Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Phân tích hàm lượng và cấu trúc của hoạt chất Boterzomib tổng hợp được làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u tuỷ xương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:55

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm cải tiến quy trình tổng hợp Bortezomib làm nguyên liệu thuốc điều trị bênh đa U tuỷ xương; xây dựng phương pháp xác định cấu trúc Bortezomib; xác định hàm lượng của bortezomib bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép detector UV.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Phân tích hàm lượng và cấu trúc của hoạt chất Boterzomib tổng hợp được làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u tuỷ xương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------------------- NGUYỄN TUẤN ANH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC Hà Nội 2019
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------------------------- NGUYỄN TUẤN ANH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG CHUYÊN NGÀNH: HOÁ HỌC MÃ SỐ: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH Hà Nội 2019
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Phân tích hàm lượng và cấu trúc của hoạt chất Boterzomib tổng hợp được làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u tuỷ xương” là do tôi thực hiện với sự hướng dẫn của TS.Đặng Thị Tuyết Anh. Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào. Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá.Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình bày trong luận văn này. Hà Nội, Ngày tháng năm 2019 HỌC VIÊN Nguyễn Tuấn Anh
ii LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Đặng Thị Tuyết Anh Phó phòng Hóa Dược - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các anh, chị và đồng nghiệp phòng Hóa dược - Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành tốt luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hoá Học ,tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại Viện Hoá Học đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn đến đề tài chương trình Hoá Dược Mã số: CNHD.ĐT.076/17-19 để em có thể tham gia và thực hiện luận văn này. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Tuấn Anh
iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.1 TỔNG QUAN VỀ BORTEZOMIB ................................................................ 2 1.1.1 Cấu trúc hoá học .......................................................................................................... 2 1.1.2 Hoạt tính của Bortezomib ......................................................................................... 2 1.2TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI ......................................................................... 3 1.2.1 Phương pháp sắc ký cột ............................................................................................. 3 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................... 6 1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ............................................... 8 1.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS) ....................................................................... 9 1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ................................................... 10 1.3.1 Tính đặc hiệu .............................................................................................................. 10 1.3.2 Độ chính xác ............................................................................................................... 10 1.3.3. Độ đúng ...................................................................................................................... 11 1.4.4. khoảng tuyến tính ..................................................................................................... 11 1.4.5. Miền giá trị ................................................................................................................ 12 1.4.6. Giới hạn phát hiện .................................................................................................... 13 1.4.7. Giới hạn định lượng................................................................................................. 13 CHƯƠNG II ........................................................................................................ 15 THỰC NGHIỆM ................................................................................................. 15 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................................ 15 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 15 2.2.1Chuẩn bị mẫu Bortezomib tổng hợp ............................................................ 15 2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc ............................................................................ 18 2.2.2.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại ..................................................... 18
iv 2.2.2.2 Phương pháp phổ MS ....................................................................... 19 2.2.2.3 Phương pháp phổ NMR .................................................................... 19 2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC ............................................... 19 2.2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký .................................................. 19 2.2.3.2 Chuẩn bị mẫu ................................................................................... 19 2.2.3.3 Tính thích hợp của hệ thống ............................................................. 20 2.2.3.4 Khoảng tuyến tính và miền giá trị .................................................... 20 2.2.3.5 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp .............................. 20 2.2.3.6 Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng ..................................... 21 2.2.3.7 Độ chính xác ..................................................................................... 21 2.2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................ 22 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 23 3.1 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BORTEZOMIB ............................. 23 3.1.1 Xác định cấu trúc của hợp chất 2 .......................................................................... 23 3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất 3 .................................................................................. 24 3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất 4 .................................................................................. 25 3.1.4 Xác định cấu trúc hợp chất Bortezomib 5 ........................................................... 26 3.2 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BORTEZOMIB ........................ 29 3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................... 29 3.2.2 Khoảng tuyến tính ..................................................................................................... 30 3.2.3 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp................................................. 31 3.4.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ......................................................... 32 3.4.5 Độ chính xác ............................................................................................................... 33 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 36 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 39
v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên gọi IR Infrared Spectrometry MS Mass Spectrometry NMR Nuclear Magnetic Resonance 1 1 H-NMR H-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy 13 13 C-NMR C-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocoy HPLC High-performance Liquid Chromatography LDA lithium diisopropylamide THF Tetrahydrofuran MECN Acetonitrile MeOH Methanol EtOAc Ethyl acetate EDCI 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3- HBTU tetramethyluronium hexafluorophosphate 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3- TBTU tetramethyluronium tetrafluoroborate TFA Trifluoroacetic acid HOBt Hydroxybenzotriazole
vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Quy trình phân tách các chất trên sắc ký cột ................................................ 4 Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng ............................................................ 5 Hình 3: Cách tính giá trị Rf ........................................................................................ 6 Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC ................................................................................... 7 Hình 5: Sơ đồ cải tiến tổng hợp Bortezomib ............................................................ 16 Hình 6: 1H-NMR của hợp chất 2 .............................................................................. 23 Hình 7: Phổ 13C- NMR của chất 2............................................................................ 24 Hình 8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 3....................................................................... 24 Hình 9: Phổ IR của hợp chất 4 ................................................................................. 25 Hình 10: Phổ 1H-NMR của hợp chất 4..................................................................... 26 Hình 11: Phổ FTIR của hợp chất 5........................................................................... 26 Hình 12: Phổ 1H-NMR của hợp chất 5..................................................................... 27 Hình 13: Phổ 13C NMR của hợp chất 5 .................................................................... 28 Hình 14: Phổ HRMS của hợp chất Bortezomib ....................................................... 28 Hình 15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ Bortezomib và diện tích pic ............................................................................................................................. 31 Hình 16: Sắc ký đồ HPLC của Bortezomib tại điều kiện tối ưu chất chuẩn ............ 34 Hình 17: Sắc ký HPLC của Bortezomib mẫu tổng hợp ........................................... 34
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống .................................... 29 Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Bortezomib ......................... 30 Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của Bortezomib.................................. 31 Bảng 4: Kết quả khảo sát độ lặp lại tạo LOD .......................................... 32 Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại của Bortezomib ................................ 33
1 MỞ ĐẦU Bortezomib có tên thương mại là velcade là thuốc kháng ung thư thế hệ mới được dùng trong điều trị bệnh đa u tuỷ xương, đa u tuỷ là bệnh ung thư của tương bào trong tuỷ xương. Bệnh chiếm khoảng 10% tổng số các ca bệnh máu ác tính trên toàn thế giới, với khoảng 15.200 trường hợp mắc mới mỗi năm, đứng hàng thứ 2 trong số các bệnh máu ác tính, chi phí điều trị bệnh đa u tuỷ xương ở Việt Nam bằng thuốc bortezomib(velcade) nhập ngoại là rất đắt giá của 1 lọ Velcade 3,5 mg xuất xứ từ Bỉ có giá khoảng 25 triệu đồng / lọ (3,5 mg), từ Pháp - khoảng 22 triệu đồng / lọ 3,5 mg và từ Ấn Độ - khoảng 14 triệu đồng. Ở nước ta hiện nay, trong quá trình tìm hiểu chưa có nghiên cứu nào về việc tổng hợp và phân tích định lượng của bortezomib được công bố, chính vì vậy đề tài đã nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp sản phẩm bortezomib dựa vào các ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp tổng hợp công bố trên thế giới nhằm mục đích tạo điều kiện cho bệnh nhân sử dụng thuốc với giá thành rẻ hơn. Tuy nhiên, để đánh giá độ tinh khiết và hàm lượng sản phẩm bortezomib tổng hợp được chúng tôi đã xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC ghép đầu dò UV. Theo hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài “ phân tích hàm lượng và cấu trúc của hoạt chất Bortezomib tổng hợp được làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u tuỷ xương” với mục tiêu như sau: 1. Cải tiến quy trình tổng hợp Bortezomib làm nguyên liệu thuốc điều trị bênh đa U tuỷ xương 2. Xây dựng phương pháp xác định cấu trúc Bortezomib 3. Xác định hàm lượng của bortezomib bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép detector UV
2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ BORTEZOMIB 1.1.1 Cấu trúc hoá học Tên IUPAC: (R)-3-methyl-1-((S)-3-phenyl-2-(pyrazine-2-carboxamido) propanamido) butylboronic acid Công thức phân tử: C19H25BN4O4 Khối lượng phân tử: 238.237g.mol-1 1.1.2 Hoạt tính của Bortezomib Bortezomib là chất ức chế thuận nghịch hoạt động giống chymotrypsin có thể ức chế các proteasome 25S của tế bào động vật có vú. bortezomib ngăn chặn sự phân giải protein ảnh hưởng đến dòng thác tín hiệu bên trong tế bào, dẫn đến chết tế bào [1-4]. Kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy rằng bortezomib là thuốc độc tính tế bào đối với nhiều loại tế bào ung thư khác nhau. Các nghiên cứu lâm sàng bao gồm nhiều bệnh nhân trên toàn thế giới đã xác nhận hiệu quả và tính năng của Bortezomib trong điều trị cho bệnh đa u tủy. Bortezomib giúp đẩy lùi bệnh một phần hoặc hoàn toàn trong 30-50% các trường hợp. 20% Các
3 trường hợp không đáp ứng bortezomib đơn thuần có thể đáp ứng với điều trị phối hợp bortezomib với dexamethason hoặc melphalan và prednisone Ngoài ra, Bortezomib (Velcade) cũng được dùng để điều trị cho bệnh nhân u lympho tế bào mantle đã nhận được ít nhất 1 đợt điều trị trước đó. Nghiên cứu mới đây của các nhà nghiên cứu Hy Lạp công bố trên tạp chí Arthritis & Rheumatism của Trường ĐH Thấp khớp học Hoa Kỳ (ACR) [5] cho thấy thuốc sinh học bortezomib (Velcade) có thể trở thành thuốc điều trị viêm khớp dạng thấp có triển vọng. 1.2 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI 1.2.1 Phương pháp sắc ký cột Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh. Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột. Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong 4 giờ trước khi đưa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc. Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi. Sau khi đưa chất hấp phụ lên cột, rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không được để khô dung môi trong cột.
4 Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đưa chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ… Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén. Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích. Hình 1: Quy trình phân tách các chất trên sắc ký cột 1.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC) Các bước trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình ): Chuẩn bị bản mỏng:Bản mỏng được bảo quản trong bình hút ẩm. Dùng bút chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đường chấm chất phân tích (cách mép dưới của bản mỏng 1,2 cm), đường giới hạn di chuyển của dung môi (cách mép trên của bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm). Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ, lượng chất phải
5 đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng không quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử. Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy kín và đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết. Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là Ce(SO4)2). Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, kích thước 20×20 cm, dày 0,2 mm. Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dược liệu vì đơn giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao. Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử
6 trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 3). Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf. Hình 3: Cách tính giá trị Rf 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao: (High-performance liquid chromatography); viết tắt: HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột
7 . Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược [6]. Sắc ký có thể được mô tả là một quá trình dịch chuyển khối lượng liên quan tới hấp phụ. HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của các thành phần trong mẫu. Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ. Chất lỏng bị nén là hỗn hợp dung môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha động". Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy ra giữa những thành phần trong mẫu và chất hấp phụ ở cột. Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có khả năng dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200pg, tách những hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như
8 không giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp [7-11]. 1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13 C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13 C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [12]. Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:  TMS  x 6  .10 ( ppm) o Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ. Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa một các tổng quát như sau:  chuan  x 6  .10 ( ppm) o Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ. Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13 C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học
9 của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [13]. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm. Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [13]. Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [12]. 1.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS) Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e. Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu. [10,14]. Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những thông số
10 quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau. 1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 1.3.1 Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác (tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất,…) có trong mẫu thử. Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu: Sắc ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [15-18]. 1.3.2 Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện. Độ chính xác cũng còn được coi là mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so với giá trị trung bình [15-18]. Phương pháp xác định Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%. Yêu cầu Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở
11 giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [19]. 1.3.3. Độ đúng Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần giữa giá trị tìm thấy so với giá trị thực thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [15-18]. Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống. Phương pháp xác định Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau). Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau: Lượng hoạt chất thu hồi Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) = x 100 % Lượng hoạt chất thêm vào Trong đó: 𝑋 là giá trị mẫu đo được µ là giá trị mẫu theo lý thuyết. Yêu cầu Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [15,16]. Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao. 1.4.4. khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x). Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, khoảng tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R2 [15-18]