Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Bước đầu khảo sát nguồn gốc chó Phú Quốc dựa trên vùng nhiễm sắc thể y

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:100

Thêm vào BST

Báo xấu

105
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Bước đầu khảo sát nguồn gốc chó Phú Quốc dựa trên vùng nhiễm sắc thể y tập trung tìm hiểu về kết quả tách chiết và thu nhận DNA tổng số, định loại Haplotype 3 mẫu chó phú quốc bằng trình tự vùng kiểm soát; xây dựng quy trình PCR khuếch đại từng vùng hệ gen NST y của 2 mẫu chó PQ31 và PQ32.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Bước đầu khảo sát nguồn gốc chó Phú Quốc dựa trên vùng nhiễm sắc thể y

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Hà Thị Cầm BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT NGUỒN GỐC CHÓ PHÚ QUỐC DỰA TRÊN VÙNG NHIỄM SẮC THỂ Y LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Hà Thị Cầm BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT NGUỒN GỐC CHÓ PHÚ QUỐC DỰA TRÊN VÙNG NHIỄM SẮC THỂ Y Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN HOÀNG DŨNG TS. CHUNG ANH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2015
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào. Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác, tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định. TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 04 năm 2015 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Hà Thị Cầm
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, con xin gởi đến ba mẹ và các anh chị lời cảm ơn và lòng biết ơn vô vàn. Ba mẹ và anh chị luôn ủng hộ con, cho con niềm tin, nghị lực trong cuộc sống, luôn chăm lo, động viên và hỗ trợ con mọi mặt cả về vật chất lẫn tinh thần. Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Hoàng Dũng – người thầy đã tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong những lúc khó khăn nhất. Trong suốt quá trình làm đề tài thầy luôn nhắc nhở, sửa chữa những sai sót và cũng không ngừng động viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Chung Anh Dũng thuộc Phòng Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam và Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại Viện. Tôi xin trân trọng biết ơn tới quý thầy, cô thuộc Khoa Sinh học và Phòng Đào tạo sau Đại học - Trường Đại học Sư phạm Tp HCM đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành việc báo cáo luận văn này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tất cả các anh, chị, em, bạn bè trong Phòng Genome & Bioinformatic - Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành và Phòng Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài tại Viện. TP Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2015 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Hà Thị Cầm
MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các hình Danh mục các bảng MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN.............................................................................................. 5 1.1. Tổng quan về chó Phú Quốc................................................................................. 5 1.1.1. Phân loại giống chó Phú Quốc Việt Nam .................................................... 5 1.1.2. Đặc điểm giống chó Phú Quốc Việt Nam ................................................... 6 1.1.3. Nguồn gốc của chó Phú Quốc Việt Nam ..................................................... 7 1.1.4. Các nghiên cứu về chó Phú Quốc ở Việt Nam ............................................ 8 1.2. Các nghiên cứu ứng dụng trình tự gene để truy tìm nguồn gốc chó. ................... 9 1.2.1. Genome ty thể và việc sử dụng trình tự genome ty thể trong truy tìm nguồn gốc chó........................................................................................ 9 1.2.2. NST Y và việc sử dụng trình tự NST Y trong truy tìm nguồn gốc chó. ...................................................................................................... 12 1.2.3. Các nghiên cứu ứng dụng trình tự gen để truy tìm nguồn gốc chó Phú Quốc ở Việt Nam. ............................................................................... 15 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................... 17 2.1. Vật liệu – hóa chất.............................................................................................. 17 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 17 2.1.2. Hóa chất ...................................................................................................... 17 2.1.3. Hóa chất tách chiết DNA ............................................................................ 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng ....................................................... 20 2.2.1. Phương pháp thu mẫu – tách DNA tổng số ................................................ 20 2.2.2. Phương pháp điện di agarose ...................................................................... 23 2.2.3. Phương pháp PCR khuếch đại trình tự vùng D-loop .................................. 23 2.2.4. Phương pháp khuếch đại từng vùng NST Y bằng kỹ thuật PCR ............... 25 2.2.5. Phương pháp giải trình tự ........................................................................... 27
2.2.6. Phương pháp hiệu chỉnh trình tự ................................................................ 28 2.2.7. So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank ............................................................ 29 2.2.8. Phương pháp xây dựng bộ dữ liệu DNA .................................................... 29 2.2.9. Phương pháp xây dựng đa dạng di truyền dựa trên cây phát sinh loài ....... 29 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................... 30 3.1. Kết quả tách chiết và thu nhận DNA tổng số ................................................... 30 3.2. Ðịnh loại haplotype 3 mẫu chó Phú Quốc bằng trình tự vùng kiểm soát ........................................................................................................... 31 3.2.1. Thiết lập phản ứng PCR khuếch đại vùng kiểm soát ........................................... 31 3.2.2. Kết quả giải và phân tích trình tự DNA vùng D-loop ......................................... 32 3.2.3. Lắp ráp trình tự ..................................................................................................................... 32 3.2.4. So sánh trình tự truy vấn của các mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu GenBank .................................................................................................................................. 33 3.2.5. Định loại haplotype cho chó Phú Quốc ..................................................................... 34 3.3. Xây dựng quy trình PCR khuếch đại từng vùng hệ gen NST Y của 2 mẫu chó PQ31 và PQ32. ............................................................................................ 36 3.3.1. Xây dựng quy trình khuếch đại từng vùng DNA trên NST Y bằng kỹ thuật PCR ....................................................................................................................... 36 3.3.2. Kết quả giải trình tự các mảnh genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 .................................................................................................................... 49 3.3.3. Lắp ráp trình tự .................................................................................................................. 49 3.3.4. So sánh trình tự truy vấn của các mảnh DNA NST Y nghiên cứu với cơ sở dữ liệu GenBank ........................................................................................... 50 3.3.5. Tổng kết kết quả giải trình tự. ..................................................................................... 51 3.3.6. Phân tích tính đa hình của trình tự NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 ................................................................................................................................. 52 3.3.7. Suy luận haplotype của cá thể PQ31 và PQ32 từ các SNP đã nhận diện .......................................................................................................................................... 54 3.3.8. Bàn luận về nguồn gốc chó Phú Quốc. ................................................................... 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 58 PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair – Cặp base DNA Deoxyribonucleic acid DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribounucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry kb Kilo base mtDNA Mitochondrial DNA – DNA ty thể NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction R Reverse rDNA Ribosomal DNA RNA Ribonucleic acid RNAse Ribounuclease SDS Sodium dodecyl sulfate Tm Melting Temperature TBE Tris/Borate/EDTA TE Tris – EDTA Taq Thermus aquaticus U Unit UV Ultraviolet VKA Vietnam Kennel Association F Forward
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Chó Vện – một trong hai con chó Phú Quốc của Việt Nam tham dự cuộc thi Chó đẹp thế giới tại Paris vào tháng 7/2011 ............................... 5 Hình 1. 2. Các dạng xoáy lưng của chó Phú Quốc .................................................... 6 Hình 2. 1. Vị trí bắt cặp của mồi 15412F và 42R trên vùng D-loop ....................... 23 Hình 3. 1. Kết quả điện di ba mẫu DNA tổng số của chó Phú Quốc ....................... 30 Hình 3. 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D-loop của 3 mẫu chó Phú Quốc ......................................................................................................... 32 Hình 3. 3. Ðại diện một đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát của mẫu PQ19.... 33 Hình 3. 4. Ðại diện một đoạn trình tự đồng nhất vùng kiểm soát của ba mẫu chó khảo sát. ................................................................................................... 33 Hình 3. 5. Kết quả BLAST đại diện của mẫu PQ19 trên NCBI ............................... 34 Hình 3. 6. Phả hệ đồ (phylogeny tree) mô tả chi tiết vị trí phân bố của chó lưng có xoáy Phú Quốc . .................................................................................. 35 Hình 3. 7. Kết quả PCR mảnh 03 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 39 Hình 3. 8. Kết Quả PCR mảnh 11 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 (lần 1) ........................................................................................ 39 Hình 3. 9. Kết quả PCR mảnh 11 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 (lần 2) ........................................................................................ 40 Hình 3. 10. Kết quả PCR mảnh 12 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 41 Hình 3. 11. Kết quả PCR mảnh 16 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 41 Hình 3. 12. Kết quả PCR mảnh 20 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. ................................................................................................. 42 Hình 3. 13. Kết quả PCR mảnh 21 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 42 Hình 3. 14. Kết quả PCR mảnh 24 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 43
Hình 3. 15. Kết quả PCR mảnh 27 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 43 Hình 3. 16. Kết quả PCR mảnh 28 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 44 Hình 3. 17. Kết quả PCR mảnh 29 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 ................................................................................................... 44 Hình 3. 18. Kết quả PCR mảnh 30 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32 ................................................................................................... 45 Hình 3. 19. Kết quả PCR mảnh 31 genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 46 Hình 3. 20. Kết quả PCR mảnh B genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 46 Hình 3. 21. Kết quả PCR mảnh R genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 47 Hình 3. 22. Kết quả PCR mảnh N genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 47 Hình 3. 23. Kết quả PCR mảnh K genome NST Y của 2 cá thể chó PQ31 và PQ32. .................................................................................................. 48 Hình 3. 24. Biểu đồ huỳnh quang đại diện một phần kết quả giải trình tự của sản phẩm PCR bởi cặp primer 03HAf1 và 03r2 của 2 cá thể PQ31 và PQ31 ................................................................................................... 49 Hình 3. 25. Ðại diện một đoạn trình tự đồng nhất mảnh 03 genome NST Y của mẫu PQ31. ............................................................................................... 50 Hình 3. 26. Kết quả BLAST đại diện của mảnh 03 cá thể PQ31 trên NCBI ................ 50
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hóa chất tách chiết DNA ........................................................................... 17 Bảng 2.2. Hóa chất chạy PCR .................................................................................... 18 Bảng 2.3. Hóa chất chạy điện di................................................................................. 18 Bảng 2.4. Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 18 Bảng 2.5. Danh sách của ba mẫu chó sử dụng trong nghiên cứu............................... 21 Bảng 2.6. Cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng khuếch đại vùng gen D-loop ........................................................................................................ 24 Bảng 2.7. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại vùng D-loop .................... 24 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt khuếch đại vùng D-loop ................................................... 24 Bảng 2.9. Tên và trình tự 36 primer sử dụng trong đề tài .......................................... 25 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại từng vùng hệ gen NST Y của chó Phú Quốc sử dụng Taq DNA 2X PreMix - Hãng GeneOn (BC0612).................................................................................................... 27 Bảng 2.11. Chương trình PCR khuếch đại từng vùng hệ gen NST Y của chó Phú Quốc .................................................................................................... 27 Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch DNA của ba mẫu nghiên cứu............................. 31 Bảng 3.2. Các cặp mồi khuếch đại từng vùng DNA trên NST Y .............................. 36 Bảng 3.3. Bảng tóm tắt kết quả giải trình tự sau khi hiệu chỉnh và thống nhất 2 chiều trình tự .............................................................................................. 51 Bảng 3.4. Phân tích biến đổi đơn nucleotide (SNP) của 2 cá thể PQ31 và PQ32 dựa trên trình tự vùng DNA của NST Y. ................................................... 52
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Chó (Canis familiaris) là động vật thuần hóa lâu đời nhất và được cho là đã tiến hóa từ sói (Canis lupus) [34]. Trên toàn thế giới có hơn 400 giống, được nuôi sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Trong đó, chỉ có 3 giống chó có xoáy lưng là giống chó Phú Quốc của Việt Nam, chó xoáy Thái Lan và chó xoáy Nam Phi (Rhodesian Ridgebacks). Với những đặc tính như thông minh, nhanh nhẹn, hình dáng đẹp… chó Phú Quốc hiện đang trở thành một giống chó quý của nước ta. Tuy nhiên, nguồn gốc chó Phú Quốc hiện nay vẫn còn nhiều tranh luận. Ngoài chó Phú Quốc Việt Nam, trên thế giới còn có hai giống chó khác cũng có dải lông xoáy trên lưng là chó xoáy Thái Lan và chó xoáy Rhodesian Nam Phi. Hai giống chó này đã được Liên đoàn Các hiệp hội Nuôi chó giống Quốc tế (Federation Cynologique Internationale - FCI) công nhận. Chó Phú Quốc vì chưa được đăng ký tại FCI nên nhiều nguời cho rằng nó có nguồn gốc từ chó xoáy Thái Lan [36]. Hiện nay, Việt Nam đã có một số nghiên cứu trên chó Phú Quốc. Tuy nhiên, những nghiên cứu này chỉ dừng lại ở việc khảo sát và ghi nhận lại các đặc điểm về hình thái bên ngoài, chưa có nghiên cứu nào đi sâu về mặt di truyền, nghiên cứu ở mức độ phân tử để có thể cho được một kết luận về nguồn gốc chó Phú Quốc mang tính khoa học nhất. Do đó, việc xác định nguồn gốc và bảo vệ nguồn gen chó Phú Quốc là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học. Hơn nữa, việc xác định các kiểu di truyền và tạo lập cơ sở dữ liệu DNA của các giống, loài, đăng kí ở ngân hàng gen thế giới về tài nguyên di truyền động vật đặc hữu của Việt Nam nói chung và giống chó Phú Quốc nói riêng đang là vấn đề rất quan trọng, mang tính khoa học và thực tiễn cao. Các nghiên cứu trên mtDNA của chó, cụ thể là vùng điều khiển (D-loop) đã xác định được 6 nhóm haplotype là A, B, C, D, E, và F [33], trong đó có đến 71,3 % chó mang haplotype A; 95,9 % mang haplotype A, B hoặc C, cả 3 nhóm đều phân bố trên toàn thế giới (trừ nhóm C không có ở Châu Mỹ). Ngược lại, ba nhóm haplotype D, E và F là nhóm hiếm, chỉ chiếm chưa đến 5% cá thể chó trên thế giới và phân bố hạn hẹp
2 ở khu vực Đông Á. Hơn nữa, các nghiên cứu trên mtDNA cũng cho thấy sự đa dạng di truyền cao nhất được tìm thấy trong số những con chó trong khu vực Đông Á, và dữ liệu mtDNA cũng chỉ ra rằng nguồn gốc của những con chó là từ thuần hóa sói trong khu vực Nam Á của Sông Dương Tử (ASY) [33], [27], [18]. Từ năm 2012, Phòng Genomics & Bioinformatics, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể chó Phú Quốc để đánh giá độ đa dạng di truyền chó Phú Quốc giống tại Tp. Hồ Chí Minh” đã cho ra nhiều kết quả nổi bật. Theo đó, chó Phú Quốc mang kiểu gene đơn bội dạng E thuộc là dạng rất hiếm trên thế giới (chỉ chiếm 1-2%) phân bố hạn hẹp ở khu vực Đông Á như ShiBa Nhật Bản, Indo Hàn Quốc, Shar-Pei Trung Quốc và PungSang Triều Tiên. Mặc dù, sử dụng mtDNA cho kết quả xác thực nhưng nó hạn chế là chỉ nghiên cứu trên dòng mẹ. Còn nghiên cứu nguồn gốc theo dòng cha thì không có. Một nghiên cứu gần đây của Ding và cộng sự (2012), trong đó đã dựa trên kiểu di truyền dòng cha phân tích vùng DNA trên NST Y có kích thước 14.437 bp của 151 con chó lấy mẫu trên toàn thế giới và tìm thấy 28 haplotype phân phối trong năm nhóm gen đơn bội, trong đó có hai nhóm chủ yếu giới hạn trong khu vực Đông Á. Đồng thời định loại haplotype đã ghi nhận 1 cá thể chó Phú Quốc nằm trong nhóm H1a là một dẫn xuất của nhóm HG1, trong khi đó 2 cá thể chó Thái Ridgeback mang haplotype H6a và H8a là dẫn xuất từ nhóm HG6. Hai nhóm HG1 và HG6 được cho là xuất phát từ 2 sói đực khác nhau. Điều này gợi ý có vẻ chó Phú Quốc và chó Thái Ridgeback không cùng tổ tiên [10], [14]. Qua đó, nhóm nghiên cứu chúng tôi bắt đầu khảo sát các dữ liệu di truyền theo dòng cha trên chó Phú Quốc để bổ sung các kết quả nghiên cứu trên mtDNA theo dòng mẹ. Từ đó, xác định nguồn gốc của giống chó Phú Quốc, đó là lý do chúng tôi quyết định chọn đề tài “Bước đầu khảo sát nguồn gốc chó Phú Quốc dựa trên vùng nhiễm sắc thề Y”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Bước đầu xây dựng quy trình khuếch đại trình tự từng vùng DNA trên NST Y. - Xác định haplotype của chó Phú Quốc dựa trên trình tự từng vùng DNA trên NST Y.
3 - Phân tích và bước đầu truy tìm nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc. 3. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu máu chó Phú Quốc được thu nhận tại khu vực thành phố Hồ Chí Minh. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Nội dung 01: Thiết lập và tối ưu hóa quy trình khuếch đại từng vùng NST Y của chó Phú Quốc thuộc haplotype E bằng phương pháp PCR. - Tối ưu hóa primer: Sử dụng các primers do Ding và cộng sự (2012) công bố. - Tối ưu hóa về nhiệt độ bắt cặp: Nhiệt độ bắt cặp cần được tối ưu hóa sao cho phù hợp với các primers đặc hiệu để thu được phản ứng PCR cho tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất. - Tối ưu về thời gian kéo dài: Thời gian kéo dài sẽ được hiệu chỉnh theo hướng tăng hoặc giảm thời gian so với công thức lý tưởng để thu sản phẩm PCR tốt nhất. - Nồng độ của DNA khuôn được tối ưu hóa bằng cách thay đổi nồng độ cho đến khi khuếch đại thành công, cả về số lượng lẫn chất lượng sản phẩm PCR thu được. - Số lượng chu kỳ thông thường của một phản ứng PCR là 25-30, tùy theo từng điều kiện cụ thể mà số chu kỳ được hiệu chỉnh để hiệu quả khuếch đại là cao nhất. Nội dung 02: Giải trình tự từng vùng NST Y và hiệu chỉnh trình tự - Sản phẩm PCR sẽ được thu nhận để giải trình tự bằng chính cặp mồi dùng để khuếch đại và các cặp mồi bên trong. - Thông tin trình tự sẽ được thu thập và hiệu chỉnh bằng mắt với sự hỗ trợ của phần mềm SeaView và FinchTV. - Xác lập tính duy nhất của các thông tin DNA trình tự trên bằng thuật toán BLAST và FASTA trên ngân hàng dữ liệu Genbank, (tránh trường hợp tạp nhiễm do đọc trình tự nhầm). - Kiểm tra và chấp nhận kết quả cuối cùng. Nội dung 03: Xác định haplotype của chó Phú Quốc - Xác định tính đa hình dựa trên một nucleotides đơn lẻ (SNP) của từng vùng DNA trên NST Y của chó Phú Quốc đã giải trình tự. - Định loại haplotype của chó Phú Quốc dựa trên các SNP thu được.
4 - Phân tích truy tìm nguồn gốc chó Phú Quốc và quan hệ với chó lưng xoáy Thái Lan. 5. Phạm vi nghiên cứu - Các cá thể chó Phú Quốc mang kiểu gene đơn bội thuộc dòng E. - Phân tích từng vùng DNA của nhiễm sắc thể Y dài 14.437 bp trên hệ gene chó Phú Quốc. 6. Ý nghĩa khoa học của luận văn Đề ra được quy trình khuếch đại trình tự từng vùng DNA của NST Y trên cá thể chó Phú Quốc. Bổ sung dữ liệu, từ đó góp thêm bằng chứng về nguồn gốc chó Phú Quốc.
5 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chó Phú Quốc 1.1.1. Phân loại giống chó Phú Quốc Việt Nam Trong hệ thống phân loại sinh giới, chó Phú Quốc có vị trí phân loại như sau: Giới: Động vật – Animalia Phân giới: Động vật đa bào – Metazoa Ngành: Động vật có dây sống – Chordata Phân ngành: Động vật có xương sống – Vertebrata Lớp: Thú – Mammalia Bộ: Ăn thịt – Carnivora Họ: Chó – Canidae Phân họ: Chó – Caninae Giống: Chó - Canis Linnaeus, 1758 Loài: Chó – Canis lupus Linnaeus, 1758 Phân loài: Chó nhà - Canis lupus familiaris Linnaeus, 1758 Hình 1. 1. Chó Vện – một trong hai con chó Phú Quốc của Việt Nam tham dự cuộc thi Chó đẹp thế giới tại Paris vào tháng 7/2011 [4]
6 1.1.2. Đặc điểm giống chó Phú Quốc Việt Nam Chó Phú Quốc là một trong ba dòng chó có xoáy lông ở lưng trên thế giới. Hai loại chó lông xoáy ở lưng còn lại là chó lông xoáy Rhodesia (còn có tên là Ari ở Nam Phi) và chó lông xoáy Thái. Ở Việt Nam, chó Phú Quốc là một giống chó nguyên thủy, đã được nuôi từ rất lâu trên đảo Phú Quốc, thuộc vùng biển tỉnh Kiên Giang - Việt Nam để hỗ trợ con người đi săn và canh gác. Chó Phú Quốc là vốn quý với nhiều đặc tính nổi bậc mà những giống chó khác không có như: thông minh, nhanh nhẹn, có khả năng đi săn và giữ nhà tốt… [36] Chó Phú Quốc có tầm vóc trung bình, dễ nuôi, thích hợp cho vùng nông thôn, sông nước. Các đặc điểm chính của chó Phú Quốc khác biệt với các giống chó khác: Đầu chó nhỏ phù hợp với sọ dài, tai nhỏ và đứng, mõm đen, mắt nâu. Thân hình thon nhỏ và ngực nở, bụng thon, đặc biệt là chó đực. Bốn chân chó khỏe, các bắp thịt nổi rõ, duỗi thẳng khi đứng và bàn chân có màng phát triển. Đuôi với lông ngắn vót, thường xuyên ở tư thế cong với độ cong từ ½ đến ¼ vòng tròn. Về màu lông, chó Phú Quốc có nhiều màu sắc khác nhau như: đen, nâu, vàng, vện, xám và các màu khác. Nhưng màu phổ biến nhất là đen và vàng chiếm đến 60%. Kiểu lông thẳng chiếm trên 98%. Một đặc điểm khác rất đặc trưng cho chó Phú Quốc được mọi người lưu ý là xoáy trên lưng. Xoáy lưng rất đa dạng và đối xứng theo đường giữa, các dạng thường thấy có thể là hình kim, mũi tên, yên ngựa, cây đàn, chiếc lá (Hình 1.2). Thống kê cho thấy tỉ lệ chó xoáy lưng chiếm 40% trong tổng số quần thể. Hình 1. 2. Các dạng xoáy lưng của chó Phú Quốc [48]
7 Đặc điểm sinh dục và sinh sản của chó Phú Quốc: kết quả điều tra cho thấy tháng lên giống của chó tập trung vào tháng 12 thay vì tháng 8 như các giống chó địa phương thông thường khác. Khả năng sinh con của chó thuộc loại trung bình (4 con/lứa), nhưng khả năng nuôi sống đến cai sữa chiếm đến hơn 96%. Một trong những đặc tính khá quan trọng của chó Phú Quốc là đẻ hang chiếm trên 52% trong tổng số chó được khảo sát. Các bệnh thường gặp ở chó Phú Quốc là bệnh đường ruột và ký sinh trùng. Ngoài ra bệnh dại cũng được tìm thấy khá phổ biến ở chó Phú Quốc. [1] 1.1.3. Nguồn gốc của chó Phú Quốc Việt Nam Chó Phú Quốc là một loài chó riêng của đảo Phú Quốc, do có vị trí địa lý biệt lập với đất liền nên giống chó này không bị lai tạp với các giống chó khác. Chó Phú Quốc là loài bán hoang dã và có tập tính săn bắt độc lập hoặc theo bầy đàn [1]. Hiện nay, giống chó Phú Quốc vẫn chưa xác định được nguồn gốc. Theo Đào Văn Tiến, 1977 cho rằng chó Phú Quốc (Canis dingo) có nguồn gốc của chó Dingo ở châu Úc, nhưng hiện nay có lẽ đã tuyệt chủng [1]. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây của Oskarsson năm 2012 [26] cho thấy chó hoang Dingo Úc và chó Polynesia có nguồn gốc từ chó ở châu Á du nhập vào, nên chó hoang Dingo không thể là tổ tiên của chó Phú Quốc. Hai nhà khoa học người Mỹ là Merle Wood và Merle Hidinger cho rằng trong quá khứ chỉ có chó xoáy Thái Lan và chó xoáy Rhodesian của Nam Phi là có dải lông xoáy trên lưng, vì vậy chó Phú Quốc phải có nguồn gốc từ có xoáy Thái Lan. Họ còn nói hơn 400 năm trước, các ngư dân Thái Lan đã mang chó xoáy Thái Lan đến đảo Phú Quốc và đã trở thành tổ tiên của chó Phú Quốc ngày nay [26]. Giáo sư Dư Thanh Khiêm, Viện trưởng Viện giáo dục Woluwe SaintPierre ở Brussel (Bỉ), một chuyên gia tìm hiểu về chó xoáy Phú Quốc hơn 30 năm không đồng ý với giả thuyết này. Ông cho biết tất cả các cuộc hành trình của người Thái Lan đều được mô tả lại trong cuốn sách „Abrégé de l‘histoire Générale des Voyages bởi Jean-Francoise de la Harpe, một thành viên của hội các học giả Pháp, xác nhận rằng việc các ngư dân Thái có đến đảo Phú Quốc không thấy ghi chép trong quyển sách này. Ngoài ra, khi so sánh về đặc điểm hình thái cho thấy có sự khác biệt giữa chó xoáy Thái Lan và chó Phú Quốc. Chó xoáy Thái Lan có khối lượng trung bình khoảng 23 kg, cao 55 cm, trong khi chó Phú Quốc có khối lượng lớn nhất chỉ 18 kg và cao 48 cm. Nếu suy luận theo giả thuyết nguồn
8 gốc của chó Phú Quốc là từ những con chó xoáy Thái Lan do ngư dân Thái Lan mang đến và để lại trên đảo Phú Quốc, thì với điều kiện tự nhiên của đảo Phú Quốc, một hòn đảo có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn tài nguyên rừng nhiệt đới với nhiều giống loài đa dạng thì nguồn thức ăn cho chó xoáy Thái Lan lưu lại trên Phú Quốc là dồi dào và chó xoáy Thái Lan sẽ không có sự biến đổi về hình dáng nhỏ gọn hơn để phù hợp với việc săn mồi trên đảo Phú Quốc như hình dáng của chó Phú Quốc hiện nay. Vì vậy, giả thuyết trên là không phù hợp. Rất có thể, với những nghiên cứu sâu hơn nữa, cho biết được chó Phú Quốc có thể có một sự phát triển song song với chó xoáy Thái Lan, và muốn biết chính xác hơn thì phải phân tích DNA mới có thể xác định được mối quan hệ của các giống chó này [31], [32]. 1.1.4. Các nghiên cứu về chó Phú Quốc ở Việt Nam Ở Việt Nam, chó Phú Quốc đang rất được nhiều người quan tâm. Năm 2000, tác giả Nguyễn Hữu Chiếm, Nguyễn Văn Biện cùng các cán bộ Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ và Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Kiên Giang thực hiện đề tài “Điều tra, nghiên cứu bảo tồn gen động vật: chó Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang”. Đề tài này được thực hiện từ tháng 10 năm 2000 đến tháng 12 năm 2003. Tổng số 617 con chó với đủ các lứa tuổi đã được khảo sát lấy số liệu. Nội dung nghiên cứu được tập trung trên các yếu tố: ngoại hình, số đo, phương thức chăn nuôi, quản lý, huấn luyện, các bệnh và sự thất thoát. Ngoài ra, đề tài còn phân tích điện di protein của các nhóm chó dựa trên màu sắc của chúng để xác định đặc điểm đa dạng di truyền của quần thể chó Phú Quốc và so sánh với một số giống chó khác trong vùng. Kết quả nghiên cứu cho thấy chó Phú Quốc là vốn quý với nhiều đặc tính nổi bật mà những giống chó khác không có được như: thông minh, nhanh nhẹn, có khả năng đi săn và giữ nhà tốt. [1] Năm 2009, Hoàng Tuấn Thành và cộng sự thuộc Viện Chăn Nuôi đã nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh sản của chó Phú Quốc nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu này sử dụng 40 con chó Phú Quốc được nuôi giữ, bảo tồn tại Thành phố Hồ Chí Minh. Đặc điểm ngoại hình của chó Phú Quốc chủ yếu được phân theo nhóm màu lông: lông ngắn, mượt bao gồm các màu đen – vàng – vện – xám – nhóm màu khác với đặc điểm xoáy lưng chủ yếu là xoáy ngược hình kiếm. Kết quả theo dõi
9 khả năng sinh trưởng và sinh sản đàn chó Phú Quốc như sau: khối lượng cơ thể các giai đoạn sơ sinh – cai sữa – động dục lần đầu – trưởng thành (24 tháng tuổi) của chó đực và cái lần lượt là 0,3 – 1,7 – 15 – 18 kg và 0,2 – 1,5 – 13 – 16 kg. Khi phối giống kép tỷ lệ đậu thai đạt trên 90%. Số lứa đẻ/ năm đạt 1,45 với số con sơ sinh trung bình/lứa là 5,2 con [5]. Cho đến năm 2012 chưa có nghiên cứu nào công bố về việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử trên đối tượng chó Phú Quốc. 1.2. Các nghiên cứu ứng dụng trình tự gene để truy tìm nguồn gốc chó 1.2.1. Genome ty thể và việc sử dụng trình tự genome ty thể trong truy tìm nguồn gốc chó Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen trong tế bào chất nằm ở ty thể, chiếm từ 1 – 5% DNA của tế bào. Kích thước của hệ gen ty thể (mtDNA) ở phần lớn động vật hữu nhũ vào khoảng 16 đến 17.5kb. Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của DNA và mỗi tế bào chứa từ hàng trăm đến hàng triệu ty thể nên số lượng DNA ty thể là rất lớn. Với số lượng bản sao lớn như vậy nên có thể thu được DNA ty thể có giá trị cho các phân tích quan hệ di truyền từ một số lượng ít tế bào. DNA ty thể (mtDNA) có những đặc điểm cơ bản sau: - Tốc độ đột biến lớn gấp 10-25 lần so với hệ gen nhân; - Số lượng bản sao lớn; - Ðơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp; - Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài. Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 – 10 lần so với các gen nhân do cơ chế sửa chữa tái bản DNA không hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị DNA trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong một loài. Bên cạnh đó, các biến dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau. MtDNA có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtDNA thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ.Với những đặc điểm trên, cùng với việc mtDNA bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng nên mtDNA được sử dụng như một công
10 cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi. [28] Phân loại học cổ điển trên các đối tượng thuộc bộ chó chủ yếu dựa vào các đặc điểm màu lông, ngoại hình bên ngoài. Những đặc điểm này có khả năng biến đổi nhanh chóng qua các thế hệ nên không được coi là cơ sở chính xác để xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài. Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã tìm đến những đặc điểm có thể bộc lộ mức độ biến đổi phù hợp hơn cho việc phân tích quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loại ở các loài. Khi đó, mtDNA và đặc biệt là vùng kiểm soát, còn gọi là vùng D-loop, với những ưu điểm nổi bật đã được chọn làm đối tượng nghiên cứu. Thuật ngữ D-loop được dùng để chỉ một vùng có chức năng điều khiển nằm trong mtDNA. Đây là vùng không mã hóa duy nhất trong DNA ty thể và cũng là vùng liên quan đến sự mở đầu tái bản của mtDNA. Ở chó nhà (Canis familiaris), vùng này có kích thước 1270 bp từ vị trí 15458 - 16727 trên ty thể [17], nó chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Về cấu trúc, D-loop của chó có thể được chia làm ba vùng chính là vùng hypervariable region 1 (HV1), hypervariable region 2 (HV2) và một đoạn lặp lại song song khoảng 30 lần. Vùng HV1 nằm ở đầu 5’ vùng điều khiển, kích thước khoảng 650 bp [12], rất đa hình và là mối quan tâm trong pháp y [32]. Vùng HV2 bảo thủ nhất có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân loại học, vùng này chứa các cụm trình tự bảo thủ (hộp F, E, D, C và BSB) [32]. Vùng HV2 nằm ở đầu 3’ của vùng điều khiển, kích thước khoảng 350 bp, vùng này có tốc độ tiến hóa chậm hơn so với vùng HV1 từ 10 đến 20 lần. Giữa vùng HV1 và HV2 là một đoạn trình tự 10 nucleotide lặp lại (5’-GTACACGT(A/G)C-3’) từ vị trí 16.130 - 16.430 bp, số lần lặp đi lặp lại sẽ khác nhau ở một cá thể, nên trình tự đoạn này gây ra khó khăn trong nghiên cứu và thường được loại bỏ khi phân tích di truyền vùng D-loop [25]. Cũng giống như vùng HV1của người, HV1 của chó rất đa hình thường được dùng để phân tích xác định các haplotype trong vùng điều khiển. [32] Như vậy, các gen trong hệ gen ty thể và vùng D-loop đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực phân loại phân tử. Chính vì thế mà