Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ cây đơn đất (Wedelia Chinensis)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn này tập trung vào phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ được phân lập từ cây thuốc này bằng các phương pháp phổ hiện đại nhằm đưa ra được các chỉ tiêu quan trọng trong việc nghiên cứu phân tích các thành phần hóa học tiếp theo của cây thuốc này. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ cây đơn đất (Wedelia Chinensis)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THANH HÒA PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪCÂY ĐƠN ĐẤT (WEDELIA CHINENSIS) Chuyên ngành:Hóa phân tích Mã số: 8 44 01 18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHẠM THẾ CHÍNH Thái Nguyên-2018
LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn: Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Thế Chính ngƣời thầy đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo và truyền đam mê nghiên cứu cho em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn để em hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo viên Trƣờng THPT Đồ Sơn – Hải Phòng đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và công việc để em hoàn thành luận văn. Em xin cảm ơn sự hỗ trợ của nhóm nghiên cứu công ty TNHH Hải Anh đã hỗ trợ cùng hoàn thành các kết quả thực nghiệm. Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy, các cô đã dạy dỗ em nên ngƣời! Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ em hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Nguyễn Thanh Hòa a
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................. a MỤC LỤC .................................................................................................... b DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... f DANH MỤC BẢNG BIỂU ......................................................................... g MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN ............................................................................. 2 1.1. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc ..................................... 2 1.1.1. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)[1,4] .................... 2 1.1.2. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng (MS) [1,4] ........................................... 6 1.1.3. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) [1,4] ............................................. 7 1.2. Phân tích hàm lƣợng các chất bằng HPLC [16] ......................................... 9 1.3. Đặc điểm cây đơn đất ................................................................................. 12 1.3.1 Nguồn gốc và phân bố....................................................................... 13 1.4.Thành phần hóa học của cây đơn đất ......................................................... 13 1.4.1 Nhóm wedelo .................................................................................... 13 1.4.2 Nhóm tecpenoit ................................................................................. 14 1.4.3 Nhóm flavonoit ................................................................................. 14 1.4.4 Thành phần hóa học của tinh dầu cây đơn đất .................................. 15 1.5. Mục tiêu của luận văn ......................................................................... 16 Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM ....................................................................... 17 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị .................................... 17 2.1.1. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................. 17 2.1.2. Hóa chất và dung môi ...................................................................... 17 2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng .......................................................................................... 17 2.1.4. Xác nhận cấu trúc ............................................................................. 17 2.2. Chuẩn bị mẫu các hợp chất thiên nhiên .................................................... 18 2.2.1. Khảo sát điều kiện tách cột bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) ........... 18 b
2.2.2. Phân lập các chất tinh khiết từ cặn chiết diclometan ....................... 19 2.3. Phân tích cấu trúc của hợp chất HOA01 bằng phổ IR ............................. 20 2.4. Phân tích cấu trúc của hợp chất HOA01 bằng phổ MS ........................... 21 2.5. Phân tích cấu trúc của HOA01 bằng phổ NMR ....................................... 21 2.6. Phân tích cấu trúc của HOA01 bằng phổ 2D (HSQC, HMBC, NOESY) 23 2.7. Phân tích độ sạch của HOA01 bằng LC/MS/MS ..................................... 23 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 24 3.1. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 24 3.2. Kết quả chuẩn bị mẫu nghiên cứu ............................................................. 24 3.2.1. Khảo sát điều kiện tách mẫu nghiên cứu ......................................... 24 3.2.2. Phân tách các hợp chất thiên nhiên bằng sắc ký cột ........................ 25 3.3. Kết quả phân tích cấu trúc của hợp chất HOA01 ..................................... 26 3.3.1. Phân tích cấu trúc của HOA01 bằng phổ hồng ngoại IR ................ 27 3.3.2. Phân tích cấu trúc của HOA01 bằng phổ MS .................................. 28 3.3.3. Phân tích cấu trúc của HOA01 bằng NMR ...................................... 29 3.3.4. Phân tích cấu trúc của HOA01 bằng HSQC, HMBC và phổ NOESY 33 3.4. Phân tích hàm lƣợng của HOA01 bằng phƣơng pháp LC/MS/MS ........ 38 3.5. Phân tích cấu trúc của 1P bằng NMR ........................................................ 38 KẾT LUẬN ................................................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 44 c
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MS Phƣơng pháp phổ khối lƣợng EI Phƣơng pháp bắn phá bằng dòng electron CI Phƣơng pháp ion hóa hóa học FAB Phƣơng pháp bắn phá nguyên tử nhanh GC Phƣơng pháp sắc ký khí HPLC Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao SKLM Sắc kí lớp mỏng TMS Chất chuẩn d
DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân tách các hợp chất thiên nhiên từ cặn chiết diclometan ..................................................................................................................... 26 e
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tính chất của hạt nhân trong từ trƣờng ngoài ............................... 3 Hình 1.2. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của 2 – etyl phenol ......................... 4 Hình 1.3.Phổ cộng hƣởng từ hai chiều ......................................................... 5 Hình 1.4. Phổ khối lƣợng củaToluen C7H8 .................................................. 7 Hình 1.5. Phổ hồng ngoại của 7 – hidroxi – 4– metylcoumarin .................. 8 Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC ..................................................... 9 Hình 1.7. Hình ảnh cây đơn đất (Wedelia chinensis) ................................ 12 Hình 3.1. Phổ IR của hợp chất HOA01 ..................................................... 27 Hình 3.2. Phổ MS của hợp chất HOA01 .................................................... 29 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của HOA01 .......................................................... 30 Hình 3.4. Phổ 1H-NMR giãn 1 của HOA01 ............................................... 31 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR giãn 2 của HOA01 ............................................... 31 Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất HOA01 ........................................ 32 Hình 3.7. Phổ DEPT của HOA01 .............................................................. 33 Hình 3.8. Phổ HSQC của hợp chất HOA01 ............................................... 34 Hình 3.9. Phổ HSQC của hợp chất HOA01 ............................................... 34 Hình 3.10. Phổ HMBC của HOA01 .......................................................... 36 Hình 3.11. Phổ HMBC của HOA01 tiếp ................................................... 36 Hình 3.12: Phổ COSY của hợp chất HOA01 ............................................. 37 Hình 3.13: Phổ LC/MS của hợp chất HOA01 ........................................... 38 Hình 3.14. Phổ DEPT của 1P ..................................................................... 39 Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của 1P ............................................................... 40 f
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Phân loại phổ hai chiều (2D) ....................................................... 5 Bảng 2.1. Kết quả chạy sắc ký cột ............................................................. 20 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tách bằng SKLM ................... 25 Bảng 3.2. Bảng dữ liệu phổ quy gán của HOA01 ...................................... 35 Bảng 3.3 . Kết quả phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 1P ............... 41 g
MỞ ĐẦU Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các nhiệm vụ quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta mới có câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lƣợng và phân tích chúng trong các mẫu nghiên cứu thực cũng nhƣ trong đời sống và công nghệ. Để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phƣơng pháp phổ nhƣ phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, phổ khối lƣợng. Mỗi phƣơng pháp cho ph p xác định một số thông tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Đơn đất có tên khoa học là Wedelia chinensis hay còn gọi là cây đơn đất, cây còn có tên gọi khác là đơn kim hoặc đơn buốt tùy theo từng vùng miền gọi khác nhau và thƣờng bị nhầm lẫn với sài đất (Wedelia calendulacea), đƣợc dùng trong dân gian của nhiều địa phƣơng ở Việt Nam nhƣ một vị thuốc quan trọng trong nhiều bài thuốc quý để chữa nhiều loại bệnh thông thƣờng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy cây này có nhiều hoạt tính sinh học quý nhƣ hoạt tính chống ung thƣ, kháng viêm và hoạt tính bảo vệ gan. Nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Phạm Thế Chính trƣờng Đại học Khoa học Thái Nguyên đã bƣớc đầu cho thấy đơn đất là một cây thuốc tiềm năng có nhiều ứng dụng trong dƣợc học và mỹ phẩm. Do có hoạt tính sinh học lý thú, nhiều hợp chất mới đƣợc phát hiện từ cây thuốc này nên đƣợc nhiều nhà Khoa học quan tâm nghiên cứu. Luận văn này tập trung vào phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ đƣợc phân lập từ cây thuốc này bằng các phƣơng pháp phổ hiện đại nhằm đƣa ra đƣợc các chỉ tiêu quan trọng trong việc nghiên cứu phân tích các thành phần hóa học tiếp theo của cây thuốc này. 1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về c c phƣơng ph p c nh cấu tr c 1.1.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)[1,4] Cơ sở của các phƣơng pháp phổ đều dựa trên sự tƣơng tác của từ trƣờng với hạt nhân của các nguyên tố. Tính chất của hạt nhân nguyên tố Nhƣ ta biết, hạt nhân nguyên tử có khối lƣợng, điện tích và liên quan đến tƣơng tác của electron bao quanh hạt nhân nhƣ trung hòa điện tích và tính chất hóa học đặc trƣng của nguyên tử. Hạt nhân của một vài đồng vị tự nhiên của các nguyên tố có momen góc hay momen spin với tổng biên độ ħ√ Hợp phần đo lớn nhất của momen góc là Iћ trong đó ћ = h/2л là hằng số Planck rút gọn. I là số lƣợng tử, có thể là số nguyên hay số bán nguyên (0,1,3/2…). Vì I đƣợc lƣợng tử hóa nên có một dãy các số không liên tục của momen góc đƣợc quan sát và độ lớn của nó bằng ћm , ở đây số lƣợng tử m có thể có các giá trị I, I -1, I-2,… -I. Nhƣ vậy có 2I + 1 giá trị khác nhau của trạng thái spin của hạt nhân với số lƣợng tử I. Hạt nhân nguyên tử ngoài momen spin đƣợc đặc trƣng bằng số lƣợng tử spin còn có momen từ µ đƣợc đặc trƣng bằng số lƣợng tử từ mI thay đổi theo trạng thái spin khác nhau, µ có 2I + 1 giá trị khác nhau. Khi không có từ trƣờng ngoài tác động thì tất cả các trạng thái spin có mức năng lƣợng nhƣ nhau. Tính chất của hạt nhân trong từ trường ngoài Nếu đặt một hạt nhân vào một từ trƣờng của nam châm, thì sinh ra một lực làm lệch hƣớng momen từ của hạt nhân. Khuynh hƣớng lệch là sắp xếp hƣớng momen từ của hạt nhân cùng hƣớng với đƣờng sức của từ trƣờng. Điều này có thể liên hệ với tính chất của một kim nam châm trong từ trƣờng trái đất. Kim nam châm cũng hƣớng theo từ trƣờng trái đất. Nếu 2
nhƣ lệch kim nam châm một góc Φ, rồi thả kim nam châm tự do thì nó sẽ chuyển động trở lại vị trí cân bằng ban đầu (hình vẽ). Hình 1.1 Tính chất của hạt nhân trong từ trường ngoài Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13 C trong phân tử có tần số cộng hƣởng khác nhau. Đặc trƣng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:  TMS  x 6  .10 ( ppm) o νTMS, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ. Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học đƣợc định nghĩa một cách tổng quát nhƣ sau:  chuan  x 6  .10 ( ppm) o νchuẩn, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ. Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hƣởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hƣởng ở trƣờng yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [3]. 3
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết đƣợc loại proton nào có mặt trong chất đƣợc khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà đƣợc tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm. Hình 1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của 2 – etyl phenol Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không tƣơng đƣơng sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hƣởng thành nhiều hợp phần là do tƣơng tác của các hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tƣơng tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tƣơng tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tƣơng tác [3]. Hằng số tƣơng tác spin-spin J đƣợc xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tƣơng tác spin-spin J ta có thể rút ra kết luận về vị trí trƣơng đối của các hạt nhân có tƣơng tác với nhau [2]. Phổ 2D-NMR NMR (nuclear magnetic resonance) là kỹ thuật có giá trị nhất để xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Phƣơng pháp NMR có hạn chế là chỉ áp dụng cho các hạt nhân nguyên tử với số hiệu nguyên tử (số thứ tự Z) lẻ 4
hoặc số khối (A) lẻ vì các nguyên tử loại này có spin hạt nhân thì mới có tính chất từ nhƣ 1H, 13C, 15N, 19F, 31P… Các hạt nhân không có tính từ nhƣ 2D, 12C, 16O, 32S… không thể hiện trên phổ NMR. Hình 1.3.Phổ cộng hưởng từ hai chiều Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (2D - NMR) biểu diễn trên một mặt phẳng, hai trục tọa độ biểu diễn các thông số tùy theo loại phổ nhƣ bảng sau: Bảng 1.1: Phân loại phổ hai chiều (2D) Loại phổ Trục x (nằm Trục y (thẳng ngang) đứng) HOMO2DJ δ1 H(ppm) J1H- 1H(Hz) COSY (hoặc HOMOCOSY,DQF COSY) δ1 H(ppm) δ1 H (ppm) HET2DJ(13C VÀ 1H) δ13C(ppm) J1H- 13C(Hz) HET2DJ (các hạt nhân X khác) δX(ppm) JH- X(Hz) 5
HETCOR (hoặc HETROCOSY) δ13C(ppm) δ1 H(ppm) HSQC, HMBC δ1 H(ppm) δ13C(ppm) COLOC δ13C(ppm) δ1 H(ppm) TOCSY δ1 H(ppm) δ1 H(ppm) 2D- INADEQUATE δ13C(ppm) δ13C(ppm) 1.1.2. Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1,4] Nguyên tắc chung của phƣơng pháp phổ khối lƣợng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dƣơng có số khối z = m/e. Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận đƣợc phổ khối lƣợng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu. Để phá vỡ phân tử ngƣời ta có nhiều phƣơng pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phƣơng pháp ion hóa hóa học (CI), phƣơng pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng electron có năng lƣợng cao để bắn phá phân tử là phƣơng pháp hay đƣợc sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dƣơng hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ: ABC 2e (1) > 95% ABC e 2 ABC 3e (2) ABC- ABC A BC ABC AB B AB A B Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lƣợng bắn phá các phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhƣng với năng lƣợng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dƣơng (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên ngƣời ta thƣờng thực hiện bắn phá các phân tử ở mức năng lƣợng 70 eV. 6
Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phƣơng pháp bắn phá và năng lƣợng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa. Hình 1.4. Phổ khối lượng củaToluen C7H8 Các ion dƣơng hình thành đều có khối lƣợng m và mang điện tích e, tỉ số m/e đƣợc gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định đƣợc xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cƣờng độ I) và số khối z thì đồ thị này đƣợc gọi là phổ khối lƣợng (Hình 1.3). Nhƣ vậy, khi phân tích phổ khối lƣợng ngƣời ta thu đƣợc khối lƣợng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đó có thể xác định đƣợc cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phƣơng pháp phổ với nhau. 1.1.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1,4] Trong số các phƣơng pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất. Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn. Có hai loại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị và biến dạng, 7
dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết. Hình 1.5. Phổ hồng ngoại của 7 – hidroxi – 4– metylcoumarin Đƣờng cong biểu diễn cƣờng độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại đƣợc gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trƣng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định. Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo đƣợc đối chiếu với các dao động đặc trƣng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tƣơng tự nhƣ sự khác nhau của các vân ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thƣờng đƣợc làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau. Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu đƣợc chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trƣng. Các pic nằm trong vùng từ 4000 – 1600 cm-1 thƣờng đƣợc quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, nhƣ OH, NH, C=O, C≡N… nên đƣợc gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 – 626 cm-1 phức tạp hơn và thƣờng đƣợc dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là 8
để xác định nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 đƣợc gọi là vùng vân ngón tay. 1.2. Phân tích hàm lƣợng các chất bằng HPLC [16] Sắc ký lỏng hiệu năng cao đôi khi còn đƣợc gọi là sắc ký lỏng áp suất cao (High - Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích sắc ký, các chất đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thƣờng. Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Sắc ký thƣờng đƣợc hoàn thành trong một thời gian ngắn (khoảng 30 phút). Chỉ những thành phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích đƣợc bằng HPLC. Ngày nay HPLC đã và đang đƣợc sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hóa học nói chung cũng nhƣ trong kiểm tra chất lƣợng thuốc và phân tích sinh dƣợc nói riêng. Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC (1) Bình chứa pha ộng:Máy HPLC thƣờng có 4 đƣờng dung môi vào đầu bơm cao áp cho ph p chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đƣờng là 100%. 9
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đƣờng dung môi cùng một lúc mà thƣờng sử dụng 2 hoặc 3 đƣờng để cho hệ pha động luôn đƣợc pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải. Lƣu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tinh khiết dùng cho phân tích. Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đƣờng nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích. (2)Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tƣợng có thể có nhƣ sau:  Tỷ lệ pha động của các đƣờng dung môi không đúng làm cho thời gian lƣu của peak thay đổi.  Trong trƣờng hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết đƣợc thì bơm cao áp có thể không hút đƣợc dung môi, khi đó ảnh hƣởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC. Trong các trƣờng hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích. (3) Bơm cao p: Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt đƣợc áp suất cao khoảng 250-600bar và tạo dòng liên tục. Lƣu lƣợng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút. (4) Bộ phận tiêm mẫu: Để đƣa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi. Có 2 cách đƣa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (autosamper). (5) Cột sắc ký: Cột chứa pha tĩnh đƣợc coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.Cột pha tĩnh thông thƣờng làm bằng th p không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đƣờng kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0,3-5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký. (6) Đầu dò: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lƣợng. Tùy 10
theo tính chất của các chất phân tích mà ngƣời ta lựa chọn loại đầu dò phù hợp.Tín hiệu đầu dò thu đƣợc có thể là: độ hấp thụ quang, cƣờng độ phát xạ, cƣờng độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…Trên cơ sở đó, ngƣời ta sản xuất các loại đầu dò sau: - Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV - Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại đầu dò thông dụng nhất. - Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang. - Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng qu t chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất. - Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thƣờng dùng đo các loại đƣờng. - Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn. - Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,… (7)Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này đƣợc phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lƣu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak nhƣ tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích. (8) In dữ liệu: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ đƣợc in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển. Ngày nay, phƣơng pháp HPLC đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân tích định tính cũng nhƣ định lƣợng các thành phần trong dƣợc phẩm, thực phẩm, môi trƣờng, hóa chất,… Thiết bị HPLC cũng ngày càng phát triển và hiện đại hơn nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo và sản xuất thiết bị phân tích. Để đảm bảo chất lƣợng kết quả phân tích nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu khác nhau, đáp ứng đƣợc nhu cầu phân tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã đầu tƣ các hệ thống HPLC 11
hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất thiết bị phân tích nhƣ Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex (UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò nhƣ quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion-IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu. 1.3. Đặc iểm cây ơn ất Cây đơn đất có tên khoa học là Wedelia chinensis (W. Chinensis), thuộc họ Cúc (Asteraceae). Cây còn có các tên gọi khác nhau theo từng vùng, miền nhƣ: đơn buốt, đơn kim và cây này rất dễ bị nhầm lẫn với cây sài đất [6]. Hình 1.7. Hình ảnh cây đơn đất (Wedelia chinensis) Đơn đất là một loại cỏ mọc hằng năm, thân cao 0,4 - 1 m. Thân màu xanh có lông trắng cứng nhỏ. Lá mọc đối, gần nhƣ không cuống, phiến lá k p gồm ba lá ch t. Lá ch t hình mác, phía đáy hơi tròn, m p lá có răng 12