Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển cấu trúc Promoter::Gen-GmNAC (35S::GmNAC004) thông qua vector pZY101- Asc và chủng vi khu n Agrobacterium tumefaciens EHA101 vào giống đậu tương ĐT22 Việt Nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THN MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC (35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc VÀ CHỦNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA101 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THN MAI HƯƠNG

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm : 8420114 Mã số LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN VĂN ĐỒNG

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ một học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2018

Tác giả luận văn

Lê Thị Mai Hương

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo phòng Sau Đại học, thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập cũng như khi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Chương trình Khoa học và Công

nghệ độc lập cấp nhà nước trong đề tài mã số 03/2012/HĐ-ĐTĐL.

Cuối cùng tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè lời cảm ơn thân thương nhất - những người đã luôn quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận này, cũng như trong cuộc sống.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 2018

Học viên

Lê Thị Mai Hương

MỤC LỤC

i

ii

iii v

vi vii

1 1

LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………….…….. LỜI CẢM ƠN………………………………………………...…………...…... MỤC LỤC………………………………………………………….…………. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT………………………..……. DANH MỤC BẢNG.………………………………………………….……… DANH MỤC HÌNH…………………………………………………..……….. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU………………………………………………..……… 1.1. Đặt vấn đề…….………………………………………………………... 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài....................….……………………...... 1.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài.................................

3 3

4 4

4 7 9

10 15

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………...…..... 2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trong và ngoài nước.………………….... 2.1.1. Giới thiệu chung về cây đậu tương…….......................................... 2.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới……………………..… 2.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam.……………………….. 2.1.4. Tình hình phát triển và ứng dụng cây đậu tương chuyển gen trên thế giới và tại Việt Nam…..………………………………………...…… 2.2. Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương…………………...…………… 2.2.1. Chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn A. tumefaciens….. 2.2.2. Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương………………………………………………………......

15 19

27 27 27 27

30

32

35 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….…. 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu…………...………………………… 3.2. Nội dung nghiên cứu.…….……………………………………….…… 3.3. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………..…... 3.4. Phương pháp nghiên cứu………..……………………………………... 3.4.1. Phương pháp biến nạp ………………………………………….… 3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây ở thế hệ T0……...... 3.4.3. Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử bằng phun Basta……….. 3.4.4. Phương pháp thu thập và phân tích số liệu thống kê..…………….

36

iii

37

40 42 42 43

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………….…………… 4.1. Kết quả biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22………………………………………………………………………. 4.2. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen bằng phun Basta..............………….. 4.3. Kết quả phân tích PCR cây chuyển gen thế hệ T0.….……………...…. 4.3.1. Phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar......……..………... 4.3.2. Phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc 35S::GmNAC004. 4.4. Kết quả chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử………………………

45

51 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………….......... 5.1. Kết luận…………………………………………………....................... 5.2. Đề nghị………………………………………………............................

51

52 53 60

DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN…………....... TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………….................................. PHỤ LỤC…………………………………………………...............................

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Dichlorophenoxyacetic acid Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic

2,4-D ADN ARN AS BĐG CCM cDNA CNSH CTAB CS DMSO DW

EDTA GM IBA LB NBT OD600 PCR RT PCR RM RWC SDS

SEM

SIM SSC TL

TT TW

v/ p

Acetosyringone Biến đổi gen Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy Complementary DNA Công nghệ Sinh học Hexadecyltrimethylammonium bromide Cộng sự Dimethyl sulfoxide Dry weight - Trọng lượng khô Ethylendiamin Tetraacetic Acid Germination medium - Môi trường nảy mầm hạt Indol butyric acid Luria-Bertani Nitrotetrazolium Blue chloride Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600 nm bằng quang phổ kế Polymerase Chain Reaction Real-time PCR Rooting medium - Môi trường ra rễ Relative water content - Hàm lượng nước tương đối Sodium dodecyl sulfate Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi Saline-sodium citrate Trọng lượng Thứ tự Turgid weight - Trọng lượng trương vòng/ phút Weight - Trọng lượng Yeast extract peptone - Môi trường nuôi khuẩn

W YEP

DANH MỤC BẢNG

4

8 8 9

23 28 35

35

38

39 40 41

44 45 46

46 47

Bảng 2.1. Các giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây đậu tương…………...... Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới ………………………….... Bảng 2.3. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới…... Bảng 2.4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam ……………………....… Bảng 2.5. Một số nghiên cứu về vai trò của các gen GmNAC................................. Bảng 3.1. Thông tin về vector pZY101::35S::GmNAC004…………………..… Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu…………………..... Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR…………………………………………. Bảng 4.1. Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101………………………………………. Bảng 4.2. Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101- Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101………………………………….. Bảng 4.3. Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……… Bảng 4.4. Kết quả phun basta các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004………………………………………………………………. Bảng 4.5. Kết quả phân tích PCR các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 thế hệ T0…………………………………………………..... Bảng 4.6. Kết quả sàng lọc và đánh giá các dòng đậu tương sau chuyển gen bằng phun Basta đến thế hệ T3……………………………………………………...... Bảng 4.7. Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T1………………………........ Bảng 4.8. Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T2………………………........ Bảng 4.9. Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T3………………………........

DANH MỤC HÌNH

28

30

37 38 39

40

41 42 43

44 48

49 49

50 Hình 3.1. Hạt đậu tương giống ĐT22………………………….……………… Hình 3.2. Cấu trúc vector pZY101::35S::GmNAC004………………………... Hình 4.1. Kết quả biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào nốt lá mầm của giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101 ……………………………………………………..… Hình 4.2. Kết quả mẫu tạo đa chồi trên môi trường SIM…………...………… Hình 4.3. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi trên môi trường SEM…………. Hình 4.4. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp sử dụng cấu trúc gen 35S::GmNAC004 và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……... Hình 4.5. Kết quả chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ Basta cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004…………………………………………..…….. Hình 4.6. Kết quả kiểm tra chất lượng ADN tổng số của các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 ………………………………………... Hình 4.7. Phân tích PCR gen bar trên các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004…………………………………………………………..…... Hình 4.8. Kết quả phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen T0………………………………………...……………. Hình 4.9. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen đồng hợp đến thế hệ T3………… Hình 4.10. Các dòng đậu tương được chuyển gen 35S::GmNAC004 sống sót sau phun basta được chăm sóc đến khi ra hoa, kết quả………........................... Hình 4.11. Phân tích PCR gen bar trên các cây đậu tương chuyển gen T1....... Hình 4.12. Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T1.....………………………………………………... Hình 4.13. Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T2…………………………………………………… Hình 4.14. Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T3……………………………………………………

50

vii

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Đậu tương (Glicine max (L.) Merr.) thuộc họ Đậu (Fabacea), bộ

Fabales, là cây trồng lấy hạt và là cây cho dầu quan trọng bậc nhất trên thế

giới, do khả năng thích ứng rộng nên cây đậu tương được trồng khắp các

châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ với sản lượng đậu tương

thu được chiếm 85,4% tổng sản lượng đậu tương trên toàn thế giới, tiếp đến

là Châu Á đạt 12,1% (FAOSTAT, 2016). Tại Việt Nam, đậu tương là cây

thực phẩm có vai trò quan trọng nhưng năng suất cây trồng này còn thấp,

chưa thể đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước. Nguyên nhân gây ảnh

hưởng lớn đến năng suất và sản lượng đậu tương của Việt Nam là do các

bệnh dịch hại, sâu bệnh và chủ yếu là do hạn hán.

Trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện tích khô hạn,

nhiễm mặn ngày một tăng. Việc nghiên cứu các đáp ứng của cây lương thực,

bao gồm cây đậu tương, trồng trong điều kiện môi trường thiếu nước, mặn,

lạnh… ngày càng trở nên quan trọng (Petit và cộng sự, 1999; Manavalan và

cộng sự, 2009; Tran và Mochida, 2010). Một trong những kỹ thuật luôn mang

lại nhiều kỳ vọng đó là nghiên cứu, phát triển giống đậu tương biến đổi gen dựa

trên việc phân lập các gen có lợi và thiết kế các véc tơ hiệu năng cao để chuyển

các gen mục tiêu vào giống đậu tương xác định.

Các yếu tố phiên mã NAC (NAM, ATAF và CUC) đã được báo cáo là

tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng đối với các điều kiện bất thuận

như hạn, mặn và lạnh (Tran et al., 2010). Theo nghiên cứu mới nhất của Reem

M. Hussain và cộng sự (2017), đã xác định được 139 gen GmNAC, nghiên

cứu cụ thể 28 gen GmNAC chọn lọc kết quả cho thấy biểu hiện gen GmNAC

phụ thuộc vào kiểu gen; 8 trong số 28 gen chọn lọc (GmNAC004,

GmNAC021, GmNAC065, GmNAC066, GmNAC073, GmNAC082,

GmNAC083 và GmNAC087) đã được phát hiện có mức độ biểu hiện cao ở

các giống đậu tương chịu hạn.

Tại Việt Nam, định hướng nghiên cứu về giống đậu tương Việt Nam

chuyển gen chịu hạn còn khá mới. Cho tới nay, tất cả các công trình biến nạp

gen vào đậu tương mới chỉ thành công trên giống mô hình như G. max 'Jack',

Williams. Do có sự khác biệt về nguồn gốc nên hầu hết các giông mô hình

khó ra hoa kết quả tại Việt Nam. Giống đậu tương ĐT22 do Trung tâm

Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo được công nhận là giống mới

(Quyết định số 219 QĐ/BNN-KHCN ngày 19/01/2006) đã được trồng khá

phổ biến ở các vùng Hà Nội, Hà Nam, Thái Bình, Vĩnh phúc, Cao bằng, Sơn

La, Bắc Cạn, Điện Biên… và cho năng suất từ 18-27 tạ/ha, tùy thuộc vào

mùa vụ và điều kiện thâm canh. ĐT22 thích hợp gieo trồng trong cả 3 vụ

trong năm có khả năng kháng bệnh phấn trắng và chống đổ tốt nhưng khả

năng chịu hạn lại kém. Theo nghiên cứu của phòng Thí nghiệm Trọng điểm

Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã chỉ ra rằng khả

năng tiếp nhận gen cũng như khả năng tái sinh cây sau chuyển gen của giống

ĐT22 cao hơn so với các giống đậu tương hiện có của Việt Nam.

Xuất phát từ tình hình thực tế nêu trên và dựa trên các công bố mới nhất

về chức năng và tiềm năng ứng dụng của hệ thống gen GmNAC, chúng tôi

đã tiến hành thực hiện đề tài đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc

Promoter::Gen-GmNAC (35S::GmNAC004) thông qua vector pZY101-

Asc và chủng vi khu(cid:13)n Agrobacterium tumefaciens EHA101 vào giống

đậu tương ĐT22 Việt Nam”.

1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài

Mục đích:

Chuyển cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 bằng kỹ

thuật biến nạp gen.

Yêu cầu của đề tài:

- Biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông

qua vector pZY101-Asc và chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA101.

- Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây ở thế hệ T0.

- Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử bằng phun thuốc diệt cỏ

Basta.

1.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài

Ý nghĩa khoa học:

Đề tài cho thấy một hướng đi mới trong công tác chọn tạo giống cây

trồng bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens khác

xa với các phương pháp chọn giống truyền thống.

Ý nghĩa thực tiễn:

Các giống đậu tương chuyển gen tạo ra từ kết quả của đề tài có thể sử

dụng làm vật liệu khởi đầu trong công tác chọn tạo giống chống chịu tốt với

điều kiện bất lợi của môi trường mang thương hiệu Việt Nam.

Tính mới của đề tài:

Đề tài là công trình nghiên cứu đầu tiên về khả năng tiếp nhận cấu trúc

gen 35S::GmNAC004 trên cây đậu tương giống ĐT22.

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trong và ngoài nước

2.1.1. Giới thiệu chung về cây đậu tương

2.1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu tương

Đậu tương hay còn gọi là đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine

max (L.) Merr. Căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng

nhiễm sắc thể, đậu tương được xếp vào Bộ Fabales, Họ Fabaceae, Phân họ

Leguminosae, Chi Glycine (Ngô Thế Dân, 1999).

Đậu tương là cây họ đậu mùa hè hàng năm, thân thẳng đứng gồm thân

chính và các cành, lá và thân thường có lông, hoa màu tía hoặc trắng, chùm

hoa sinh ra ở nách lá trên một cây có thể có rất nhiều hoa, nhưng chỉ 2/ 3

hoặc 3/ 4 số hoa đậu quả và quả cũng có lông tơ. Quả màu vàng rơm nhạt

đến đen, có 3-4 hạt, đôi khi 5 hạt. Hạt đậu tương có các màu sắc khác nhau

tùy thuộc vào giống như màu trắng, vàng nhạt, xanh, nâu và đen, và loại hạt

nhiều màu. Rốn hạt cũng có màu sắc khác nhau như vàng, da bò, nâu và đen,

rễ có nốt sần cố định đạm. Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu

tương được chia làm hai giai đoạn chính là: (1). Giai đoạn phát triển sinh

dưỡng; (2). Giai đoạn sinh sản. Trong từng giai đoạn trải qua các bước khác

nhau được tóm lược như sau:

Bảng 2.1. Các giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây đậu tương

Giai đoạn sinh dưỡng

VE Xuất hiện – lá mầm trồi lên khỏi mặt đất

Giai đoạn sinh dưỡng

VC Unrolled unifoliolate leaves – phát triển của lá mầm

V1 Lá kép đầu tiên – một tập hợp lá chét

V2 Lá kép thứ hai – hai tập hợp lá chét

V4 Lá kép thứ bốn – bốn tập hợp lá chét

V(n)

Lá kép thứ n – Giai đoạn V tiếp tục với sự phát triển của số lá chét. Số lá chét cuối cùng phụ thuộc vào giống đậu tương và các điều kiện môi trường.

Giai đoạn sinh sản

R1 Bắt đầu ra hoa – cây có ít nhất một bông hoa trên đốt bất kỳ.

R2 Đầy đủ hoa - có một hoa nở tại một trong hai đốt trên cùng

R3 Bắt đầu có quả– các quả dài 5 mm tại một trong 4 đốt trên cùng

R4 Đầy đủ quả– các quả dài 2 cm tại 1 trong 4 đốt trên cùng

R5 Bắt đầu hạt – hạt dài 3 mm trong các quả ở một trong 4 đốt trên cùng của thân chính

Hạt hoàn chỉnh - quả có chứa một hạt giống màu xanh lá cây lấp đầy dung lượng quả tại một trong bốn đôt cao nhất trên thân chính

R7 Bắt đầu chín - một quả bình thường trên thân chính đã đạt đến màu sắc chín của giống

R8 Quả chín - 95% vỏ quả đã đạt đến màu sắc chín của giống

2.1.1.2. Giá trị của cây đậu tương

Vai trò của cây đậu tương đối với đời sống của con người:

Cây đậu tương đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người bởi nó

là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu đạm, giàu chất béo, giàu

các chất khoáng và các vitamin. Hàm lượng protein trung bình khoảng 35,5-

40 % trong khi đó, hàm lượng protein trong gạo chỉ từ 6,2-12 %, ngô từ 9,8-

13,2 %, thịt bò 21 %, thịt gà 20 %, cá từ 17-20 % và trứng từ 13-14. Hàm

lượng lipit trung bình từ 15-20 % và thành phần chủ yếu là các axit béo

không no khoảng 60-70 % có hệ số đồng hóa cao và mùi vị thơm như axit

linoleic khoảng 52-65 %, oleic khoảng 25-36 %, linolenolic khoảng 2-3 %

(Trần Văn Điền, 2007). Ở các nước Châu Á (Nhật Bản, Hàn Quốc...), đậu

tương góp phần trong việc sản xuất các thức ăn cổ truyền như đậu phụ,

tương miso, xì dầu shoyu... Ngày nay, sự tiêu thụ các sản phẩm từ đậu tương

có xu hướng tăng lên trên toàn cầu, vì chúng có nhiều lợi ích như làm giảm

lượng cholesterol, phòng chống các bệnh ung thư, đái tháo đường, béo phì

và bảo vệ cơ thể chống lại các bệnh về đường ruột và thận (Friedman và

Brandon, 2001).

Vai trò của cây đậu tương với ngành công nghiệp:

Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau: chế

biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt

lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không. Tuy nhiên, đậu tương chủ yếu

được dùng làm nguyên liệu để ép dầu: hiện nay trên thế giới đậu tương là

cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, chiếm 50% tổng lượng

dầu thực vật (Trần Văn Điền, 2007).

Vai trò của cây đậu tương với ngành nông nghiệp:

Trong nông nghiệp, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, với tỉ lệ

1 kg hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Các bộ phận

thân, lá, rễ, quả, hạt của cây đậu tương đều có hàm lượng đạm khá cao cho

nên các sản phẩm phụ như thân, lá tươi và nghiền khô đều là thức ăn tổng

hợp cho gia súc. Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh

dưỡng khá cao (N: 6,2 % ; P2O5: 0,7 % ; K2O: 2,4 %) và cũng được dùng sản

xuất thức ăn cho gia súc. Ngoài ra, đậu tương còn là cây luân canh cải tạo

đất tốt. Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây

trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng vụ sau, góp phần tăng năng

suất cả hệ thống cây trồng đồng thời giảm chi phí cho việc bón nitơ. Thân, lá

đậu tương có thể dùng để bón ruộng thay phân hữu cơ bởi hàm lượng nitơ

trong thân chiếm 0,05 %, trong lá chiếm 0,19 % (Trần Văn Điền, 2007).

2.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Cây đậu tương có trị kinh tế và khả năng thích nghi rộng trong các điều

kiện môi trường khác nhau nên được xem là một trong những loại cây trồng

chiến lược, được trồng rộng rãi trên toàn thế giới, đứng ở vị trí thứ 4 chỉ sau

cây lúa, cây ngô và cây lúa mì. Đậu tương được trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ

chiếm tỷ lệ 85,4 %, tiếp đến là Châu Á chiếm tỷ lệ 12,1 % (FAOSTAT,

2016). Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp

Quốc, diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng khoảng 16,18 triệu ha

trong vòng 4 năm trở lại đây, năm 2012 đạt 105,35 triệu ha, năm 2016 tăng

lên 121,53 triệu ha. Tuy diện tích gieo trồng đậu tương tăng đều qua các năm

nhưng sản lượng đậu tương trên thế giới chỉ có xu hướng tăng nhẹ. Năm

2012 sản lượng đậu tương trên thế giới đạt 241,16 triệu tấn, năm 2013 sản

lượng tăng lên 277,54 triệu tấn, năm 2014 sản lượng tiếp tục tăng lên 306,37

triệu tấn, năm 2015 sản lượng đậu tương có xu hướng tăng đạt 323,20 triệu

tấn, tới năm 2016 sản lượng tăng nhẹ đạt 334,89 triệu tấn cao nhất trong 5

năm gần đây (Bảng 2.2).

Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Năm

2012 2013 2014 2015 2016 Diện tích gieo trồng (triệu ha) 105,35 111,01 117,63 120,79 121,53 Năng suất (tạ/ ha) 22,89 24,99 26,04 26,76 27,56 Sản lượng (triệu tấn) 241,16 277,54 306,37 323,20 334,89

(Nguồn FAOSTAT, 2016)

Năng suất đậu tương trên thế giới cũng chỉ dao động nhẹ, năm 2016 đạt

27,56 tạ/ ha cao nhất trong năm năm qua. Bốn quốc gia sản xuất nhiều đậu

tương nhất là Mỹ, Brazil, Argentina và Ấn Độ cũng có những biến động về

sản lượng đậu qua các năm. Mỹ là nước có diện tích gieo trồng và sản lượng

đậu tương lớn nhất, năm 2016 diện tích đạt 33,48 triệu ha và sản lượng đạt

117,21 triệu tấn (Bảng 2.3).

Bảng 2.3. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới

Năm Quốc gia

2014

2015

2016

Mỹ Brazil Argentina Ấn Độ Mỹ Brazil Argentina Ấn Độ Mỹ Brazil Argentina Ấn Độ

Diện tích gieo trồng (triệu ha) 33,42 30,27 19,25 11,09 33,12 32,18 19,33 11,67 33,48 33,15 19,50 11,50

Năng suất (tạ/ ha) 31,98 28,66 27,74 9,36 32,29 30,29 31,76 7,34 35,00 29,05 30,15 12,18

Sản lượng (triệu tấn) 106,88 86,76 53,39 10,37 106,95 97,46 61,39 8,57 117,21 96,29 58,79 14,01

(Nguồn: FAOSTAT, 2016)

Có nhiều nguyên nhân gây ra sự không ổn định về năng suất và sản

lượng đậu tương, ngoài các yếu tố dịch bệnh, yếu tố kỹ thuật, tình hình biến

đổi khí hậu và hạn hán là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất đậu

tương trên toàn thế giới.

2.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Tại Việt Nam, đậu tương là cây trồng quan trọng thứ ba (sau lúa và

ngô). Đậu tương cung cấp protein chủ yếu trong bữa ăn hàng ngày của người

Việt Nam, đồng thời còn là nguồn thức ăn chính cho sự phát triển ngành

chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản. Tuy nhiên, ngành nông nghiệp Việt

Nam hoạt động chủ yếu bằng phương pháp canh tác truyền thống nên năng

suất cây trồng thấp và sản xuất còn nhỏ lẻ. Hàng năm, Việt Nam nhập khẩu

một lượng lớn đậu tương từ các quốc gia khác trên thế giới. Theo Bộ Nông

nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2016 Việt Nam đã nhập khẩu 1,56 tấn

đậu tương.

Hiện nay, cây đậu tương đang được trồng tại 25 tỉnh thành trong cả

nước, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía

Nam, khu vực trồng đậu tương chính tập trung ở vùng Đồng bằng sông

Hồng. Diện tích canh tác đậu tương ngày càng bị thu hẹp, bên cạnh đó sản

lượng đậu tương qua các năm tương đối đồng đều nhưng tổng sản lượng

chung qua các năm biến động và theo chiều hướng giảm (Bảng 2.4).

Bảng 2.4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Năm

2011 2012 2013 2014 2015 2016

Diện tích gieo trồng (Nghìn ha) 181,1 119,6 117,8 109,4 100,8 94,0

Sản lượng (Nghìn tấn) 266,9 173,5 168,3 156,5 146,4 147,5

Năng suất (Tấn/ha) 1,47 1,45 1,43 1,43 1,45 1,57

(Nguồn:Tổng cục thống kê Việt Nam - GSO)

Trải dài trên 15 vĩ độ Bắc, Việt Nam có địa hình phức tạp và đa dạng

khí hậu. Khí hậu Việt Nam phân chia thành 2 mùa rõ rệt: mùa mưa khoảng 6

- 8 tháng, từ tháng 5 - 6 đến tháng 9 - 11, mùa khô kéo dài 5 - 6 tháng tiếp

theo. Việt Nam có khoảng 9,6 triệu ha đất canh tác, khoảng 2,5 triệu ha đất

có tưới dành cho cây lúa còn lại có tới 70% đất canh tác nhờ nguồn nước

mưa tự nhiên. Các nhà khoa học trên thế giới và trong nước khẳng định Việt

Nam là một trong năm nước bị ảnh hưởng nặng nề nhất của biến đổi khí hậu

và mực nước biển dâng. Nhiệt độ tăng và lượng mưa thay đổi sẽ ảnh hưởng

nền nông nghiệp và nguồn nước. Thay đổi chế độ mưa có thể gây lũ nghiêm

trọng vào mùa mưa, và hạn hán vào mùa khô. Trong các thiên tai ở Việt

Nam, khô hạn đã gây nhiều thiệt hại cho sản xuất nông nghiệp làm giảm

năng suất tới 70 - 80%, gây thất thu rất lớn cho sản xuất và thu nhập của

nông dân. Chọn tạo thành công các giống đậu tương 3 vụ có tính thích ứng

rộng năng suất cao là một bước tiến quan trọng của ngành chọn giống ở

nước ta, song trong điều kiện sản xuất nhờ nước mưa, năng suất của các

giống chỉ phát huy được 1/2 tiềm năng, vì vậy rất cần thiết phải phải nghiên

cứu chọn tạo các giống đậu tương chịu hạn bằng kỹ thuật di truyền để vừa

mở rộng diện tích, tăng sản lượng đồng thời giảm thiểu tổn thất cả về số

lượng cũng như chất lượng của đậu tương trước và sau thu hoạch, góp phần

nâng cao chất lượng sản phẩm, giá trị hàng hoá, tăng hiệu quả kinh tế cho

người sản xuất.

2.1.4. Tình hình phát triển và ứng dụng cây đậu tương chuyển gen trên thế

giới và tại Việt Nam

Tính đến năm 2016, đã có 404 sự kiện chuyển gen vào cây trồng đã được

tạo ra, hầu hết các sự kiện chuyển gen tập trung vào đối tượng cây ngô (148 sự

kiện), bông (58 sự kiện), khoai tây (45 sự kiện), cải dầu (38 sự kiện), đậu tương

đứng thứ 5 với 34 sự kiện chuyển gen. Các giống đậu nành chuyển gen chiếm

50% diện tích canh tác cây trồng chuyển gen trên toàn thế giới. Thống kê tỉ lệ

diện tích canh tác đối với từng loại cây trồng, đậu tương đứng thứ nhất với

78%, 64% bông, 26% ngô và 24% hạt cải dầu được trồng trên toàn thế giới là

các giống chuyển gen. Các quốc gia canh tác 90% đậu tương chuyển gen là

Hoa Kỳ, Brazil, Argentina, Canada, Nam Mỹ và Uruguay (ISAAA, 2016). Lợi

ích thu được từ đậu tương chuyển gen trong 20 năm từ 1996 đến năm 2015 là

52,4 tỷ đô la Mỹ và 5,05 tỷ đô la Mỹ chỉ riêng cho năm 2015.

Các tính trạng chuyển gen vào đậu tương đã được áp dụng và thương mại

hóa chủ yếu là tính trạng kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ. Tổng diện tích

trồng đậu tương chuyển gen trên thế giới năm 2016 đạt 91,4 triệu hecta bao

gồm 68 triệu hecta kháng thuốc trừ cỏ, và 23,4 triệu hecta đậu tương đa tính

trạng. Theo thống kê mới nhất của ISAAA năm 2017, trong 37 sự kiện chuyển

gen vào đậu tương được công bố chỉ có 1 sự kiện chuyển gen chịu hạn duy

nhất: IND-ØØ41Ø-5 mang gen Hahb-4 (có nguồn gốc từ cây hoa hướng

dương - Helianthus annuus) đã được thương mại hóa tại Argentina năm

2015.

Sự kiện toàn bộ hệ gen của đậu tương đã được giải trình tự, cùng với nó

là hàng trăm gen điều khiển tính chịu hạn, mặn, lạnh… ở thực vật nói chung

và ở đậu tương nói riêng đã được phát lộ. Và đặc biệt, dòng đậu tương có

khả năng kháng hạn rất cao đã được tạo ra khi chúng được biến nạp gen điều

khiển At DREB2A sẽ là cơ sở và động lực hết sức quan trọng trong việc thúc

đẩy quá trình nghiên cứu và chọn tạo các giống đậu tương biến đổi gen có

khả năng chống chịu lại các điều kiện bất lợi (lạnh, hạn, mặn) hiện nay.

Tại Việt Nam, công tác nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng triển khai

chậm hơn so với thế giới hàng chục năm. Một số công trình chuyển gen ban

đầu chỉ được tiến hành nghiên cứu lẻ tẻ tại một số phòng thí nghiệm:

Từ năm 2006, cây trồng biến đổi gen đã được Nhà nước đầu tư nghiên

cứu với quy mô tập trung hơn sau khi "Chương trình trọng điểm phát triển và

ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông

thôn đến năm 2020" được phê duyệt. Các cây trồng được ưu tiên nghiên cứu để

biến đổi gen là lúa, ngô, bông, đậu tương - là những cây lương thực, thực phẩm

quan trọng nhất ở Việt Nam. Hàng năm, nước ta đang phải nhập khẩu nhiều

triệu tấn nên việc tăng sản lượng những cây trồng này là nhu cầu rất cấp bách.

Nhiều phòng thí nghiệm thuộc các viện nghiên cứu chuyên ngành về

CNSH, các trường Đại học như Viện Công nghệ Sinh học, Viện Di truyền

Nông nghiệp, Viện Sinh học Nông nghiệp, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Lúa

Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp

Nha Hố, Đại học Lâm nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên… đã nhanh chóng

triển khai các nghiên cứu chuyển gen ở những loại cây trồng nói trên trong thời

gian qua và đã có báo cáo kết quả ban đầu trong nghiên cứu cây chuyển gen ở

Việt Nam như sau:

- Viện Công nghệ Sinh học đã phân lập được gen EPSPS kháng thuốc

trừ cỏ Glyphosate từ chủng vi khuẩn Agrobacterium CP4, tổng hợp yếu tố

chloroplast transit peptide và thiết kế vector biểu hiện mang cấu trúc 35S-

CTP-EPSPS-Cmyc-Nos để chuyển vào các dòng ngô Việt Nam. Chuyển

thành công gen mã hóa kháng nguyên của vỏ protein của virus đốm vòng

vào cây đu đủ, tạo ra các dòng đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng.

- Viện Di truyền Nông nghiệp đã nghiên cứu chuyển gen kháng sâu

cry1A(c) vào phôi non của các dòng ngô mô hình, dòng ngô chọn lọc bằng

phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Các dòng ngô chuyển gen kháng sâu thế hệ T0-T4 nhận được đã được sàng

lọc, đánh giá mức độ ổn định và biểu hiện của gen chuyển. Bước đầu đã thu

nhận được một số dòng ngô chuyển gen ổn định và đang duy trì, đánh giá

trong điều kiện nhà lưới cách ly vật lý. Tại đây, vector biểu hiện mang cấu

trúc promoter FMV và gen kháng thuốc diệt cỏ EPSPS cũng đã được thiết kế

và chuyển vào các giống đậu tương của Việt Nam (DT2008 và ĐT26).

Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống

bệnh cúm ở gia cầm cũng được thực hiện với mục đích sử dụng thực vật

chuyển gen để sản xuất vaccine dùng qua đường miệng thay thế cho vaccine

tiêm và giảm giá thành vaccine. Kết quả đã thu được các dòng bèo tấm

Wolffia australiana mang gen kháng nguyên VP2 của virus Gumboro,

bèo L. gibba, L. minor, và S. polyrrhiza mang gen kháng nguyên HA1

của virus H5N1. Một số dòng bèo tấm chuyển gen thu được đã có biểu

hiện protein sau khi cho gà ăn dịch bèo tấm chuyển gen.

- Viện lúa ĐBSCL đã nghiên cứu chuyển nạp gen kháng sâu soycry1Ac

(pPTN791) và vip3A (pPTN-vip3A) vào 2 giống đậu tương nhập nội

(Maverick, Williams 82) và giống đậu tương Việt Nam (MTĐ176, PC19)

thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả đã tạo được các dòng chuyển

gen mang gen kháng sâu soycry1Ac chọn lọc qua các thế hệ từ T0 đến T5

bằng các phân tích Southern blot, RT-PCR và Western blot (dòng T5). Qua

đánh giá tính kháng sâu trong nhà lưới, một số dòng biểu hiện tính kháng sâu

cao đã được xác định, trong đó có các dòng chuyển gen mang gen kháng sâu

soycry1Ac nhưng không mang gen chỉ thị chọn lọc bar.

- Viện Nghiên cứu Bông đã nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1A(c)

vào cây bông bằng phương pháp vi tiêm hoặc thông qua vi khuẩn A.

tumefacien.

- Viện Nghiên cứu Hệ gen: Gen mã hóa chitinase - có hoạt tính kháng

nấm TcChi1, với các kích thước khác nhau (vùng mang mã có kèm hoặc

không kèm vùng 5’) đã được nghiên cứu tách dòng thành công trong vector

pJET1.2 và xác định trình tự hoàn chỉnh (vùng mang mã có kích thước 1159

bp). Tạo được vector biểu hiện thực vật pCB301 mang gen mã hóa chitinase

TcChi1 được điều khiển biểu hiện bởi CaMV35S promoter để chuyển vào

một số dòng ca cao (Theobroma cacao L.) có giá trị thương mại đang được

canh tác ở Việt Nam.

Trong lĩnh vực biến nạp gen ở đậu tương, một số nghiên cứu đã được tiến

hành thành công ở nhiều trung tâm, viện nghiên cứu như Viện Di truyền

Nông nghiệp, Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, Viện Công nghệ Sinh

học:

-Viện Công Nghệ Sinh học đã thực hiện các nghiên cứu cấp cơ sở: Nghiên

cứu và hoàn thiện kỹ thuật biến nạp gen ở cây đậu tương (2005 - 2006); Phát

triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục

vụ cho biến nạp gen của Nguyễn Thị Thúy Hường và cộng sự (2009).

- Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu vào đậu tương được triển khai tại

Viện Di truyền Nông nghiệp (Nguyễn Văn Đồng và CS, 2012a; Nguyễn Anh

Vũ và CS, 2013b) và Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long (Trần Thị Cúc

Hoà và CS, 2013). Các đề tài nghiên cứu này tập trung vào chuyển gen

nguồn gốc Bt bao gồm các gen cry1Ac, cry2Aa, cry4A và vip3A vào giống

đậu tương nhập nội Williams 82, Maverick và giống đậu tương Việt Nam

MTĐ176.

- Các công trình nghiên cứu của các tác giả trong nước về tách chiết

phân lập gen, đánh giá khả năng tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương

đã được triển khai và bước đầu thu được một số kết quả (Nguyễn Văn Đồng

và CS, 2012a, 2012b, 2013a, 2013b; Nguyễn Anh Vũ và CS, 2013a, 2013b;

Trần Thị Cúc Hoà, 2013).

Hướng nghiên cứu phân lập, tách chiết các gen điều khiển tính chống

chịu hạn ở lúa, ngô, đậu tương ... thiết kế các vector phục vụ chuyển gen vào

thực vật đã được tiến hành tại một số phòng thí nghiệm của Viện Di truyền

Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học. Các nghiên cứu đã phân lập được

hàng loạt các gen điều khiển tăng cường tính chịu hạn: OsDREB1A,

OsDREB2A, ZmDREB2A, OsDREB2A-2ACA, OsNAC1, OsNac5, OsNAC6,

OsNac10, OsAREB1A, OsRap2.4A, OsRap2.4B, OsNLI-IF, GmMYB,

GmGLP1, GmCHS7, Os06g46270, Os04g23910, Os08g02070 và

Os10g39310.

Tại viện Lúa ĐBSCL, vector mang gen chịu hạn drebIA (pPTN-rd29A-

DREBIA) được thiết kế và chuyển nạp vào 2 giống đậu tương nhập nội

(Maverick, Williams 82) và giống đậu tương Việt Nam (MTĐ176, PC19)

bằng phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium. Đã xác định được

các dòng T0 mang gen chịu hạn drebIA và tiếp tục chọn lọc, đánh giá trong

điều kiện nhà lưới.

Các nghiên cứu bước đầu về khả năng chịu nóng, chịu hạn các dòng/

giống đậu tương Việt Nam của các nhóm nghiên cứu của Trần Thị Phương

Liên, Chu Hoàng Mậu đã chỉ ra sự cấp thiết của việc chọn tạo ra các giống đậu

tương chống chịu với các điều kiện bất lợi tại Việt Nam. Tuy vậy, các nghiên

cứu trên chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá sơ bộ khả năng chống chịu hạn và ở

một số lượng nhỏ các giống đậu tương. Do vậy, cần phải tiến hành mở rộng các

nghiên cứu để đánh giá thêm các nguồn gen chống chịu ở đậu tương một cách

toàn diện, đặc biệt ở các giống đậu tương địa phương và các giống có tiềm

năng kinh tế.

2.2. Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương

2.2.1. Chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khu(cid:22)n A. tumefaciens

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật đã được

nghiên cứu và ứng dụng vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: chuyển gen

thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen trực tiếp bằng

súng bắn gen, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen bằng vi tiêm,… Nhưng

cùng với phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen thì phương pháp

chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là một trong hai

phương pháp chuyển gen thành công nhất và được ứng dụng nhiều nhất.

Phương pháp này sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens như một vector sinh

học để chuyển một đoạn DNA của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả tạo

được cây biến đổi gen (Hooykaas and Schilperoort, 1992; Zambryski, 1998).

Vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vị trí bị tổn

thương. Khi bị tổn thương, mô thực vật sẽ tiết ra một số hợp chất phenol,

hợp chất này đóng vai trò dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciens biểu hiện vùng

gen Vir nằm trên Ti-plasmid (Hooykaas and Beijersbergen, 1994). Kết quả

biểu hiện gen Vir, sợi đơn T-DNA sẽ được chuyển và tổng hợp trong hệ gen

thực vật. Vấn đề chính của phương pháp chuyển gen này là làm thế nào để

có thể kết hợp giữa tế bào chủ với vector tương ứng.

Mặc dù ban đầu đậu tương không phải là đối tượng được xem xét để

lây nhiễm với vi khuẩn (Cleene and Ley, 1976) cho tới khi Pederson và CS

(1983) đã chứng minh đậu tương là vật chủ thích hợp với loại vi khuẩn này.

Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen vẫn bị kiểm soát bởi yếu tố giống (Parrott et

al., 1989; Delzer et al., 1990). Mặt khác, khả năng thu được các chồi chuyển

gen từ những khối mô có khả năng tái sinh như phôi vô tính và nốt lá mầm

ban đầu rất thấp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiều

nghiên cứu nhằm tối ưu quy trình như: bổ sung hợp chất có vai trò xúc tác

như acetosyringine để kích thích sự biểu hiện của gen Vir, L-cystein (Parrott

et al., 1989), thiol (Olhoft and Somers, 2001) hoặc sử dụng các chủng vi

khuẩn có khả năng gây độc tính cao (Hansen et al., 1994), xác định các yếu

tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm (Meurer et al.,

1998; Paz et al., 2006), cải tiến nốt lá mầm làm vật liệu biến nạp (Paz et al.,

2006), kết hợp lây nhiễm với tái sinh (Chee et al., 1989). Vấn đề khác khi sử

dụng vi khuẩn A. tumefacines còn phụ thuộc vào chủng khuẩn (Mello-Farias

et al., 2008), số lượng bản sao ADN được tổng hợp trong hệ gen thực vật,

pH môi trường (Santarem et al., 1997), mức độ gây tổn thương của mẫu

(Stachel et al., 1985).

Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tạo ra bằng phương

pháp nốt lá mầm sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens làm trung gian được báo

cáo vào năm 1988. Nốt lá mầm của giống Peking được lây nhiễm với chủng

vi khuẩn A. tumefaciens mang gen chỉ thị gus, gen kháng kanamycin và

glyphosate. Mẫu được nuôi cấy trong môi trường có chứa BAP để cảm ứng

tạo chồi, kanamycin cùng với các kháng sinh khác có tác dụng loại bỏ lượng

vi khuẩn còn lại sau khi đồng nuôi cấy. Sau một vài tháng, cây con được tái

sinh và được kiểm tra thông qua sự biểu hiện của gen gus hoặc khả năng

kháng glyphosate. Chỉ 6% tổng số chồi lựa chọn được chuyển gen. Tám cây

được tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng có một sợi ADN được

chèn vào. Mặc dù sự biến nạp cho hiệu quả không cao nhưng báo cáo chỉ ra

rằng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen của một giống đậu tương khi được

lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp.

Gần đây vi khuẩn A. tumefaciens và phương pháp chuyển gen bằng nốt

lá mầm cũng được sử dụng để chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus

Bean Pob Mottle (một loại virus gây bệnh đốm vỏ trên hạt đậu) vào đậu

tương (Di et al., 1996). Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây

chuyển gen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau được tạo ra từ 400 lá mầm ban

đầu. Phân tích Southern cho thấy sự tích hợp gen BPMVCP-P vào bộ gen và

thể hiện qua các cây T1. Khoảng 30% cây T2 có nguồn gốc từ 1 dòng chuyển

gen ban đầu được xét nghiệm ELISA (Enzym-linked Immuno Sorbent

Assay) cho thấy khả năng kháng hoàn toàn với virus này. Tình trạng hình

thái không bị biến đổi so với thế hệ T1.

Parrott và CS (1989) đã đưa ra phương pháp chuyển gen khác đó là sử

dụng vi khuẩn A. tumefaciens lây nhiễm với mẫu mô lá mầm hạt non để tạo

phôi vô tính sau đó tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ba cây chuyển gen có

chứa gen zein kích thước 15kb được hình thành. Tuy nhiên, những cây

chuyển gen này đều bị khảm và khi phân tích các cây ở thế hệ sau không

thấy có một cây nào có chứa gen zein 15kb.

Một phương pháp mới và có khả năng cho hiệu quả hơn đã được phát

triển để biến nạp vi khuẩn A. tumefaciens mang gen vào thẳng tế bào mô

đích. Kỹ thuật mới này gọi là SAAT (Sonicate Assiisted Agrobacterium -

media transformation) (Trick and Finer, 1997). Sử dụng SAAT với nuôi cấy

huyền phù phát sinh phôi vô tính đã cho hiệu quả chuyển gen ổn định và

không có hiện tượng thể khảm. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian

nuôi cấy cộng sinh mô thực vật với Agrobacterium được rút ngắn. Với kỹ

thuật hiển vi điện tử quét, nhóm tác giả khám phá ra SAAT, tạo ra những

rãnh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép A. tumefaciens dễ

dàng đi vào mô đích mong muốn không giống như phương pháp chuyển nạp

gen khác. Sử dụng kỹ thuật SAAT để chuyển gen vào đỉnh sinh trưởng đã

làm gia tăng hiệu quả chuyển nạp gen tạm thời trong nhiều cơ quan như: lá,

nốt lá mầm, phôi hữu tính, phôi vô tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể hiện

GUS tăng gấp 100-400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa (cowpea), cây

vân sam trắng (white spuruce), lúa mì, ngô và đậu tương, đồng thời gen

chuyển nạp tương đối ổn định qua các thế hệ. Cũng với phương pháp trên

Meurer et al., (1998) áp dụng trên 28 giống đậu tương. Nhóm tác giả cho

rằng, dễ thực hiện thành công phương pháp SAAT thì cần khảo sát các yếu

tố như: chủng vi khuẩn, xác định tế bào chủ và khả năng tiếp nhận gen của

mô mong muốn. Với phương pháp SAAT, chọn những cụm phôi có 10-20

phôi (đường kính 2-4 mm) được lây nhiễm với 1ml dịch khuẩn A.

tumefaciens có nồng độ OD600 = 0,1-0,5 trong thời gian 0-300 giây. Sau 2

ngày trên môi trường lây nhiễm có 0,1mM Acetosyringone mẫu được

chuyển lên môi trường chứa 400 mg/l timetin. Hai tuần sau khi SAAT,

chuyển mô sang môi trường có 20 mg/l hygromycin và 400 mg/l Timentin.

Những dòng chuyển gen được quan sát và phân lập trong khoảng 6-8 tuần

sau khi SAAT. Kỹ thuật này cho hiệu quả chuyển gen cao hơn so với các

phương pháp chuyển gen khác. Mở ra một hướng mới sử dụng vi khuẩn A.

tumefaciens để biến nạp gen cho các mô đích khác nhau.

Công nghệ biến nạp gen ở đậu tương đã được rất nhiều nhà khoa học

trên thế giới nghiên cứu và cải tiến, trong đó các nghiên cứu của các tác giả

Olhoft (2003; 2004), Paz và Wang (2006; 2009), Kijong Lee và cộng sự

(2011) đã sử dụng phương pháp biến nạp gen vào nốt lá mầm của đậu tương.

Một số tác giả khác như Noriyuki Furutani và Soh Hidaka (2004) cũng thử

biến nạp gen qua mô sẹo đậu tương, tuy nhiên hiệu quả thu được chưa cao.

Phương pháp biến nạp gen vào nốt lá mầm đậu tương thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens vẫn là phương pháp có hiệu quả nhất hiện nay.

2.2.2. Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở

cây đậu tương

Trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện tích khô hạn,

nhiễm mặn ngày một tăng. Việc nghiên cứu các đáp ứng của cây lương thực,

bao gồm cây đậu tương, trồng trong điều kiện môi trường thiếu nước, mặn,

lạnh… ngày càng trở nên quan trọng (Petit et al., 1999; Manavalan et al.,

2009; Tran and Mochida, 2010). Bởi không phải bất kỳ loài thực vật nào

cũng có khả năng tự mình chống chịu lại với điều kiện hạn hán, do đó việc

tìm ra những gen có khả năng kháng hạn, phân lập và chuyển vào cây trồng

quan tâm đang được tiến hành ở hầu hết các phòng thí nghiệm về thực vật.

Cho tới nay, có rất nhiều công bố liên quan tới việc phân lập tách chiết cũng

như chuyển thành công đoạn gen kháng hạn vào cây trồng nói chung và cây

đậu tương nói riêng.

Khi gặp điều kiện bất lợi - hạn, mặn, lạnh, cây trồng thường có những

phản ứng sinh lý đa dạng, phức tạp để thích nghi và tồn tại (Manavalan et

al., 2009). Khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi (hạn, mặn, lạnh) ở cây

trồng nói chung và ở đậu tương nói riêng là tính trạng được kiểm soát bởi

nhiều gen (Dorothea Bartels et al., 2005). Tuy nhiên, những công trình

nghiên cứu về cơ chế phân tử của khả năng chống chịu hạn ở thực vật trong

các năm gần đây đã chỉ ra rằng: trong số hàng trăm gen tham gia vào quá

trình chịu hạn của thực vật, được chia thành hai nhóm: Nhóm 1 - Gen điều

khiển (gen tổng hợp protein điều khiển quá trình phiên mã - transcription

factor, kinase...) và nhóm 2 - Gen chức năng (gen tham gia vào quá trình

tổng hợp photphatases, protease, late embryogenesis abundant (LEA), các

protein sinh tổng hợp amino acids, đường: proline, mannitol, sorbitol) làm

cho thực vật tạo ra hàng loạt phản ứng sinh hoá và sinh lí để tồn tại và thích

nghi (Hardiato and Tran, 2011). Cụ thể, khô hạn, mặn, lạnh sẽ làm cho thực

vật đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong

các mô thực vật, quá trình sinh trưởng chậm lại, hệ rễ phát triển xuyên sâu

và lan rộng để hút nước... (Manuela et al., 2003; Manavalan et al., 2009).

Một điều hết sức thú vị là trong điều kiện bất lợi như lạnh, hạn, mặn chỉ

cần một gen điều khiển hoạt động nó sẽ kích hoạt hàng loạt các gen chức

năng hoạt động để bảo vệ cây trồng. Điều này đồng nghĩa với việc chỉ cần

biến nạp một gen điều khiển tính chịu hạn, mặn và lạnh từ “cây cho” sang

“cây nhận” thì xác suất bắt gặp “cây nhận” có khả năng chịu hạn, mặn và

lạnh là rất cao.

Protein kinases, bao gồm histidine kinase và protein kinase kích hoạt sự

phân bào (mitogen-actived protein kinase MAPK), đóng vai trò quan trọng

trong quá trình dẫn truyền tín hiệu ngoại bào và tiến triển của quá trình phát

triển tế bào (Tran et al., 2007; Hadiarto and Tran, 2011). Nghiên cứu của

Nishihama và CS (2002) đã chỉ ra rằng một protein MAPK kinase kinase

(MAPKKK) điều khiển bởi gen NPK1 có vai trò quan trọng trong quá trình

phân bào. Một nghiên cứu khác đã chỉ ra biểu hiện của MAPKKK có khả

năng làm kích hoạt tín hiệu quá trình oxy hoá trong tế bào từ đó dẫn đến cải

thiện khả năng chống chịu với điều kiện lạnh, hạn, mặn ở cây thuốc lá

chuyển gen (Kovtun et al., 2000). Năm 2004, Shou và CS đã chuyển thành

công đoạn cDNA mã hoá NPK1 vào cây ngô nhằm nghiên cứu biểu hiện của

gen. Kết quả cho thấy NPK1 tăng cường khả năng chịu hạn ở cây ngô

chuyển gen, trong điều kiện hạn, cây ngô chuyển gen cho thấy khả năng

quang hợp cao hơn hẳn cây không chuyển gen.

Năm 2007, các tác giả Nelson và cộng sự đã công bố giống ngô biến

đổi gen mang gen điều khiển tính chịu hạn ZmNF-YB2 (maize CAAT box

transcription factor) của công ty Monsanto - Mỹ cho năng suất cao gấp hơn

hai lần so với đối chứng khi thử nghiệm trên đồng ruộng Châu Phi. Chun-

Rong Wang và CS (2008) đã tạo được dòng ngô biến đổi gen mang gen điều

khiển tính chịu hạn phospholipase C1 (ZmPLC1) cho kết quả chịu hạn tốt…

Lần đầu tiên trên thế giới, dòng đậu tương biến nạp gen điều khiển At

DREB2A (dehydration responsive element biding protein) có khả năng

kháng hạn rất cao đã được tạo ra.

Gen GmDREB2 và gene P5CR là hai trong số các gen có chức năng

chịu hạn đã từng được nghiên cứu và biến đổi ở cây đậu tương (Chen et al.,

2007); (Ronde et al., 2004). Cả hai gen GmDREB2 và P5CR, viết tắt lần lượt của Dehydration Responsive Element Binding protein và L-∆1-Pyrroline-5-

Carboxylate Reductase, đều có mặt tự nhiên trong hệ gen của đậu tương

(Delauney and Verma, 1990). Trong điều kiện hạn hán, gen GmDREB2 được

kích hoạt biểu hiện và mã hóa cho một yếu tố phiên mã có khả năng liên kết

với yếu tố di truyền DRE của nhiều gen tham gia vào phản ứng chịu hạn,

góp phần kích hoạt phản ứng thích ứng với môi trường thiếu nước. Chính từ

đặc điểm này, các nhà nghiên cứu đi đến hướng tăng cường sự biểu hiện của

gen GmDREB2 nhằm nâng cao tính chống chịu trong điều kiện môi trường

thiếu nước ở thực vật, mà Arabidopsis chính là một ví dụ liên quan. Trong

khi đó, theo Ronde và cộng sự (2004), với việc chuyển thêm bản copy của

gen P5CR vào trong cây, đậu tương được xác định có khả năng chống chịu

với hạn hán tốt hơn. Theo nghiên cứu này chỉ ra rằng số lượng gen P5CR có

mối liên hệ đến hàm lượng nước trong tế bào, cũng như hàm lượng proline

tự do. Lý do cây chịu hạn tốt hơn là vì proline tự do sẽ liên kết và làm ổn

định màng tế bào.

Các yếu tố phiên mã NAC (NAM, ATAF và CUC) đã được báo cáo là

tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng đối với các điều kiện bất thuậ

như hạn, mặn và lạnh (Tran et al., 2010). Các nghiên cứu sâu về yếu tố NAC

trên một số cây trồng đã đưa ra giả thuyết là ít nhất có 105 yếu tố phiên mã

NAC ở cây Arabidopsis, 140 ở cây lúa, 205 ở cây đậu tương và 152 ở cây

thuốc lá (Fang et al., 2008; Mochida et al., 2009; Ooka et al., 2003; Rushton et

al., 2008). Cùng với việc khám phá ra khả năng sử dụng các gen NAC để làm

tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất thuận ở cây mô hình

Arabidopsis, rất nhiều nghiên cứu ứng dụng thành công gen NAC trên các cây

trồng bằng kỹ thuật biến đổi gen đã được công bố (Hu et al., 2006).

Nhóm nghiên cứu của Xiong - Trung tâm Quốc gia về nghiên cứu thực

vật Trung Quốc - đã phân lập gen OsNAC1 và biến nạp vào lúa. Cây lúa

được biến nạp gen tăng cường tính chịu hạn, mặn và qua phân tích

microarray thì sự biểu hiện của gen ngoại sinh SNAC1 đã hoạt hoá hàng loạt

gen liên quan tính chịu hạn, mặn. Kết quả thử nghiệm trên đồng ruộng cho

thấy các cây lúa được biến nạp gen SNAC1 cho năng suất cao hơn 22-34 %

so với các cây đối chứng ở điều kiện hạn (Hu et al., 2006). Tương tự, nhóm

nghiên cứu của Shinozaki đã phân lập và nghiên cứu đặc tính của gen

OsNAC6 và cho kết quả các cây lúa được biến nạp gen đã tăng cường tính

chịu hạn, mặn và lạnh. Đặc biệt, ngoài việc tăng cường tính chống chịu với

bất lợi thời tiết, cây lúa được biến nạp gen OsNAC6 còn tăng cường tính

kháng bệnh bạc lá so với các cây đối chứng (Nakashima et al., 2007). Kết

quả này tương đồng với nghiên cứu khoa học của tác giả Ohnishi về đặc tính

của OsNAC6 (Ohnishi et al., 2005).

Từ năm 2009, chức năng của nhóm gen GmNAC được các nhà khoa học

tập trung nghiên cứu nhiều hơn (Bảng 2.5).

Bảng 2.5. Một số nghiên cứu về vai trò của các gen GmNAC

Gen

Áp lực môi trường

Tham khảo

GmNAC1 GmNAC2

Pinheiro, G.L. et al. (2009) Pinheiro, G.L. et al. (2009)

GmNAC3 GmNAC4

ABA Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu, mặn, lạnh, ABA, JA PEG, mặn, ABA, JA ABA Hạn, mặn, lạnh Hạn, mặn, lạnh, ABA Hạn, mặn, lạnh, ABA

Pinheiro, G.L. et al. (2009) Tran, L.S.P. et al. (2009) Tran, L.S.P. et al. (2009) Tran, L.S.P. et al. (2009)

Đáp ứng với sự mất nước

Le, D.T. et al. (2011)

Đáp ứng với sự mất nước, Phytophthora sojae

GmNAC46 GmNAC002 GmNAC003 GmNAC004 GmNAC006, GmNAC019, GmNAC023, GmNAC029, GmNAC038, GmNAC039, GmNAC041, GmNAC044, GmNAC050, GmNAC051, GmNAC052, GmNAC055, GmNAC057, GmNAC061, GmNAC062, GmNAC084, GmNAC091, GmNAC092, GmNAC095, GmNAC099, GmNAC0102 GmNAC007, GmNAC011, GmNAC018, GmNAC030, GmNAC043, GmNAC085, GmNAC101, GmNAC109,

Gen

Áp lực môi trường

Tham khảo

Hạn, muôi

Tran, L.S.P. et al. (2009)

GmNAC148 GmNAC010 GmNAC012

Hạn,mặn, ABA

GmNAC011 GmNAC020

Hao, Y-J. et al. (2011) Tran, L.S.P. et al. (2009); Hao, Y-J. et al. (2011)

Hạn, mặn, lạnh

Tran, L.S.P. et al. (2009)

GmNAC013, GmNAC015, GmNAC028, GmNAC006 GmNAC2

Hạn

Pereira, S.S. et al. (2011)

Lu và cộng sự (2012) đã phân lập và nghiên cứu chức năng đặc trưng của

gen ZmNAC1 từ ngô. Phân tích sự biểu hiện cho thấy gen ZmNAC1 có khả

năng thích nghi cao với nhiệt độ thấp, nồng độ muối cao, stress hạn và xử lý

với ABA, nhưng khả năng điều hòa giảm xuống khi xử lý với salicylic acid.

Khi tiến hành thí nghiệm ở cấp độ dưới mức tế bào của tế bào nguyên sinh chất

cho thấy ZmNAC1 tồn tại ở trong nhân. Phân tích microarray đã chứng minh

được chức năng ZmNAC1 như là chất hoạt hóa phiên mã. Sự biểu hiện mạnh

của ZmNAC1 trong cây Arabidopsis dẫn đến sự nhạy cảm với ABA và stress

thẩm thấu ở giai đoạn nảy mầm, nhưng tăng cường khả năng chống chịu với sự

mất nước khi so sánh với hạt nảy mầm wild-type. Kết quả đó chứng minh được

chức năng của ZmNAC1 như các yếu tố phiên mã để đáp ứng với bất lợi phi

sinh học và có thể áp dụng trong các kỹ thuật tăng cường khả năng chống chịu

với hạn hán trên đồng ruộng.

Trong các công trình nghiên cứu của Lam Son Phan Tran và cộng sự

(2009) đã chỉ ra rằng ở đậu tương trong số 31 gen điều khiển GmNAC thuộc

nhóm gen điều khiển NAC được kiểm tra, có 9 gen liên quan đến khả năng

chịu hạn, mặn và lạnh. Theo nghiên cứu của Tran, trong số các gen GmNAC

tham gia vào khả năng chống chịu hạn, mặn, lạnh thì các gen ở nhiễm sắc

thể số 1 (GmNAC002, GmNAC003, GmNAC004) có khả năng biểu hiện

mạnh hơn cả. Mặt khác, bộ gen của đậu tương đã được giải mã hoàn toàn

(Schmutz et al., 2010), tạo điều kiện cho nghiên cứu toàn diện gen điều

khiển (transcription factors) ở đậu tương. Theo những nghiên cứu đã được

công bố bởi nhóm nghiên cứu của Tran (Mochida et al., 2009; 2010) thì ở

đậu tương có ít nhất 205 gen GmNAC điều khiển. Cũng theo nghiên cứu và

công bố của nhóm do Tran lãnh đạo, ít nhất có 31 gen tham gia vào khả năng

chống chịu, đặc biệt là gen GmNAC085 (Le et al., 2011).

Theo nghiên cứu mới nhất của Reem M. Hussain và cộng sự (2017), đã

xác định được 139 gen GmNAC, nghiên cứu cụ thể 28 gen GmNAC chọn lọc

kết quả cho thấy biểu hiện gen GmNAC phụ thuộc vào kiểu gen; 8 trong số

28 gen chọn lọc (GmNAC004, GmNAC021, GmNAC065, GmNAC066,

GmNAC073, GmNAC082, GmNAC083 và GmNAC087) đã được phát hiện

có mức độ biểu hiện cao ở các giống đậu tương chịu hạn. Nghiên cứu này

xác định gen GmNAC có thể được xem là trọng tâm trong các nghiên cứu

trong tương lai trong việc phát triển đậu tương chịu hạn cao.

Trên cơ sở các nghiên cứu về gen GmNAC, lần đầu tiên nghiên cứu về

siêu biểu hiện của 2 cấu trúc pGreen-P35S-GmNAC003 và pGreen-P35S-

GmNAC004 trên cây Arabidopsis được công bố (Truyen N. Quach et al.,

2014). Các cây Arabidopsis biến đổi gen GmNAC004 cho thấy sự gia tăng số

lượng và chiều dài rễ trong điều kiện không hạn và duy trì số lượng và chiều

dài rễ dưới điều kiện hạn nhẹ so với cây đối chứng, trong khi cây biến đổi

gen GmNAC003 không cho thấy bất kỳ phản ứng nào.

Tại Việt Nam, định hướng nghiên cứu về giống đậu tương Việt Nam

chuyển gen chịu hạn còn khá mới. Viện Lúa ĐBSCL đã nghiên cứu tạo chọn

dòng đậu tương chịu hạn (vector pPTN-rd29A-drebIA), kết quả phân tích

PCR của 8 dòng T0 kháng thuốc diệt cỏ có 5 dòng có sự hiện diện của gen

chịu hạn drebIA. Tuy nhiên, trong hệ thống phức tạp của các gen liên quan

đến tính trạng chịu hạn và biểu hiện gen chịu hạn sau biến nạp cần có thêm

nhiều nghiên cứu hơn nữa.

Cho tới nay, tất cả các công trình biến nạp gen vào đậu tương mới chỉ

thành công trên giống mô hình như G.max 'Jack', Williams. Do có sự khác

biệt về nguồn gốc nên hầu hết các giông mô hình khó ra hoa kết quả tại Việt

Nam. Để khắc phục nhược điểm này, đề tài đã tiến hành nghiên cứu trên

giống đậu tương ĐT22 đang trồng phổ biến tại Việt Nam đã được xác định

có khả năng tiếp nhận gen tốt (Nguyễn Văn Đồng và CS, 2012).

Trên cơ sở những thành tựu về chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam và trên

thế giới, chúng tôi đã tiến hành chuyển gen GmNAC004 sử dụng promoter

35S vào giống đậu tương chọn lọc của Việt Nam thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens và thu được kết quả bước đầu.

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế

bào Thực vật - Viện Di Truyền Nông Nghiệp.

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01/ 2017 đến 05/ 2018.

3.2. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương

ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A. tumefaciens

EHA101.

Nội dung 2: Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây ở thế hệ T0.

Nội dung 3: Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử bằng phun thuốc

diệt cỏ Basta.

3.3. Vật liệu nghiên cứu

- Vật liệu thực vật

Giống đậu tương ĐT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ

(Viện Cây lương thực và cây thực phẩm) chọn tạo từ dòng đột biến của hạt

lai (ĐT95 x ĐT12) và được Hội đồng Khoa học Công nghệ (Bộ NN&PTNT)

công nhận là giống mới (Quyết định số 219 QĐ/BNN-KHCN ngày

19/01/2006).

Đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng trung bình từ 85-90 ngày. Hoa

màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có màu nâu. Khối lượng 1000

hạt khoảng 155-160 g. Có khả năng kháng bệnh phấn trắng.

Hình 3.1. Hạt đậu tương giống ĐT22

- Vật liệu di truyền

+ Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101: được chọn tạo

từ kết quả nghiên cứu sẵn có, phù hợp cho quá trình chuyển gen vào giống

đậu tương ĐT22 và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Thí nghiệm Trọng

điểm Công nghệ Tế bào Thực vật (Nguyễn Văn Đồng và CS, 2012).

+ DNA Plasmid: được thiết kế trên nền vector pZY101-Asc:35S và gen

GmNAC004 phân lập từ giống đậu tương DT2008 (Phòng Thí nghiệm trọng

điểm Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp).

Các thông tin chi tiết và cấu trúc của vector pZY101::35S::GmNAC004

được trình bày cụ thể trong Bảng 3.1, Hình 3.2.

Bảng 3.1. Thông tin về vector pZY101::35S::GmNAC004

Vector pZY101::35S::GmNAC004

Nhóm nghiên cứu tự phân lập và thiết kế Nguồn gốc

35S::GmNAC004

Tổ hợp Promote::Gen

A. tumefaciens chủng EHA101

Chủng vi khu(cid:22)n tái tổ hợp

Vector pZY101::35S::GmNAC004

Rifampicin 25 mg/l + Kanamycin 25 mg/l + Spectomycin 50 mg/l + Streptomycin 50 mg/l Chỉ thị chọn lọc vi khu(cid:22)n

Glufosinate 10 mg/l

Chỉ thị chọn lọc thực vật

YEP (Thành phần môi trường được nêu chi tiết trong Bảng 5.7) Môi trường nuôi cấy vi khu(cid:22)n

Trình tự nucleotide của hộp gen BamHI- GmNAC004-AscI được giải trình tự trong vector biểu hiện pZY101::35S::G mNAC004

GGATCCATGGGAGTTCCAGAGAAAGACCCTCT TTCCCAATTGAGTTTGCCTCCTGGTTTTCGGTTTT ACCCCACCGACGAGGAGCTCCTCGTTCAGTATCT ATGCCGCAAGGTCGCTGGCCACCATTTCTCTCTTC CAATCATTGCTGAAATTGATTTGTACAAGTTCGA CCCATGGGTTCTTCCAAGTAAGGCGATTTTCGGT GAGAAAGAGTGGTACTTTTTCAGCCCTAGAGACA GGAAATACCCTAACGGGTCCCGACCCAACAGAG TAGCCGGGTCGGGTTATTGGAAAGCCACCGGAAC CGACAAGATCATCACCACCGAAGGTAGAAAAGT TGGCATAAAAAAAGCCCTCGTTTTCTACATTGGC AAAGCCCCCAAAGGCACCAAAACCAATTGGATC ATGCACGAGTATCGCCTCCTCGACTCTTCCCGAA AAAACACCGGCACCAAGCTTGATGACTGGGTTCT GTGTCGTATCTACAAGAAGAACTCGAGTGCACAG AAGGCGGTGCAAAACGGCGTCGTTCCGAGCAAC GAGCACACTCAATACAGCAACGGTTCCTCTTCCT CTTCTTCGTCACAACTCGACGACGTTCTGGAATC GCTGCCAGCGATTGATGAACGGTGTTTCCCGATG CCACGTGTCAACACGCTGCAGCAACAGCAGCAC GAGGAGAAGGTCAATGTTCAGAACTTGGGTGAA GGGGGGTTACTGGATTGGACCAACCCTTCGGTTC TGAATTCGGTCGTTGATTTCGTATCGGGGAATAA TAATCATAATCAATTGGTGCAGGACCAGACGCAA GGCATGGTGAACTACAACGCGTGCAATGACCTCT ATGTCCCTACGTTATGCCATGTGGGCACGTCAGT TCCGCAAAAGATGGAGGAAGAGGTGCAAAGCGG CGTGAGAAACCAACGGGTCCAGAACAATTCCTG GTTTCTTCAGAATGATTTCACACAGGGGTTTCAG AATTCGGTTGACACGTCTGGGTTTAAGTACCCGG TTCAACCGGTGGGGTTCGGGTTCAGGAATTGAA CCCTGTTATCGATTAATAGGCGCGCC

Hình 3.2. Cấu trúc vector pZY101::35S::GmNAC004

Dụng cụ, thiết bị, hoá chất được sử dụng cho nuôi cấy mô, biến nạp gen

và phân tích sinh học phân tử hiện có tại Phòng Thí Nghiệm Trọng Điểm

Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Di Truyền Nông Nghiệp.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Phương pháp biến nạp

Thực hiện quy trình chuyển gen vào đậu tương bằng phương pháp nốt

lá mầm của Zhang và cộng sự (2004). Thành phần môi trường nuôi cấy được

trình bày chi tiết ở phần Phụ lục, các bước trong quá trình biến nạp cụ thể

như sau:

- Nảy mầm hạt (GM):

+ Đặt đĩa hạt đậu tương và dung dịch chứa 100 ml Clorox và 4 ml 12N

HCl trong tủ hút ẩm để khử trùng hạt, thời gian 16 giờ.

+ Cấy hạt đã khử trùng vào đĩa môi trường GM (rốn hạt úp xuống). Đặt 5 đĩa hạt trong 1 túi, buộc túi để trong điều kiện 240 C, chu kì ánh sáng là 18

giờ và 6 giờ tối trong 5 ngày.

- Chu(cid:22)n bị vi khu(cid:22)n để lây nhiễm:

+ Nuôi vi khuẩn A. tumefaciens (mẫu bảo quản ở -80oC) trên đĩa môi

trường YEP trong 3 ngày ở nhiệt độ 280C để tạo khuẩn lạc.

+ Cấy chuyển khuẩn lạc sang 5 ml môi trường YEP, nuôi lắc 250 v/ p ở

nhiệt độ 280 C trong 8 giờ.

+ Lấy 5 ml dịch khuẩn chuyển sang 150 ml môi trường YEP, tiếp tục nuôi lắc 250 v/ p ở 280 C trong 16 giờ (OD650= 1,1-1,2). Ly tâm thu cặn vi

khuẩn với tốc độ 3500 v/ p trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hòa cặn tế bào

vi khuẩn trong 40 ml môi trường CCM cho tới khi đạt OD650= 0,6.

- Chu(cid:22)n bị lây nhiễm:

+ Đổ dịch khuẩn vào đĩa petri để lây nhiễm với mẫu lá mầm.

+ Cắt lấy phần lá mầm của hạt. Sau khi cắt bỏ chồi/ nốt lá mầm, tạo 7-8

vết tổn thương sâu 0,5 mm, dài 3-4 mm dọc theo trục nối giữa lá mầm và trụ

dưới lá mầm.

- Lây nhiễm và đồng nuôi cấy (CCM):

Ngâm mẫu lá mầm ngập trong dịch khuẩn 30 phút sau đó cấy mẫu trên

đĩa môi trường đồng nuôi cấy CCM (mặt phẳng mẫu úp xuống môi trường). Cuốn đĩa mẫu với parafilm và đặt trong điều kiện 240 C, chu kì 18 giờ sáng,

6 giờ tối trong 5 ngày.

- Nhân chồi (SIM):

+ Rửa mẫu trong dung dịch SIM rồi đặt trên đĩa môi trường SIM (vùng

trụ dưới lá mầm đặt lên môi trường và vùng tái sinh ngang bằng với bề mặt môi trường với góc nghiêng 30-450).

+ Đặt đĩa mẫu ở 240 C, chu kì 18 giờ sáng, 6 giờ tối trong 14 ngày. Sau

14 ngày, cắt bằng phần trụ dưới lá mầm rồi cắm vào trong môi trường SIM

mới để mẫu phát triển trong 14 ngày tiếp theo.

- Kéo dài chồi (SEM):

+ Mẫu phát sinh chồi được cắt bỏ lá mầm, tạo vết cắt mới ở phần trụ

dưới lá mầm rồi chuyển sang môi trường SEM.

+ Đặt đĩa mẫu ở 240 C, chu kì 18 giờ sáng, 6 giờ tối trong thời gian từ

14 - 28 ngày rồi chuyển mẫu sang môi trường SEM mới 2 tuần 1 lần, mỗi

lần chuyển đều tạo vết cắt mới.

- Ra rễ (RM):

+ Cắt chồi (> 3 cm) và ngâm trong IBA (1 mg/ ml) từ 1-2 phút rồi đặt vào môi trường RM không có chọn lọc. Đặt đĩa mẫu ở 240 C, chu kì 18 giờ

sáng, 6 giờ tối trong 14 ngày.

+ Khi chồi phát triển hơn 2 rễ, rửa hết môi trường khỏi chồi với nước

rồi chuyển cây sang môi trường đất, bảo vệ bởi hộp đậy kín bên ngoài. Đặt chậu cây ở 240 C chu kì 18 giờ sáng, 6 giờ tối trong 7 ngày rồi chuyển cây

sang chậu đất lớn hơn đưa vào nhà lưới.

3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây ở thế hệ T0

3.4.2.1. Sàng lọc thông qua gen bar (phun thuốc diệt cỏ Basta)

Tùy thuộc vào tốc độ thích ứng của cây con phát triển ngoài môi trường

mà chọn thời gian phun Basta (chứa 2 % glufosinate) cho hợp lý. Thường

cây con được sử dụng trong thí nghiệm phun Basta là những cây phát sinh

khoảng 3-5 lá thật. Nồng độ Basta sử dụng trong thí nghiệm chọn lọc là

100mg/l. Nồng độ này được xác đinh dựa trên những thử nghiệm trước đây

tại phòng thí nghiệm trọng điểm. Cây con sau khi phun Basta được che chắn

để giảm tác động của môi trường (mưa, nắng, gió, sương…) tới kết quả phun

Basta. Thí nghiệm phun Basta được tiến hành lặp lại 2 lần, mỗi lần cách

nhau 3 ngày. Những cây con sống sót sau 2 lần phun Basta, được tiếp tục

chăm sóc làm vật liệu cho những phân tích đánh giá tiếp theo.

3.4.2.2. Kiểm tra cây chuyển gen bằng phân tích PCR

Tách chiết ADN tổng số:

Quy trình tách chiết ADN được tiến hành theo quy trình tách chiết

ADN của Doyle và cộng sự (1987) có cải tiến:

- Bước 1: Thu mẫu lá từ những cây con sống sót sau 2 lần phun basta.

Giữ mẫu lá thu được trong nitơ lỏng, nghiền mẫu lá ngay sau khi thu mẫu.

- Bước 2: Nghiền nhỏ 1 g mẫu lá bằng chày cối sứ trong nito lỏng và

chuyển vào ống eppendoft 2 ml.

- Bước 3: Bổ sung 1,5 ml dung dịch đệm CTAB (Phụ lục) mỗi ống

eppendoft. Lắc đều mẫu và ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở 650 C trong 60 phút.

- Bước 4: Ly tâm hỗn hợp dịch chiết mẫu lá tốc độ 13000 v/ p trong 10

phút, ở 40 C.

- Bước 5: Thu dịch nổi, chuyển sang ống eppendoft 2 ml. Bổ sung dung

dịch 25:24:1 (phenol: chloroform: isoamylalcohol) vào ống chứa dịch chiết theo tỷ lệ 1:1. Lắc đều hỗn hợp và ly tâm ở 40 C, tốc độ 13000 v/ p trong 10

phút.

- Bước 6: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 2 ml. Bổ sung dung

dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1 vào ống chứa dịch chiết. Lắc đều hỗn hợp và ly tâm lạnh ở 40 C, tốc độ 12000 v/ p trong 10

phút.

- Bước 7: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml. Bổ sung

dung dịch isopropanol theo tỷ lệ 1:1 vào ống chứa dịch chiết. Lắc nhẹ nhàng.

Giữ mẫu trong tủ -200 C trong 2 giờ. Ly tâm ở 40 C, tốc độ 12000 v/ p trong

10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại tủa ADN.

- Bước 8: DNA được làm khô bằng cách mở nắp và để trong tủ hút

trong vòng 2 giờ. Hòa tan lại ADN bằng hỗn hợp NaCl 1M + Rnase 1 mg/ ml, ủ hỗn hợp ở tủ 370 C trong 30 phút.

- Bước 9: Bổ sung theo tỷ lệ 1:1 ethanol 100% vào hỗn hợp dung dịch

(ADN + NaCl 1M + Rnase 1mg/ml), giữ hỗn hợp ở tủ -200 C trong 1 giờ.

- Bước 10: Ly tâm hỗn hợp (ethanol 100% + ADN + NaCl 1M + Rnase

1 mg/ ml) ở 40 C, tốc độ 12000 v/ p trong 10 phút nhằm thu lại tủa ADN.

- Bước 11: Rửa lại tủa ADN thu được ở bước 10 bằng dung dịch Ethanol 70 %, ly tâm lạnh 40 C tốc độ 12000 v/ p trong 10 phút. Lặp lại bước

này 2 lần.

- Bước 12: Làm khô tủa DNA sử dụng máy hút chân không. Hòa tan

ADN bằng nước cất khử ion. Bảo quản ADN trong tủ -200 C.

- Bước 13: Kiểm tra chất lượng ADN tách chiết được bằng máy đo

nanodrop và bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1 %.

Phân tích PCR:

Phân tích PCR các mẫu ADN tổng số được tiến hành với các cặp mồi

đặc hiệu cho gen chuyển tương ứng (Bảng 3.2). Thể tích phản ứng PCR là

20 µl (Bảng 3.3). Phản ứng PCR được tiến hành trên máy chu trình nhiệt model PTC-100. Chương trình phản ứng chung: 950 C/ 5 phút, 950 C/ 30 giây, 570 C/ 30 giây, 720 C/ 90 giây, lặp lại trong 35 chu kỳ, 720 C/ 10 phút, kết thúc 40 C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

1%.

Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

TT

Tên mồi

Trình tự 5’ – 3’

Gen chuyển

Kích thước

bar

Nhiệt độ gắn mồi 570 C

57oC

35S::Gm NAC004

428 bp ~1400 bp

BAR-R506 CTGAAGTCCAGCTGCCAGA BAR-F78 RB-R 2X35S-F

CCACTACATCGAGACCAGCA CTTTTCTCTTAGGTTTACCCGCCA TGCTCCACCATGTTGACCTGCA

Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR

Nồng độ ban đầu

TT Thành phần 1 Nước khử ion vô trùng 2 Taq - buffer 3 MgCl2 4 dNTPs 5 Primer - Forward 6 Primer - Reverse 7 Taq DNA polymerase 8 ADN khuôn

10 X 25 mM 2,5 mM 10 pmol 10 pmol 10 pg/ µl 100 ng/ µl

Thể tích (µl) 13,85 2 0,5 1,5 0,5 0,5 0,15 1 20

Tổng

3.4.3. Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử bằng phun Basta

Sau khi khẳng định sự có mặt của gen chuyển của các dòng chuyển gen

ở thế hệ T0, tiến hành chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử qua các thế hệ

như sau:

- Gieo ít nhất 30-50 hạt của mỗi dòng chuyển gen thế hệ T0 ra bầu đất.

Sau 10 ngày, khi cây ra 2 lá đơn tiến hành phun Basta (100 mg/ l), lặp lại 2

lần, mỗi lần cách 3 ngày.

- Thống kê số cây sống và chết ở thế hệ T1 của mỗi dòng từ thế hệ T0.

Các cây sống và chết của thế hệ T1 có tỷ lệ phân ly 3:1 dựa theo quy luật

Mendelian được lựa chọn để sàng lọc ở thế hệ tiếp theo. Những cây sống sót

ở thế hệ T1 được trồng ra bầu đất lớn để thu hạt cho thế hệ T2, toàn bộ hạt

của các cây được giữ riêng biệt.

- Các hạt thế hệ T2 tiếp tục được gieo ra bầu đất (30-50 hạt/dòng) và

sau đó được phun basta để kiểm tra sự phân ly tính trạng của các dòng. Các

cây sống sót ở thế hệ T2 có tỷ lệ phân ly 3:1 theo Mendelian được giữ lại

trồng để thu hạt cho thế hệ T3, toàn bộ hạt của các cây riêng biệt từ mỗi

dòng được giữ riêng biệt.

- Các hạt thế hệ T3 tiếp tục được gieo ra bầu đất và được phun basta.

Các cây sống sót ở thế hệ T3 có tỷ lệ 3:1 theo định luật Mendelian được

trồng riêng biệt và thu hạt riêng biệt.

Các dòng chuyển gen sau khi sàng lọc bằng basta qua 3 thế hệ có tỷ lệ

phân ly 3:1 được khẳng định là các dòng chuyển gen mang một đoạn chèn

của gen quan tâm.

3.4.4. Phương pháp thu thập và phân tích số liệu thống kê

- Quá trình biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC vào đậu tương được theo

Số mẫu phát sinh đa chồi

dõi và đánh giá thông qua các chỉ tiêu sau:

Tổng số mẫu lây nhiễm

Số mẫu sống sót sau chọn lọc

Tỷ lệ mẫu đa chồi đậu tương (%) = * 100

Số mẫu đưa vào chọn lọc

Tỷ lệ sống sót sau chọn lọc (%) = * 100

Số cây dương tính với PCR PCRPC Tổng số mẫu lây nhiễm ban đầu

*100 Hiệu suất biến nạp ở thế hệ T0 (%) =

- Kết quả nghiên cứu được xử lý và đánh giá theo phương pháp thống

kê sinh học. Các tính toán được thực hiện trên cơ sở sử dụng những ứng

dụng của phần mềm Microsof Execel.

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương

ĐT22

Nghiên cứu biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương

ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101

được tiến hành với tổng số 1339 nửa lá mầm trong 5 thí nghiệm. Mỗi thí

nghiệm đều được tiến hành với 119-390 mẫu nửa lá mầm, sau thời gian đồng

nuôi cấy 5 ngày, mẫu được chuyển sang môi trường cảm ứng tạo chồi (chưa

có chất chọn lọc) trong thời gian 14 ngày (Hình 4.1).

Hình 4.1. Kết quả biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào nốt lá mầm của giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101

Ghi chú: (A, B): Nảy mầm hạt trên môi trường GM; (C): Mẫu biến nạp đồng nuôi cấy trên môi trường CCM; (D): Mẫu phát sinh chồi trên môi trường SIM không có chất chọn lọc.

Sau 14 ngày, những mẫu đa chồi được cắt bỏ chồi đỉnh, giữ lại các cụm

mẫu đa chồi, tạo vết tương mới ở trụ lá mầm rồi tiếp tục chuyển mẫu sang

môi trường cảm ứng tạo chồi SIM có bổ sung chất chọn lọc glufosinate nồng

độ 10 mg/ ml. Kết quả chọn lọc trên SIM thu được số lượng mẫu sống sót

tạo đa chồi đạt tỉ lệ 55,27 % (Bảng 4.1, Hình 4.2).

Bảng 4.1. Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101

Số lượng mẫu

Tỉ lệ mẫu tạo đa chồi (%)

Thí nghiệm

CCM 250 119 350 230 390 1339

SIM 150 28 190 120 252 740

60,00 23,53 54,29 52,17 64,62 55,27

1 2 3 4 5 Tổng

Hình 4.2. Kết quả mẫu tạo đa chồi trên môi trường SIM

Ghi chú: (E): Mẫu phát sinh đa chồi trên môi trường SIM không có chất chọn lọc; (F): Mẫu sau 14 ngày trên môi trường SIM có chất chọn lọc

Những mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc đa chồi SIM tiếp tục

được chọn lọc trên môi trường kéo dài chồi SEM có bổ sung 5 mg /ml

glufosinate. Sau quá trình chọn lọc, số lượng chồi sống sót cuối cùng của 5

thí nghiệm là 22 chồi, tỉ lệ mẫu sống sót sau quá trình chọn lọc đạt 2,97 %

(Bảng 4.2, Hình 4.3).

Bảng 4.2. Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101

Số lượng mẫu

Tỉ lệ mẫu sống sót sau chọn lọc (%)

Thí nghiệm

1 2 3 4 5 Tổng

SIM 150 28 190 120 252 740

SEM 135 20 110 113 190 568

RM 2 2 2 8 8 22

1,33 7,14 1,05 6,67 3,17 2,97

Hình 4.3. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi trên môi trường SEM

Ghi chú: (G): Mẫu trong giai đoạn chọn lọc và kéo dài chồi trên môi trường SEM; (H): Chồi đang kéo dài.

Chồi sống sót sau quá trình chọn lọc khi phát triển dài trên 3cm sẽ được

cắt và ngâm từ 1-2 phút trong dung dịch IBA (nồng độ 1 mg/ ml) rồi chuyển

sang môi trường RM không có chất chọn lọc để ra rễ. Sau 1-2 tuần, khi mỗi

chồi phát triển được hơn 2 rễ, rửa sạch môi trường khỏi chồi trong nước và

trồng ra bầu đất. Kết quả biến nạp của 5 thí nghiệm đã thu được 9 cây đậu

tương chuyển gen sống sót sau khi chuyển ra trồng trong điều kiện nhà lưới

(Bảng 4.3, Hình 4.4).

Bảng 4.3. Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101

Số cây sống sót sau khi ra đất

Thí nghiệm 1 2 3 4 5 Tổng

Chồi sống sót sau chọn lọc tạo rễ trên môi trường RM 2 2 2 8 8 22

1 0 0 4 4 9

I

J

Hình 4.4. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp sử dụng cấu trúc gen 35S::GmNAC004 và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101

Ghi chú: (I): Chồi đậu tương ra rễ trên môi trường RM; (J): Cây đậu tương sống sót sau khi đưa ra bầu đất trong điều kiện nhà lưới.

4.2. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen bằng phun Basta

Các cây chuyển gen T0 sống sót trong nhà lưới tiếp tục chọn lọc với

thuốc diệt cỏ Basta với nồng độ 100 mg/ l. Cây con được phun kiểm tra sau

khi trồng trong bầu được 2 tuần tuổi, theo dõi 6 ngày sau khi phun 2 lần với

Basta. Với việc kiểm tra này đã loại bỏ được khả năng cây mang gen ở thể

khảm. Những cây sống sót sau chọn lọc qua Basta được tách ADN tổng số

và phân tích PCR để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển. Kết quả phun Basta

đã thu được 5 cây sống sót trên tổng số 9 cây ra đất (Bảng 4.4, Hình 4.5).

Bảng 4.4. Kết quả phun basta các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004

Số lượng mẫu biến nạp 250 119 350 230 390 1339

Số cây sống sót sau phun basta 0 0 0 3 2 5

Số cây sống sót sau khi ra đất 1 0 0 4 4 9

Thí nghiệm 1 2 3 4 5 Tổng

A

B

Hình 4.5. Kết quả chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ Basta cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004

Ghi chú: (A): Cây đối chứng ĐT22 không kháng Basta; (B): Cây chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 có biểu hiện kháng basta sau khi phun 6 ngày.

4.3. Kết quả phân tích PCR cây chuyển gen thế hệ T0

Những cây con sống sót sau khi phun Basta được thu lá tách chiết ADN

để phục vụ cho việc phân tích tiếp theo. Chất lượng ADN sau khi tách chiết

được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 0,8% và đo

nanodrop. Kết quả điện di ADN mẫu lá được trình bày trong Hình 4.6.

M ĐT22 1 2 3 4 5

Hình 4.6. Kết quả kiểm tra chất lượng ADN tổng số của cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004

Ghi chú: (M). Marker 1kb plus genruler; (ĐT22): Cây đậu tương không chuyển gen; (1-5): Cây chuyển gen với cấu trúc 35S::GmNAC004.

Qua kết quả điện di cho thấy, lượng ADN thu được cao, chất lượng

ADN tốt. Chất lượng và hàm lượng ADN đủ điều kiện cho phân tích PCR

kiểm tra sự có mặt của gen chuyển.

4.3.1. Phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar

Sau khi thu nhận được ADN tổng số từ 5 cây đậu tương sống sót với

Basta, tôi tiến hành phân tích sự có mặt gen bar - gen chỉ thị chọn lọc bằng

cặp mồi BAR-F78/ BAR-R506 (trình tự mồi, kích thước đoạn gen nhân lên

mong muốn được trình bày trong Bảng 3.2). Kết quả PCR phân tích sự có

mặt gen bar được trình bày như Hình 4.7.

M p đc -- 1 2 3 4 5

428 bp

Hình 4.7. Phân tích PCR gen bar trên các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004

Ghi chú: (M). Marker 1kb plus genruler; (p): Plasmid 35S/ GmNAC004; (đc): Cây không chuyển gen ĐT22; (--): H2O; (1-5): Cây chuyển gen với cấu trúc 35S::GmNAC004.

Kết quả PCR gen chọn lọc thực vật bar cho thấy, đối chứng dương

cho băng nét và rõ ràng, cây không chuyển gen ĐT22 không cho băng, đối

chứng âm không cho băng, 5 cây chuyển gen cho băng có kích thước bằng

với kích thước plasmid (428 bp), trong đó cây số 1, 3, 4 và 5 cho băng đậm

nét, cây số 2 cho băng mờ. Như vậy, 5 cây chuyển gen sống sót sau quá trình

chọn lọc với Basta có kết quả dương tính với gen bar.

4.3.2. Phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc 35S::GmNAC004

Năm cây đậu tương chuyển gen có kết quả PCR dương tính gen bar

được tiếp tục tiến hành phân tích sự có mặt của cấu trúc gen

35S::GmNAC004 bằng cặp mồi cdsNAC04BAmHI-F/ GmNAC4-R767

(kích thước và trình tự mồi xem ở Bảng 3.2). Kết quả phân tích đã xác định

được 4 cây dương tính với cặp mồi cdsNAC04BAmHI-F/ GmNAC4-R767,

trong đó trong đó cây số 1, 4 và 5 cho băng đậm nét, cây số 3 có băng nhưng

mờ, cây số 2 không cho băng. Các băng thu nhận được có kích thước bằng

với kích thước với đối chứng dương plasmid 35S::GmNAC004. Đối chứng

âm nước và ĐT22 không xuất hiện băng chứng tỏ phản ứng không bị nhiễm

và cặp mồi sử dụng đặc hiệu không xuất hiện băng nội sinh. Với kết quả này,

hiệu suất biến nạp cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đạt 0,3 % (Bảng 4.5, Hình

4.8).

Bảng 4.5. Kết quả phân tích PCR các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 thế hệ T0

Kết quả phân tích PCR dương tính

Hiệu suất biến nạp gen 35S::GmNAC004 (%)

Số lượng mẫu biến nạp

Gen bar

Cây chuyển gen sống sót sau phun basta

Gen 35S::GmNAC004

1339

0,3

M p -- đc 1 2 3 4 5

1400 bp

Hình 4.8. Kết quả phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen T0

Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler; (p): Plasmid 35S/GmNAC004; (-): H2O; (đc): Cây ĐT22 không chuyển gen; (1-5): Cây chuyển gen với cấu trúc 35S::GmNAC004.

Trên lý thuyết, chất lượng băng PCR phải tương tự nhau nhưng nhiều

khả năng do chất lượng ADN tách chiết không đồng đều, làm ảnh hưởng tới

kết quả của phân tích PCR. Các mẫu được xác nhận dương tính với gen đích

nhưng phản ứng PCR lên không rõ ràng cần được tách chiết và kiểm tra lại

một lần nữa trước khi tiến hành những phân tích tiếp theo.

4.4. Kết quả chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử

Căn cứ kết quả PCR đã tìm ra 4 dòng có phản ứng dương tính với gen

đích 35S::GmNAC004. Tiến hành gieo trồng hạt của 4 dòng này cùng với

hạt đậu tương ĐT22 đối chứng để sàng lọc bằng phương pháp phun Basta

đến thế hệ T3 (Bảng 4.6). Mục đích của thí nghiệm này nhằm xác định khả

năng phân ly cũng như lựa chọn những dòng đậu tương đồng hợp tử.

Thế hệ

Thu hạt

STT PCR

Kháng Basta

Gieo hạt T1

Kháng Basta

Thu hạt

Tỷ lệ kháng Basta

Gieo hạt T2

Tỷ lệ kháng Basta

Gieo hạt T0

78 %

100 %

Gieo ngẫu nhiên 1/52 dòng

Hạt 69 Dòng trộn lẫn

Dòng có khả năng đồng hợp, thu hạt sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo

40 %

52 %

33 %

Gieo ngẫu nhiên 1/31 dòng

Không sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo

Hạt 40 Dòng trộn lẫn

74 %

76 %

73 %

Gieo ngẫu nhiên 1/37 dòng

Hạt 48 Dòng trộn lẫn

Dòng mang 1 đoạn chèn của gen quan tâm, thu hạt lưu giữ

68 %

59 %

34 %

Không sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo

Gieo ngẫu nhiên 1/22 dòng

Hạt 26 Dòng trộn lẫn

Bảng 4.6. Kết quả sàng lọc và đánh giá các dòng đậu tương sau chuyển gen bằng phun Basta đến thế hệ T3

Chi tiết quá trình đánh giá sự phân ly của 4 dòng chuyển gen quan tâm

từ thế hệ T1 được trình bày trong Bảng 4.7.

Bảng 4.7. Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T1

Hạt T0 gieo

Số cây T1 kháng Basta

Tổng số cây T1 thu được

Dòng chuyển gen

Tỷ lệ cây T1 kháng Basta (%)

Tỷ lệ cây sống/ chết (+/ -)

88

1

90

69 78,41

~3:1

52

2

55

21 40,38

~1:1

66

3

67

48 72,73

~3:1

34

4

34

20 58,82

~1:1

Kết quả từ bảng trên cho thấy, ở thế hệ T1 cả 4 dòng đều phân ly nhưng

dòng số 1 và số 3 phân ly theo tỷ lệ 3:1 nên có thể dự đoán được dòng số 1

và số 3 mang 1 đoạn chèn của gen quan tâm. Để kiểm tra hai dòng số 1 và số

3 có tiếp tục phân ly theo định luật Mendelian hay không, hai dòng này cùng

với dòng số 2 và số 4 được phân tích tiếp ở thế hệ T2.

Do số lượng cá thể T1 của mỗi dòng khá nhiều nên hạt thu được của thế

hệ T1 trong mỗi đầu dòng được trộn lẫn sau đó gieo và sàng lọc thế hệ T2

(Bảng 4.8).

Bảng 4.8. Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T2

Hạt T1 gieo

Số cây T2 kháng Basta

Tổng số cây T2 thu được

Dòng chuyển gen

Tỷ lệ cây T2 kháng Basta (%)

Tỷ lệ cây sống/ chết (+/ -)

70 70 70 70

67 60 50 64

1 2 3 4

52 31 37 22

77,61 51,67 74,00 34,38

~3:1 ~1:1 ~3:1 ~1:2

Kết quả đánh giá ở thế hệ T2 trong Bảng 4.8 cho thấy, dòng số 1 và số

3 vẫn tiếp tục phân ly theo tỷ lệ 3:1. Dòng số 2 và số 4 phân ly không theo tỷ

lệ 3:1. Kết quả này khẳng định hai dòng số 1 và số 3 phân ly theo đúng tỷ lệ

của Mendelian. Do vậy, để chọn lọc được dòng đồng hợp, với dòng số 1, số

3 và 2 dòng còn lại tôi lựa chọn ngẫu nhiên 1 dòng ở thế hệ T2 để phân tích

thế hệ T3 (Bảng 4.9).

Bảng 4.9. Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T3

Hạt T2 gieo

Tổng số cây T3 thu được

Dòng chuyển gen

Số cây T3 kháng Basta

Tỷ lệ cây T3 kháng Basta (%)

Tỷ lệ cây sống/ chết (+/ -)

52

1

52 100,00

70 70

30

2

10 33,33

1:2

70

37

3

28 75,68

~3:1

70

22

4

15 68,18

~1:1

Như vậy từ Bảng 4.9 cho thấy, đến thế hệ T3 dòng số 1 không có sự

phân ly, tỷ lệ kháng Basta đạt 100 % nên dòng này có khả năng đồng hợp tử.

Dòng số 3 có tỷ lệ cây kháng đạt 76 %, tỷ lệ phân ly đạt ~ 3:1. Dòng số 2 và

số 4 có tỷ lệ cây kháng Basta đạt lần lượt 33 %, 68%, phân ly không theo tỷ

lệ 3:1 nên 2 dòng này không được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.

Dòng số 1 và số 3 được giữ lại thu hạt để tiếp tục đánh giá sự biểu hiện của

gen chuyển và khả năng chịu hạn trong điều kiện nhân tạo.

Quá trình sàng lọc bằng phun Basta đến thế hệ T3 được thể hiện qua

Hình 4.9, 4.10 như sau:

Cây đối chứng ĐT22 trước khi phun basta

Cây đối chứng ĐT22 sau khi phun basta

Dòng chuyển gen 35S::GmNAC004 T1 phân ly sau khi phun basta

Dòng chuyển gen 35S::GmNAC004 thế hệ T2 chết và phân ly sau khi phun basta

Dòng chuyển gen 35S::GmNAC004 T3 phân ly

Dòng chuyển gen thế hệ T3 có khả năng đồng hợp

Hình 4.9. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen đồng hợp đến thế hệ T3

Hình 4.10. Các dòng đậu tương được chuyển gen 35S::GmNAC004 sống sót sau phun basta được chăm sóc đến khi ra hoa, kết quả

Trong quá trình sàng lọc bằng phun Basta, sự biểu hiện gen chuyển ở

từng thế hệ của 4 dòng được kiểm tra lại bằng phân tích PCR ngẫu nhiên

một số cây đại diện. Kết quả cho thấy, cả 4 dòng đều có mặt của gen chuyển

ở thế hệ sau (Hình 4.11, 4.12, 4.13, 4.14).

Hình 4.11. Phân tích PCR gen bar trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T1

Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler; (-): H2O; (P4): Plasmid 35S/ GmNAC004; (1-9): Cây chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004;(đc): Cây không chuyển gen ĐT22.

Hình 4.12. Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T1

Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler;(P4): Đối chứng dương; (-): H2O; (1-6): Cây chuyển gen 35S::GmNAC004 thế hệ T1.

M P (-) đc 1 2 3 4 5 6 7

1500bp

1000bp

Hình 4.13. Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T2

Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler;(P): Đối chứng dương; (-): H2O; đc: Cây không chuyển gen ĐT22; (1-7): Cây chuyển gen 35S::GmNAC004 thế hệ T2.

Hình 4.14. Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T3

Ghi chú: (M): Marker 1kb plus genruler;(P): Đối chứng dương; (1-5): Cây chuyển gen 35S::GmNAC004 thế hệ T2; ĐT22: Cây không chuyển gen.

CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN

5.1. Kết luận

1. Kết quả chuyển gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 sử

dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA101 mang vector

pZY101::35S::GmNAC004 đã thu được 22 cây đậu tương sống sót sau quá

trình chọn lọc, trong đó có 9 cây sống sót sau khi ra đất. Sau khi sàng lọc

bằng phun Basta, kết quả thu được 5 cây dương tính với phun Basta.

2. Kết quả phân tích cây chuyển gen đã xác định được 4 cây đậu tương

có phản ứng dương tính với gen đích thông qua phương pháp PCR.

3. Kết quả sàng lọc gen bằng phương pháp phun Basta đến thế hệ T3 đã

xác định được 1 dòng có khả năng đồng hợp tử và 1 dòng mang 1 đoạn chèn

của gen quan tâm.

5.2. Đề nghị

1. Tiến hành thí nghiệm khẳng định lại sự có mặt của gen đích cũng

như ước đoán số bản copy bằng phương pháp Southern blot của dòng

chuyển gen thu được.

2. Đánh giá khả năng chịu hạn của dòng đậu tương chuyển gen có khả

năng đồng hợp trong điều kiện nhà lưới.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Thị Mai Hương, Nguyễn Trung Anh (2018), “Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 11(96), 32-37.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Đăng Tôn, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn

Hải, Lê Thị Muội, Trần Đình Long (2003), “Gen mã hoá Dehydrin từ

một số giống đậu tương Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(2),

237-244.

2. Đinh Thị Ngọc, Chu Hoàng Mậu, Bùi Thị Tuyết, Phạm Thị Thanh Nhàn

(2008), “Nghiên cứu khả năng chịu hạn và tách dòng gen chaperonin của

một số giống đậu tương (Glycine max. Merill) địa phương ở vùng Tây Nguyên”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(1), 79-88.

3. Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Thùy Dương, Đào Thị Thu Hà, Huỳnh Thị Thu

Huệ, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (2004), “Thiết kế véc tơ thế hệ mới

mang gen kháng côn trùng cryIAc để chuyển vào cây trồng”, Tạp chí

Công nghệ Sinh học, 2(1), 85-92.

4. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007),

“Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật”, Tạp chí Công

nghệ Sinh học, 5(1), 1-18.

5. Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu

Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “ Phát triển hệ thống tái

sinh in vitro ở cây đậu tương (Glycine max(L.) Merill) phục vụ cho

chuyển gen”, Tạp chí khoa học & công nghệ, 52(4), 82-88.

6. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hương và Nguyễn Hữu Kiên (2012),

“Nghiên cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tương ĐT22 thông

qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt

Nam, 9(39), 119-124.

7. Nhà Xuất Bản Thống Kê Hà Nội (2010), Niên Giám Thống Kê 2009.

8. Trần Thị Cúc Hoà (2007), “Khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các

giống đậu tương Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông

thôn, 18, 9-14.

9. Trần Thị Cúc Hoà (2008), “Hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ

giống MTĐ176, HL 202, Maverick và William 82 bằng phương pháp nốt

lá mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông

Nghiệp và Phát triển nông thôn.

10. Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải, Lê Thị Muội (2003), “Protein của

một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn khác nhau”, Tạp

chí Công nghệ Sinh học, 1(1), 95-100.

Tài liệu tiếng Anh

11. Dorothea B., Ramanjulu S. (2005), “Drought and Salt Tolerance in

Plants”, Critical Reviews in Plant Sciences, 24, 23-58.

12. Friedman M., Brandon D. (2001), “Nutritional and health benefits of soy

proteins”, J. Agric. Food Chem, 49(3), 1069-1086.

13. Hadiarto T., Tran L.S. (2011), “Progress studies of drought-responsive in

rice”, Plant Cell Rep, 30, 297-310.

14. Hoisington, D.A. (1992), Laboratory Protocols, CIMMYT Applied

Molecular Genetics Laboratory, Mexico DF, 1-86.

15. Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., Xiong L. (2006),

“Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor

enhances drought resistance and salt tolerance in rice”, Proc Natl Acad

Sci U S A, 103(35), 12987-12992.

16. Hussain, R. M., Ali, M., Feng, X., & Li, X. (2017), “The essence of NAC

gene family to the cultivation of drought-resistant soybean (Glycine max

L. Merr.) cultivars”, BMC Plant Biol, 17(1), 55.

17. Kovtun Y., Chiu W.L., Tena G., Sheen J. (2000), “Functional analysis of

oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in

plants”, Proc Nalt Acad Sci USA, 97, 2940-2945.

18. Le D.T., Choi J. D., Tran L.S. (2010), “Amino acids conferring herbicide

resistance in tobacco acetohydroxyacid synthase”, GM Crops, 1(2), 62-

67.

19. Le D.T., Nishiyama R., Watanabe Y., Mochida K., Yamaguchi-Shinozaki

K., Shinozaki K., Tran L.S. (2011), “Genome-wide expression profiling

of soybean two-component system genes in soybean root and shoot

tissues under dehydration stress”, DNA Res., 18(1), 17-29.

20. Lee K., Yi B.Y., Kim K.H., Kim J.B., Suh S.C., Woo H.J., Shin S.S.,

Kweon S.J. (2011), “Development of efficient transformation protocol

for soybean (Glycine max L.) and characterization of transgene

expression after Agrobacterium –mediated gene transfer”, J. Korean Soc.

App. Biol. Chem, 54(1), 37-45.

21. Li Z., Xing A., Moon B.P., Richard P. M., Mills K., Falco S.C. (2009),

“Site-Specific Integration of Transgenes in Soybean via Recombinase-

Mediated DNA Cassette Exchange”, Plant Physiol, 151(3), 1087-1095.

22. Liener I.E. (1994), “Implications of antinutritional components in

soybean foods”, Crit Rev Food Sci Nutr., 34(1), 31-67.

23. Manavalan L.P., Guttikonda S.K., Tran L.S., Nguyen. H.T. (2009),

“Physiological and molecular approaches to improve drought resistance

in soybean”, Plant and Cell Physiology, 50(7), 1260-1276.

24. Manuela M.C., João P.M., João S.P. (2003), “Understanding plant

response to drought from genes to the whole plant”, Functional Plant

Biology, 30, 239-264.

25. Nakashima K., Tran L.S., Dong N.V., Fujita M., Maruyama K., Todaka

D., Ito Y., Hayashi N., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2007),

“Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6

involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice”,

the Plant journal, 51(4), 617-630.

26. Nelson D. E., Repetti P. P., Adams T. R. et al. (2007), “Plant nuclear

factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to

improved corn yields on water-limited acres”, PNAS, 104, 16450-16455.

27. Nishihama R., Soyano T., Ishikawa M., Araki S., Tanaka H., Asada T.,

Irie K., Ito M., Terada M., Banno H., Yamazaki Y., Machida Y. (2002),

“Expansion of the cell plate in plant cytokinesis requires a kinesin-like

protein/MAPKKK complex”, Cell, 109, 87-99.

28. Ohnishi T., Sugahara S., Yamada T., Kikuchi K., Yoshiba Y., Hirano

H.Y., Tsutsumi N. (2005), “OsNAC6, a member of the NAC gene family,

is induced by various stresses in rice”, Genes Genet Syst., 80(2), 135-139.

29. Ososki A.L., Kennelly E.J. (2003), “Phytoestrogens: a review of the

present state of research”, Phytotherapy Research, 17, 845-69.

30. Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A. (2003), “Efficient

soybean transformation using hygromycin B selection in the

cotyledonary-node method”, Planta, 216, 723-735.

31. Olhoft P. M., Flagel L. E., Somers D. A. (2004), “T-DNA locus structure

in a large population of soybean plants transformed using the

Agrobacterium-mediated cotyledonary-node method”, Plant Biotechnol.

J., 2(4), 289-300.

32. Paz M., Martinez J. C., Kalvig A., Fonger T., Wang K. (2006),

“Improved cotyledonary node method using an alternative explant

derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean

transformation”, Plant Cell Reports, 25, 206-213.

33. Paz M., Wang K. (2009), “Soybean transformation and regeneration

using half-seed explants”, US Patent, 7473-7822.

34. Petit J.R., Jouzel J., Raynaud D., Barkov N.I., Barnola J.M., Basile I.,

Bender M., Chappellaz J., Davis M., Delaygue G., Delmotte M.,

Kotlyakov V.M., Legrand M., Lipenkov V.Y., Lorius C., Pespin L., Ritz

C., Saltzman E., Stivernard M. (1999), “Climate and atmospheric history

of the past 420,000 years from the Vostok ice core, Antarctica”, Nature,

399, 429-436.

35. Sakai T., Kogiso M. (2008), “Soy isoflavones and immunity”, J. Med.

Invest., 55(3-4), 167-173.

36. Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning, Vol 1, 2, 3, Cold

Spring Harbor Laboratory, New York.

37. Schmutz J., Steven B. C., Jessica S., Jianxin M., Therese M., Nelson W.,

David L. H., Qijian S., Jay J. T., Jianlin C., Xu D., Hellsten U., May

G.D., Yu Y., Sakurai T., Umezawa T., Bhattacharyya M.K., Sandhu D.,

Valliyodan B., Lindquist E., Peto M., Grant D., Shu S., Goodstein D.,

Barry K., Montona F.G., Abernathy B., Jianchang D., Zhixi T., Liucun

Z., Navdeep G., Trupti J., Marc L., Anand S., Zhang X.C., Shinozaki K.,

Nguyen H.T., Wing R.A., Cregan P., Specht J., Grimwood J., Rokhsar

D., Stacey G., Shoemaker R.C., Jackson S.A. (2010), “Genome sequence

of the palaeopolyploid soybean”, Nature, 463, 178-183.

38. Shou H., Bordallo P., Wang K. (2004), “Expression of the Nicotiana

protein kinase (NPK1) enhanced drought tolerance in transgenic maize”,

Journal of Experimental Botany, 55(399), 1013-1019.

39. Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S.D., Fujita Y.,

Maruyama K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki

K. (2004), “Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-

inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-

element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter”, Plant

Cell, 16(9), 2481-2498.

40. Tran L.S., Mochida K. (2010), “A platform for functional prediction and

comparative analyses of transcription factors of legumes and beyond”,

Plant Signaling & Behavior, 5(5), 1-3.

41. Tran L.S., Mochida K. (2010), “Functional genomics of soybean for

improvement of productivity in adverse conditions”, Funct Integr

Genomics, 10, 447-462.

42. Tran L.S., Mochida K. (2010), “Identification and prediction of abiotic

stress responsive transcription factors involved in abiotic stress signaling

in soybean”, Plant Signaling & Behavior, 5(3), 255-257.

43. Tran L.S., Nishiyama R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2010),

“Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic

stress tolerance in plants by biotechnological approach”, GM Crops, 1(1),

32-39.

44. Tran L.S., Quach T.N., Guttikonda S.K., Aldrich D.L., Kumar R.,

Neelakandan A., Valliyodan B., Nguyen H.T (2009), “Molecular

characterization of stress-inducible GmNAC genes in soybean, Division

of Plant Sciences”, Mol Genet Genomics, 281(6), 647-664.

45. Tran L.S., Urao T., Qin F., Maruyama K., Kakimoto T., Shinozaki K.,

Yamaguchi-Shinozaki K. (2007), “Functional analysis of AHK1/ATHK1

and cytokinin receptor histidine kinases in response to abscisic acid,

drought, and salt stress in Arabidopsis”, PNAS, 104(51), 20623-20628.

46. Truyen N. Quach, Lam-Son Phan Tran, Babu Valliyodan, Hanh TM.

Nguyen, Rajesh Kumar, Anjanasree K. Neelakandan, Satish Kumar

Guttikonda, Robert E. Sharp, Henry T. Nguyen (2014), “Functional

Analysis of Water Stress-Responsive Soybean GmNAC003 and

GmNAC004 Transcription Factors in Lateral Root Development in

Arabidopsis”, PLOS ONE, 9(1), e84886.

47. Wang C. R., Yang A.F., Yue G.D., Gao Q., Yin H.Y., Zhang J.R. (2008),

“Enhanced expression of phospholipase C1 (ZmPLC1) improves drought

tolerance in transgenic maize”, Planta, 227(5), 1127-1140.

48. http://www.isaaa.org

49. http://www.fao.org

50. http://www.gmocompass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/342.

genetically_modified_soybean_global_area_under_cultivation.html

PHỤ LỤC

Hóa chất và môi trường sử dụng trong chuyển gen đậu tương

Thành phần/1lít

Ferrous-NaEDTA (100X)

YEP 10 g 5 g 5 g 7 12 g

GM 100 ml 10 ml 10 ml 20 g 5,8 11 g

CCM 10 ml 1 ml 1 ml 3,9 g 30 g 5,4 11g

SIM 100 ml 10 ml 10 ml 0,6 g 30 g 5,7 12g

SEM 10 ml 100 ml 10 ml 0,6 g 30 g 5,7 13 g

RM 10 ml 100 ml 10 ml 0,6 g 20 g 5,6 13g

Khử trùng 20 phút, sau đó bổ sung:

TT 1 Bacto-peptone 2 Yeast-extract 3 NaCl 4 B5 major salts (10X) 5 B5 minor salts (100X) 6 7 MS major salts (10X) 8 MS minor salts (100X) 9 MES 10 Sucrose 11 pH 12 Agar 13 Kanamycin 14 Rifampicin 15 Spectomycin 16 Streptomycin

25 mg 25 mg 50 mg 50 mg

1 ml

Acetosyringone (AS), 40 mg/ml

18 Asp/Glu, 25 mg/ml 19 B5 vitamin (500X) 20 BAP, 16,7 mg/ml 21 Cefotaxime, 200 mg/ml

2 ml 0,1 ml

2 ml

2 ml 0,1 ml 1 ml

2 ml 2 ml 1 ml

2 ml 2 ml 0,5 ml

1 ml

Dithiothrietol (DTT), 154 mg/ml 23 IAA, 1 mg/ml 24 GA3, 1 mg/ml 25 Glufosinate, 10 mg/ml 26 L-cystein, 25 mg/ml 27 Na-thiosulfate, 158 mg/ml 28 Vancomycin 5 mg/ml

0,25 ml 16 ml 1 ml

1 ml 10 ml

0,1 ml 0,5 ml 0,5 ml 5 ml

10 ml

Ghi chú:YEP (Yeast extract peptone): Môi trường nuôi khu(cid:22)n GM (Germination medium): Môi trường nảy mầm hạt CCM (Cocultivation medium): Môi trường đồng nuôi cấy SIM (Shoot induction medium): Môi trường tạo đa chồi SEM (Shoot elongation medium): Môi trường kéo dài chồi RM (Rooting medium): Môi trường ra rễ