Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:73

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của Luận văn là xử lý mẫu và tạo dịch chiết. Nghiên cứu phân lập thành phần hóa hoc. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được. Định lượng scopolamine bằng HPLC. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG PHÚ LÂM NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG CỦA SCOPOLAMINE TỪ CÂY ĐẠI CÀ DƯỢC (BRUGMANSIA SUAVEOLENS) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG PHÚ LÂM NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG CỦA SCOPOLAMINE TỪ CÂY ĐẠI CÀ DƯỢC (BRUGMANSIA SUAVEOLENS) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Mai THÁI NGUYÊN - 2017
LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Mai đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Nghiên cứu cấu trúc,Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Hóa Học - Trường Đại Học Khoa Học Thái Nguyên đã trang bị cho em kiến thức để tiếp cận với các vấn đề nghiên cứu khoa học và các anh chị, các bạn học viên lớp K9B- lớp Cao học Hóa đã trao đổi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè và đồng nghiệp của tôi - những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Hoàng Phú Lâm a
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................a MỤC LỤC ......................................................................................................... b DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................... d DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................e DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... f DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ .......................................................................... g MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. Giới thiệu chi Brugmansia ......................................................................... 3 1.2. Nghiên cứu hóa học chi Brugmansia ......................................................... 3 1.3. Giới thiệu cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)................................ 5 1.3.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................... 5 1.3.2. Công dụng theo kinh nghiệm dân gian ................................................... 5 1.3.3. Hợp chất scopolamine …………………………………………………6 1.4. Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật................................... 7 1.4.1. Chọn dung môi chiết ............................................................................... 7 1.4.2. Quá trình chiết ....................................................................................... 10 1.5. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ ................. 11 1.5.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký ............................................. 11 1.5.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký ............................................................. 12 1.5.3. Phân loại phương pháp sắc ký .............................................................. 12 1.6. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ.............................................................................................................. 17 1.6.1. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS) ............................................ 17 1.6.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR) ........................................................................................ 18 Chương 2: THỰC NGHIỆM........................................................................ 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 20 b
2.2. Các phương pháp nghiên cứu................................................................... 20 2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu ........................................................... 20 2.2.2. Phương pháp phân lập các chất ............................................................. 20 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được ................ 21 2.3. Thực nghiệm ............................................................................................ 21 2.3.1. Xử lý mẫu dược liệu, chiết tách và phân lập các hợp chất ................... 21 2.3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất .................................... 23 2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng của hợp chất phân lập được .......... 25 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 27 3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất bằng các phương pháp phổ .................... 27 3.1.1. Hợp chất BS1 (Scopolamine)................................................................ 27 3.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất BS2 ............................................................ 31 3.1.3. Xác định cấu trúc các hợp chất BS3 ..................................................... 37 3.2. Xác định hàm lượng chất BS1 (CBS1) có trong mẫu khô ....................... 41 KẾT LUẬN .................................................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47 c
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CC Column Chromatography Sắc ký cột TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng Me Nhóm metyl MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng Proton Magnenic Rosonance 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Spectrocopy Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 C-NMR Resonance Spectroscopy 13 δ ̣ hóa ho ̣c Chuyể n dich Distortionless Enhancement by DEPT Phổ DEPT Polarisation Transfer Electronspray Ionization Mas ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Spectrum Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều HMBC Connectivity liên kết Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên HSQC Connectivity kết Glc Glucoside Rh Rhamnozơ LC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50% HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography d
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất BS1 và chất tham khảo .............. 29 Bảng 3.2. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất BS2 và các chất tham khảo ........ 35 Bảng 3.3. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất BS3 và chất tham khảo .............. 40 Bảng 3.4. Cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ loài cà độc dược ....... 41 Bảng 3.5. Kết quả đo phổ HPLC của mẫu BS1 .............................................. 43 Bảng 3.6. Kết quả phân tích phương sai ......................................................... 43 Bảng 3.7. Kết quả mẫu nghiên cứu ................................................................. 45 e
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens) ........................ 5 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các chất từ loài Brumansia suaveolens .................. 23 Hình 3.1. Phổ MS của hợp chất BS1 .............................................................. 27 Hình 3.2. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS1..................................................... 28 Hình 3.3. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS1 ................................................... 29 Hình 3.4. Phổ HMBC của hợp chất BS1 ........................................................ 30 Hình 3.5. Một số tương tác chính HMBC của hợp chất BS1 ......................... 30 Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của hợp chất BS1 (Scopolamine) ....................... 31 Hình 3.7. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS2..................................................... 32 Hình 3.8. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS2 ................................................... 33 Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất BS2 .......................................................... 33 Hình 3.10. Phổ HMBC của hợp chất BS2 ...................................................... 34 Hình 3.11. Một số tương tác chính HMBC của hợp chất BS2 ....................... 34 Hình 3.12. Phổ khối của hợp chất BS2 ........................................................... 36 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất BS2 .............................................. 36 Hình 3.14. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS3................................................... 37 Hình 3.15. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS3 ................................................ 38 Hình 3.16. Phổ DEPT của hợp chất BS3 ........................................................ 38 Hình 3.17. Phổ HMBC của hợp chất BS3 ...................................................... 39 Hình 3.18. Một số tương tác chính HBMC của hợp chất BS3 ....................... 39 Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất BS3 .............................................. 41 Hình 3.20. Sắc ký đồ của chất BS1 ở nồng độ 0,19 mg/mL ........................... 41 Hình 3.21. Sắc ký đồ của chất BS1 ở nồng độ 0,475 mg/mL ......................... 42 Hình 3.22. Sắc ký đồ của chất BS3 ở nồng độ 0,95 mg/mL ........................... 42 Hình 3.23. Đường chuẩn của hợp chất BS1 .................................................... 44 Hình 3.24. Sắc ký đồ của chất BS1 trong cặn chiết ........................................ 44 f
DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ Hình 3.1. Phổ MS của hợp chất BS1 ................................................................ 1 Hình 3.2. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS1....................................................... 2 Hình 3.3. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS1 ..................................................... 3 Hình 3.4. Phổ HMBC của hợp chất BS1 .......................................................... 4 Hình 3.5. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS2....................................................... 5 Hình 3.6. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS2 ..................................................... 6 Hình 3.7. Phổ DEPT của hợp chất BS2 ............................................................ 7 Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất BS2 .......................................................... 8 Hình 3.9. Phổ khối của hợp chất BS2 ............................................................... 9 Hình 3.10. Phổ 1H -NMR của hợp chất BS3................................................... 10 Hình 3.11. Phổ 13C -NMR của hợp chất BS3 ................................................ 11 Hình 3.12. Phổ DEPT của hợp chất BS3 ........................................................ 12 Hình 3.13. Phổ HMBC của hợp chất BS3 ...................................................... 13 Hình 3.14. Sắc ký đồ của chất BS1 ở nồng độ 0,19 mg/mL ........................... 14 Hình 3.15. Sắc ký đồ của chất BS1 ở nồng độ 0,475 mg/mL ......................... 15 Hình 3.16. Sắc ký đồ của chất BS1 trong cặn chiết ........................................ 16 g
MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nên thảm thực vật phát triển rất đa dạng và phong phú; có khoảng 11000 đế n 12000 loài thực vật bậc cao, trong đó, gần 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thuốc. Ngoài sự phong phú về chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong nhân dân để phòng và chữa nhiều bệnh khác nhau. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức một vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc dân gian, cổ truyền được tồn tại và lưu truyền đến ngày nay. Đây là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá, từ xa xưa, nó đã được con người biết đến, khai thác và sử dụng vào phục vụ đời sống, sức khỏe của mình. Có được đặc tính dược liệu quý giá là do cây thuốc có các hợp chất thiên nhiên mang hoạt tính sinh học. Các hợp chất thiên nhiên thường ít độc hơn so với hợp chất tổng hợp, được dùng làm chất kích thích, điều hòa sinh trưởng, làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp v.v...; đặc biệt, chúng được dùng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp mỹ phẩm, thực phẩm và làm thuốc phòng, chữa bệnh cho con người. Ngày nay, do biến đổi khí hậu, loài người đang phải đối mặt với hàng loạt dịch, bệnh nguy hiểm và nan y. Mặt khác, mặc dù khoa học - công nghệ phát triển mạnh mẽ và đạt được nhiều tiến bộ vượt bậc, mang tính đột phá, đời sống của con người đã được cải thiện rõ rệt, nhưng do sự biến đổi của môi trường, do áp lực của công việc, do thức ăn chúng ta sử dụng hàng ngày chưa bảo đảm an toàn thực phẩm, cùng với sự biến thể của các loại vi khuẩn, vi rút gây bệnh v.v… đã và đang đe dọa cuộc sống của chúng ta không ngừng. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra những loại thuốc tăng cường sức đề kháng, phòng, chống và chữa bệnh là một vấn đề đã và đang được sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như của toàn xã hội. Chi Brugmansia là chi trong họ Cà (Solananceae), là một chi khá lớn, được phân bố ở nhiều quốc gia và có mặt ở hầu hết các tỉnh, thành trong cả 1
nước. Các bộ phận lá, rễ, vỏ thân, cành, quả của các loài trong chi Brugmansia là các vị thuốc quí trong dân gian. Cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens) được trồng làm cảnh và sử dụng làm dược liệu. Tuy nhiên, do có nhiều các hợp chất dạng tropane alkaloid nên cây có độc tính hoặc gây dị ứng khi tiếp xúc hoặc sử dụng với liều lượng cao. Vì vậy chúng tôi lựa chọn loài Brugmansia suaveolens họ cà (Solananceae) làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định cấu trúc và hàm lượng của scopolamine từ cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens)” Nhiệm vụ của đề tài là: 1. Xử lý mẫu và tạo dịch chiết. 2. Nghiên cứu phân lập thành phần hóa hoc. 3. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được. 4. Định lượng scopolamine bằng HPLC. 2
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chi Brugmansia Chi Brugmansia là chi trong họ Cà (Solananceae). Chi Brugmansia trên thế giới có tám loài là B. arborea , B. aurea , B. candida , B. dolichocarpa, B. insignis, B. sanguinea, B. versicolorand và B. vulcanicola. Ở Viê ̣t Nam, chi này chỉ có một loài là B. suaveolens [1, 2]. 1.2. Nghiên cứu hóa học chi Brugmansia Tinh dầu lá và hoa loài B. candida được các tác giả Geoffrey C. Kite và Christine Leon nghiên cứu. Kết quả cho thấy, các hợp chất benzaldehyde, methyl benzoate, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, methyl salicylate, benzyl benzoate, benzyl salicylate, α-thujene, α-pinene, β-pinene, limonene, 1,8-cineole, trans-ocimene, trans-sabinene hydrate, terpinolene, α-terpineol, β-elemene, β-cedrene, [z]-α-trans-bergamotene, α-farnesene, trans-nerolidol, cis,trans-farnesol, trans,trans-farnesol, trans,cis-farnesol, indole được tìm thấy trong tinh dầu hoa; các hợp chất ethyl benzoate, methyl salicylate, α-pinene, trans-ocimene, perillene, α-elemene, [z]-α-trans-bergamotene, α-santalene, β- caryophyllene, [z]-α-cis-bergamotene, α-guaiene, cis,β-farnesol, γ-gurjunene, β-selinene, β-bisabolene, β-sesquiphellandrene, trans-nerolidol, dendrolasin và santalol acetat được tìm thấy trong tinh dầu lá [3]. Từ tinh dầu hoa loài B. suaveolens các hợp chất heptanal, octanal, 1,8- cineole, (E)-β-ocimene, γ-terpinene, linalool, nonanal, phenethyl alcohol, terpinen-4-ol, 2-isobutyl-3-methoxypyrazine, α-terpineol, theaspirane A, theaspirane B, megastigmatrienone I, (E)-nerolidol, megastigmatrienone II, megastigmatrienone III, megastigmatrienone IV, pentacosane, heptacosane, nonacosane và hentriacontane đã được tác giả Samuel J. Anthony và cộng sự thông báo [4]. 3
Từ cặn nước của hoa loài B. suaveolens được Alexander Garcia Parker và cộng sự nghiên cứu tác dụng giảm đau trên chuột. Nghiên cứu này đã được tiến hành để kiểm tra khả năng giảm đau của nó bằng cách sử dụng acetic axit gây đau bụng và đĩa nóng gây bỏng chân. Cặn nước từ hoa loài B. suaveolens dùng với mức liều 100 và 300 mg/kg thể trọng lượng ức chế đáng kể cảm giác đau do axit gây ra. Tăng nhiệt độ tấm đĩa kim loại, các tác giả nhận thấy ở cả mức hai liều 100 và 300 mg/kg đều có khả năng làm giảm cảm giác đau [5]. Một số alkaloid tropane như hyoscine (scopolamine) (1) [6], atropine (2) và scopolamine (1) [7] cũng đã được thông báo có mặt trong loài B. arborea. Cặn metanol của loài này có tác dụng chống viêm, giảm đau, làm lành vết thương, thông mũi, chống co thắt và đặc biệt là có tác dụng trong điều trị bệnh thấp khớp [8]. Cặn metanol và nước của B. arborea có tác dụng ức chế tái hấp thụ serotonin (5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2C, D1, D2, 𝛼1 và 𝛼2) - hoạt tính chống trầm cảm [9]. B. candida chứa các alkaloid tropane trong số đó có hyoscyamine (3) và scopolamine (1) là chất có hoạt tính kháng cholinergic đã được sử dụng rộng rãi làm thuốc giảm đau, an thần, chống co thắt và giãn đồng tử [10, 11, 12]. 4
1.3. Giới thiệu cây đại cà dược (Brugmansia suaveolens) 1.3.1. Đặc điểm thực vật Tên khoa học: Brugmansia suaveolens Tên tiếng Việt: đại cà dược, cà độc dược cảnh Chi: Brugmansia suaveolens) Họ: Cà (Solananceae) Mô tả : Cây nhỡ khỏe, cao 4-5m, hóa gỗ, có vỏ xám, cành lá thường thòng xuống. Lá mọc so le, phiến có dạng như lá thuốc lá, to, dài 15-20 cm, tới 30 cm, rộng 20 cm, có lông ở mặt dưới, gốc có khi không cân; đầu nhọn; cuống dài 2-3 cm. Hoa mọc thòng xuống, to, Hình 1.1. Hình ảnh cây đại cà dược đơn độc hay xếp từng đôi, màu trắng, (Brugmansia suaveolens) tràng hình hoa loa kèn. 1.3.2. Công dụng theo kinh nghiệm dân gian Trong y học cổ truyền Trung Hoa, nó là một trong 50 vị thuốc cơ bản, với tên gọi dương kim hoa. Theo Đông y, hoa cà độc dược có vị cay, tính ôn, có độc, có tác dụng ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấp đau nhức. Lá là vị thuốc ngừa cơn hen, giảm đau bao tử, chống say tàu xe. Ngoài ra còn điều trị phong tê thấp, đau dây thần kinh toạ, đau răng... Người ta thường dùng lá cuộn thành điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để hút (chữa ho, hen suyễn), dùng lá hơ nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi khô tán bột mịn. 5
Vì cây có độc tính cao nên chỉ dùng theo sự hướng dẫn của thầy thuốc. Khi bị ngộ độc, có hiện tượng giãn đồng tử, mờ mắt, tim đập nhanh, giãn phế quản, môi miệng khô, khô cổ đến mức không nuốt và không nói được. Chất độc tác động vào hệ thần kinh trung ương, có thể gây tử vong do hôn mê. Trong dân gian có rất nhiều bài thuốc dùng cây đại cà dược, tuy nhiên thành phần hóa học và giải thích những tác dụng trong dân gian chưa được các nhà khoa học trong nước nghiên cứu. 1.3.3. Hợp chất scopolamine Hợp chất scopolamine là một alkaloid có khung tropan, là este của scopinol và axit tropic. Scopolamin (hyoscin) có tác dụng an thần mạnh gây ngủ, gây mê. Trước đây scopolamine được dùng để điều trị đau do co thắt cơ trơn theo đường tiêm hoặc uống (đau dạ dày, đau đường ruột..) nhưng vì có nhiều tác dụng phụ nên hiện nay chỉ dùng trong sản xuất miếng dán chống say tàu xe [13]. Liều cao của scopolamine có thể gây ra nhiều tác dụng phụ nguy hiểm, thậm chí là tử vong. Theo các chuyên gia, scopolamine là một loại thuốc nhưng không giống bất kỳ thứ thuốc nào khác. Một người có thể đang đi và bỗng nhiên thành người khác một cách nhanh chóng sau khi bị thổi bột scopolamine vào mặt, chỉ một phút sau là người này bị kiểm soát. Các nghiên cứu về dược lý của scopolamine cũng chỉ ra rằng hợp chất này có tác dụng dược lý liên quan tới hệ thần kinh trung ương (gây kích thích hoặc trầm cảm), có ảnh hưởng tới hệ tuần hoàn, hệ tiêu hóa và trong một số trường hợp có thể sử dụng như là những chất giải độc. Tuy vậy, với những liều lượng nhất định, scopolamine lại có thể gây tác dụng phụ như làm tăng nhịp tim, gây giãn đồng tử, mờ mắt [14, 15, 16]. 6
Với các tác dụng phụ trên, giới tội phạm đã mệnh danh scopolamine như là “hơi thở của quỷ”. Tại Columbia, giới tội phạm vẫn thường sử dụng scopolamine để kiểm soát tâm trí của những người khác để phạm tội. Thực tế đã có rất nhiều trường hợp báo cáo bị hại vì scopolamine, do đó, nhiều chính phủ đã khuyến cáo công dân của mình phải cảnh giác với tội phạm sử dụng chất này. Scopolamine có tác dụng như một loại ma túy hay mê dược được bào chế từ cây Borrachero ở Colombia và có tác dụng gây mê, đồng thời có khả năng làm mất đi thần trí của con người và đưa con người vào trạng thái bị thôi miên. Loại này được coi là loại thuốc đáng sợ nhất thế giới mà tội phạm thường dùng để xóa trí nhớ và làm mất ý thức tạm thời của nạn nhân, loại này cũng được giới tội phạm ở Việt Nam sử dụng trong thời gian gần đây. Scopolamine tồn tại ở dạng tự nhiên khá phổ biến trong một số loài thực vật họ cà, trong đó có loài B. suaveolens [17]. Tuy vậy hàm lượng scopolamine trong loài này đến nay vẫn chưa được thông báo. Do đó cần thiết có các phân tích định lượng hàm lượng của scopolamine trong loài B. suaveolens để có những cảnh báo hợp lý trong việc sử dụng hay tiếp xúc với loài thực vật này, tránh các tác dụng phụ không mong muốn của scopolamine. 1.4. Tổng quan về các phương pháp chiết mẫu thực vật Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình,…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau. 1.4.1. Chọn dung môi chiết Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận. 7
Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc. Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa. Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)- phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlrofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa… Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác. Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom. Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu 8
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ. Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết. Ví dụ trechlonolide A thu được từ trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng. Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol. Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn. Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất không mong muốn. 9
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. 1.4.2. Quá trình chiết Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm. - Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nước. - Chiết lôi cuốn theo hơi nước. Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khóa ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh. Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết mới được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau. Ví dụ: - Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Đragendorff và tác nhân Maye. 10
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết. - Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. - Các lacton của sesquitecpene và các glicosid trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết. 1.5. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. 1.5.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký Sắc ký là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh. Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…). Phương pháp sắc ký dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của 11