Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tiểu đường typ II metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung Luận văn này nghiên cứu phân tích cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tiểu đường typ II metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tiểu đường typ II metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––– TRẦN THỊ BÍCH HẢO PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––– TRẦN THỊ BÍCH HẢO PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI Chuyên ngành: Hoá Phân Tích Mã số: 60 44 0118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM THỊ THẮM THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tới TS. Phạm Thị Thắm - nguyên giảng viên Trƣờng ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên nay là giảng viên Đại học Thủy Lợi đã tin tƣởng giao đề tài, định hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn thạc sỹ này. Tôi xin gửi lời trân trọng cảm tới TS Dƣơng Nghĩa Bang, TS. Phạm Thế Chính cùng các thầy cô khoa Hóa học, Trƣờng ĐH Khoa học- ĐH Thái Nguyên đã ta ̣o điề u kiê ̣n , giúp đỡ tôi trong quá trình tri ển khai nghiên cứu, thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các thầy, cô, cán bộ, kĩ thuật viên Phòng Hóa dƣợc, thuộc Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ dạy và hƣớng dẫn tôi trong quá trình học tập, thực nghiệm và thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè lớp Cao học khóa 2014- 2016 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn. Tác giả luận văn Trần Thị Bích Hảo a Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... a MỤC LỤC ......................................................................................................... b DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ e DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. g MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 2 1.1. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc ..................................... 2 1.1.1. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) .......................................................... 2 1.1.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) ................................ 3 1.1.3. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng (MS) ........................................................ 5 1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........ 7 1.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 7 1.2.2. Phân loại .................................................................................................. 8 1.2.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................. 8 1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo................................................................ 9 1.2.5. Detector dad .......................................................................................... 10 1.2.6. Detector ms ........................................................................................... 11 1.3. Khái quát về bệnh tiểu đƣờng .................................................................. 13 1.3.1. Phân loại bệnh tiểu đƣờng ..................................................................... 13 1.3.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đƣờng huyết ............................................ 14 1.3.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đƣờng ............................. 15 1.3.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng .......................................... 15 1.4. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng metformine hydrochloride ........................ 16 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc.......................................................... 16 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................ 17 Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM ........................................................................ 20 b Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2.1. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 20 2.1.1. Hóa chất và dung môi ........................................................................... 20 2.1.2. Thiết bị xác định và phân tích cấu trúc ................................................. 20 2.1.3. Phân tích xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp đƣợc ........................................................... 21 2.2. Tổng hợp và phân tích cấu trúc của metformine hydrochloride .............. 21 2.2.1. Quy trình tổng hợp metformin hydrochloride....................................... 21 2.2.2. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ IR ............. 22 2.2.3. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ NMR ......... 22 2.2.4. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ MS ............ 22 2.3. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride...................................... 23 2.3.1. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton .................. 23 2.3.2. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH .................. 23 2.3.3. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH .................... 23 2.4. Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp (HPLC) ............................................................................................................ 24 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 26 3.1. Tổng hợp và phân tích cấu trúc metformine hydrochloride .................... 27 3.1.1. Tổng hợp metformin hydrochloride ...................................................... 27 3.1.2. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng pháp IR .... 27 3.1.3. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng pháp NMR ...................................................................................................... 28 3.1.4. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phƣơng pháp MS . 30 3.2. Phân tích tìm kiếm các phƣơng pháp kết tinh metformine hydrochloride để thu đƣợc độ sạch cao nhất ................................................... 31 3.3. Hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp hplc .............. 31 KẾT LUẬN .................................................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 35 PHỤ LỤC c Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
d Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 13 C- NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic Resonance) DMSO Dimethyl sulfoxide 1 H- NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic Resonance) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MS Phổ khối lƣợng va chạm điện tử (Electron Impact-Mass Spectrometry) H, C Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon ppm Phần triệu (parts per million) s singlet dd Double doulet CHCl3 Clorofrom EtOH Ethanol MW Microwave MeOH Methanol OMe Methoxy SOCl2 Sulfonylchlorua e Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid................................................ 16 Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine. .......................................... 16 Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride ............................... 17 Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro .......... 18 Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi...... 18 Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin ........................................ 18 Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin .......................................... 18 Sơ đồ 3.1: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride ................................ 27 f Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol ..................................................... 3 Hình 1.2: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của benzyl axetat ................................ 5 Hình 1.3: Phổ khối lƣợng của benzamit............................................................ 7 Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS. ...................................................................... 9 Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang........................................................ 10 Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector ........................... 11 Hình 2.2: Biểu đồ đƣờng chuẩn. ..................................................................... 25 Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất metformin hydrochloride .............................. 27 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride ........................... 29 Hình 3.3: Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride .......................... 29 Hình 3.4: Phổ MS của metformin hydrochloride............................................ 30 Hình 3.5: Biểu đồ đƣờng chuẩn định lƣợng.................................................... 32 Hình 3.6: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride .............................. 33 g Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU Metformin đƣợc mô tả năm 1957 nhƣ chất có hoạt tính hạ đƣờng huyết và năm 1979 đƣợc đƣa ra thị trƣờng ở Pháp nhƣng đến tận 1994 mới đƣợc FDA cho phép lƣu hành để chữa bệnh tiểu đƣờng Typ 2 ở Mỹ. Metformin là một thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm biguanid, có cơ chế tác dụng khác với các thuốc chống đái tháo đƣờng nhóm sulfonylure. Trƣớc đây, để xác định đƣợc cấu trúc phân tử một hợp chất hữu cơ đặc biệt là cấu trúc và độ sạch của các hợp chất ứng dụng trong dƣợc phẩm không hề đơn giản; có thể mất đến hàng năm hoặc vài năm. Để xây dựng đƣợc tiêu chuẩn của hợp chất chính trong dƣợc phẩm là một công việc cực kì khó khăn và tốn kém. Ngày nay, với các công cụ là các phƣơng pháp phân tích hóa lý hiện đại, việc phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ đã trở thành đơn giản, có khi chỉ tốn thời gian tính bằng giờ. Việc xác định hàm lƣợng và độ sạch của các loại thuốc cũng nhanh hơn nhiều lần do có phƣơng pháp HPLC. Vì vậy, việc phân tích cấu trúc, hàm lƣợng của thuốc điều trị tiểu đƣờng typ II metformin hydrochloride bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại là công việc rất quan trọng, là cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn của sản phẩm và là tiêu chí để đánh giá chất lƣợng giá thành của thuốc. Do đó đề tài nghiên cứu phân tích cấu trúc, hàm lƣợng của thuốc điều trị tiểu đƣờng typ II metformin hydrochloride bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định cấu trúc 1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) Trong số các phƣơng pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất. Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bƣớc sóng khoảng 10-4 đến 10-6 m. Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến. Phần của vùng hồng ngoại đƣợc sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm trong giữa 2,5x10-4 và 16x10-6 m. Đại lƣợng đƣợc sử dụng nhiều trong phổ hồng ngoại là số sóng (cm-1), ƣu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ thuận với năng lƣợng [3]. Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn. Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết. Đƣờng cong biểu diễn cƣờng độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại đƣợc gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trƣng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định, (Hình 1.1). 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo đƣợc đối chiếu với các dao động đặc trƣng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tƣơng tự nhƣ sự khác nhau của các vân ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thƣờng đƣợc làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau [3]. Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu đƣợc chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trƣng. Các pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thƣờng đƣợc quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, nhƣ OH, NH, C=O, C≡N… nên đƣợc gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức tạp hơn và thƣờng đƣợc dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 đƣợc gọi là vùng vân ngón tay [3]. 1.1.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (CHTHN) là phƣơng pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phƣơng pháp phổ biến đƣợc sử dụng là phổ 1H-NMR và 13 C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13 C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trƣờng không đổi thì moment từ của nó có thể định hƣớng cùng chiều hay ngƣợc chiều với từ trƣờng. Đó là spin hạt nhân có tính chất lƣợng tử với các số lƣợng tử +1/2 và -1/2 [2]. Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hƣởng khác nhau. Đặc trƣng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì: 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
 TMS  x 6  .10 ( ppm) o Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ. Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học đƣợc định nghĩa một các tổng quát nhƣ sau:  chuan  x  .10 6 ( ppm) o Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hƣởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hƣởng của máy phổ. Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hƣởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hƣởng ở trƣờng yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [1]. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết đƣợc loại proton nào có mặt trong chất đƣợc khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà đƣợc tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm. 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 1.2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không tƣơng đƣơng sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hƣởng thành nhiều hợp phần là do tƣơng tác của các hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tƣơng tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tƣơng tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tƣơng tác [1]. Hằng số tƣơng tác spin-spin J đƣợc xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tƣơng tác spin-spin J ta có thể rút ra kết luận về vị trí trƣơng đối của các hạt nhân có tƣơng tác với nhau [2]. 1.1.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS) Nguyên tắc chung của phƣơng pháp phổ khối lƣợng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dƣơng có số khối z = m/e. Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận đƣợc phổ khối lƣợng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu [3,4]. 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Để phá vỡ phân tử ngƣời ta có nhiều phƣơng pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phƣơng pháp ion hóa hóa học (CI), phƣơng pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lƣợng cao để bắn phá phân tử là phƣơng pháp hay đƣợc sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dƣơng hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ: ABC 2e (1) > 95% ABC e 2 ABC 3e (2) ABC- Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lƣợng bắn phá các phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhƣng với năng lƣợng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dƣơng (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên ngƣời ta thƣờng thực hiện bắn phá các phân tử ở mức năng lƣợng 70 eV [3]. ABC A BC ABC AB B AB A B Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phƣơng pháp bắn phá và năng lƣợng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa. Các ion ion dƣơng hình thành đều có khối lƣợng m và mang điện tích e, tỉ số m/e đƣợc gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định đƣợc xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cƣờng độ I) và số khối z thì đồ thị này đƣợc gọi là phổ khối lƣợng (Hình 1.3). 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 1.3: Phổ khối lượng của benzamit (C6H5CONH2). Nhƣ vậy, khi phân tích phổ khối lƣợng ngƣời ta thu đƣợc khối lƣợng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định đƣợc cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phƣơng pháp phổ với nhau. 1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 1.2.1. Khái niệm Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lƣợng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng , nhƣ phân tích các hợp chấ t thuốc trừ sâu , thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng… 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1.2.2. Phân loại Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời ta chia HPLC thành 4 loại:  Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).  Sắc ký phân bố (partition chromatography).  Sắc ký ion (ion chromatography).  Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography). Riêng SKPB đƣợc chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tƣơng đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thƣờng - SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo - SKPĐ (reversed phase chromatography). Trong đó, sắc ký pha đảo đƣợc sử dụng nhiều hơn cả. 1.2.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ đƣợc gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:  Pha tĩnh đƣợc giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).  Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography). Trong quá trình sử dụng, ngƣời ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ƣu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau: o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích. o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên ngƣời ta không thể ứng dụng phƣơng pháp rửa giải gradient dung môi. 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Vì vậy, ngƣời ta thƣờng chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này. Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu nhƣ không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl mạch dài nhƣ C8 (n-octyl), C18 (n- octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn nhƣ C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Ngƣời ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại đƣợc sử dụng nhiều nhất. Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS. 1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:  Hòa tan mẫu phân tích.  Phù hợp với đầu dò.  Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.  Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.  Tinh khiết dùng cho sắc ký. Trong sắ c ký pha đảo , dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhƣng kinh nghiệm thực tế cho thấy nƣớc, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất. 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Trong đó nƣớc là một dung môi đƣợc cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải. Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tƣơng tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lƣỡng cực, tính acid hoặc tính base của dung môi. Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớn lên khả năng phân tách của sắc ký. Thông thƣờng pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nƣớc hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan đƣợc trong nƣớc. Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc đƣợc thay đổi theo một chƣơng trình đã định sẵn (chƣơng trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn. 1.2.5. Detector dad Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiện nay có thể lắp 1024 diot) đƣợc sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấm silicon tinh khiết, kích thƣớc 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 - 0,050 mm. Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ thống đƣợc điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện đƣợc tích - 5V. Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện phóng điện. Sự nạp điện lại đƣợc tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo. Kết quả là dòng điện tỷ lệ với lƣợng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ. a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng, c) đường quang phản xạ nhiều lần. Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell) 1.2.6. Detector ms Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện trƣờng hoặc từ trƣờng nhất định. Tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) có ảnh hƣởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết đƣợc điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định đƣợc khối lƣợng của ion đó. Do quá trình phân tích với đầ u dò MS đòi hỏi mƣ́c đô ̣ ch ân không cao, nhiê ̣t đô ̣ cao , các chất khảo sát phải ở trạng thái khí , vâ ̣n tố c dòng chảy nhỏ ; trong khi hê ̣ thố ng LC la ̣i hoa ̣t đô ̣ng ở áp suấ t cao với mô ̣t lƣơ ̣ng dung môi tƣơng đố i lớn , nhiê ̣t đô ̣ tƣơng đố i thấ p , các chất phân tí ch ở thể lỏng . Điều này gây rấ t nhiề u khó khăn trong viê ̣c tim ̀ cách giải quyế t đƣơ ̣c sƣ̣ tƣơng thić h giƣ̃a hê ̣ thố ng sắ c ký lỏng và đầ u dò khố i phổ. 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn