Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn thọ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:118

Thêm vào BST

Báo xấu

46
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài đã cải biến phương pháp RP-HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm; 5µm) phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, cho phép định lượng lutein trong sự có mặt của hỗn hợp lutein ester; xác định điều kiện thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein ester chiết tách từ hoa cúc vạn thọ dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC đã cải biến thông qua việc xác định hiệu suất xà phòng hoá và độ tinh khiết của sản phẩm lutein tự do thu được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn thọ

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Mỹ Kim Vương CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC Nha Trang - 2019
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Mỹ Kim Vương CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER Chuyên ngành : Hoá phân tích Mã số : 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Người hướng dẫn 1 Người hướng dẫn 2 TS. Hoàng Thị Huệ An TS. Trần Thị Phương Anh Nha Trang - 2019
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Cải biến phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP – HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát quá trình xà phòng hoá lutein ester” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này. Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Lê Mỹ Kim Vương
Lời cảm ơn Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè trong lớp. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hoàng Thị Huệ An và TS. Trần Thị Phương Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Khoa Hoá học và Phòng Đào tạo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Tôi chân thành cảm ơn các thầy cô ở Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học, đồng thời giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các thầy cô tại Trung tâm Thí nghiệm Thực hành Trường Đại học Nha Trang đã hỗ trợ trang thiết bị thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn. Đề tài này được thực hiện trong khuôn khổ dự án “Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn thọ”, mã số CNHD.DASXTN.026/17-18 thuộc Chương trình nghiên cứu KHCN trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020. Xin trân trọng cảm ơn Bộ Công Thương và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ lọc, hóa dầu đã cấp kinh phí thực hiện dự án này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Trân trọng! Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Lê Mỹ Kim Vương
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ANOVA analysis of variance Phân tích phương sai AOAC Assosiation of Official Hiệp hội các nhà hóa Analytical Chemists phân tích chính thức. ASTM American Society for Testing Hiệp hội phép thử Mỹ. of Materials DAD Diod array detector Detector mảng diod. DMF Dimethyle formamide DNA Acid Deoxyribonucleic ADN EU Europe Union Liên minh châu Âu FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm GC-MS Gas chromatography mass Sắc ký khí Khối phổ spectrometry HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng chromatography cao. ICH International Conference on Hội đồng hòa hợp quốc Harmonization tế. JECFA The Joint FAO/WHO Expert Hội đồng các chuyên gia Committee on Food) FAO/WHO về phụ gia thực phẩm LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện.
LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng. MTBE Methyle tert-butyle ether R2 Correlation coefficient Hệ số tương quan RT Retention Time Thời gian lưu SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu. THF Tetrahydrofurane UV – Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến. v/v Volume/volume Thể tích/thể tích. v/w Volume/weight Thể tích/khối lượng. w/w Weight/weight Khối lượng/khối lượng. lmax Wavelength of maximum Bước sóng hấp thụ cực absorption đại.
Danh mục các bảng Bảng 1.1.Dữ kiện hấp thụ UV-Vis của lutein và zeaxanthin………………. 12 Bảng 2.1.Các thành phần pha động thử nghiệm ở chế độ rửa giải isocratic...52 Bảng 3.1.Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thừa số lưu giữ lutein và lutein ester………………………………………………………………….. 62 Bảng 3.2.Giá trị k’ của lutein và lutein ester khi thử nghiệm rửa giải theo chương trình gradient dung môi đề nghị…………………………………….66 Bảng 3.3.Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến độ rộng chân peak và số đĩa lý thuyết của cột tách đối với các cấu tử phân tích……………………………..67 Bảng 3.4.Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến độ rộng chân peak, số đĩa lý thuyết và chiều cao của đĩa đối với các cấu tử phân tích……………………70 Bảng 3.5.Kết quả xác định hàm lượng carotenoid tổng số và lutein có trong lutein đối chứng……………………………………………………………...74 Bảng 3.6.Kết quả dựng đường chuẩn lutein (lặp lại 3 lần song song)……... 75 Bảng 3.7.Khảo sát độ lặp lại khi tiêm cùng mẫu chuẩn trong ngày………... 78 Bảng 3.8.Khảo sát độ thu hồi khi thêm mẫu chuẩn ở các nồng độ 12; 15; 18ppm………………………………………………………………………..81 Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin đến hiệu suất xà phòng hoá…………………………………………………………………………...84 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester……………………………………………………………………. ……86 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa……...........88 Bảng 3.12.Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester………………………………………………………………………….92 Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá trên mẫu lớn.…......96 Bảng 3.14.Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá mẫu thêm chuẩn ………………………………………………………………………...97
Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15] ................. 10 Hình 1.2. Một số dạng đồng phân cis thường gặp của lutein [15].................. 11 Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15] .. 11 Hình 1.4. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B [16] ............. 17 Hình 1.5. Sơ đồ thiết bị HPLC [16] ................................................................ 18 Hình 1.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử A và B [16] .................................. 22 Hình 1.7. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai chất .......... 23 Hình 3.1. Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và rửa giải của lutein và lutein ester ........................................................................................ 63 Hình 3.2. Sơ đồ sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải .... 65 Hình 3.3. Sắc ký đồ chế độ rửa giải gradient dung môi ................................. 65 Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến một số đại lượng sắc ký .............. 68 Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi tốc độ dòng từ 0,8 đến 1,2 ml/phút ......................................................................................... 69 Hình 3.6. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình sắc ký ................. 71 Hình 3.7. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi thể tích bơm mẫu ................................................................................................................. 72 Hình 3.8. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 40 ppm ................. 75 Hình 3.9. Kết quả HPLC của các mẫu trắng, mẫu chứng thực, mẫu thực và mẫu thêm ........................................................................................................ 76 Hình 3.10. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 30 ppm ............... 79 Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin không xà phòng hóa (lutein ester) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml ...................................................... 82 Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin sau khi xà phòng hóa (lutein tự do) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml ..................................................... 82
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu lutein đối chứng cho thấy trans-lutein có RT ~ 0,89 phút ................................................................................................................. 83 Hình 3.14. Phổ hấp thụ UV-Vis ứng với: a) peak trans-lutein (RT ~ 8,9 min); b) peak cis-lutein (RT ~ 10,3 min) .................................................................. 83 Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ oleoresin ...................................... 85 Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin khi thay đổi nồng độ oleoresin từ 0,1 – 0,9 g/ml ............................................ 87 Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin khi cố định nồng độ oleoresin 0,3 g/ml .......................................................... 87 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 88 Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau khi xà phòng hóa bằng KOH 5% w/v trong EtOH trong 1 h ở các nhiệt độ khác nhau ....... 91 Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 92 Hình 3.21. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu xà phòng hoá trong các khoảng thời gian khác nhau ................................................................................................ 95
1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 6 1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 6 2. Mục đích của đề tài ..................................................................................... 8 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 8 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................. 9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................... 10 1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN .................................................................... 10 1.1.1. Cấu trúc phân tử ................................................................................ 10 1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của lutein ............................................... 11 1.1.2.1. Tính chất vật lý ............................................................................ 11 1.1.2.2. Tính chất hóa học ........................................................................ 13 1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của lutein ........................................ 13 1.1.3.1. Hoạt tính sinh học của lutein ...................................................... 13 1.1.3.2. Ứng dụng của lutein .................................................................... 14 1.1.4. Các nguồn lutein quan trọng trong tự nhiên ...................................... 16 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ........................................... 16 1.2.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký .................................................... 16 1.2.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị HPLC .......................... 18 1.2.2.1. Bình đựng dung môi pha động .................................................... 18 1.2.2.2. Bộ phận khử khí ........................................................................... 19 1.2.2.3. Bơm cao áp .................................................................................. 19 1.2.2.4. Bộ phận tiêm mẫu ........................................................................ 19 1.2.2.5. Cột sắc ký .................................................................................... 19 1.2.2.6. Đầu dò ......................................................................................... 20
2 1.2.2.7. Bộ phận ghi tín hiệu .................................................................... 21 1.2.2.8. Thiết bị in dữ liệu ........................................................................ 21 1.2.3. Các đại lượng đặc trưng cơ bản trong HPLC .................................... 21 1.2.3.1. Thời gian lưu - Thời gian lưu thực .............................................. 21 1.2.3.2. Hệ số dung lượng ........................................................................ 22 1.2.3.3. Độ chọn lọc ................................................................................. 23 1.2.3.4. Số đĩa lý thuyết ............................................................................ 23 1.2.3.5. Độ phân giải ................................................................................ 24 1.2.4. Cách xây dựng một quy trình phân tích HPLC ................................. 25 1.2.4.1. Chọn kiểu sắc ký .......................................................................... 26 1.2.4.2. Chọn cột sắc ký............................................................................ 26 1.2.4.3. Chọn pha động ............................................................................ 27 1.2.4.4. Chọn chế độ rửa giải ................................................................... 28 1.2.5. Cách thẩm định một quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC ..................................................................................................................... 28 1.2.5.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký ............................................. 29 1.2.5.2. Tính đặc hiệu (Specificity) ........................................................... 29 1.2.5.3. Độ đúng (Accuracy) .................................................................... 30 1.2.5.4. Độ chính xác (Precision) ............................................................. 30 1.2.5.5. Khoảng nồng độ tuyến tính (Range)............................................ 31 1.2.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD: Detection Limit) ................................ 32 1.2.5.7. Độ thô (Robustness) .................................................................... 33 1.2.5.8. Khả năng áp dụng của phương pháp (Scope) ............................. 33 1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CARATENOID .............................................................................................. 33
3 1.3.1. Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis........... 33 1.3.1.1. Định lượng sản phẩm carotenoid tinh chế .................................. 33 1.3.1.2. Định lượng carotenoid trong các mẫu sinh học .......................... 34 1.3.2. Định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC ............................. 34 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ..................... 38 1.4.1. Nghiên cứu quá trình xà phòng hóa lutein ester ................................ 38 1.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng lutein bằng phương pháp HPLC ........................................................................................................... 41 1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................. 41 1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................ 45 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 48 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 48 2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 48 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................. 48 2.2. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ........................................................................... 49 2.2.1. Dụng cụ ............................................................................................. 49 2.2.2. Thiết bị............................................................................................... 49 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 50 2.3.1. Cải biến phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp với lutein ester ................................................................................................... 50 2.3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch khảo sát điều kiện chạy HPLC ............. 50 2.3.1.2. Chọn thành phần pha động và chế độ rửa giải ........................... 51 2.3.1.3. Chọn tốc độ dòng ........................................................................ 53 2.3.1.4. Chọn thể tích bơm mẫu................................................................ 53 2.3.1.5. Dựng đường chuẩn lutein ............................................................ 54
4 2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng lutein.............................................. 56 2.3.2.1. Tính đặc hiệu ............................................................................... 56 2.3.2.2. Độ chụm (precision) .................................................................... 56 2.3.2.3. Độ tuyến tính của đường chuẩn – Khoảng nồng độ tuyến tính ... 57 2.3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [41] .. 57 2.3.2.5. Độ đúng. ...................................................................................... 57 2.3.3. Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định điều kiện thích hợp xà phòng hóa lutein ester .................................................................................. 58 2.3.3.1. Phương pháp tổng quát xà phòng hóa lutein ester ..................... 58 2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất xà phòng hóa lutein ester ....... 58 2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa lutein ester đến đến hiệu suất xà phòng ............................................................................. 59 2.3.3.4. Thử nghiệm quy trình xà phòng hóa lutein ester......................... 60 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................. 61 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 62 3.1. CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN TRONG HỖN HỢP CHỨA LUTEIN ESTER ............................................................. 62 3.1.1. Chọn thành phần pha động ................................................................ 62 3.1.2. Chọn tốc độ dòng............................................................................... 66 3.1.3. Chọn thể tích bơm mẫu ..................................................................... 70 3.1.4. Kết luận về điều kiện phân tích hỗn hợp lutein và lutein ester ......... 73 3.2. DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN .................. 74 3.2.1. Xác định độ tinh khiết của mẩu lutein đối chứng .............................. 74 3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn lutein ..................................................... 74 3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐÃ XÂY DỰNG ............................................................................................................ 76
5 3.3.1. Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích ......................................... 76 3.3.2. Độ lặp lại trong ngày (intra-day injection repeatability) ................... 78 3.3.3. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn ................................................. 78 3.3.4. Xác định LOD và LOQ ..................................................................... 80 3.3.5. Xác định độ thu hồi ........................................................................... 80 3.3.6. Kết luận về việc thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng .......... 81 3.4. NHẬN BIẾT PEAK LUTEIN VÀ LUTEIN ESTER ............................. 82 3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐÃ THỬ NGHIỆM ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ ....................................... 84 3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ oleoresin ..................................................... 84 3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa .............. 85 3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa .......... 88 3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa......... 92 3.5.5. Kết luận về khảo sát điều kiện xà phòng hoá .................................... 96 3.6. THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ .................................. 96 3.6.1. Thử nghiệm trên mẫu lớn .................................................................. 96 3.6.2. Thử nghiệm trên mẫu thêm chuẩn ..................................................... 97 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................... 98 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 98 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 100
6 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Lutein là một sắc tố carotenoid có màu vàng cam, là dẫn xuất 3,3’-diol của b,e-caroten. Lutein có trong nhiều loài thực vật (cải bó xôi, bông cải xanh, rau ngót, hoa, quả, rong, tảo…) và trong mô của một số loài động vật (lòng đỏ trứng và da của gia cầm, da cá cảnh…) [1]. Lutein - cùng với đồng phân của nó là zeaxanthin - là các sắc tố tập trung ở hoàng điểm của mắt người với hàm lượng cao, có vai trò quan trọng trong việc xử lý hình ảnh, phát triển của thần kinh thị giác và não bộ [2]. Nhiều nghiên cứu dịch tể học gần đây đã chứng minh rằng lutein có khả năng bắt giữ oxy đơn và các gốc tự do, hấp thụ mạnh tia tử ngoại. Nhờ đó, lutein có tác dụng bảo vệ cơ thể khỏi một số bệnh ung thư, bệnh tim mạch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa và các bệnh về mắt ở người cao tuổi (bệnh đục thủy tinh thể, thoái hóa hoàng điểm) [3]. Do vậy, lutein đang được quan tâm nghiên cứu khai thác từ các nguồn tự nhiên nhằm ứng dụng trong trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm (làm thuốc bổ mắt, vi chất dinh dưỡng, kem chống nắng, son dưỡng môi, chất màu thực phẩm...) [4] Hiện nay, nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu lutein nhất là hoa cúc vạn thọ châu Mỹ (Tagetes erecta L.). Lutein tồn tại trong hoa cúc vạn thọ dưới dạng monoester hay diester của các acid béo (acid myristic, palmitic…). Hàm lượng carotenoid tổng số trong cánh hoa chiếm khoảng 0,1 – 0,2% (tính theo trọng lượng khô), trong đó lutein chiếm trên 80% [5]. Theo các quy trình truyền thống, lutein ester từ hoa cúc vạn thọ thường được chiết bằng hexan; dịch chiết được cô đặc dưới áp suất thấp để thu được một dạng dầu sệt (gọi là oleoresin), sau đó được xà phòng hóa bằng KOH trong alcol để chuyển thành dạng lutein tự do – là dạng cơ thể người có thể hấp thụ. Một số quy trình xà phòng hóa lutein ester đã được đề nghị như các quy trình của Ausich (1997) [6], Kumar (2004) [7], Swaminathan (2009) [8], Sankar (2012) [9] … Các quy trình trên chưa có sự nhất quán về điều kiện phản ứng (nồng độ oleoresin, nồng độ KOH, nhiệt độ, thời gian) cũng như chưa có đầy đủ thông tin về hiệu suất xà phòng hóa. Hơn nữa, công đoạn xà phòng hóa thường được tiến hành
7 ở nhiệt độ cao (50 – 600C hoặc 70 – 800C) và trong thời gian khá dài (3 giờ – 10 giờ); điều này có thể gây ra sự phân hủy đáng kể lutein do lutein là một hợp chất kém bền nhiệt. Nguyên nhân là do các tác giả trên đã sử dụng các phương pháp khác nhau (sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao) để theo dõi tiến trình phản ứng hoặc định lượng lutein trong hỗn hợp xà phòng hóa. Thực tế này dẫn đến sự bối rối đối với người nghiên cứu trong việc chọn lựa quy trình xà phòng hóa lutein ester ứng dụng cho các mục đích phân tích lutein ở quy mô phòng thí nghiệm hoặc nhằm thu nhận lutein tự do từ cao chiết lutein ester ở quy mô công nghiệp. Để làm sáng tỏ vấn đề trên, cần khảo sát đầy đủ và hệ thống hơn về ảnh hưởng của các yếu tố phản ứng đến hiệu suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do, từ đó đưa ra quy trình thích hợp cho phép xà phòng hóa lutein ester với hiệu suất cao và sản phẩm chất lượng cao. Muốn vậy, cần sử dụng một phương pháp phân tích đáng tin cậy cho phép định lượng lutein tự do trong hỗn hợp xà phòng hóa lutein ester chiết tách từ hoa cúc vạn thọ. Cho đến nay, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn được xem là một phương pháp hiệu quả để phân tích hỗn hợp carotenoid [10]. Nhiều quy trình phân tích sử dụng phương pháp HPLC đã được xây dựng để phân tích hỗn hợp carotenoid trên các đối tượng khác nhau, trong đó có thể sử dụng cột sắc ký pha thường (cột silica, cột cyanopropyl...) hay pha đảo (cột C18, C30) với đầu dò tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), đầu dò dãy diode quang (PDA), đầu dò khối phổ (MS), hoặc đầu dò cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [10]. Trong số đó, phương pháp HPLC sử dụng cột silica là phương pháp đã được JECFA sử dụng như là phương pháp tiêu chuẩn để định lượng lutein và zeaxanthin trong các sản phẩm lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ [11][12]. Tuy nhiên, ở Việt Nam với điều kiện khí hậu có độ ẩm cao, cột silica dễ hút ẩm và do đó rất nhạy cảm với sự thay đổi thành phần nước trong pha động chạy sắc ký, kết quả là thời gian lưu khó lặp lại [13]. Đối với các cột pha đảo, cột C30 có ưu điểm là cho phép phân tách rất hiệu quả nhiều hỗn hợp carotenoid phức tạp nhưng lại khá đắt tiền. Do đó, cột pha đảo C18 thường được ưu tiên lựa chọn khi phân tích hỗn hợp carotenoid không quá phức tạp. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu xây dựng phương pháp
8 HPLC định lượng lutein và hỗn hợp các carotenoid khác nhau sử dụng cột C18 [14] nhưng các phương pháp này không phù hợp với điều kiện sẵn có ở phòng thí nghiệm của chúng tôi (hoặc về các thông số của cột sắc ký, hoặc về thành phần pha động, …). Tại Việt Nam, rất ít nghiên cứu về định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC. TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) đã sử dụng cột C18 (150 x 4,6 cm; 5 µm) với đầu dò PDA để xây dựng phương pháp RP-HPLC khá hiệu quả và thuận tiện cho phép định lượng astaxanthin và hỗn hợp carotenoid đi kèm (lutein, zeaxanthin, b-caroten, lycopen, astaxanthin ester) trong đối tượng giáp xác thủy sản [13]. Trong nghiên cứu của Trương Ngọc Bảo Hiếu và Ngô Văn Tứ đã xây dựng phương pháp phân tích b-carotene trong một số loại ngũ cốc có màu bằng cách sử dụng cột C18 (150 x 4,6 cm, 5µm). Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của chúng tôi hiện chỉ có cột pha đảo C18 (250 x 4,6 cm; 5 µm) và đối tượng nghiên cứu trong luận văn hướng tới không phù hợp với các nghiên cứu trên. Do đó, việc cải biến phương pháp HPLC định lượng carotenoid sẵn có sao cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và đối tượng phân tích cụ thể là vấn đề đặt ra đối với người làm công tác phân tích. Vì vậy, trong đề tài này chúng tôi sẽ nghiên cứu cải biến phương pháp HPLC nói trên để định lượng lutein và theo dõi quá trình xà phòng hóa lutein ester. 2. Mục đích của đề tài - Cải biến phương pháp RP-HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm; 5µm) phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, cho phép định lượng lutein trong sự có mặt của hỗn hợp lutein ester. - Xác định điều kiện thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein ester chiết tách từ hoa cúc vạn thọ dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC đã cải biến thông qua việc xác định hiệu suất xà phòng hoá và độ tinh khiết của sản phẩm lutein tự do thu được. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Hoa cúc vạn thọ Mỹ Tagetes erecta L. được trồng trong dự án đề tài cấp tỉnh của TS. Hoàng Thị Huệ An.
9 Phạm vi nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi kế thừa một số kết quả nghiên cứu trước đây của TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) [13] và xây dựng phương pháp HPLC phù hợp để định lượng lutein, từ đó ứng dụng kiểm soát quá trình xà phòng hoá lutein ester. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học của đề tài - Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện sắc ký đến khả năng định lượng lutein khi có mặt hỗn hợp lutein ester bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm; 5 µm). - Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa (nồng độ tác chất, nhiệt độ, thời gian) đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Cho phép định lượng lutein trong các mẫu thực tế có chứa lutein và lutein ester bằng phương pháp HPLC với cột pha đảo C18 (250 x 4,6 cm; 5 µm). - Góp phần hoàn thiện quy trình xà phòng hóa lutein ester ở quy mô phòng thí nghiệm và ở quy mô công nghiệp.
10 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN 1.1.1. Cấu trúc phân tử Lutein là một sắc tố xanthophyll (tức oxycarotenoid) có nhiều ứng dụng trong công nghiệp chất màu thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm nhờ có màu vàng cam rất đẹp và tác dụng chống oxy hóa khá mạnh. Lutein có công thức phân tử C40H56O2 (phân tử lượng 568,9), là dẫn xuất 3,3’- diol của b,e-caroten và là một dạng tiền vitamin A [15]. Phân tử lutein chứa bộ khung cấu trúc isoprenoid C40 điển hình của các carotenoid và có 2 vòng 6 cạnh ở hai đầu mạch carbon. Chuỗi liên kết đôi liên hợp trong lutein có thể tồn tại ở cấu hình cis hoặc trans, do đó tạo ra số lượng lớn đồng phân mono-cis và poly-cis của lutein. Trong tự nhiên lutein thường tồn tại ở dạng đồng phân hình học bền nhất là dạng all-trans (hình 1.1) [15], [16]. Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15] Tuy nhiên, dưới tác dụng của bức xạ nhiệt hay ánh sáng, dạng all-trans có thể bị chuyển hóa thành các dạng đồng phân cis, trong đó bền hơn cả là các dạng 9-cis, 13-cis và 15-cis hay 9’-cis, 13’-cis, 15’-cis…(Hình 1.2.).