằm trong sách đỏ của Việt Nam. Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hàm lượng hoạt chất của các loài thuộc chi Balanophora ở nước ta nói chung và loài B. fungosa subsp. indica nói riêng mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn; vừa tạo cơ sở giải thích công dụng dân gian của loài này vừa tạo cơ sở để đánh giá hiệu quả kinh tế của nó. 1
Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora và loài B. fungosa subsp indica 1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Balanophora Chi Balanophora ở nước ta còn được gọi là chi Dó đất. Theo khóa phân loại thực vật, chi Balanophora có vị trí phân loại như sau : + Ngành: Mộc lan - Magnoliophyta + Lớp : Hai lá mầm - Magnoliopsida + Bộ : Đàn hương - Santalales + Họ : Dó đất, Dương đài - Balanophoraceae + Chi : Dó đất - Balanophora Các loài thuộc chi Balanophora thuộc loại thực vật có hoa đặc biệt, không có diệp lục-sống ký sinh. Các loài này thường sống ký sinh trên rễ của nhiều loài cây gỗ lớn trong rừng ẩm. Chúng có thân thoái hóa thành một “củ” nhỏ có kích thước và hình dạng khác nhau. Thân thường gồm nhiều thùy, sần sùi, màu nâu sẫm, không có lá hay chỉ có lá vẩy, đến khi sinh sản thì cụm hoa của nó mới lộ ra trên mặt đất. Cụm hoa là một bông nạc. Tùy từng loài, cây Dó đất hoặc có hoa đơn tính cùng gốc, hoặc khác gốc. Cụm hoa đực thường dài 10 - 15 cm, gốc trục cụm hoa có một ít lá vẩy. Bao hoa có 4 - 7 thùy, nhị có bao phấn hình móng ngựa. Cụm hoa cái ngắn hơn, có hình thoi hay hình trứng dài 5 - 7 cm, mang rất nhiều hoa cực nhỏ, không có bao hoa. Mùa hoa thường vào tháng 10 đến tháng 2, thụ phấn nhờ côn trùng. Quả nhỏ, khô, dạng bầu dục dài 0,2 - 0,5 mm. Trên thế giới, chi Bananophora đã ghi nhận có khoảng 120 loài, phân bố ở vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới châu Á và châu Úc [1]. Ở Việt Nam, chi Bananophora có khoảng 7 loài, trong đó một số loài gặp phổ biến như B. cucphuongensis, B. fungosa subsp indica, B. latisepala, B. laxiflora, và B. polyandra. Chúng đều là những cây thuốc dân gian ở nước ta. Người dân tộc miền núi thường dùng cụm hoa làm thuốc bổ, có tác dụng mạnh gân cốt, giúp 2
cơ thể cường tráng, chữa đau bụng, nhức mỏi chân tay. Người dân thương dùng dưới dạng thuốc sắc nước hoặc ngâm rượu (thái mỏng, sao qua rồi ngâm rượu) [2]. B. laxiflora B. cucphuongensis B. fungosa subsp indica B. latisepala Balanophora polyandra Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora 1.1.2. Đặc điểm thực vật loài B. fungosa subsp indica Loài B. fungosa subsp. indica ở nước ta có một số tên gọi như Dó đất, Xà cô. Cây mọc trong các rừng thường xanh ở độ cao trải rộng từ 500-2.600 3
m. Loài này sống kí sinh trên rễ của nhiều loại cây thân gỗ, kể cả cả cây gỗ và dây leo trong họ Nho hay nhiều cây họ Đậu. Mọc phổ biến ở các tỉnh vùng tây nguyên nước ta. Loài này có thân thoái hóa thành một củ có nhiều dạng khác nhau, thường gồm nhiều thùy. Củ thường có màu từ vàng cam tới nâu, bề mặt hơi sần. Hoa thuộc loại đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực dài, trục hoa ở gốc có một ít lá (dạng vẩy), bao hoa chứa 4-7 thùy, nhị hoa có 4-7 bao phấn. Cụm hoa cái ngắn, hoa không có bao hoa mà chỉ là những khối hình trứng có chân và kéo dài bằng một sợi mảnh [3]. Hình 1.2. Một số hình ảnh về loài B. fungosa subsp. indica 4
1.2. Một số nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học chi Balanophora Các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Balanophora là các hợp chất dạng lignan hay các hợp chất polyphenol có chứa các nhóm caffeoyl, coumaroyl, galloyl, v/v. Có thể nói, nghiên cứu về thành phần hóa học chi Balanophora bắt đầu vào giữa những năm 50 của thế kỉ 20, khởi đầu với công bố phân lập một số hợp chất triterpen từ loài B. japonica [4]. Sau đó, cũng từ loài B. japonica, Mitsumasa và cộng sự đã thông báo phân lập và xác định được một hợp chất neo-lignan, balanophonin (3), và 10 hợp chất khác (4-13) thuộc lớp chất lignan và dẫn xuất phenolic acid [5]. Nghiên cứu khác về thành phần hóa học loài B. japonica, Jiang và cộng sự người Nhật đã phân lập và xác định cấu trúc của 34 hợp chất phenolic (19-52) có cấu trúc hóa học khá đặc biệt chỉ gồm một đơn vị đường liên kết qua cầu ester với các phenolic acid khác nhau gồm caffeic acid, coumaroic acid, galloic acid và hexahydroxydiphenoic acid [6]. 5
Tuy chưa có các nghiên cứu về phân tích định lượng, các hợp chất 19- 52 đã sơ phân lập được với hiệu suất 0.0012- 0.7069% (các hợp chất 19, 20, 22, 24-27) so với khối lượng mẫu khô từ phần dưới mặt đất và hiệu suất 0.0014-0.2231% (các hợp chất 19-21, 23, 28-52) từ phần trên mặt đất loài B. japonica [6]. Tiếp đó, Jiang và cộng sự tiếp tục công bố ba hợp chất, balanophotannins A-C (53-55), các lignan glycoside (56-59); balanophotannins D-G (60-63) từ loài B. japonica [7, 8]. Các kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đã phát hiện hợp chất balanophotannin E diệt tế bào ung thư gan tốt nhất, với giá trị IC50 là 4.22 µM [8]. 6
Trong thí nghiệm về sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa (theo phương pháp DPPH) của các dịch chiết từ các cây thuốc truyền thống, Wang và cộng sự đã phát hiện dịch chiết 80% acetone từ loài B. polyandra thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do mạnh. Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài này đã phân lập được 2 hợp chất, balapolyphorins A-B (64-65), cùng với 20 hợp chất dạng lignan hoặc phenolic (9, 20, 35, 37, 41, 42, 50-52, 54, 57, 66-74). Các hợp chất này cũng đã được đánh giá hoạt tính DPPH, hầu hết các hợp chất đều thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do với giá trị thu dọn 50% số lượng gốc tự do DPPH (SC50) từ 8.4-68.3 µM [9]. 7
Từ hoa loài Balanophora laxiflora, Ho và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các thành phần chống oxi hóa bằng hệ thống HPLC kết hợp DPPH. Trong số các hợp chất phát hiện được, 5 hợp chất bao gồm: caffeic acid (6), 1-O-(E)- caffeoyl-β-D-glucopyranose (20), 1-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose (19), 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose (46), và 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose (52) được xác định là thành phần chống oxi hóa chính của loài này [10]. Một nghiên cứu khác của She cũng về tác dụng chống oxi hóa đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chất, balaxiflorins A- B (75, 76) cùng 17 hợp chất phenolic khác (6, 20, 35, 37, 41, 48, 49, 52, 58, 68, 70, 71, 74, 77-80) [11]. Các hợp chất phenolic có chứa nhóm galloyl, cafeoyl, và (S)- hexahydroxydiphenoyl (81-89) cũng được phát hiện thấy có trong thành phần hóa học của loài B. tobiracola [12]. 8
Từ loài B. harlandii, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất, 1-O-[(E)-p-coumaroyl]-3-O-galloyl-β-D-glucopyranose (90) và 18 hợp chất (7, 20, 30, 37, 42, 68, 71, 81-83, 86, 87, 91-96). Các hợp chất này đã được đánh giá hoạt tính chống oxi hóa DPPH, kết quả cho thấy một số hợp chất mang khung dihydrochalcone và tannin thể hiện hoạt tính tốt nhất với giá trị SC50 trong khoảng 8.2-16.2 µM [13]. Từ loài B. involucrata, Luo và cộng sự phân lập được ba hợp chất phenolic đã biết (11, 71, 72) [14]. Một nghiên cứu khác về thành phần hóa học loài B. papuana của các nhà khoa học Nhật Bản, Hosoya và cộng sự đã phân lập 9
được 2 hợp chất khác có khung dihydrochalcone, papuabalanols A-B (97, 98). Các hợp chất này đã được đánh giá hoạt tính hạ huyết áp và ức chế enzyme tyrosinase [15]. Kết quả cho thấy, hợp chất 97 (100 µM) phát hiện có tác dụng làm giãn mạch trong khi hợp chất 98 lại có tác dụng ức chế hoạt động của enzym tyrosinase (33-79%) ở các nồng độ thử nghiệm 12.5, 25, và 50 µM. Từ kết quả tổng quan các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các nghiên cứu chủ yếu xuất phát từ các nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản và Trung Quốc. Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Balanophora chủ yếu là các hợp chất dạng ligan hoặc các phenolic có chứa các nhóm galloyl, caffeoyl, và hexahydroxydiphenoyl. Tuy vậy, cho đến nay gần như chưa có nghiên cứu về hóa học loài B. fungosa subsp. indica. 1.3. Phương pháp sắc ký trong phân tích, phân lập các hợp chất hữu cơ Phương pháp sắc ký là một trong những phương pháp phổ biến và hữu hiệu sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Cơ sở của phương pháp sắc ký dựa trên sự khác nhau về bản chất hấp phụ và phân bố của các chất giữa hai pha: pha tĩnh và pha động. Tùy theo bản chất của pha tĩnh hoặc pha động hay dựa trên cách thức triển khai sắc ký mà người ta phân loại thành các phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký điện di, sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký cột trọng lực, sắc ký cột trung áp, sắc ký cột cao áp.... Tùy theo mục đích nghiên cứu và đối tượng cần phân lập 10
người ta lựa chọn những phương pháp sắc ký phù hợp. Thông thường để phân lập một hợp chất cần có sự kết hợp của các phương pháp sắc ký khác nhau và thường thấy là sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột trọng lực. Trong khi đó, để phân tích định tính hay định lượng của một hợp chất trong thuốc, dược liệu thì cần đến phương pháp sắc ký hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), HPLC gắn khối phổ. 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (SKLM) hay còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ của chất phân tích lên chất hấp phụ. SKLM thường được sử dụng trong phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký cột. Trong SKLM pha động sử dụng là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ (thường gặp là: silica gel hay nhôm oxit). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kính hay tấm nhôm. Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng và tấm kính/nhôm tráng chất hấp phụ gọi là bản mỏng. Chất phân tích được hòa tan trong dung môi dễ bay hơi và đưa lên bản mỏng thành một điểm gọn nhờ một mao quản (capillary) và sấy đuổi dung môi. Tùy theo mục đích nghiên cứu mà lượng chất phân tích đưa lên bản mỏng là khác nhau. SKLM được triển khai trong một bình sắc ký bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy và bão hòa pha động. Pha động di chuyển chầm chậm dọc theo bản mỏng, và lôi kéo mẫu chất phân tích đi theo nó. Tùy theo khả năng hấp phụ-giải hấp phụ của mỗi chất mà chúng sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau và quãng đường khác nhau trên bản mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích trên bản mỏng là hệ số di chuyển Rf. Hệ số này được tính bằng tỉ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất phân tích và khoảng dịch chuyển của pha động trên bản 11