Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá trữ lượng và hoạt tính sinh học của cây xạ đen (Ehretia asperula Xoll. & Moritzi) tại tỉnh Hòa Bình

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-----------------------------

NGUYỄN THỊ HẰNG

ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll. & Moritzi)

TẠI TỈNH HÒA BÌNH

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội, 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-----------------------------

NGUYỄN THỊ HẰNG

ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll. & Moritzi)

TẠI TỈNH HÒA BÌNH

Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ HỒNG HÀ

Hà Nội, 2018

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thị Hồng Hà, phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên,Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam luôn tận tình chỉ bảo, thúc giục và hướng dẫn trong suốt quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Di truyền Nông Nghiệp – Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nấm và các bạn đồng nghiệp, phòng Chọn tạo giống và Công nghệ sản xuất Nấm đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện, bảo vệ luận văn. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo, các anh chị đồng nghiệp Bộ môn Vi Sinh vật – Viện Nông Hóa Thổ Nhưỡng đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các cán bộ nghiên cứu của phòng Hoạt tính Sinh học - Viện Hóa sinh biển, phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin cảm ơn chị Vũ Thị Nguyệt – Phòng Thủy sinh học môi trường, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình làm luận văn này.

Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ của đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được từ cây xạ đen tại tỉnh Hoà Bình. Thử nghiệm tạo chế phẩm làm thực phẩm chức năng từ các cao chiết tiềm năng”, do GS. TS. Đặng Đình Kim, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam làm chủ nhiệm.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè – những người đã luôn ở bên tôi, luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 01 tháng 09 năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Hằng

MỤC LỤC

Lời cảm ơn .......................................................................................................... I

Ký hiệu viết tắt ................................................................................................ VI

Mở đầu ................................................................................................................ 1

I.TỔNG QUAN .................................................................................................. 3

1.1.Đặc điểm phân loại ........................................................................................ 3

1.1.1.Chi Cườm rụng (Ehretia P. Browne) ........................................................ 3

1.1.2.Cây xạ đen Ehretia asperula Zoll. & Moritzi ............................................ 5

1.2.Tình hình nghiên cứu cây xạ đen ở Việt Nam và trên thế giới ................... 13

1.2.1.Tình hình nghiên cứu cây xạ đen ở Việt Nam .......................................... 13

1.2.2.Tình hình nghiên cứu cây xạ đen trên thế giới ......................................... 17

II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 21

2.1.Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 21

2.2.Thiết bị máy móc ......................................................................................... 22

2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 23

2.3.1. Phương pháp điều tra ............................................................................... 23

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực vật ........................................................... 23

2.3.3. Phương pháp xử lý mẫu .......................................................................... 24

2.3.4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học .......................................... 26

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 32

3.1. Giám định loài của cây xạ đen tại Hòa Bình .............................................. 32

3.2. Đánh giá phân bố và trữ lượng loài của cây xạ đen tại Hòa Bình ......... 34

3.2.1. Đặc điểm phân bố địa lý .......................................................................... 34

3.2.2. Trữ lượng cây xạ đen tại Hòa Bình ......................................................... 35

3.3. Kết quả quá trình chiết tách .................................................................... 39

3.3.1. Điều chế các loại cao ............................................................................... 39

3.3.2. Phân lập chất sạch từ cặn etyl axetat của bộ phận thân cây xạ đen ........ 39

3.4. Hoạt tính sinh học của cây xạ đen .......................................................... 43

3.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ................................................... 43

3.4.2. Hoạt tính chống oxy hóa ........................................................................ 46

3.4.3. Hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư. ..................................... 49

IV. KẾT LUẬN ................................................................................................. 58

V. KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 60

PHỤ LỤC 1 ....................................................................................................... 68

KHÓA PHÂN LOẠI TỚI LOÀI ....................................................................... 70

iii

PHIẾU ĐIỀU TRA THỰC TRẠNG CÂY XẠ ĐEN TẠI TỈNH HÒA BÌNH 72

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Kết quả phân bố cây xạ đen tại khu vực điều tra ............................... 9

Bảng 1.2. Hoạt tính sinh học của các cao chiết xạ đen trên vi khuẩn ............... 16

Bảng 3.1. Trữ lượng cây xạ đen tai tỉnh Hòa Bình năm 2016 .......................... 35

Bảng 3.2. Khối lượng cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn của các bộ phận cây

xạ đen Hòa Bình ................................................................................................ 39

bảng 3.3. Cấu trúc hóa học của các hợp ET1-ET6 ............................................ 42

bảng 3.4. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cặn chiết tổng chiết tách

từ 3 bộ phận của cây xạ đen ................................................................................ 44

Bảng 3.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cao chiết phân đoạn

chiết tách từ 3 bộ phận của cây xạ đen………………………………………..45

bảng 3.6. Hoạt tính chống ôxy hoá của các cao chiết tổng của cây xạ đen ...... 47

bảng 3.8. Hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết tổng cây xạ đen ............... 50

bảng 3.9. Kết quả xác định giá trị ic50 của cao chiết tổng của cây xạ đen ........ 50

bảng 3. 10. Hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết phân đoạn xạ đen ......... 52

bảng 3. 11. Kết quả xác định giá trị ic50 của cao chiết phân đoạn xạ đen ......... 53

bảng 3.12. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất tinh khiết đã phân lập ......... 55

bảng 3.13. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất tinh khiết ............................. 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của một số hợp chất ............................................................ 17

Hình 1.2. Cấu trúc 2D của acid rosmarinic ...................................................... 19

Hình 1.3. Cấu trúc 3D của acid rosmarinic ...................................................... 19

Hình 1.4 cấu trúc 2D của phân tử amyrin ......................................................... 20

Hình 2.4: Sơ đồ tạo cao chiết tổng quát ............................................................ 25

Hình 2.5: Sơ đồ phân lập chất sạch từ cao etoac của thân cây xạ đen .............. 26

Hình 3.1. Tiêu bản khô của lá, cành cây xạ đen ................................................ 34

Hình 3.2. Tiêu bản khô của hoa cây xạ đen....................................................... 34

Hình 3.3. Hoa cây xạ đen .................................................................................. 34

Hình 3.4. Quả cây xạ đen .................................................................................. 34

Hình 3.5. Bản đồ cây xạ đen nuôi trồng tại tỉnh Hòa Bình…………………38

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

13C-NMR

Carbon (13) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Resonance carbon (13)

1H-NMR

Hydro (1) Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Resonance proton (1)

ppm Part per million Một phần triệu

Eagle DMEM Dulbecco’s Modified Medium

MEME Minimum Essential Medium with Eagle’s salt

PSF Penicillin- Streptomycin sulfate – Fungizone

Non-Essential Amino Acids NAA

Bovine Calf Serum BCS

DMSO Dimethyl Sulfoside

Trichloro Acetic acid TCA

Phosphate Buffered Saline PBS

Sulfo Rhodamine B SRB

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan

LU-1 Human lung adenocarcinoma Ung thư phổi

MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú

HeLa HeLa cervical cancer cells Tế bào ung thư cổ tử cung HeLa

Vero Tế bào thận khỉ

Dichloromethane D

n-Hexane H

Methanol M

EtOAc Ethyl acetate

Acetone A

Water W Nước

XĐ Xạ đen

VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định

viii

VQG Vườn quốc gia

MỞ ĐẦU

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới, có nhiều điều kiện

thuận lợi cho các sinh vật phát triển. Theo thống kê "Tiếp cận các nguồn gen và

chia sẻ lợi ích" (của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới - IUCN), thì tại Việt

Nam hiện có gần 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch thuộc hơn 2.256 chi,

305 họ (chiếm 4% tổng số loài, 15% tổng số chi, 57% tổng số họ thực vật trên

thế giới). Trong số đó, nguồn tài nguyên cây có tiềm năng được sử dụng trong

y học chiếm khoảng 30%. Theo Danh lục Cây thuốc Việt Nam của Viện Dược

liệu (2016) về điều tra nguồn tài nguyên cây thuốc cho thấy ở Việt Nam có

tổng số 5.117 loài và dưới loài, thuộc 1.823 chi, 360 họ của 8 ngành thực vật

bậc cao có mạch, cùng với một số taxon thuộc nhóm rêu, tảo và nấm lớn, trong

đó thuộc nhóm thực vật bậc cao có mạch có tới hơn 5.000 loài. Theo thông tư

số 40/2013/TT-BYT của Bộ Y tế có 334 loài thuộc danh mục thuốc thiết yếu,

thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. Như vậy, việc sử dụng các dược phẩm có

nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được quan tâm.

Chi Ehretia P. Br. (họ Vòi voi, Boraginaceae) là một chi thực vật bao

gồm có 7 loài, trong đó, có 2 loài được người dân dùng làm thuốc là E.

acuminata R. Br. (cườm rụng nhọn) và E. asperula (dót, xạ đen) để giải độc

mát gan, tăng cường chức năng gan, hỗ trợ điều trị viêm gan, vàng da; điều trị u

bướu, mụn nhọt, ung thũng; hoặc làm thuốc chống viêm kháng khuẩn cho các

bệnh nhân mắc bệnh viêm nhiễm. Cây xạ đen E. asperula là cây thuốc thuộc

nhóm thanh nhiệt giải độc có tên khoa học vị thuốc là Herba Ehretiae

asperulae (thông tư số 40/2013/TT-BYT của Bộ Y tế).

Tuy nhiên, đến thời điểm hiện tại những nghiên cứu sâu về chi Ehretia

hay cây xạ đen E. asperula ở tỉnh Hòa Bình nói riêng vẫn ở mức rất hạn chế.

Các công trình nghiên cứu này thường vẫn đang ở giai đoạn xác định tên loài,

cũng như bước đầu xác định được một số hợp chất hóa học thứ cấp cơ bản.

Những nghiên cứu khác như đánh giá hiện trạng phân bố cũng như trữ lượng,

đặc tính sinh học và ứng dụng trong nghiên cứu chữa bệnh vẫn còn rất ít không

chỉ ở Việt Nam mà cả trên thế giới.

Do vậy, chúng tôi chọn cây xạ đen E. asperula ở tỉnh Hòa Bình để làm đối

tượng nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn: ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll.

& Moritzi) TẠI TỈNH HÒA BÌNH

Mục tiêu của luận văn là giám định lại tên loài của cây xạ đen đồng thời

đánh giá tình hình thực trạng cây xạ đen ở tỉnh Hòa Bình. Sau đó, tiến hành

nghiên cứu tạo cao chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của loài xạ đen. Để đạt

được mục tiêu trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau:

- Thu hái và giám định tên khoa học của cây xạ đen

- Đánh giá hiện trạng cây xạ đen tại tỉnh Hòa Bình

- Chiết tách các phân đoạn và một số hợp chất từ cây xạ đen

- Thử hoạt tính sinh học của các cao chiết và hợp chất tinh khiết.

I.TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm phân loại

1.1.1.Chi Cườm rụng (Ehretia P. Browne)

1.1.1.1. Đặc điểm phân loại

Chi Ehretia được P. Browne mô tả lần đầu tiên vào năm 1756 và đặt theo

tên của nhà thực vật học Georg Dionysius Ehret (17̣08-1770). Công trình

nghiên cứu của Miller J.S (1989) được xem là một trong những công trình

nghiên cứu thống nhất về mặt phân loại, không chỉ phân loại đúng danh pháp

cũng như tên loài của Ehretia tinifolia L., Miller còn có công trình về chi

Cườm rụng ở Madagasca. Trong 7 loài ông mô tả có tới 5 loài là loài mới cho

khoa học [44]. Ở Trung Quốc, trong khi Lian và Liu nghiên cứu khá kỹ họ

Boraginaceae và cũng công bố nhiều tài liệu liên quan tới họ thưc vật này ở

phần lục địa thì Hsiao và môt số tác giả khác lại tập trung nghiên cứu họ này ở

Đài Loan và cũng công bố môt số công trình liên quan tới chi Ehretia [62].

Chi Cườm rụng (Ehretia P. Browne) thuộc họ Vòi voi (Boraginaceae), bộ

Hoa lốc (Polemoniales), lớp Hai lá mầm (Dycotyledones) [3],[6], [9], [10],

[15],[ 62]. Chi Cườm rụng bao gồm các cây gỗ hay cây bụi, thường xanh, kích

thước trung bình tới các cây gỗ cao tới 30 m, thân thẳng và đường kính tới 65

cm, có rãnh ở gốc, vỏ màu nâu hoặc xám, có nhiều vết nứt nhỏ, vỏ trong thì

xốp và có sợi, màu vàng nhạt. Lá đơn, mọc cách, có cuống, mép lá nguyên hay

khía răng cưa, đôi khi lượn sóng, có gân hình mang, không có lá kèm. Cụm hoa

ở đầu cành hay nách lá, phân nhánh hoặc không, đôi khi sắp xếp thành dạng

ngù hoăc xim cuộn một ngả (xim bọ cạp). Hoa lưỡng tính, mẫu 5, đài rời, xếp

lớp, có 5 thùy; tràng màu trắng hay vàng, hình ống hoặc hình chuông, ít khi

hình phễu, trên có 5 thùy, các thùy mở rộng hoặc uốn cong gập lại. Nhị 5, chỉ

nhi ̣đính trên ống tràng, vượt ra khỏi tràng, bao phấn hình thuôn tới hình bầu

dục thuôn. Bầu thường hình trứng, 2 ô, mỗi ô chứa 2 noãn. Vòi nhuy ̣ở đỉnh

bầu, chia 2 nhánh hoặc xẻ sâu tới giữa vòi nhụy, ̣ núm nhụy 2, hình đầu hoặc

thon dài. Quả hạch, màu vàng, cam hoăc đỏ nhạt, gần hình cầu, nhẵn, vỏ quả

trong khi chín chia 2 ô, mỗi ô 2 hạt họăc 4 ô, mỗi ô 1 hạt [3], [6], [9], [15].

Về mặt hệ thống học, đôi khi chi Cườm rụng lại được tách thành một họ

riêng biệt họ Cườm rụng (Ehretiaceae). Trên thế giới, chi này bao gồm khoảng

50 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Á, châu

Âu, châu Phi [44], [46], [62].

Các loài khác nhau của chi Ehretia được nghiên cứu và tách các hợp chất

alkaloid, axit phenolic, flavonoid, benzoquinon, glycosides cyanogenetic và

axit béo [8, 40] có hoạt tính sinh học tốt như kháng viêm, chống ung nhọt [24].

Rễ, vỏ cây, lá, quả, gỗ của cây thuộc chi Ehretiaare được sử dụng làm thuốc

chống viêm, ho, ngứa, sưng tấy, tiêu chảy, kiết lỵ, sốt, suy nhược và giang mai

[37, 62]. Ở Zimbabwe, các phần khác nhau của Ehretia obtusifoliaare được sử

dụng để điều trị đau họng, đau răng ở trẻ sơ sinh, đau bụng, đau bụng kinh, vô

sinh ở phụ nữ [42]. Ở Trung Quốc, loài Ehretia thyrsiflora đã được sử dụng để

làm trà đắng [44]. Ở Ấn Độ, Ehretia laevis được sử dụng để điều trị đau đầu và

loét, nó cũng có các đặc tính kháng sán lá, lợi tiểu, tiêu đờm [50]. Vỏ bên trong

của E. laevis được sử dụng làm thực phẩm [60]. Ehretia serrata, một loài thực

vật có nguồn gốc từ Pakistan được biết đến là Puna [45]. Gỗ của chi này được

sử dụng cho mục đích làm nhiên liệu và lá sử dụng làm cho gia súc.

Các tài liệu nghiên cứu đối với cây Xa ̣đen (E. asperula) trên thế giới rất ít,

có thể do cây này chỉ phân bố ở Viêt Nam, Trung Quốc và Malaysia.

1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu về chi Cườm rụng tại Việt Nam

Gagnepain và Courcher là những tác giả có nghiên cứu về họ

Boraginaceae ở Việt Nam. Trong cuốn Thực vật chí đại cương Đông Dương

các tác giả đã mô tả 8 loài thuộc chi Cườm rụng [62]. Khi viết về chi Cườm

rung ở Việt Nam, Phạm Hoàng Hộ đã thống kê và mô tả 3 loài. Theo phân loại

của Phạm Hoàng Hộ chi Cườm rụng ở Việt Nam có 7 loài [8]. Theo Võ Văn

Chi trong cuốn “Từ điển cây thuốc” ông lại cho là chi Ehretia chỉ có 5 loài do

loài E. dentate Courch. đươc chuyển sang chi Carmona và E. thyrsiflora Nakai

trở thành tên đồng nghĩa của loài E. acuminate R. Br [18]. Theo Bùi Hồng

Quang (2007) chi Cườm rụng ở Việt Nam có 6 loài [14]. Ngoài các tài liệu

chuyên khảo kể trên trong danh mục của các Vườn Quốc gia như Cúc Phương

hay Pù Mát, các loài của chi Cườm rụng cũng được thống kê. Trong danh mục

các loài thực vật phân bố tại VQG Pù Mát Nghệ An, Nguyễn Nghĩa Thìn cho

rằng loài E. tsangii Johnst. có phân bố tại đây, như vậy có 7 loài thực vật thuộc

chi Cườm rụng tại Việt Nam [16].

Ở Việt Nam chi Ehretia có 7 loài, trong đó 2 loài được người dân dùng

làm thuốc là E. acuminata R. Br. (Cườm rụng nhọn) và E. asperula (Dót, xạ

đen) [6].

Hoàng Quỳnh Hoa (2010) đã phân loại, mô tả đầy đủ đặc điểm hình thái,

lập khóa phân loại lưỡng phân và bảng khóa mở cũng như đặc điểm vi phẫu

cành và lá của 7 loài thuộc chi Ehretia P. Br. ở miền Bắc Việt Nam [6]… và

lần đầu tiên công bố và xác định tên khoa học của các loài trong chi Ehretia P.

Br. ở miền Bắc Việt Nam, bao gồm: E. acuminata R. Br.; E. asperula Zoll. et

Mor.; E. dichotoma Blume; E. dicksonii Hance.; E. laevis Roxb.; E.

longiflora Champ. ex Benth. và E. tsangii Johnst [6].

1.1.2.Cây xạ đen Ehretia asperula Zoll. & Moritzi

1.1.1.3. Đặc điểm sinh học

Cây xạ đen Ehretia asperula Zoll.et Mor lần đầu tiên được định danh

vào năm 1864 bởi ZoZoll. & Moritzi [27], [46], [62].

Cây xạ đen là một trong những cây thuốc nam nổi tiếng với nhiều công

dụng chữa bệnh. Đây là loài cây mọc tự nhiên trong các khu rừng của nước ta

như Hòa Bình, Tuyên Quang, Ninh Bình, Quảng Bình…[4], [11]. Xạ đen cũng

bắt nguồn từ dân tộc Mường, khi mà người Mường còn chưa biết bệnh ung thư

là gì thì mỗi lúc thấy ốm yếu, mệt mỏi, vàng da thì họ đều hái loài cây này về

làm thuốc. Theo tiếng Mường thì gan nghĩa là “xạ”, loài cây này khi cắt sẽ

chảy ra một lớp nhựa đen, vì thế cái tên “xạ đen” ra đời. Ngoài ra, cây xạ đen

còn được gọi là cây “Duồng khụ” - ý nói đây là một cây thuốc rất tốt của người

Mường. Trước đây, mế Hậu (cụ Bùi Thị Bẻn, dân tộc Mường, ở huyện Kim

Bôi, Hoà Bình, là mẹ của Lương y Đinh Thị Phiển đã dùng cây xạ đen, còn gọi

là xạ đen cuống để chữa bệnh vô sinh. Nay bà Phiển là người thừa kế bài thuốc

xạ đen của mế Hậu để chữa bệnh ung thư. Do đó mà cây này còn có tên là cây

ung thư [8].

Đến giữa những năm 80 của thế kỷ trước, giáo sư Lê Thế Trung (Viện

Quân y 103) đã chỉ đạo điều tra 14 cây thuốc nam mà dân gian cho là có tác

dụng trị bệnh ung thư. Trong đó, có cây xạ đen với ký hiệu K10. Theo các sách

phân loại thực vật trước đây, loài cây này có tên Việt Nam là “Dây gối Ấn Độ”

hoặc “Dây gối bắc”, tên khoa học của cây này là Celastrus hindssi Benth.,

thuộc họ Dây gối (Celastraceae) [19]. Tuy nhiên, đến năm 2006 một số nghiên

cứu của Đại học Dược Hà Nội kết hợp với các nhà sinh thái học của Viện Sinh

thái và Tài Nguyên sinh vật đã khẳng định lại rằng cây xạ đen Hòa Bình có tên

khoa học là Ehretia L., thuộc chi Ehretia, họ Vòi voi (Boraginaceae) [20]. Năm

2007, Nguyễn Thị Vân Khanh và cộng sự đã đính chính lại tên khoa học cho

cây này là Ehretia asperula Zoll. & Moritzi [13] và theo Hoàng Quỳnh Hoa

(2010) đã khẳng định tên khoa học cây xạ đen là Ehretia asperula Zoll. &

Moritzi, thuộc họ Vòi voi (Boraginaceae) [6]. Theo danh lục các loài thực vật ở

Việt Nam (2005) gọi là cây Dót [65], ở Trung Quốc gọi cây xạ đen là Su bao

hou ke shugia [62], [65].

Năm 2017, các nhà nghiên cứu thuộc Viện Nghiên cứu Hệ gen đã xác

đinh trình tự DNA của cây xạ đen thu hái tại các vùng khác nhau của tỉnh Hòa

Bình [55].

Đặc điểm phân loại khoa học của Cây xạ đen Ehretia asperula Zoll. et

Mor. [64]

Cây xạ đen

Phân loại khoa học

Thực vật Giới (regnum)

Ngành Magnoliophyta

Lớp Magnoliopsida

Solanales Bộ (ordo)

Boraginaceae Họ (familia)

Ehretia Chi (genus)

Loài (species) E. asperula

Danh pháp hai phần

Ehretia asperula

ZOLL. & MORITZI, 1846

1.1.1.4. Đặc điểm hình thái của cây xạ đen

Xạ đen Ehretia asperula Zoll. & Moritzi thuộc Họ Vòi voi

(Borraginaceae), là cây dây leo thân gỗ mọc thành bụi, dài trung bình 3-5 m.

Cành cây tròn, lúc non có màu xám nhạt, không có lông, sau chuyển sang màu

nâu, có lông, về sau có màu xanh. Cuống lá 0,6-1,5 cm, có nốt sần, phiến lá có

hình elip hoặc gần giống như elip, kích thước phiến lá 3-12 × 2-6 cm, dai,

không có lông hoặc chỉ có một lớp lông tơ mỏng trong các nách gân lá, rìa lá

không có phiến răng cưa khi trưởng thành. Lá mọc đơn cách [6], [11], [20],

[62], [64].

Cụm hoa có màu nâu nhạt, nằm trên ngọn hay nách lá, các cụm hoa nằm

ngang nhau và có chiều rộng khoảng 4-6 cm, có lông tơ. Hoa mẫu 5, tràng hoa

màu trắng, có hình dạng như chiếc phễu 3,5-4 mm. Thùy hoa có hình tam giác

2-2.5 mm, thường mảnh, dài hơn ống tràng hoa. Chỉ nhị 3,5-4 mm, chèn vào

phần trên của đế, bao phấn 1 mm. Quả hạch có màu đỏ hoặc màu vàng cam, có

đường kính 3-4 mm. Mỗi quả có 4 hạch, mỗi hạch chứa một hạt. Vỏ quả trong

được phân chia khi trưởng thành thành các hạt cứng của quả. Ra hoa tháng 3 -

5; ra quả tháng 8 – 12 [11], [20], [62], [64].

1.1.1.5. Đặc điểm phân bố địa lý

Xạ đen là loài cây thích hợp khí hậu nhiệt đới gió mùa, có mùa đông

lạnh. xạ đen thích hợp với những vùng có nhiệt độ bình quân trong năm khoảng

22- 23oC. Nhiêt độ bình quân các tháng thấp nhất trong năm từ 12 - 15oC, xạ

đen vẫn có thể chịu được điều kiện nhiệt độ thấp dưới 5oC hoặc nhiệt độ cao tối

đa tới 37 - 38oC. xạ đen sinh trưởng phát triển tốt ở những khu vực có độ ẩm

không khí dao động trong khoảng từ 75% đến 85%. Những nơi lượng mưa bình

quân từ 2.000- 3.000 mm/năm thích hợp cho cho cây xạ đen phát triển [4],

[12].

Xạ đen có thể sống được trong môi trường chịu bóng, nó có thể mọc tự

nhiên dưới tán rừng tự nhiên, hoặc được gây trồng dưới tán rừng trồng, dưới

tán cây ăn quả. Ngoài ra, nó cũng có thể sinh trưởng phát triển bình thường

trong điều kiện chiếu sáng hoàn toàn [4].

Xạ đen có thể mọc được trên nhiều loại đất có nguồn gốc đá mẹ khác

nhau (sa thạch, phiến thạch, trầm tích, mắc ma …).: đất dốc tụ, đất feralit, đất

đen, đất bạc màu.... trên núi đá và đồi đất, thường mọc ở thung lung núi, các

khe dưới chân núi đá nơi đất ẩm, xốp, thành phần cơ giới thịt trung bình, đất

hơi chua đến trung tính nhưng yêu cầu phải thoát nước tốt [4], [12].

1.1.1.6. Thực trạng cây xạ đen ở Việt Nam và trên thế giới

Cây xạ đen Ehretia asperula Zoll. & Moritzi., được tìm thấy không chỉ ở

các nước nhiệt đới, mà còn tại các nước thuộc vùng ôn đới. Trên thế giới, cây

xạ đen phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Ấn Độ và một số nước Đông Nam Á

như Việt Nam, Myanmar, Thái Lan, Indonesia v.v., thường gặp trong rừng ở độ

cao từ 1.000 đến 1.500 m [4].

Tại nước ta, cây mọc ở rừng từ Quảng Ninh, Hà Nội, Hòa Bình, Yên Bái,

Lạng Sơn, Hà Nam, Ninh Bình qua Quảng Bình, Thừa Thiên – Huế tới Gia Lai.

Chúng cũng có thể mọc tự nhiên trong rừng hoặc được trồng tại các vườn hộ,

trang trại hoặc trồng rải rác [2], [4], [11].

Theo kết quả điều tra khảo sát của Đỗ Thanh Hải, cây xạ đen tại tỉnh Hòa

Bình còn mọc tại các huyện: Cao Phong, Lạc Sơn, Kim Bôi, Đà Bắc, Tân Lạc.

Tuy nhiên ngoài tự nhiên số lượng còn rất ít, phân bố nơi vùng sâu vùng xa [3].

Bảng 1.1: Kết quả phân bố cây xạ đen tại khu vực điều tra [2]

Tên xã

Số

Tỷ lệ

Số cá

%

Độ

Loài cây khu vực gặp xạ

điểm

cao

thể

đen

%

số

điều

gặp

(m)

bắt

cá

tra

Xạ đen

gặp

Xạ

thể

đen

Tự Do – 3 3 23,1 5 26,3 700 Nghiến , Trai, Táu,

Lạc Sơn Ô rô, Nhãn rừng,

Kim giao

Ngọc Sơn – 2 2 15,4 4 21,1 600 Nghiến , Trai, Táu,

Lạc Sơn Ô rô, Nhãn rừng, Kim

giao.

Thung Nai – 2 1 7,7 2 10,5 300 Nghiến , Trai, Táu, Ô

Cao Phong rô, Bông bét

Bình Thanh - 1 1 7,7 1 5,3 250 Nghiến , Trai, Táu, Ô

Cao Phong rô, Bông bét

Tú Sơn – Kim 1 1 7,7 1 5,3 300 Nghiến , Trai, Táu, Ô

Bôi rô, Nhãn

Nam Sơn – 3 2 15,4 3 15,8 700 Nghiến , Trai, Táu, Ô

Tân Lạc rô, Kim giao

Quyết Chiến – 1 1 7,7 2 10,5 600 Nghiến , Trai, Táu,

Tân Lạc Ô rô, Kim giao

Hiến lương – 1 1 7,7 1 5,3 400 Nghiến , Trai, Táu, Ô

rô, Chò chỉ Đà Bắc

100 Tổng 13 12 92,3 19

Hiện nay, ở nhiều nơi, cây xạ đen trong tự nhiên bị chặt phá, khai thác

rất bừa bãi bởi người dân tại các địa phương. Hầu hết xạ đen hiện nay vẫn trồng

rất manh mún, nhỏ lẻ mà chưa có một sự quy hoạch rõ ràng. Nhiều người trồng

xạ đen dưới dạng tận dụng đất đai như trồng ở bờ ao, bờ rào, bờ kênh, bên

đường đi [3], [4].

Một số địa phương của tỉnh Hòa Bình đang phát triển mở rộng diện tích

vườn, trang trại trồng cây xạ đen.Việc mở rộng và phát triển diện tích này

không những đáp ứng nhu cầu của thị trường, cung cấp dược liệu quý mà còn

giảm gánh nặng khai thác, chặt phá bừa bãi cây xạ đen trong tự nhiên, bảo tồn

cây thuốc nam quý. Một số vùng như Lạc Sơn, Lương Sơn, Lạc Thủy của tỉnh

Hòa Bình đã triển khai nhân giống và quy hoạch vùng trồng cây. Nhiều trang

trại chuyên trồng xạ đen nhằm phục vụ nguyên liệu cho y học đã hình thành với

quy mô vừa và nhỏ. Như vậy, vấn đề trồng và quy hoạch vùng trồng cây xạ đen

với mục đích kinh doanh đã bắt đầu được thực hiện. Song vẫn còn nhiều diện

tích mà chúng ta có thể trồng xạ đen cần được quy hoạch để đem lại hiệu quả

kinh tế, đem lại thu nhập. Xóa đói giảm nghèo cho bà con nông dân các địa

phương trên [4].

Theo kết quả khảo sát ở một số vùng, vườn của tỉnh Hòa Bình đã trồng

xen lẫn các loại cây bản địa với xạ đen như: cây trầm Aquilaria, cây sấu, cây

trám trắng... [3],[ 4]. Xạ đen không đòi hỏi tốn công sức chăm bón, không yêu

cầu kỹ thuật cao và nhiều diện tích đất. Việc trồng xen dưới tán cây rừng và cây

ăn quả sẽ làm tăng thêm giá trị thu trên một đơn vị diện tích đất [4].

Hiện nay, ở một số địa phương của tỉnh Hòa Bình đang mở rộng phát

triển diện tích vườn trang trại trồng cây xạ đen. Phát triển mở rộng diện tích

trồng xạ đen không những nhằm đáp ứng nhu cầu của thị trường cung cấp dược

liệu quý mà còn giảm bớt nạn khai thác, chặt phá bừa bãi cây xạ đen trong nhân

dân các địa phương, bảo tồn phát huy được nguồn gen cây thuốc nam quý [4].

Một số vùng như: Lạc Sơn, Lương Sơn đã triển khai nhân giống và quy

hoạch vùng trồng cây. Nhiều trang trại chuyên trồng xạ đen phục vụ nhu cầu

nguyên liệu cho y học đã hình thành ở quy mô vừa và nhỏ như: trang trại của

lương y Đinh Thị Phiển ở Lương Sơn với diện tích khoảng 5 ha, trang trại của

GS.TS Lê Thế Trung ở bãi Đá Chông, ông Đinh Văn Thảo trồng dưới tán rừng,

vườn lược liệu Thắng Tuấn ... [4], [12].

1.1.1.7. Giá trị dược học của cây xạ đen

Việt Nam là một trong những nước nhiệt đới gió mùa phù hợp với sự

phát triển của nhiều cây cỏ, thảo dược. Đặc biệt, là các loại thảo dược có khả

năng ngăn ngừa hoặc hạn chế các bệnh ung thư: giảo cổ lam (Gynostemma

Pentaphyllum), sâm ngọc linh (Panax vietnamensis), xạ đen và nhiều loài thảo

dược khác [18], [24], [57]. Trong số đó, xạ đen (Ehretia asperula Zoll. et

Moritzi.) được sử dụng như là dược liệu truyền thống để phòng ngừa và điều trị

viêm dạ dày, mụn nhọt, chống uể oải, vàng da[15].

Cây xạ đen là một trong những cây thuốc nam nổi tiếng với nhiều công

dụng chữa bệnh.Từ xa xưa người Mường đã đánh giá rất cao tác dụng của cây

xạ đen, cây thuốc này được liệt kê là một cây thuốc tốt nhất trong các cây họ

xạ, và thường được sử dụng để điều trị các bệnh sau [1], [11], [19].

Điều trị u bướu, mụn nhọt, ung thũng. 

Giải độc mát gan, tăng cường chức năng gan, hỗ trợ điều trị viêm gan, 

vàng da.

 Dùng làm thuốc chống viêm kháng khuẩn cho các bệnh nhân mắc bệnh

viêm nhiễm.

 Dùng để cầm máu vết thương (bị chảy máu chỉ cần nhai lá xạ đen đắp

vào vết thương là cầm được máu ngay, 2 ngày sau viết thương sẽ tự lành).

Các hợp chất chiết xuất từ Ehretia asperula có thể kháng lại các tế bào

của ung thư gan (ung thư biểu mô tế bào gan, hep G2), ung thư mũi (ung thư

biểu mô vòm họng), ung thư đại tràng (ung thư biểu mô đại tràng), ung thư vú

và kháng HIV H-9 [6], [15], [19], [34], [39].

Hoàng Quỳnh Hoa (2010), đã liệt kê được 7 chứng/bệnh được nhắc đến

trong quá trình sử dụng các loài trong chi Ehretia P. Br. ở miền Bắc Việt Nam

là sốt nóng, ung bướu, dị ứng mẩn ngứa, hậu sản, ỉa chảy, bệnh về gan và đau

xương [5]. Trong đó, cách dùng chữa bệnh về gan được nhắc tới nhiều nhất,

sau đó là u bướu hoặc hậu sản. Ngoài ra, đã xác định được 7/8 bộ phận (trừ

hoa) của dược liệu được nhân dân sử dụng làm thuốc, trong đó vỏ thân của

Cườm rụng hoa dài (Ehretia longiflora Champ.), có chứa 8 hợp chất là

ehretiquinone (1), ehretiolide (2), ehreticoumarin (3), ehretilactone A (4),

ehretilactone B (5), ehretiamide (6), ehretine (7), và ehretiate (8); trong đó

ehretiquinone (1) và prenylhydroquinone (14) có khả năng kháng vi khuẩn

Mycobacterium tuberculosis H37Rv ở liều tương ứng 25,0 và 26,2 μg/ml [6].

Lá hoặc toàn cây trên mặt đất của xạ đen (E. asperula Zoll. & Mor.) được sử

dụng nhiều nhất [5]. Đồng thời kết quả điều tra cho thấy nhân dân địa phương

có bốn cách sử dụng cây thuốc thuộc chi Ehretia P. Br., trong đó phổ biến nhất

là sắc với nước uống và ít dùng nhất là cách đắp lá tươi.Về tác dụng sinh học

và độc tính cấp đã xác định được mẫu lá E. acuminata R. Br. liều 3 g/kg và vỏ

thân E. longiflora Champ. ex Benth. ở 2 liều 3g/kg và 9g/kg đều có tác dụng

cải thiện chức năng gan, làm giảm hoạt độ ALT tương ứng là 55,6% ; 34,0% và

30,5% trên mô hình gây độc cho gan bằng paracetamol [5]. Mẫu lá E.

tsangii thể hiện tác dụng cải thiện chức năng gan kém hơn so với 2 loài trên.

Dịch chiết methanol của lá E. acuminata R. Br. và vỏ thân E.

longiflora Champ. ex Benth. có tác dụng ức chế tế bào ung thư gan với tỷ lệ tế

bào sống sót là 50,23 ± 0,25 % và 45,12 ± 0,20 %, giá trị IC50 tương ứng là 20

và 18 μg/ml [5]. Các mẫu cao lỏng lá E. acuminata R. Br.; vỏ thân E.

longiflora Champ. ex Benth. và lá E. tsangii Johnst. không có độc tính khi thử

bằng đường uống với liều tối đa mà chuột có thể dung nạp được và tương ứng

cao gấp 100, 120 và 300 lần so với liều thường dùng, chứng tỏ dược liệu có

độ an toàn cao [6]. Trong đó, hợp chất axit rosmarinic (EL8) chiết xuất từ cây

xạ đen có tác dụng ức chế tế bào ung thư gan Hep-G2 in vitro với IC50 là 0,5

μg/ml [6].

1.2.Tình hình nghiên cứu cây xạ đen ở Việt Nam và trên thế giới

1.2.1.Tình hình nghiên cứu cây xạ đen ở Việt Nam

Xạ đen là một trong những cây nổi tiếng về khả năng chữa bệnh từ lâu,

song để đưa vào nghiên cứu thì chỉ bắt đầu từ năm 1987 khi Gs. Lê Thế Trung

có chuyến công tác tới tỉnh Hòa Bình với mục đích sưu tầm các bài thuốc quý

trong dân gian và ông đã tìm thấy bài thuốc về cây xạ đen. Được chứng kiến

nhiều trường hợp bệnh nhân đã điều trị khỏi ung thư bằng cách uống nước sắc

từ cây xạ đen, ông đã rất tâm đắc với cây thuốc này, và đề nghị mang cây xạ

đen về nghiên cứu, phân tích thành phần hóa học của vị thuốc này [19].

Sau một thời gian dài nghiên cứu, thử nghiệm từ năm 1987 đến năm

1998 công trình nghiên cứu về cây xạ đen của Giáo sư Lê Thế Trung và các

cộng sự đã hoàn tất. Kết quả thử nghiệm trên động vật gây ung thư các bác sỹ

đã tìm thấy một số hoạt chất quý trong cây xạ đen có tác dụng hạn chế sự phát

triển của khối u, đặc biệt là các khối u ác tính (ung thư) [19]. Nghiên cứu cho

thấy, xạ đen có các hoạt chất flavonoid, quinon (có tác dụng phòng chống ung

thư và làm cho tế bào ung thư hóa lỏng dễ tiêu), hợp chất saponin triterpenoid

(có tác dụng chống nhiễm khuẩn) [19]. Hơn nữa, hợp chất lấy từ xạ đen nếu

được kết hợp với chất phylamin còn phát huy tác dụng, kéo dài tuổi thọ trung

bình của động vật bị ung thư hơn nhiều chất đã qua nghiên cứu thực nghiệm

khác [19]. Năm 1999 đề tài cấp nhà nước của giáo sư Lê Thế Trung được

nghiệm thu, cây xạ đen được công nhận là một trong số ít vị thuốc điều trị ung

thư. Đến năm 2003, đối tượng cây xạ đen đã được thử nghiệm qua nhiều ứng

dụng lâm sàng, và chưa ghi nhận được một ca có tác dụng phụ nào. Những năm

gần đây, cây xạ đen đã được phát triển thành các dược phẩm để hỗ trợ điều trị

ung thư, tiêu hạch, tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, điều hòa hoạt huyết, giảm

đau, an thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Ngoài ra các tác dụng khác

trong trị bệnh mất ngủ, điều hòa huyết áp, trị viêm nhiễm, bệnh tiểu đường

[19].

Năm 2006, Ly và cs đã phân lập được 8 hợp chất phenolic, trong đó có 5

hợp chất đã biết là rutin, kaempferol 3-rutinoside, axit rosmarinic, axit

lithospermic , và axit lithospermic,và ba oligomers mới bao gồm 1 dimer và 2

trimer của axit rosmarinic. Trong đó, hai chất axit rosmarinic và axit

lithospermic B chiếm tỷ lệ lớn nhất trong thành phần.Tất cả 8 hợp chất nói trên

đều biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa đối với methyl linoleate và

phosphatidylcholine [43].

Năm 2007, Nguyễn Thị Vân Khanh đã phân lập và nhận dạng cấu trúc

của hỗn hợp α- stigmasterol (C29H50O) và -stigmasterol (C29H48O) từ lá cây

này [9].

Kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Thảo và cs (2008) cho thấy, các phân

đoạn chloroform dịch chiết xạ đen: R6 có hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư

biểu mô KB, MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 19,78; 19,62 μg/ml; R5 có hoạt

tính ức chế enzyme khử độc quinone reductase để loại bỏ tác nhân gây ung thư

của các dòng tế bào Hepalala7 và BPcl với giá trị IC50 lần lượt là 19,87; 19,82

μg/ml. R7 có hoạt tính ức chế enzyme aromatase là enzyme quyết định hình

thành estrogen và kích thích các tế bào ung thư phụ thuộc estrogen phát triển

với IC50 là 19,95 μg/ml [15].

Những nghiên cứu về thành phần hóa học của cây xạ đen ở Việt Nam

được thực hiện chủ yếu bởi nhóm tác giả tại Viện Hóa học thuộc Viện KH &

CNVN. Năm 2008, Trịnh Thị Thủy và cs. đã công bố cấu trúc hóa học của các

triterpenes và phenolic glycoside từ các mẫu cây xạ đen thu được ở Quảng

Bình (Việt Nam). Bằng phương pháp phổ NMR, các tác giả đã xác định được

cấu trúc của các chất này là axit glucosyringic, lup-20(29)-ene-3b,11b-diol,

lup-20(29)-ene-3-one (lupenone) và lup-5,20(29)-diene-3-one [18]. Đồng thời

nhóm tác giả này đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt

tính sinh học cây xạ đen Ehretia dentate Couch. được thu hái tại tỉnh Hòa Bình,

sau này tên khoa học của chúng được đính chính là Ehretia asperula Zoll. &

Moritzi Các tác giả đã phân lập và xác định được cấu trúc của sáu nhóm chất

thuộc ba khung carbon khác nhau: nitril glucosid: (-) – ehretiosid A1 là đồng

phần quang học (+) – ehretiosid A1và lần đầu tiên được tìm thấy trong thiên

nhiên; astragalin thuộc nhóm flavonoid glucosid; hai hợp chất phenolic khác là:

axit rosmaritric và metyl rosmarinat. Đã xác định được thành phần sản phẩm

CH-1 từ lá cây xạ đen (chiếm 0,566%) so với mẫu khô là baurerenol và urs-12-

en-3-ol(- amyrin) [1]. Trong đó, baurerenol và - amyrin là thành phần hóa

học chính của của cây xạ đen Ehretia asperula [1], [18], [21].

Năm 2010, Hoàng Quỳnh Hoa tiến hành “Nghiên cứu một số cây thuốc

chi Cườm rụng (Ehretia P. Br.), họ Vòi voi (Boraginaceae) ở miền Bắc Việt

Nam”. Qua nghiên cứu đã khẳng định được rằng cây xạ đen có tên khoa học là

Ehretia asperula Zoll. & Moritzi. và trong thành phần hóa học chứa hợp chất

acid rosmarinic (EL8) chiết xuất từ lá cây xạ đen có tác dụng ức chế tế bào ung

thư gan Hep-G2 in vitro với IC50 là 0,5 μg/ml [5], [6].

Năm 2012 nhóm nghiên cứu Phạm Thị Lương Hằng và cs. thuộc khoa

sinh học của trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội

tiến hành thử hoạt tính sinh học của cây xạ đen bằng phương pháp khuếch tán

trên đĩa thạch. Họ thử nghiệm bốn loại dịch chiết của xạ đen là dịch chiết n-

hexane, dịch chiết EtOAc, dịch chiết MeOH và dịch chiết nước trên vi khuẩn

gram dương (B. subtilis và Sarcina sp.), vi khuẩn gram âm (E. coli ATCC

25922 và P. aeruginosa ATCC 27853). Kết quả thực nghiệm cho thấy tất cả

dịnh chiết đều không có tính kháng khuẩn đối với Sarcina sp., E. coli và P.

aeruginosa . Còn đối với vi khuẩn B. subtilis dịch chiết n-Hexane, dịch chiết

EtOAc đều không có tính kháng khuẩn, đối với dịch chiết MeOH và đặc biệt là

dịch chiết nước có tính kháng khuẩn trung bình với B. subtilis [7].

Bảng 1.2. Hoạt tính sinh học của các cao chiết xạ đen trên vi khuẩn

Gram dương, Gram âm

D-d (mm) B. subtilis Sarcina sp. E. coli P. aeruginosa

Dịch chiết

- - - - n-hexanEtOAce

- - - - EtOAce

2 - - - MeOH

7 - - - Nước

- Không có hoạt tính; + hoạt tính yếu (1mm

++ hoạt tính trung bình (5mm10

mm)

Nghiên cứu gần đây nhất của Phạm Thị Loan (2018) đã xác định được

rằng cao ethanol thể hiện hoat tính ức chế dòng tế bào ung thư gan Hep - G2 tốt

với giá trị IC50 từ 26,48- 31,34 μg/ml, nhưng hoạt tính chống oxy hóa yếu và

hầu như không biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định như E. Coli, S.

aureus, B. subtilis, P. aeruginosa, C. albicans, L. fermentum[10].

Việc xác định được các hợp chất hóa học có giá trị của xạ đen đã dẫn đến

tình trạng khai thác quá mức, khiến cho số lượng quần thể cây trong tự nhiên

giảm sút nghiêm trọng. Để khắc phục tình trạng này các phương pháp nuôi

trồng cây xạ đen đã được áp dụng chủ yếu hiện nay là giâm hom nhưng cho số

lượng cây giống còn hạn chế, mang nhiều bệnh từ cây mẹ [4]. Phương pháp

nhân giống in vitro phương pháp nhân giống hiện đại là một trong các biện

pháp hữu hiệu, giúp bảo tồn và phát triển nguồn giống thực vật nói chung và

nguồn dược liệu nói chung, phục vụ cho nhu cầu của đời sống. Từ năm 2015

một số nghiên cứu nhân giống invitro cây xạ đen Ehretia asperulla Zoll.&

Moritzi. được tiến hành nghiên cứu [4], [17].

1.2.2.Tình hình nghiên cứu cây xạ đen trên thế giới

Trên thế giới, việc nghiên cứu cây xạ đen cũng dừng lại ở mức rất hạn

chế. Năm 1997, Kuo & Kuo (1997) đã phân lập được 4 hợp chất triterpene mới

là celasdin-A, celasdin-C, celasdin-B và maytenfolone-A từ mẫu cây xạ đen.

Trong đó hợp chất celasdin-B được xác định là có hoạt tính kháng virus HIV-

AIDS ở các tế bào bạch cầu H9 với giá trị EC50 = 0,8 µg/ml, và chất

maytenfolone - A có hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư gan (HEPA-2B) và

ung thư vòm họng (KB) với giá trị ED50 lần lượt là 2,3 và 3,8 µg/ml [39].

Celasdin A Celasdin B

Maytenfolone-A

Celasdin C

Hình 1.1. Cấu trúc của một số hợp chất

Huang và cs. (2000) phân lập và xác định được một chuỗi các hợp chất

agrofuran sesquiterpen polyol ester mới từ cây xạ đen C. hindsii là

1β,2β,6α,15β-tetracetoxy-8 β, 9 α -dibenzoyloxy- β -dihydroagarofuran

(celahin D) (1); 1,1 β -acetoxy-8 β,9 α -dibenzoyloxy-4 α, 6 α -dihydroxy-2 β

(amethylbutanoyloxy)- β -dihydroagarofuran (2) và 1 β -acetoxy-8 β, 9 α -

dibenzoyloxy-6 α -hydroxy-2 β (α -methylbutanoyloxy)- β -dihydroagarofuran

(3), emarginatine - E (4) được phân lập từ Celastrus hindsii Benth. Đáng chú

ý, các tác giả còn phân lập được 6 hợp chất khác, trong đó có 3 triterpene là

loranthol (5), lupenone (6) và friedelinol (7), và đặc biệt sesquiterpene pyridine

alkaloid là emarginatine – E với hoạt tính gây độc tế bào biểu mô biểu mô KB

với ED50=1,7 µg/ml và ung thư trực tràng COLO-205 với ED50=4,1 µg/ml.

[34].

Ly và cs. (2006) phân lập được 8 hợp chất phenolic, trong đó có 5 hợp

chất đã biết là rutin, kaempferol 3-rutinoside, rosmarinic acid, lithospermic

acid, và lithospermic acid,và ba oligomers mới, bào gồm 1 dimer và 2 trimer

của rosmarinic acid. Trong đó, hai chất rosmarinic acid và lithospermic acid B

chiếm tỷ lệ lớn nhất trong thành phần.Tất cả 8 hợp chất nói trên đều biểu hiện

hoạt tính chống oxy hóa đối với methyl linoleate và phosphatidylcholine [43].

Gần đây nhất là nghiên cứu của các nhà khoa học tại Thượng Hải cho

thấy thân xạ đen có chứa các chất diphenylpropane và các chất macrocyclic

lactone, quinoflavan. Các hợp chất này có tác dụng gây độc tế bào trung bình

và yếu trên dòng ung thư phổi, ruột kết, gan và vú [35] Đáng chú ý là các hợp

chất tách được có hàm lượng tương đối thấp, khoảng 1,5-20 mg trong 5 kg thân

khô cây xạ đen.

 Hợp chất axit rosmarinic

Axit rosmarinic là este của axit caffeic và axit 3,4-

dihydroxyphenyllactic. Hợp chất này thường được tìm thấy nhiều trong các loài

thực vật họ Boraginaceae và các cây thuộc chi Nepetoideae của họ Lamiaceae

như Rosmarinus officinalis, Perilla spp., và Salvia officinialis [6], [43]. Ngoài

ra, nó cũng được tìm thấy trong các loài thực vật bậc cao khác và trong một số

loài dương xỉ. Axit rosmarinic có một số đặc tính sinh học tốt như: kháng virut,

kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa [6], [53]. Sự hiện diện của axit

rosmarinic trong cây thuốc, thảo mộc và gia vị có tác dụng thúc đẩy những lợi

ích cho sức khoẻ. Ở thực vật, axit rosmarinic được cho là hoạt động như một

hợp chất bảo vệ tích lũy có sẵn. Sinh tổng hợp axit rosmarinic bắt đầu với các

axit amin L-phenylalanine và L-tyrosine. Tất cả tám enzyme tham gia vào quá

trình tổng hợp đều được phân lập và xác định cDNA đặc trưng. Một số cây có

khả năng tích lũy axit rosmarinic với lượng cao khi nuôi cấy tế bào thực vật

như Coleus blumei hoặc Salvia officinalis (lên đến 36% trọng lượng khô của tế

bào). Vì lý do này, một sản phẩm công nghệ sinh học của axit rosmarinic với

nuôi cấy tế bào thực vật đã được tiến hành thực hiện.

Hình 1.2. Cấu trúc 2D của Hình 1.3. Cấu trúc 3D của

acid rosmarinic acid rosmarinic

 Hợp chất - amyrin

Hình 1.4 Cấu trúc 2D của phân tử amyrin

Amyrin là hợp chất có liên quan đến nhóm triterpene, chúng gồm có 3

loại chính là α-amyrin (có bộ khung ursane), β-amyrin (có bộ khung oleanane)

và δ-amyrin, các hợp chất này thường được tìm thấy trong lá, vỏ, và trong cả

nhựa của nhiều loài thực vật khác nhau. Trong quá trình sinh tổng hợp thực vật,

α-amyrin là tiền thân của axit ursolic và β-amyrin là tiền thân của axit

oleanolic. Cả 3 amyrin xuất hiện trên bề mặt của trái cây cà chua.

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Huy Cường đã xác định được 2 hợp

chất urs-12-en-3-ol(- amyrin) và baurerenol trong thành phần sản phẩm CH-

1 từ lá cây xạ đen (chiếm 0,566%) so với mẫu khô và là thành phần hóa học

chính của của cây xạ đen Ehretia asperula [1].

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng -amyrin là hợp chất có hoạt tính dược

lý khác nhau trong đánh giá in vitro cũng như trong in vivo đối với khả năng

chống viêm, kháng khuẩn, virus cũng như kháng tế bào ung thư. Khả năng

kháng khuẩn của -amyrin từ dịch chiết hoa Bombax malabaricum cho thấy

chúng có khả năng kháng cao đối với các loài vi khuẩn, nấm, nấm men như

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Stretoccocus faecalis, Neisseria

gonorrehea, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans [25]. , -

amyrin được phân lập từ cây Protium heptaphyllum có khả năng giảm bệnh

vươm nướu [33].

II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Vật liệu nghiên cứu

 Mẫu cây: Cây xạ đen thu tại tỉnh Hòa Bình

 Các chủng vi sinh vật kiểm định được cung cấp từ Phòng Sinh học Thực

nghiệm - Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, gồm:

 Vi khuẩn Gr (-): E. coli (ATCC 25922 )

P. aeruginosa (ATCC 25923 )

 Vi khuẩn Gr (+): B. subtillis (ATCC 11774 )

S.s aureus ATCC 12222

 Nấm sợi: A. niger (439)

F. oxysporum (M42)

 Nấm men: C. albicans (ATCC 7754)

S. cerevisiae (SH 20)

 Các dòng tế bào sử dụng trong thực nghiệm hoạt tính sinh học được lưu

giữ tại Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, ở

đây thử nghiệm trên các dòng :

 Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)

 Dòng MCF-7 (Human breast adenocarcinoma – Ung thư vú)

 Dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư biểu mô phổi)

 Dòng Vero (Vero cells – Tế bào biểu mô thận khỉ)

 Dòng HeLa (Ung thư cổ tử cung)

 Môi trường nuôi cấy

 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

 Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB-

Sigma) cho nấm men và nấm mốc. Trypcase Soya Broth (TSB-Sigma)

cho vi khuẩn.

 Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn,

Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.

 Môi trường nuôi các dòng tế bào ung thư

- Môi trường MEME (Minineal Essential Medium with Eagle’s salts), 7-

10% huyết thanh bê tươi và dịch kháng sinh PSF (potassium penicillin -

streptomycin - fungizone), NAA (nonessential amino acid).

- Môi trường DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential

Medium), 10% huyết thanh bê tươi và dịch kháng sinh PSF, NAA.

- Dịch kháng sinh PSF: 100 đơn vị penixilin/ml, 100 g streptomyxin

sunfat/ml, 0,25 g amphoterixin B/ml.

2.2.Thiết bị máy móc

- Tủ cấy vi sinh - Box laminar PII (Đức);

- Tủ ấm– Memmert (Đức);

- Cân điện tử AL300 – Thụy Sỹ;

- Nồi khử trùng Lequenx (Pháp);

- Máy lắc thường Gerhardt (Đức);

- Kính hiển vi thường Olympus (Nhật Bản);

- Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản)

- Kính hiển vi soi ngược,

- Tủ ấm CO2, tủ ấm thường,

- Tủ lạnh sâu -80oC,

- Máy đo huỳnh quang dùng cho phiến 96 giếng,

- Máy trộn vortex, các bộ lọc, bộ pipet-man các cỡ...

- Máy cất quay chân không.

- Máy sấy.

- Bình chiết, bình cầu cất quay, cốc thuỷ tinh, ống đong chia

vạch, bàn cắt, dao cắt bản mỏng.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp điều tra

- Điều tra sơ bộ: thông qua phỏng vấn người dân, thầy lang, .v.v. để nắm

được tình hình phân bố, khai thác và sử dụng của cây xạ đen tại tỉnh Hòa Bình.

- Điều tra thực địa: Điều tra theo địa giới hành chính (huyện, xã). Chọn

huyện, xã điển hình theo kết quả phỏng vấn sơ bộ. Từ đây sẽ tiếp tục điều tra

theo tuyến với người cung cấp thông tin quan trọng: Người cung cấp thông tin

là những người am hiểu về cây thuốc trong khu vực (thầy lang, người thu hái

cây thuốc…). Các bước thực hiện bao gồm:

+ Xác định tuyến điều tra: Tuyến điều tra được xác định dựa trên thực trạng

thực vật, địa hình và phân bố cây thuốc trong khu vực. Các tuyến điều tra được

đi qua các địa hình và thảm thực vật khác nhau; lấy trung tâm cộng đồng làm

tâm và đi theo các hướng khác nhau.

+ Thu thập thông tin tại thực địa: Đi theo tuyến và phỏng vấn người cung cấp

thông tin về tên, tuổi, địa chỉ, dân tộc, giới tính của người cung cấp thông tin;

tên cây (tên địa phương, phiên âm); bộ phận dùng; cách sử dụng; thời gian thu

hái, cách thu hái; tình hình mua bán, giá cả, nguồn và thông tin thương mại về

cây xạ đen; các mối đe dọa ảnh hưởng đến nguồn tài nguyên cây thuốc…

Khu vực điều tra tại các huyện Lương Sơn, huyện Lạc Sơn, huyện Tân

Lạc; huyện Cao Phong, huyện Đà Bắc, huyện Yên Thủy, huyện Lạc Thủy và

huyện Kim Bôi tỉnh Hòa Bình.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực vật

 Phương pháp thu thập mẫu thực vật: Thu thập mẫu vật, chụp ảnh,

quan sát và ghi chép các đặc điểm của mẫu mà ở trạng thái khô không quan sát

được. Quan sát về phân bố, môi trường sống và các đặc điểm khác.

 Phương pháp kế thừa: Nghiên cứu tài liệu, tập hợp, phân tích các tư

liệu trong và ngoài nước về các loài thuộc chi Ehretia.

 Phương pháp hình thái so sánh: Đây là phương pháp truyền thống và

phổ biến nhất trong nghiên cứu phân loại thực vật từ trước đến nay. Phương

pháp này dựa vào đặc điểm hình thái của cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh

sản để nghiên cứu, trong đó chủ yếu dựa vào đặc điểm của cơ quan sinh sản.

Các kết quả được tổng hợp và soạn thảo hoàn chỉnh theo quy ước quốc tế

về soạn thảo thực vật và quy phạm soạn thảo Thực vật chí Việt Nam.

 Phương pháp chuyên gia: là phương pháp điều tra qua đánh giá của các

chuyên gia về phân loại thực vật.

2.3.3. Phương pháp xử lý mẫu

2.3.3.1. Phương pháp chiết tạo cao tổng và các cao chiết phân đoạn

Sử dụng phương pháp ngâm dầm, trích kiệt bằng methanol để trích ly

các hợp chất ra khỏi mẫu xạ đen (3 mẫu: rễ, thân, lá), qua trình cụ thể được

thực hiện như sau:

Các mẫu xạ đen được phơi khô sau đó nghiền nhỏ thành bột, tiến hành

ngâm 3 mẫu bột: rễ (2500 g), thân (5000 g), lá (5800 g). Các mẫu bột xạ đen

được ngâm trong bình thủy tinh khác nhau với dung dịch methanol trong vòng

3 ngày, sau đó lọc loại bỏ cặn, dịch chiết đem cất loại dung môi thu được cao

tổng MeOH, quá trình này lăp lại thêm 3 lần để lấy tối ưu lượng chất có trong

lá, thân, rễ xạ đen. Từ cao tổng MeOH tiến hành chiết phân đoạn với các hai

loại dung môi là n-hexane và ethyl acetate, quá trình được thực hiện cụ thể như

sau: hòa tan cao MeOH với hai lít nước chia đều vào 2 bình chiết có thể tích 2

lít sau đó bổ sung thêm vào mỗi bình chiết 1 lít n-hexane lắc đều trong 15-20

phút rồi để cho hai dung dịch tách thành 2 lớp, sau khi tách thành 2 lớp tiến

hành chiết lấy phần n-hexane cất loại dung môi thu được cao n-hexane, quá

trình này được thực hiện liên tiếp 3 lần. Sau khi chiết lấy phần n-hexane thì

phần hỗn hợp nước lại tiếp tục được bổ sung thêm 2 lít ethyl acetate và cũng

lắc đều trong 15-20 phút, quá trình chiết với ethyl acetate có khả năng tạo nhũ

cao hơn so với n-hexane cho nên thời gian tách lớp của chúng cũng lâu hơn.

Sau khi tách lớp đem chiết lấy phần dịch ethyl acetate, cất loại dung môi thu

được cao ethyl acetate. Cũng như với quá trình làm với dung dịch n-hexane thì

quá trình này cũng thực hiện chiết liên tiếp 3 lần. Phần hỗn hợp nước còn lại

đem cất loại bỏ dung môi dư rồi đem chiết trên sắc ký cột diaion để loại bỏ

Bột khô xạ đen

Chiết 3 lần bằng MeOH

Thêm nước

Căn MeOH (365g)

Bổ sung n-hexan

Lớp nước

Lớp n-hexan

Bổ

sung

EtOAc

đường, muối và các hợp chất cô cơ.

Cặn n-Hexan

Lớp EtOAc

(119,3g)

Hình 2.4: Sơ đồ tạo cao chiết tổng quát

Cặn EtOAc

Cặn nước

Phân lập 5 hợp chất từ cặn chiết EtOAc thân cành xạ đen

(43,7g) YMC-RP 18, dung môi MeOH:nước 1:3 thu được 3 phân đoạn ký hiệu là E1,

Tiến hành phân lập phần cặn chiết EtOAc sử dụng sắc ký cột pha đảo

E2, E3. Phân đoạn E1 được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silica gel, sử dụng

dung môi rửa giải CHCl3:MeOH:nước tỷ lệ 5:1:0.1 thu được hợp chất ET1 (3

mg). Phân đoạn E2 được tiến hành sắc ký cột silica gel (EtOAc:MeOH:nước

10:1:0.2) thu được hai phân đoạn nhỏ E2.1 và E2.2, tiến hành sắc ký cột YMC-

RP 18 hai phân đoạn này với hệ dung môi rửa giải là axeton:nước 1:2 và

MeOH:nước 1:1 thu được hợp chất ET2 (5 mg), ET3 (4,6 mg) và ET4 (5 mg).

Tiếp tục tiến hành sắc ký cột silica gel phân đoạn E3, dung môi CHCl3:MeOH:nước

4:1:0.1 thu được hai hợp chất ET5 (6 mg) và ET6 (12 mg).

Cặn EtOAc (120 g)

CC, YMC-RP 18 MeOH: nước 1:3

CC, silicagel EtOAc: MeOH:nước 10:1:0.2

CC,

silicagel

CHCl3:

MeOH:

E2.1

E2.2

nước 5:1:0.1

CC, YMC-RP 18 axeton:nước 1:2

CC, YMC-RP 18 MeOH:nước 1:1 Hình 2.5: Sơ đồ phân lập chất sạch từ cao EtOAc của thân cây xạ đen ET6

ET1

ET5

ET2

2.3.4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

ET3

ET4

(5mg)

(6mg)

(3mg)

(12mg )

(5mg)

2.3.4.1. Phép thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

(4,6mg )

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt

tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng

(96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và

Vlietlinck (1991), và McKane & Kandel (1996).

Phép xác định gồm hai bước như sau:

Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm mẫu thử có hoạt tính

Chuẩn bị VSVKĐ

Các chủng VSVKĐ được duy trì trong các môi trường: thạch thịt -

pepton đối với vi khuẩn; Hanxen đối với nấm men, và Czapek - Dox đối với

nấm mốc. Trước khi tiến hành thí nghiệm, các chủng VSVKĐ được hoạt hóa

trong các môi trường dinh dưỡng dịch thể: môi trường Eugon Broth cho vi

khuẩn và Mycophyl cho nấm (ủ 24 giờ ở 37°C đối với vi khuẩn, 48 giờ ở 30°C

đối với nấm), sau đó pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land.

Chuẩn bị mẫu thử

Hòa tan mẫu thử bằng dung môi DMSO với nồng độ từ 1- 4mg/ml.

Tiến hành thí nghiệm

Nhỏ mẫu thử từ phiến pha mẫu vào các giếng của phiến thí nghiệm

Chứng dương tính

+ Streptomycin cho vi khuẩn Gr(+)

+ Tetracyclin cho vi khuẩn Gr(-)

+ Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men.

Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp.

Chứng âm tính

Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử.

Phiến thí nghiệm được để trong tủ ấm 370C/24h đối với vi khuẩn và

300C/48h đối với nấm.

Đọc kết quả

Giếng có mẫu thử dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt,

không có vi sinh vật sinh trưởng. Mẫu thử dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục

thử bước 2 để tính giá trị MIC (Minimum Inhibitory concentration).

Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mẫu thử dương tính

Chuẩn bị mẫu thử

Các mẫu thử dương tính ở bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp

dần, để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ mà ở đó vi sinh vật bị

ức chế gần như hoàn toàn.

Tiến hành thí nghiệm

Giống như ở bước 1

Tính kết quả

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mẫu:

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ thấp nhất của mẫu thử ức chế

sự phát triển của vi sinh vật, và khi nuôi lại vi sinh vật ở nồng độ của mẫu này

trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra thì thu được giá trị CFU < 5.

2.3.4.2. Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa

Phân tích khả năng bẫy các gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazyl) là phương pháp đã được công nhận để xác định nhanh hoạt tính

chống oxy hóa. Chất thử được hòa trong dimethyl sulfoxide (DMSO 100%) và

DPPH được pha trong ethanol 96%. Sự hấp thụ của DPPH ở =515nm được

xác định bằng máy đọc ELISA sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử trên

phiến vi lượng 96 giếng. Các thử nghiệm được thể hiện là giá trị trung bình của

ít nhất 3 phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn (p ≤ 0,05).

Thử nghiệm được thực hiện như sau:

- Pha dung dịch gốc DPPH 300M trong ethanol 96%.

- Mẫu được pha trong DMSO 100% với nồng độ 4mg/ml đối với dịch chiết

thô và 1mg/ml với mẫu tinh sạch.

- Sử dụng 1mM flavonoid hoặc 5mM axit ascorbic trong DMSO10% làm

chứng dương.

Mẫu được nhỏ trên phiến vi lượng 96 giếng với dung dịch DPPH ở trên để

được nồng độ cuối của mẫu thử trong phản ứng từ 200μg/ml đến 12,5 μg/ml

(hoặc nồng độ thấp hơn nữa tùy hoạt tính của mẫu thử).

Phiến được ủ kín ở 37oC trong 30 phút và đọc kết quả ở bước sóng 515nm.

Tính kết quả

Khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging capacity, SC%):

Giá trị trung bình của SC (%) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương

trình xử lý số liệu Excel theo công thức:

Độ lệch tiêu chuẩn  tính theo công thức của Ducan như sau:

Giá trị SC50 (g/ml):

Mẫu (chất thử) được pha loãng thành các nộng độ giảm dần, lặp lại 3 lần ở

mỗi nồng độ. Hiệu quả bẫy gốc tự do tạo bởi DPPH của mỗi mẫu được tính dựa

trên % trung hòa gốc tự do so với mẫu trắng (Blank) và chứng âm tính. Mẫu có

hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH được thực hiện các bước tiếp theo để

tìm giá trị IC50 (µg/ml). Giá trị IC50 là nồng độ của chất thử mà tại đó trung hòa

được 50% các gốc tự do, được xác định bằng phần mềm TableCurve AISN

Sofware (Jandel Scientific) qua giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương

ứng.

2.3.4.3. Phương pháp gây độc tế bào dùng SRB

Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan và cs. Xác định hoạt tính gây

độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid và cs

đang được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI).

Phương pháp này đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học

các hợp chất thiên nhiên áp dụng từ năm 1996.

Phương pháp này sử dụng rộng rãi trong sàng lọc hoạt tính gây độc tế

bào in vitro. Phản ứng dựa vào khả năng SRB bám vào protein của tế bào đã

được cố định bởi trichloroacetic acid (TCA). SRB là chất nhuộm

aminoxanthene hồng nhạt với 2 nhóm sulfonic tác dụng gắn với các chất chứa

amino acid cơ bản trong điều kiện axit nhẹ, và tách ra trong điều kiện kiềm.

Lượng chất màu tách ra từ tế bào được nhuộm là tương ứng với khối lượng tế

bào.

Độ mạnh của sự bám dính SRB cho phép phản ứng thực hiện trong đĩa

96 giếng. Phản ứng SRB được chứng minh là có tính ứng dụng bởi lớp tế bào

sau khi cố định bởi TCA và nhuộm với SRB có thể được lưu giữ lâu dài. Chất

mầu tách ra từ tế bào nhuộm SRB là bền vững. Với tính nhạy cao, sử dụng với

phiến 96 giếng và tính bền vững, phản ứng SRB là phù hợp với ứng dụng sàng

lọc lớn cũng như trong nghiên cứu. Phản ứng này được dùng rộng rãi cho kiểm

tra độc tính của thuốc với các dòng tế bào ung thư và không ung thư.

Phép xác định gồm hai bước như sau:

Bước 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính

Chuẩn bị tế bào

Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các

môi trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DMEM.

Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO2 5%; độ ẩm 98%;

nhiệt độ 37oC, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệm

tiến hành từ 18-24 giờ.

Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bào

bằng đệm PBS. Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền dịch

tế bào ở nồng độ thí nghiệm ( khoảng 3-5x104 tế bào/ml tùy theo từng loại tế

bào thử nghiệm).

Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu thử: Chất chiết từ thân, lá, rễ cây xạ đen.

Tạo mẫu gốc (1- 10 mg/mL) trong dung môi DMSO. Dimethyl

sulphoxide (DMSO) độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa loãng với môi trường

ở nồng độ nhỏ hơn 1%.

Tiến hành thí nghiệm

Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau:

Dãy đối chứng âm: DMSO 10%

Dãy đối chứng dương: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (Ellipticine)

pha tới nồng độ 0,01mM trong DMSO.

Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bào

Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 37oC trong 3 ngày.

Kết thúc thí nghiệm

Tế bào sau khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để

khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% để

loại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắc

ngang.

Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515mm.

Tính kết quả

Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu

thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì được đánh giá là có hoạt tính.

Giá trị CS(%) được tính theo công thức:

Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn

σ được tính theo công thức:

Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i

: giá trị OD trung bình

n: số giếng thử lặp lại

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ được chọn ra cho

thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50.

Bước 2: Tìm giá trị IC50

Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chương trình Table curve

theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử

để tính giá trị IC50. Công thức:

Trong đó: y: nồng độ chất thử

X: Giá trị CS (%)

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Giám định loài của cây xạ đen tại Hòa Bình

Mẫu được thu tại Xóm Bãi Rồng, Thượng Tiến, Kim Bôi, Hòa Bình

Thời gian thu mẫu: tháng 6/2016

Đã thu mẫu và gửi PGS.TS. Nguyễn Xuân Phương, Viện Sinh thái và

Tài nguyên sinh vật giám định tên loài của cây xạ đen tại Hòa Bình. Dưới đây

là đặc điểm hình thái của cây xạ đen được miêu tả như sau:

Cây dây leo thân gỗ mọc thành bụi, dài trung bình 3-5 m. 

Cành tròn, lúc non có màu xám nhạt, không có lông, sau chuyển sang 

màu nâu, có lông, về sau có màu xanh.

 Cuống lá 0,6-1,5 cm, có nốt sần, phiến lá có hình elip hoặc gần giống

như elip, kích thước phiến lá 3-12 × 2-6 cm, dai, không có lông hoặc chỉ có

một lớp lông tơ mỏng trong các nách gân lá, rìa lá không có phiến răng cưa khi

trưởng thành. Lá mọc đơn cách.

 Cụm hoa có màu nâu nhạt, nằm trên ngọn hay nách lá, các cụm hoa nằm

ngang nhau và có chiều rộng khoảng 4-6 cm, có lông tơ. Hoa mẫu 5, tràng hoa

màu trắng, có hình dạng như chiếc phễu 3,5-4 mm. Thùy hoa có hình tam giác

2-2.5 mm, thường mảnh, dài hơn ống tràng hoa. Chỉ nhị 3.5-4 mm, chèn vào

phần trên của đế, bao phấn 1 mm.

 Quả hạch có màu đỏ hoặc màu vàng cam, có đường kính 3-4 mm. Mỗi

quả có 4 hạch, mỗi hạch chứa một hạt. Vỏ quả trong được phân chia khi trưởng

thành thành các hạt cứng của quả. Ra hoa tháng 3 - 5; ra quả tháng 8 - 12.

Từ những đặc điểm hình thái được mô tả phía trên, sau khi giám định

loài (sử dụng khóa phân loại theo tài liệu [42, 55] ở phụ lục 1) thu được kết quả

như sau: Cây xạ đen tại Hòa Bình có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. &

Moritzi thuộc chi Ehretia P. Browne, họ Vòi voi (Borraginaceae). Dưới đây là

hình ảnh tiêu bản mẫu giám định loài cây xạ đen tại Hòa Bình.

Hình 3.1. Tiêu bản khô của Hình 3.2. Tiêu bản khô của

lá, cành cây xạ đen hoa cây xạ đen

Hình 3.3. Hoa cây xạ đen Hình 3.4. Quả cây xạ đen

3.2. Đánh giá phân bố và trữ lượng loài của cây xạ đen tại Hòa Bình

3.2.1. Đặc điểm phân bố địa lý

Nghiên cứu đã tiến hành điều tra theo các điểm có cây xạ đen mà người

dân dẫn đường chỉ dẫn, phát hiện tại các xã:

 Liên Hòa, Lạc Thủy, Lạc Lương thuộc huyện Lạc Thủy

 Lạc Lương thuộc huyện Yên Thủy

 Ngọc Sơn, Tự Do, Cao Dương, Hợp Châu, Tân Thành huyện Lạc Sơn

 Phú Vinh, Phú Cường, Nam Sơn, Quyết Chiến thuộc huyện Tân Lạc

 Hiền Lương thuộc huyện Đà Bắc

 Bình Thanh, Thung Nai thuộc huyện Cao Phong

 Hợp đồng, Thượng Tiến, Tú Sơn, Bắc Sơn thuộc huyện Kim Bôi

Hòa Bình có khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa động lạnh, ít mưa; mùa hè

nóng, mưa nhiều. Nhiệt độ trung bình hàng năm trên 23°C. Tháng 7 có nhiệt độ

cao nhất trong năm, trung bình 27 - 29°C, ngược lại tháng 1 có nhiệt độ thấp

nhất, trung bình 15,5 - 16,5°C. Đây là một trong những điều kiện tự nhiên phù

hợp để cây xạ đen sinh trưởng tốt.

Trong quá trình điều tra thu thập mẫu cây xạ đen chúng tôi còn bắt gặp

cây có trong vườn nhà của một số hộ gia đình nông dân ở vùng núi cao. Tuy

nhiên, phần lớn xạ đen hiện nay được bán bán và sử dụng hiện nay chủ yếu là

xạ đen được trồng tại các hộ gia đình. Diện tích trồng cây xạ đen thay đổi theo

từng khu vực huyện, xã, gia đình…

3.2.2. Trữ lượng cây xạ đen tại Hòa Bình

Qua quá trình điều tra tổng hợp đã xác định một số kết quả về trữ lượng

của cây xạ đen. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Trữ lượng cây xạ đen tai Tỉnh Hòa Bình năm 2016

STT Địa điểm Diện tích (ha) Diện tích trồng xạ đen (ha)

A A.1 A.2 B. B.1 C. C.2 C.3 C.4 C.5 D D.1 Huyện Cao Phong Xã Bình Thanh Xã Thung Nai Huyện Đà Bắc Xã Hiền Lương Huyện Kim Bôi Xã Bắc Sơn Xã Hợp Đồng Xã Thượng Tiến Xã Tú Sơn Huyện Lạc Sơn Xã Ngọc Sơn 25437 2643 3638 820.200 4019 68200 1409 1396 5554 4554 58050 3329 13,09 4,73 3,51 2,73 4,12 14,80 2,43 3,67 4,75 3,95 7,46 3,21 Năng suất khô (tấn/ha) 2,72 2,70 2,74 2,52 2,52 2,82 2,69 2,87 2,95 2,76 2,63 2,65

5079 37500 2032 1642 2712 52300 3489 3779 2040 2621 29300 1458 28210 3241 2,61 2,91 3,0 2,91 2,82 2,65 2,85 2,56 2,48 2,72 2,62 2,62 2,52 2,52 4,25 70 35,5 16,2 18,3 21,3 5,5 6,8 4,2 4,8 2,6 2,6 4,5 4,5 136,8

D.2 E E.1 E.2 E.3 F F.1 F.2 F.3 F.5 G G.1 H H.1 Xã Tự Do Huyện Lương Sơn Xã Cao Dương Xã Hợp Châu Xã Tân Thành Huyện Tân Lạc Xã Phú Vinh Xã Phú Cường Xã Nam Sơn Xã Quyết Chiến Huyện Lạc Thủy Xã Liên Hòa Huyện Yên Thủy Xã Lạc Lương Tổng Kết quả bảng 3.1. cho thấy:

Cây xạ đen hiện nay được trồng chủ yếu ở các hộ gia đình tại 18 xã thuộc 8

huyện của tỉnh Hòa Bình với tổng diện tích trồng của toàn tỉnh là 136,8 ha.

Năng suất khô đạt từ 2,52 - 2,91 (tấn/ha) (phụ thuộc từng huyện). Trong đó,

huyện Lương Sơn có diện tích trồng lớn nhất khoảng 70 ha tập trung nhiều nhất

ở 3 xã Cao Dương, Hợp Châu, Tân Thành. Trong quá trình điều tra chúng tôi

cũng ghi nhận được một số vườn xạ đen lớn thuộc về các gia đình ông Nguyễn

Văn Thức, Nguyễn Thanh Hải, vườn dược liệu Thắng Tuấn ở thôn Cao Đường,

bà Nguyễn Thị Tuyết- thôn Đồng Bon xã Cao Dương, Lạc Sơn.

Qua quá trình điều tra khảo sát trên chúng tôi đã xây dựng được bản đồ

phân bố cây xạ đen như hình 3.5.

Ký hiệu

: Các xã có cây xạ đen phân

bố

Hình 3.5. Bản đồ phân bố cây xạ đen tại tỉnh Hòa Bình

3.3. Kết quả quá trình chiết tách

3.3.1.Điều chế các loại cao

Sau qua trình chiết các cao chiết tổng, dựa vào độ phân cực của các dung

môi đã áp dụng phương pháp chiết lỏng –lỏng để thu được các cặn chiết phân

đoạn của các bộ phận rễ, thân-cành, lá cây xạ đen lần lượt là: cặn n-Hexan, cặn

etyl acetat và cạn nước. Khối lượng của từng cặn chiết được tổng hợp dưới

bảng 3.2.

Bảng 3.2. Khối lượng cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn của các bộ phận

cây xạ đen Hòa Bình

Lá Thân Rế

Bộ phận

(5800g) (5000g) (2500g)

MeOH MeOH MeOH Cao

tổng (320g) (365,5g) (194,6g)

Etyl Etyl n- Etyl Cặn n-hexan Nước n-hexan Nước Nước axetat axetat hexan axetat chiết

Khối

lượng 135,5 34,4 150,1 119,3 43,7 202,3 64,3 28,5 101,8

(g)

3.3.2. Phân lập chất sạch từ cặn etyl axetat của bộ phận thân cây xạ đen

Bằng các phương pháp sắc ký cột silicagel pha thường, pha đảo và

sephadex đã phân lập được 6 chất sạch, ký hiệu lần lượt từ ET1-ET6. Cấu trúc

hóa học của 6 chất được xác định bằng các phương pháp phân tích phổ hiện đại

và kết hợp với các tài liệu đã công bố trước đó.

Hợp chất ET1 phân lập được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, tan

tốt trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực kém và trung bình. Kiểm tra trên

sắc ký lớp mỏng cho thấy vết chất ET1 trùng khớp với hợp chất daucosterol,

một hợp chất rất phổ biến trong thực vật [47].

Hợp chất ET2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối

lượng phun mù điện tử xuất hiện tín hiệu tại m/z 179 [M+H]+ cho phép dự đoán

ET2 có khối lượng phân tử 178. Phổ 1H NMR tại vùng trường trung bình thấp

xuất hiện tín hiệu của 3 proton vòng thơm tương tác kiểu ABX tại H 7,28 (1H,

d, J = 1,5 Hz, H-2), 6,88 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5) và 7,20 (1H, dd, J = 1,5, 8,0

Hz, H-6), và tín hiệu của 2 proton nối đôi dạng trans tại H 7,62 (1H, d, J =

16,0 Hz, H-7) và 6,69 (1H, dd, J = 8,0, 16,0 Hz, H-8). Ngoài ra tín hiệu đặc

trưng của một nhóm methoxy tại H 3,92 và nhóm -CHO tại H 9,60 (1H, d, J =

8,0 Hz, H-9) cũng được ghi nhận. Phổ 13C NMR và phổ DEPT của 2 cho biết

sự có mặt của 10 tín hiệu trong đó có 3 nguyên tử cacbon bậc 4 tại δC 125,1 (C-

1), 149,5 (C-3) và 127,8 (C-4), 6 nhóm metin và một nhóm methoxy (-OCH3)

tại δC 56,5. Tại vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu của nhóm andehit tại δC

196,1 (C-9). Kết hợp giữa sự phân tích các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu

tham khảo cho phép kết luận hợp chất ET2 là coniferaldehyde [55].

Hợp chất ET3 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phân tích dữ liệu

phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của hệ tương tác spin ABX của vòng thơm

[H 7,05 (d, J = 2,0 Hz), 6,95 (dd, J = 2,0; 8,0 Hz), 6,80 (d, J = 8,0 Hz)] và một

nối đôi có cấu hình trans tại H 7.56 (d, J = 16,0 Hz) và 6,27 (d, J = 16,0 Hz).

Phổ cacbon 13C-NMR cho tín hiệu của 1 nhóm methyl carboxylate tại 169.7 và

51.9.Từ những phân tích trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc

của ET3 được xác định là methyl caffeate [36].

Hợp chất ET4 thu được dưới dạng dầu không màu. Phổ khối lượng phun

mù điện tử xuất hiện tín hiệu tại m/z 385 [M+H+]+ phép dự đoán ET4 có khối

lượng phân tử 384. Phổ 1H NMR tại vùng trường trung bình xuất hiện tín hiệu

của 5 proton vòng thơm trong đó có 3 tín hiệu proton vòng thơm tương tác kiểu

ABX tại H 6,96 (1H, d, J = 2,0, H-2), 6,79 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5) và 6,85

(1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6), 2 tín hiệu proton vòng thơm khác tại H 6,97

(1H, s, H-2′) và 6,99 (1H, s, H-6′). Bên cạnh đó phổ proton còn cho thấy sự

xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm methoxy (-OCH3) tương ứng tại H 3,82, 3,88,

3,37 (mỗi pic 3H, s, OCH3-3, 3′, 9′). Hai tín hiệu proton nối đôi dạng trans tại

H 6,59 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-7′) và 6,18 (1H, dt, J = 15,5, 6,0 Hz, H-8). Hai

tín hiệu nhóm metin tại H 5,55 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-7) và 3,51 (1H, m, H-8)

và 2 tín hiệu proton của 2 nhóm metilen tại H 3,85 (2H, m, H-9) và 4,08 (2H,

dd, J = 1,0, 6,5 Hz, H-9′). Phổ 13C NMR và phổ DEPT cho ta xác định được

hợp chất ET4 có 21 nguyên tử cacbon trong đó chứa 2 nhóm metilen, 9 nhóm

metin, 7 nguyên tử cacbon bậc bốn và 3 nhóm methoxy tương ứng tại C 56,4,

56,7 và 57,9 (OCH3-3, 3′, 9′). Từ các dữ kiện phổ trên và so sánh với tài liệu

tham khảo cho phép kết luận hợp chất ET4 là 9′-methoxydehydrodiconiferyl

alcohol [37].

Hợp chất ET5 được phân lập dưới dạngdạng bột màu vàng sẫm. Trên

phổ 1H NMR của ET5 cũng giống chất 3 đã thu nhận sự có mặt của 6 proton

thơm của hai hệ tương tác spin ABX tại H [6.74 (d, J = 2,5Hz, H-5′), 6,60 (dd,

J = 2,0; 8,0 Hz, H-9′), 6,72 (d, J = 8,0 Hz (H-8′)] và [7,21 (d, J = 2,0 Hz, H-5),

6,83 (d, J = 8,0 Hz, H-8), 7,10 (dd, J = 2,0; 8,0 Hz, H-9)], hai olefinic proton

của nối đôi với cấu hình trans, một oxymethine proton H 5,23 (dd, J = 5,0; 7,5

Hz) và hai proton của nhóm methylen H 3,07 (m). Tuy nhiên sự có mặt của hai

nhóm methoxy tại H 3,72 và 3,92 của ET5 đã xác định đây là một dẫn xuất

của acid rosmarinic có tên là oresbiusin B [35].

Hợp chất ET6 thu được dưới dạng bột màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của

hợp chất ET6 có các tín hiệu đặc trưng của các proton hệ spin ABX vòng thơm

tại δH 6,86 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,57 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 7,58 (1H, dd, J =

2,0, 8,5 Hz). Bên cạnh đó còn xuất hiện 1 tín hiệu đặc trưng cho proton trong

nhóm –OCH3 tại độ dịch chuyển δ 3,91 (3H, s). Trên phổ 13C-NMR xuất hiện

tín hiệu của 8 nguyên tử cacbon, kết hợp với phổ DEPT ta nhận thấy có 1 nhóm

metyl, 3 nhóm metin và 4 cacbon bậc 4. Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu đặc

trưng của một cacbon vòng thơm chứa nhóm thế OH tại  152,7 ppm, tín hiệu

đặc trưng của nhóm C=O axít (170,0 ppm) và một tín hiệu đặc trưng của

nguyên tử cacbon trong nhóm -OCH3 (56,4 ppm). Dựa vào dữ kiện phổ trên và

so sánh với các số liệu đã công bố, hợp chất ET6 được xác định là axit vanillic

[48].

Như vậy 6 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc gồm

daucosterol (ET1), coniferaldehyde (ET2), methyl caffeate (ET3), 9′-

methoxydehydrodiconiferyl alcohol (ET4), oresbiusin B (ET5), axit vanillic

(ET6). Cấu trúc của 6 hợp chất và tên gọi được tổng hợp ở bảng 3.3

Bảng 3.3. Cấu trúc hóa học của các hợp ET1-ET6

STT Ký hiệu Tên chất Cấu trúc hóa học

1 ET1 Daucosterol

1 ET2 Coniferaldehyde

2 ET3 Methyl caffeate

9′-

3 ET4 Methoxydehydrodiconif

eryl alcohol

4 Oresbiusin B ET5

5 ET6 axit vanillic

3.4. Hoạt tính sinh học của cây xạ đen

Với việc được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong y học cổ truyền,

chi Ehritia đã sớm được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm đến. Từ chi

này, rất nhiều các hợp chất sinh học thứ cấp đã được tách chiết, tinh sạch, sàng

lọc hoạt tính và nhiều trong số chúng có hoạt tính tốt, hứa hẹn khả năng được

áp dụng vào thực tiễn. Các hoạt tính thường được thăm dò là: hoạt tính kháng

các dòng vi sinh vật kiểm định như vi khuẩn, gây độc với các tế bào ung thư và

khả năng chống các gốc oxy hóa. Ngoài ra, tùy theo những tác dụng của loài

trong y học dân gian, tùy theo tính chất của các nhóm chất, người ta có thể

thăm dò các hoạt tính khác như: tính kháng virus, ức chế các enzyme, chống

tiểu đường… Trong nghiên cứu này, chúng tôi xin trình bày về những hoạt tính

sinh học của các hợp chất đã được tách từ cây xạ đen Hòa Bình.

3.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

3.4.1.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cao chiết tổng

Ba cao chiết tổng từ 3 bộ phận (lá, thân và rễ) của cây xạ đen được đánh

giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm đinh trên phiến vi lượng 96 giếng, kết quả

thể hiện ở bảng 3.4. dưới đây:

Bảng 3.4. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cặn chiết tổng

chiết tách từ 3 bộ phận của cây Xạ đen

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: g/ml)

ST T

Vi khuẩn Gr(-) Nấm mốc Nấm men Vi khuẩn Gr(+)

S. F. S. C. Ký hiệu mẫu E. P. B. A.

Coli aeruginosa subtillis niger aureu s oxysporu m cerevisi ae albic ans

Cao Rễ XĐ 1 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) -MeOH

Cao MeOH

2 (-) (-) (-) (-) 500 (-) (-) (-) Thân XĐ

Cao MeOH- 3 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) lá xạ đen

Kết quả bảng 3.3. cho thấy các cao chiết tổng từ 2 bộ phận rễ và lá không

biểu hiện hoạt tính kháng 8 chủng vi sinh vật kiểm định thử ở nồng độ ≤500

g/ml. Đối với cao chiết MeOH từ thân xạ đen chỉ có khả năng ức tính ức chế 1

chủng vi sinh vật kiểm định A.niger với giá trị MIC là 500 g/ml, cao chiết này

cũng không thể hiện hoạt tính với các vi sinh vật kiểm định còn lại.

Nghiên cứu mới đây của Phạm Thị Lương Hằng và cs (2013) cho thấy

dịch chiết MeOH và đặc biệt là dịch chiết nước của xạ đen có tính kháng khuẩn

với B. subtilis [7]. Điều này cho thấy có nhiều vấn đề liên quan ảnh hưởng trực

tiếp đến hoạt tính sinh học của cây xạ đen như khí hậu, thời tiết, mùa vụ, thổ

nhưỡng, vi sinh vật...

Như vậy về khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các cao chiết tổng

từ các bộ phận cây xạ đen chưa thể hiện được hoạt tính sinh học.

3.4.1.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cao chiết phân đoạn

Hoạt tính kháng vi sinh vật của 9 mẫu thử mẫu trên phiến vi lượng 96 giếng với 8 chủng thuộc vi khuẩn Gram (-/+), nấm

men và nấm mốc được thể hiện ở bảng 3.5. dưới đây:

Bảng 3.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cao chiết phân đoạn chiết tách từ 3 bộ phận của cây xạ đen

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: g/ml)

Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men Ký hiệu mẫu STT E. P. B. S. A. F. S. C. Nồng độ đầu của mẫu Coli aeruginosa subtillis Aureus niger oxysporum cerevisiae albicans

1 Cao Hexan – Rễ XĐ 500 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

2 Cao Etyl– Rễ XĐ 500 (-) (-) (-) (-) 500 (-) (-) (-)

3 500 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Cao H2O –Rễ XĐ

4 Cao Hexan – Thân XĐ 500 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

5 Cao Etyl – Thân XĐ 500 (-) (-) (-) (-) 250 (-) (-) (-)

6 500 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Cao H2O–Thân XĐ

7 Hexan–lá xạ đen 500 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

8 Cao Etyl – lá xạ đen 500 (-) (-) (-) (-) 500 (-) (-) (-)

9 500 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Cao H2O – lá xạ đen

Kết quả bảng 3.4. cũng cho thấy hầu hết các cao chiết phân đoạn của 3 bộ phận

cây xạ đen: rễ, thân, lá không có khả năng kháng 8 vi sinh vật KĐ thử nghiệm.

Ngoại trừ: cao Etyl-Rễ XĐ, cao Hexan–Thân XĐ,cao Etyl – Thân XĐ, cao Etyl

– lá xạ đen có khả năng ức chế nấm mốc A.niger với gía trị MIC từ 250-500

g/ml.

Kết quả này và kết quả của các cao chiết tổng đã làm rõ khả năng kháng

vi sinh vật của cây xạ đen là rất yếu, hầu như là không có khả năng kháng các

vi sinh vật kiểm định.

3.4.2. Hoạt tính chống oxy hóa

3.4.2.1. Hoạt tính chống ôxy hoá của các cao chiết tổng của cây xạ đen

Các chất chống oxy hóa được biết đến như vitamin E, vitamin C, lycopen,

resveratrol, và một số chất trao đổi thứ cấp khác trong cây. Các chất này được

bổ sung vào dược phẩm và thực phẩm chức năng có tác dụng tăng cường khả

năng miễn dịch của cơ thể, phòng và điều trị các bệnh do gốc tự do sinh ra như

tiểu đường, tim mạch, alzheimer, ung thư….Các chất chống oxy hóa nguồn gốc

thực vật đang được quan tâm do đặc điểm lý hóa của chúng như an toàn đối với

cơ thể, bền nhiệt … Các chất này thường có bản chất là các polyphenol. Do vậy

chúng tôi tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa từ các cao chiết tổng và các

cao chiết phân đoạn từ các bộ phận cây xạ đen lá, thân-cành, rễ nhằm tìm kiếm

các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa mới có nguồn gốc thực vật. Kết quả

thử nghiệm được tổng hợp ở bảng dưới đây (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Hoạt tính chống ôxy hoá của các cao chiết tổng của cây xạ đen

Khả năng Nồng độ đầu SC50 T của mẫu Kí hiệu mẫu bao vây T (g/ml) (µg/ml) (SC, %)

Chứng (+) 50 20,64 92,60  0,42

Chứng (-) - - 0,0  0,0

1 Cao Rễ XĐ -MeOH 500 97,5 89,34  0,3

Cao Thân XĐ - 2 500 72,5 89,77  0,9 MeOH

Cao Lá xạ đen- 3 500 46 91,13  0,0 MeOH

Chứng (-): DPPH/EtOH + DMSO. Chứng (+): Ascobic acid

Kết quả bảng 3.6. cho thấy:

Các cao chiết tổng từ 3 bộ phận thân, rễ, lá của cây xạ đen đều thể hiện

hoạt tính oxy hóa tương đối mạnh. Hoạt tính oxy hóa của các cao chiết Rễ XĐ

–MeOH, Thân XĐ –MeOH, Lá xạ đen- MeOH với các giá trị SC50 tương ứng:

97,5; 72,5; 46 g/ml. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ly và cs (2006)

là: 8 hợp chất phenolic phân lập từ cao chiết tổng 50% metanol từ cao chiết lá

cây xạ đen đều thể hiện hoạt tính oxy hóa [43], kết quả này tốt hơn so với

nghiên cứu của Phạm Thị Loan (2018): cao ethanol từ lá và cành của cây xạ

đen CH01 thu ở Tân Lạc Hòa Bình, CH02 được di thực và trồng tại Việt Trì-

Phú Thọ có hoạt tính chống oxy hóa yếu [10]. Sự khác nhau này có thể do sự

khác nhau về dung môi tách chiết hoặc điểm điểm thổ nhưỡng của vùng thu hái

mẫu. Đây là một trong những đặc điểm cần lưu ý trong các nghiên cứu tiếp

theo về cây xạ đen. Như vậy, trong các cao chiết tổng trên cao chiết tổng từ lá

có hoạt tính oxy hóa mạnh nhất.

Hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết phân đoạn 3.4.2.2.

Kết quả đánh gía hoạt tính sinh học của các cao chiết phân đoạn cây xạ

đen được được trình bày ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Hoạt tính chống ôxy hoá của các cao chiết phân đoạn của cây xạ

đen

Khả năng Nồng độ đầu SC50 của mẫu TT Kí hiệu mẫu bao vây

(g/ml) (µg/ml) (SC, %)

Chứng (+) 50 20,64 92,60  0,42

Chứng (-) - - 0,0  0,0

1 Cao Rễ XĐ -Hexan 500 493,5 53,03  1,0

2 Cao Rễ XĐ - Etyl 500 23 91,55  0,1

3 500 80,5 Cao Rễ XĐ - H2O 83,96  1,9

4 Cao Thân XĐ -Hexan 500 - 47,69  1,0

5 Cao Thân XĐ -Etyl 500 7,0 90,71  0,2

6 500 70,5 Cao Thân XĐ - H2O 85,66  1,3

7 Cao Lá xạ đen- Hexan 500 42,33  1,3 -

8 Cao Lá xạ đen- Etyl 500 6 91,95  0,1

9 500 12 Cao Lá xạ đen- H2O 88,26  0,2

Chứng (-): DPPH/EtOH + DMSO. Chứng (+): Ascobic acid

Kết bảng kết quả 3.7. cho thấy: các phân đoạn chiết mẫu thử đều biểu hiện

hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH với giá trị từ 6 ÷ 493,5 g/ml. Chỉ có 2

mẫu chiết phân đoạn n-hexan từ lá và thân của cây xạ đen là không biểu hiện

hoạt tính chống ôxi hóa. Cao chiết phân đoạn etylaxetat và nước từ lá cây xạ

đen thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị SC50 tương ứng là 6 và 12 g/ml.

Về hoạt tính chống oxy hóa của cây xạ đen là rất tốt, kết quả này sẽ tạo

điều kiện cho nghiên cứu trong lĩnh vực y được để đưa các sản phẩm phục vụ

đời sống cũng như sức khỏe của cộng đồng.

3.4.3.Hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư.

3.4.3.1. Hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư của các cao chiết

tổng của cây xạ đen.

Việc nghiên cứu các hợp chất thứ cấp có nguôn gốc thiên nhiên ngày

càng được ưu tiên hơn trong việc điều trị các loại bệnh nan y như ung thư,

HIV- AIDS … bởi độ an toàn cho người bệnh. Những nghiên cứu trước đây về

các hợp chất có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư đã được phân lập từ

chi Ehretia hứa hẹn khả năng ứng dụng của chúng trong việc chữa trị ung thư.

Theo Gs. Lê Thế Trung (1998) khi nghiên cứu lâm sàng trên động vật kết quả

cho thấy rằng các chất flavonoid, quinon trong cây xạ đen có khả năng làm

giảm sức sống của các tế bào ung thư, đặc biệt là các tế bào ung thư ác tính [8].

Trong nghiên cứu này, từ 3 bộ phận (thân, rễ, lá) của cây xạ đen chúng tôi

đã tách chiết được 3 cao chiết tổng (rễ XĐ-MeOH, thân XĐ-MeOH, lá XĐ-

MeOH). Các cao chiết tổng số được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 4

dòng tế bào ung thư và 1 dòng tế bào thường. Kết quả thể hiện trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết tổng cây xạ đen

Dòng tế bào Nồng

độ Ký hiệu Cell survival (%) STT mẫu mẫu

Hep-G2 LU-1 HeLa MCF-7 Vero (g/ml)

DMSO 100,00,0 100,00,0 100,00,0 100,00,0 100,00,0

0 Chứng (+) 5 1,340,6 5,660,2 3,451,2 31,210,9

Rễ XĐ- 63,420,7 100 66,280,4 90,102,1 24,082,3 3,600,1 MeOH

Thân XĐ- 77,280,4 100 0 67,481,1 86,332,0 32,081,7 MeOH

Lá XĐ- 76,531,5 100 0 0 31,431,6 82,831,8 MeOH

Bảng 3.9. Kết quả xác định giá trị IC50 của cao chiết tổng của cây xạ đen

Giá trị IC50 (g/ml)

TT KH mẫu Dòng tế bào

Hep-G2 LU-1 HeLa MCF-7 Vero

1 Rễ XĐ-MeOH - - 89,4 38,70 >100

Thân XĐ- 2 - - 71,13 16,45 >100 MeOH

- 3 Lá XĐ-MeOH 77,36 75,28 9,98 >100

Trong cả 3 cao chiết tổng từ 3 bộ phận thân, rễ, lá của cây xạ đen là rễ

XĐ-MeOH, thân XĐ-MeOH, lá XĐ-MeOH đều có khả năng gây độc với ít 50

nhất 2/4 dòng tế bào ung thư (MCF-7 và HeLa) với giá trị IC50 ≤ 100 g/ml.

Cao chiết MEOH của bộ phận lá biểu hiện hoạt tính gây độc với 3 dòng tế bào

ung thư gan (Hep-G2), ung thư vú (MCF-7) và ung thư tử cung (HeLa) với các

giá trị IC50 tương ứng là 77,36; 75,28; 9,98 g/ml. Trong 3 cao chiết tổng trên

đều có khả năng gây độc mạnh tới dòng ung thư vú MCF-7 với giá trị IC50 khá

thấp từ 9,98- 38,70 g/ml. Kết quả đánh giá hoạt tính trên ung thư gan yếu hơn

so với các mẫu nghiên cứu của Phạm Thị Loan (2018): cao ethanol từ lá và

cành của cây xạ đen CH01 thu ở Tân Lạc Hòa Bình, CH02 được di thực và

trồng tại Việt Trì- Phú Thọ có hoạt tính gây độc tốt với dòng tế bào ung thư gan

(Hep-G2) với giá trị IC50 lần lượt là 26,48; 31,34 g/ml [10].

Đặc biệt là cả 3 cao chiết tổng số từ 3 bộ phận trên đều không gây độc

với tế bào thường (tế bào biểu mô thận khỉ - Vero).

Từ nghiên cứu trên, chúng tôi thấy rằng hầu như các cao chiết tổng số từ

3 bộ phận thân, rễ, lá có hoạt tính sinh học cao. Đây chính là cơ sở để tiếp tục

các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học ở các cao chiết phân đoạn của cây

xạ đen. 3.4.3.2

3.4.3.2. Hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư của các cao

chiết phân đoạn từ các xạ đen

Sau khi nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào bằng cao chiết tổng (rễ XĐ-

MeOH, thân XĐ-MeOH, lá XĐ-MeOH) từ 3 bộ phận (thân, rễ, lá) của cây xạ

đen, chúng tôi tiếp tục đánh giá trên 9 cao chiết phân đoạn. Các cao chiết được

đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư và 1 dòng tế bào

thường. Kết quả thể hiện trong bảng 3.10.

Bảng 3. 10. Hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết phân đoạn xạ đen

Dòng tế bào Nồng Ký hiệu độ mẫu Cell survival (%) STT mẫu (g/ml) Hep-G2 LU-1 HeLa MCF-7 Vero

DMSO 100,00,0 100,00,0 100,00,0 100,00,0 100,00,0

0 5 Chứng (+) 1,340,6 5,660,2 3,451,2 31,210,9

1 Rễ XĐ- 59,530,5 100 0 27,190,6 76,520,1 4,810,4 Hexan

2 Rễ XĐ- 79,270,9 100 0 0 24,500,2 85,091,1 Etyl

3 Rễ XĐ- 91,251,3 100 71,221,2 77,271,3 9,151,4 8,350,1 H2O

4 Thân XĐ- 72,530,8 100 0 0 0 24,352,5 Hexan

5 Thân XĐ- 76,361,2 100 0 0 18,540,8 98,070,6 Etyl

6 Thân XĐ- 98,740,8 100 59,921,3 87,620,7 13,880,2 4,741,7 H2O

7 Lá XĐ- 72,390,7 100 0 0 0 62,481,6 Hexan

8 Lá XĐ- 79,521,2 100 0 76,331,8 95,241,8 67,821,1 Etyl

9 Lá XĐ- 93,510,3 100 41,111,1 64,441,9 21,871,5 4,680,7 H2O

Bảng 3. 11. Kết quả xác định giá trị IC50 của cao chiết phân đoạn xạ đen

Giá trị IC50 (g/ml)

TT KH mẫu Dòng tế bào

Hep-G2 LU-1 HeLa MCF-7 Vero

1 Rễ XĐ-Hexan 81,04 75,56 80,94 >100 -

2 Rễ XĐ-Etyl 67,78 75,77 10,42 >100 -

76,13 75,27 >100 - - 3 Rễ XĐ-H2O

Thân XĐ- 4 28,3 89,82 18,59 14,42 >100 Hexan

5 Thân XĐ-Etyl 55,69 75,17 13,4 >100 -

62,41 39,78 >100 - - 6 Thân XĐ-H2O

7 Lá XĐ-Hexan 39,83 76,32 20,12 >100 -

8 Lá XĐ-Etyl - 10,75 >100 - -

92,53 14,16 7,79 >100 - 9 Lá XĐ-H2O

Kết quả ở bảng 3.10. và 3.11. cho thấy:

Tất cả các cao chiết phân đoạn từ 3 bộ phận thân, rễ, lá của cây xạ đen

đều có khả năng gây độc với ít nhất 1 dòng tế bào. Một số cao chiết từ 3 bộ

phận thân, rễ, lá của cây xạ đen đều có khả năng ức chế mạnh 50% với dòng tế

bào ung thư vú (MCF-7) như Rễ XĐ-Etyl, Thân XĐ-Hexan, Thân XĐ-Etyl,

Thân XĐ-H2O Lá, Lá XĐ-Hexan, Lá XĐ-Etyl, Lá XĐ-H2O với các giá trị IC50

tương ứng sau: 10,42; 14,42; 13,4; 9,98; 20,12; 10,75; 7,79 (g/ml). Các cao

chiết Thân XĐ-Hexan, Lá XĐ-H2O còn có khả năng ức chế mạnh 50% dòng tế

bào ung thư cổ tử cung (HeLa) với các giá trị IC50 tương ứng sau: 18,59; 14,16

(g/ml). Trong đó, cao chiết phân đoạn n-hexan từ thân cây xạ đen có khả năng

gây độc với cả 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Hep-G2, LU-1, HeLa, MCF-

7) với giá trị IC50 lần lượt là 28,3; 89,82; 18,59; 14,42 g/ml. Đặc biệt là các

cao chiết này không gây độc cho tế bào thận khỉ xanh (Vero). Kết quả nghiên

cứu này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Đỗ Thị Thảo và cs (2008) cho

thấy cao chiết phân đoạn của xạ đen R6 có hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú

(MCF-7) với giá trị IC50 là 19,62 µg/ml [15].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy cao chiết từ 3 bộ phận cây xạ đen

có khả năng ức chế mạnh với 2 dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela và ung thư

vú MCF7 với giá trị IC50 thấp hơn so với những nghiên cứu trước. Đây là một

trong những điểm mới so với các nghiên cứu trước đây.

3.4.3.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất đã phân lập

Sau khi nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào bằng cao chiết phân đoạn

chúng tôi nhận thấy các cao chiết phân đoạn từ bộ phận thân và lá thể hiện hoạt

tính gây độc tế bào tốt hơn các cao chiết từ bộ phận rễ. Để làm rõ vấn đề này

chúng tôi tiếp tục đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các hợp chất đã phân

lập từ các bộ phận cây xạ đen. Tuy nhiên, trong phạm vi nghiên cứu của luận

văn này chúng tôi tập trung đánh giá các hợp chất tách chiết từ bộ phân thân-

cành cây xạ đen. Từ quá trình tách chiết thân cây xạ đen chúng tôi thu được 5

hợp chất: methyl caffate, oresbiusin B, 9′-Methoxydehydrodiconiferyl alcohol ,

axit vanillic, coniferaldehyde (hợp chất daucosterol (ET1) là chất phổ biến

không có hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư [47] nên không sử

dụng để đánh giá hoạt tính).

Bảng 3.12. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất tinh khiết đã phân lập

Dòng tế bào Nồng độ Ký hiệu mẫu Cell survival (%) STT mẫu (g/ml) Hep-G2 LU-1 HeLa MCF-7 Vero

DMSO 100,00,0 100,00,0 100,00,0 100,00,0 100,00,0

Chứng (+) 0 5 1,340,6 5,660,2 3,451,2 31,210,9

(ET2) 100 100 96,1±0,5 90,8±1,6 93,5±1,2 99,6±0,8 1

(ET3) 100 2 28,641,9 86,322,2 33,36±1,5 23,29±2,0 82,5±0,2

99,60,5

99,51,3

82,91,8

97,30,7

94,21,6

100 3 (ET4)

(ET5) 100 4 48,631,4 99,28±0,4 67,79±1,7 70,29±0,1 93,7±0,4

(ET6) 100 93,1±1,37 88,0±1,5 66,7±0,1 92,5±1,1 90,8±0,5 5

Bảng 3.13. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất tinh khiết

Giá trị IC50 (g/ml)

STT KH mẫu Hep- Vero LU-1 HeLa MCF-7 G2

ET3 (Methyl - >10 2,83 3,38 4,40 1 caffeate)

ET5(Oresbiusin B)

- - - >10 9,89 2

Kết quả bảng 3.12. và 3.13. cho thấy trong 5 hợp chất được tách chiết từ

cặn chiết etyl axetat thân-cành xạ đen có 2 hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc

tế bào là methyl caffeate (ET3) và Oresbiusin B (ET5). Trong đó, methyl cafate

có khả năng ức chế mạnh với 3 dòng ung thư Hep-G2, HeLa, MCF-7 với các

giá trị IC50 tương ứng là: 2,83; 3,38; 4,40 (g/ml). Hợp chất oresbiusin B có

khả năng ức chế dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 với giá trị IC50 là 9,89

(g/ml).

Trong năm hợp chất được tách chiết thì có 2 hợp chất có chứa nhóm

methyl ester thì khả năng gây độc tế bào ung thư tăng lên đáng kể điều này cho

thấy khả năng kháng ung thư của 2 hợp chất này có thể phụ thuộc vào nhóm

methyl ester này. Trong hai hợp chất có khả năng gây độc, methyl caffeate có

hoạt tính sinh học với cả ba tế bào ung thư đều tốt hơn hẳn hợp chất oresbiusin

B (mặc dù có 2 nhóm methyl ester). Kết quả này gợi mở cho những nghiên cứu

tiếp theo đối với các hợp chất này.

Kết quả hoạt tính còn cho thấy cả 3 hợp chất 9′-

Methoxydehydrodiconiferyl alcohol, axit vanillic, coniferaldehyde đều không

thể hiện hoạt tính với tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư cổ tử cung Hela, ung

thư vú MCF-7 và năm hợp chất này đều không thể hiện hoạt tính với tế bào ung

thư LU-1, điều này cho thấy không cấu trúc nào trong năm hợp chất này có thể

gây độc cho LU-1.

Kết quả nghiên cứu của Balachandran C và cs (2015), chất methyl

caffeate được phân lập từ trái cây Solanum torvum Swartz. bằng dung môi etyl

axetat cho thấy hoạt tính gây độc tế bào MCF-7 tốt hơn so với dung môi

hexane và methanol. Ngoài ra, hoạt tính gây độc tế bào còn được thực hiện các

tế bào MCF-7, A549, COLO320, HepG-2 và Vero. Kết quả nghiên cứu của

nhóm tác giả cho thấy hợp chất này có hoạt tính gây độc tế bào tế bào MCF-7

mạnh hơn so với các tế bào A549, COLO320 và HepG-2. Nghiên cứu cơ chế

gây độc tế bào lên các tế bào MCF-7 chỉ ra rằng: methyl caffeate làm giảm sự

gia tăng tế bào đồng thời tăng quá trình phân mảnh DNA và quá trình chết rụng

tế bào của MCF-7 thông qua gia tăng sự hoạt động của enzyme caspase để giải

phóng cytochrome C từ ty thể. Ngoài ra, hoạt tính trên của methyl caffeate chiết

xuất từ quả Solanum torvum Swartz. còn có khả năng ức chế vừa phải các

enzyme α- glucosidase: sucrase và maltase, IC50=1,5(mM) đối với sucrase còn

IC50=2(mM) đối với maltase [22], [26], [27]

Ngoài khả năng gây độc tế bào ung thư gan, ung thư vú MCF-7 trong

một số nghiên cứu trước đây, thì trong nghiên cứu lần này chúng tôi nhận thấy

điểm mới là các cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, các hợp chất tinh khiết

còn thể hiện khả năng gây độc mạnh đối với các dòng tế bào ung thư cổ tử

cung (Hela) mà các nghiên cứu trước đây chưa đưa ra được. Kết quả này gợi

mở cho những nghiên cứu tiếp theo đối với các cao chiết cũng như hợp chất

tinh khiết này.

IV. KẾT LUẬN

Sau quá trình nghiên cứu chúng tôi có một số kết luận sau:

1. Cây xạ đen thu thập tại xóm Bái Rồng, xã Thượng Tiến, huyện Kim Bôi

Hòa, tỉnh Hòa Bình có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Moritzi.

2. Cây xa đen phân bố chủ yếu tại 18 xã, thuộc 8 huyện của tỉnh Hòa Bình

Diện tích trồng toàn tỉnh khoảng 136,8 ha.

3. Từ 3 bộ phận thân, rễ, lá đã tách chiết được 3 cao chiết tổng, 9 cao chiết

phân đoạn.

4. Đã khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính gây độc tế

bào của 3 cao chiết tổng kết quả cho thấy cao Thân- MeOH có hoạt tính đối với

chủng nấm mốc A.niger với giá trị MIC 500 g/ml; cao lá – MeOH có hoạt tính

chống oxy hóa mạnh nhất với giá trị SC50 là 46 g/ml, các cao chiết Rễ -

MeOH, Thân XĐ –MeOH, Lá Xạ đen – MeOH có khả năng ức chế dòng tế bào

ung thư vú MCF-7 với các giá trị I C50 tương ứng là 38,7 16,45; 9,98 g/ml.

5. Đã khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và hoạt tính chống oxy hóa và hoạt

tính gây độc tế bào của 9 cao chiết phân đoạn thu được kết quả cho thấy các

phân đoạn EtOAc của cả 3 bộ phận rễ, thân, lá đều có hoạt tính đối với chủng

nấm mốc A.niger với giá trị MIC lần lượt 500, 250, 500 g/ml; các cao chiết

trong phân đoạn EtOAc trong cả 3 bộ phận rễ, thân, lá và cao chiết phân đoạn

nước của lá có hoạt tính chống oxy hóa với giá trị SC50 là 23; 7,0; 6 và 12

g/ml. Các phân đoạn etylacetat và cao chiết nước có hoạt tính đối với tế bào

ung thư vú với các giá trị IC50 là 10,42; 13,4; 10,75; 7,79 g/ml. Đặc biệt, phân

đoạn Thân – Hexan, lá – H2O còn có tác dụng đối với tế bào Hela các giá trị

IC50 là 18,59; 14,16 g/ml.

6. Đã phân lập được 6 hợp chất trong phân đoạn EtOAc của bộ phận thân cành

là: methyl caffeate, coniferaldehyde, 9′-methoxydehydrodiconiferyl alcohol và

axit vanillic, oresbiusin B, deucosterol. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế

bào của các hợp chất cho thấy methyl cafeate có hoạt tính mạnh với 3 dòng tế

bào ung thư Hep-G2, Hep-G2, MCF-7 với giá trị IC50 tương ứng là 2,83; 3,38;

4,40 g/ml. Chất oresbiusin có hoạt tính với dòng tế bào Hep-G2 với giá trị

IC50 là 9,89 g/ml.

7. Tất cả cao chiết tổng, phân đoạn và các chất phân lập được đều không gây

độc đối với tế bào lành tính Vero.

 Đóng góp của luận văn

Làm sáng tỏ sự hợp lý trong việc sử dụng bài thuốc dân gian xạ đen để chữa trị

ung thư:

Chứa các thành phần có hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư 

Không gây độc với tế bào lành nên có thể sử dụng làm thuốc chữa bệnh. 

Gợi mở bộ phận dùng làm thuốc là thân, cành hoặc lá, phân đoạn EtOAc 

có hoạt tính mạnh nhất.

V. KIẾN NGHỊ

Để cây xạ đen ngày càng được chú trọng và phát triển, trở thành một

trong những nguồn lực trong phát triển kinh tế trước hết tỉnh Hòa Bình cần chủ

trương quy hoạch, bảo vệ các nguồn tài nguyên này.

Tiếp tục các nghiên cứu đánh hoạt tính sinh học khác của các hợp chất

hóa học đã được tách chiết tại các cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn. Dựa

trên cơ sở đầy đủ về hoạt tính sinh học, thành phần hóa học của cây, từng bước

tiến hành nghiên cứu các sản phẩm chức năng hỗ trợ công tác điều trị các bệnh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Võ Văn Chi (2012). Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học

Hà Nội.

2. Nguyễn Huy Cường (2008). Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò

hoạt tính sinh học cây xạ đen (Celastrus hindsii Benth. & Hook. ) và cây

Cùm rụm răng (Ehretia dentata Courch.), Luận án tiến sĩ.

3. Đỗ Thanh Hải (2011). Nghiên cứu đặc điểm phân bố, thử nghiệm nhân

giống cây xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Moritzi) bằng phương pháp

giâm hom và gieo hạt tại tỉnh Hòa Bình, Luận văn Thạc sỹ.

4. Nguyễn Khắc Hải & cs (2013). Giáo trình mô đun trồng cây xạ đen, Bộ

Nông nghiệp và Phát triển Nông Thôn.

5. Hoàng Quỳnh Hoa (2010). Nghiên cứu một số cây thuốc chi Cườm rụng

(Ehretia P. Br.), họ Vòi voi (Boraginaceae) ở miền Bắc Việt Nam”, Luận

án tiến sỹ, Trường Đại học Dược Hà Nội.

6. Hoàng Quỳnh Hoa, Phạm Thanh kỳ, Phạm Hải Yến, Châu Văn Minh,

Phan Văn Kiệm (2009). Menisdausin và axit rosmarinic phân lập từ cây

Cụm Rụng hoa dài (Ehretia longiflora champ., Boraginaceae), Tạp chí

Hóa học T.47 (1), Tr. 90-94.

7. Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên, Nguyễn Thị Yến, Ngô Thị

Trang (2013). Phát triển phương pháp khuếch tán - so màu trên đĩa

thạch trong sàng lọc và phát hiện các chất có hoạt tính kháng khuẩn từ

các dịch chiết thực vật, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, khoa học tự nhiên

và công nghệ, tập 29, số 2, tr 10-17.

8. Phạm Hoàng Hộ. Cây cỏ Việt Nam quyển 2. Tr 804-806

9. Nguyễn Thị Vân Khanh, Triệu Duy Điệt, Nguyễn Văn Minh, Vũ Bình

Dương, Nguyễn Tuấn Quang, Lương Quang Anh, Phạm Quốc Long

(2007). Tuyển tập công trình hội nghị Hoá Hữu cơ lần IV, 422-425

10. Phạm Thanh Loan (2018). Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết từ

cây xạ đen Celatrus hindsii Benth.Báo cáo khoa học về nghiên cứu và

giảng dạy sinh học ở Việt Nam.

11. Đỗ Tất Lợi (2001). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất

bản Y học Hà Nội.

12. Đỗ Tiến Lực, Trần Thị Thanh Huệ, Lò Văn Nhập (2015). Nghiên cứu sự

tham gia của người dân trong bảo tồn và phát triển tài nguyên cây thuốc

tại xã Bảo Ái, huyện Yên Bình, tỉnh Yên Bái, Báo cáo Quản lý Tài

nguyên Thiên nhiên.

13. Phạm Bằng Lương, Lưu Hồng Sơn, Nguyễn Thị Tình, Phạm Thị Thủy,

Nguyễn Hữu Thọ, Nguyễn Văn Bảo, Trần Trung Kiên, Ngô Xuân Bình

(2015). Nghiên cứu nhân giống invitro cây xạ đen (Ehretia asperulla

Zoll.&Mor.) Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn T233-241

14. Bùi Hồng Quang, Vũ Xuân Phương, Trần Ninh (2007). Chi cườm rụng -

Ehretia p. Br. (Họ Vòi voi - Boraginaceae Juss.) ở Việt Nam, Báo cáo

khoa học về Tài nguyên Sinh vật, Hội nghi Khoa học toàn quốc lần thứ

2, nhà xuất bản Nông nghiệp,Tr 216.

15. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu (2008). Xác định khả năng

phòng chống ung thư của một số chất chiết thực vật Việt Nam bằng

phương pháp thử sinh học invitro. Tạp chí sinh học (30): tr 79-82

16. Nguyễn Nghĩa Thìn (2005). Đa dạng thực vật VQG Pù Mát Nghệ An

(Botanical diversity of Pu Mat National Park, Nghe An). Nhà xuất bản

Nông nghiệp.

17. Le Thi Thuy Tien, Tran Van Minh (2015). Tissue cultures of xa den

(Ehretia asperula Zollinger et Moritzi), Journal of Science , Vol. 3 (3), p

113 – 123

18. Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Huy Cường, Phạm Thị Ninh, Trần Văn Sung

(2008). Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất Tritecpen từ cây xạ

đen, Tạp chí hóa học, T.46, Tr. 456-461.

19. Lê Thế Trung (1998). Nghiên cứu đánh giá tác dụng hỗ trợ dự phòng

và điều trị ung thư của bài thuốc phối hợp Phylamin và dịch chiết từ cây

xạ đen (K10) đề tài cấp bộ Quốc phòng, Học viện Quân Y, Hà Nội.

20. Lưu Thị Kim Yến (2006). Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần

hóa học của dược liệu mang tên cây xạ đen thu hái ở Hòa Bình. Khóa

luận tốt nghiệp dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

21. Trần Văn Sung , Nguyễn Huy Cường, Phạm Thị Ninh, Trịnh Thị Thủy

(2009. Phân lập và xác định cấu trúc và tổng hợp một số dẫn xuất của α –

amyrin từ cây cùm rụng răng, Tạp chí hóa học, T.47, Tr. 691- 697.

TIẾNG ANH

22. Balachandran C, Emi N, Arun Y, Yamamoto Y, Ahilan B, Sangeetha B,

Duraipandiyan V, Inaguma Y, Okamoto A, Ignacimuthu S, Al-Dhabi

NA, Perumal PT (2015). In vitro anticancer activity of methyl caffeate

isolated from Solanum torvum Swartz. fruit. Chem Biol Interact.

23. Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E. and Berset C. (1995). Use of a Free

Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. Lebensm.-Wiss. u.-

Technol., 28: 25-30

24. Chien, Y. C., Lin, C. H., Chiang, M. Y., Chang, H. S., Liao, C. H., Chen,

I. S., Peng, C. F., & Tsai, I. L. (2012). Secondary metabolites from the

root of Ehretia longiflora (Boraginaceae) and their biological activities.

Phytochemistry, 80, 50-7 .

25. El-Hagrassi, A. M., Ali, M. M., Osman, A. F. & Shaaban, M. (2011).

Phytochemical, investigation and biological studies of Bombax

malabaricum flowers, Natural Products Research, 25(2): 141-151.

ISSN: 1029-2349

26. Fabrice B., Robert A. T., Olympe T., Nathalie J., Hubert H., Philippe C.

(2013). Antiproliferative and apoptotic effects of the oxidative

dimerization product of methyl caffeate on human breast cancer cells.

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 23(2): 574-578.

27. Federico Ferreres, JulianaVinholes, AngelGil-Izquierdo,

PatríciaValentão, Rui F.Gonçalves, Paula B.Andrade (2013). Invitro

studies of α-glucosidase inhibitors and antiradical constituents of

Glandora diffusa (Lag.) D.C. Thomas infusion, Food Chem, 136(3-4):

1390-8.

28. F. Freiburghaus, E.N. Ogwal, M.H. kunya, R. Kaminsky and R. Brun

(1996). Trop Med. Int. Health, 1, page 765.

29. Gottschling M. & Hilger H.H. (2001). Phylogenetic analysis and

character evolution of Ehretia and Bourreria (Ehretiaceae, Boraginales)

based on ITS1 sequences. Bot Jahrb Syst 123: 249 – 268

30. Gottschling M., F. Luebert, H.H. Hilger & J.S. Miller (2014). Molecular

delimitations in the Ehretiaceae (Boraginales). Mol Phylogenet Evol 72:

1 – 6. (IF 2012: 4.018)

31. Gopalsamy RajivGandhi, SavarimuthuIgnacimuthu, Michael

GabrielPaulraj, PonnusamySasikumar (2011). Antihyperglycemic

activity and antidiabetic effect of methyl caffeate isolated from Solanum

torvum Swartz. fruit in streptozotocin induced diabetic rats, European

Journal of Pharmacology, Volume 670, Issues 2–3, Pages 623-631.

32. G.H. Schmelzer, A. Gurib-Fakim, Eds (2008). Plant Resources of

Tropical Africa 11(1), Medicinal Plants 1, PROTA Foundation,

Backhuys Publishers: Netherland, page 237.

33. Holanda Pinto, S. A., Pinto, L. M. S., Cunha, G. M. A., Chaves, M. H.,

Santos,F. A. & Rao, V.S., (2008). Anti-inflammatory effect of α,β-

Amyrin, a pentacyclic triterpene from Protium heptaphyllum in rat

model of acute periodontitis, Inflammopharmacology, 16:48-52. ISSN:

0925-4692

34. Hui-Chi Huang, Chien-Chang Shen, Chieh-Fu Chen, Yang-Chang Wu,

and Yao-Haur Kuo, (2000). A Novel Agarofuran Sesquiterpene, Celahin

D from Celastrus hindsii Benth, Chem. Pharm. Bull. 48(7) page s1079—

1080.

35. Huang H., Sun H .D., Zhao M. S., Xun S.(1996). Phenolic compounds of

Isodon oresbius.J. Nat. Prod., 59(11): 1079-1080.

36. Iizuka M., Warashina I., Noro T.( 2001). Bufadienolides and a New

Lignan from the Bulbs of Urginea maritima, Chem. Pharm. Bull., 49:

282-286.

37. K. Iqbal, S.A. Nawaz, A. Malik, N. Riaz, N. Mukhtar, P. Mohammad

and M.I. Choudhary,(2005), Chem. Biodivers., 2, page 104.

38. Kumar, G.P., Navyaa, K., Ramya, E.M., Venkataramana, M., Anand, T.,

Anilakumar, K.R., (2013). DNA damage protecting and free radical

scavenging properties of Terminalia arjuna bark in PC-12 cells and

plasmid DNA. Free Rad. Antioxid. 3 pages 35-39

39. Kuo YH, Kuo LM 1997. Antitumour and anti-AIDS triterpenes from

Celastrus hindsii. Phytochemistry, 44, pages1275–1281.

40. L.I. Li, P.Yong, Y. Xia, X.U. Li, E. Ta-Na, L.Yong, S. Ren-Ning and X.

Pei-Gen, Chin. (2010). Herbal Med., 2, page 106.

41. Likhitayawuid K., Angerhofer C.K. (1993). Cytotoxic and antimalarial

bisbenzylisoquinoline alkaloids from Sephania evecta, Jounal of Natural

Products 56 (1) pages 30-38.

42. Lily, M. Peưy (1978). Medicinal plants of East and Southeast Asia,

London, England, Pages 60 – 62

43. Ly, T.N; Shimoyamada, M.; Yamauchi, R (2006). Isolation and

characterization of romarinic acid oligomers in Celastrus hinsii Benth

and their antioxidative activity. J. Agric. Food Chem. 54, pages 3786-

3793.

44. M. H. Lecomte (1912-1936). (1944). Flore Générale de L’indo-Chine,

Tome préliminaire, Tome quatrième, Publiée sous la direction de H.

Humbert,pp.54-59, 197-198, pages 205-213.

45. M.I. Sheikh (1993). Trees of Pakistan. Pictorial Printers (Pvt.) Ltd.,

Islamabad, page 62.

46. Miller J.S. (1989). A revision of the new world species of Ehretia

(Boraginaceae). Ann. Missouri Bot. Gard. pages 76: 1050-1076.

47. Moridi F. M., Nazarianpoor E., Rustaie A., Akhbari M. (2017).

Phytochemical constituents and biological activities of Cleome iberica

DC. Nat Prod Res., 31(11): pages 1329-1332.

48. Momtaz M. H., Hamada R. G. (2010). Antioxidative Effects of Acetone

Fraction and Vanillic Acid from Chenopodium murale L. on Tomato

Plant.Weed Biol. Manag, 10: 64-72.

49. Jamescullend.sc., (2006). Practical Plant Identification, Cambridge

University, page 214.

50. J. D. Hooker, C.B (1975), The Flora of British of India, pages 607, 617

-618.

51. Rossi, F., Jullian, V., Pawlowiez, R., KumarRoiné, S., Haddad, M.,

Darius, H. T., Gaertner-Mazouni, N., Chinain, M., & Laurent, D.,

(2012). Protective effect of Heliotropium foertherianum (Boraginaceae)

folk remedy and its active compound Rosmarinic acid, against a Pacific

ciguatoxin, J Ethnopharmacol, 143(1) pages 33-40.

52. Saman Zara, Dildar Ahmed, Hira Baig and Muhammad Ikram (2012).

Evaluation of antioxidant activities of various solvent extracts of Ehretia

serrate, Asian Journal of Chemistry; Vol. 24, No. 10, 4345-4351

53. Shela G., Olga, M. B., Elena, K., Antonin, L., Milan, C., Nuria, G. M.,

Ratiporn, H., Yong- Seo, P., Soon-Teck, J., and Simon, T. (2003).

Bioactive compounds and antioxidant potential in fresh and dried Jaffa

sweeties, a new kind of citrus fruit J. Nutri. Biolchem., 14, pages 154-

159

54. Smith, R. C., Reeves, J. C., Dage, R. C., and Schnettler, R. A., (1987).

Biochem. Pharmacol., 36, page 1457.

55. Sy L. K., Brown G. D., 1999. Coniferaldehyde derivatives from tissue

culture of Artemisia annua and Tanacetum parthenium, Phytochemistry,

50: 781-785.

(2017). Evaluating the systemmatic position of Ehretia asperula Zoll. &

56. Thuy Linh Nguyen, Thi Hang Pham, Van Truong Do, Thi Thu Hue Huynh

Journal of Science, Technology and Engineering, Vol.59 Number 4, pages 63

-65.

Moritzi based on ITS1 matK and trpI trpEDNA sequences, Vietnam

57. T. Koyama, (1953). J. Pharm. Soc. (Japan), 73, page 411

58. Vanden Bergher D. A., and Vlietinck. (1991). Screening methods for

Antibacterial and Ativiral Agent from Higher Plants, Methods in Plant

biochemistry. Academic Press., USA, V. 6, Pages 47-68.

59. Vlietinck, A.,J., (1998). Screening methods for detection and evaluation

of biological activities of plant preparation, Bioassay Methods in Natural

Product reseach and Drug development, Kluwer acadamic publishers,

USA.

60. Rasika C. Torane, Gayatri S. Kamble, Eliza Khatiwora, Nevedita A.

Ghayal and Nirmala R. Deshpande, (2011). Antioxidant capacity of

leaves and stem of Ehretia laevis. International Journal of Pharmacy

and Pharmaceutical Sciences ISSN- 0975-1491 Vol 3, Issue 2.

61. W.T. Wang (1979). Flora Reipublicae Popularis Sinicae, Science Press,

Beijing.

62. Wu Zheng-yi, Peter. H. Raven (2003). Flora of China, Missori

(R) Bontanical Garden, vol 16, pages 329, 333 - 336.

63. Z.D. He, Y.Q. Liu and C.R. Yang, Acta Bot. (1992). Yunnanica, 14, 328

64. Zheng Q., Sun Z., Zhang X., Yuan J., Wu H., Yang J., Xu X. (2012).

Clerodendranoic acid, a new phenolic acid from Clerodendranthus

spicatus. Molecules 17(11) pages 13656-13661.

TÀI LIỆU INTENET

65. http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Ehretia%20asperula&

list=species

PHỤ LỤC 1

KHÓA PHÂN LOẠI TỚI HỌ CỦA M.H LEMOTE

1. Cây không có hoa thật (không có nhị, không có nhụy), sinh sản bằng bào

tử. Không có lá mầm....................................... .......................Nhóm 1: Ẩn hoa.

1’. Cây có hoa thật (nhị và nhụy trên cùng một gốc hoặc trên những gốc khác

nhau). Một hay nhiều lá mầm............................................................Hiển hoa.

2. Noãn trên không đựng trong bầu 2 hoặc nhiều lá mầm.

..............................................................................................Nhóm 2: Hạt trần.

2’. Noãn đựng trong 1 bầu.................................................................... Hạt kín.

3. Hạt có 2 lá mầm. Hoa ít khi mẫu 3. Lá có gân phân nhánh, xếp thành

mạng.........................................................................................Cây có 2 lá mầm.

4. Có đài hoặc tràng hoặc cả hai.

5. Tràng có cánh hoa rời nhau hoặc liền nhau không hoàn toàn. Nhị rất

ít khi dính trên tràng...........................................................Nhóm 3: Bao hoa cổ.

5’. Tràng có cánh hoa dính liền nhau trên phần lớn bề dài. Nhị hầu như

bao giờ cũng dính trên tràng................................................Nhóm 5: Cánh hợp.

Nhóm 5: Cánh hợp

Tràng hoa có hoa dính liền trên phần lớn chiều dài, hoặc trên một quãng

ngắn ở gốc. Nhị rất nnhiều khi đính trên tràng:

1. Bầu thượng, nghĩa là ở trên đài, không dính liền với ống đài.....................

...................................................................................Nhóm phụ 1: Bầu thượng.

1 Bầu hạ, nghĩa là đính liền với ống đài.................Nhóm phụ 2: Bầu Hạ.

Xác đinh chi theo khoá phân loai chi theo H. Lecomte [21]

1. 2-4 núm nhụy riêng biệt.

2. 2 núm nhụy. Vòi hình sợi chỉ. Cây thân Quả thịt.............Chi Ehretia

Xác định chỉ thị theo khóa phân loại thực vật. Xác đỉnh chi theo khoá

phân loai thực vật chí Trung Quốc [48]

la. Bầu không chia, vòi nhụy đính ờ đỉnh bầu, tận cùng vòi nhụy có chia.

2a. Vòi nhụy chia 2, có 4 núm nhụy, quả hạch 1 ngăn, lá mầm uốn

nếp........................................................................................................Chi cordia

2b. Vòi nhụy chia 2 hoặc nguyên, có 1-2 núm nhụy; quả hạch hoặc thịt,

thường chia làm 2-4 ngăn, hiếm khi không chia; lá mầm không uốn nếp.

3a. Vòi nhụy chia 2, 1 phần bị tiêu biến không có khả năng sinh sản,

phần còn lại có 1 núm nhụy, thường có dạng hình tròn.

3b. Vòi nhụy thường chia 2, hiếm khi nguyên, có 2 núm nhụy hình đầu

hoặc thon dài, phần dưới không phình, không có phần chia nào bị lép.

4a. Quả chín có vỏ quả giữa có nhiều thịt hoặc hoá gỗ.......................Chi

Tourne/ortia

4b. Khi chín quả khô, vỏ quả giữa mỏng, vỏ quả trong cứng..............

....................................................................................... Chi Helỉotropỉum

5a. Quả hạch, không có vỏ quả giữa, khi chín chia làm 4 ngăn, mỗi

ngăn có 1 hạt. Cây thảo hàng năm....................................Chi Coldenia

5b. Quả thịt hoặc quả hạch, vỏ quả giữa có nhiều thịt, không chia

hoặc khi chín chia làm 2-4 ngăn. Cây gỗ hoặc cây bụi.

6a. Vòi nhụy không chia, núm nhụy thường có 2 ngăn, vỏ quả

trong chia 4 ngăn, mỗi ngăn có 1 hạt............................... Chi Dotula

6b. Vòi nhụy chia 2, có 2 núm nhụy

7a. Vòi nhụy chia làm 2 nhánh ở nửa trên, vỏ quả trong không

chia, có dạng hình trứng. Phiến lá có đốm trắng.Chi carmona

7b. Vòi nhụy chia 2 ở phần trên; vỏ quả trong chia làm 2 ngăn,

mỗi ngăn có 2 hạt; hiếm khi chia làm 4 ngăn, mỗi ngăn có 1 hạt;

phiến lá không có đốm trắng....................................................................Chi

Ehretia

KHÓA PHÂN LOẠI TỚI LOÀI [48]

EHRETIA P. Browne, Civ. Nat. Hist. Jamaica 168. 1756.

厚壳树属 hou ke shu shu

1a. Leaves serrate; endocarp divided at maturity into 2 2-seeded pyrenes.

2a. Leaves glabrous, teeth antrorse, apiculate; corolla lobes longer than tube;

drupes 3–4 mm in diam. ........................................................... 1. E. acuminata

2b. Eaves pubescent abaxially, teeth spreading, not apiculate; corolla lobes

shorter than tube; drupes 6–15 mm in diam.

3a. Leaf base cuneate to rotund, blade pubescent adaxially; drupes 10–15 mm

in diam. .........................................................................................3. E. dicksonii

3b. Leaf base cordate, blade densely tomentose adaxially; drupes 3–4 mm in

diam. .................................. …………………………………….2. E. corylifolia

1b. Leaves entire; endocarp divided at maturity into 4 1-seeded pyrenes.

4a. Corolla lobes longer than tube.

5a. Inflorescences and calyx densely yellow-brown pubescent, ebracteate

......................................................................................................... 14. E. laevis

5b. Inflorescences glabrous or nearly so, with linear or linear-lanceolate bracts.

6a. Petiole tuberculate; leaf blade broadly elliptic to oblong-elliptic, apex

obtuse or mucronate; flowers pedicellate ………………….. 12. E. asperula

6b. Petiole smooth; leaf blade lanceolate to oblong-lanceolate, apex acute;

flowers sessile ............ …………………………………..13. E. hainanensis

4b. Corolla lobes shorter than tube.

7a. Corolla tube cylindric; calyx lobes linear, 5–6 mm.

8a. Calyx 4–6 mm; stamens inserted at apex of corolla tube

....................................................................................................... 4. E. resinosa

8b. Calyx ca. 3 mm; stamens inserted at middle of corolla tube

.....................................................................................................5. E. densiflora

7b. Corolla tube distinctly wider distally; calyx lobes ovate to oblong, 1.5–3.5

mm.

9a. Cymes terminal; corolla funnelform, 5.5–6.5 mm; filaments ca. 1.5 mm

........................................................................................................ 6. E. confinis

9b. Cymes terminal and lateral; corolla tube campanulate, 7–11 mm; filaments

ca. 3–6 mm.

10a. Leaf blade with evident reticulate venation.

11a. Inflorescences and calyx obscurely pubescent with glandular hairs

.......................................................................................................... 7. E. tsangii

11b. Inflorescences and calyx with rust-colored glandular hairs.. 8. E. dunnian

10b. Leaf blade with only midvein and lateral veins conspicuous.

12a. Petiole, calyx, and corolla densely rust-colored pubescent …9. E.

pingbianensis

12b. Petiole and corolla glabrous, calyx ciliate.

13a. Corolla 10–11 mm, lobes ovate; filaments 8–10 mm, inserted 3.5–5 mm

above base ................................................................................ 10. E. longiflora

13b. Corolla 6.5–8 mm, lobes oblong-lanceolate; filaments 2.5–3 mm, inserted

just below throat ........................................................ ….11. E. changjiangensis

PHIẾU ĐIỀU TRA THỰC TRẠNG CÂY XẠ ĐEN TẠI TỈNH HÒA BÌNH

I. Một số thông tin chung

Tỉnh/thành phố trực thuộc TW ………………………………………………………..

Huyện/quận/thị xã/thành phố thuộc tỉnh…………………………………………........

Xã/phường/thị trấn …………………………………………………………….............

Thôn/ấp/bản Tên địa bàn điều tra………………………………………………………

Địa bàn số………………………………………………………………………

Họ và tên chủ hộ………………………………………………Dân tộc ………………..

II. Thông tin về cây xạ đen tại tỉnh Hòa Bình

1 Hộ gia đình có trồng cây xạ đen không (nếu có tích x)

Thời gian trồng cây xạ đen từ bao giờ

2 3 Diện tích trồng cây xạ đen năm 2016

Sản lượng, năng suất của sản phẩm năm 2016

4

Sản phẩm sau chế biến dạng

O Lá khô

O Thân khô

O Cao chiết

5 Giá thành sản phẩm (đồng/kg/)

O Lá khô

O Thân khô

O Cao chiết

6 Kênh tiêu thụ sản phẩm chính của hộ

O Bán trực tiếp

O Bán cho các công ty sản xuất dược liệu

O Bán cho thương lái

O Bán theo kênh khác

7 Khả năng tiêu thụ sản phẩm của hộ

O Dư thừa

O Bán hết, bị ép giá

O Bán hết, được giá

O Không bán hết được sản phẩm, bị ép giá

8 Đầu ra sản phẩm

O Giá cả không ổn định

O Lượng tiêu thụ không ổn định

O Thiếu doanh nghiệp, cơ sở thu mua thường xuyên

O Thiếu thị trường

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá trữ lượng và hoạt tính sinh học của cây xạ đen (Ehretia asperula Xoll. & Moritzi) tại tỉnh Hòa Bình

Mục tiêu của luận văn là giám định lại tên loài của cây xạ đen đồng thời đánh giá tình hình thực trạng cây xạ đen ở tỉnh Hòa Bình. Sau đó, tiến hành nghiên cứu tạo cao chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của loài xạ đen.

ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll. & Moritzi)

TẠI TỈNH HÒA BÌNH

ĐÁNH GIÁ TRỮ LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA CÂY XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll. & Moritzi)

TẠI TỈNH HÒA BÌNH

LỜI CẢM ƠN

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Tên xã

Số

Số

Tỷ lệ

Số cá

%

Độ

Loài cây khu vực gặp xạ

điểm

điểm

cao

thể

đen

%

số

điều

gặp

gặp

(m)

bắt

cá

tra

Xạ đen

gặp

Xạ

thể

đen

Dịch chiết

ET1

ET5

ET2

ET3

ET4

(5mg)

3.4. Hoạt tính sinh học của cây xạ đen

PHIẾU ĐIỀU TRA THỰC TRẠNG CÂY XẠ ĐEN TẠI TỈNH HÒA BÌNH

I. Một số thông tin chung

II.

Thông tin về cây xạ đen tại tỉnh Hòa Bình

1 Hộ gia đình có trồng cây xạ đen không (nếu có tích x)

2

3 Diện tích trồng cây xạ đen năm 2016

4

5 Giá thành sản phẩm (đồng/kg/)

6 Kênh tiêu thụ sản phẩm chính của hộ

7 Khả năng tiêu thụ sản phẩm của hộ

8 Đầu ra sản phẩm

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sử dụng thông tin di truyền trên vùng gen ITS DNA trong định loại các mẫu sâm (Panax L.) thu thập ở tỉnh Hà Giang

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh