Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG

Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)”.

THÁI NGUYÊN 2014

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................... 1

Chương 1 ...................................................................................................................................................... 6

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................................................... 6

1.1. Công nghệ sinh học trong tạo cây trồng chuyển gen sinh trưởng nhanh ......................................... 6

1.1.1. Vai trò của nitơ đối với thực vật ............................................................................................... 6

1.1.2. Cây chuyển gen tăng cường đồng hóa nitơ, sinh trưởng nhanh ............................................ 7

1.2. Giới thiệu về gen tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ (GS1) ............................................................... 9

1.3. Giới thiệu chung về thuốc lá và Bạch đàn Urô ................................................................................. 11

1.3.1. Cây thuốc lá cây mô hình cho nghiên cứu chuyển gen ......................................................... 11

1.3.2. Giới thiệu về bạch đàn urô ...................................................................................................... 12

Chương 2 .................................................................................................................................................... 13

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................. 13

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng ............................................................................................... 13

2.1.1. Vật liệu ...................................................................................................................................... 13

2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng .................................................................................................... 14

2.2. Địa điểm và thời gian ......................................................................................................................... 17

2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................................... 17

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào thuốc lá ............................................................... 18

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tạo các dòng Bạch đàn urô .......................................................... 21

Chương 3 .................................................................................................................................................... 30

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................................................... 30

3.1. Tạo các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 và đánh giá sinh trưởng ở phạm vi phòng thí nghiệm .. 30

3.1.1. Kết quả chuyển cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326 ................................................. 30

3.1.2. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 bằng PCR ....................................................... 34

3.1.3. Phân tích, đánh giá sinh trưởng các dòng thuốc lá chuyển gen ........................................... 35

3.2. Kết quả tạo các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 ...................................................................... 37

3.2.1. Kết quả chuyển cấu trúc gen GS1 vào Bạch đàn urô ............................................................ 37

Bảng 3.3. Kết quả chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô ........................................................................... 43

3.2.2. Kiểm tra các dòng Bạch đàn urô chuyển gen bằng phương pháp PCR .............................. 46

Bảng 3.4. Hàm lượng và độ sạch của các mẫu DNA tổng số. ................................................................ 48

3.2.3. Kiểm tra các dòng Bạch đàn chuyển gen bằng kỹ thuật lai southern ................................. 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................................ 56

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Văn Thắng- Viện trưởng

Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã tận

tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian

thực hiện và hoàn thành luận văn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Chu Hoàng Hà- Viện trưởng Viện

Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã

giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện

nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh luận văn.

Tôi muốn bày tỏ biết ơn tới TS. Phạm Bích Ngọc- Phó Trưởng phòng

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, ủng hộ và

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Phương Thảo và CN. Nguyễn Văn

Đoài- Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cộng tác giúp đỡ tôi

hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể cán bộ

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học trong quá suốt

trình làm luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ thuộc cơ sở đào

tạo Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam, đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.

Cuối cùng tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn bên

tôi động viên, quan tâm tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 26 tháng 12 năm 2015

Học viên

Trần Thị Hương Giang

MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AS

Acetosyringone

ADP

Adenosine diphosphat

ATP

Adenosine triphosphat

BAP

Benzyl Amino Purine

Cs

Cộng sự

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleotide

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

Food and Agriculture Organization of the United Nations

FAO

Indol-3-Butyric Acid

IBA

Knop

Môi trường Sachs & Knop (1860)

kilo base

Kb

kilo Dalton

kDa

Môi trường nuôi cấy Luria and Betani

LB

Môi trường cơ bản Murashige và Skoog (1962)

MS

NAA

Naphthyl Acetic Acid

OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

Bp

Bazo pair

RNA

Ribonucleic

SDS

Sodium dodecyl sulfate

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ............................................................. 15

Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy thuốc lá .............................................................. 15

Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy Bạch đàn ........................................................... 16

Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen .............. 20

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR.................................................... 20

Bảng 3.1. Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu biến nạp qua các giai đoạn (%)33

Bảng 3.2. Bảng so sánh chiều cao cây đối chứng và cây chuyển gen GS1 ....... 36

Bảng 3.3. Kết quả chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô ................................................. 43

Bảng 3.4. Hàm lượng và độ sạch của các mẫu DNA tổng số. .................................... 48

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Kết quả trồng khảo nghiệm dòng Dương lai chuyển gen gs1. ...................... 9

Hình 2.1. Sơ đồ vector chuyển gen pBI121:GS1. .......................................................... 14

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát. .......................................................................... 17

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen GS1 vào thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens. ...................................................................................................................... 31

Hình 3.2. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens. ................................................................... 32

Hình 3.3. Biến nạp và đồng nuôi cấy. ............................................................................ 32

Hình 3.4. Mảnh lá trên môi trường chọn lọc sau 2 tuần. ............................................. 34

Hình 3.5. Cây thuốc lá chuyển gen GS1 trên môi trường chọn lọc CL-TL50 ............. 34

Hình 3.6. Sản phẩm PCR nhân gen GS1 ....................................................................... 35

Hình 3.7. Cây thuốc lá K326 trồng trên giá thể ............................................................ 36

Hình 3.8. Cây thuốc lá K326, 5 tháng tuổi. ................................................................... 37

Hình 3.9. Tạo nguồn vật liệu chuyển gen ...................................................................... 38

Hình 3.10. Thân mầm và lá mầm trên môi trường tiền nuôi cấy ............................... 39

Hình 3.11. Thân mầm và lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy ............................. 41

Hình 3.12. Mẫu bạch đàn trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn42

Hình 3.13. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của đoạn thân mầm ............................... 43

Hình 3.14. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của mảnh lá mầm .................................. 44

Hình 3.15. Chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc từ mẫu thân mầm và lá mầm sau

6 tuần nuôi cấy ................................................................................................................. 45

Hình 3.16. Chồi Bạch đàn urô sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ ................ 45

Hình 3.17. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 2 tuần tuổi... 46

Hình 3.18. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 3 tháng tuổi 46

Hình 3.19a. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện di

trên gel agarose 0,8% ...................................................................................................... 47

Hình 3.19b. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1, điện

di trên gel agarose 0,8%. ................................................................................................. 47

Hình 3.20. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ các dòng Bạch đàn urô chuyển

gen. .................................................................................................................................... 50

Hình 3.21. Sản phẩm PCR nhân gen nptII từ các dòng Bạch đàn urô giả định

chuyển gen ........................................................................................................................ 51

Hình 3.22. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter từ các dòng Bạch đàn urô giả

định chuyển gen ............................................................................................................... 52

Hình 3.23. Sản phẩm PCR nhân đoạn NOS-T từ các dòng Bạch đàn urô giả định

chuyển gen ........................................................................................................................ 54

Hình 3.24. Kết quả Southern blot các mẫu bạch đàn chuyển gen GS1 và nptII ....... 55

MỞ ĐẦU

Nitơ một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò quan trọng

nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, là nhân tố cấu trúc

cơ bản nên các phân tử axít nucleic và protein trong tế bào. Trong cây, nitơ có

thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi

trường và nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp và các quá trình trao

đổi chất khác như quá trình sinh tổng hợp phenyl propanoid và sự huy động

nitơ trong một vài protein.

Glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) xúc tác cho phản ứng chuyển hóa

axít glutamic thành glutamine phụ thuộc vào ATP, dùng amoniac như một cơ

chất (Miflin và Lea, 1980) có tác dụng làm biến đổi tất cả nitrogen ở dạng vô

cơ tích hợp vào các hợp chất hữu cơ như: các protein và axít nucleic, chất diệp

lục, cytochrome, phytochrome.v.v. (Stephanie và cs, 2009).

Có hai dạng chính là glutamine synthetase ở tế bào chất (GS1), tìm thấy

trong tế bào chất của lá và các tổ chức không quang hợp và glutamine

synthetase ở lục lạp (GS2) chỉ có trong lục lạp của các mô tham gia vào quá

trình quang hợp và plastid của rễ. Trong đó, GS1 có vai trò đặc biệt quan

trọng trong việc đồng hóa và tái sử dụng nitơ (Dubois và cs, 1996; Cren và

Hirel, 1999; Stephanie và cs, 2009). GS1 là một octamer protein/enzyme bao

gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có khối lượng phân tử khoảng 38 - 41kDa phụ

thuộc vào các loài khác nhau. Trong một số loài, như thuốc lá, cà chua,

thông,v.v. GS1 của lá được cấu tạo từ các dạng tiểu đơn vị có kích thước giống

nhau, nhưng ở các đối tượng khác, ví dụ như cây đậu nành phân tử GS1 được

cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị có kích thước khác nhau (Becker và cs, 1992;

Canton và cs, 1999; Dubois và cs, 1996). Thêm vào đó, các thí nghiệm phân

tích bằng điện di hai chiều xác định ở cây đậu Pháp, phân tử GS1 được tạo

thành từ hai chuỗi polypeptid khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự

khác nhau này sẽ liên quan đến sự hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý

của chúng. Những khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng

của các polypeptid của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến gen trong ống

nghiệm đã tiến hành và xác nhận được vai trò quan trọng của các axít amin

chìa khoá trong tính chất xúc tác của enzyme (Clemente và Marquez, 1999).

Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ vốn là

nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nếu

gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc nghèo

nguồn nitơ cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh (Stephanie và cs, 2009).

Một kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây lâm nghiệp tiêu biểu

là: Gallardo và cs (1999) đã nghiên cứu chuyển cấu trúc gen GS1 dưới sự điều

khiển của promoter 35S vào cây Dương lai (Populus tremula x P.alba 7171),

kết quả cho thấy cây chuyển gen sinh trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng

là 76% (cây 2 tháng tuổi) và 21,3% (cây 6 tháng tuổi). Các dòng Dương lai

chuyển gen GS1 đã được trồng khảo nghiệm từ năm 2000 tại tỉnh Granada của

Tây Ban Nha, kết quả các dòng cây chuyển gen GS1 có mức độ biểu hiện

enzyme glutamine synthetase cao và có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với

giống gốc không chuyển gen (chiều cao của cây chuyển gen tăng hơn so với cây

không chuyển gen là 21% đối với cây trồng 1 năm tuổi, 36% đối với cây trồng

2 năm tuổi và 41% đối với cây trồng 3 năm tuổi) (Zhong và cs, 2004).

Bạch đàn urô (Eucayltus urophylla) là một trong những loài Bạch đàn

chính được trồng chủ yếu ở Việt Nam. Đây cũng là loài cây chủ lực trong dự án

trồng mới 5 triệu hecta rừng đã được triển khai trong cả nước giai đoạn 1998 -

2010. Các nghiên cứu về tỷ trọng gỗ, hàm lượng xenlulozo, chiều dài sợi gỗ, v.v.

đã được thực hiện, kết quả thu được cho thấy các tính trạng sinh trưởng và

chất lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu suất bột giấy cho ngành công nghiệp

giấy. Các đánh giá về sinh trưởng của Bạch đàn urô tại Việt Nam cũng cho

thấy tỷ lệ sinh trưởng của Bạch đàn urô tại Việt Nam chậm hơn so với các

nước khác như Trung Quốc, Brazil (Nguyễn Đức Kiên, 2009). Vì vậy, các

chương trình chọn giống bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng khả

năng sinh trưởng, cải thiện chất lượng gỗ và tăng sức chống chịu với điều kiện

môi trường bất lợi.

Thuốc lá là loại cây mô hình được sử dụng hiệu quả cho chuyển gen,

kiểm tra sự biểu hiện của gen ngoại lai phục vụ cho mục đích chuyển gen vào

cây mục tiêu. Trong khuôn khổ đề tài chúng tôi tiến hành thí nghiệm chuyển

gen GS1 vào cây thuốc lá để đánh giá hoạt động của gen chuyển, tạo cơ sở cho

việc chuyển gen GS1 vào cây Bạch đàn urô có khả năng sử dụng hiệu quả

nguồn nitơ để cây sinh trưởng nhanh phục vụ cho công tác cải thiện giống cây

trồng.

Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu ứng dụng vào thực tiễn, chúng tôi

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả

nitơ vào thuốc lá và Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)”.

1. Mục đích nghiên cứu

Tạo được các dòng cây thuốc lá K326 và các dòng cây Bạch đàn urô

chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ.

2. Nhiệm vụ nghiên cứu

2.1. Chuyển cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326 và phân tích, đánh giá

sinh trưởng ở phạm vi phòng thí nghiệm.

Biến nạp cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326;

Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng thuốc lá chuyển gen

bằng phương pháp PCR.

Đánh giá về hình thái, sinh trưởng của các dòng thuốc lá chuyển gen

GS1 tăng cường khả năng tổng hợp nitơ so với cây thuốc lá đối chứng không

chuyển gen (WT).

2.2. Tạo các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1

Biến nạp cấu trúc gen GS1vào Bạch đàn Urô

Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng Bạch đàn urô chuyển

gen bằng phương pháp PCR và phương pháp southern blot.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1. Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển

gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1 dưới sự điều

khiển của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển của NOS-promoter do

Phòng Công nghệ tế bào thực vật -Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.

Dòng thuốc lá K326 in vitro được cung cấp bởi Viện Kinh tế kỹ thuật

thuốc lá và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện

Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hạt giống Bạch đàn urô do Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm

nghiệp thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.

3.2. Phạm vi nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật –

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung cho các tài liệu nghiên cứu khả

năng chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ vào cây trồng thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Tạo được dòng thuốc lá chuyển gen GS1 là cây mô hình cho các thí

nghiệm chuyển gen vào các đối tượng cây trồng khác

Tạo dòng bạch đàn chuyển gen GS1 tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ

trên quy mô phòng thí nghiệm là cơ sở cho việc thử nghiệm và trồng rừng

Bạch đàn sinh trưởng nhanh phủ xanh đất trống đồi trọc.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Công nghệ sinh học trong tạo cây trồng chuyển gen sinh trưởng nhanh

Các hướng nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen đang được

nhiều nhà khoa học lâm nghiệp trên thế giới quan tâm: Tạo cây kháng sâu và

côn trùng; tạo cây kháng nấm bệnh; tạo cây sinh trưởng nhanh; tạo cây có

chất lượng gỗ tốt và tạo cây kháng được các điều kiện bất lợi của môi trường

(lạnh, mặn và hạn). Đối với cây lâm nghiệp trồng rừng kinh tế thì tốc độ sinh

trưởng và chất lượng gỗ là những tính trạng được quan tâm hàng đầu, nhằm

nâng cao giá trị kinh tế trên một đơn vị diện tích rừng trồng. Theo báo cáo của

FAO (2004) các nghiên cứu về cải tạo giống cây lâm nghiệp có liên quan đến

tăng tốc độ sinh trưởng nhanh và chất lượng gỗ tốt chiếm 63%.

Cho đến nay, có nhiều hướng nghiên cứu theo định hướng tạo giống cây

lâm nghiệp chuyển gen có khả năng sinh trưởng nhanh như: chuyển gen làm

giảm hàm lượng lignin; chuyển gen gây ức chế sự ra hoa; chuyển gen tăng

cường sử dụng các nguyên tố khoáng; chuyển gen tăng sự phân chia tế bào;

chuyển gen tăng khả năng tổng hợp và sử dụng hiệu quả nitơ. Trong các

hướng nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu tăng cường khả năng sử dụng hiệu

quả nitơ là hướng đã thu được các kết quả tốt nhất.

1.1.1. Vai trò của nitơ đối với thực vật

Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, nitơ có vai trò sinh lý

đặc biệt quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và ảnh hưởng trực tiếp đến

năng suất mùa vụ. Nitơ có mặt trong rất nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có

vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất và năng lượng, đến hoạt động

sinh lý của cây.

Nitơ là thành phần chủ yếu của protein một trong bốn hợp chất quan

trọng nhất của sự sống, protein tham gia vào mọi hoạt động sống của cơ thể,

xúc tác cho mọi phản ứng từ đơn giản như phản ứng hydrat hoá đến phức tạp

như tổng hợp DNA; sinh tổng hợp protein; vận chuyển chất dinh dưỡng; tham

gia vào các cấu trúc đặc thù để kiến tạo và bảo vệ cơ thể, là thành phần quan

trọng của màng sinh chất của tế bào cũng như các bào quan. Nitơ có trong

thành phần của axít nucleic (DNA và RNA). Ngoài chức năng duy trì và truyền

thông tin di truyền, axít nucleic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình

sinh tổng hợp protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào,v.v. Nitơ là

thành phần quan trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyết định

hoạt động quang hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh

vật trên trái đất. Nitơ là thành phần của một số phytohormone như auxin và

cytokinin. Đây là những chất quan trọng trong quá trình phân chia và sinh

trưởng của tế bào và của cây. Nitơ tham gia vào thành phần của ADP, ATP, có

vai trò quan trọng trong trao đổi năng lượng của cây. Nitơ tham gia vào thành

phần của phytochrome có nhiệm vụ điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát

triển của cây có liên quan đến ánh sáng như phản ứng quang chu kỳ, sự nảy

mầm, tính hướng quang.

Vì vậy cây rất nhạy cảm với nitơ, trong điều kiện thiếu nitơ cây sinh

trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và

phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và tích lũy, giảm năng suất.

Tùy theo mức độ thiếu đạm mà năng suất giảm nhiều hay ít. Trong trường hợp

có triệu chứng thiếu đạm thì chỉ cần bổ sung phân đạm là cây sinh trưởng và

phát triển bình thường.

1.1.2. Cây chuyển gen tăng cường đồng hóa nitơ, sinh trưởng nhanh

Nitơ một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò quan trọng

nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, là nhân tố cấu trúc

cơ bản nên các phân tử axít nucleic và protein trong tế bào. Trong cây, nitơ có

thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi

trường và nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp và các quá trình trao

đổi chất khác như quá trình sinh tổng hợp phenyl propanoid và sự huy động

nitơ trong một vài protein. Glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) xúc tác cho

phản ứng chuyển hoá axít glutamic thành glutamine phụ thuộc vào ATP, dùng

amoniac như một cơ chất (Miflin và Lea, 1980). Có hai dạng chính là

glutamine synthetase ở tế bào chất (GS1), tìm thấy trong tế bào chất của lá và

các tổ chức không quang hợp và glutamine synthetase ở lục lạp (GS2) chỉ có

trong lục lạp của các mô tham gia vào quá trình quang hợp và plastid của rễ,

trong đó GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đồng hóa và tái sử dụng

nitơ (Stéphanie và cs, 2009).

GS1 là một octamer protein/enzyme bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có

khối lượng phân tử khoảng 38 - 41kDa phụ thuộc vào các loài khác nhau. Trong

một số loài, như thuốc lá, cà chua, thông, v.v. GS1 của lá được cấu tạo từ các

dạng tiểu đơn vị có kích thước giống nhau, nhưng ở các đối tượng khác, ví dụ

như cây đậu nành phân tử GS1 được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị có kích thước

khác nhau (Dubois và cs, 1996). Thêm vào đó, các thí nghiệm phân tích bằng

điện di hai chiều xác định ở cây đậu Pháp, phân tử GS1 được tạo thành từ hai

chuỗi polypeptid khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự khác nhau này sẽ

liên quan đến sự hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý của chúng. Những

khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các polypeptid

của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến gen trong ống nghiệm đã tiến hành

và xác nhận được vai trò quan trọng của các axít amin chìa khoá trong tính chất

xúc tác của enzyme (Clemente và Marquez, 1999).

Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ

vốn là nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho

thấy, nếu gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc

nghèo nguồn nitơ cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh (Stéphanie và cs,

2009). Một kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1vào cây lâm nghiệp tiêu biểu là:

Gallardo và cs (1999) đã nghiên cứu chuyển cấu trúc gen GS1 dưới sự điều

khiển của promoter 35S vào cây Dương lai (Populus tremula x P.alba 7171), kết

quả cho thấy cây chuyển gen GS1 sinh trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng

là 76% (cây 2 tháng tuổi) và 21,3% (cây 6 tháng tuổi). Các dòng Dương lai

chuyển gen GS1đã được trồng khảo nghiệm từ năm 2000 tại tỉnh Granada của

Tây Ban Nha, kết quả các dòng cây chuyển gen GS1 có mức độ biểu hiện

enzyme glutamine synthetase cao và có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với

giống gốc không chuyển gen (chiều cao của cây chuyển gen tăng 21% đối với cây

trồng 1 năm tuổi, 36% đối với cây trồng 2 năm tuổi và 41% đối với cây trồng 3

năm tuổi) (Zhong và cs, 2004). Cùng với hướng nghiên cứu này, Fuentes và cs

(2001) cũng đã nghiên cứu chuyển gen GS1 với sự điều khiển promoter 35S vào

cây thuốc lá, kết quả cho thấy mức độ phiên mã và tổng hợp enzyme glutamine

synthetase tăng cao, hoạt tính enzyme GS1 ở lá cây chuyển gen tăng cao hơn 6

lần so với cây đối chứng. Dưới điều kiện có nguồn nitơ bình thường thì không

ảnh hưởng lớn tới quang hợp và phát triển của cây chuyển gen. Nhưng trong

điều kiện nguồn nitơ bị hạn chế, cây chuyển gen phát triển phần thân tăng 70%,

ở phần rễ tăng 100%, ở phần lá tăng 50% so với cây đối chứng không chuyển

gen.

Hình 1.1. Kết quả trồng khảo nghiệm dòng Dương lai chuyển gen gs1. Cây

chuyển gen có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn so với giống gốc không chuyển gen

(chiều cao của cây chuyển gen tăng 21% đối với cây trồng 1 năm tuổi, 36% đối

với cây trồng 2 năm tuổi và 41% đối với cây trồng 3 năm tuổi) (Zhong và cs,

2004).

1.2. Giới thiệu về gen tăng cường sử dụng hiệu quả nitơ (GS1)

GS1 là một octamer protein bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ hơn, có khối

lượng khoảng từ khoảng 38 – 41kDa phụ thuộc vào các loài khác nhau. Trong

một số loài, như thuốc lá (Dubois và cs, 1996), cà chua (Becker và cs, 1992) củ

cải đường (Brechlin và cs, 1999), hoặc ở cây thông (Cantón và cs, 1999), GS1

của lá được cấu tạo từ các dạng tiểu đơn vị có kích thước giống nhau, nhưng ở

các đối tượng khác, ví dụ như cây đậu nành (Hirel và cs, 1987), GS1 có hai tiểu

đơn vị kích thước khác nhau được tìm thấy trong phân tử enzyme hoàn chỉnh.

Thêm vào đó, các thí nghiệm phân tích bằng điện di hai chiều xác định ở cây

đậu Pháp, tiểu phần cấu tạo nên GS1 được tạo thành từ hai chuỗi polypeptid

khác nhau. Tuy nhiên, điều đáng chú ý ở sự khác nhau này sẽ liên quan đến sự

hoạt động của enzyme và chức năng sinh lý của chúng, điều mà phần nhiều

chúng ta chưa biết. Những khảo sát xa hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và

chức năng của các polypeptid của GS1, những nghiên cứu sử dụng đột biến

gen trong ống nghiệm đã được tiến hành (Clemente và Márquez,1999), đã xác

nhận vai trò quan trọng của các axít amin chìa khoá trong tích chất xúc tác

của enzyme.

Các gen mã hoá cho GS trong thực vật được gọi là type II và hoàn toàn

giống như các sinh vật eukaryote khác, còn các gen mã hoá trong các sinh vật

prokaryote được gọi là type I, nhưng gần đây các công trình nghiên cứu của

Mathis và cs (2000) đã chứng minh rằng các gen type I cũng có mặt trong thực

vật và một họ gen nhỏ có thể được biểu hiện trong một số tổ chức cơ quan nhất

định.

Mặc dù thông thường chỉ có một gen mã hoá cho GS2 nhưng các nghiên

cứu trên một phổ rộng các loài đã cho thấy rằng GS1 được mã hoá bởi một họ

gen, có thể từ 3 đến 6 gen. Trong đậu Hà lan có 3 gen GS1 biểu hiện trong lá và

trong các tế bào Libe (phloem). Hai trong các gen đó là GS3A và GS3B có trình

tự tương đồng cao ở cả vùng mã hoá (99%) và vùng không mã hoá (96%),

polypeptid của chúng chỉ khác nhau ở 3 axít amin (Walker và cs, 1995). Năm

gen của GS1 được tách từ lá ngô bởi Li và cs (1993). Ba trong các gen này là

GS1-2, GS1-3, GS1-4 biểu hiện mạnh trong lá trưởng thành, trong mầm hạt và

trong thân ngô, hai gen còn lại GS1-5, GS1-1 biểu hiện trong mầm hạt, trong

thân nhưng không thấy biểu hiện trong lá. Những phân tích về hệ thống phát

sinh gen GS được nghiên cứu bởi Biesiadka và Legocki (1997).

Các nghiên cứu về rễ và các nốt rễ (Ireland và Lea, 1999) đã chỉ ra rằng

GS1 biểu hiện trong lá và tiếp sau đó là sự tổng hợp các polypeptid tương ứng.

Trong nhiều thực vật C3, GS1 được mã hoá bởi một gen, sự biểu hiện chủ yếu

ở rễ và biểu hiện càng mạnh mẽ trong lá già (Brugière và cs, 2000). Trong thực

vật C4, sự biểu hiện của gen GS1 xuất hiện chủ yếu ở rễ và chồi rồi giữ ở mức

độ cao trong cả hai cơ quan này trong suốt quá trình phát triển của thực vật

(Li và cs, 1993). Tìm thấy một hoặc hai gen trong họ đa gen của GS1 trong mô

vân lá của trong thực vật C3, C4, cây họ lúa và cây ngoài họ lúa (Dubois và cs,

1997).

Trong phloem protein GS đóng vai trò vận chuyển và tập hợp nitơ trong

cây (Sakurai và cs, 1996). Cũng có giả thuyết cho rằng có thể tồn tại một

enzyme khác có hoạt tính của enzyme GS1 trong phloem khác với enzyme GS1

trong lá và nốt sần. Để làm sáng tỏ giả thuyết này người ta phân tích cây thuốc

lá chuyển gen gây bất hoạt enzyme GS1 trong phloem và xác định vai trò của

enzyme GS1 trong quá trình tổng hợp prolin, là axít amin chỉ thị trong điều

kiện khô hạn.

1.3. Giới thiệu chung về thuốc lá và Bạch đàn Urô

1.3.1. Cây thuốc lá cây mô hình cho nghiên cứu chuyển gen

Trong chuyển gen thực vật, cây thuốc lá được xem xét như là loại cây mô

hình phục vụ cho các nghiên cứu đánh giá chức năng gen bởi vì hệ thống tái

sinh và tiếp nhận gen ngoại lai của cây thuốc rất hiệu quả, thời gian phân hóa

từ mô đến tạo cây hoàn chỉnh khá ngắn, mặt khác cây thuốc lá là cây ngắn

ngày, rễ trồng và chăm sóc nên dễ dàng thu được hạt để nghiên cứu các thế hệ

tiếp theo. Bởi vậy, hầu hết các công trình nghiên cứu về chức năng gen biểu

hiện trong thực vật đều sử dụng cây thuốc lá như là một cây mô hình để nghiên

cứu. Ngoài ra, các nhà khoa học xem cây thuốc lá là một hệ thống biểu hiện

gen ngoại lai cao nên các gen biểu hiện các protein/enzyme có giá trị được biểu

hiện trong cây thuốc lá sau đó tách chiết và tinh sạch, rất hiệu quả.

Đến nay, đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu thành công từ việc sử dụng

cây thuốc lá làm cây mô hình cho chuyển gen và các ứng dụng như: Mario

Pezzotti ở Đại học Verona đã tạo ra cây thuốc lá chuyển gen có khả năng sản

xuất interleukin có hoạt tính sinh học (một loại cytokinine có khả năng kháng

viêm). Theo tạp chí FASEB, các nhà khoa học Anh đã nghiên cứu chuyển gen

mã hóa cho kháng thể của microcystin - LR vào cây thuốc lá. Zhang và cs

(2007) đã nghiên cứu chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium chuyển vector

chứa 2 gen SbtCcry1 Ac và GNA kháng côn trùng vào đối tượng cây thuốc lá.

Theo NewScientist, các nhà khoa học Anh và Mỹ đã chuyển thành công gen mã

hóa kháng thể chống bệnh dại ở người vào cây thuốc lá. Thí nghiệm cho thấy

kháng thể từ thực vật biến đổi gen này rất có hiệu quả cao trong việc chống

virus gây bệnh dại. Nhóm khoa hóc của Neil Bruce, Đại học Cambridge đã

thành công trong việc cấy chuyển một gen của vi khuẩn Enterobacter cloacea

vào cây thuốc lá, giúp cây thuốc lá tiết ra một loại enzyme có thể hấp thụ và

chuyển đổi các phân tử thuốc nổ TNT trong đất thành chất không độc hại.

Công ty CropTech - Mỹ đã chuyển thành công một số gen của người vào cây

thuốc lá, loại cây thuốc lá này sẽ tạo ra các protein có khả năng trị nhiều bệnh.

Lina Gallego và cs (2008) cũng đã chuyển thành công các gen trong hệ thống

tổng hợp Gibberellin vào cây thuốc lá và cho thấy cây thuốc lá biến đổi gen

tăng trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng.

1.3.2. Giới thiệu về bạch đàn urô

Bạch đàn urô là một trong những loài bạch đàn chính được trồng chủ

yếu ở Việt Nam. Bạch đàn urô là loài cây mọc nhanh, tăng trưởng đường kính

bình quân từ 1,25 cm đến 2 cm/năm, tăng trưởng chiều cao đạt từ 1,2 - 1,5

m/năm tùy theo điều kiện tự nhiên. Cây mọc thẳng, có thân tròn đều, ít bạnh

vè. Mặc dù tầm quan trọng của Bạch đàn urô trong trồng rừng sản xuất nhưng

năng suất của Bạch đàn urô ở Việt Nam còn thấp (8 -10 m³/hecta/năm) so với ở

các nước khác. Các nghiên cứu đánh giá về sinh trưởng của bạch đàn urô tại

Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng của bạch đàn tại Việt Nam chậm hơn

so với các nước khác như Trung Quốc, Braxin. Tăng trưởng chiều cao trung

bình hàng năm trong cả hai thử nghiệm ở độ tuổi 5 đạt được trong khoảng từ

1,9 - 2,7m3 (Kien và cs, 2009), so với 35 m3 đạt được ở Trung Quốc hay Brazil

(Santos và cs, 1990; Wei & Borralho, 1998). Rõ ràng cải tiến di truyền cho

Bạch đàn urô ở Việt Nam rất cần chú trọng thực hiện theo hướng tăng sức sinh

trưởng.

Những nghiên cứu chọn tạo giống Bạch đàn urô thông qua chọn dòng vô

tính đã đưa năng suất của rừng trồng Bạch đàn urô ở Việt Nam lên cao hơn.

Một khảo nghiệm được tiến hành tại vùng Trung tâm miền Bắc trong giai

đoạn 1998 - 2003 được tiến hành cho 36 dòng Bạch đàn urô và giống đối chứng

là cây hạt của Bạch đàn urô lấy từ sản xuất. Kết quả khảo nghiệm dòng vô tính

tại một số xã thuộc huyện Tam Nông và Đoan Hùng cho thấy sau 3, 4, 5 năm

ba dòng Bạch đàn urô PN10, PN46 và PN47 là những dòng có thể tích thân cây

tương ứng là 101, 127 và 103,6 dm/cây với năng suất tương ứng là 23,38 và 30

m3 /hecta/năm. Trong khi giống đối chứng là cây hạt của Bạch đàn urô chỉ có

thể tích thân cây 41,4 - 43,8 dm /cây và năng suất chỉ đạt 8 -10 m3 /hecta/năm

(Nguyễn Sỹ Huống và cs, 2003).

Năm 2013, các nhà khoa học thuộc Viện Giống và Công nghệ sinh học

Lâm nghiệp thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu, chọn

tạo thành công giống Bạch đàn urô 262. Giống Bạch đàn urô 262 có các đặc

điểm chính như sinh trưởng, phát triển tốt, năng suất bình quân đạt 23,9

m3/hecta/năm, không bị sâu bệnh, hiệu quả kinh tế cao gấp 1,5 - 2 lần so với

giống thông thường. Mặc dù, năng suất giống Bạch đàn urô ở nước ta đã được

cải thiện nhưng vẫn còn tương đối thấp so với các nước khác trên thế giới. Rất

cần tiếp tục những nghiên cứu về cải tiến giống, chăm sóc, gieo trồng. Trong đó

quan trọng hơn cả là công tác chọn tạo giống, hướng tạo ra những dòng Bạch

đàn urô sinh trưởng nhanh thông qua chuyển gen là một hướng giải quyết rất

có tiềm năng.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng

2.1.1. Vật liệu

2.1.1.1. Vật liệu thực vật

- Dòng thuốc lá K326 in vitro được cung cấp bởi Viện Kinh tế kỹ thuật

thuốc lá và hiện đang được lưu giữ tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện

Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Hạt giống Bạch đàn urô do Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm

nghiệp thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.

2.1.1.2. Vật liệu chuyển gen

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển

gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1 dưới sự điều

khiển của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển của NOS-promoter

(sản phẩm của Đề tài “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn urô (Eucalyptus

urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen”) do Phòng Công

nghệ tế bào thực vật -Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam cung cấp.

Hình 2.1. Sơ đồ vector chuyển gen pBI121-35S/GS1. GS1: gen mã hóa cho

glutamine synthetase; CaMV35S: promoter 35S của virut khảm cây hoa lơ, nptIII:

gen chọn lọc kháng kháng sinh kanamycine; Nos: trình tự kết thúc của gen

nopaline synthase.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng

2.1.2.1. Hóa chất

- Các hóa chất sử dụng cho tách ADN tổng số từ tế bào thực vật: CTAB (Invitrogen), NaCl (Sigma), tris base (Sigma), EDTA (Sigma), đệm TESC (100 mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 0,4 M NaCl, 2% CTAB), SDS, CH3COOK, NaCl isopropanol, cồn 70%, nước deion v.v.

- Các hóa chất dùng cho điện di axít nucleic: dung dịch đệm TAE 50X (Tris base: 121 g, axít acetic glacia: 28,6 ml, 0,5 M EDTA pH 8,0: 50 ml, nước khử ion vừa đủ: 500 ml), dung dịch đệm TAE 1X, agarose 1%; ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml. Đệm kiểm tra mẫu DNA (Loading buffer).

- Các hóa chất dùng cho PCR : Taq ADN polymerase (Thermo Scientific), đệm Taq ADN polymerase 10X, Pfu ADN polymerase (Thermo Scientific), đệm Pfu ADN polymerase 10X, MgSO4 25 mM,dNTPs 2 mM mỗi loa ̣i (Thermo Scientific), v.v.

- Các hóa chất: Javel 50%, nitơ lỏng, nước cất, acetosyringone; các

kháng sinh: kanamycin, cefotaxim, rifamicin.

2.1.2.2. Môi trường nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Bảng 2.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Tên môi trường Thành phần môi trường

LB đặc yeast extrac 5g/l; trypton 10g/l; NaCl 10g/l; agar 16g/l, pH =

7,0.

LB lỏng yeast extrac 5g/l; trypton 10g/l; NaCl 10g/l; pH = 7,0.

Dịch lỏng tạo dịch Môi trường cơ bản 1/2 MS không bổ sung agar

huyền phù vi

khuẩn

- Môi trường nuôi cấy thực vật:

Bảng 2.2. môi trường nuôi cấy thuốc lá

Tên môi Kí Thành phần môi trường trường hiệu

Tái sinh TS MS + 30g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH=5,8

Đồng nuôi cấy Co- MS + 30g/l sucrose + 7,5 g/l agar+ AS 50µM, pH=5,8

Chọn lọc cây MS + 1 mg/l BAP + 30g/l sucrose + 500 mg/l

chuyển gen cefotaxime + 50 mg/l kanamycin + 7,5 g/l agar, CL- TL50

pH=5,8

Ra rễ RR50 MS + 30g/l sucrose + 500 mg/l cefotaxime + 50 mg/l

kanamycin + 7,5 g/l agar, pH=5,8

Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy Bạch đàn

Tên môi Kí hiệu Thành phần môi trường trường

Gieo hạt MS0 MS + 30g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH=5,8

Tiền nuôi cấy Pre-T MSBĐ* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 20g/l

cho thân mầm sucrose + 2,6 g/l gellan + 50 µM AS, pH = 5,8

Tiền nuôi cấy Pre-L MSBĐ* + 1.0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 20g/l

cho lá mầm sucrose + 2,6 g/l gellan + 50 µM AS, pH = 5,8

Đồng nuôi cấy Co-T MSBĐ* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 20g/l

cho thân mầm sucrose + 2,6 g/l gellan + 100 µM AS, pH = 5,8

Đồng nuôi cấy Co-L MSBĐ* + 1.0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA+ 20g/l

cho lá mầm sucrose + 2,6 g/l gellan + 100 µM AS, pH = 5,8

Tái sinh thân Aft-T MSBĐ* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA+ 20g/l

mầm sucrose + 2,6 g/l gellan + 400 mg/l cefotaxime, pH =

5,8

Tái sinh lá Aft-L MSBĐ* + 1.0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA+ 20g/l

mầm sucrose + 2,6 g/l gellan + 400 mg/l cefotaxime, pH =

5,8

Chọn lọc cây MSBĐ*+ 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA+ 20g/l CL-T150

chuyển gen từ sucrose + 2,6 g/l gellan + 400 mg/l cefotaxime + 150

thân mầm mg/l kanamycin, pH = 5,8

Chọc lọc cây CL-L150 MSBĐ* + 1.0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 20g/l

chuyển gen từ sucrose + 2,6 g/l gellan + 400 mg/l cefotaxime + 150

mg/l Kanamycin, pH = 5,8 lá mầm

Ra rễ RR100 ½ MS giảm ½ Nitơ tổng số + 0,5 mg/l NAA + 0,2

mg/l IBA + 20g/l sucrose + 250 mg/l cefotaxime + 75

mg/l kanamycin

MSBĐ*:MS giảm ½ nitơ tổng số + 100 mg/l nước dừa (dừa bánh tẻ).

2.1.2.3. Máy móc và thiết bị

Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam: Bao gồm các loại box cấy vô trùng; nồi khử trùng; bể ổn nhiệt; máy

nước cất; máy đo pH; máy đo OD; máy PCR; máy điện di; máy chụp ảnh gel;

tủ ấm; tủ lắc; dàn nuôi cấy và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác của

các hãng: Nuaire, Wealtec, Amerex, AB, Hoirba, Hettech, Sartorius, Olympus,

v.v.

2.2. Địa điểm và thời gian

Địa điểm: tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công -

nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Thời gian: từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 6 năm 2015. -

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Toàn bộ quy trình nghiên cứu được tóm tắt qua sơ đồ 2.1

TẠO DỊCH HUYỀN

TẠO VẬT LIỆU CHUYỂN GEN

PHÙ VI KHUẨN

BIẾN NẠP VÀ ĐỒNG

NUÔI CẤY

CHỌN LỌC MẪU MÔ BIẾN NẠP TRÊN

MÔI TRƯỜNG CHỌN LỌC

CHỒI CHUYỂN GEN TÁI SINH TRÊN MÔI

TRƯỜNG RA RỄ

Phân tích PCR

KIỂM TRA CÂY

Phân tích Southern blot

CHUYỂN GEN

Đánh giá sinh trưởng

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát.

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu chuyển gen vào thuốc lá

2.3.1.1. Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens

Chuyển gen vào thuốc lá được thực hiện theo phương pháp của

Topping cải tiến (1998), sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefaciens có chứa vector

chuyển gen pBI121-35S/GS1 có kích thước khoảng 13kb chứa gen GS1dưới sự

điều khiển của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển của NOS-

promoter. Các bước được tiến hành như sau:

Bước 1: chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa gen quan tâm được

bảo quản trong glycerol -800C được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có chứa

kháng sinh chọn lọc, nuôi tối ở 280C trong 2 ngày.

Bước 2: cây con in vitro phát triển 3-4 lá thật, chọn các lá bánh tẻ để tiến hành

biến nạp. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1 cm2.

Bước 3: một ngày trước khi biến nạp, chọn khuẩn lạc tròn đều, đứng độc lập

nuôi lỏng trong 10 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi qua đêm (16h).

Sau đó nuôi phục hồi thêm 4h trong 100 ml LB lỏng không bổ sung kháng sinh

chọn lọc.

Bước 4:biến nạp:

- Khuẩn sau khi nuôi được đem đo OD650=0,5-0,7 thì sử dụng để biến

nạp.

- Đem ly tâm thu cặn khuẩn, cặn khuẩn được hòa tan với dung dịch ½

MS để tạo dịch huyền phù vi khuẩn.

Các mảnh lá được chuyển sang bình tam giác có chứa dịch huyền phù vi

khuẩn.

Bước 5: sau 10 phút chuyển các mảnh lá lên giấy thấm khử trùng, thấm khô và

cấy lên môi trường CL-TL150

Bước 6: sau 2-3 tuần các mảnh lá bắt đầu được cảm ứng tạo mô sẹo, chuyển

sang môi trường CL-TL150

Bước 7: sau 4-6 tuần các mảnh lá đã tạo chồi, các chồi phát triển tốt được

chuyển sang môi trường tạo rễ RR50

Bước 8: cây con ra nhiều rễ, cao 5-7 cm thì được đưa ra bầu chứa giá thể đất:

trấu: cát (1:1:1). Sau đó cho cây vào túi nilông, ghim phần trên và đưa vào

phòng nuôi cây có điều khiển nhiệt độ 25-280C, 2000 lux, 16h chiếu sáng trong

1 tuần.

Bước 9: đưa cây ra trong nhà kính.

Bước 10: sau 2 tuần cây ổn định, có độ đồng đều về kích thước đảm bảo phục

vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.3.1.2. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng kĩ thuật PCR

Sau khi trồng ra bầu đất, cây phát triển ổn định, lá xanh tốt thì tiến

hành lấy lá để phân tích cây chuyển gen.

a) Phương pháp tách triết DNA tổng số

Mẫu lá non của các dòng thuốc lá chuyển gen và các dòng thuốc lá đối

chứng đem tách triết DNA theo quy trình (Michele và cs, 2002).

Quy trình tiến hành như sau:

Bước 1: nghiền 0,15g mẫu lá non bằng ống eppendort 2 ml trong nitơ lỏng để

phá vỡ thành tế bào.

Bước 2: bổ sung 500 µl đệm triết SDS, trộn đều.

Bước 3: ủ trong bể ổn nhiệt 650C trong 5 phút, thỉnh thoảng đảo qua đảo lại để

tăng khả năng biến tính các thành phần khác không phải DNA.

Bước 4: bổ sung tiếp 150 µl CH3COOK 5M, đảo đều, ủ ở trên đá 10 phút

Bước 5: ly tâm 13 000 vòng, 10 phút, thu 500 µl dịch nổi cho vào ống mới

Bước 6: bổ sung 350 µl isopropanol lạnh, để trong 20-30 phút để tăng lượng

tủa thu được, ly tâm 13 000 vòng, 10 phút, đổ bỏ phần dịch phía trên, thu tủa.

Bước 7: rửa tủa DNA bằng 350 µl cồn 70%, lặp lại 2 lần.

Bước 8: làm khô tủa ở nhiệt độ thường hoặc bằng máy làm khô.

Bước 9: hòa tan DNA vào 50 µl TE hoặc nước deion có bổ sung RNase nồng độ

100µg/ml.

Bước 10: bảo quản DNA trong tủ -200C.

Bước 11: DNA thu được sau quá trình tách triết, được mang đi đo OD260/280

bằng máy NanoDrop để kiểm tra độ tinh sạch DNA và nồng độ DNA, sau đó

pha loãng về nồng độ 100 ng/µl để thực hiện phản ứng PCR tiếp theo.

b) Khuếch đại DNA bằng phản ứng PCR

Phương pháp PCR để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển mục tiêu GS1

trong các dòng thuốc lá chuyển gen với cặp mồi đặc hiệu là pGS1-F:5’-

tctagagagagatccttttctgctctttgaa-3’/pGS1-R: 5’-gagctcaatcggaaaacgagggaaag -3’

Thành phần của phản ứng PCR được sử dụng theo kit GoTaq®Green

Master Mix của hãng Promega được mô tả trong bảng 2.4 và chu trình nhiệt

được tiến hành theo bảng 2.5.

Bảng 2.4. thành phần của phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen

Thành phần Thể tích 1 phản ứng (µl)

Tag polymerease

Master Mix (2X) Ion Mg2+

7,5 dNTP mix

Go Taq Buffer

Loading Dye 6X

DNA 2

Forward Primer 5pM 0,6

Reverse Primer 5pM 0,6

4,3 H2O

Tổng thể tích 15

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kì

Khởi đầu 94 4 phút 1

Biến tính 94 40 giây

35 Gắn mồi 56 40 giây

Kéo dài 72 1 phút

72 7 phút

Giữ 4 ∞

c) Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% . Theo phương

pháp của Sambrook và cs với quy trình như sau:

Bước 1: chuẩn bị gel agarose 0,8%: cân 0,8g agarose hòa tan trong 100 ml

dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng

50-600C, đổ dung dịch vào khay điện di có cài sẵn răng lược và đặt bản gel vào

bể điện di, đổ dung dịch TAE 1X ngập bản gel.

Bước 2: tra mẫu và điện di: sản phẩm PCR được tra vào giếng, điện di cùng

với Marker 1kb để kiểm tra kích thước.

Bước 3: nhuộm bản gel: bản gel được lấy ra từ khuôn, ngâm khoảng 10-20

phút trong dung dịch nước có chứa EtBr, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 302

nm trên máy soi DNA, ảnh được chụp bằng máy soi gel.

2.3.1.3. Phương pháp đánh giá về hình thái, sinh trưởng của các dòng

thuốc lá chuyển gen GS1

Để đánh giá về khả năng sử dụng hiệu quả nitơ của các dòng thuốc lá

chuyển gen và không chuyển gen, các cây thuốc lá sau 2-4 tuần trồng trên giá

thể, có độ đồng đều về kích thước được chuyển ra ngoài môi trường nhà kính,

không bón phân. Khi cây trồng được 3 tháng tuổi và 5 tháng tuổi chúng tôi sẽ

đánh giá về khả năng sinh trưởng và phát triển của cây qua chỉ tiêu về chiều

cao cây. Các chỉ tiêu về chiều cao cây được tổng hợp, phân tích và đánh giá

bằng phần mền excel (T-test).

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tạo các dòng Bạch đàn urô

2.3.2.1. Phương pháp chuyển gen vào Bạch đàn urô

a) Chuẩn bị vật liệu chuyển gen

- Hạt bạch đàn được sát khuẩn bằng cồn 70% (v/v) trong thời gian 1 phút, loại

bỏ cồn, sau đó khử trùng tiếp bằng Javel 50% trong thời gian 5 - 7 phút, rửa

lại bằng nước cất vô trùng 5 lần (lắc mạnh). Ngâm trong nước ít nhất 1 giờ.

Sau đó thấm khô hạt bằng giấy thấm khử trùng, hạt không quá khô.

- Hạt bạch đàn sau khi khử trùng được cấy vào môi trường dinh dưỡng MS cơ

bản có bổ sung thêm 30 g/l đường và 8 g/l agar, pH 5,8. Để trong tối, điều kiện

nhiệt độ phòng nuôi cấy 25oC, trong thời gian 3 ngày. Sau 3 ngày trong tối, hạt

bắt đầu nảy mầm và chuyển cây mầm nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 4-5

ngày, hạt nẩy mầm đồng đều thành cây mầm.

- Dùng panh và dao cắt các đoạn thân mầm dài khoảng 0,5 cm và lá mầm có

chứa cuống lá trên giấy thấm đã được làm ẩm bằng nước cất khử trùng để

tránh khô mẫu. Gắp thân mầm và lá mầm vào đĩa petri chứa môi trường tiền

nuôi cấy (Bảng 2.4) và nuôi trong tối 2 ngày ở 25oC. Đoạn thân mầm và mảnh

lá mầm sau khi tiền nuôi cấy sẽ được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.

b) Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens C58 mang gen GS1

- Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: lấy khuẩn A. tumefaciens chủng C58 chứa vector

chuyển gen được bảo quản trong glycerol ở -850C, cấy trải khuẩn lên môi

trường LB đặc bổ sung 50mg/l kanamycin, 50 mg/l rifamycin. Nuôi vi khuẩn ở

nhiệt độ 280C trong 2 ngày.

- Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: chọn một khuẩn lạc cho vào 10 ml môi trường

LB lỏng bổ sung hai loại kháng sinh với hàm lượng 50mg/l kanamycin và

50mg/l rifamycin. Nuôi khuẩn ở nhiệt độ 280C, lắc 200v/p, trong 14 -16 giờ.

Sau đó hút một 2ml dịch vi khuẩn cho vào 50ml LB lỏng, nuôi lắc 200v/p, ở

nhiệt độ 280C, trong 4 - 5 giờ cho đến khi OD600  0,5-0,8. Dịch vi khuẩn được

ly tâm lạnh ở tốc độ 5.000v/p, trong 10 phút, rồi loại bỏ dịch nổi thu cặn vi

khuẩn. Hoà tan cặn vi khuẩn trong dung dịch 1/2MS lỏng với giá trị OD600=

0,5. Để dung dịch ổn định trong 30 phút rồi mới dùng để biến nạp gen.

c) Chuyển gen GS1 vào vật liệu nhận gen

Thể nhận gen được ngâm trong dung dịch A.tumefaciens đã chuẩn bị ở

trên trong 10 phút (lắc nhẹ). Sau đó, mẫu được thấm khô và cấy chuyển lên

môi trường đồng nuôi cấy (Bảng 2.3), ở nhiệt độ 250C, trong 72 giờ để vi

khuẩn xâm nhiễm và chuyển gen sang tế bào thực vật.

d) Rửa khuẩn và cảm ứng tạo chồi

Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, thân mầm và lá mầm được rửa khuẩn bằng

nước cất vô trùng 1 lần và rửa lại bằng nước cất bổ sung kháng sinh diệt

khuẩn cefotaxime 400 mg/l, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và

chuyển sang môi trường cảm ứng tạo chồi (Bảng 2.3), nuôi dưới ánh sáng

cường độ 2.000lux, 25oC trong 4 ngày. Lá mầm và thân mầm chuyển gen GS1

sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo chồi sẽ được cấy chuyển

sang môi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh kanamycin.

e) Tái sinh chồi chuyển gen trên môi trường chọn lọc

Mẫu thân mầm và lá mầm sau khi được chuyển sang môi trường chọn

lọc trong vòng 21-24 ngày tạo mô sẹo, những mô sẹo lại tiếp tục được chọn lọc

trên môi trường có bổ sung kanamycin 150 mg/l, được nuôi cấy dưới ánh sáng

trắng cường độ 2.000 lux, 250C. Sau 4 tuần nuôi cấy, các chồi phát triển được

chuyển vào môi trường ra rễ có bổ sung 400 mg/l cefotaxime và 75 mg/l

kanamycin. Sau 3 tuần xác định số mẫu cấy số mẫu tạo sẹo/ tổng số mẫu cấy

ban đầu, số mẫu tạo cụm chồi/ tổng số mẫu cấy ban đầu.

2.3.2.2. Phân tích các dòng cây bạch đàn urô chuyển gen

a) Phương pháp tách triết DNA tổng số

Tách chiết DNA tổng số của các dòng bạch đàn urô chuyển gen GS1 và 1

dòng cây không chuyển gen (ký hiệu: wt) làm đối chứng. Lấy khoảng 100 mg lá

ở phần ngọn làm mẫu tách chiết DNA tổng số. DNA tổng số được tách theo

hướng dẫn kỹ thuật của Bộ Kít (Plant DNA Isolation Kít, hãng Norgen).

b) Kiểm tra sự có mặt của gen GS1 trong các dòng Bạch đàn urô chuyển

gen bằng kỹ thuật PCR

 Phương pháp PCR nhân đoạn gen mục tiêu (gen GS1) từ các dòng

Bạch đàn urô chuyển gen

- Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen GS1 có kích thước 408 bp, như sau: GS1-tF:

5’- G A T G A A G A G A C A T G G T A C G G G -3’ và GS1-tR: 5’- G G A

C T T G G T G C T G T A A T T T G T G -3’.

- Mẫu DNA tổng số: đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1, ký hiệu +);

DNA tổng số tách từ cây Bạch đàn urô không chuyển gen (ký hiệu: wt);

Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen GS1:

Stt Thành phần Thể tích (µl)

1. 8,5 H2O deion

2. 2X PCR mastermix 12,5

3. Prime 1: GS1-tF 10 pM 1,0

4. Prime 2: GS1-tR 10 pM 1,0

5. DNA sợi khuôn 2,0

Tổng thể tích 25

Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR nhân đoạn gen GS1:

Bước Nhiệt độ Thời gian

95oC 5 phút 1. Biến tính

1 phút 2. Biến tính

30 giây 3. Bắt mồi

94oC 60oC 72oC 1 phút 4. Tổng hợp

Từ bước 2-4 lặp lại 35 chu kỳ

10 phút 5. Kết thúc

72oC 4oC ∞ 6. Bảo quản

- Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 1,5%.

 Phương pháp PCR nhân đoạn gen chọn lọc (nptII) từ các dòng Bạch

đàn urô giả định chuyển gen

- Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen nptII có kích thước 700 bp, như sau:

NPTII-F: 5’-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3’ và NPTII-R: 5’-

ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3’.

Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen nptII:

Stt Thành phần Thể tích (µl)

1. 2. 3. 4. H2O deion 2X PCR mastermix Prime 1: NPTII-F: 10 pM Prime 2: NPTII-R: 10 pM 19 25 2 2

5. DNA sợi khuôn: 100ng/µl 2

Tổng thể tích 50

Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR nhân đoạn gen nptII:

Bước Thời gian

1. Biến tính Nhiệt độ 95oC 5 phút

2. Biến tính 1 phút

3. Bắt mồi 30 giây

4. Tổng hợp 94oC 62oC 72oC 1 phút

Từ bước 2-4 lặp lại 35 chu kỳ

5. Kết thúc 10 phút

6. Bảo quản 72oC 4oC ∞

- Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

1%.

 Phương pháp PCR nhân đoạn trình tự khởi động – Promoter (35S)

từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen

- Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn trình tự khởi động – Promoter (35S) có kích

thước 123 bp, như sau: p35S-cf3: 5’- CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG-3’ và

p35S-cr4: 5’- TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC-3’

Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn Promoter (35S):

Stt Thành phần Thể tích (µl)

1. 19 H2O deion

2. 2X PCR mastermix 50

3. Prime 1: p35S-cf3: 10 pM 2

4. Prime 2: p35S-cr4: 10 pM 2

5. DNA sợi khuôn: 100 ng/µl 2

Tổng thể tích 50

Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR nhân Promoter (35S):

Bước Nhiệt độ Thời gian

1. Biến tính 95oC 3 phút

2. Biến tính 95oC 30 giây

3. Bắt mồi 62oC 30 giây

4. Tổng hợp 72oC 45 giây

Từ bước 2-4 lặp lại 50 chu kỳ

5. Kết thúc 72oC 7 phút

6. Bảo quản 4oC ∞

- Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 2%.

 Phương pháp PCR nhân đoạn trình tự kết thúc -Terminator (NOS-t)

từ các dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen

- Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn trình tự kết thúc -Terminator (NOS-t) có kích

thước 118 bp, như sau: HA-nos-f: 5’-GCATGACGTTATTTATGAGATGGG-

3’/HA-nos-r: 5’-GACACCGCGCGCGATAATTTATCC-3’.

Thành phần phản ứng PCR nhân Terminator (NOS-t):

Stt Thành phần Thể tích (µl)

19 1. H2O deion

25 2X PCR mastermix 2.

2 Prime 1: HA-nos-f: 10 pM 3.

2 Prime 2: HA-nos-r: 10 pM 4.

2 DNA sợi khuôn: 100 ng/µl 5.

50 Tổng thể tích

Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR nhân Terminator (NOS-t):

Bước Nhiệt độ Thời gian

3 phút 1. Biến tính 95oC

30 giây 2. Biến tính 95oC

30 giây 3. Bắt mồi 62oC

45 giây 4. Tổng hợp 72oC

Từ bước 2-4 lặp lại 50 chu kỳ

7 phút 5. Kết thúc 72oC

∞ 6. Bảo quản 4oC

- Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

2%.

c) Kiểm tra các dòng cây bạch đàn urô chuyển gen bằng kỹ thuật lai

southern.

Các cây Bạch đàn urô sau chuyển gen đã chọn lọc trên môi trường bổ sung

kháng sinh kanamycin được kiểm tra sự có mặt của gen chuyển (gen GS1, gen

nptII) bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu. Các cây dương tính với

phản ứng PCR được sử dụng cho phân tích southern blot.

Tách chiết DNA tổng số (DNA genome)

DNA tổng số được tách đảm bảo độ tinh sạch cho phản ứng cắt enzyme

giới hạn. Chúng tôi tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá bánh tẻ của các dòng

bạch đàn urô bằng phương pháp tách chiết CTAB với đệm chiết có chứa PVP.

Với kích thước genome bạch đàn cần khoảng 10 µg mẫu DNA tổng số để thực

hiện phản ứng cắt enzyme giới hạn.

(1) Tách DNA tổng số: Nghiền 2 g lá bánh tẻ bạch đàn urô, chia vào 8 ống

effendorft 2 ml (0,25 g mỗi ống). Thêm 0.75 ml dung dịch đệm chiết CTAB

(100 mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 2% CTAB, 2% PVP), ủ

60 phút ở 65°C. Thêm 0,75 ml Chloroform, đảo đều, li tâm 12.000 rpm trong

15 phút, thu 700 µl dung dịch pha trên. Thêm 700 µl Isopropanol, ly tâm thu

cặn DNA (12.000 rpm, 15 phút), làm khô cặn DNA. Hòa cặn vào 50 µl dung

dịch TE.

(2) Tinh sạch cho phản ứng cắt: Gom DNA tổng số sau khi tách ở 8 ống vào 1

ống effendorft. Thêm 500 µl đệm TESC, đảo đều. Li tâm 6000 rpm trong 5

phút, thu cặn. Hòa cặn vào 500 µl đệm TES (100 mM Tris-HCl pH8, 20 mM

EDTA, 1M NaCl). Thêm 500 µl Isopropanol, li tâm thu cặn DNA. Rửa cặn

bằng cồn 70°, làm khô DNA và hòa cặn DNA trong 40 µl nước deion có RNAse.

 Cắt enzyme giới hạn:

Sử dụng 1u enzyme giới hạn cho mỗi µg mẫu DNA tổng số. Cắt qua đêm ở

37°C. Chúng tôi dùng enzyme HindIII.

STT Thành phần Thể tích cho phản ứng cắt 30 µl

1 Enzyme (10u/µl) 3 µl

2 Buffer (10x) 3 µl

3 DNA tổng số 30 µg

4 Nước deion Vừa đủ 30 µl

 Điện di trên gel agarose

Điện di sản phẩm cắt DNA tổng số đã tinh sạch trên gel agarose 1%, ở

điện thế thấp trong thời gian dài (6h). Chúng tôi đã bỏ qua bước nhuộm

Ethidium Bromide vì mức độ độc hại. Sau đó xử lý với dung dịch HCl 0,25M

trong 10 phút và ngâm vào dung dịch chuyển màng.

 Chuyển DNA lên màng lai

Phương pháp chuyển màng bằng dung dịch kiềm có ưu điểm là thời gian

chuyển màng nhanh, đơn giản, mẫu DNA tự liên kết với màng trong quá trình

chuyển màng. Màng lai được cắt vừa với bản gel và đặt dưới bản gel, một cột

giấy được đặt phía dưới nhằm tạo áp lực thẩm thấu trong khi dung dịch

chuyển màng thấm truyền từ trên thông qua các tấm giấy lọc được cấp từ khay

đựng buffer. Quá trình chuyển màng hoàn tất sau 3h với bản gel dày dưới

5mm, hoặc qua đêm. Sau khi chuyển màng, màng lai được rửa với dung dịch

2X SSC và tiến hành lai với mẫu dò.

 Tổng hợp mẫu dò (probe)

Bước 1: Nhân dòng trình tự gen npII từ plasmid pBI121 mang gen nptII bằng

phản ứng PCR với mồi đặc hiệu (NPTII-F: 5’-G A G G C T A T T C G G C T

A T G A C T G-3’ và NPTII-R: 5’-A T C G G G A G C G G C G A T A C C G

T A-3’). Thành phần chạy PCR và chu kỳ PCR như mục 2.5.2.2b: Mẫu PCR

sau khi tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng tổng hợp mẫu dò theo

hướng dẫn của bộ Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit.

 Tiền lai và lai

Màng lai được cố định bằng dung dịch tiền lai (200µl/cm2) trong 4h ở

44°C trong ống lai. Đổ bỏ dung dịch tiền lai. Bổ sung dung dịch lai (60µl/cm2),

lai qua đêm ở 44°C.

 Rửa màng lai loại bỏ mẫu dò thừa

Màng lai được rửa 2 lần với đệm rửa 2x ở nhiệt độ phòng, 1 lần với đệm

rửa 1X 65°C – 15 phút, 2 lần với đệm rửa 0.1x, 65°C – 15 phút.

 Hiện màng

Phức hợp enzyme Streptavidin-AP có khả năng gắn bám đặc hiệu với

gốc biotin trên mẫu dò. Ngoài ra, enzyme Alkaline phosphatase có khả năng

phân hủy , BCIP-T (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, p-toluidine salt)

thành hợp chất có màu tím đen. Nhờ vậy có thể phát hiện mẫu dò gắn với đoạn

DNA cần nghiên cứu trên màng lai. Quy trình này được thực hiên theo hướng

dẫn của bộ kit Biotin Chromogenic Detection Kit (hãng Themosience).

2.3.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại; các

bình thí nghiệm được đặt trong tủ tối hoặc trên giàn đèn có cường độ ánh sáng

2.000lux, chu kỳ 16h sáng và 8 h tối tùy theo thí nghiệm. Nhiệt độ phòng nuôi

cấy điều chỉnh ở mức 25 ± 20C. Số liệu được thu thập, xử lý tính toán bằng

phần mềm Excel.

- Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo = x 100%

- Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi = x 100%

- Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi = x 100%

- Hiệu suất chuyển gen = x 100%

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tạo các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 và đánh giá sinh trưởng ở phạm vi

phòng thí nghiệm

Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens đã được báo cáo

thành công và áp dụng phổ biến ở nhiều loài thực vật, trong đó có loại cây mô

hình là cây thuốc lá. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng dòng thuốc lá

K326 để kiểm tra hoạt động của cấu trúc gen pBI121-35S/GS1 thiết kế. Nhóm

nghiên cứu tiến hành chuyển cấu trúc này vào cây thuốc lá thông qua A.

Tumefaciens theo phương pháp Topping cải tiến (1998).

Sau quá trình chuyển gen, trước hết phải khẳng định nguyên liệu tạo

được là cây chuyển gen thực sự thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử ở mức

độ phòng thí nghiệm. Xác định sự có mặt của gen trong tế bào cây chuyển gen

được tiến hành bằng kỹ thuật PCR, với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển và

DNA của dòng cây cần kiểm tra. Tiếp theo là đánh giá sự ổn định của gen

chuyển ở các dòng cây chuyển gen qua các chu kỳ nhân giống vô tính và khả

năng sinh trưởng của các dòng cây chuyển gen ở phạm vi nhà lưới. Sự có mặt

và ổn định của cấu trúc gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen tạo điều

kiện thuận lợi cho việc chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô.

3.1.1. Kết quả chuyển cấu trúc gen GS1 vào dòng thuốc lá K326

Phương pháp chuyển gen thông qua A. Tumefaciens dựa trên cơ chế gây

bệnh của A. Tumefaciens khi xâm nhiễm vào tế bào, gắn đoạn T-DNA vào bộ

máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội

sinh, tạo ra khối u nên A. Tumefaciens được khai thác để chuyển gen ngoại lai

vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn. Để khai thác và sử dụng

Ti-plasmid của A. tumefaciens như một vector chuyển gen các nhà khoa học đã

loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine trong đoạn T-DNA và thay thế

vào đó là các gen marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ của T-

DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào nhờ các gen chvA, chB (giúp A.

tumefaciens tiếp xúc được với tế bào thực vật bị tổn thương) và các protein của

vùng vir (virE, virB, virG, virD-cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-

plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia

di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật,

vận chuyển tới thân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của tế bào nhận).

Chuyển gen GS1 vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

cũng là một bước quan trọng trong toàn bộ quá trình tạo được cây chuyển gen.

Hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương đối đơn giản và thời gian tái sinh từ mô lá

đến cây hoàn chỉnh ngắn (khoảng 3 tháng) và tỷ lệ tái sinh cao nên cây chúng

Tái sinh đa chồi

Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn

Dịch huyền phù vi khuẩn

tôi đã lựa chọn cây thuốc lá làm cây mô hình cho chuyển gen GS1.

Ra cây bầu đất

Ra rễ

Trồng cây trong bầu đất

Vi khuẩn trên môi trường LB đặc

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen GS1 vào thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn

A. tumefaciens.

Tạo dịch huyền phù vi khuẩn:

Chủng vi khuẩn A.tumefaciens tạo khuẩn lạc trên đĩa thạch để thành

những dòng thuần riêng biệt. Sau khi chọn một khuẩn lạc để nuôi qua đêm

trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 50 mg/l và rifamycin 50 mg/l,

cần nuôi phục hồi từ 3-4 giờ ở điều kiện 220 vòng/phút ở 280C để khuẩn lạc ở

pha log, ở pha này vi khuẩn A.tumefaciens đạt trạng thái khỏe nhất thuận lợi

cho quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào đối tượng chuyển gen.

Hiệu suất của quá trình chuyển gen phụ thuộc phần lớn vào chất lượng

của khuẩn, nếu khuẩn quá yếu OD600 quá thấp (0,1 đến 0,4) vi khuẩn không đủ

khả năng xâm nhiễm vào mẫu cấy. Ngược lại, OD600 quá cao (lớn hơn 1) lúc

này vi khuẩn đi vào trạng thái thoái già hóa và chết đi cũng không đủ khả

năng xâm nhiễm mặc dù đã tối ưu các điều kiện khác.

Dịch huyền phù vi khuẩn thu được có giá trị đo OD600 = 0,5 đủ điều kiện

để biến nạp vào thuốc lá (hình 3.2).

A

B

Hình 3.2. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens. A: A. tumefaciens trên môi trường LB

đặc bổ sung kanamycin và rifamycin; B: A. tumefaciens sau khi nuôi phục hồi

trên môi trường LB lỏng.

Giai đoạn biến nạp và đồng nuôi cấy:

Các mảnh lá được ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn (để tạo điều kiện

cho vi khuẩn xâm nhập vào mô lá. Sau 10 - 15 phút lây nhiễm chuyển các

mảnh lá lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô. Sau biến nạp, các mảnh lá

được đồng nuôi cấy hai ngày trên môi trường Co và chuyển sang môi trường

chọn lọc CL-TL50.

Hình 3.3. Biến nạp và đồng nuôi cấy.

Giai đoạn chọn lọc sau biến nạp:

Cấu trúc gen chuyển pBI121-35S/GS1 (đoạn T-DNA mang gen GS1 dưới

sự điều khiển biểu hiện của promoter 35S và gen nptII dưới sự điều khiển biểu

hiện của NOS-promoter) nên gen GS1 và nptII được chuyển đồng thời vào cây

chuyển gen. Gen ntpII (neomycin phosphotransferase II) – kháng kanamycin là

gen có khả năng tạo ra sản phẩm ức chế tác động của kanamycin được bổ sung

trong môi trường chọn lọc nên trên môi trường chọn lọc CL-TL50 bổ sung

kanamycin 50mg/l, những mảnh lá, cụm chồi, cây không mang cấu trúc gen

chuyển GS1 cũng đồng thời không mang gen kháng kanamycin thì sẽ không

thể tái sinh và phát triển được. Kanamycin tác động tới các tế bào không

chuyển gen theo cơ chế liên kết với tiểu phần nhỏ của ribosome trong tế bào,

ức chế quá trình sinh tổng hợp protein và các con đường sinh tổng hợp khác

liên quan, trong đó có hoạt động của lục lạp. Mảnh lá, cụm chồi, cây mất khả

năng hấp thụ dinh dưỡng, hoạt động của lục lạp bị rối loạn nên sẽ bị vàng và

chết dần. Vì vậy, kanamycin được dùng rộng rãi như một chất chọn lọc các tế

bào, mảnh lá, cây chuyển gen (Bevans và cs, 1983; Herrera-Estrlla và cs, 1983)

qua các giai đoạn.

Sau đồng nuôi cấy các mảnh lá thuốc lá được chuyển sang môi trường

CL-TL50, khoảng 2 -3 tuần các mảnh lá được cảm ứng tạo mô sẹo được tách và

cấy chuyển sang môi trường chọn lọc CL-TL50 một lần nữa. Các chồi mọc tốt

trên môi trường CL-TL50 được tách và cấy chuyển sang môi trường ra rễ RR

để tạo thành cây hoàn chỉnh. Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng

qua các giai đoạn khác nhau thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1.Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu biến nạp qua các giai đoạn (%)

Mảnh

Số chồi phát

Số chồi

lá tạo

Tỷ lệ

Thí nghiệm

lá biến

triển trên CL-

ra rễ trên

(%)

cụm

(%)

nạp

TL150

RR50

chồi

Mẫu thuốc lá

K326 chuyển gen 50 35 70 38 32 84,21 GS1

- - Đ/C (-) 15 - - -

Ghi chú: Đ/C (-): mẫu thuốc lá không biến nạp gen.

Kết quả cho thấy rằng, từ 50 mảnh lá thuốc lá biến nạp gen thu được 35

mảnh lá cảm ứng tạo được cụm chồi trên môi trưởng bổ sung kanamycin,

chiếm tỷ lệ 70%. Các cụm chồi được tách ra khỏi mảnh lá và cấy chuyển sang

môi trường chọn lọc mới (CL-TL150) thu được 38 chồi phát triển tốt. Ngược lại,

các mảnh lá thuốc lá không biến nạp gen - Đ/C (-), 100% mẫu bị vàng và chết

không tạo được chồi trên môi trường bổ sung kháng sinh kanamycin (hình

3.4).

Hình 3.4. Mảnh lá trên môi trường chọn lọc sau 2 tuần. A: Mẫu lá biến nạp trên

môi trường chọn lọc CL-TL50; B: Mẫu lá không biến nạp trên môi trường tái

sinh TS; C: Mẫu lá không biến nạp trên môi trường chọn lọc CL-TL50

Một dòng chuyển gen hoàn chỉnh phải có khả năng ra rễ để phát triển

thành một cây hoàn thiện trên môi trường chọn lọc. Những chồi không chuyển

gen sẽ không có khả năng ra rễ, vàng và chết dần.

Hình 3.5. Cây thuốc lá chuyển gen GS1 trên môi trường chọn lọc CL-TL50

Qua các giai đoạn chọn lọc in vitro, từ 38 dòng đã thu được 32 dòng

chuyển gen GS1 phát triển tốt, lá xanh đậm, chồi mập, bộ rễ dài (hình 3.5) trên

môi trường ra rễ chọn lọc. Tỷ lệ ra rễ của các chồi chuyển gen GS1 (84,21%)

trên môi trường chọn lọc ra rễ là tương đối cao.. Bước đầu có thể dự đoán 32

dòng thuốc lá thu được là các dòng chuyển gen GS1; Tuy nhiên để khẳng định

chắc chắn các dòng này là dòng chuyển gen, chúng tôi ra đưa các dòng chuyển

gen GS1 và dòng không chuyển gen (wt) ra trồng trong giá thể đất để thu lá

phân tích bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu nhận gen GS1.

3.1.2. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 bằng PCR

Cấu trúc chuyển gen GS1 dưới sự điều khiển hoạt động của promoter

35S được chuyển vào mảnh lá cây thuốc lá giống K326. Các dòng ra rễ và phát

triển tốt trên môi trường chọn lọc ra rễ được đưa ra trồng ngoài nhà kính và

kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào bằng phương pháp PCR trên khuôn là

DNA tổng số tách từ các mảnh lá thuốc lá với cặp mồi đặc hiệu F-GS1/R-GS1.

Kết quả thu được 25 dòng trên tổng số 32 dòng cho kết quả dương tính với

phản ứng PCR. Các giếng xuất hiện một băng vạch DNA đặc hiệu có kích

thước khoảng 1,1Kb. Điều này chứng tỏ các dòng cây này có mang cấu trúc

gen GS1 mong muốn (hình 3.6).

Hình 3.6. Sản phẩm PCR nhân gen GS1. M: Maker 1 Kb; ĐC (+): đối chứng

dương là plasmid mang gen GS1; 1 - 6: mẫu thuốc lá chuyển gen GS1.

3.1.3. Phân tích, đánh giá sinh trưởng các dòng thuốc lá chuyển gen

Nitơ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với quá trình sinh trưởng và phát

triển ở thực vật. Khi cây trồng bị thiếu nitơ cây phát triển chậm, thấp lùn, nẩy

chồi kém. Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn

nitơ vốn là nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng, nếu gen GS1 hoạt động

mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc nghèo nguồn nitơ cây vẫn có

khả năng sinh trưởng nhanh.

Các dòng thuốc lá chuyển gen GS1 và không chuyển gen (wt) sau khi

đưa ra cây trên giá thể được 2-4 tuần (hình 3.7), có độ đồng đều về kích thước

được đem chuyển ra ngoài môi trường với điều kiện thiếu chất dinh dưỡng, đất

khô cằn, trồng tại vị trí có ánh sáng kém không thuận lợi cho quá trình quang

hợp. Kết quả, cho thấy các dòng cây chuyển gen GS1 (D-1) sinh trưởng nhanh

hơn so với cây đối chứng là 31% (cây 3 tháng tuổi) và 25% (cây 5 tháng tuổi)

(hình 3.8).

WT

D-1

D-2

D-3

Hình 3.7. Cây thuốc lá K326 trồng trên giá thể. WT: Cây đối chứng không

chuyển gen; D-1, D-2 và D-3: các dòng cây chuyển gen GS1.

Các dòng cây chuyển gen (D-1, D-2, D-3) và không chuyển gen (wt) sau

khi trồng, đánh gia sinh trưởng về chiều cao ở giai đoạn 3 và 5 tháng tuổi. Kết

quả thu được trình bày như ở bảng 3.2 cho thấy rằng sinh trưởng về chiều cao

của dòng thuốc lá chuyển gen GS1 và dòng thuốc lá không chuyển gen khác

nhau là có ý nghĩa. Giai đoạn cây 3 tháng tuổi 3 dòng thuốc lá chuyển gen GS1

có chiều cao cây đạt từ 118,5 cm đến 130,1cm, trong khi đó dòng thuốc lá

không chuyển gen chỉ đạt chiều cao 90,6cm. Giai đoạn 5 tháng tuổi, các dòng

thuốc lá chuyển gen GS1 cũng có chiều cao (135,8 - 159,5cm) cao hơn so với

dòng đối chứng không chuyển gen (119,6cm). Kết quả này có ý nghĩa quan

trọng trong việc sử dụng cấu trúc pBI121-35S/GS1 để biến nạp vào các loài cây

trồng khác, nâng cao khả năng hấp thụ và sử dụng hiệu quả nguồn nitơ nhất là

trong điều kiện cây trồng bị thiếu hụt nguồn nitơ cần thiết cho quá trình sinh

trưởng và phát triển của cây.

Bảng 3.2. Bảng so sánh chiều cao cây đối chứng và cây chuyển gen GS1

Dòng

WT D-1 D-2 D-3 Chiều cao cây (cm) (3 tháng tuổi) 90,6±2,08 130,1±2,31 118,5±3,50 126,4±3,33 Chiều cao cây (cm) (5 tháng tuổi) 119,6±1,52 159,5±3,78 135,8±2,33 150,3±4,26

Hình 3.8. Cây thuốc lá K326, 5 tháng tuổi. wt: cây thuốc lá không chuyển gen và

D-1: cây thuốc lá chuyển gen GS1.

Như vậy, cấu trúc gen GS1 khi chuyển vào cây có tác dụng mạnh trong

suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, làm tăng khả năng tổng hợp

và tích lũy nitơ trong cây, thúc đẩy quá trình quang hợp và tổng hợp các chất

hữu cơ; thân lá phát triển tốt, giữ vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá

trình đẻ nhánh, ra hoa tạo quả sớm, số lượng quả nhiều, cho năng xuất cao. Ở

cây đối chứng không chuyển gen (wt) có biểu hiện hoàn toàn ngược lại, thiếu

nitơ cây sinh trưởng chậm, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng,

đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và tích lũy, giảm

năng suất.

3.2. Kết quả tạo các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1

Trên cơ sở kế thừa các kết quả nghiên cứu trên thế giới về tạo giống cây

lâm nghiệp biến đổi gen sinh trưởng nhanh. Đề tài đã sử dụng gen GS1- gen

chìa khóa liên quan đến kích thích sinh trưởng nhanh phân lập từ các đối

tượng cây trồng khác để chuyển vào cây Bạch đàn urô nhằm giải quyết vấn đề

về cải thiện giống Bạch đàn urô ở Việt Nam. Đặc biệt hướng nghiên cứu của đề

tài là lựa chọn gen GS1 chuyển vào Bạch đàn urô không những có thể tạo ra

giống Bạch đàn urô chuyển gen có sức sinh trưởng nhanh, mà giống Bạch đàn

urô chuyển gen còn có thể gây trồng hiệu quả trên các vùng đất bạc màu -

nghèo dinh dưỡng, đang là một hướng nghiên cứu phù hợp với định hướng

phát triển giống cây lâm nghiệp của Bộ Nông nghiệp và PTNT hiện nay. Vì

thực tế trồng rừng ở nước ta cho thấy, hầu hết các vùng được quy hoạch trồng

rừng là các vùng đất trống, đồi núi trọc nghèo dinh dưỡng. Nên việc tạo ra

được giống bạch đàn mới có sức sinh trưởng nhanh và gây trồng hiệu quả trên

các nền đất nghèo dinh dưỡng sẽ nâng cao được năng suất và góp phần vào

việc mở rộng diện tích gây trồng, phủ xanh đất trống - đồi núi trọc.

3.2.1. Kết quả chuyển cấu trúc gen GS1 vào Bạch đàn urô

Muốn chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn A. tumefaciens thì trước

tiên phải tạo được vật liệu thực vật sạch in vitro. Đây là giai đoạn đầu tiên có

vai trò quan trọng nhằm cung cấp cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình

chuyển gen. Yêu cầu của giai đoạn này là tỷ lệ hạt nảy mầm cao và tỷ lệ mẫu

sạch cao. Để đáp ứng được như trên thì các hạt lấy từ ngoài môi trường tự

nhiên cần được làm sạch nguồn vi sinh vật trước khi đưa chúng vào môi

trường nuôi cấy. Hạt được sát khuẩn bằng 70% (v/v) cồn trong thời gian 1

phút, để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, đồng

thời bảo vệ mô thực vật và tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.

B

A

Hình 3.9. Tạo nguồn vật liệu chuyển gen. A: hạt bạch đàn khử trùng được gieo

trên môi trường MS; B: hạt bạch đàn nảy mầm thành cây trên môi trường MS

sau 7 - 8 ngày nuôi cấy.

Kết quả cho thấy hạt Bạch đàn urô được khử trùng và gieo vào môi

trường với tỷ lệ mẫu sạch 97%, tỷ lệ nảy mầm nảy mầm đạt khoảng 95% đáp

ứng nguồn nguyên vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.

Ngay trong cùng chi bạch đàn thì vật liệu sử dụng thích hợp cho chuyển

gen cũng khá khác nhau (lá mầm, trụ dưới lá mầm, thân thật, chồi đỉnh, chồi

sơ cấp, lá non). Trong đó hai loại vật liệu được sử dụng phổ biến nhất là lá

mầm và trụ dưới lá mầm hoặc cả hai loại này (Tournier và cs, 2003; Tibok,

1990; Quisen, 2007; Dibax và cs, 2010; Sarotoretto và cs, 2002; Gonzalez và cs,

2002; Chang và cs, 2006; Ho và cs, 1998; Prakash và Gurumurthi, 2009). Hạt

sau khi nuôi cấy 7 - 8 ngày trên môi trường MS phát triển thành cây mầm. Các

lá mầm và thân mầm được cắt thành những mảnh nhỏ cấy lên các công thức

môi trường tiền nuôi cấy Pre-T và Pre-L.

Hình 3.10. Thân mầm và lá mầm trên môi trường tiền nuôi cấy. A: Thân mầm

bạch đàn trên môi trường tiền nuôi cấy Pre-T; B: Mảnh lá mầm bạch đàn trên

môi trường tiền nuôi cấy Pre-L.

Mẫu thân mầm bạch đàn được cắt thành đoạn có kích thước 0,5cm và lá

mầm được cắt có đoạn cuống lá. Ở thí nghiệm này chúng tôi tiến hành biến

nạp ngẫu nhiên 5 lô thí nghiệm, tổng số mẫu sử dụng là 1100 mẫu thân mầm

và 900 mẫu lá mần. Mẫu bạch đàn được nuôi cảm ứng trên môi trường Pre-T

và Pre-L trong tối 2 ngày. Thời gian tiền nuôi cấy là khoảng thời gian mà mẫu

cấy được nuôi cấy trên môi trường tái sinh trước khi tiến hành quá trình lây

nhiễm vi khuẩn, trong thời gian này các tế bào, mô diễn ra quá trình phân chia

mạnh mẽ. Vi khuẩn A. tumefaciens có khả năng chuyển gen tốt hơn đối với các

tế bào, mô đang phân chia.

Sau khi nuôi cảm ứng đoạn thân mầm và lá mầm 2 ngày trên môi

trường tiền nuôi cấy tiến hành biến nạp đoạn gen GS1 nhờ chủng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển gen. Bản chất của vi

khuẩn A. tumefaciens là loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, nên sự tồn tại

phát triển với khoảng thời gian dài sẽ có tác dụng không mong muốn đến sự

sống, phát triển và phát sinh hình thái của mẫu sau này. Nhưng nếu khoảng

thời gian này quá ngắn thì sự xâm nhiễm chưa kịp diễn ra, giảm sự biến nạp

gen và hiệu quả chuyển gen sẽ thấp. Thời gian đồng nuôi cấy mẫu là khoảng

thời gian mà mẫu cấy đã lây nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy

trên môi trường đồng nuôi cấy, môi trường này vừa chứa các chất cần thiết

cho mô, tế bào thực vật sinh trưởng, phát triển lại vừa chứa các yếu tố kích

thích sự sinh trưởng, phát triển và xâm nhiễm của vi khuẩn vào mô và tế bào

thực vật. Theo các nghiên cứu từ trước khoảng thời gian đồng nuôi cấy thích

hợp sẽ là 10 phút, đây là khoảng thời gian thích hợp sẽ tạo điều kiện cho vi

khuẩn xâm nhiễm và tiến hành quá trình chuyển gen vào mô thực vật, đồng

thời sẽ giúp cho bước diệt khuẩn, phục hồi cũng như chọn lọc về sau được dễ

dàng.Thân mầm và lá mầm bạch đàn được cho vào dịch huyển phù vi khuẩn

với thời gian tối ưu là 10 phút, sau đó được thấm khô trên giấy thấm vô trùng,

rồi cấy lên môi trường đồng nuôi cấy Co-T và Co-L, để trong tối 72 giờ.

A

B

Hình 3.11. Thân mầm và lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy. A: Thân mầm

bạch đàn trên môi trường đồng nuôi cấy Co-T; B: Mảnh lá mầm bạch đàn trên

môi trường đồng nuôi cấy Co-L.

Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu được rửa sạch vi khuẩn bằng dung

dịch cefotaxime 400mg/l, thấm khô và cấy chuyển sang môi trường tái sinh có

bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime 400mg/l. Bước rửa khuẩn đảm bảo

cho mẫu cấy không bị nhiễm lại khuẩn A.tumefaciens, nếu bước rửa khuẩn

không đảm bảo đã rửa sạch khuẩn thì vi khuẩn sẽ phát triển cùng với mẫu cấy

trên môi trường chọn lọc với mật độ cao và mẫu cấy sẽ bị vi khuẩn làm đen và

chết, mẫu cấy không có khả năng phát triển trên môi trường chọn lọc. Đồng

thời, sau khi rửa khuẩn cần tiến hành chuyển mẫu biến nạp lên môi trường tái

sinh có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime 400 mg/l, đây là bước hoạt

hóa đảm bảo cho mẫu cấy thích ứng với điều kiện nuôi cấy. Nếu chuyển luôn

mẫu cấy lên môi trường có bổ sung chất chọn lọc kanamycin 150mg/l mẫu cấy

không có thời gian thích ứng sẽ làm cho mẫu cấy bị chết khi cho ngay lên môi

trường kháng sinh có nồng độ cao.

A

B

Hình 3.12. Mẫu bạch đàn trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh diệt

khuẩn. A: Mẫu thân mầm bạch đàn trên môi trường Aft-T; B: Mẫu lá mầm bạch

đàn trên môi trường Aft-L.

Sau biến nạp, mẫu cấy được nuôi cấy 4 ngày trên môi trường tái sinh

(hình 3.12) có những mô đã được tạo sẹo ở hai đầu bị tổn thương đối với mẫu

cấy là đoạn thân mầm và tại cuống lá đối với mẫu biến nạp là đoạn lá mầm.

Mẫu cấy không bị nhiễm đảm bảo cho các thí nghiệm ở các bước chọn lọc trên

chồi nuôi cấy trên môi trường có kháng sinh chọn lọc ở các bước tiếp theo.

Quy trình chuyển gen vào Bạch đàn urô đã được Bùi Văn Thắng và cộng

sự thiết lập (chưa công bố). Theo quy trình này trước khi chuyển mẫu sang

môi trường chọn lọc, các mẫu nuôi cấy đã được nuôi trên môi trường tái sinh 4

ngày để phục hồi. Đối với mẫu nuôi cấy là thân mầm khả năng tạo sẹo cao hơn

so với mẫu nuôi cấy là lá mầm.

Do đoạn T-DNA chuyển gen GS1, cấu trúc chuyển có mang gen kháng

kanamycin, nên các môi trường sau biến nạp đều được bổ sung 150mg/l

kanamycin để sàng lọc thể nhận gen GS1. Trong nghiên cứu này, kết quả là các

mẫu thân mầm và lá mầm sống sót trên môi trường chọn lọc có chứa

kanamycin.

Thí nghiệm chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô được lặp lại 5 lần. Sau khi

chuyển sang môi trường chọn lọc nuôi khoảng 21-24 ngày, các mẫu thân mầm

và lá mầm sống sót và xuất hiện mô sẹo tại các vị trí bị tổn thương và tại các vị

trí tổn thương cũng có thể đã xuất hiện các chồi nhỏ. Theo như nghiên cứu

trước về quá trình tái sinh cây bạch đàn, đây là tiền đề cho việc tái sinh chồi.

Sau khoảng 21-24 ngày tiếp theo các cụm chồi sẽ được chuyển sang môi trường

CL-T150 và CL-L150, các chồi có chiều cao khoảng 2-3cm được cắt chuyển sang

môi trường chọn lọc ra rễ RR75

Song song với thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm đối chứng được thiết

lập bằng cách đặt các mẫu thân mầm và lá mầm trực tiếp lên môi trường CL-

T150 và CL-L150. Toàn bộ các mảnh lá mầm và thân mầm không chuyển gen

được đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh đều đen dần và chết.

Kết quả chọn lọc sau biến nạp được thể hiện ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả chuyển gen GS1 vào Bạch đàn urô

CTTN Tên mẫu Số mẫu tạo sẹo Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) Chồi tạo thành Chồi ra rễ Tỷ lệ (%) Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo đa chồi

lá mầm 900 550 61,1 35 3,9 41 21 51,2

Mẫu biến nạp 1100 800 72,7 80 7,3 55 29 52,7 thân mầm

50 20 33,3 - - - - - lá mầm Đ/C (wt) 60 30 50,0 - - - - - thân mầm

Sau khi mẫu bạch đàn được nuôi cấy trên môi trường tái sinh 4 ngày

được chuyển lên môi trường chọn lọc. Sau 3 tuần nuôi cấy, sẽ có những mô, tế

bào thực vật bị hóa nâu hay bạch tạng không phát triển rồi chết trên môi

trường có bổ sung chất kháng sinh (hình 3.13 và 3.14). Giải thích hiện tượng

này là do các mô tế bào này không mang gen ngoại lai nptII. Do đó, trên môi

trường nuôi cấy bổ sung kanamycin làm mất sức sống và khả năng phát triển

của mẫu. Còn các mẫu sống sót được trên môi trường có chứa kháng sinh là do

tế bào đã mang gen ngoại lai nptII được điều khiển bởi NOS-promoter. Khi

promoter hoạt động, gen nptII sẽ mã hóa cho enzyme Neomycin phosphotrans-

ferase II làm mất hoạt tính kanamycin nên mô thực vật vẫn phát triển tốt. Tác

dụng gây độc của kanamycin đối với mô bạch đàn đã được ghi nhận trên đối

tượng E. grandis (Gonzalez và cs, 2002), E.camadulensis (Quisen và cs, 2009).

A

B

Hình 3.13. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của đoạn thân mầm. A: đoạn thân

mầm khi trước khi chuyển lên môi trường chọn lọc; B: đoạn thân mầm trên môi

trường chọn lọc sau 3 tuần nuôi cấy.

A

B

Hình 3.14. Quá trình sàng lọc thể nhận gen của mảnh lá mầm. A: mảnh lá mầm

trước khi chuyển lên môi trường chọn lọc; B: mảnh lá mầm trên môi trường

chọn lọc sau 3 tuần nuôi cấy.

Mẫu biến nạp sống sót trên môi trường chọn lọc là điều kiện tiên quyết

quyết định đến hiệu quả chuyển gen. Mẫu cấy sống sót trên môi trường có chất

chọn lọc kanamycin với nồng độ thích hợp đảm bảo cho mẫu chuyển gen sống

sót trên môi trường chọn lọc nghiêm ngặt.

Kết quả nghiên cứu, theo bảng 3.3 đã chỉ ra rằng hiệu quả biến nạp ở

đoạn thân mầm có cao hơn so với lá mầm. Khả năng sống sót tạo sẹo ở thân

mầm là 72,7%, lá mầm là 61,1% và tạo cụm chồi ở đoạn thân mầm là 7,3%

cao hơn so với ở lá mầm là 3,9%. Sau 3 tuần chọn lọc trên môi trường chọn lọc

tiếp tục chuyển những đoạn thân mầm và lá mầm đã tạo cụm chồi lên môi

trường chọn lọc lần 2, sau 3 tuần các cụm chồi phát triển có chiều cao khoảng

1,5-2cm (hình 3.15) được cắt chuyển sang môi trường ra rễ có bổ sung kháng

sinh chọn lọc.

A

B

Hình 3.15. Chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc từ mẫu thân mầm và lá mầm

sau 6 tuần nuôi cấy. A: chồi phát triển từ đoạn thân mầm; B: chồi phát triển từ

mảnh lá mầm.

Các điều kiện nuôi cấy tối ưu và mẫu biến nạp được chọn lọc nghiêm

ngặt bởi chất chọn lọc kanamycin, những cụm chồi được hình thành trên môi

trường chọn lọc bước đầu khẳng định mang gen ngoại lai GS1, đảm bảo cho

thí nghiệm chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường ra rễ.

Các chồi tái sinh từ thể nhận gen là mảnh lá mầm và đoạn thân trên môi

trường chọn lọc có 150 mg/l kanamycin tiếp tục được sàng lọc trên môi trường

ra rễ chọn lọc có 75 mg/l kanamycin. Đồng thời chồi Bạch đàn urô không

chuyển gen (wt) cũng được nuôi cấy trên môi trường ra rễ chọn lọc có 75 mg/l

kanamycin làm đối chứng.

Kết quả sau 2 lần cấy chuyển trên môi trường ra rễ chọn lọc có 75 mg/l

kanamycin, kết quả thống kê thu được như bảng 3.3 cho thấy rằng, từ 900 thể

nhận gen là mảnh lá mầm chuyển gen GS1 thu được 41 chồi tái sinh trên môi

trường chọn lọc 150 mg/l kanamycin nhưng chỉ thu được 21/41 chồi ra rễ trên

môi trường chọn lọc có 75 mg/l kanamycin. Kết quả tương tự ở đoạn thân

mầm từ từ 1100 thể nhận gen là mảnh lá mầm chuyển gen GS1 thu được 55

chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc 150mg/l kanamycin nhưng chỉ thu được

29/55 chồi ra rễ trên môi trường chọn lọc có 75 mg/l kanamycin. Ngược lai, các

chồi Bạch đàn urô không chuyển gen (wt) không có khả năng ra rễ trên môi

trường chọn lọc sau 3 tuần nuôi cấy chồi vàng và chết (hình 3.16).

A

B

C

Hình 3.16. Chồi Bạch đàn urô sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ. A: Chồi

đối chứng không chuyển gen (wt) trên môi trường ra rễ không bổ sung

kanamycin; B: Chồi chuyển gen trên môi trường ra rễ bổ sung 75 mg/l

kanamycin; C. Chồi đối chứng không chuyển gen (wt) trên môi trường ra rễ bổ

sung 75 mg/l kanamycin.

Các cây ra rễ được huấn luyện và đưa ra trồng trong bầu đất (hình 3.17

và 3.18), cây được 3 tháng tuổi ra lá mới được cắt để tách chiết DNA tổng số

làm khuôn cho phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu.

Hình 3.17. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 2 tuần tuổi.

Hình 3.18. Các dòng Bạch đàn chuyển gen GS1 trồng trong chậu đất 3 tháng tuổi.

3.2.2. Kiểm tra các dòng Bạch đàn urô chuyển gen bằng phương pháp PCR

Trong 50 dòng ra rễ trên môi trường chọn lọc, chúng tôi đưa ra trồng

được 41 dòng ở nhà kính, sau khi ra cây trồng được 3 tháng tuổi tiến hành thu

mẫu lá non của các dòng Bạch đàn chuyển gen để tách chiết DNA tổng số.

DNA tổng số được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.

3.2.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen

GS1 và dòng đối chứng

Lấy mẫu 41 dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen GS1 (ký hiệu từ E-

X1 đến E-X41) và 1 dòng cây không chuyển gen (ký hiệu: wt) làm đối chứng.

Mỗi dòng cắt khoảng 100 mg lá bánh tẻ làm mẫu tách chiết DNA tổng số. DNA

tổng số được tách theo hướng dẫn kỹ thuật của Bộ kít (Plant DNA Isolation

Kít, hãng Norgen - Canada).

DNA tổng số sau khi tách chiết được định tính bằng kỹ thuật điện di

trên gel agarose 0,8%. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá bánh tẻ Bạch

đàn urô được thể hiện trên ảnh điện di đồ (hình 3.19 a,b) sau đây:

Hình 3.19a. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1,

điện di trên gel agarose 0,8%.

Hình 3.19b. DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá Bạch đàn urô chuyển gen GS1,

điện di trên gel agarose 0,8%.

Trên ảnh điện di đồ, băng DNA tổng số thu được cho thấy một số mẫu

chỉ có một phân đoạn duy nhất, đều, gọn, tập trung, không xuất hiện vệt sáng

phía sau kéo dài, phân tử lượng cao (nằm gần giếng tra mẫu). Điều đó cho thấy

các mẫu DNA tách chiết được không bị đứt gãy, có độ nguyên vẹn cao, không

lẫn protein, các loại RNA và các tạp chất khác. Một số mẫu, ngoài việc thu

được băng DNA có kích thước lớn nằm trên cùng, các mẫu DNA xuất hiện các

đoạn DNA nhỏ đứt gãy. Tuy nhiên, chất lượng DNA thu được đảm bảo đủ tiêu

chuẩn để thực hiện phản ứng PCR nhân gen.

Bảng 3.4. Hàm lượng và độ sạch của các mẫu DNA tổng số.

Hàm

Tỷ lệ

Hàm

Tỷ lệ

Stt

Tên mẫu

lượng

OD260nm/

Stt Tên mẫu

lượng

OD260nm/

(ng/µl)

OD280nm

(ng/µl)

OD280nm

1 wt

524 1,86

22 E-X21

456 1,90

2 E-X1

427 1,82

23 E-X22

578 1,86

3 E-X2

623 1,90

24 E-X23

409 1,89

4 E-X3

615 1,91

25 E-X24

520 1,88

5 E-X4

619 1,94

26 E-X25

630 1,90

6 E-X5

578 1,86

27 E-X26

617 1,88

7 E-X6

592 1,89

28 E-X27

578 1,82

8 E-X7

713 1,85

29 E-X28

546 1,81

9 E-X8

675 1,82

30 E-X29

705 1,94

10 E-X9

498 1,80

31 E-X30

528 1,95

11 E-X10

597 1,96

32 E-X31

552 1,88

12 E-X11

598 1,82

33 E-X32

559 1,82

13 E-X12

646 1,90

34 E-X33

560 1,88

14 E-X13

466 1,87

35 E-X34

565 1,85

15 E-X14

497 1,98

36 E-X35

610 1,99

16 E-X15

520 1,92

37 E-X36

399 1,92

17 E-X16

488 1,87

38 E-X37

409 1,93

18 E-X17

625 1,85

39 E-X38

456 1,90

19 E-X18

467 1,90

40 E-X39

567 1,85

20 E-X19

510 1,90

41 E-X40

654 1,85

21 E-X20

592 1,89

Tiếp theo các mẫu DNA tách chiết được xác định nồng độ và độ tinh

sạch trên máy Nanodrop2000: OD260nm và OD280nm; tỷ lệ OD260nm/OD280nm có

giá trị 1,8 – 2,0; mẫu DNA được xem là sạch, còn tỷ số nhỏ hơn 1,8 và lớn hơn

2,0 cho biết DNA tách chiết còn bị nhiễm tạp protein. Kết quả đo các mẫu

DNA tách chiết được trình bày cụ thể như bảng 3.4.

Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy 42 mẫu DNA tổng số tách chiết từ lá bạch

đàn đều có hàm lượng cao, giao động từ 399 đến 713 ng/µl. Tỷ lệ

OD260nm/OD280nm của 16 mẫu DNA tổng số đều nằm trong khoảng 1,8 – 2,0,

điều này cho thấy các mẫu DNA sạch protein đảm bảo chất lượng để thực hiện

các phản ứng PCR nhân gen với mồi đặc hiệu. Các mẫu DNA tổng số, sau khi

đo được hàm lượng DNA, tiến hành pha loãng các mẫu về cùng một nồng độ là

100 ng/µl bằng nước đề ion và bảo quản mẫu ở tủ - 20oC.

3.2.2.2. PCR nhân đoạn gen GS1 của các dòng bạch đàn urô chuyển gen

Các mẫu DNA tổng số tách chiết từ các dòng Bạch đàn urô giả định

chuyển gen (ký hiệu: E-X1 – E-X41) và cây đối chứng không chuyển gen (ký

hiệu: wt) được sử dụng làm khuôn DNA trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc

hiệu nhân một đoạn gen gs1 có kích thước 408 bp (GS1-tF:5’- G A T G A A G

A G A C A T G G T A C G G G-3’ và GS1-tR: 5’-G G A C T T G G T G C T G

T A A T T T G T G -3’). Thành phần và chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR

được mô tả như ở phần phương pháp.

Hình 3.20. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ các dòng Bạch đàn urô

chuyển gen. Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100bp; (+) đối chứng dương

(plasmid pBI121-35S/GS1); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-36

tương ứng với mẫu E-X1 đến E-X36.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%; kết quả thu được

cho thấy rằng: Trong 41 dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen phân tích có 7

dòng (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) xuất hiện một băng

DNA có kích thước khoảng 408bp bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, rõ nét,

bằng với mẫu đối chứng dương (+). Các dòng còn lại và mẫu wt đối chứng âm

(cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này. Kết quả này, bước

đầu cho thấy 7 dòng Bạch đàn urô phân tích có thể là các dòng đã được chuyển

gen GS1.

3.2.2.3. PCR nhân gen nptII của các dòng Bạch đàn urô chuyển gen

DNA tổng số của 7 dòng Bạch đàn urô chuyển gen dương tính với đoạn

gen GS1 và dòng wt được sử dụng làm khuôn để phân tích sự có mặt của gen

chọn lọc (gen nptII) trong các dòng Bạch đàn urô chuyển gen bằng kỹ thuật

PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen nptII có kích thước 700 bp (NPTII-F: 5’-G

A G G C T A T T C G G C T A T G A C T G-3’; NPTII-R: 5’-A T C G G G A

G C G G C G A T A C C G T A-3’) tham khảo Tadeusz Wroblewski và cộng

sự (2007). Thành phần và chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR được mô tả như

ở phần phương pháp.

Hình 3.21. Sản phẩm PCR nhân gen nptII từ các dòng Bạch đàn urô giả định

chuyển gen. Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100bp; (+) đối chứng dương

(plasmid pBI121-35S/GS1); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-7

tương ứng với mẫu E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%; kết quả thu được như

hình 6.3. Kết quả cho thấy vẫn 7 dòng Bạch đàn urô giả định chuyển gen có ký

hiệu (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) xuất hiện một băng

DNA có kích thước khoảng 700bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, rõ nét,

bằng với mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1), mẫu wt đối chứng

âm (cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này. Kết quả này

một lần nữa khẳng định 7 dòng Bạch đàn urô (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-

X25, E-X29, E-X32) phân tích có thể là các dòng đã được chuyển gen.

3.2.2.4. PCR nhân đoạn trình tự khởi động – 35S Promoter

Ngoài việc kiểm tra gen mục tiêu (gen GS1), gen chọn lọc (gen nptII), để

khẳng định các dòng Bạch đàn urô (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-

X29, E-X32) là dòng chuyển gen. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng

cặp mồi đặc hiệu p35S-cf3: 5’- C C A C G T C T T C A A A G C A A G T G G-

3’ và p35S-cr4: 5’- T C C T C T C C A A A T G A A A T G A A C T T C C -3’

để nhân một đoạn khởi động 35S-Promoter có kích thước khoảng 123 bp.

Tương tự như trên, 7 mẫu DNA tổng số tách chiết từ các dòng Bạch đàn

urô chuyển gen (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) và cây đối

chứng không chuyển gen (wt) được sử dụng làm khuôn DNA trong phản ứng

PCR với cặp mồi đặc hiệu (p35S-cf3 và p35S-cr4). Thành phần và chu kỳ nhiệt

độ của phản ứng PCR được mô tả như ở phần phương pháp.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%; kết quả thu được như

hình 6.4. Kết quả cũng cho thấy 7 mẫu DNA tách chiết từ 7 dòng Bạch đàn urô

giả định chuyển gen xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 123 bp so

với thang DNA chuẩn 100 bp, đậm, rõ nét và bằng với mẫu đối chứng dương

(plasmid pBI121-35S/GS1). Trong khi đó, mẫu wt (cây không chuyển gen)

không có xuất hiện băng DNA này. Đoạn trình tự phân lập từ loại virút khảm

súp lơ (cauliflower mosaic virus), không có ở thực vật. Vì vậy, các dòng Bạch

đàn urô khi PCR xuất hiện băng DNA của 35S Promoter, được xem là các

M wt + 1 2 3 4 5 M wt 6 7

dòng cây đã được chuyển gen ngoại lai.

123bp

Hình 3.22. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter từ các dòng Bạch đàn urô

giả định chuyển gen. Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100bp; (+) đối chứng

dương (plasmid pBI121-35S/GS1); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-

7 tương ứng với mẫu E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32.

3.2.2.5. PCR nhân đoạn trình tự kết thúc – NOS–Terminator

Ngoài đoạn trình tự 35S Promoter, trong cassette chuyển gen (RB -

NOS-P/NPTII/NOS-T-35S-P/GS1/NOS-T - LB) vào Bạch đàn urô còn có đoạn

DNA điều hòa kết thúc phiên mã NOS-Termanator (NOS-T). Do đó, trong

nghiên cứu này cùng với việc kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự 35S

Promoter, chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra sự có mặt của đoạn NOS-T trong

các dòng Bạch đàn urô chuyển gen. NOS – Termanator phân lập từ vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens nếu dòng Bạch đàn urô nào xuất hiện có mặt của

đoạn trình tự NOS – Termanator cũng được xem là đã chuyển gen ngoại lại (vì

trong thực vật không có đoạn trình tự này).

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu HA-nos-f: 5’-G C A T G A C G T T A T T T

A T G A G A T G G G-3’ và HA-nos-r: 5’-G A C A C C G C G C G C G A T A

A T T T A T C C-3’ để nhân một đoạn trình tự kết thúc NOS-T có kích thước

khoảng 118 bp. 7 mẫu DNA tổng số tách chiết từ 7 dòng Bạch đàn urô giả định

chuyển gen (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) và cây đối

chứng không chuyển gen (wt) được sử dụng làm khuôn DNA trong phản ứng

PCR với cặp mồi đặc hiệu (HA-nos-f và HA-nos-r). Thành phần và chu kỳ

nhiệt độ của phản ứng PCR được mô tả như ở phần phương pháp.

Hình 3.23. Sản phẩm PCR nhân đoạn NOS-T từ các dòng Bạch đàn urô giả định

chuyển gen. Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 1Kb; (+) đối chứng dương (plasmid

pBI121-35S/GA20); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-7 tương ứng

với mẫu E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32.

Kết quả cũng cho thấy 7 mẫu DNA của 7 dòng Bạch đàn urô chuyển gen

(E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) đều xuất hiện một băng

DNA có kích thước khoảng 118 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, đậm, rõ

nét và bằng với mẫu đối chứng dương (plasmid pBI121-35S/GS1). Ngược lại,

mẫu wt (cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này. Một lần

nữa khẳng định các dòng Bạch đàn urô này có thể đã được chuyển cấu trúc

gen ngoại lai (RB - NOS-P/NPTII/NOS-T-35S-P/GS1/NOS-T - LB).

3.2.3. Kiểm tra các dòng Bạch đàn chuyển gen bằng kỹ thuật lai southern

Bảy dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 được kiểm tra dương tích với

phản ứng PCR được chúng tôi tiếp tục phân tích bằng kỹ thuật lai southern để

kiểm tra sự có mặt của gen trong genome và số bản sao của gen chuyển. Do cây

bạch đàn cũng có họ gen GS1 nên trong phản ứng lai southern chúng tôi kiểm

tra sự có mặt của gen nptII bằng mẫu dò. Nếu dòng cây kiểm tra lai southern

dương tính với gen nptII thì cũng đồng nghĩa với dương tính với gen GS1 (2

gen chuyển đồng thời trong cùng cấu trúc chuyển gen).

Kết quả lai southern thu được như hình 3.25 cho thấy 7 dòng Bạch đàn

urô chuyển gen GS1 và gen nptII (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29,

E-X32) phân tích có các dòng (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X29) dương tính

chứa một bản copy gen chuyển trong genome của cây Bạch đàn urô chuyển

gen; dòng E-X25 và E-X32 âm tính.

M P WT 1 2 3 4 5 6 7

Hình 3.24. Kết quả Southern blot các mẫu bạch đàn chuyển gen GS1 và nptII.

M: Marker 1kb, P: sản phẩm PCR gen nptII; wt: dòng bạch đàn urô không

chuyển gen; giếng 1-7: các dòng cây bạch đàn urô chuyển gen tương ứng E-X7,

E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận:

1. Đã tạo được 25 dòng thuốc lá chuyển gen GS1 dương tính với phản ứng

PCR

2. Đã thu được 50 chồi ra rễ trên môi trường chọn lọc 75 mg/l kanamycin.

3. Đã thu được 7 dòng PCR dương tính với gen GS1, gen nptII, đoạn trình

tự 35S-Promoter, đoạn trình tự NOST và dương tính với phân tích lai

Southern.

4. Các dòng dương tính đều mang một bản sao của gen chuyển trong

genome.

Kiến nghị:

1. Đánh giá mức độ biểu hiện của gen chuyển bằng kỹ thuật RT-PCR hoặc

lai Nothern hoặc Western.

2. Đánh giá mức độ ổn định của gen chuyển qua các thế hệ nhân giống

dinh dưỡng

3. Phân tích đánh giá tốc độ sinh trưởng và các đặc điểm lâm học của các

dòng Bạch đàn urô chuyển gen ở nhà kính.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Đặng Trọng Lương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu

1.

Đống, Trần Duy Quý (2001a), "Nghiên cứu chuyển gen cryIA(c) kháng sâu vào

một số giống cải bắp (Brassica oleraceavar capitana) qua Agrobacterium", Kết

quả nghiên cứu khoa học 1999-2000, Viện Di truyền Nông nghiệp, NXB Nông

nghiệp, Hà nội, tr. 120-128.

Dương Mộng Hùng (1993), Chọn cây trội và nhân giống bằng nuôi cấy

2.

mô tế bào cho hai loài bạch đàn E. camadulensis và E. urophylla, Báo cáo đề tài,

trường Đại Học Lâm nghiệp, Hà Tây.

Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học

3.

thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

Nguyễn Đức Kiên, Trần Hồ Quang, Gunnar Jansson, Chris Harwood,

4.

David Clapham, Sara von Arnold (2009), "Cellulose content as a selection trait

in breeding for kraft pulp yield in Eucalyptus urophylla", Ann. For. Sci. (66),

tr. 711-719.

Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalyptus theo sinh

5.

trưởng và kháng bệnh ở Việt Nam. NXB Nông nghiệp.

Nguyễn Hoàng Nghĩa, Lê Đình Khá, Hoàng Chương (1993), Kết quả

6.

khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn giai đoạn 1990-1992, Báo cáo khoa học,

Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam.

Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển

7.

(1999), Tạo cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) kháng thuốc trừ cỏ basta bằng

chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Báo cáo Khoa học

Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội,

tr. 1297-1304.

Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển

8.

(1999), Tạo cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) kháng thuốc trừ cỏ basta bằng

chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Báo cáo Khoa học

Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội,

tr. 1297-1304.

Nguyễn Luyện, "Tìm hiểu về cây bạch đàn E. urophylla", Tạp chí lâm

9.

nghiệp (số 10, tháng 10/1991).

10. Nguyễn Quang Thạch, (1995), Công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông

nghiệp Hà Nội.

Nguyễn Quang Thạch, (2000), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Nông

11.

nghiệp, Hà Nội.

Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo

12.

(2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2003), "Nghiên cứu

13.

hệ thống tái sinh in vitro cây Hông (Paulownia forturey) và ảnh hưởng của tác

nhân chọn lọc để tạo cây chuyển gen", Báo cáo Khoa học hội nghị Công nghệ

Sinh học toàn quốc 2003, tr. 866-869.

Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2003), "Nghiên cứu

14.

hệ thống tái sinh in vitro cây Hông (Paulownia forturey) và ảnh hưởng của tác

nhân chọn lọc để tạo cây chuyển gen", Báo cáo Khoa học hội nghị Công nghệ

Sinh học toàn quốc 2003, tr. 866-869.

15. Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm

bằng kỹ thuật RNAi. Luận văn Thạc sỹ sinh học.

Phan Tố Phượng, Phạm Thu Hằng, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý, Lili

16.

C., Zhang S., Fauquet C. M., Beachy R. N. (1998). Chuyển gen kháng

hygromycin, gen gus và gen kháng bệnh bạc lá vào lúa bằng súng bắn gen. Tạp

chí Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm, (2), tr. 56-57.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

17. Ahlandsberg S, Sathish P, Sun C, and Jansson C (1999) Green

fluorescent protein as a reporter system in the transformation of barley

cultivars. Physiol Plant 107: 194–200.

18. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977) Method for detection of specific

RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and

hybridization with DNA probes. Proc Natl Acad Sci. 74: 5350–5354.

Becker TW, Caboche M, Carrayol E and Hirel B (1992) Nucleotide

19.

sequence of a tobacco cDNA encoding plastidic glutamine synthetase and light-

inducibility, organ specificity and diurnalrhythmicity in the expression of the

corresponding genes of tobacco and tomato. Plant Mol Biol 19: 367-379.

20. Biesiadka J, Legocki AB. (1997) Evolution of the glutamine synthetase

gene in plants. Plant Science 128: 51–58.

21. BRECHLIN P., MÄCK G., BURBA M. und TISCHNER R. (1999)

Changes in the isoform pattern and subunit composition of GS-1 in sugar beet

leaves depent on leaf age. Plant Physiol 155: 497-502.

22. Brugiere N, Dubois F, Masclaux C, Sangwan R, Hirel B. (2000)

Immunolocalization of glutamine synthetase in senescing tobacco (Nicotiana

tabacum L.) leaves suggest that ammonia assimilation is progressively shifted

to the mesophyll cytosol. Planta. 211:519–527.

Cantón FR, Suarez MF, Jose-Estanyol M and Cánovas F (1999)

23.

Expression analysis of a cytosolic glutamine synthetase genein cotyledons of

scots pine seedlings: Developmental regulationand spatial distribution of

specific transcripts. Plant Mol Biol 40: 623-634.

Clemente MT and Marquez AJ (1999) Site-directed mutagenesis of Glu-

24.

297 from the [alpha] – polypeptide of Phaseolus vulgaris glutamine synthetase

alters kinetic and structural propertiesand confers risistance to L-methionine

sulfoximine. Plant Mol Biol 40: 835-845.

Cren M and Hirel B (1999) Glutamine synthetase in higher phants:

25.

Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell. Plant Cell

Physiol 40: 1187-1193.

26. DeBlock M, De Brower D, and Tenning P (1989) Transformation of

Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the

expression of the bar and neo genes in the transgenic plants. Plant Physiol. 91:

694–701.

Dubois F, Brugière N, Sangwan RS and Hirel B (1996) Localisation of

27.

tobacco cytosolic glutamine synthetase enzymes and the corresponding

transcripts show organ-and cell-specific patterns of protein synthesis and gene

expression. Plant Mol Biol 31: 803-817.

FAO (2004). Priliminary review of biotechnology in forestry including

28.

genetic modification.

29. Fraley RT, Rogers SG, Horsch RB (1983) Expression of bacterial genes

in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803–4807.

Fuentes SI, Allen DJ, Ortiz-Lopez A, Herna´ndez G (2001) Over-

30.

expression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and

growth at low nitrogen concentrations. J Exp Bot 52: 1071–1081

31. Gallardo F, Fu J, Cantón FR, García-Gutiérrez A, Cánovas FM and

Kirby EG (1999) Expression of a conifer glutamine synthetase gene in

transgenic poplar. Planta 210: 19-26.

Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003)

32.

"Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in

transgenic tobacco", Plant Growth Regul, 41: 279-286.

33. Hiei Y, Ohta S, Komari T, and Kumashiro T (1994) Efficient

transformation of rice (Oriza sativa) mediated by Agrobacterium and sequence

analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6: 271-282.

Hirel B and Cren M (1987) Glutamine synthetase in higher phants:

34.

Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell. Plant Cell

Physiol 40: 1187-1193.

Ireland RJ, Lea PJ.( 1999) The enzymes of glutamine, glutamate,

35.

asparagine, and aspartate metabolism. In: Singh BK, editor. Plant Amino

Acids, Biochemistry and Biotechnology. New York: Marcel Dekker; 49–109.

Jefferson RA (1987) “Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene

36.

fusion system”. Plant Mol Biol Rep 5: 387–405.

37. Kevil, C. G., L. Walsh, F. S. Laroux, T. Kalogeris, M. B. Grishim, and J.

S. Alexander. (1997) An improved, rapid Northern protocol. Biochemical and

Biophysical Research Communications 238: 277- 279.

Luo Jianzhong (2003) "Variation in growth and wood density of

38.

Eucalyptus urophylla. In Eucalyptus in Asia", Proceeding of an international

conference. Turbull J.E. edit, 94-100.

39. Mathis R, Gamas P, Meyer Y, Cullimore JV (2000) The presence of

GSI-like genes in higher plants: support for the paralogous evolution of GSI

and GSII genes. J Mol Evol 50: 116–122.

40. Matsuoka T, Kuribara H, Akiyama H, Miura H, Goda Y, Kusakabe Y,

Kenji I, Toyoda M, and Hino A (2001) A multiplex PCR method of detecting

recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize. J Food Hyg

Soc Japan 42, 24-32.

Miflin BJ and Lea PJ (1980) Ammonia assimilation. In: Miflin BJ, ed.

41.

The biochemistry of plants, vol 5. San Diego, CA, USA: Academic Press, 169–

202.

42. Oliveira IC, Brears T, Knight TJ, Clark A and Coruzzi GM (2002)

Overexpression of Cytosolic Glutamine Synthetase: Relation to Nitrogen,

Light, and Photorespiration. Plant Physiol 129: 1–11.

43. Ow DW, Wood KV, DeLuca M, De Wet JR, Helinski DR, and Howell

SH (1986) Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant

cells and transgenic plants. Science 234: 856–859.

44. Poke, F.S., R.E. Vaillancourt, R.C. Elliott & J.B. Reid (2003) "Sequence

variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR)

and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2)", Mol. Breed, 12(2), 107-118.

45. Rivera AL, Gómez-Lim M, Fernández F, Loske AM (2012) Physical

methods for genetic plant transformation. Physics of Life Reviews 9: 308–345.

Sakurai N, Hayakawa T, Nakamura T, Yamaya T. (1996) Changes in

46.

the cellular localization of cytosolic glutamine synthetase protein in vascular

bundles of rice leaves at various stages of development. Planta 200: 306–311.

Santos, P.E.T (1990) "Potential for genetic improvement program,

47.

estimates of genetic parameters and genotype x environment interaction in

Eucalyptus urophylla S.T.Blake stands", Scienctia Forestalis 43-44: 11-19.

Schlamp K, A. Weinmann, M. Krupp, T. Maass, PR Galle, and A.

48.

Teufel (2008) BlotBase: a northern blot database. Gene, 427(1-2): 47–50.

Stéphanie M, Bernard and Dimah ZH (2009) The importance of

49.

cytosolic glutamine synthetase in nitrogen assimilation and recycling. New

Phytologist 182: 608–620

50. Waldron, C., Murphy, E.B., Roberts, J.L., Gustafson, G.D., Armour,

S.L., and Malcolm, S.K. (1985) Resistance to hygromycin B. Plant Mol Biol

5:103–108.

51. Wang K, Herrera-Estrella L, Van Montagu M, Zambryski P (1984)

Right 25 bp terminus sequence of the nopaline T-DNA is essen tial for and

determines direction of DNA transfer from Agrobacterium to the plant

genome. Cell 38:455-462.

52. Wei X, Borralho N.M.G (1998a), "Genetic control of growth traits of

Eucalyptus urophylla. S.T. Blake in Southest China", Silvae Genetica 47(2-3):

158-165.

Zhong PJ, Gallardo F, Pascual MB, Sampalo R, Romero J, de Navarra

53.

AT and Cánovas FM (2004) Improved growth in a field trial of transgenic

hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase. New Phytologist 164: 137–

145..

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/