Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến một số Exon của gen DJ 1 trên người bệnh Parkinson

BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Hồ Trường Giang

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN MỘT SỐ EXON CỦA GEN DJ-1

TRÊN NGƯỜI BỆNH PARKINSON

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Hồ Trường Giang

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN MỘT SỐ EXON CỦA GEN DJ-1

TRÊN NGƯỜI BỆNH PARKINSON

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy

Hà Nội, 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

HỒ TRƯỜNG GIANG

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu của tôi được thực hiện tại Phòng Hệ gen học Vi sinh – Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã tạo điều kiện để các công việc chuyên môn của đề tài được tiến hành thuận lợi.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉ dẫn, chia sẻ kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Hệ gen học Vi sinh thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện nghiên cứu, điều này khiến tôi thực sự cảm kích và biết ơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô thuộc Khoa Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy, truyền thụ kiến thức để tôi hoàn thành khóa học và nghiên cứu của mình.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đã luôn bên tôi, là động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành nghiên cứu.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

HỒ TRƯỜNG GIANG

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC ........................................................................................................ 1

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU ............................................ 4

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ 6

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... 7

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 8

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 10

1.1. BỆNH PARKINSON ............................................................................... 11

1.1.1. Khái niệm .............................................................................................. 11

1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ................................................................................... 11

1.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ ..................................................... 18

1.1.4. Một số đặc điểm lâm sàng bệnh Parkinson ........................................... 20

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN BỆNH PARKINSON ......... 21

1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 21

1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................... 24

1.3. CƠ SỞ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH PARKINSON .................................................................................................. 25

1.3.1. Vai trò của một số gen trong bệnh Parkinson ....................................... 25

1.3.2. Cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của gen DJ-1 ....................... 26

1.3.3. Vai trò gen DJ-1 trong bảo vệ chống oxy hóa tế bào thần kinh ........... 29

1.3.4. Tương tác của DJ-1 và ty thể ................................................................ 30

1.3.5. Sự thiếu hụt gen DJ-1 ........................................................................... 32

1.3.6. Đột biến gen DJ-1 trong bệnh Parkinson .............................................. 32

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 33

2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ......................................... 33

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng và mẫu nghiên cứu .............................. 33

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ................................................................................ 33

2.1.3. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................... 34

2.1.4. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 34

2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ..................................................................... 35

2.2.1. Hóa chất................................................................................................. 35

2.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 35

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 35

2.3.1. Thu thập đối tượng nghiên cứu ............................................................. 35

2.3.2. Thu thập và bảo quản mẫu .................................................................... 36

2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ................................................... 37

2.3.4. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng DNA tổng số .............................. 38

2.3.5. Thiết kế mồi .......................................................................................... 39

2.3.6. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR ...................................................... 40

2.3.7. Giải trình tự DNA ................................................................................. 41

2.3.8. Phân tích số liệu .................................................................................... 45

2.3.9. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ......................................................... 45

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 46

3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .................... 46

3.1.1. Phân bố bệnh nhân Parkinson theo độ tuổi và giới tính ....................... 46

3.1.2. Phân bố bệnh nhân theo thời gian mắc bệnh và giai đoạn bệnh ........... 48

3.2. KHUẾCH ĐẠI VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CÁC EXON TRONG GEN DJ-1 ................................................................................................................. 49

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................... 49

3.2.2. Khuếch đại các exon trong gen DJ-1 .................................................... 50

3.2.3. Xác định trình tự các đoạn exon trong gen DJ-1 .................................. 53

3.3. PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN DJ-1 ........................................... 54

3.3.1. Kết quả xác định các đột biến trên exon 5 gen DJ-1. ........................... 57

3.3.2. Kết quả xác định các đột biến exon 7 gen DJ-1 . ................................. 59

3.3.3. Đột biến intron 4 và intron 5 của gen DJ-1 .......................................... 61

3.4. ĐỐI CHIẾU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG ĐIỂN HÌNH TRÊN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU………………………………………………63

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 66

4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 66

4.1.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu .......................................... 66

4.1.2. Phân tích và đánh giá các đột biến gen DJ-1 và đối chiếu lâm sàng trên bệnh nhân Parkinson ....................................................................................... 66

4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 68

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 78

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU

Tiếng Anh Tiếng Việt

Chữ viết tắt

APS Ammonium persulphate

ATP Adenosine triphosphate

Bcl-xL B-cell lymphoma-extra large

U lympho tế bào B cực lớn

BLB blood lysis buffer

Dung dịch đệm phân giải tế bào máu

bp base pair Cặp bazơ nitơ

CMA Chaperone-mediated autophagy

Tự thực bào qua trung gian chaperone

DA Dopamine

DNA Deoxyribonucleic Acid Acid deoxyribonucleic

dNTP deoxyribonucleotide triphosphate

Deoxyribonucleotid triphotphat

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

GSH Glutathione

Kb Kilobase Kilobazơ

LAMP2A Lysosomal associated membrane

protein 2A Lysosome liên kết màng protein 2A

NF-kB Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B

NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi nhờ polymeraza

PD Parkinson disease Bệnh Parkinson

RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic

RNase Ribonuclease Ribonuclease

ROS Reaction oxidative species Các chất có tính oxy hóa

SNc Substantia Nigra pars compacta Phần đặc liềm đen

TAE Tris – acetic acid – EDTA

TE Tris – EDTA

VTA Ventral tegmental area Vùng trần trung não

UCP Uncoupling protein Protein không ghép cặp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các gen chính và loci liên quan đến bệnh Parkinson

Bảng 2.1. Trình tự mồi tương ứng của các exon 2, 3, 4, 5, 6, 7 gen DJ-1

Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng PCR

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng giải trình tự

Bảng 3.1. Phân bố bệnh nhân theo độ tuổi và giới tính

Bảng 3.2. Phân bố bệnh nhân theo thời gian mắc bệnh và giai đoạn bệnh

Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của các exon 2, 3, 4, 5, 6, 7 gen DJ-1

Bảng 3.4. Thông tin bệnh nhân và các đột biến gen DJ-1

Bảng 3.5. Các đột biến được xác định trên 6 exon của gen DJ-1

Bảng 3.6. Một số triệu chứng lâm sàng của nhóm bệnh nhân Parkinson

Bảng 3.7. Đối chiếu một số đặc điểm lâm sàng trên nhóm bệnh nhân có đột biến gen DJ-1

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Parkinson và các triệu chứng điển hình

Hình 1.2. Quá trình oxy hóa dopamine (DA)

Hình 1.3. Chức năng gen DJ-1 trong tế bào

Hình 1.4. Cấu trúc bộ gen của gen DJ-1 và một số đột biến được xác định trong bệnh Parkinson

Hình 1.5. Gen DJ-1 được kích hoạt như một chất chống oxy hóa

Hình 1.6. Cấu trúc của ba loại đường 5 carbon.

Hình 1.7. Sơ đồ biểu diễn của một hệ thống giải trình tự DNA mao quản

Hình 3.1. Kết quả điện di agarose kiểm tra tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu của 32 bệnh nhân Parkinson và 5 mẫu chứng

Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại và tinh sạch của exon 2, kích thước 392 bp trên gel agarose 1%; M: Marker 1 kb PLUS.

Hình 3.3. Sản phẩm PCR sau tinh sạch của 6 exon nghiên cứu.

Hình 3.4. Ví dụ kết quả giải trình tự exon 6 đủ độ tin cậy và được lựa chọn

Hình 3.5. Trình tự acid amin exon 5 của các mẫu bệnh và vị trí acid amin đột biến

Hình 3.6. Trình tự acid amin exon 7 của các mẫu bệnh và vị trí acid amin đột biến

Hình 3.7. Đặc điểm lâm sàng những trường hợp đột biến exon 7 gen DJ-1

MỞ ĐẦU

Bệnh Parkinson là một bệnh gây nên rối loạn nhiều yếu tố của hệ thần kinh vận động. Đặc trưng lâm sàng chính của bệnh bao gồm các triệu chứng: run khi nghỉ, cứng cơ, vận động chậm, suy giảm tư thế,… Ngoài những thay đổi về vận động, bệnh nhân Parkinson còn có những triệu chứng suy giảm chức năng đi kèm của các hệ cơ quan khác như: tiêu hóa, tâm thần và một số giác quan,…. Những triệu chứng này là hậu quả của sự tổn thương (mất chức năng và/hoặc hoại tử) tiến triển của các tế bào hệ dopaminergic vùng liềm đen thuộc trung não dẫn đến gián đoạn dẫn truyền hệ dopaminergic ở vùng lưng thể vân, là nơi kết thúc tiền synap với các tế bào thần kinh này [1].

Ngày nay, sau bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson là chứng rối loạn thoái hóa thần kinh phổ biến thứ hai trên thế giới. Tỷ lệ mắc bệnh này phụ thuộc vào tuổi: bệnh Parkinson ảnh hưởng đến 1-2% dân số trên 60 tuổi, nhưng tỷ lệ này tăng lên 4-5% ở 85 tuổi [2]. Thống kê tại Mỹ, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson trong cộng đồng người da trắng là 120/100.000. Ở nhóm trên 65 tuổi, tỷ lệ đó là 1 - 1,5% [3]. Ở Châu Âu, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson ở nhóm bệnh nhân trên 65 tuổi là 1,6%. Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson so với các bệnh lý thần kinh khác là khoảng 1,6% [4].

Những nghiên cứu gần đây đã xác định được khoảng 11 gen của các dạng di truyền Parkinson. Các dạng di truyền do đột biến chiếm 10-15% của tất cả các trường hợp mắc bệnh Parkinson [5]. Cho đến nay, các nghiên cứu đã chỉ ra hai gen di truyền dạng trội của nhiễm sắc thể thường được cho là gây ra bệnh Parkinson, chủ yếu là di truyền từ mẹ hoặc cha hoặc cả hai: α- Synuclein (SNCA) và Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2); và bốn gen gây di truyền dạng lặn của nhiễm sắc thể thường: Parkin, Phosphatase và Tensin Homologue (PTEN) - giảm Kinase 1 (PINK1), PARK7 (DJ-1), và ATPase type 13A2 (ATP13A2). Trong đó, đột biến các gen Parkin, PINK1, và DJ-1 liên quan đến rối loạn chức năng ty thể và stress oxy hóa [6].

Gen DJ-1 mã hóa protein PARK 7 đóng vai trò là một cảm biến stress oxy hóa – nó loại bỏ các peroxide bằng cách tự oxy hóa (autoxidation) [7]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các tế bào có mức độ DJ-1 cao, có khả năng chống lại stress oxy hóa và chất độc thần kinh như 6-OHDA (6- hydroxydopamin) trong khi mức độ DJ-1 thấp hơn sẽ khiến các tế bào dễ bị stress oxy hóa hơn [8]. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng DJ-1 bảo vệ các tế bào thần kinh hệ dopaminergic chống lại các tổn thương oxy hóa không chỉ trong in vitro mà còn cả trong in vivo [9]. DJ-1 bị oxy hóa đã được chứng minh là giảm đáng kể trong bệnh Parkinson khởi phát sớm, nguyên phát.

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen DJ-1. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đột biến các exon của gen DJ-1 trên bệnh nhân Parkinson ở Việt Nam. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đột biến một số exon của gen DJ-1 trên người bệnh

Parkinson” với mục tiêu:

1. Phân tích và đánh giá các điểm đột biến một số exon của gen DJ-1

trên người bệnh Parkinson.

2. Đánh giá mối liên quan của những đột biến được xác định với một số

biểu hiện lâm sàng điển hình trên người bệnh Parkinson.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. BỆNH PARKINSON

1.1.1. Khái niệm

Bệnh Parkinson được đặt theo tên của một bác sĩ người Anh là James Parkinson, ông đã mô tả các triệu chứng lâm sàng của một bệnh lý thần kinh mà ông quan sát được và liệt kê trong bài luận có tên: "An Essay on the Shaking Palsy" (1817). Parkinson là một bệnh rối loạn thoái hoá của hệ thần kinh trung ương gây ảnh hưởng đến tình trạng vận động, thăng bằng và kiểm soát cơ của bệnh nhân. Bệnh Parkinson thuộc nhóm các bệnh rối loạn vận động. Bệnh có đặc điểm cứng cơ, run, tư thế và dáng đi bất thường, chuyển động chậm chạp và trong trường hợp bệnh nặng người bệnh có thể mất hoàn toàn một số chức năng vận động. Các triệu chứng chính của bệnh xuất hiện tương ứng với sự giảm khả năng dẫn truyền từ vùng vỏ não do hạch nền (basal galia) điều khiển. Thông thường điều này liên quan đến sự giảm sản xuất dopamine trong tế bào thần kinh dopaminergic của trung não (cụ thể là liềm đen - substantia nigra). Parkinson là bệnh mãn tính nguyên phát. Trong trường hợp thứ phát - hội chứng Parkinson (Parkinsonism), nguyên nhân gây bệnh có thể là do độc tính của một số loại thuốc, chấn thương sọ não, hay các bệnh lý tổn thương thần kinh khác.

Hình 1.1. Parkinson và các triệu chứng điển hình

(Nguồn: https://theconversation.com và https://medindia.net)

Một số thuật ngữ về Parkinson:

- Hội chứng Parkinson (Parkinsonism, Parkinson’s syndrom): là hội

chứng gồm các triệu chứng thứ phát tương tự bệnh Parkinson.

- Bệnh Parkinson (Parkinson’s disease): là bệnh do thoái hoá nguyên phát một số cấu trúc của não (nhân đỏ, liềm đen, hạch nền,…). Gồm có: bệnh Parkinson khởi phát sớm (Early Onset Parkinson’s disease) và bệnh Parkinson tản phát (Sporadic Parkinson’s disease).

1.1.2. Cơ chế sinh bệnh

Stress oxy hóa

Ở bệnh nhân Parkinson quá trình oxy hóa protid và lipid tăng cao. Quá trình dị hóa này tạo ra nhiều gốc tự do có hại cho tế bào nói chung và tế bào thần kinh nói riêng [10]. Các chất oxy hoá (ROS) là nguy cơ chính gây nhiễm độc thần kinh bao gồm các rối loạn chuyển hóa, rối loạn thoái hoá. Các thành phần dưới tế bào như ty thể, màng tế bào và các cấu trúc dưới tế bào khác của tế bào thần kinh là mục tiêu tấn công của các chất độc thần kinh trong đó có các gốc tự do [11].

Stress oxy hóa nhận được sự quan tâm nhất trong cơ chế bệnh sinh bệnh Parkinson vì có liên quan đến chuyển hóa oxy hóa của dopamine [12], liên quan đến hydro peroxide (H2O2) và các chất có tính oxy hóa khác (Hình 1.2).

Hình 1.2. Quá trình oxy hóa dopamine (DA)

Stress oxy hóa và hậu quả là dẫn đến chết tế bào tiến triển trong phần đặc của liềm đen dưới những hoàn cảnh như: (a, b) Tăng chuyển hóa dopamine dẫn đến hình thành peroxide dư thừa; (c) Sự thiếu hụt glutathione (GSH), từ đó làm mất khả năng chuyển hóa và loại bỏ H2O2 của não; hoặc (d) tăng phản ứng của sắt, có thể thúc đẩy hình thành OH*. Các nghiên cứu vùng phần đặc của liềm đen trên những bệnh nhân Parkinson sau chết não thấy có biểu hiểu tăng sắt, giảm glutathione (GSH); có sự phá hủy của ROS đến lipid, protein, DNA, cho thấy phần đặc của liềm đen ở tình trạng stress oxy hóa.

Cả chuyển hóa enzym và hóa học của dopamine đều dẫn đến hình thành H2O2. H2O2 trong điều kiện bình thường được phân hủy bằng phản ứng kết hợp với glutathione (GSH) (Hình 1.2). Sự gia tăng nồng độ H2O2 có thể dẫn đến một phản ứng với sắt tạo ra gốc hydroxyl (OH*) có hoạt tính phản ứng cao và có khả năng gây độc tế bào theo phản ứng Fenton (d).

Vai trò của sắt đối với stress oxy hóa

Rất nhiều các nghiên cứu, sử dụng nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau, đã chứng minh rằng lượng sắt tăng lên ở vùng liềm đen của những bệnh nhân Parkinson. Nghiên cứu sử dụng Laser microprobe (LAMMA) chỉ ra rằng sắt tích tụ chủ yếu trong hạt neuromelanin của tế bào thần kinh dopaminergic [13]. Sự tích tụ sắt ở những khu vực bị ảnh hưởng có thể thấy ở những tình trạng thoái hóa thần kinh khác. Ngoài ra, sự tăng tích tụ sắt ở vùng phần đặc liềm đen cũng được quan sát thấy khi gây tổn thương bằng 1,2,3,6-methyl- phenyl-tetrahydropyridine (MPTP) hoặc 6-hydorxydopamine (6-OHDA). Từ phát hiện này chỉ ra rằng sự tích tụ sắt là thứ phát ở những tế bào bị thoái hóa do nhiều nguyên nhân khác nhau. Tuy nhiên, điều này không phủ nhận tầm quan trọng của nó trong bệnh Parkinson, như sắt có thể gây chết tế bào ngay cả khi nó được tích lũy thứ phát do nguyên nhân khác.

Vai trò của glutathione đối với stress oxy hóa

Sự khiếm khuyết trong một hoặc nhiều hệ thống phòng thủ chống oxy hóa tự nhiên có thể dẫn đến thoái hóa thần kinh trong bệnh Parkinson [14]. Đáng chú ý nhất đó là sự phát hiện ra việc giảm có chọn lọc của glutathione ở

vùng phần đặc liềm đen trên bệnh nhân Parkinson. Sự giảm nồng độ của glutathione không được phát hiện ở những khu vực khác của não bộ những bệnh nhân Parkinson cũng như không được báo cáo ở bất cứ rối loạn thoái hóa khác. Giảm glutathione có thể dẫn đến làm suy yếu khả năng loại bỏ H2O2 và thúc đẩy hình thành OH*, đặc biệt là khi gia tăng sự có mặt của sắt. Không có sự rối loạn trong các enzyme chủ yếu liên quan đến tổng hợp glutathione. Tuy nhiên, có sự tăng đáng kể nồng độ của γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTT), enzyme có vai trò trong chuyển các tiền chất của glutathione và chuyển hóa dạng oxy hóa của glutathione (GSSG). Sự tăng γ- GTT có thể chống lại một nỗ lực của những tế bào còn sống sót cố gắng dung nạp tiền chất của glutathione vào tế bào để bổ sung lượng giảm sụt của GSH hoặc cơ chế bù trừ để loại bỏ GSSG - là một dạng độc tố tiềm tàng dẫn đến hậu quả của stress oxy hóa. So sánh kết quả giải phẫu bệnh não của bệnh nhân Parkinson qua khám nghiệm tử thi cũng phát hiện có thể Lewy ngẫu nhiên (Incidental Lewy bodies - ILB) ở liềm đen là hệ quả do sự thiếu hụt về glutathione [15].

Tổn thương do stress oxy hóa

Bằng chứng về tổn thương do oxy hóa ở não bộ những bệnh nhân Parkinson là có sự tăng nồng độ các sản phẩm của lidpid peroxidation malondialdehyde (MDA) và lipid hydroperoxide ở vùng phần đặc liềm đen nhưng không thấy ở vỏ não ở những bệnh nhân Parkinson [16]. Nhuộm 4- hydroxynonenal cho thấy lipid peroxy, một sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa, có khả năng làm biến đổi protein và thúc đẩy độc tế bào tăng lên ở những tế bào thần kinh dopaminergic còn sống sót. Ngoài ra còn có sự tăng nồng độ của protein carbonyl và 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, phản ánh quá trình oxy hóa với protein và DNA tương ứng đã được tìm thấy ở vùng phần đặc liềm đen cũng như ở nhiều vùng khác trong não bộ bệnh nhân Parkinson [16]. Nhìn chung, những kết quả này cho thấy sự tổn thương do oxy hóa là khá phổ biến ở bệnh nhân Parkinson. Tuy nhiên phần lớn các bệnh nhân Parkinson được điều trị bằng levodopa, và cũng không chắc chắn liệu thuốc này có góp phần vào trong chuyển hóa oxy hóa gây tổn thương oxy hóa hay không.

Nhưng levodopa đã được chứng minh là gây ra sự thoái hóa tế bào thần kinh dopaminergic trong môi trường nuôi cấy. Mặc dù vậy, tình huống có thể khác ở những bệnh nhân Parkinson khi mà cơ chế phòng vệ bị suy giảm.

Rối loạn chức năng ty thể

Có sự giảm chọn lọc 30 - 40% hoạt động của Phức hợp I của ty thể trong chuỗi hô hấp vùng phần đặc liềm đen ở những bệnh nhân Parkinson. Sự giảm vận động Phức hợp I của ty thể cũng được tìm thấy trong tiểu cầu và cơ của những bệnh nhân Parkinson. Một khiếm khuyết trong Phức hợp I của ty thể có thể góp phần làm thoái hóa tế bào trong bệnh Parkinson thông qua làm giảm tổng hợp ATP và gây rối loạn năng lượng sinh học. Ở đầu tận synap của não chuột, ức chế Phức hợp I của ty thể bởi MPTP hoặc MPP+ có thể dẫn đến sự suy giảm ATP của tế bào. Tuy nhiên, các nghiên cứu ở động vật thực nghiệm cho thấy sự sụt giảm hoạt động của Phức hợp I của ty thể ở mức 40% hoặc ít hơn không gây ảnh hưởng đến ATP của tế bào [17].

Sự khiếm khuyết ở Phức hợp I của ty thể cũng có thể dẫn đến tổn thương tế bào thông qua các gốc tự do được sinh ra trực tiếp tại vị trí này hoặc theo con đường tăng bù đắp hô hấp tại Phức hợp II ty thể. Sự khiếm khuyết của Phức hợp I của ty thể có thể góp phần vào sự phát triển của quá trình chết theo chương trình (apoptosis). Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy việc giảm điện thế màng ty thể gây hậu quả là làm rối loạn chức năng bơm proton dẫn đến mở các lỗ nhỏ và làm tăng tính thấm của ty thể gây thoát các protein ty thể nhỏ, đó là dấu hiệu cho sự khởi đầu của quá trình chết theo chương trình. Phức hợp I của ty thể là vị trí chính của bơm proton, vì thế có thể một khiếm khuyết của Phức hợp I của ty thể ở bệnh nhân Parkinson có thể góp phần làm tổn thương thần kinh và dẫn đến chết theo chương trình.

Nhiễm độc kích thích

Nhiễm độc kích thích là nguyên nhân gây thoái hóa thần kinh liên quan đến bệnh Parkinson và có thể diễn ra theo hai cơ chế. Cơ chế đầu tiên liên quan đến sự nhiễm độc kích thích “mạnh” do sự tăng tổng hợp glutamate. Tế bào thần kinh dopaminergic vùng phần đặc liềm đen rất giàu các thụ thể

glutamate, nhận dẫn truyền glutamate từ vỏ não và các nhân dưới đồi và đã cho thấy sự đáp ứng mạnh mẽ với glutamate ngoại sinh. Tổn thương các tế bào hệ dopaminergic bất hoạt ức chế các tế bào thần kinh vùng dưới đồi và làm tăng tỷ lệ kích hoạt các kích thích đầu ra của các tế bào thần kinh này. Các sợi trục của các tế bào thần kinh vùng dưới đồi dẫn truyền tới vùng phần đặc liềm đen, tổn thương các tế bào hệ dopaminergic có thể thúc đẩy làm tăng nhiễm độc kích thích. Thực tế, tổn thương các tế bào thần kinh vùng dưới đồi giúp bảo vệ tế bào thần kinh vùng phần đặc liềm đen khỏi độc tố của 6- OHDA. Giả thuyết thứ hai liên quan đến cơ chế nhiễm độc kích thích “yếu”. Giả thuyết này cho rằng việc giảm quá trình chuyển hóa năng lượng do một khiếm khuyết chức năng của ty thể do mất các thụ thể phụ thuộc ATP Mg- blockade của N-methyl-D-aspartate (NMDA) và các thụ thể này cho phép các glutamate ở nồng độ sinh lý cho phép Ca++ vào trong tế bào [17].

Tổn thương do nhiễm độc kích thích được cho là bởi nitric oxide (NO). NO được hình thành bởi sự chuyển hóa của arginine thành citrulline trong phản ứng được xúc tác bởi nitric oxide synthase (NOS). Phản ứng thông qua glutamate làm tăng cytosolic calcium kết quả là kích hoạt NOS với sự tăng sản xuất NO. NO phản ứng với các gốc superoxide để hình thành gốc peroxynitrite và hydroxyl, cả hai là các tác nhân oxy hóa rất mạnh [16]. NO cũng có thể góp phần gây thoái hóa tế bào bằng cách tách sắt từ ferritin, và nó có thể tham gia vào phản ứng Fenton, sau đó là ức chế Phức hợp IV ty thể, do đó có khả năng chuyển đổi Phức hợp I của ty thể thuận nghịch rối loạn sang một rối loạn chuỗi hô hấp không thể đảo ngược. David Marsden FRS và cộng sự (1994) [15] đã chứng minh rằng chuỗi hô hấp ty thể bị hư hại do tiếp xúc lâu dài với NO và glutathione là một yếu tố bảo vệ quan trọng. Điều này có ý nghĩa đối với những bệnh nhân Parkinson khi mà có lượng glutathione giảm. Chất ức chế NOS là 7-nitroindazole (7-NI), ngăn chặn hình thành NO, có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh dopaminergic từ độc tố của MTTP ở cả chuột cống và khỉ đầu chó [17].

Các yếu tố dinh dưỡng thần kinh

Các nghiên cứu kinh điển trên in vitro của Levi-Montalcini & Hamburger (1953) [17] đã chứng minh rằng các tế bào thần kinh giao cảm được nuôi cấy không thể tồn tại nếu lấy đi yếu tố tăng trưởng thần kinh (nerve growth factor - NGF). Tương tự như vậy, thí nghiệm cắt đứt sợi trục tế bào thần kinh (axotomy) có thể gây thoái hóa tế bào thần kinh dopaminergic của con đường dẫn truyền thần kinh liềm đen – thể vân nếu không cung cấp cho những tế bào này những yếu tố cần thiết cho sự sống tại mô đích. Cả tế bào thần kinh và các tế bào thần kinh đệm hình sao đều có thể tổng hợp mRNA và protein từ nhiều loại phân tử dinh dưỡng thần kinh, bao gồm cả yếu tố dinh dưỡng thần kinh võng mạc (ciliary neurotrophic factor - CNTF), yếu tố dinh dưỡng thần kinh nguồn gốc từ não (brain-derived neurotrophc factor - BDNF), và yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc thần kinh đệm (glial derived neurotrophic factor - GDNF), có khả năng hỗ trợ cho sự sống của các tế bào thần kinh lân cận. Ở hệ thống thần kinh trung ương của cơ thể trưởng thành khỏe mạnh, các yếu tố dinh dưỡng này được duy trì liên tục ở nồng độ thấp, nhưng chúng có thể được tăng tổng hợp sau chấn thương. Thương tổn thần kinh dưới liều gây chết ở chuột cống trưởng thành kích hoạt tế bào thần kinh đệm hình sao với sự tăng tổng hợp các yếu tố dinh dưỡng thần kinh như CNTF, NGF, và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (fibroblas growth factor - FGF). Sự tăng hoạt tính của tế bào thần kinh đệm đã được chỉ ra ở những khu vực bị mất tế bào thần kinh dopaminergic trên bệnh nhân Parkinson. Cũng có những bằng chứng rõ ràng cho thấy một số phân tử dinh dưỡng có khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh dopaminergic dưới tác hại của các độc tố. BDNF tăng khả năng sống sót của tế bào thần kinh dopaminergic nuôi cấy và bảo vệ chúng khi tiếp xúc với MPTP. Cả GDNF và CNTF đều có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vùng phần đặc liềm đen ở chuột cống trong thí nghiệm cắt ngang sợi trục của con đường dẫn truyền liềm đen – thể vân. GDNF đã được chứng minh là làm tăng khả năng sống sót và phát triển của các tế bào thần kinh dopaminergic ở loài gặm nhấm và động vật linh trưởng có tổn thương các tế bào thần kinh dopaminergic và đảo ngược được những triệu chứng của bệnh Parkinson ở linh trưởng gây ra bởi MPTP. Nghiên cứu bằng kỹ thuật

situ hybridization cho thấy không xác định được lượng mRNA của GDNF ở não của bệnh nhân Parkinson cũng như nhóm chứng cùng tuổi [17]. Do đó, dường như sự sụt giảm biểu hiện của GDNF không phải là yếu tố khởi đầu cho sự mất tế bào dopaminergic. Tuy nhiên sự suy giảm khả năng tổng hợp các yếu tố dinh dưỡng trong các tổn thương có thể làm mất cơ chế bảo vệ quan trọng và góp phần làm cho thoái hóa tế bào. Nói cách khác, các yếu tố dinh dưỡng có thể giải cứu hoặc bảo vệ tế bào thần kinh dopaminergic. Việc đưa các yếu tố thông qua hệ thống tuần hoàn bị hạn chế do sự cản trở của hàng rào máu não của thần kinh trung ương, và liệu pháp hiệu quả trên mô hình động vật đòi hỏi phải đưa thuốc trực tiếp vào vỏ não hoặc vào nội sọ.

Điều biến miễn dịch tế bào thần kinh đệm

Các tế bào thần kinh đệm và cytokine được biết đến khi tham gia vào điều biến phản ứng của tế bào của thần kinh trung ương sau các tổn thương. Một lượng lớn các tế bào thần kinh đệm phản ứng tích cực (HLA-DR) được phát hiện trong khu vực vùng phần đặc liềm đen trên bệnh nhân Parkinson, đặc biệt tại các khu vực có sự thoái hóa thần kinh cực đại, cụ thể là phần bụng và phần ngang của vùng phần đặc liềm đen. Lượng interleukin-1β (IL-1β), interferon-γ (INF-γ), và yếu tố hoại tử u-α (TNF-α) ở khu vực vùng phần đặc liềm đen của bệnh nhân Parkinson tăng từ 76%–157% khi so với nhóm chứng [18].

Tế bào thần kinh đệm được chứng minh là có vai trò bảo vệ tế bào thần kinh nuôi cấy khỏi sự phá hủy oxy hóa dưới tác dụng của H2O2 [11]. Hơn nữa, glutathione được tổng hợp chủ yếu ở các tế bào thần kinh đệm và được chuyển đến các tế bào thần kinh để đáp ứng với sự kích thích thần kinh. Sự sụt giảm glutathione được thấy trong vùng phần đặc liềm đen trên những bệnh nhân Parkinson vì thế nó có thể là thứ phát sau một khiếm khuyết của các tế bào thần kinh đệm, cùng với sự mất nhiều hơn của tế bào thần kinh so với việc giảm glutathione đơn thuần. Mặt khác, sự suy giảm của glutathione gây ra thoái hóa tế bào thần kinh nuôi cấy chỉ xuất hiện trong sự có mặt của tế bào thần kinh đệm, điều đó cho thấy các cytokine hoặc NO tạo ra từ các tế bào thần kinh đệm góp phần gây thoái hóa thần kinh trên mô hình thực nghiệm.

1.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ

Nguyên nhân cụ thể của bệnh Parkinson hiện nay vẫn chưa được liệt kê một cách đầy đủ vì ngày càng có nhiều yếu tố được xác định là nguyên nhân gây nên bệnh Parkinson. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy một số tác nhân có thể làm tăng nguy cơ tiến triển của bệnh Parkinson. Những tác nhân này bao gồm việc tiếp xúc với nước giếng khoan, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, hóa chất công nghiệp, bột giấy gỗ, nông nghiệp, hay sống trong môi trường nông thôn.

Một số các độc tố ngoại sinh đã được xác định liên quan đến sự phát triển của hội chứng Parkinson, bao gồm các kim loại nặng, cyanide, sơn mài, dung môi hữu cơ, carbon monoxide và carbon disulfide.

Vai trò của những độc tố nội sinh hiện cũng đã được chú ý trong mối liên quan đến bệnh Parkinson như tetrahydroisoquinolines (TIQ hay THIQ) và beta-carbolines. Tuy nhiên, không có độc tố cụ thể nào được tìm thấy trong não của những bệnh nhân Parkinson, và trong nhiều trường hợp bệnh Parkinson có liên quan đến các độc tố không phải thể điển hình Lewy.

Yếu tố môi trường

Bằng chứng thuyết phục nhất về yếu tố môi trường trong bệnh Parkinson liên quan đến độc tố 1,2,3,6-methyl-phenyl-tetrahydropyridine (MPTP). MPTP là một sản phẩm phụ của việc sản xuất trái phép dẫn xuất tổng hợp của meperidine. Những người nghiện ma túy có MPTP xuất hiện một hội chứng nổi bật giống như bệnh Parkinson. MPTP gây ra độc tính thông qua chuyển đổi thành ion pyridinium (MPP+) trong tế bào thần kinh đệm hình sao dưới xúc tác của monooxidase type B (MAO-B). MPP+ sau đó được hấp thu bởi tế bào thần kinh dopamine và gây ra rối loạn Phức hợp I của ty thể, được tìm thấy tương tự trong bệnh Parkinson. Những nghiên cứu này chứng minh cho khả năng rằng các yếu tố môi trường có thể gây ra bệnh Parkinson. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có yếu tố nào giống như MPTP được xác định ở những bệnh nhân Parkinson.

Một trong những yếu tố môi trường nổi bật khác liên quan đến nguy cơ bệnh Parkinson tăng cao là căng thẳng mãn tính (chronic stress). Điều kiện làm việc bất lợi về tâm lý là một nguồn căng thẳng tiềm ẩn liên quan đến sức khỏe cộng đồng. Một nghiên cứu gần đây về mối liên hệ giữa căng thẳng nghề nghiệp và nguy cơ mắc bệnh Parkinson cho thấy sự đòi hỏi cao của công việc dường như làm tăng nguy cơ mắc bệnh Parkinson ở nam giới, đặc biệt là ở nam giới có trình độ học vấn cao; trong khi việc kiểm soát công việc đòi hỏi kỹ năng cao làm tăng nguy cơ bệnh Parkinson ở nhóm nữ giới có trình độ học vấn thấp [2].

Nhân tố di truyền

Đã có những khảo sát về sự đột biến trong hệ gen của ty thể, dựa trên kết quả của việc xác định những khiếm khuyết trong Phức hợp I của ty thể ở vùng phần đặc liềm đen trên những bệnh nhân Parkinson. Phức hợp I của ty thể bao gồm 41 tiểu đơn vị, 7 trong số đó được mã hóa bởi DNA ty thể (mtDNA). DNA ty thể là dạng cấu trúc vòng tròn kép đã trải qua đột biến khi so với DNA ở nhân. Trong một nghiên cứu hệ gen của ty thể phát hiện 5Kb bị xóa, nhưng kết quả này giống hệt ở những người cao tuổi bình thường. Ikebe và cộng sự [19] đã giải trình tự DNA ty thể trong tổng số 5 bệnh nhân mắc bệnh Parkinson tản phát (sporadic Parkinson’s disease) và ghi nhận có những đột biến điểm khác nhau trong một tiểu đơn vị trong “Phức hợp I của ty thể”. Tuy nhiên, không có đột biến liên quan đến bệnh nào được xác định ở những bệnh nhân thể liên quan đến yếu tố gia đình (familial form of Parkinson’s disease). Đột biến DNA ty thể có thể được di truyền từ mẹ, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu đều thất bại trong việc chứng minh di truyền từ mẹ ở những bệnh nhân mắc bệnh Parkinson. Điều đó không loại trừ sự tham gia của DNA ty thể, như phần lớn các bệnh nhân có đột biến của ty thể (ví dụ như xóa hoặc đột biến A3243G) không có yếu tố gia đình.

Một nghiên cứu cho thấy bệnh Parkinson có liên quan với vị trí q21-23 của nhiễm sắc thể số 4 trong một đại gia đình người Mỹ gốc Ý. Những bệnh nhân này có tuổi khởi phát bệnh tương đối sớm nhưng không có bệnh lý lâm sàng điển hình của bệnh Parkinson, bao gồm cả thể Lewy. Sau đó, một đột

biến đã được phát hiện liên quan đến các gen mã hóa cho các protein α- Synuclein trong gia đình này cũng như trong một số gia đình dường như không liên quan gốc Hy Lạp. Phân tích trình tự cho thấy các đột biến gồm có sự thay đổi cặp cơ sở duy nhất từ G thành A ở vị trí 209 (G209A), kết quả là một alanine được thay thế bằng threonine ở vị trí 53 (Ala53Thr) trong protein α-Synuclein. Trong các gia đình bị ảnh hưởng, 85% bệnh nhân có đột biến gen biểu hiện những đặc điểm lâm sàng của bệnh Parkinson, trong khi những đột biến này không tìm thấy trong bất kỳ 314 người ở nhóm chứng. Một đột biến thứ hai trong các protein α-Synuclein (Ala30Pro) đã được mô tả trong một gia đình người Đức. Những phát hiện này cho bằng chứng rằng một đột biến duy nhất trong gen của protein α-Synuclein ở người là đủ để gây nên một thể của bệnh Parkinson.

Sự liên quan của bệnh Parkinson với cả MPTP và đột biến của α- Synuclein cho thấy cả nhân tố môi trường hoặc yếu tố di truyền có thể gây ra bệnh Parkinson. Tuy nhiên, không thể chắc chắn rằng đa số các trường hợp bệnh Parkinson sẽ được giải thích là do một nguyên nhân duy nhất.

Điều này dẫn đến song thuyết trong nguyên nhân gây bệnh Parkinson, thừa nhận rằng bệnh Parkinson có thể là kết quả của sự tương tác giữa đột biến nhiều gen và/hoặc sự kết hợp giữa của một đột biến gen và độc tố môi trường. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng có sự thoái hóa cận lâm sàng của liềm đen ở chuột đột biến SOD (superoxide dismutase) và những tế bào thần kinh dopamine ở những con chuột này có độ nhạy cảm rất cao với liều nhỏ MPTP, liều mà không ảnh hưởng tới chủng không đột biến (wild-type) cùng lứa. Phát hiện này có thể cho phép phát triển những động vật biến đổi gen cho chúng ta cơ hội để hiểu hơn về cơ chế gây chết tế bào trong bệnh Parkinson.

1.1.4. Một số đặc điểm lâm sàng bệnh Parkinson

Bệnh Parkinson biểu hiện bởi 3 triệu chứng chính [2] là:

- Run khi nghỉ: là run không chủ ý, thấy rõ ở đầu chi thể với tần số 4-8 chu kỳ/giây. Run thường là triệu chứng xuất hiện sớm nhất và khởi phát ở một bên (khởi phát không đối xứng).

- Cứng đơ: là hiện tượng cơ co để chống lại trọng lực tác động lên cơ thể nên thường xảy ra ở mặt gấp của cơ thể (gây nên tư thế nửa gấp trên bệnh nhân), ở giai đoạn muộn cứng cơ lan tràn có thể gây nên hiện tượng “bánh răng” – co cơ thành từng nấc.

- Giảm vận động: mất các động tác tự nhiên như biểu cảm của khuôn

mặt, vận động chi thể,…do các nhóm cơ vận động chủ ý bị tăng trương lực.

Ba triệu chứng chính xuất hiện rất sớm và thường khởi phát không đối xứng hai bên. Những triệu chứng này kèm theo sự đáp ứng của bệnh nhân với thuốc điều trị đặc hiệu levodopa có thể giúp cho bác sĩ chuyên khoa chẩn đoán xác định bệnh Parkinson.

Các triệu chứng thứ phát đi kèm như: rối loạn nhận thức, rối loạn tâm thần, rối loạn tư thế, rối loạn trương lực cơ, rối loạn tiếng nói và chữ viết,… là hệ quả của quá trình bệnh tiến triển (quá trình tiến triển của bệnh được đánh giá theo các giai đoạn I – V). Trong đó các triệu chứng rối loạn nhận thức như: giảm trí nhớ, giảm khả năng tư duy,… hay những triệu chứng của hội chứng rối loạn tâm thần như: ảo thanh, ảo thính, ảo thị, trầm cảm,…tiến triển nhanh và gây hậu quả rất nặng nề trên bệnh nhân [4].

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN BỆNH PARKINSON

1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Những nghiên cứu toàn diện về di truyền trong bệnh Parkinson cho thấy rằng một NST thường - chiếm ưu thế thừa kế, với các biểu hiện của bệnh ở mỗi thế hệ. Nhưng cũng có những giả thuyết về NST thường - kiểu lặn, trong một vài thế hệ. Các nghiên cứu gần đây phát hiện ra có một số gen đột biến ở trong nhóm người mắc bệnh. Cho dù các gen đột biến được xác định có thể không phải là nguyên nhân của tất cả những trường hợp bệnh Parkinson nhưng phát hiện này đã gợi mở cho các nhà khoa học thực hiện thêm các nghiên cứu để hiểu biết sâu hơn nữa về bệnh Parkinson. Hầu hết mọi người mắc bệnh Parkinson đều có sự tương tác của các yếu tố di truyền tiềm ẩn và môi trường. Trong đó di truyền, cụ thể là các gen đột biến đóng vai trò quan trọng hơn trong sự khởi phát sớm bệnh Parkinson. Nghiên cứu của Quỹ

Parkinson - Mỹ cho thấy 65% những người khởi phát bệnh Parkinson dưới 20 tuổi, và 32% những người mắc bệnh ở độ tuổi từ 20 đến 30 có tình trạng đột biến gen. Các tác giả cho biết, cùng với 10 đột biến gen tìm thấy trước đây và 2 đột biến mới xuất hiện đã tiến gần hơn khả năng nhìn thấy một bức tranh toàn cảnh về các gen tác động đến bệnh Parkinson [20].

Ngày nay, có hơn 16 loci và 11 gen được nghiên cứu có liên kết với bệnh Parkinson, nhưng chỉ có 6 gen được kết luận là có liên kết với di truyền kiểu Mendel [21]. Các nghiên cứu gần đây tập trung vào phổ biến đổi 6 gen này, chức năng của các protein mã hóa chúng, các protein đột biến và con đường chuyển hóa mà chúng liên quan. Các gen đã và đang được các tác giả trên thế giới nghiên cứu là gen α-Synuclein nằm trên nhiễm sắc thể số 4, gen Parkin nằm trên nhiễm sắc thể số 6, gen ApoE nằm trên nhiễm sắc thể số 19 và gen TAU nằm trên nhiễm sắc thể số 17. Một số gen khác liên quan tới bệnh Parkinson bao gồm gen PARK1, PARK2, PINK1, LRRK2, và PARK6 nằm trên nhiễm sắc thể số 1, và gen Cytochrome P450 (CYP2D6)… Cho đến nay, các nghiên cứu đã chỉ ra hai gen gây di truyền dạng trội của nhiễm sắc thể thường (autosomal dominant) được cho là gây ra bệnh Parkinson, chủ yếu là di truyền từ mẹ hoặc cha hoặc cả hai: α-Synuclein (SNCA) và Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2); và 4 gen gây di truyền dạng lặn của nhiễm sắc thể thường (autosomal recessive): Parkin, Phosphatase và Tensin Homologue (PTEN) - giảm Kinase 1 (PINK1), DJ-1, và ATPase type 13A2 (ATP13A2). Shoukhrat Mitalipov cùng các cộng sự tại Đại học Khoa học và Sức khỏe Oregon (Hoa Kỳ) đã tiến hành một nghiên cứu thay mtDNA bị lỗi trong bệnh Parkinson ở loài khỉ nâu. Kết quả kiểm tra gen cho thấy tất cả những con khỉ con thí nghiệm đều khỏe mạnh và không một con khỉ nào có mtDNA từ con khỉ gốc bị bệnh Parkinson. Phương thức thay đổi gen di truyền mới sẽ mang lại lợi ích cho nhiều gia đình, có thể giúp thoát khỏi căn bệnh nan y do lỗi gen di truyền gây ra [22]. Một nhóm chuyên gia quốc tế gồm các nhà khoa học của Anh và Đức vừa phối hợp thực hiện một nghiên cứu và tìm thấy yếu tố rủi ro mang tính di truyền làm gia tăng bệnh Parkinson. Ngoài ra nhóm đề tài còn phát hiện thấy việc tăng hoạt hóa của gen pyridoxal kinase (PDXK) có ảnh hưởng lớn đến nguy cơ gây bệnh [23].

Việc hoàn thành bản đồ gen của con người cũng đã cung cấp nhiều công cụ cho phép các nhà nghiên cứu tìm kiếm và xác định vai trò của yếu tố di truyền trong việc khởi phát bệnh. Những công cụ này bao gồm: trình tự gen của con người, bản đồ các biến dị di truyền và tiếp tục phát triển các công nghệ giúp đơn giản hóa việc phân tích các biến thể di truyền. Việc ứng dụng các công nghệ sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh như: nghiên cứu liên kết gen (Genome Wide Association Studies-GWAS), nghiên cứu giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing-NGS) cho phép phát hiện và chữa trị các bệnh di truyền, gồm cả bệnh Parkinson nhanh chóng, chính xác, với chi phí giảm thấp. Trong 5 năm qua, các nỗ lực chuyên sâu đã được dành cho các nghiên cứu GWAS. Ở đây, mục đích là để xác định các biến thể di truyền phổ biến trong quần thể, có kích thước hiệu ứng rất nhỏ (tỉ số <1.5), và "điều chỉnh nguy cơ" (chứ không phải gây ra) bệnh. GWAS yêu cầu số lượng lớn các trường hợp và kiểm soát dân số phù hợp. Có hơn 20 vị trí nhạy cảm đối với bệnh Parkinson đã được xác định được cho là kết quả từ GWAS và các phân tích meta. Mặc dù kích thước ảnh hưởng của các biến thể này không đủ lớn để báo cáo dự đoán bệnh hoặc chẩn đoán trong thực hành lâm sàng, nhưng các loci GWAS rất quan trọng. Mỗi loci trong số này bị đột biến có thể dẫn đến phân tử mới ảnh hưởng bệnh Parkinson nói chung. Hơn nữa, tác động của việc thực hiện một số biến thể rủi ro có thể cao hơn, do các hiệu ứng bổ sung hoặc phối hợp. Tuy nhiên, các ước tính cho thấy rằng các biến thể thông thường chỉ giải thích một phần nhỏ di truyền của bệnh [24], [25]. Do đó, các đột biến hiếm gặp có hiệu quả lớn và các biến thể phổ biến của mỗi hiệu ứng nhỏ chỉ giải thích một phần cơ chế của bệnh. Có một khả năng là "tính di truyền bị biến mất" nằm trong một loại biến thể khác nhau, mà không phải là phổ biến đủ để được phát hiện bởi GWAS, và không xuất hiện đủ để được tìm thấy trong liên kết gia đình. Thực tế, các biến thể của loại này bao gồm Gly2019Ser trong LRRK2 [24], và một vài biến thể trong GBA [26], các biến thể phổ biến nhất được biết đến trong bệnh Parkinson. Các biến thể của loại này có thể tồn tại trong một số gen vẫn còn chưa biết, và sự phổ biến của chúng cũng có thể là đặc trưng của dân số (giống như các biến thể của LRRK2-Gly2019Ser và GBA).

1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện trên thế giới có khoảng 6,3 triệu người mắc bệnh Parkinson, còn ở Việt Nam chưa có số liệu thống kê dịch tễ học đầy đủ về bệnh này. Theo một số nghiên cứu, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson so với các bệnh thần kinh khác là khoảng 1 - 2%. Tại khoa thần kinh Bệnh viện Đại học Y dược TP.HCM, năm 2015 có đến 1.089 người bệnh Parkinson đang theo dõi và điều trị với tổng số trên 4.000 lượt khám/năm [27]. Ở Việt Nam, theo một số chuyên gia, tuổi mắc bệnh là từ 40 đến 70. Bệnh hiếm khi khởi phát trước tuổi 30, tuổi mắc bệnh có tỷ lệ cao là từ 60 đến 69 [28], [29]. Sự già hóa dân số là một thách thức đối với nước ta và trên thế giới. Theo kết quả cuộc tổng điều tra dân số năm 1999 số người cao tuổi là 6.199.600 người, chiếm tỷ lệ 8,12% số dân. Như vậy, nếu bệnh Parkinson chiếm tỷ lệ 2% thì số lượng bệnh nhân sẽ không nhỏ, đòi hỏi sự giúp đỡ của các thầy thuốc chuyên khoa và đa khoa [26]. Chẩn đoán lâm sàng vẫn là phương pháp chính được các tác giả trong nước sử dụng. Đặc điểm bệnh học của bệnh là sự thoái hóa lan tràn, tiến triển, không hồi phục của tế bào thần kinh dopaminergic ở vùng đặc của liềm đen và sự xuất hiện của thể vùi nội bào ưa eosin (thể Lewy) trong các tế bào thần kinh còn lại. Chẩn đoán bệnh Parkinson chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng điển hình. Do đó, việc chẩn đoán chính xác bệnh Parkinson vẫn còn có những nhầm lẫn với nhiều bệnh lý khác, hay gặp là phân biệt với hội chứng Parkinson ở giai đoạn sớm. Các nhà khoa học cũng ước tính khoảng 80% các trường hợp hội chứng Parkinson là bệnh Parkinson đích thực, 20% số bệnh nhân còn lại là hội chứng Parkinson do các nguyên nhân khác như do dùng thuốc hướng thần kinh, bệnh Wilson, tràn dịch não áp lực... Các xét nghiệm bổ trợ như chụp cắt lớp vi tính não, chụp cộng hưởng từ não và ngay cả phương pháp thăm dò chức năng não như chụp cắt lớp bằng Positron (Positron Emission Tomography: PET), chụp cắt lớp điện toán SPECT... cũng chỉ góp phần cho chẩn đoán loại trừ, không phải chẩn đoán đặc hiệu [30], [31]. Thống kê cho thấy tỷ lệ chẩn đoán sai đối với bệnh Parkinson ở các nước trên thế giới vẫn chiếm khoảng 10%. Tại Việt Nam, tình hình quản lí và nghiên cứu các bệnh lý thoái hóa não nói chung và bệnh Parkinson nói riêng còn có nhiều hạn chế. Do vậy, tỷ lệ sai sót trong chẩn đoán và điều trị có thể

còn cao hơn nhiều. Tuy nhiên, các nghiên cứu về bệnh Parkinson trong nước vẫn chủ yếu tập trung vào nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng, các yếu tố nguy cơ và điều trị Parkinson. Những nghiên cứu về di truyền phân tử dựa vào việc phân tích và xác định các đột biến đặc biệt trên một số gen đặc hiệu (SNCA, Parkin, PTEN, PINK1, DJ-1,…) mang chỉ thị di truyền của bệnh Parkinson để hỗ trợ việc chẩn đoán sớm và điều trị bệnh có độ chính xác và tính ứng dụng cao còn chưa được quan tâm đầy đủ.

1.3. CƠ SỞ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH PARKINSON

1.3.1. Vai trò của một số gen trong bệnh Parkinson

Ban đầu bệnh Parkinson được coi là có nguyên nhân độc lập và bị phơi nhiễm bởi yếu tố môi trường, mặc dù 10-30% bệnh nhân mắc bệnh Parkinson được báo cáo có mối quan hệ họ hàng [32]. Các nguyên nhân của bệnh Parkinson hiện nay vẫn chưa được xác định chính xác, tuy nhiên các nhà nghiên cứu tin rằng môi trường và di truyền là hai yếu tố đóng vai trò lớn nhất gây nên bệnh Parkinson. Đến nay các nhà khoa học đã tìm thấy mối liên quan giữa biến đổi gen với một tỷ lệ nhỏ người bệnh khởi phát Parkinson ở độ tuổi dưới 50. Vai trò của các gen đột biến ít được tìm thấy trong trường hợp bệnh khởi phát muộn, nhưng đóng vai trò quan trọng hơn trong sự khởi phát sớm bệnh Parkinson. Một số gen và các loci liên quan đến bệnh Parkinson được liệt kê trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1. Các gen chính và loci liên quan đến bệnh Parkinson [21].

Locus Vị trí Gen

Tuổi phát bệnh Di truyền

Liên kết xác định với bệnh Parkinson

PARK1/PARK4 4q21 SNCA Biến thiên AD

PARK2 6q25-q27 Parkin < 40 AR

PARK6 1p35-p36 PINK1 < 40 AR

AR PARK7 1p36 DJ-1 30-40

AD PARK8 12q12 LRRK2 Biến thiên

AR PARK9 1p36 ATP13A2 < 20

Liên kết không xác định với bệnh Parkinson

AD PARK5a 4p14 UCHL1 Muộn

AD PARK11? 2q36-q37 GIGYF2 Muộn

PARK13b 2p13 Omi/HTRA2

AR PARK14? 22q13.1 PLA2G6 < 20

AR PARK15? 22q12-q13 FBXO7 < 40

aChỉ một đột biến được xác định trong một gia đình.

bVai trò không rõ ràng.

AD: Di truyền trội NST thường; AR: di truyền lặn NST thường

GIGFY2, PLA2G6, và FBXO7 là các gen mới được đề xuất, nhưng vai

trò của chúng trong bệnh Parkinson cần phải được xác định thêm.

1.3.2. Cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của gen DJ-1

DJ-1 là một gen có chiều dài 24 Kb và chứa tám exon (1A, 1B, 2, 3, 4, 5, 6, 7), hai trong số đó là không mã hóa và có thể thay thế (exon 1A và 1B) [33]. DJ-1 mã hóa protein PARK7 bao gồm 189 acid amin nhỏ với tổng cộng

11 sợi 𝛽 (𝛽1-𝛽11) và 8 chuỗi xoắn ốc α (αA-αH). DJ-1 tồn tại ở dạng monodimer, được biểu hiện khắp nơi và được bảo tồn cao trong các loài khác nhau; nó được phân phối rộng rãi và được biểu hiện cao trong não và các mô não. Trong não người, DJ-1 đã đánh dấu biểu hiện trong cả các tế bào thần kinh đệm. Trong não chuột, DJ-1 được biểu hiện ở khắp nơi trong các tế bào thần kinh nhưng cũng biểu hiện ở tế bào thần kinh đệm [34].

Ban đầu gen DJ-1 được mô tả như là một gen tiền ung thư (oncogen), và sau đó được chứng minh là có tham gia vào khả năng sinh sản của nam giới cũng như có mặt trong một số cấu trúc thần kinh [35]. Sự phân bố của

DJ-1 kiểu tự nhiên là ở nhân hoặc tế bào chất, trong khi DJ-1 đột biến cho thấy giảm ở vị trí nhân và chuyển sang vị trí ty thể [3]. DJ-1 được chứng minh là hoạt động như chaperone phân tử nhạy cảm với các phản ứng oxi hóa khử, ngăn cản sự kết hợp của synuclein và tiểu đơn vị nơron thần kinh [36]. Chức năng gen DJ-1 được trình bày trong Hình 1.3.

Hình 1.3. Chức năng gen DJ-1 trong tế bào

(Nguồn:https://www.researchgate.net/publication/332848410_Role_of_DJ- 1_in_the_mechanism_of_pathogenesis_of_Parkinson%27s_disease)

hydroxylase (TH) và

(1) DJ-1 có thể điều chỉnh tổng hợp dopamine thông qua hoạt hóa trực tiếp 4-dihydroxy-L-phenylalanine tyrosine decarboxylase (DDC).

(2) Trong nhân, DJ-1 đóng vai trò là chất kích hoạt phiên mã NF-kB và phiên mã tiếp theo của gen mã hóa UCP4. Sự tách rời do các protein không ghép cặp (UCP) gây ra có thể làm giảm sản xuất ROS.

(3) DJ-1 ngăn chặn sự kết hợp α-syn độc hại tiềm ẩn thông qua việc kích hoạt sự phân hủy α-syn bởi tác nhân tự thực bào qua trung gian chaperone (CMA).

(4) DJ-1 kích thích hệ thống chống oxy hóa nội sinh bằng cách kích

hoạt Nrf2.

(5) DJ-1 điều chỉnh và ổn định Bcl-xL trong ty thể ngăn ngừa apoptosis.

(6) DJ-1 điều hòa tích cực p53 thông qua quá trình sumoyl hóa qua trung gian Topor. Sự biểu hiện quá mức của DJ-1 làm giảm sự biểu hiện của Bax và ức chế quá trình apoptosis. DJ-1 cũng ức chế PTEN để kích hoạt con đường PI3K / PKB (Akt).

Hình 1.4. Cấu trúc bộ gen của gen DJ-1 và một số đột biến được xác định trong bệnh Parkinson.

* Hộp đen là phần chuỗi exon không mã hóa; hộp sáng là chuỗi exon

mã hóa.

* Có ba đột biến sai nghĩa ở dạng đồng hợp tử được gạch chân.

(Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/Genomic-structure-of-the-DJ-1- gene-and-mutations-identified-in-PD_fig1_5391442)

Các đột biến đồng hợp tử trong gen DJ-1 lần đầu tiên được mô tả trong hai gia đình châu Âu: một đột biến là xóa bỏ đoạn 14 Kb bao phủ một phần lớn vùng mã hóa, bao gồm các exon từ 1 đến 5, trong một gia đình Hà Lan; và một biến thể sai nghĩa - missense (đột biến L166P gen DJ-1) trong một gia đình Ý [37], [38]. Việc xóa bỏ một đoạn lớn nucleotide dẫn đến làm mất sự biểu hiện của protein, và từ đó sẽ mất cơ chế chức năng (Hình 1.4). Đã xác định được các đột biến sai nghĩa, đột biến ở vị trí cắt (splice-site), và mất exon (exonic deletion) trong gen DJ-1 có liên kết với bệnh Parkinson, nhưng chủ yếu là các đột biến hiếm vì chỉ có <1% trường hợp khởi phát sớm. Về mặt

hình thái, bệnh nhân có đột biến DJ-1 không thể phân biệt được với trường hợp mắc bệnh có liên quan đến đột biến gen Parkin và PINK1 [39].

Đột biến L166P được chứng minh là làm tăng tính không ổn định do khả năng phá vỡ vùng xoắn C-terminal, dẫn đến sự giảm độ tự phân bố của gen DJ-1. Các monome không ổn định sau đó nhanh chóng bị phân hủy bởi proteasome 20S / 26S [40]. Do đó gốc 166 là rất quan trọng, và đột biến L166P có cơ chế làm mất chức năng, giống như trường hợp xóa một vùng lớn 14 Kb. Hơn nữa, các nghiên cứu tế bào đã chứng minh rằng ở các tế bào bị knock - out DJ-1 thường nhạy cảm với stress do oxy hóa vì tạo ra H2O2 [41]. Dưới điều kiện stress oxy hoá, DJ-1 trải qua một quá trình acid hóa với giá trị đẳng điện ly (từ 6.2 đến 5.8) để oxy hoá cysteine 106 và do đó làm bất hoạt các loại oxy hoạt tính. Sau đó DJ-1 chuyển vị trí ra màng ngoài ty thể, nơi tế bào được bảo vệ khỏi cơ chế chết theo chương trình (apoptosis) [7]. DJ-1 dường như hoạt động như một cảm biến cho phản ứng oxy hóa khử, có tác dụng bảo vệ dưới điều kiện oxy hóa.

1.3.3. Vai trò gen DJ-1 trong bảo vệ chống oxy hóa tế bào thần kinh

Tế bào thần kinh là các tế bào hậu nguyên phân và chúng được đặc trưng bởi mức tiêu thụ oxy cao, hàm lượng lipid và hoạt động trao đổi chất khiến chúng nhạy cảm hơn với tổn thương oxy hóa so với các tế bào khác [42]. Stress oxy hóa đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Parkinson [43]. DJ-1 mã hóa protein PARK7 có nhiệm vụ bảo vệ tế bào thần kinh chống lại stress oxy hóa, nó hoạt động như một cảm biến của stress oxy hóa bằng cách tương tác với các enzyme khác của hệ thống chống oxy hóa và bằng cách nâng cao biểu hiện của các gen qua đó bảo vệ chống oxy hóa tương ứng [44]. Mạng lưới enzyme bảo vệ chống oxy hóa bao gồm từ superoxide effutase, glutathione peroxidase, catalase và paraoxonase [45]. Sự biểu hiện quá mức của protein PARK7 thúc đẩy sự gia tăng nồng độ glutathione giúp bảo vệ tế bào thần kinh khỏi stress oxy hóa gây ra bởi H2O2 và 6-OHDA. Hơn nữa, các tế bào có mức độ PARK7 cao có khả năng chống lại stress oxy hóa và độc tố thần kinh, như 6-OHDA, trong khi mức độ thấp hơn của PARK7 khiến các tế bào dễ bị stress oxy hóa [43].

Trong điều kiện stress oxy hóa, dư lượng cysteine được bảo tồn trong gen DJ- 1 (Cys106) bị oxy hóa và sự điều chỉnh oxy hóa này cho phép protein PARK7 hoạt động như một công cụ phản ứng oxy hóa ROS (reactive oxidative species) và như một cảm biến để cân bằng oxy hóa tế bào. Protein PARK7 chủ yếu được định vị trong tế bào chất, nhưng dưới tác động oxy hóa, nó có thể được chuyển vào trong ty thể và nhân lần lượt sau 3 và 12 giờ sẽ hoạt động như một tế bào chất (Hình 1.5) [47]. Quá trình oxy hóa Cys106 thành -) là cần thiết cho quá trình định vị ty thể và bảo vệ các tế dạng sulfin (HSO2 bào chống lại stress oxy hóa và để ức chế sự hình thành fibrils của α- Synuclein. DJ-1 được chuyển vào nhân hoạt động như một hệ số cấu thành yếu tố phiên mã của các yếu tố phiên mã NF-kB vì nó không có vị trí gắn DNA riêng biệt [48].

Hình 1.5. Gen DJ-1 được kích hoạt như một chất chống oxy hóa

(Nguồn:https://www.researchgate.net/publication/332848410_Role_of_DJ 1_in_the_mechanism_of_pathogenesis_of_Parkinson%27s_disease)

1.3.4. Tương tác của DJ-1 và ty thể

Rối loạn chức năng ty thể đóng vai trò trung tâm của cơ chế thoái hóa

thần kinh trong bệnh Parkinson.

Ty thể được coi là một trong những cơ quan sản xuất chính của các chất oxy hóa (ROS) trong tế bào. Sự sản xuất quá mức của ROS gây ra sự di chuyển nhanh chóng của DJ-1 sang ty thể, cho thấy rằng ty thể là một địa điểm cho hoạt động bảo vệ thần kinh của DJ-1 [49]. Trên hình ảnh kính hiển vi điện tử, DJ-1 đã được xác định có mặt trong cả trong ma trận ty thể và trong khoảng gian bào. Điều đó đã chỉ ra rằng DJ-1 được tập trung cùng với tiểu đơn vị phức hợp ty thể NDUFA4 ngay cả khi không có stress oxy hóa. Liên kết của DJ-1 với các tiểu đơn vị Phức hợp I của ty thể được tăng cường do stress oxy hóa [50]. Việc loại bỏ gen DJ-1 trong các tế bào thần kinh dopaminergic ở người đã dẫn đến khử cực của ty thể, sự phân mảnh và tích lũy các dấu hiệu tự phát xung quanh ty thể. DJ-1 ngăn chặn sự phân mảnh ty thể trong trường hợp ty thể bị độc rotenone (có trong một số thuốc trừ sâu) gây ra theo cách tương tự như PINK1 [51]. Tổn thương lan tràn của các tế bào thần kinh dopaminergic liềm đen đặc trưng cho bệnh Parkinson và nó là nguyên nhân chính gây suy yếu vận động [2]. Các sợi trục của hệ thống liềm đen - thể vân tạo thành một trong những vùng dài nhất trong não và có thể cần một ATP bổ sung để vận chuyển các thành phần đến các đầu tiếp hợp nằm ở vị trí xa hơn. Nó đã chỉ ra rằng tỷ lệ phosphoryl hóa trong phản ứng oxy hóa của ty thể và mức độ sản xuất ROS cơ bản đặc trưng cho các tế bào thần kinh dopaminergic liềm đen là cao hơn so với các tế bào thần kinh dopaminergic của VTA (vùng trần trung não) [52]. Hoạt động tạo nhịp của các tế bào thần kinh dopaminergic liềm đen được hướng đến là một trong những lý do cho nhu cầu năng lượng cao và tính dễ bị tổn thương của các tế bào này. Các tế bào thần kinh dopaminergic liềm đen là các máy tạo nhịp tự chủ, tạo ra khả năng hoạt động với tốc độ khá chậm (2-10 Hz) khi không có đầu synap vào [53]. Hoạt động của máy điều hòa nhịp là do các đặc tính của tiểu đơn vị tạo lỗ Cav1.3 của kênh Ca++ loại L điều chỉnh mức độ cơ bản của dopamine trong thể vân. Các dao động Cytosolic Ca++ trong các tế bào thần kinh dopaminergic của liềm đen khởi đầu Ca++ vào trong thành ty thể và kích thích sản xuất ATP. Kích hoạt hô hấp của ty thể trong trường hợp không có nhu cầu ATP cao dẫn đến tăng phân cực ty thể và tăng sản xuất ROS [52].

1.3.5. Sự thiếu hụt gen DJ-1

DJ-1 là một gen đa chức năng và đột biến của nó có liên quan đến một số bệnh trong đó có các bệnh thoái hóa thần kinh, đột quỵ, tiểu đường type II và ung thư [44]. Việc xóa đồng hợp tử hoặc đột biến điểm trong gen DJ-1 ở người dẫn đến việc thay thế dư lượng acid amin proline bằng leucine (đột biến L166P) gây ra bệnh Parkinson khởi phát sớm. Các cấu trúc tinh thể của gen DJ-1 và đột biến L166P chứng minh rằng đột biến này ngăn chặn sự gấp khúc bình thường của vùng đầu C (C-terminal region). Sự thay đổi trong cấu trúc như vậy dẫn đến sự gián đoạn về tính chất vận chuyển và khả năng hình thành các dimer. Trái ngược với DJ-1 tạo thành các dimer, đột biến L166P tồn tại trong các tế bào dưới dạng monome [54]. Mất chức năng gen DJ-1 trong bệnh Parkinson có liên quan đến việc giảm hoạt động lysosomal và tổn thương ty thể. Chức năng và hoạt động của gen DJ-1 bị mất bởi đột biến L166P và đột biến này liên quan đến bệnh Parkinson [36].

1.3.6. Đột biến gen DJ-1 trong bệnh Parkinson

Bệnh Parkinson di truyền có liên quan đến locus PARK7 được xác định bởi Abou-Sleiman và cộng sự (2004) [33]. Bằng cách nhân dòng vị trí trong vùng quan trọng của PARK7, Bonifati và cộng sự (2007) [24] cũng đã xác định các đột biến trong gen DJ-1 trong hai gia đình người Hà Lan có quan hệ họ hàng, và cho thấy biểu hiện sự xóa bỏ bộ gen đồng hợp tử lớn bao gồm các exon 1–5 của gen DJ-1. Bệnh Parkinson liên quan đến gen DJ-1 phù hợp với di truyền lặn. Đột biến gen DJ-1 ít thường xuyên hơn đột biến gen Parkin ở bệnh nhân Parkinson khởi phát sớm và tần suất của chúng là khoảng 1% –2% bệnh nhân Parkinson [55]. Về mặt lâm sàng, bệnh Parkinson liên quan đến gen DJ-1 được đặc trưng bởi sự khởi phát sớm, tiến triển bệnh chậm và đáp ứng tốt với levodopa. Những đặc điểm này cũng phổ biến ở các dạng khác của bệnh Parkinson khởi phát sớm, bao gồm các liên quan đến gen Parkin và liên quan đến gen PARK6. Các rối loạn tâm thần (bao gồm cả lo âu trầm trọng và loạn thần), rối loạn hành vi sớm và các đặc điểm rối loạn vận động đều xuất hiện ở cả hai gia đình liên quan đến đột biến gen DJ-1 [55].

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng và mẫu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu:

+ Nhóm bệnh: là các bệnh nhân bị bệnh Parkinson được thu thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện, khi đến khám và điều trị tại Khoa Nội thần kinh Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 từ năm 2017 đến năm 2019.

+ Nhóm chứng: là những trường hợp được chẩn đoán không mắc bệnh

Parkinson.

- Mẫu nghiên cứu: là mẫu máu của hai nhóm bệnh và chứng.

- Căn cứ vào mục đích nghiên cứu chúng tôi đưa ra các tiêu chuẩn lựa

chọn đối tượng nghiên cứu và mẫu như sau:

* Tiêu chuẩn đối tượng nghiên cứu

+ Đối tượng nghiên cứu được giải thích rõ ràng mục đích lấy mẫu máu

nghiên cứu và đồng ý cho lấy máu.

+ Đối tượng nghiên cứu đã được các bác sĩ chuyên khoa Nội Thần kinh khám và chẩn đoán là có mắc bệnh Parkinson hay không, theo đúng tiêu chuẩn Hội Ngân hàng Não và Parkinson, Vương quốc Anh [56]. Nhóm bệnh được chẩn đoán giai đoạn bệnh (5 giai đoạn) theo Hoen – Yahr [57].

* Tiêu chuẩn mẫu

Mẫu máu của hai nhóm đối tượng nghiên cứu được thu thập và bảo

quản đúng qui trình.

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ

- Những đối tượng không đồng ý tham gia nghiên cứu.

- Bệnh nhân mắc hội chứng Parkinson. Bệnh nhân có tiền sử chấn

thương sọ não và/hoặc tiền sử bị mắc các bệnh lý tâm thần kinh khác.

- Những mẫu máu không được lấy và bảo quản đúng qui trình.

2.1.3. Thiết kế nghiên cứu

Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang và chọn mẫu thuận

tiện.

Đối chiếu một số đặc điểm lâm sàng trên bệnh nhân tương ứng

2.1.4. Sơ đồ nghiên cứu

2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1. Hóa chất

Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

 Nhóm hóa chất dùng cho tách DNA tổng số: PBS, proteinase K 1U, dung dịch: phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), đệm lysis tách máu; dung dịch CH3COONa 3M pH 5,2 và pH 4; đệm TE; ethanol 100%, ethanol 70%; RNase.

 Nhóm hóa chất dùng cho PCR: Taq DNA polymerase, Taq buffer,

dNTP, mồi đặc hiệu.

 Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose: agarose, đệm TAE,

6X DNA loading dye, ethidium bromide.

 Nhóm hóa chất giải trình tự: BigDye® Terminator v3.1, BigDye®

Sequencing Buffer, Hi-DiTM,…

Các hóa chất đảm bảo độ tinh sạch sử dụng trong sinh học phân tử và được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới: Thermo Fisher Scientific (Mỹ); Promega (Mỹ), Sigma (Mỹ)...

2.2.2. Thiết bị

Các loại máy móc thiết bị, dụng cụ chính được sử dụng: ống Eppendorf, các loại đầu côn, Pipet, bể ổn nhiệt, cân phân tích, máy li tâm thường, máy li tâm lạnh, máy Vortex, máy Spin Down, bộ điện di nhỏ, máy soi gel, máy chụp ảnh GelDoc, tủ lạnh -200C, tủ hút, máy làm đá, máy PCR AmpGen 9700 (Perkin – Elmet), máy giải trình tự Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (ABI 3500).

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Thu thập đối tượng nghiên cứu và lập bệnh án nghiên cứu

- Nhóm bệnh:

* Chẩn đoán xác định bệnh Parkinson:

Bệnh nhân đã được các bác sĩ chuyên khoa Nội Thần kinh chẩn đoán là mắc bệnh Parkinson theo đúng tiêu chuẩn Hội Ngân hàng Não và Parkinson, Vương quốc Anh [56] như sau:

+ Có 3 triệu chứng chính (run lúc nghỉ, cứng đơ, giảm vận động).

+ Hoặc có 2/3 triệu chứng chính và đáp ứng tốt với thuốc điều trị đặc

hiệu levodopa.

* Chẩn đoán giai đoạn của bệnh Parkinson:

Bệnh nhân được chẩn đoán giai đoạn bệnh theo Hoen – Yahr [57].

+ Giai đoạn I: có các dấu hiệu một bên cơ thể.

+ Giai đoạn II: có các dấu hiệu ở một bên gây suy giảm chức năng,

nhưng không mất thăng bằng cơ thể.

+ Giai đoạn III: có triệu chứng cả hai bên cơ thể với tư thế không vững,

bệnh nhân vẫn tự chủ được trong hoạt động nhưng bị hạn chế nhất định.

+ Giai đoạn IV: bị suy giảm chức năng nặng, nhưng vẫn có thể đi đứng

được với sự hỗ trợ một phần.

+ Giai đoạn V: bệnh nhân phải ngồi xe lăn hoặc tại giường, không vận

động tự chủ được.

* Chẩn đoán các rối loạn kèm theo

Các rối loạn kèm theo như: rối loạn tâm thần, rối loạn nhận thức được

các bác sĩ chuyên khoa chẩn đoán bằng các test tâm lý như MMSE, Beck.

- Nhóm chứng: được các bác sĩ chuyên khoa Nội Thần kinh chẩn đoán là KHÔNG mắc bệnh Parkinson theo đúng tiêu chuẩn Hội Ngân hàng Não và Parkinson, Vương quốc Anh [56].

2.3.2. Thu thập và bảo quản mẫu

Mẫu sinh phẩm là 2 ml máu ngoại vi của mỗi đối tượng nghiên cứu được lấy vô trùng và được đựng trong các ống chuyên dụng chứa sẵn EDTA có tác dụng chống đông máu, đảm bảo không bị nhiễm bẩn, không bị lẫn các mẫu với nhau, đảm bảo đủ thông tin (tên, tuổi, giới, ngày lấy mẫu, mã số ID).

Mẫu được bảo quản trong điều kiện -20oC cho đến khi được sử dụng để

tách chiết và phân tích DNA.

2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách từ các mẫu máu theo phương pháp được mô tả bởi Sambrook và cộng sự (2001) [58] với một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Các bước tiến hành như sau:

1. Mẫu máu được lấy ra khỏi tủ -20oC, để tan trong điều kiện thường,

hút bỏ dịch huyết thanh bên trên sau đó đảo trộn kỹ lượng máu còn lại.

2. Thu tế bào: Thêm vào ống Eppendorf (1,5 ml) 0,7 ml máu, bổ sung 0,7 ml PBS 1X. Đảo trộn đều. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng (24oC). Hút bỏ dịch pha trên, chỉ giữ lại phần cặn tế bào dưới đáy ống. Lặp lại bước này 3 lần.

3. Ly giải tế bào: Bổ sung 0,6 ml dung dịch lysis và 6 µl proteinase K 1U và 2 µl RNase A, đảo đều. Ủ trong ~3h ở 56oC bằng bể ổn nhiệt, cho đến khi mẫu được ly giải hết.

4. Thu DNA: Bổ sung 0,6 ml phenol, lắc mạnh. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch pha trên. Lặp lại với dung dịch phenol: chloroform: isoamyl alcohol và chloroform – isoamyl alcohol. Lúc này dịch thu được chủ yếu còn lại là DNA.

5. Tủa DNA: Bổ sung CH3COONa 3M với tỷ lệ DNA: CH3COONa là 1: 10 và ethanol 100% tỷ lệ DNA: ethanol là 1: 2, đảo trộn đều. Ủ qua đêm trong tủ -20oC. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Loại dịch pha trên và thu DNA dưới đáy ống.

6. Rửa tủa: Bổ sung 0,5 ml ethanol 70%, đảo đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Loại dịch, thu cặn. Để tủa khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng.

7. Hòa tan tủa: Bổ sung 50 µl đệm TE, đảo đều để tủa tan hoàn toàn.

8. Bảo quản DNA: ở -20oC để chuẩn bị cho các bước tiếp theo.

2.3.4. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng DNA tổng số

Điện di DNA trên gel agarose

Điện di DNA là phương pháp phổ biến dùng để phân tách các đoạn acid nucleic có kích thước và cấu hình khác nhau. Dưới tác dụng của điện trường trong môi trường đệm trung hòa hoặc kiềm, các acid nucleic tích điện âm sẽ di chuyển về phía điện cực dương theo nguyên tắc: các phân tử nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn các phân tử lớn, các phân tử có cấu hình cồng kềnh sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử nhỏ gọn. Các phân tử này được phát hiện dưới tia UV sau khi nhuộm với ethidium bromide.

Chúng tôi tiến hành kiểm tra kết quả tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% pha trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 110V. Thang DNA chuẩn sử dụng là 1 Kb plus. Nếu kết quả điện di chỉ cho 1 băng sáng duy nhất, kích thước tương ứng với băng lớn nhất của marker, không lẫn protein hoặc RNA, chứng tỏ DNA tổng số đã được tách chiết thành công.

* Quy trình điện di kiểm tra

- Đổ gel agarose 0,8%: hòa tan 0,8 g agarose trong 100 ml TBE 1X, đun sôi cho agarose hòa tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 60oC, đổ vào khay gel điện di có cài sẵn các răng lược thích hợp. Sau khoảng 30 phút trong nhiệt độ phòng, khi gel đã đông cứng, đặt vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X ngập cách mặt gel từ 1–2 mm.

- Tra mẫu: mỗi giếng tra 3 μl sản phẩm

- Chạy điện di: tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện

thế là 110 V trong thời gian khoảng 30 phút.

- Chụp gel: bản gel được lấy ra khỏi khay và ngâm trong dung dịch ethidium bromide 10 μg/mL trong khoảng 10 phút, rửa sạch bản gel bằng nước cất. Chụp gel bằng máy chụp gel GelDoc.

- Đánh giá kết quả dựa trên thang DNA chuẩn.

Đo mật độ quang phổ hấp thụ

Để kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng DNA thu được, chúng tôi tiến hành xác định chất lượng của sản phẩm DNA bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Giá trị mật độ quang của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ của DNA trong dung dịch. Tỷ lệ A260/A280 biểu thị mức độ protein còn sót trong dịch chiết (do protein có phổ hấp thụ cao nhất ở bước sóng 280 nm, đồng thời hấp thụ ở bước sóng 260 nm). DNA được coi là sạch khi giá trị A260/A280 = 1,8 - 2,0. Với các mẫu đạt yêu cầu có chỉ số OD 1,8 – 2,0 và nồng độ DNA dao động từ 200 đến 500 µg/ml được pha loãng tới nồng độ 100 μg/ml để dùng làm khuôn cho phản ứng PCR.

2.3.5. Thiết kế mồi

Mồi được kế thừa và hiệu chỉnh dựa trên trình tự các cặp mồi đã được công bố bởi Lockhart và cộng sự năm 1996 [59]. Dựa trên trình tự nucleotid của mỗi exon, chúng tôi sử dụng công cụ “Primer Blast’’/ NCBI để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Trình tự mồi tương ứng của các exon 2, 3, 4, 5, 6, 7 gen DJ-1.

Exon

Trình tự mồi

GGACAGCGACTTCTGAACAC

2.3.6. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được Kary Mullis và các cộng sự phát minh (1985) [60], được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA bất kì khi biết trình tự nucleotid ở hai đầu DNA. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA in vitro nhờ enzym DNA polymeraza.

Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: (1) Giai doạn biến tính DNA thành dạng sợi đơn bằng cách nâng nhiệt độ lên 94- 95oC trong khoảng thời gian ngắn. (2) Giai đoạn bắt cặp: hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ gắn với DNA tương đồng ở hai đầu đoạn DNA cần nhân dòng theo nguyên tắc bổ sung khi hạ nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ Tm tương ứng của các mồi (khoảng 37-65oC); (3) Giai đoạn kéo dài chuỗi: phản ứng tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi, thực hiện ở 72oC nhằm tránh hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu.

Các bước thực hiện:

- Chuẩn bị cho 25 μl hỗn hợp phản ứng theo tỷ lệ của nhà sản xuất

- Các thành phần của phản ứng PCR (Bảng 2.2).

Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng PCR

Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích

Khuôn DNA 100 μg/ml 5 μl

dNTP 2 mM 2 μl

Taq buffer ( + Mg2+) 10X 1 μl

Taq polymerase 1U 1,5 μl

Mồi xuôi 10 pg/μl 1 μl

Mồi ngược 10 pg/ μl 1 μl

Nước khử ion 13,5 μl

25 μl Tổng thể tích

− Phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt: 95°C trong 7 phút, 25 chu kì (95°C, 30 giây; 50-65°C tùy theo mồi, 30 giây; 72°C, 15 giây); 72°C, 7 phút, sau đó giữ ở 4°C.

− Kiểm tra sản phẩm PCR bằng cách điện di trên agarose 1%.

− Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit QIAquick PCR Purification Kit

(Qiagen).

2.3.7. Giải trình tự DNA

Phương pháp giải trình tự DNA được phát triển bởi Fred Sanger vào khoảng giữa những năm 1970 [61]. Thay vì sử dụng phản ứng hóa học, Sanger lựa chọn phương pháp sử dụng tới một dạng cấu trúc thứ ba của gốc đường ribose (Hình 1.6). Ribose có một nhóm hydroxyl ở cả hai vị trí carbon 2’ và 3’ trong khi deoxyribose chỉ có duy nhất một nhóm hydroxyl ở vị trí carbon 3’. Dạng thứ ba của ribose loại bỏ hydroxyl ở cả hai vị trí carbon 2’ và 3’. Dạng này được gọi là dideoxyribose, bất cứ khi nào một dideoxyribose được gắn vào một chuỗi polynucleotide thì quá trình kéo dài chuỗi đó sẽ bị dừng lại. Như vậy, sự kết hợp của các dideoxynucleotide riêng biệt sẽ tạo ra các chuỗi có kết thúc chọn lọc.

Hình 1.6. Cấu trúc của ba loại đường 5 carbon.

(các nhóm hydroxyl được biểu diễn bằng màu đỏ).

(Nguồn: https://senthilarivan.wordpress.com/)

Sanger đã thiết lập một quy trình với bốn phản ứng được thực hiện riêng biệt, kết hợp mỗi loại dideoxynucleotide khác nhau cùng với bốn deoxynucleotide. Quy trình này sẽ tạo ra các đoạn có kết thúc tại tất cả các vị

trình tự riêng biệt cùng với một trong bốn

trí gắn của nhóm dideoxynucleotide, nếu tỷ lệ dideoxynucleotide và deoxynucleotide tương ứng được thiết lập đúng. Phương pháp giải trình tự Sanger đã làm tiền đề cho các nghiên cứu giải trình tự DNA, quỹ data các dữ liệu trình tự từ các nghiên cứu khoa học cũng dần dẫn đến việc thành lập các kho lưu trữ trình tự DNA đầu tiên bởi Walter Goad tại Phòng thí nghiệm Quốc gia Los Alamos năm 1979. Kho dữ liệu này sau đó trở thành GenBank [62]. Năm 1986, Leroy Hood và cộng sự [65] đã đưa ra một phương pháp giải trình tự DNA trong đó các tín hiệu phóng xạ được thay thế bằng tín hiệu huỳnh quang. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng laser cảm ứng huỳnh quang liên kết với một hệ thống máy tính phân tích. Theo phương pháp này, mồi sẽ được gắn một trong bốn loại tín hiệu huỳnh quang khác nhau và được đưa vào các loại phản ứng giải dideoxynucleotide. Khi các phản ứng đã hoàn thành, bốn sản phẩm của phản ứng được gộp lại và chạy cùng nhau trong một làn của gel giải trình tự polyacrylamide. Một cảm biến laser bốn màu sẽ quét qua các đoạn di chuyển trong gel. Tín hiệu huỳnh quang của từng đoạn sau đó được gửi tới một máy tính với phần mềm được thiết kế để nhận diện các base. James M. Prober và cộng sự tại DuPont đã phát triển tiếp phương pháp giải trình tự gắn huỳnh quang [60]. Thay vì gắn huỳnh quang vào mồi, nhóm nghiên cứu này đã gắn tín hiệu vào các kết thúc dideoxy. Một bộ nhuộm bao gồm các succinylfluorescein, thay đổi bước sóng phản xạ thông qua các nhóm phụ khác nhau. Các loại thuốc nhuộm là: SF505, SF512, SF519, và SF526 được gắn lần lượt vào ddG, ddA, ddC, và ddT. Tất cả bốn loại nhuộm đều được kích thích bằng laser bước sóng 480 nm và mỗi loại sẽ phát ra một tín hiệu khác nhau được phát hiện bởi hệ thống cảm biến. Hệ thống phát hiện này cho phép phản ứng giải trình tự có thể được thực hiện trong một ống duy nhất với cả bốn loại ddNTP và quá trình đọc trình tự được thực hiện chỉ trong một lần duy nhất.

Harold Swerdlow và cộng sự (1990) đã sử dụng phương pháp điện di mao quản trong giải trình DNA [63]. Mao quản điện di có kích thước nhỏ, đường kính bên trong là 50 μm, có khả năng tản nhiệt rất hiệu quả do diện tích bề mặt lớn. Do đó, hệ thống mao quản có thể chạy với điện áp cao hơn từ

đó giảm thời gian thực hiện. Hơn nữa, hệ thống mao quản có thể chạy tự động, đây là một ưu điểm lớn so với hệ thống sử dụng gel. Vào năm 1993, B.L. Karger và cộng sự [60] đã sử dụng một loại chất nền phân tách độ nhớt thấp, là tiền đề để phát triển một nền tảng giải trình tự thông lượng cao ngày nay (Hình 1.7).

Hình 1.7. Sơ đồ biểu diễn của một hệ thống giải trình tự DNA mao quản.

A. Các thiết lập cơ bản của một hệ thống mao quản.

Phản ứng giải trình tự được chứa trong ngăn chứa mẫu, đệm điện di được chứa trong ngăn thứ hai, mao quản được bơm đầy polymer, một điện thế được đưa vào hai đầu mao quản.

B. Tín hiệu phát ra từ các đoạn giải trình tự khi đi qua laser quét, được thu nhận thông qua các cảm biến sáng, thông tin sẽ được chuyền về máy tính.

C. Biểu đồ tín hiệu đầu ra.

(Nguồn: https://senthilarivan.wordpress.com/)

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành giải trình tự DNA trên máy điện di mao quản Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (ABI 3500). Quy trình được tiến hành theo hướng dẫn đi kèm máy.

− Chuẩn bị thành phần phản ứng.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng giải trình tự

Thành phần Lượng

BigDye® Terminator v3.1 4 µl

BigDye® Sequencing Buffer 2 µl

Mồi 3,2 pmol

Khuôn 5-20 ng

Nước Thêm tới 20 µl

− Chạy phản ứng với chu trình nhiệt: 96°C trong 1 phút, 25 chu kì

(96°C, 10 giây; 50°C, 5 giây; 60°C, 4 phút); sau đó giữ ở 4°C.

− Tinh sạch sản phẩm

Bổ sung 5 µl EDTA 125 mM và 60 µl ethanol 100%. Trộn đều, ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút tại 4°C. Loại bỏ phần dịch sau đó bổ sung 60 µl ethanol 70%. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút tại 4°C rồi loại bỏ phần dịch. Làm khô và bảo quản ở 4°C.

− Biến tính

Bổ sung 20 µl Hi-DiTM rồi trộn đều dung dịch. Biến tính ở 95°C trong

5 phút.

− Điện di mao quản

Chuyển mẫu sang plate. Đặt chương trình cho máy đọc trình tự.

− Xử lí thô kết quả

2.3.8. Phân tích số liệu

Trình tự đọc được từ hệ thống giải trình tự ABI 3500 được trả về dưới dạng file AB1 bao gồm hai loại dữ liệu: trình tự nucleic acid và cường độ của tín hiệu mà hệ thống ghi nhận được. Tiến hành đọc và chỉnh sửa trên phần mềm BioEdit v7.2.5. Thông qua độ mạnh yếu của tín hiệu thu được, chúng tôi có thể xác định một cách tương đối chất lượng của đoạn trình tự đã đọc được. Từ đó, tiến hành cắt bỏ đoạn trình tự có chất lượng thấp, nhằm làm tăng độ tin cậy cho đoạn trình tự thu được (contig). Đồng thời trình tự này được lưu dưới dạng file FASTA phù hợp với các phần mềm phân tích sau đó.

Nghiên cứu sử dụng một chuỗi các gen DJ-1 trên Genbank (với mã NC_000001.11) làm trình tự tham chiếu. Những trình tự này được sử dụng để xác định vị trí của 6 exon trong nghiên cứu của chúng tôi. Công cụ tin sinh học BioEdit đã được sử dụng cho các chuỗi DNA của cả nhóm bệnh nhân và nhóm đối chứng để dịch các chuỗi protein. Nhiều chuỗi sắp xếp gen và protein đã được thực hiện bởi các công cụ ClustalW và kết quả căn chỉnh đã được sử dụng để tìm ra sự thay thế nucleotide và acid amin.

2.3.9. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu

Luận văn tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu trong Y học. Đối tượng nghiên cứu và gia đình hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu, có sự chấp thuận của đại diện đối tượng nghiên cứu và/hoặc gia đình đối tượng nghiên cứu.

Các gia đình đối tượng nghiên cứu có thể rút khỏi nghiên cứu khi không muốn tham gia. Đại diện gia đình đối tượng nghiên cứu được thông báo kết quả xét nghiệm, đồng thời giải thích về khả năng tiến triển của bệnh.

Các thông tin của đối tượng nghiên cứu và gia đình sẽ được đảm bảo bí mật (các thông tin bao gồm cả phần hỏi bệnh, khám bệnh và kết quả xét nghiệm chỉ được trao đổi riêng cho đối tượng nghiên cứu và người đại diện gia đình của đối tượng nghiên cứu).

Nghiên cứu được tiến hành hoàn toàn vì mục đích khoa học, lợi ích của

đối tượng nghiên cứu và gia đình.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

3.1.1. Phân bố bệnh nhân Parkinson theo độ tuổi và giới tính

Theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện, những bệnh nhân Parkinson đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ, chúng tôi đã thu được 32 bệnh nhân có đầy đủ thông tin để phục vụ nghiên cứu này.

Đặc điểm chung về độ tuổi và giới tính của nhóm bệnh nhân nghiên

cứu được trình bày trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Phân bố bệnh nhân theo độ tuổi và giới tính

Giới Nam Nữ Tổng

Tuổi n % % n % n

4 17,4% 44,45% 8 25% 4 < 60

13 56,5% 33,33% 16 50% 3 60-69

6 26,1% 22,22% 8 25% 2 ≥ 70

71,875% 28,125% 100% Tổng 23 32 9

64,91 ± 6,338 62,44 ± 7,196 64,22 ± 6,568

Tuổi trung bình

Thống kê trong Bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ bệnh nhân thu thập được phân bố theo giới là: nam (23)/nữ (9) ≈ 2,56. Tỷ lệ này khá tương đồng với những nghiên cứu của Elisabetta Pupillo và cộng sự năm 2016 [64] tại Italia là 2,17; Cao Hữu Hân và cộng sự năm 2010 [65] trong nghiên cứu cơ cấu bệnh tại khoa Nội Thần kinh Bệnh viện 103 từ năm 2004 đến năm 2008 là 2,7; Nhữ Đình Sơn (2004), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và một số yếu tố nguy cơ của bệnh Parkinson là 2,25 [28].

Theo kết quả của nhiều nghiên cứu về dịch tễ bệnh Parkinson, chúng

tôi đưa ra lý giải cho sự khác biệt về tỷ lệ mắc bệnh của hai giới như sau:

+ Do đặc tính nghề nghiệp và môi trường làm việc của nam giới tiếp xúc với nhiều yếu tố nguy cơ gây thoái hóa thần kinh nguyên phát, bao gồm: tiếp xúc với các chất độc sử dụng trong công nghiệp và các sản phẩm phụ thải ra trong quá trình sản xuất; tiếp xúc với các hóa chất có tính oxy hóa cao;…. Trong các nhóm nghề nghiệp có nguy cơ mắc bệnh Parkinson cao (nông dân, công nhân gỗ, thợ sơn và luyện kim tiếp xúc thường xuyên với thuốc trừ sâu, dung môi và kim loại), số lượng nam giới tham gia cũng nhiều hơn nữ giới.

+ Ngoài ra, có nhiều các nghiên cứu lâm sàng ở người đã chứng minh estrogen (một nhóm các hợp chất steroid đóng vai trò là hormon sinh dục nữ chính) là một yếu tố gây nên sự khác biệt trong phân bố giới tính của bệnh Parkinson. Estrogen có thể bảo vệ thần kinh. Các cơ chế mà estrogen có thể bảo vệ thần kinh bao gồm việc kích hoạt con đường protein kinase hoạt hóa mitogen, điều chế biểu hiện Bcl-x (L) và/hoặc hiệp lực với chất thu hồi gốc tự do là glutathione [66].

+ Một số nghiên cứu liên kết di truyền gần đây đã xác định vị trí gen Parkin, là một gen nhạy cảm với bệnh Parkinson nằm trên nhiễm sắc thể X, một phát hiện có khả năng giải thích tỷ lệ mắc bệnh Parkinson cao hơn ở nam giới [67].

Tuổi của nhóm bệnh chủ yếu ở lứa tuổi từ 60 đến 69 tuổi (50%) với giá trị trung bình là 64,22 ± 6,568. Kết quả này cũng phù hợp với những nghiên cứu trước đây là: độ tuổi mắc bệnh Parkinson thường gặp từ 60 đến 70 tuổi [64], [65], [30]. Cơ sở của việc phân chia nhóm tuổi trong nghiên cứu này xuất phát từ nghiên cứu về các bệnh liên quan đến quá trình thoái hóa não của R. Peters (2006) [68] chứng minh rằng nhóm tuổi bắt đầu xuất hiện thoái hóa não là trên 45 tuổi; lứa tuổi hứng chịu những hậu quả do quá trình thoái hóa não gây nên là trên 60 tuổi, biểu hiện bởi những bệnh thoái hóa não điển hình như Alzheimer, Parkinson, bệnh sa sút trí tuệ,…

3.1.2. Phân bố bệnh nhân theo thời gian mắc bệnh và giai đoạn

bệnh

Đối với bệnh Parkinson, việc xác định thời gian bắt đầu mắc bệnh và giai đoạn của bệnh có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng. Các chỉ số này giúp bác sỹ trong việc đánh giá quá trình tiến triển của bệnh, điều chỉnh các phác đồ điều trị cho phù hợp với từng bệnh nhân. Chúng tôi đã thống kê thời gian mắc bệnh và các giai đoạn bệnh của 32 bệnh nhân Parkinson. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Phân bố bệnh nhân theo thời gian mắc bệnh và giai đoạn bệnh

Giai đoạn

I

II

III

IV

V

Tổng

(n=32)

Thời gian

< 3 năm

19 3-5 năm

8 > 5 năm

5 1,00 1,25 ± 0,463 4 ± 2,309 8 ± 4,243 0 3 ± 2,627

Thời gian mắc bệnh trung bình (năm)

Kết quả Bảng 3.2 cho thấy thời gian mắc bệnh của nhóm bệnh chủ yếu là dưới 3 năm (n=19 chiếm 59,4%), nhóm bệnh nhân này cũng đang ở những giai đoạn đầu của bệnh Parkinson (giai đoạn I, II, III). Kết quả này tương đồng với nghiên cứu trước đó của Nhữ Đình Sơn (2004) [28] và Lê Đức Hinh (2008) [30] cho rằng bệnh Parkinson đã được quan tâm hơn trong cộng đồng. Người bệnh có ý thức hơn trong việc tự chăm sóc y tế và có những hiểu biết nhất định về bệnh Parkinson như triệu chứng khởi phát, các yếu tố nguy cơ, một số đặc điểm di truyền bệnh Parkinson,…do đó việc phát hiện bệnh Parkinson ngày càng sớm hơn, tạo điều kiện cho quá trình điều trị có hiệu quả hơn, tiên lượng tiến triển của bệnh chính xác hơn.

Thời gian mắc bệnh trung bình của các bệnh nhân Parkinson ở giai đoạn I là 1 năm; giai đoạn II là 1,25 ± 0,463 năm; giai đoạn III là 4 ± 2,309 năm và giai đoạn IV là 8 ± 4,243 năm. Mặc dù các bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu đã và đang được điều trị thường xuyên, liên tục theo phác đồ, nhưng kết quả thống kê trên cho thấy bệnh vẫn có thời gian tiến triển, điều này chứng tỏ rằng việc điều trị nội khoa chỉ làm chậm quá trình tiến triển của bệnh Parkinson chứ không thể chữa khỏi bệnh.

Không có bệnh nhân giai đoạn V trong quá trình chúng tôi lấy mẫu nghiên cứu. Nguyên nhân có thể do bệnh nhân Parkinson ở giai đoạn này diễn biến nặng, mất khả năng vận động kèm theo các rối loạn tâm thần,….Do vậy, để đảm bảo được chăm sóc thường xuyên và đầy đủ bệnh nhân thường được điều trị ngoại trú.

3.2. KHUẾCH ĐẠI VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CÁC EXON TRONG GEN DJ-1

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

Để tiến hành sàng lọc đột biến gen DJ-1, bước đầu tiên chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ các mẫu máu (32 mẫu bệnh và 5 mẫu chứng). Sau đó, DNA tổng số được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện trên Hình 3.1.

Hình 3.1. Kết quả điện di agarose kiểm tra tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu của 32 bệnh nhân Parkinson (E) và 5 mẫu chứng (C)

Mức độ đứt gãy của DNA tổng số sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng PCR sau này. Kết quả điện di cho thấy, DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu khác nhau đều cho một băng duy nhất, rõ nét. Chất lượng DNA từ các mẫu khác nhau tương đối đồng đều và ổn định thể hiện qua các băng điện di có độ sáng cao, băng gọn, không bị đứt gãy và lẫn rất ít RNA. Các mẫu DNA tổng số đảm bảo yêu cầu chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Sau khi tách chiết DNA tổng số thành công, chúng tôi tiến hành xác định chất lượng của sản phẩm DNA bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Kết quả đo mật độ quang phổ hấp thụ cho thấy các mẫu DNA chúng tôi tách chiết được đều có giá trị A260/A280 ≈ 1,8 - 2,0 và nồng độ DNA dao động từ 200 đến 500 µg/ml đảm bảo yêu cầu dùng làm khuôn cho phản ứng PCR.

3.2.2. Khuếch đại các exon trong gen DJ-1

Với các mẫu DNA tổng số đạt yêu cầu, chúng tôi tiến hành pha loãng về nồng độ 10 µg/ml và sử dụng làm khuôn để tiến hành phản ứng PCR, nhằm khuếch đại toàn bộ các exon trên gen DJ-1: exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, exon 6 và exon 7.

Đối với kỹ thuật PCR, thiết lập được một chu trình nhiệt là một yếu tố quan trọng, đảm bảo cho sự giãn xoắn của phân tử DNA cũng như việc gắn mồi và kéo dài chuỗi trong mỗi chu kỳ. Sự thay đổi yếu tố nào đó trong chu trình nhiệt có thể sẽ thu được sản phẩm PCR không như mong muốn.

Trên cơ sở những nhận định đó, để thu được kết quả PCR tốt nhất, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các phản ứng PCR nhằm khuếch đại exon 2 với mẫu 5E có kết quả đo OD A260/280 = 1,92 với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau để tìm ra vùng nhiệt độ gắn mồi tốt nhất. Qua hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR của exon 2 trên bệnh nhân 5E chúng tôi nhận thấy, ở nhiệt độ gắn mồi 57oC sản phẩm PCR xuất hiện 2 băng với kích thước ~ 1 kb và 392 bp. Điều đó chứng tỏ phản ứng PCR diễn ra chưa đặc hiệu.

Tại nhiệt độ 59oC, 61oC và 63oC đều thu được một băng duy nhất kích thước 392 bp phù hợp với kích thước theo tính toán lý thuyết của exon 2, tuy

nhiên, băng sản phẩm PCR ở điều kiện 61oC sáng rõ hơn hẳn (Hình 3.2). Do đó, nhiệt độ gắn mồi tốt nhất của exon 2 là 61oC.

Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại và tinh sạch của exon 2 tại nhiệt độ 61oC, kích thước 392 bp trên gel agarose 1%; M: Marker 1Kb PLUS.

Từ kết quả thu được, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm với các mẫu còn lại có độ tinh sạch khác nhau. Nếu các băng DNA thu được khi điện di kiểm tra lên đặc hiệu, gọn, rõ nét, đúng kích thước dự đoán của đoạn DNA đích thì tiến hành phản ứng PCR với tất cả các mẫu DNA còn lại.

Tương tự, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các exon còn lại và đã thu được nhiệt độ gắn mồi cho kết quả tốt nhất và ổn định nhất cho mỗi exon như sau: exon 3 Tm = 58oC, exon 4 Tm = 58oC, exon 5 Tm = 60oC, exon 6 Tm = 61oC, exon 7 Tm = 58oC, đây chính là nhiệt độ gắn mồi chúng tôi đã thiết lập, sử dụng được trong chu trình nhiệt của phản ứng PCR với tất cả các mẫu nghiên cứu. Chu trình nhiệt của các exon 2, 3, 4, 5, 6, 7 được tổng hợp trong Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của các exon 2, 3, 4, 5, 6, 7 gen DJ-1

x 30 chu kỳ

Exon Chu trình nhiệt Exon Chu trình nhiệt

x 30 chu kỳ

94oC – 5 phút 94oC – 30s 61oC – 30s 2 72oC – 45s 72oC – 5 phút 4oC ~ + ∞ 94oC – 5 phút 94oC – 30s 60oC – 30s 5 72oC – 45s 72oC – 5 phút 4oC ~ + ∞

x 30 chu kỳ

94oC – 5 phút 94oC – 30s 58oC – 30s 3 72oC – 45s 72oC – 5 phút 4oC ~ + ∞ 94oC – 5 phút 94oC – 30s 61oC – 30s 6 72oC – 45s 72oC – 5 phút 4oC ~ + ∞

94oC – 5 phút 94oC – 30s 58oC – 30s 4 72oC – 45s 72oC – 5 phút 4oC ~ + ∞ 94oC – 5 phút 94oC – 30s 58oC – 30s 7 72oC – 45s 72oC – 5 phút 4oC ~ + ∞

Sau khi xác định được các điều kiện chạy PCR tối ưu nhất cho từng exon, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại các exon quan tâm. Sau đó, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%.

Kết quả thể hiện trên ảnh điện di trong Hình 3.3 cho thấy, sản phẩm PCR của các exon thu được rất đặc hiệu, chỉ cho một băng duy nhất, rõ nét, kích thước tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết. Mẫu đối chứng âm không thấy xuất hiện băng, chứng tỏ kết quả chúng tôi thu được đáng tin cậy, không lây nhiễm DNA từ bên ngoài trong quá trình thao tác. Như vậy, chúng tôi đã khếch đại thành công tất cả 6 exon của gen DJ-1, đảm bảo tiêu chuẩn cho các phản ứng tiếp theo.

Hình 3.3. Sản phẩm PCR sau tinh sạch của 6 exon nghiên cứu.

Điện di trên gel agarose 1%; M: Marker 1Kb PLUS.

A. Exon 2; B. Exon 3; C. Exon 4; D. Exon 5; E. Exon 6; F. Exon 7

3.2.3. Xác định trình tự các đoạn exon trong gen DJ-1

Mẫu đã khuếch đại trong quá trình phản ứng PCR sẽ được sử dụng làm khuôn và sử dụng chính các cặp mồi khuếch đại để thực hiện phản ứng giải trình tự. Quá trình thực hiện phản ứng và đọc kết quả được thực hiện tự động bởi hệ thống máy đọc trình tự Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer.

Chúng tôi nhận thấy tất cả các mẫu nghiên cứu được giải trình tự đều đạt yêu cầu. Tín hiệu giải trình tự có cường độ khá cao, không hề xuất hiện các tín hiệu phụ hay các tín hiệu chồng chéo (ví dụ như Hình 3.4), như vậy chất lượng đoạn giải trình tự là đủ điều kiện cho phân tích, trình tự thu được là đáng tin cậy.

Hình 3.4. Ví dụ kết quả giải trình tự exon 6 đủ độ tin cậy và được lựa chọn

3.3. PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN DJ-1

Kết quả giải trình tự được chúng tôi so sánh với trình tự tham chiếu của

gen DJ-1 trên Genbank có ký hiệu NC_000001.11.

Sau khi đối chiếu trình tự các exon gen DJ-1 chúng tôi thấy rằng, có 24 mẫu đột biến trong 32 mẫu bệnh. Kết quả các đột biến được xác định và không được xác định cụ thể như sau:

+ Không tìm thấy đột biến các exon 2, exon 3, exon 4 và exon 6 (kết quả phân tích được trình bày trong phần phụ lục). Kết quả phân tích không xác định đột biến trên exon 2, exon 3, exon 4 và exon 6 theo chúng tôi do đây là những đột biến hiếm, xảy ra với tỷ lệ rất thấp, khoảng 1% - 2% các trường hợp có đột biến gen DJ-1. Nghiên cứu Robert Hering và cộng sự (2004) [69] trên 104 bệnh nhân Parkinson khởi phát sớm ở Đức đã xác định được duy nhất một trường hợp đột biến exon 3 (c.192G>C), không phát hiện đột biến exon 4 và exon 6 trong 104 mẫu nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của Stephen Hague và cộng sự (2003) [70] được thực hiện trên 107 bệnh nhân Parkinson khởi phát sớm dưới 50 tuổi chỉ xác định được một trường hợp đột biến đột biến dị hợp tử, vô nghĩa (nonsense) c.56delC c.57G>A exon 2 của bệnh nhân mắc bệnh Parkinson, và không xác định đột biến trên các exon 3, exon 4, và exon 6. Những nghiên cứu này đều đi đến kết luận: các đột biến

xảy ra trên exon 2, exon 3, exon 4 và exon 6 đều là những đột biến hiếm khi xảy ra trong những trường hợp có đột biến gen DJ-1.

+ Đã xác định được đột biến exon 5 và exon 7 gen DJ-1.

+ Ngoài ra, đột biến còn được tìm thấy trên vùng không dịch mã

là intron 4 và intron 5.

Thông tin bệnh nhân và các đột biến được trình bày trong Bảng 3.4

Bảng 3.4. Thông tin bệnh nhân và các đột biến gen DJ-1

STT

ID

Tên

Giới tính

Tuổi

Giai đoạn

Đột biến

1E Nguyen Thi H

Nữ

III

- Intronn4, Exon 7

Pham Thi T

Nữ

- Intronn4, Intronn5

6E Nguyen Trung K

Nam

- Intronn4, Intronn5, Exon 5

7E Nguyen Viet H

Nam

III

- Intronn4, Intron 5, Exon 7

8E Hoang Van P

Nam

- Intronn4

9E Nguyen Duy M

Nam

III

- Intronn4, Intronn5

10E Ho Minh A

Nam

III

- Intronn4, Intronn5

12E Hoang H

Nam

- Intronn4, Intronn5

14E Quan Van T

Nam

III

- Intronn4

16E Le Huu K

Nam

- Intronn4

17E Le Van H

Nam

- Intronn4

18E Nguyen Dang D

Nam

III

- Intronn4

19E Nguyen Van Q

Nam

- Intronn4, Intronn5

21E Le Quang T

Nam

- Intronn4

22E Trinh Huu L

Nam

- Intronn4, Exon 7

23E Nguyen Dac C

Nam

III

- Intronn4, Intronn5

24E Dinh Van T

Nam

III

- Intronn4, Exon 7

25E Trieu Thi T

Nữ

- Intronn4, Intronn5

27E Nguyen Minh N

Nữ

III

- Intronn4, Intronn5

28E Nguyen Van T

Nam

III

- Intronn4, Intronn5

29E Nguyen Anh S

Nam

- Intronn4, Intronn5

30E Pham Hong N

Nam

- Intronn4, Intronn5

31E Dinh Van D

Nam

III

- Intronn4, Intronn5

32E Tran Hoang P

Nam

III

- Intronn4, Exon 7

Số liệu trong Bảng 3.4 cho thấy, đột biến exon 5 có 1 trường hợp, đột biến exon 7 có 5 trường hợp, đột biến intron 4 xảy ra ở tất cả các trường hợp có đột biến, trong đó đột biến duy nhất intron 4 có 6 trường hợp.

Đột biến 3 vị trí (bao gồm: intron 4, intron 5 và exon 5 hoặc 7) được

phát hiện ở hai bệnh nhân nam (6E; 7E).

Đột biến song song ở intron 4 và intron 5 là 12 trường hợp và đột biến

xảy ra ở intron 4 với exon 7 là 4 trường hợp.

Tham chiếu

Allele 1

Allele 2

Amino Acid 1

Amino acid 2

Vị trí cDNA

Vị trí Intron

Đột biến thay đổi

Tần số đột biến

Vị trí amino acid

Dị hợp tử(+)/ Đồng hợp tử(-)

257

284

413

138

411

137

c.257C>G p.A86G c.284A>T p.G95L c.413A>C p.H138P c.411A>T p.G137G IVS4+29T>G

IVS4+44G>A

IVS4+45G>A

IVS4+92T>C

109

IVS4+109G>T

-4

IVS5-4C>G

-5

IVS5-5A>G

-11

IVS5-11C>T

-12

IVS5-12T>C

-13

IVS5-13T>C

-14

IVS5-14T>C

-15

IVS5-15T>C

-16

IVS5-16G>T

-24

IVS5-24T>G

-38

IVS5-38A>C

-49

IVS5-49T>C

IVS5+30G>A

IVS5+33A>T

IVS5+41G>T

-17

IVS6-17T>G

-18

IVS6-18T>G

-28

IVS6-28A>C

Bảng 3.5. Các đột biến được xác định trên 6 exon của gen DJ-1

3.3.1. Kết quả xác định các đột biến trên exon 5 gen DJ-1

Sự khác biệt về trình tự gen xảy ra ở exon 5 được biểu hiện ở bệnh

nhân Parkinson 6E cùng với 2 đột biến song song ở vùng intron 4 và 5.

Hai đột biến dị hợp tử của exon 5 cho thấy sự thay đổi trình tự acid amin Ala86Gly (c.257C>G; p.A86G), Gln95Leu (c.284A>T; p.G95L) được trình bày trong Hình 3.5 và Bảng 3.5.

Đối chiếu với các triệu chứng lâm sàng điển hình tại thời điểm thu thập bệnh nhân nghiên cứu chúng tôi thấy: bệnh nhân 6E (67 tuổi, bị bệnh khoảng 1 năm, biểu hiện ban đầu là triệu chứng run cả 2 tay, giai đoạn II) được chẩn đoán xác định là bệnh Parkinson khởi phát muộn, đối xứng 2 bên, bệnh tiến triển nhanh, có rối loạn nhận thức (trí nhớ kém) và rối loạn tâm thần (luôn lo lắng, bồn chồn và rối loạn giấc ngủ), đáp ứng kém (coi như không đáp ứng) với thuốc điều trị levodopa (Bảng 3.7).

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khi được so sánh với nghiên cứu gần nhất của Abbas và cộng sự (2016) [71] cho thấy có sự khác biệt trong các trường hợp đột biến exon 5.

Trong nghiên cứu của Abbas, có năm đột biến đồng hợp tử sai nghĩa đã được tìm thấy. Một trường hợp đột biến c.313A>T, p. Ile105Phe và bốn trường hợp đột biến c.293G>A, p.Arg98Gln.

+ Đối với trường hợp đột biến c.313A>T, p. Ile105Phe, tác giả liên hệ với các triệu chứng lâm sàng nhận thấy sự khởi phát của bệnh là không đối xứng hai bên, đáp ứng của bệnh nhân với levodopa chậm gây hậu quả bệnh nhân giảm vận động tiến triển nhanh.

+ Đối với bốn trường hợp đột biến c.293G>A, p.Arg98Gln, bệnh Parkinson khởi phát sớm, đối xứng hai bên và đáp ứng tốt với levodopa.

Hình 3.5. Trình tự acid amin exon 5 của các mẫu bệnh

và vị trí acid amin đột biến

Chúng tôi đưa ra nhận định sau: các đột biến sai nghĩa được tìm thấy của exon 5 đều ở dạng chuyển nhóm (giữa các nhóm phân cực và không phân cực), hậu quả gây ảnh hưởng đến khả năng cuộn gập và hình thành nên cấu trúc bậc cao hơn, do đó ảnh hưởng tới chức năng của protein hoàn chỉnh. Đồng thời trường hợp này có xảy ra đột biến intron 4 và intron 5 kèm theo. Đột biến phối hợp giữa exon và intron có thể là nguyên nhân gây nên những triệu chứng lâm sàng điển hình như: thời điểm và đặc điểm khởi phát bệnh, đáp ứng kém với thuốc điều trị đặc hiệu (levodopa),...

3.3.2. Kết quả xác định các đột biến exon 7 gen DJ-1

Kết quả giải trình tự và phân tích cho thấy có năm đột biến exon 7 trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu. Bệnh nhân (1E; 22E; 24E và 32E) có đột biến ở exon 7 và intron 4. Bệnh nhân 7E cho thấy có ba đột biến được phát hiện ở intron 4; intron 5 và exon 7 (Bảng 3.5 và Hình 3.6).

Hình 3.6. Trình tự acid amin exon 7 của các mẫu bệnh

và vị trí acid amin đột biến

Kết quả này cũng cho chúng ta thấy rõ hơn về hai đột biến tại exon 7 của bệnh nhân 1E, chỉ một đột biến nucleotide dẫn đến thay đổi acid amin ở vị trí 138, Histidine bị thay đổi thành Proline (c.413A>C p. H138P). Ở bốn đột biến khác, không có hiện tượng biến đổi acid amin trong khi Glycine không đổi (c.411A>T p. G137G) được trình bày trong Bảng 3.5.

Đối chiếu với giai đoạn bệnh và những triệu chứng lâm sàng trên bệnh nhân (Bảng 3.4 và Bảng 3.7), chúng tôi nhận thấy nhóm bệnh nhân có đột

biến exon 7 phân bố ở 3 nhóm tuổi, có bốn trường hợp đang ở giai đoạn III (1E ; 7E ; 24E ; 32E), một trường hợp mới phát hiện ở giai đoạn I (22E). Nhìn chung trên lâm sàng, những bệnh nhân đang ở giai đoạn III có các dấu hiệu rối loạn vận động biểu hiện rõ như run, rối loạn tư thế, rối loạn thăng bằng, và sa sút trí tuệ khá trầm trọng. Bệnh nhân giai đoạn I các triệu chứng thay đổi chưa điển hình.

Kết quả của chúng tôi cũng có khác biệt so với nghiên cứu của Macedo và cộng sự (2009) [72] khi nghiên cứu của Macedo xác định có hai đột biến exon 7 là: một đột biến đồng hợp tử mất đoạn 3 nucleotide ở exon 7 dẫn đến loại bỏ Proline được bảo tồn cao c.555-557delGCC; p.P158del, và 1 đột biến dị hợp tử sai nghĩa c.535G>A; p.A179T. Dựa trên những thống kê lâm sàng, Macedo đã kết luận: những đột biến trên exon 7 như xóa đồng hợp tử dẫn đến mất Proline (P158Del) có thể gây ra những thay đổi về cấu trúc khiến DJ-1 không ổn định và/hoặc không hoạt động. Đột biến dị hợp tử sai nghĩa A179T dẫn đến sự thay thế Alanin kỵ nước bằng một gốc Threonine ưa nước phân cực nằm trong chuỗi xoắn H ở đầu C (C-terminal). Hai đột biến này có thể đã gây nên những rối loạn vận động, nhận thức và tâm thần trên bệnh nhân. Đối với trường hợp đột biến c.555–557delGCC; p.P158del, bệnh nhân run nhiều, kết hợp rối loạn nhận thức tiến triển nhanh. Đối với trường hợp đột biến c.535G>A; p.A179T, bệnh nhân run kết hợp với những triệu chứng suy nhược thần kinh. Các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân Parkinson theo nghiên cứu của Macedo và cộng sự (2009) được liệt kê trong Hình 3.7.

Hình 3.7. Đặc điểm lâm sàng những trường hợp đột biến exon 7 gen DJ-1

3.3.3. Đột biến intron 4 và intron 5 gen DJ-1

Trong quá trình giải trình tự và xác định đột biến các exon gen DJ-1, chúng tôi phát hiện xảy ra những đột biến trên một số vùng không mã hóa là: intron 4 và intron 5 (kết quả phân tích đột biến được trình bày trong phần Phụ lục).

Kết quả phân tích được tổng hợp trong Bảng 3.5 cho thấy: 1 đột biến được tìm thấy ở vùng biên intron của các exon, 24 đột biến xuất hiện ở intron 4 và 14 đột biến xuất hiện ở intron 5. Có 5 đột biến dị hợp tử ở intron 5 (bao gồm, IVS5 + 33A>T ở 1 bệnh nhân, IVS5 + 41G>T ở 7 bệnh nhân, IVS6- 17T>G ở 1 bệnh nhân, IVS6-18T>G ở 1 bệnh nhân và IVS6-28A>C ở 1 bệnh nhân) và 1 đột biến đồng hợp tử ở intron 5 (bao gồm, IVS5 + 30G>A ở 7 bệnh nhân Parkinson). Ngoài ra, chúng tôi tìm thấy 11 đột biến dị hợp tử ở intron 4 (IVS5-11C>T ở 8 bệnh nhân, IVS5-49T>C ở 4 bệnh nhân, IVS5- 12T>C ở 3 bệnh nhân, IVS5-13T>C ở 2 bệnh nhân, IVS5- 4C>G ở 1 bệnh nhân, IVS5-5A>G ở 1 bệnh nhân, IVS5-14T>C ở 1 bệnh nhân, IVS5-15T>C ở 1 bệnh nhân, IVS5-16G>T ở 1 bệnh nhân, IVS5-24T>G ở 1 bệnh nhân, và IVS5-38A>C ở 1 bệnh nhân); Trong đó, ba đột biến trong số năm đột biến đồng hợp tử ở intron 4 được tìm thấy ở tất cả bệnh nhân Parkinson, bao gồm IVS4 + 29T>G, IVS4 + 44G>A và IVS4 + 45G>A.

Đối chiếu với các triệu chứng lâm sàng trên nhóm bệnh nhân (Bảng 3.7) này chúng tôi nhận thấy: bệnh nhân chỉ đột biến intron 4 (6/6 trường hợp) hoặc đột biến intron 4 kết hợp intron 5 (12/12 trường hợp) đều khởi phát bệnh Parkinson không đối xứng hai bên. Đột biến kết hợp intron 4 và intron 5 thì các triệu chứng lâm sàng điển hình như: rối loạn nhận thức là 10/12 trường hợp, rối loạn tâm thần là 9/12 trường hợp và đáp ứng levodopa là 10/12 trường hợp; đa số cao hơn so với những trường hợp chỉ đột biến intron 4 lần lượt là: 3/6 trường hợp , 4/6 trường hợp và 5/6 trường hợp.

Trong nghiên cứu của Tarantino và cộng sự (2009) [73], đột biến xảy ra trên intron 4 là một đột biến dị hợp tử, khi một nucleotide bị chèn vào trình tự được bảo tồn của intron 4 (IVS4 + 3insA). Đột biến này có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình nối intron hoặc có thể dẫn đến sự tích tụ của tiền RNA

chưa được giải mã trong nhân. Việc kích hoạt vị trí đột biến thay thế cũng có thể làm phát sinh các mRNA và đồng dạng protein khác nhau có những thay đổi cả về cấu trúc và chức năng. Khi đánh giá hiệu quả phiên mã để xác định xem liệu cả hai đột biến không mã hóa có ảnh hưởng đến biểu hiện gen DJ-1 hay không, nhóm tác giả đã quan sát thấy mức cDNA thấp hơn trong nhóm đối tượng nghiên cứu cũng như ở họ hàng của họ so với nhóm đối chứng. Đặc biệt, ở cả hai trường hợp mang đột biến dị hợp tử g.159C>G thì số lượng cDNA giảm rõ rệt. Từ kết quả nghiên cứu của mình, tác giá đã đưa ra giả thuyết rằng tình trạng lâm sàng như rối loạn tâm thần, rối loạn giấc ngủ,… của bệnh nhân có đột biến intron 4 có thể là do tác động kết hợp của cả hai đột biến, trong đó alen IVS4 + 3insA đóng vai trò gây bệnh quan trọng hơn so với alen g.159C>G.

Nghiên cứu của Erer và cộng sự (2016) [74] khi phân tích đột biến gen DJ-1 trên 50 bệnh nhân Parkinson khởi phát sớm ở Thổ Nhĩ Kỳ đã tìm được 3 trường hợp đột biến gen DJ-1, tuy nhiên những đột biến này chỉ xảy ra trên các intron. Một đột biến dị hợp tử intron 4 (IVS4+30 c.252+30 T>G), một đột biến đồng hợp tử intron 5 (VS5+4 c.322+4 A>C) và một đột biến dị hợp tử intron 5 (IVS6-14 c.323-14 A>G). Do số lượng đột biến tìm được nhỏ (3 trường hợp), nhóm nghiên cứu đã kết luận: chưa có mối liên hệ rõ ràng giữa các biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân và yếu tố đột biến trên intron 4 và intron 5 của gen DJ-1. Tuy nhiên, những bệnh nhân có đột biến intron 4 và intron 5 có những đặc điểm lâm sàng đặc trưng như: đáp ứng kém với levodopa, rối loạn nhận thức và rối loạn giấc ngủ.

Những kết quả nghiên cứu trên đã chứng minh những nhận định mới về

vai trò của các intron như sau [75]:

+ Trình tự của các intron bị đột biến thường không biểu hiện ở chuỗi polypeptide. Vì vậy có thể xem như intron là một nhân tố giúp ổn định vật chất di truyền. Tuy nhiên, một số đột biến ở intron có thể ngăn cản sự cắt bỏ intron, do đó tạo nên phân tử mRNA sai hỏng, không được dùng để tổng hợp protein.

+ Các intron không những chỉ có chức năng cắt bỏ một phân tử khỏi tiền RNA mà còn có thể tự mã hóa các protein cụ thể hoặc được xử lý sau phiên mã. Sự ghép nối thay thế thường được sử dụng để tạo ra nhiều protein từ một gen duy nhất.

+ Một số intron có tác dụng tăng cường sự biểu hiện của gen mà chúng tham gia bởi một quá trình được gọi là sự tăng cường qua trung gian intron (IME- Intron Mediated Enhancement).

+ Intron có chức năng làm thay đổi khả năng biểu hiện của gen.

3.4. ĐỐI CHIẾU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG ĐIỂN HÌNH TRÊN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU

Sau khi xác định nhóm bệnh nhân có xảy ra đột biến gen DJ-1 (24 mẫu). Chúng tôi đối chiếu một số đặc điểm lâm sàng điển hình như Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Một số triệu chứng lâm sàng của nhóm bệnh nhân Parkinson

Nhóm Có đột biến (24) Không đột biến (8) P

Triệu chứng % n n %

91,67% 22 8 100% > 0,05

Khởi phát không đối xứng

75% 18 4 50% Rối loạn nhận thức > 0,05

75% 18 4 50% Rối loạn tâm thần > 0,05

20 7 83,33% 87,5% Đáp ứng levodopa > 0,05

Kết quả Bảng 3.6 cho thấy những trường hợp triệu chứng của bệnh Parkinson xuất hiện không đối xứng ở nhóm có đột biến là 91,67%, ở nhóm không có đột biến là 100%. Kết quả này cũng tương đồng với nhiều nghiên cứu trên thế giới. Cho rằng, một triệu chứng chính để chẩn đoán xác định bệnh Parkinson là khởi phát không đối xứng hai bên cơ thể. Triệu chứng này đã được liệt kê là một trong ba triệu chứng quan trọng để chẩn đoán bệnh Parkinson của Hội Ngân hàng Não và Parkinson, Vương quốc Anh [56].

Các triệu chứng rối loạn nhận thức, rối loạn tâm thần, và khả năng đáp ứng levodopa ở cả hai nhóm có đột biến và không có đột biến khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P > 0,05. Có thể do cỡ mẫu nhỏ nên kết quả thống kê còn chưa có nhiều khác biệt. Tuy nhiên, trên một số bệnh nhân có đột biến kết hợp, các triệu chứng lâm sàng điển hình đều xuất hiện và tiến triển nhanh.

Để thống kê đầy đủ, kết hợp giữa những trường hợp mẫu có đột biến gen DJ-1 và các triệu chứng lâm sàng điển hình, chúng tôi đã chia số mẫu có đột biến thành 4 nhóm và liệt kê các triệu chứng lâm sàng điển hình đối với các nhóm như Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Đối chiếu một số đặc điểm lâm sàng trên nhóm bệnh nhân

có đột biến gen DJ-1

Triệu

Không đối xứng

Rối loạn nhận thức

Rối loạn tâm thần

Đáp ứng levodopa

chứng

Nhóm

6 (+)

3 (+)

4 (+)

5 (+)

Đột biến

3 (-)

2 (-)

1 (-)

intron 4 (6)

12 (+)

10 (+)

9 (+)

10 (+)

Đột biến

2 (-)

3 (-)

2 (-)

intron 4, 5 (12)

1 (-)

1 (+)

1 (-)

Đột biến exon 5, intron 4, 5 (1)

1 (-)

1 (+)

Đột biến exon 7, intron 4, 5 (1)

4 (+)

3 (+)

4 (+)

Đột biến exon 7, intron 4 (4)

1 (-)

Kết quả Bảng 3.7 cho thấy, 2 trường hợp có đột biến kết hợp intron 4 và intron 5 với exon 5 hoặc exon 7 đều khởi phát đối xứng 2 bên (bệnh nhân 6E và 7E), kiểu khởi phát này là kiểu không điển hình theo Nhữ Đình Sơn (2004) [28], Lê Đức Hinh (2008) [30]. Khám lâm sàng hai bệnh nhân này còn phát hiện các triệu chứng rối loạn nhận thức và rối loạn tâm thần điển hình

của bệnh teo não lan tràn. Chúng tôi nhận định hai bệnh nhân mắc bệnh Parkinson kèm theo teo não lan tràn có thể là hệ quả của đột biến kết hợp giữa các exon và các intron.

Có 18/20 trường hợp rối loạn nhận thức và 18/20 trường hợp rối loạn tâm thần cho thấy rằng: dù chỉ là những triệu chứng thứ phát nhưng xảy ra trên phần lớn những trường hợp có đột biến.

Có 4 trường hợp đáp ứng kém (được coi là không đáp ứng) với levodopa xảy ra trên những mẫu bệnh nhân có đột biến intron 4; intron 4 và intron 5; intron 4, intron 5 và exon 5. Kết quả này khá tương đồng với nghiên cứu của Abbas và cộng sự (2016) [71], Erer và cộng sự (2016) [74] khi thấy một số bệnh nhân Parkinson có đột biến exon 5, intron 4 và intron 5 gen DJ-1 đáp ứng kém với thuốc điều trị đặc hiệu levodopa.

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

4.1.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu

- Tỷ lệ bệnh nhân thu thập được phân bố theo giới là: nam/nữ ≈ 2,56.

- Tuổi của nhóm bệnh chủ yếu ở lứa tuổi từ 60 đến 69.

- Thời gian mắc bệnh của nhóm bệnh chủ yếu là dưới 3 năm.

- Thời gian mắc bệnh trung bình của các bệnh nhân Parkinson ở các

giai đoạn tăng dần.

4.1.2. Phân tích và đánh giá các đột biến gen DJ-1 và đối chiếu lâm

sàng trên bệnh nhân Parkinson

- Đã phát hiện đột biến trên 24 mẫu bệnh.

- Trong 24 mẫu đột biến, không thấy có đột biến của các exon 2, exon 3,

exon 4 và exon 6.

- Đột biến exon 5 xảy ra 1 trường hợp với 2 đột biến dị hợp tử. Đối chiếu thấy có sự tương đồng với một số biểu hiện lâm sàng trên bệnh nhân như: thời điểm khởi phát muộn và đặc điểm khởi phát đối xứng hai bên và đáp ứng kém với thuốc đặc trị levodopa.

- Đột biến exon 7 có 5 trường hợp. Đối chiếu thấy có sự tương đồng với một số đặc điểm lâm sàng trên bệnh nhân như: rối loạn vận động, rối loạn nhận thức và rối loạn tâm thần.

- Đột biến trên các intron 4, 5 cũng được xác định. Trong các trường hợp đột biến intron 4 và intron 5 có những trường hợp đột biến kết hợp với exon 5 hoặc exon 7. Khi đối chiếu với những triệu chứng lâm sàng điển hình nhận thấy trên những bệnh nhân này có các triệu chứng rối loạn nhận thức và rối loạn tâm thần rất nặng và tiến triển nhanh.

4.2. KIẾN NGHỊ

- Các nghiên cứu tiếp theo cần có cỡ mẫu lớn hơn.

- Phân tích trên nhiều gen hơn và có thể phân tích toàn bộ hệ gen biểu

hiện của bệnh nhân Parkinson.

- Cần khảo sát một nhóm bệnh nhân có yếu tố gia đình để đánh giá di

truyền của các đột biến.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Michela Zaltieri, Francesca Longhena, Marina Pizzi, Cristina Missale, PierFranco Spano, and Arianna Bellucci. (2015). Mitochondrial Dysfunction and -Synuclein Synaptic Pathology in Parkinson’s Disease: Who’s on First?. Parkinson’s Disease, Volume 2015, Article ID 108029, 10 pages.

Fahn S. (2003). Description of Parkinson's disease as a clinical syndrome, Ann N Y Acad Sci, 991: 1-14.

3. Ole-Bjørn Tysnes, Anette Storstein. (2017). Epidemiology of

Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna);124(8):901-905.

Trần NT. (2017). Người trẻ mắc bệnh Parkinson. Bệnh viện Đại học Y dược TP.HCM. Nhà xuất bản Y dược Tp. Hồ Chí Minh.

Farrer MJ. (2006). Genetics of Parkinson disease: paradigm shifts and future prospects. Nat Rev Genet, 7: 306-18.

6. Klein C, Djarmati A, Hedrich K, Schafer N, Scaglione C, Marchese R, Kock N, Schule B, Hiller A, Lohnau T, Winkler S, Wiegers K, Hering R, Bauer P, Riess O, Abbruzzese G, Martinelli P, Pramstaller PP. (2005). PINK1, Parkin, and DJ-1 mutations in Italian patients with early-onset Parkinsonism. Eur J Hum Genet 13: 1086-93.

7. Mitsumoto A, Nakagawa Y. (2001). DJ-1 is an indicator for endogenous reactive oxygen species elicited by endotoxin. Free Radic Res 35: 885-893.

8. Nirit Lev, Dusan Roncevich, Debby Ickowicz, Eldad Melamed, and Daniel Offen. (2006). Role of DJ-1 in Parkinson’s Disease, Journal of Molecular Neuroscience 42:56-64.

Ludmila P. Dolgacheva & Alexey V. Berezhnov & Evgeniya I. Fedotova & Valery P. Zinchenko & Andrey Y. Abramov. (2019). Role of DJ-1 in the mechanism of pathogenesis of Parkinson's disease, Journal of Bioenergetics and Biomembranes 51:175–88.

10. Betarbet R, Sherer TB, Greenamyre JT. (2005). Ubiquitin-proteasome system and Parkinson's diseases. Exp Neurol 191 Suppl 1: S17-27.

11. Dias V, Junn E, Mouradian MM. (2013). The role of oxidative stress in

Parkinson's disease. J Parkinsons Dis 3(4): 461-91.

12. Winklhofer KF, Haass C. (2010). Mitochondrial dysfunction in

Parkinson's disease, Biochim Biophys Acta 1802(1): 29-44.

13. D. A. Loeffler J. R. Connor P. L. Juneau B. S. Snyder L. Kanaley A. J. DeMaggio H. Nguyen C. M. Brickman P. A. LeWitt. (1995). Transferrin and Iron in Normal, Alzheimer's Disease, and Parkinson's Disease Brain Regions. Journal of Neurochemistry. Vol 65, Issue2, Pp 710-16.

14. Peter Jenner, C. Warren Olanow. (1996). Oxidative stress and the

pathogenesis of Parkinson's disease. Neurology; 47(Suppl 3): S161-70.

15. Jeswinder Sian BSc David T. Dexter PhD Andrew J. Lees FRCP

Susan Daniel MRCPath Yves Agid MD, PhD France Javoy‐Agid PhD Peter Jenner DSc C. David Marsden FRS. (1994). Alterations in glutathione levels in Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders affecting basal ganglia. Annals of Neurology. Vol 36, Issue3. Pp 348-55.

16. Z. I. Alam A. Jenner S. E. Daniel A. J. Lees. (1997). Oxidative DNA Damage in the Parkinsonian Brain: An Apparent Selective Increase in

in Substantia Nigra. Journal of

8‐Hydroxy guanine Levels Neurochemistry. Vol 69, Issue3. Pp 1196-1203.

17. Joseph Rogers Carl J. Kovelowski. (2003). Inflammatory Mechanisms in Parkinson’s Disease. Neuroinflammation, Pp 391-403. Humana Press.

18. Dr E. C. Hirsch PhD S. Hunot PhD P. Damier MD, PhD B. Faucheux PhD. (2014). Supplement: Cell Death and Neuroprotection in Parkinson's Disease. Annals of Neurology. Vol 44, IssueS1. Pages S115-S120.

19. Shin-ichiro Ikebe, Masashi Tanaka, Takayuki Ozawa. (1995). Point mutations of mitochondrial genome in Parkinson's disease. Molecular Brain Research, Vol 28 (2), Pp 281-95.

20. Nalls MA, Pankratz N, Lill CM, Do CB, Hernandez DG, Saad M, DeStefano AL, Kara E, Bras J, Sharma M, Schulte C, Keller MF, Arepalli S, Letson C, Edsall C, Stefansson H, Liu X, Pliner H, Lee JH, Cheng R, Xiromerisiou G, Myers RH, Clark LN, Stefansson K, Hardy JA, Heutink P, Chen H, Wood NW, Scott WK, Gasser T, Bertram L, Eriksson N, Foroud T, Singleton AB. (2014). Large-scale meta-analysis of genome-wide association data identifies six new risk loci for Parkinson's disease. Nat Genet 46: Pp 989-93.

21. Lesage S, Brice A. (2009). Parkinson's disease: from monogenic forms

to genetic susceptibility factors. Hum Mol Genet 18: Pp 48-59.

22. Kang L, Zheng HX, Zhang M, Yan S, Li L, Liu L, Liu K, Hu K, Chen F, Ma L et al. (2016). MtDNA analysis reveals enriched pathogenic mutations in Tibetan highlanders. Scientific reports 6: R31-R83.

23. Elstner M, Morris CM, Heim K, Lichtner P, Bender A, Mehta D, Schulte C, Sharma M, Hudson G, Goldwurm S et al. (2009). Single-cell expression profiling of dopaminergic neurons combined with association analysis identifies pyridoxal kinase as Parkinson's disease gene. Annals of neurology 66 (6): Pp 792-98.

24. Bonifati V. (2007). LRRK2 low-penetrance mutations (Gly2019Ser) and risk alleles (Gly2385Arg)-linking familial and sporadic Parkinson's disease. Neurochem Res 32(10): Pp 1700-1708.

25. Bonifati V. (2014). Genetics of Parkinson's disease-state of the art.

Parkinsonism & related disorders 20 Suppl 1: S23-S28.

26. Sidransky E, Nalls MA, Aasly JO, Aharon-Peretz J, Annesi G, Barbosa ER, Bar-Shira A, Berg D, Bras J, Brice A, Chen CM, Clark LN, Condroyer C, De Marco EV, Durr A, Eblan MJ, Fahn S, Farrer MJ, Fung HC, Gan-Or Z, Gasser T, Gershoni-Baruch R, Giladi N, Griffith A, Gurevich T, Januario C, Kropp P, Mitsui J, Mizuta I, Nicoletti G, Oliveira C, Ottman R, Orr-Urtreger A, Pereira LV, Quattrone A, Rogaeva E, Rolfs A, Rosenbaum H, Rozenberg R, Samii A, Samaddar T, Schulte C, Sharma M, Singleton A, Spitz M, Tan EK, Tayebi N, Toda T, Troiano AR, Tsuji S, Wittstock M, Wolfsberg TG, Wu YR, Zabetian CP, Zhao Y, Ziegler SG. (2009). Multicenter analysis of glucocerebrosidase mutations in Parkinson's disease. N Engl J Med 361: Pp 1651-1661.

27. Trần Công Thắng. (2017). Sa sút trí tuệ ở bệnh nhân Parkinson và cách xử trí. Hội nghị khoa học kỹ thuật lần 34 đại học y dược 2017: trang 34-42. Nhà xuất bản Y – Dược Tp. Hồ Chí Minh.

28. Nhữ Đình Sơn. (2004). Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và một số yếu tố nguy cơ của bệnh Parkinson. Học viện Quân y, Vol Luận án Tiến sĩ Y học Hà Nội.

29. Nguyễn Thế Anh. (2008). Nghiên cứu một số đặc điểm chức năng nhận thức ở bệnh nhân Parkinson cao tuổi. Trường ĐHY Hà Nội, Vol Luận văn Thạc sĩ Y học Hà Nội.

30. Lê Đức Hinh. (2008). Bệnh Parkinson. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

31. Nguyễn Thanh Bình. (2010). Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và nồng độ dopamine huyết tương ở bệnh nhân tâm thần phần liệt thể Paranoid. Học viện Quân Y, Vol Luận án Tiến sĩ Y học Hà Nội.

32. Farrer MJ, Haugarvoll K, Ross OA, Stone JT, Milkovic NM, Uitti RJ, Toft M. (2006). Genomewide association, Parkinson disease, and PARK10. Am J Hum Genet 78: 1084-8; author reply 1092-1094.

33. Patrick M Abou-Sleiman, Daniel G Healy, Nicholas W Wood. (2004). Causes of Parkinson's disease: genetics of DJ-1. Cell Tissue Res 10; 318(1): Pp 185-89.

34. Sourav Bandyopadhyay, Mark R Cookson. (2004). Evolutionary and functional relationships within the DJ-1 superfamily, BMC Evol Biol. 2 19;4:6.

35. D Nagakubo, T Taira, H KiTAUra, M Ikeda, K Tamai, S M Iguchi- Ariga, H Ariga. (1997). DJ-1, a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation with ras. Biochem Biophys Res Commun 2 13;231(2): Pp 509-13.

36. Shendelman S, Jonason A, Martinat C, Leete T, Abeliovich A. (2004). DJ-1 is a redox-dependent molecular chaperone that inhibits SNCA aggregate formation. PLoS Biol 2: e362.

37. Bonifati V, Dekker MC, Vanacore N, Fabbrini G, Squitieri F, Marconi R, Antonini A, Brustenghi P, Dalla Libera A, De Mari M, Stocchi F, Montagna P, Gallai V, Rizzu P, van Swieten JC. (2002). Autosomal recessive early onset Parkinsonism is linked to three loci: PARK2, PARK6, and PARK7. Neurol Sci 23 Suppl 2: S59-60.

38. Bonifati V, Rizzu P, van Baren MJ, Schaap O, Breedveld GJ, Krieger E, Dekker MC, Squitieri F, Ibanez P, Joosse M, van Dongen JW, Vanacore N, van Swieten JC, Brice A, Meco G, van Duijn CM, Oostra

BA, Heutink P. (2003). Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset Parkinsonism. Science 299: Pp 256-59.

39. Klein C, Lohmann-Hedrich K. (2007). Impact of recent genetic findings in Parkinson's disease. Curr Opin Neurol 20: Pp 453-64.

40. Moore DJ, Zhang L, Troncoso J, Lee MK, Hattori N, Mizuno Y, Dawson TM. (2005). Association of DJ-1 and Parkin mediated by pathogenic DJ-1 mutations and oxidative stress. Hum Mol Genet 14: Pp 71-84.

41. Yokota T, Sugawara K, Ito K, Takahashi R, Ariga H, Mizusawa H. (2003). Down regulation of DJ-1 enhances cell death by oxidative stress, ER stress, and proteasome inhibition. Biochem Biophys Res Commun 312: Pp 1342-1348.

42. Plamena R. Angelova, Marthe H. R. Ludtmann, Mathew H. Horrocks, and Andrey Y. Abramov. Ca2+ is a key factor in α-Synuclein-induced neurotoxicity. (2016). J Cell Sci. May 1; 129(9): Pp 1792–1801.

43. Chien W. L., Lee T. R., Hung S. Y., Kang K. H., Wu R. M., Lee M. J. and Fu W. M. (2013). Increase of oxidative stress by a novel PINK1 mutation, P209A. Free Radic. Biol. Med. 58, Pp 160–169.

44. Hiroyoshi Ariga, Kazuko Takahashi-Niki, Izumi Kato, Hiroshi Maita, Takeshi Niki. (2013). Neuroprotective function of DJ-1 in Parkinson's disease. Oxid Med Cell Longev. Epub: 683920.

45. Sonia Gandhi, Andrey Y Abramov. (2012). Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev Epub 2012:428010.

46. Gunjima, K., Tomiyama, R., Takakura, K. et al. (2014). 3,4- Dihydroxybenzalacetone Protects Against Parkinson's Disease-Related Neurotoxin 6-OHDA Through Akt/Nrf2/Glutathione Pathway. Journal of Cellular Biochemistry 115(1).

47. Blackinton J, Kumaran R, van der Brug MP, Ahmad R. (2009). Post- transcriptional regulation of mRNA associated with DJ-1 in sporadic Parkinson disease. Neurosci Lett ;452: Pp 8–11.

48. Yamaguchi S., Yamane T., Takahashi-Niki K., Kato I., Niki T., Goldberg M. S., et al. (2012). Transcriptional activation of low-density lipoprotein receptor gene by DJ-1 and effect of DJ-1 on cholesterol homeostasis. PLoS One 7. Pp 141-146.

49. Eunsung Junn, Won Hee Jang, Xin Zhao, Byeong Seon Jeong, M Maral Mouradian. (2009). Mitochondrial localization of DJ-1 leads to enhanced neuroprotection. J Neurosci Res Jan;87(1): Pp 123-9.

50. Hayashi T, Ishimori C, Takahashi-Niki K, Taira T, Kim YC, Maita H, et al. (2009). DJ-1 binds to mitochondrial complex I and maintains its activity. Biochem Biophys Res Commun. 390(3): Pp 667–672.

51. Thomas KJ, McCoy MK, Blackinton J, Beilina A, van der Brug M, Sandebring A, et al. (2011). DJ-1 acts in parallel to the PINK1/Parkin pathway to control mitochondrial function and autophagy. Hum Mol Genet. 20(1): Pp 40–50.

52. Pacelli C, Giguere N, Bourque MJ, Levesque M, Slack RS, Trudeau LE. (2015). Elevated Mitochondrial Bioenergetics and Axonal Arborization Size Are Key Contributors to the Vulnerability of Dopamine Neurons. Curr Biol 25(18): Pp 2349–2360.

53. Surmeier DJ, Halliday GM, Simuni T. (2017). Calcium, mitochondrial dysfunction and slowing the progression of Parkinson's disease. Exp Neurol 298(Pt B): Pp 202–209.

54. Anderson PC, Daggett V. (2008). Molecular basis for the structural instability of human DJ-1 induced by the L166P mutation associated with Parkinson's disease. Biochemistry 47(36): Pp 9380–9393.

55. Christine Klein, Ana Djarmati, Katja Hedrich, Nora Schäfer, Cesa Scaglione, Roberta Marchese, Norman Kock, Karin Wiegers, Robert Hering, Peter Bauer, Paolo Martinelli, Peter P Pramstaller. (2005). PINK1, Parkin, and DJ-1 mutations in Italian patients with early-onset Parkinsonism. Eur J Hum Genet Sep;13(9): Pp 1086-93.

56. Hughes AJ, Daniel SE, Kilford L, Lees AJ. (1992). Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease. A clinico-pathological study of 100 cases. JNNP; 55:Pp 181-184.

57. Hoehn M, Yahr M. (1967). Parkinsonism: onset, progression and

mortality. Neurology 17 (5): Pp 427–42.

58. Sambrook J.F. et al,. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set). Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

59. Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M. (1996). Expression monitoring by hybridization to high- density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol ;14: Pp 1675–1680.

60. Daniel H. Farkas, Carol A. Holland. (2009). Overview of Molecular Diagnostic Techniques and Instrumentation. Cell and Tissue Based Molecular Pathology.

61. Sanger, F.; Donelson, J.E.; Coulson, A.R.; Kössel, H.; Fischer, D. (1973). Use of DNA Polymerase I Primed by a Synthetic Oligonucleotide to Determine a Nucleotide Sequence in Phage f1 DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 70 (4): Pp 1209–1213.

62. Oren Harmon and Michael Dietrich. (2013). From bomb to bank: Walter Goad and the introduction of computers into biology. Outsider scientists: routes to innovation in biology. University of Chicago Press: Pp 128–144.

63. Harold Swerdlow, Raymond Gesteland.

(1990). Capillary gel electrophoresis for rapid, high resolution DNA sequencing. Nucleic Acids Research, Vol 18, Issue 6, Pp 1415–1419.

64. Elisabetta Pupillo, Claudio Cricelli, Francesco Mazzoleni, Iacopo Cricelli, Ettore Beghi. (2016). Neuroepidemiology 47(1): Pp 38-45.

65. Cao Hữu Hân, Nhữ Đình Sơn, Nguyễn Hoàng Thịnh, Trần Nguyên Hồng. (2010). Nghiên cứu cơ cấu bệnh tật tại khoa Nội Thần kinh Bệnh viện 103 (2004-2008), Tạp chí Y – Dược học Quân sự, vol 35 (2), trang 20-24.

66. C A Singer, K L Rogers, D M Dorsa. (1998). Modulation of Bcl-2 expression: a potential component of estrogen protection in NT2 neurons. Neuroreport ; 9(11):2565-8.

67. Pankratz N, Nichols WC, Uniacke SK, et al. (2002). Genome screen to identify susceptibility genes for Parkinson’s disease in a sample without parkin mutations. Am J Hum Genet; 71:124–35.

68. R. Peters. (2006). Ageing and the brain. Postgrad Med J.; 82(964): Pp

84–88.

69. Robert Hering, Karsten M. Strauss, Xiao Tao, Andreas Bauer, Dirk Woitalla, Eva-Maria Mietz, Slobodanka Petrovic, Peter Bauer, Wilhelm Schaible, Thomas Mu¨ller, Ludger Scho¨ls, Christine Klein, Daniela Berg, Philipp T. Meyer, Jo¨rg B. Schulz, Bernd Wollnik, Liang Tong, Rejko Kru¨ger, Olaf Riess. (2004). Novel Homozygous p.E64D Mutation in DJ1 in Early Onset Parkinson Disease (PARK7). HUMAN MUTATION 24:321-329.

70. Stephen Hague, Ekaterina Roga eva, Dena Hernandez, Cindy Gulick, Amanda Singleton, Melissa Hanson, Janel Johnson, Roberto Weiser, Marisol Gallardo, MD,5 Bernard Ravina, Katrina Gwinn-Hardy,

Anthony Crawley, Peter H. St. George-Hyslop, Anthony E. Lang, Peter Heutink, Vincenzo Bonifati, MD,7,8 John Hardy, Andrew Singleton. (2003). Early-Onset Parkinson’s Disease Caused by a Compound Heterozygous DJ-1 Mutation. Ann Neurol; 54:271–274.

71. Masoom M Abbas, Shyla T Govindappa, Sumedha Sudhaman, B K Thelma, Ramesh C Juyal, Madhuri Behari, Uday B Muthane. (2016). Early Onset Parkinson's disease due to DJ1 mutations: An Indian study. Parkinsonism Relat Disord ; 32:20-24.

72. Maria G. Macedo, Dagmar Verbaan, Yue Fang, Stephanie M. van Rooden, Martine Visser, Burcu Anar, Antonella Uras, Patrizia Rizzu, van Hilten and Peter Heutink. (2009). Genotypic and Phenotypic Characteristics of Dutch Patients with Early Onset Parkinson’s Disease. Movement Disorders. Vol. 24, No. 2, Pp. 196–203.

73. Patrizia Tarantino, Donatella Civitelli, Ferdinanda Annesi, Elvira V. De Marco, Francesca E. Rocca, Pierfrancesco Pugliese, Giuseppe Nicoletti, Sara Carrideo, Giovanni Provenzano, Grazia Annesi, Aldo Quattrone. (2009). Compound heterozygosity in DJ-1 gene non-coding portion related to parkinsonism. Parkinsonism and Related Disorders 15. Pp 324–326.

74. Sevda Erer, Unal Egeli, Mehmet Zarifoglu, Gulcin Tezcan, Gulsah Cecener, Berrin Tunca, Secil Ak Elif, Kaleagası Okan, Dogu Esen Saka, Bulent Elibo. (2016). Mutation Analysis of the Parkin, PINK1, DJ1, and SNCA genes in Turkish Early-Onset Parkinson’s Patients and - Phenotype Correlations. Clinical Neurology and Genotype Neurosurgery. S0303-8467(16)30244.

75. Bong-Seok Jo, Sun Shim Choi. (2015). Introns: The Functional Benefits of Introns in Genomes. Genomics Inform; 13(4): Pp 112–118.

PHỤ LỤC

Hình PL1. Sản phẩm PCR đã tinh sạch của exon 2 trong nghiên cứu.

M: Marker 1 Kb PLUS.

Hình PL2. Sản phẩm PCR đã tinh sạch của exon 3 trong nghiên cứu.

M: Marker 1 Kb PLUS.

Hình PL3. Sản phẩm PCR đã tinh sạch của exon 4 trong nghiên cứu.

M: Marker 1 Kb PLUS

Hình PL4. Sản phẩm PCR đã tinh sạch của exon 5 trong nghiên cứu.

M: Marker 1 Kb PLUS.

Hình PL5. Sản phẩm PCR đã tinh sạch của exon 6 trong nghiên cứu.

M: Marker 1 kb PLUS

Hình PL6. Sản phẩm PCR đã tinh sạch của exon 7 trong nghiên cứu. M: Marker 1 Kb PLUS.

Hình PL7. Trình tự so sánh trên exon 2

Hình PL8. Trình tự so sánh trên exon 3

Hình PL9. Trình tự so sánh trên exon 4 và intron 4

Hình PL10. Trình tự so sánh trên exon 5 và intron 5

Hình PL11. Trình tự so sánh trên exon 6 và intron 6

Hình PL12. Trình tự so sánh trên exon 7

DANH SÁCH BỆNH NHÂN VÀ CHỨNG

ID

Họ và tên

Giới

Giai đoạn bệnh

Rối loạn tâm thần

Rối loạn nhận thức

Đáp ứng L-dopa

Tuổi Thời gian mắc bệnh (năm)

Khởi phát không đối xứng

1E Nguyễn Thị Huân 2E Phạm Thị Tú 3E Nguyễn Thanh Giang 4E Hoàng Ngọc Tú 5E Trần Thị Ngọc Tâm 6E Nguyễn Trung Kiên 7E Nguyễn Việt Hùng 8E Hoàng Văn Phái 9E Nguyễn Duy Minh 10E Hồ Minh An 11E Dương Quý Tuy 12E Hoàng Hải 13E Nguyễn Thị Lý 14E Quản Văn Thưởng 15E Từ Ngọc Cẩn 16E Lê Hữu Khôi 17E Lê Văn Hóa 18E Nguyễn Đăng Đào 19E Nguyễn Văn Quý 20E Nguyễn Thùy Trâm 21E Lê Quang Thắng 22E Trịnh Hữu Luật

Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam

56 57 60 56 56 67 60 60 75 60 64 74 55 61 66 71 69 78 57 70 69 57

3 1 2 3 2 1 3 1 5 1 5 2 9 2 11 1 2 2 1 1 1 1

III II III III III II III I III III IV II III III IV I II III II I II I

Có Không Có Không Không Có Có Không Có Có Có Có Có Có Có Không Có Có Không Không Có Không

Có Có Có Không Không Có Có Không Có Có Có Có Có Có Có Không Không Có Không Không Có Không

Có Có Có Có Có Không Không Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có

Có Có Có Có Có Không Có Có Có Có Không Có Có Không Có Có Có Có Có Có Có Có

23E Nguyễn Đắc Chung 24E Đinh Văn Thoại 25E Triệu Thị Tính 26E Thế Thị Chiều 27E Nguyễn Minh Nguyệt 28E Nguyễn Văn Tuyên 29E Nguyễn Anh Sơn 30E Phạm Hồng Nhiều 31E Đinh văn Dinh 32E Trần Hoàng Phương 1C Phạm Thị Viết 2C Đào Thị Chinh 3C Quách Văn Hiếu 4C Cao Xuân Vinh 5C Nguyễn Mậu Cõn

Nam Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam

60 70 69 65 74 62 65 64 71 57 55 67 53 61 82

5 8 1 1 4 6 1 1 6 3 0 0 0 0 0

III III II I III III I II III III 0 0 0 0 0

Có Có Có Không Có Có Không Có Có Có Chứng Chứng Chứng Chứng Chứng

Có Có Có Có Có Có Có Có Có Có Chứng Chứng Chứng Chứng Chứng

Không Có Có Có Có Không Có Có Có Có Chứng Chứng Chứng Chứng Chứng

VIỆN HÀN LÂM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BẢN GIẢI TRÌNH CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THEO KẾT QUẢ CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Học và tên học viên: Hồ Trường Giang Tên luận văn: "Nghiên cứu đột biến một số exon của gen DJ-1 trên người

bệnh Parkinson”.

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy Ngày bảo vệ luận văn: 7/10/2020 Căn cứ biên bản họp hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ, học viên đã

chỉnh sửa luận văn như sau:

STT Nội dung đã bổ sung, chỉnh sửa

Nội dung đề nghị bổ sung, chỉnh sửa

Tính logic của tổng quan Đã sửa nội dung tổng quan 1

2 Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang và chọn mẫu thuận tiện.

3 Mục tiêu 2 cần thu hẹp

Mục tiêu 2: Đánh giá mối liên quan của những đột biến được xác định với một số biểu hiện lâm sàng điển hình trên người bệnh Parkinson.

4 Danh mục viết tắt chưa thống Đã sửa

nhất

5 Bổ sung chú thích 1 số bảng biểu Đã sửa và bổ sung bảng 3.1 và 3.2

6 Việt hóa hình