Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme Chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Cspergillus, Trichoderma và ứng dụng

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH ------------------------

Leâ Thò Hueä

KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG SINH TOÅNG HÔÏP

ENZYME CHITINASE CUÛA MOÄT SOÁ CHUÛNG NAÁM SÔÏI

THUOÄC GIOÁNG ASPERGILLUS, TRICHODERMA VAØ

ÖÙNG DUÏNG

Chuyeân ngaønh: Vi sinh vaät hoïc

Maõ soá: 60 42 40

LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC

Ngöôøi höôùng daãn khoa hoïc PGS. TS. ÑOÀNG THÒ THANH THU

Thaønh phoá Hoà Chí Minh - 2010

DANH MỤC VIẾT TẮT

CPE chế phẩm enzyme

CT Canh trường

DNS 3,5-dinitrosalicylic axit

MT Môi trường

OD Mật độ quang

∆OD Hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thử thật và thử không

UI Đơn vị hoạt độ enzyme (tính theo đơn vị quốc tế)

PTHQ Phương trình hồi qui

TB Giá trị trung bình

Nhiệt độ tối ưu topt

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

pH tối ưu pHopt

MỞ ĐẦU

Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lượng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất

trong thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và được ứng

dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật,

nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp

enzyme từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn

theo qui mô công nghiệp. Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và

có nhiều ứng dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm

sau này người ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme

thủy phân chitin.

Chitin là một polymer sinh học có thể so sánh với các polysaccharide như cellulose, keratin.

Chitin phân bố rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngoài

của tôm cua và côn trùng. Đây là một polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan trong nước,

chứa các đơn phân là N-acetyl-glucosamine liên kết bởi liên kết 1,4-β. Chitin có nhiều công dụng

trong nhiều lĩnh vực như y học và công nghiệp…

Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa và phân giải chitin đang được nghiên cứu nhiều

trong những năm gần đây. Chitin bị phân giải bởi hệ enzyme có tên gọi chung là chitinase. Enzyme

này được sản xuất bởi các tổ chức sống dưới tế bào để phục vụ nhu cầu chức năng sinh lý của

chúng. Sự phân giải chitin dưới tác động enzyme phụ thuộc vào các yếu tố hóa lý (tỉ lệ giữa cơ chất

và enzyme, pH, nhiệt độ…). Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là

nguồn quan trọng. Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể là các chủng vi

khuẩn thuộc các chi Enterobacter và Streptomyces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperillus,

Penicillium, và Trichoderma, và một số động vật nguyên sinh.

Những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase do tiềm

năng ứng dụng to lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong thu nhận tế bào

trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine, sản

xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y học, trong việc kiểm soát nấm kí sinh trên cây

trồng…v.v…

Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase như trên, mục đích đề tài chúng tôi nhằm nghiên

cứu sinh tổng hợp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ một số chủng nấm sợi và bước

đầu khảo sát một số ứng dụng của enzyme này. Chúng tôi thực hiện đề tài: Khảo sát khả năng sinh

tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

ứng dụng.

Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi có khả năng tổng hợp chitinase cao, thu nhận chế

phẩm chitinase từ canh trường và bước đầu nghiên cứu một số ứng dụng của chitinase.

Nhiệm vụ của đề tài

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của một vài chủng nấm sợi thuộc giống

Aspergillus, Trichoderma. Chọn chủng nấm sợi để nghiên cứu tiếp.

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm sợi đã

chọn và tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm.

- Thu nhận chế phẩm chitinase.

- Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ

chất, thời gian thủy phân cơ chất.

- Bước đầu thử nghiệm ứng dụng nấm sợi sinh enzyme chitinase hoặc chế phẩm chitinase.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài

Thời gian : từ tháng 8/2009 – 7/2010

Địa điểm : Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI

1.1.1. Khái quát về enzyme

1.1.1.1. Cấu trúc [1, 23]

Enzyme là một loại phân tử protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia xúc tác cho các

phản ứng sinh học.

Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, được cấu tạo từ các L-acid amin

liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động

của enzyme.

Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme một cấu tử gồm những enzyme có thành phần hóa học

duy nhất là protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm những enzyme có hai thành phần: phần protein

thuần gọi là apoenzyme có vai trò xúc tác, phần thứ hai phi protein là coenzyme là những chất hữu

cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. Ngoài ra có một số kim loại như Zn, Cu, Mn, Fe ...

đóng vai trò liên kết enzyme và cơ chất trong quá trình xúc tác phản ứng, liên kết giữa apoenzyme

và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử.

1.1.1.2. Cơ chế hoạt động [16, 23]

Trung tâm hoạt động của enzyme (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất mà

chúng xúc tác, phản ứng hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất như “chìa khóa-ổ

khóa“ tạo phức hợp enzyme-cơ chất. Quá trình tác động của enzyme vào cơ chất để tạo sản phẩm

trải qua ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với cơ chất (S) nhờ những liên kết tạo phức E-S

Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzyme (E), cơ chất sẽ bị thay đổi cấu hình không

gian và mức độ bền vững các liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm.

Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, được giải phóng nguyên vẹn. Sản phẩm (P) tạo thành.

Sơ đồ cơ chế tác động enzyme:

E + S  E-S  E + P

1.1.1.3. Phân loại enzyme [16, 23]

Có nhiều cách phân loại enzyme, ở đây chúng tôi đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc

tác của enzyme. Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp tại Moscow đã đề ra một bảng phân loại

mới, trong đó enzyme được chia ra làm 6 lớp chính:

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

- Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hoàn nguyên sinh học)

- Transferase (lớp enzyme vận chuyển)

- Hydrolase (lớp enzyme thủy phân)

- Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo con đường thủy phân)

- Ligase hay Syntetase (lớp enzyme tổng hợp chất)

- Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa)

1.1.2. Enzyme chitinase [32]

1.1.2.1. Cấu trúc

Chitinase [Poly- Beta- 1- 4 – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase]

thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay

chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-

acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.

3 → Hydrolase

2 → Glycosylase

1 → Glycosidase

14 → Chitinase

Chitinase còn có các tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) là chitodextrinase, β-poly-N-

acetyl glucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC

(Streptomyces griceus) ...

Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 và

Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20.

 Họ Glycohydrolase 18

Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote,

Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác

như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase.

Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β

cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β polymer bị

phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer. [32]

Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas

hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

marcescens…

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68]

 Họ Glycohydrolase 19

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn

Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một

vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển.

Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV.

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [68]

 Họ Glycohydrolase 20

Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi

khuẩn, Streptomyces và người.

Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide

nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:

Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc

tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu

cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt

động xúc tác.

Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu

cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I.

Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II

Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự

amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu

cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu

cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao.

1.1.2.2. Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase [11]

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-- chitobiosidase, N-acetyl- -

D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase.

Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn

olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma

harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9),

Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8).

Chitin 1,4- - chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các

dimer chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pI = 4,4 ±

0,2).

N-acetyl –  - D - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho

sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine.

Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine.

Hình 1.3. Vị trí phân cắt enzyme chitinase [69]

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo

thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa.

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase ở Trichoderma [11]

Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay

bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2.

β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu

không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc).

Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm

cơ chất. Các oligsaccharide thường được thủy phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một

cách ngẫu nhiên. Một số enyme chitinase có khả năng thủy phân trisaccharid, một số khác thì

không. Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và

trisaccharid; một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid. Tóm lại chitinase

thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên.

Endochitinase, chitobiosidase và β –N- acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất

là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu

từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn

là chitobiosidase và -N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi

chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng -N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm

hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của -N-

acetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế có

thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và -N- acetylhexosaminidase.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine.

1.1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase [11]

* Trọng lượng phân tử

Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng

30kDa (kilodalton). Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), một số

chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng 120kDa. Trọng

lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30

đến 120 kDa.

* Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis

Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và

tảo; pI từ 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 – 8,8 ở vi sinh vật. Hằng số

Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml)

* Ảnh hưởng của nhiệt độ [32, 62] Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20 – 500C (Frandberg và

Schnure, 1994; Huang và cộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal, 1998; Wiwat và cộng sự, 1999;

Bendt và cộng sự, 2001).

Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 400C, ngoại

trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 50OC (Jeuniaux, 1963). Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme chitinase có thể có

những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và

chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 800C. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp. Từ 30-450C và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp. BG-11 hoạt tính cao nhất ở 40-600C.

Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Rifai nhận thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25-600C, nhiệt độ tối ưu là 400C.

* Ảnh hưởng của pH [32]

Giá trị pH tối thích (pHop) của hệ enzyme chitinase từ 4-9 đối với các enzyme chitinase ở

thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme chitinase ở động vật là 4,8- 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5- 8,0.

Theo các nhà khoa học, pHop của enzyme chitinase có thể có sự phụ thuộc vào cơ chất được

sử dụng. Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pHop khoảng 5,0 khi cơ chất là glucol

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu.

Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4,0-8,5

(Morrisey và cộng sự, 1976; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự, 2001). Chitinase của nấm

hoạt tính cao nhất ở pH = 5, trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0. Theo Bhushan và Hoondal

(1998), hoạt tính của chitinase từ Bacillus sp. BG-11 cao nhất ở pH = 8,5.

1.1.2.4. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase [11, 27]

Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật.

Enzyme chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn như Chromobacterium, Klebsiella,

Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng hợp

enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sự sinh

trưởng và phát triển.

Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus,

Gliocladium, Calvatia ... và cả ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus ...

Enzyme chitinase được thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các nấm kí sinh gây

bệnh cho cây trồng. Những thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như thuốc lá (Nicotiana sp.),

cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) ... và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp

enzyme chitinase.

Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều

loài động vật không xương như ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt ... có thể thu nhận được

enzyme chitinase. Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và

dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú

ăn sâu bọ.

Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá

trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Enzyme

chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticun) của chúng trong quá trình biến thái hay lột

xác.

1.1.3. Chitin (cơ chất của chitinase)

1.1.3.1. Lịch sử nghiên cứu chitin [55]

Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên cứu loài nấm

Agaricus volvaceus và một vài loài nấm khác xử lý với dung dịch kiềm, ông thu được sản phẩm và

đặt tên là chitin (chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp là “tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc).

Hai năm sau Odier bắt đầu chú ý đến bản chất, cấu trúc của chitin.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Năm 1843, Lassaige chứng minh rằng trong chitin có sự có mặt của nitrogen.

1.1.3.2. Chitin trong tự nhiên [30, 56, 57]

Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polyme sinh học được tổng hợp

với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên chitin

tồn tại ở cả động vật và thực vật.

Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số

động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong giới thực vật,

chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae.

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với

nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi. Trong tự nhiên, chitin hiếm khi tồn tại ở

trạng thái tự do mà gần như luôn luôn liên kết dưới dạng phức hợp chitin- protein. Điều này dẫn đến

sự đề kháng với các hóa chất và các enzyme thủy phân, gây nhiều khó khăn cho việc chiết tách, tinh

chế chúng. Tùy thuộc vào các đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng

một loài có thể thấy sự thay đổi về lượng và chất của chitin.

Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin

chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực là nguồn

nguyên liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng.

Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau [45,51]

Bọ cánh cứng 37%

Nhện 38%

Bò cạp 30%

Sâu 20-38%

Nấm 5-20%

Tôm 33%

Cua 70%

Mực 3-20%

Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là

từ vỏ cua và tôm. Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất như:

CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ … nên việc tách chiết còn khó khăn vì phải đảm bảo cả hai

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời không làm biến đổi tính chất của chitin.

1.1.3.3. Cấu trúc phân tử và tính chất của chitin

 Cấu trúc phân tử [57, 58]

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng

chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-Glucosamine liên kết với nhau bởi

liên kết 1-4 glucoside.

Hình 1.5. Cấu trúc chitin [61]

Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ, sự khác nhau này thể hiện ở sự sắp xếp

các chuỗi. Các chuỗi α–chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau, tuy nhiên, chúng có một cặp xếp cùng

chiều, ở chuỗi β – chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, còn ở chuỗi γ – chitin có các

cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc.

Hình 1.6. Cấu trúc của alpha-chitin [61]

 Tính chất của chitin [27, 31]

Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch. Chitin

không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và trong các dung môi thông

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…).

1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme của nấm sợi trên môi trường lên men

bán rắn [14, 35, 36]

1.1.4.1 Thành phần môi trường nuôi cấy nấm sợi sinh chitinase [4, 11, 29]

 Nguồn dinh dưỡng cacbon

Nấm sợi có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau, trong đó nguồn

cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng

trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff.

Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên trong môi trường nuôi

cấy nấm sợi sinh chitinase, cần có nguồn chitin là chất cảm ứng và là nguồn cacbon nhằm tăng khả

năng sinh tổng hợp enzyme chitinase. Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzyme chitinase là

chitin (có thể dạng huyền phù, dạng bột hay dạng thô) và các dẫn xuất của chitin. Nghiên cứu của

Jesús de la Cruz và cộng sự (1922) chỉ ra rằng Trichoderma harzianum chỉ tạo ra chitinase khi có

nguồn cacbon từ chitin chứ không từ nguồn khác như cellulose hay chitosan.

 Nguồn dinh dưỡng nitơ

Nguồn nitrogen có ý nghĩa lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi. Theo

Kapat và cộng sự (1996), khi loại ure ra khỏi môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng khả năng tổng hợp

chitinase. Takashi và cộng sự (2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm sợi Aspergillus sp.

đã chỉ ra rằng hoạt tính chitinase cao khi sử dụng nguồn nitơ từ (NH4)2SO4. Theo Nampoothiri và

cộng sự (2003), khi bổ sung 2,0% (w/w) cao nấm men vào môi trường nuôi cấy bán rắn thì khả

năng tạo chitinase ở Trichoderma harzianum tăng đáng kể. Tuy nhiên, theo Kovacs và cộng sự

(2003), trong nuôi cấy bán rắn, nguồn nitrogen bổ sung vào môi trường cám gạo-chitin không ảnh

hưởng đến khả năng tạo chitinase. Suresh và Chandrasekharan (1999) cũng ghi nhận sự gia tăng sản

lượng enzyme này khi môi trường nuôi cấy Trichoderma harzianum được cung cấp muối amonium

phosphat và cao nấm men. N. N. Nawani và B. P. Kapadnis trong quá trình nghiên cứu tối ưu hóa

bằng phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên toán thống kê cho thấy đối với Streptomyces sp. NK

1057 khi cung cấp nguồn nitơ từ cả hai nguồn là cao nấm men và (NH4)2SO4 thì sản lượng chitinase

tăng từ 4 – 10% so với dùng riêng lẻ các nguồn này. [33]

 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu ... có vai trò quan trọng như tham gia vào quá

trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, tham gia thành phần cấu tạo protein,

enzyme, điều hòa pH môi trường nuôi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme nói

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

chung, chitinase nói riêng.

1.1.4.2. Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme chitinase của nấm sợi

- Ảnh hưởng của độ ẩm

Độ ẩm có ý nghĩa trong nuôi cấy bán rắn. Theo Matsumoto và cộng sự (2001), với độ ẩm

75%, chủng Verticillium lecanii ATCC 26854 sinh chitinase có hoạt tính cao nhất. Đối với

Trichoderma harzianum, hoạt tính chitinase cao nhất ở độ ẩm môi trường là 65% (Nampoothiri và

cộng sự, 2003). Takashi và cộng sự (2002) chỉ ra rằng nấm sợi Aspergillus sp. tổng hợp chitinase

có hoạt tính cao ở điều kiện độ ẩm môi trường 57%.

- Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase

của các chủng nấm sợi. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp

là acid, trung tính hay kiềm. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện pH

= 5-6 (Takashi và cộng sự, 2002). Nhiều nghiên cứu trên Trichoderma harzianum chỉ ra rằng pH

thích hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4-6 (Nguyễn Thị

Hồng Thương và các đồng tác giả, 2003).

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của nấm sợi. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 28-320C, tối đa dưới 500C. Nhiệt độ quá cao hoặc

quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp

enzyme sẽ bị ức chế. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ 370C (Takashi và cộng sự, 2002)

- Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng

Chitinase có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme cấu trúc. Tuy nhiên trong các môi trường

nuôi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm tăng khả năng tạo chitinase.

Nhìn chung sự hiện diện của chitin trong môi trường nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase

(Monreal và Reese, 1969; Ulhoa và Peberdy, 1993). Trong số các cơ chất, chitin huyền phù có khả

năng kích thích tạo chitinase cao nhất (Bhushan, 2000; Nampoothiri và cộng sự, 2003). Trong hầu

hết các trường hợp, khi nồng độ chitin khoảng 1-1,5% là vi sinh vật có khả năng tạo chitinase (Felse

và Panda, 2000).

Năm 2003, Binod và cộng sự đã sử dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào nấm, vỏ

tôm, cua ...) để tạo chitinase từ nấm sợi nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Việc tận dụng phế liệu

này vừa đem lại hiệu quả kinh tế, vừa góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

Nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp và các đồng tác giả (2003) chỉ ra rằng hệ enzym chitinase

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

của Trichoderma sp. có thể được cảm ứng bởi vách tế bào vi nấm (Curvularia oryzae, Phytophthora

primulae), vách tế bào nấm lớn (Schizophyllum commune, Trametes versicolor) hoặc chitin vỏ tôm,

trong đó vách tế bào nấm cảm ứng quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của Trichoderma tốt

hơn chitin vỏ tôm.

1.1.5. Những ứng dụng của enzyme chitinase [30, 33]

1.1.5.1. Ứng dụng trong việc thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh)

Thể nguyên sinh của tế bào nấm đã được sử dụng như một công cụ thí nghiệm có hiệu quả

trong việc nghiên cứu quá trình hình thành thành tế bào, quá trình tổng hợp enzyme, quá trình bài

tiết chất cũng như việc cải tiến các chủng nấm ứng dụng trong công nghệ sinh học. Do trong thành

tế bào nấm có chứa chitin, hệ enzyme thủy phân chitin là một trong những nhân tố có thể sử dụng

để phá vỡ thành tế bào, tạo tế bào trần từ tế bào nấm.

Dahiya và cộng sự (2005) đã mô tả hiệu quả của enzyme chitinase thu nhận từ chủng

Enterobacter sp. NRG 4 trong việc tạo tế bào trần từ nấm Trichoderma reesei, Aspergilllus niger,

Pleutotus florida ...

Mizuno và cộng sự (1997) tách tế bào trần từ Schizophyllum commune bằng cách sử dụng

dịch lọc môi trường nuôi Bacillus circulans KH – 304. Phức hợp enzyme từ Bacillus circulans WL

– 12 với hoạt tính chitinase cao đã rất hiệu quả trong việc thu nhận tế bào trần từ Phaffia rhozyme

(Johnson và cộng sự, 1979).

1.1.5.2. Ứng dụng trong việc sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetyl

glucosamine

Chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetyl glucosamine là chất có tiềm năng rộng lớn

trong y dược. Chitooligosaccharides có lợi ích tiềm năng đối với sản xuất thuốc cho người. Ví dụ,

chitohexaose và chitoheptaose được phát hiện có tính kháng các khối u.

Chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus đã được sử dụng để sản xuất chitopentaose và

chitotriose từ cơ chất chitin huyền phù (Murao và cộng sự, 1992).

Sự kết hợp giữa các enzyme thủy phân chitin cần thiết để thu nhận những oligomer có chiều

dài chuỗi mong muốn. Ví dụ, để tạo chitooligosaccharides cần tỉ lệ endochitinase, tỉ lệ thấp N-acetyl

glucosamindase và exochitinase; trong khi để tạo N- acetyl glucosamine thì cần tỉ lệ cao

exochitinase và N-acetyl glucosamindase. (Aloise và cộng sự, 1996) nhận thấy khi ủ enzyme

chitinase với tetramer hoặc pentamer thu nhận từ Nocardia oritentalis thì thấy có sự hình thành các

hexamer.

Sashiwa và cộng sự (2002) đã sản xuất N- acetyl glucosamine từ α-chitin bằng cách sử dụng

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330.

1.1.5.3. Ứng dụng trong việc nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học

Chitin có mặt trong lớp vỏ ngoài và ống tiêu hóa của côn trùng. Villagomez-Castro và

Lopez-Romero (1996) đã chỉ ra rằng các sự sự kiện thuộc về hình thái học ở nấm luôn có sự tham

gia của enzyme chitinase. Allosamidin, một chất ức chế mạnh của enzyme chitinase, được nhận

thấy có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của các loài như ve bét, ấu trùng nhặng sau khi chúng ăn

vào (Sakuda và cộng sự, 1987).

1.1.5.4. Ứng dụng trong việc ước tính sinh khối nấm

Các nhà nghiên cứu đã mô tả một loại phương pháp khác để ước tính lượng nấm có trong

đất. Kỹ thuật bao gồm việc quan sát dưới kính hiển vi và ly trích những chất chỉ thị đặc trưng cho

nấm như glucosamine ergosterol.

Có sự liên quan chặt chẽ giữa hoạt tính của chitinase và lượng nấm có trong đất. Sự liên quan

như thế không thấy xuất hiện với vi khuẩn và xạ khuẩn. Chính vì thế, chitinase trở thành yếu tố chỉ

thị thích hợp cho mức sinh trưởng của nấm trong đất (Miller và cộng sự,1998). Tương tự, chitinase

và protein gắn kết với chitin có thể được sử dụng để dự báo sự lây nhiễm nấm trên con người (Laine

và Lo, 1996).

1.1.5.5. Ứng dụng trong việc kiểm soát muỗi

Chitinase đóng vai trò quan trọng đối với hình thái nấm men, côn trùng. Kuranda và Robbins

(1991) chỉ ra vai trò của chitinase trong sự phân chia tế bào trong suất quá trình sinh trưởng của

nấm men Sacharomyces cerevisiae.

Người ta chỉ ra rằng ấu trùng muỗi Aedes aegypti có thể bị giết trong vòng 48 giờ với sự tác

động của chế phẩm thô từ nấm Myrothecium verrucaria. Nấm gây bệnh côn trùng như Beauveria

bassiana có thể gây nhiễm trứng của muỗi Aedes aegypti. Điều này mở ra tiềm năng trong việc sản

xuất chất kiểm soát côn trùng truyền bệnh như muỗi.

1.1.5.6. Ứng dụng trong y học

Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng enzyme chitinase trong việc chẩn đoán

các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra. Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất

là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm. Hay ở nấm men thì chitin hiện diện trong những vết

chồi. Do đó có thể dùng phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một

phương pháp chẩn đoán nhanh các loài nấm gây bệnh. Các nhà khao học đã đề xuất một phương

pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase đã được phân lập tạo dòng

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên chitinase VP1), enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể

sử dụng như một mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao để nhận diện một cách đặc hiệu các

vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh. [32]

Ngoài ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bôi ngoài da

chứa chất chống nấm bệnh thường xảy ra các nước vùng nhiệt đới bởi khả năng phân hủy vách tế

bào vi nấm của chúng.

1.1.5.7. Ứng dụng trong việc kiểm soát nấm gây bệnh trên cây trồng

Nhiều loài côn trùng và nấm mốc có hại cho cây trồng và vật nuôi do gây ra nhiều loại dịch

bệnh, ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp. Vì chitin không phải là thành phần phổ biến ở

thực vật và động vật có xương nên người ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin

trong các nấm và côn trùng như 1-(2,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol), nikkomycin,

polyoxin D ...Khi áp dụng trên cây cảnh, cây lương thực và trên động vật, những tác nhân trên

chứng tỏ có nhiều ưu thế trong việc tiêu diệt nấm mốc, côn trùng có hại mà không gây hại đáng kể

cho thực vật hoặc động vật có xương sống.

Theo Hirohi Ihui, enzyme chitinase luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây

không chứa chitin. Chitinase và β-1,3-glucanase được tạo ra trong mô thực vật khi tế bào bị kích

thích bởi nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển

của bệnh. Chitinase sản xuất bởi Enterobacter sp. NRG4 có hoạt tính cao đối với Fusarium

moniliforme, Aspergillus niger, Mucor rouxii và Rhizopus nigricans (Dahiya và cộng sự, 2005).

Bhushan và Hoodal (1998) nghiên cứu về tính tương thích của những chitinase chịu nhiệt từ

Bacillus sp. BG-11 với thuốc diệt côn trùng và thuốc diệt nấm thường được sử dụng. Chitinase từ

Bacillus cereus YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật như Fusarium oxyporum, F.

Solani, Penicillium ultimum (Change và cộng sự, 2003). CHIT42, CHIT40 và CHIT72 từ

Trichoderma harzianum P1 và Trichoderma virens 41 có thể tác động trên sự nảy mầm và sự kéo

dài của sợi nấm của nhiều nấm gây bệnh thực vật như Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago

avenae, ... khi chúng được ủ với dịch enzyme.

1.1.5.8. Ứng dụng trong sản xuất protein đơn bào

Chất thải rắn từ quá trình chế biến tôm chứa chủ yếu là chitin, CaCO3 và protein. Revah-

Moiseev và Carrod (1981) đã đề nghị sử dụng loại chất thải này để chuyển đổi bằng phương pháp

sinh học chitin thành protein đơn bào nhờ sử dụng enzyme thủy phân chitin. Họ sử dụng enzyme

chitinase thu nhận từ Saccharomyces marcescens để thủy phân chitin và Pichia Kudriavazevii để

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

sản xuất protein đơn bào (với 45% protein và 8-11% acid nucleic). Những nấm thường được dùng

để sản xuất protein đơn bào là Hansenula polymorpha, Candida tropicalis, Sacharomyces

cerevisiae và Myrothecium verrucaria.

Vyas và Deshpande (1991) đã dùng enzyme thủy phân chitin thu nhận từ Myrothecium

verrucaria và dùng Sacharomyces cerevisiae để sản xuất protein đơn bào từ chất thải chứa chitin.

Tổng hàm lượng protein thu được là 61%, với tỉ lệ rất thấp acid nucleic (3,1%). Các nghiên cứu chỉ

ra rằng Sacharomyces cerevisiae là chủng tốt nhất để sản xuất protein đơn bào (60% protein và chỉ

1-3% acid nucleic).

1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI NGHIÊN CỨU

1.2.1. Các chủng thuộc chi nấm Aspergillus [7,8, 60]

1.2.1.1. Vị trí phân loại

Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota

Lớp: Eurotiomycetes

Bộ: Eurotiales

Họ: Trichocomaceae

Giống: Aspergillus

1.2.1.2. Đặc điểm hình thái

Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt, một số trường hợp trở nên nâu

hay màu sẫm khác ở một vùng nhất định của khuẩn lạc.

Aspergillus niger khi nuôi cấy trên môi trường thạch-khoai tây-dextrose ở 250C cho khuẩn

lạc ban đầu màu trắng, sau nhanh chóng chuyển sang màu đen với việc tạo vô số bào tử đính, mặt

trái khuẩn lạc màu hơi vàng nhạt và khi trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt

thạch. Aspergillus awamori khi nuôi cấy trên môi trường Czapek cho khuẩn lạc đạt kích thước 4,5- 5,0cm sau 7 ngày ở nhiệt độ 250C, còn trên môi trường MEA (cao malt) cho kích thước khuẩn lạc

lớn hơn. Khuẩn lạc có màu nâu nhạt, dần chuyển sang đậm. Hệ sợi trắng dần ngả vàng sậm.

Cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn, các chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp

mọi hướng. Bào tử trần không có vách ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc ... ở các

loài khác nhau.

Theo Bùi Xuân Đồng, Aspergillus niger có bào tử đính trưởng thành hình cầu, phần lớn 4,0-

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

5,0µm, xù xì không đều với những gờ rõ và gai không sắp xếp thành vạch kẻ dọc theo chiều dài.

Aspergillus awamori có bông mau chóng chuyển màu nâu hơi đỏ, mặt trái khuẩn lạc màu tương tự,

cuống bào tử đính phần lớn phát triển dài 1,0-1,5mm, bào tử đính phần lớn đường kính 4,0 đến 4,5

µm.

A B

Hình 1.7. Hình thái nấm Aspergillus niger [62, 63]

(A): bào tử, (B): Khuẩn lạc trên môi trường PGA

Hình 1.8. Hình thái nấm Aspergillus awamori [63]

(A): Khuẩn lạc trên MT Czapek; (B): Khuẩn lạc trên MT MEA

(C), (D), (E): hình thái bào tử

1.2.1.3. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh

Nấm Aspergillus có mặt khắp nơi trong tự nhiên, chúng phân bố rộng và dễ thích nghi vì

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

chúng có thể hình thành khuẩn lạc trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau.

Nghiên cứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 300C. Theo Takashi và cộng sự (2002), nhiệt độ thích hợp để Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất là 370C.

Wainwright và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Aspergillus

awamori là khoảng 5.0-7.0. Độ pH quá acid (khoảng 2-3) sẽ ngăn cản sự tạo thành bào tử, dẫn đến

hệ sợi bị phân tán khi nuôi cấy chìm.

Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm Aspergillus niger, gồm amylase,

amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase ... Ngoài ra chitinase của nấm này cũng

được đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010 [60].

Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng không có hại,

nhưng một số có thể tạo độc tố gây hại đến động vật và con người. Sự an toàn của Aspergillus niger

được đề cập đến trong nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van Dijck và cộng

sự (2003), Blumenthal (2004), Olemspka-Beer và cộng sự (2006) [41]. Theo thông tin tóm tắt từ

những bài báo của các tác giả này, khoảng 3-10% các chủng Aspergillus niger có khả năng sinh ra

độc tố trong những điều kiện nuôi cấy xác định như ochratoxin A.

1.2.2. Trichoderma harzianum [5, 12, 54]

1.2.2.1. Vị trí phân loại

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong phân loại do các

đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ.

Theo Rifai (1969), Barnett và Hunter (1972), Trichoderma thuộc lớp nấm, nấm bất toàn

Deuteromycetes (Fungi imperfect), chúng được phân loại như sau:

Giới: Nấm

Nghành: Ascomycota

Lớp: Deuteromycetes

Bộ: Moniliales

Họ: Moniliceae

Giống: Trichoderma

Một số tài liệu phân loại giống Trichoderma thuộc họ Moniliacae, bộ Moniliales, lớp nấm,

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

nấm bất toàn (Fungi imperfecti).

1.2.2.2. Đặc điểm hình thái [62, 63]

Khuẩn lạc Trichoderma harzianum ban đầu có màu lục trắng, sau dần dần chuyển sang màu

lục sẫm, mặt dưới khuẩn lạc không màu.

Bào tử áo hình cầu, nhẵn, không màu, đường kính 6-12 m, ở giữa sợi nấm hoặc đính ở các

nhánh.

Giá bào tử trần ngăn vách, phân nhánh 2-3 lần, đường kính 4 - 5 m, dài tới 250 m. Thể

bình có kích thước 3-4 x 5-7m, thường thành 2-5 cái ở đỉnh nhánh tận cùng, ở dọc các nhánh

thường đơn độc. Thể bình ở giữa thường dài tới 17 m và có đường kính nhỏ hơn, phần rộng nhất

khoảng 2-3 m. Bào tử trần hình gần cầu, hình trứng, phần gốc hơi bẹt, nhẵn, màu lục nhạt, không

vách ngăn, kích thước 2-3 x 3-3,5 m, nhày ở thể bình.

Hình 1.9. Hình thái bào tử và khuẩn lạc của Trichoderma harzianum [64]

1.2.2.3. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh

Trichoderma harzianum được tìm thấy ở những vùng ấm áp. Theo nghiên cứu của Domsch

và cộng sự (1980), nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của Trichoderma harzianum vào

khoảng 30C, tối đa khoảng 36C. Trichoderma harzianum cũng có thể phát triển ở nhiệt độ khoảng

5C, nhưng sinh trưởng rất chậm và yếu .

Trichoderma harzianum tổng hợp enzyme chitinase và các chất kháng sinh (Trichodermin,

glyotosin…).Vấn đề độc tố của Trichoderma harzianum chưa được biết đến.

1.3. SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE

1.3.1. Trên thế giới

So với các enzyme khác như protease, amylase, pectinase ... thì hệ enzyme chitinase được

nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn hạn chế. Đối tượng được nghiên

cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces (L.R. Berger và D.M. Renolds, 1958; R.

Grupta, R. K. Saxena, P. Chatuvedi và J. S. Windi, 1995). Những nghiên cứu trên đối tượng này

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào việc phá vỡ vách tế bào nấm. Năm 1978, P.A.

Carroad và R. A. Tom có công trình nghiên cứu việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý

chất thải chứa chitin, và tiếp đó là nghiên cứu của I. G. Cosio, R. A. Fisher, P. A (1982) đề cập đến

quá trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin.

Về sau, trong những năm 1989, việc thu nhận chitinase được tiếp tục nghiên cứu trên các đối

tượng khác như Serratia liquefaciens (S. Joshi, Kozlowski), Myrothecium verrucaria (P. Vyas và

M. V. Deshpand) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của chitinase trong việc phá vỡ vách tế bào

nấm.

Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma.

Năm 1991, C. J. Ulhoa, J. F. Peberdy nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của

Trichoderma harzianum. Năm 1999, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh

tổng hợp chitinase từ Trichoderma hazianum. Năm 2000, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu quá

trình nuôi cấy chìm thu nhận chitinase từ Trichoderma harzianum trong bể lắc. Năm 2003, Ashok

Pandey và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ

Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Dường như Trichoderma là chi nấm đến

nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong

bảo vệ thực vật. Đối với chi nấm Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng

sinh chitinase của chúng trên môi trường bán rắn (Nopakarn Rattanakit và cộng sự, 2002). Những

chủng thuộc chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase là Aspergillus carneus (A. A. Sherief,

1990); A. Fumigatus (Jin-Ian Xia và Jing Xiong, 2009). A. A. Shubakow và P. S. Kucheryavykh

(2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nhiều chủng nấm khác nhau trong đó có các chủng thuộc các chi

nấm Aspergillus và Trichoderma... Tuy nhiên những nghiên cứu về chitinase từ nấm sợi phần lớn

thực hiện trên môi trường nuôi cấy lỏng.

Vi khuẩn cũng là một đối tượng được nghiên cứu về việc sinh tổng hợp chitinase. Năm 1998,

B. Bhushan, G. S. Hoondal nghiên cứu enzyme chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp G-1. Và gần đây

nhất, năm 2009, S. M. Akhir và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy thu nhận

enzyme chitinase từ Bacillus licheniformis bằng phương pháp nghiên cứu bề mặt đáp ứng (RSM).

Ưu điểm của chitinase thu nhận từ vi khuẩn này là tính bền nhiệt của chúng.

Trên đối tượng thực vật, cũng có một vài nghiên cứu thu nhận chitinase. Năm 2004, Isabela

S. Santos và cộng sự có công trình nghiên cứu về chitinase thu nhận trên đối tượng thực vật (hạt cây

Adenanthera pavonina L.), cây họ đậu Phaseolumungo. Kết quả cho thấy chitinase từ hạt cây

Adenanthera pavonina L. là loại enzyme bền nhiệt. Tác giả Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Chou Chen (1998) nghiên cứu thu nhận chitinase chiết rút từ lá khoai lang.

1.3.2. Trong nước

Nhìn chung những nghiên cứu về enzyme chitinase trong nước còn rất hạn chế cho dù tiềm

năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là không thể phủ nhận. Năm 2001, tác giả Đinh Minh Hiệp

có công trình nghiên cứu đặc tính của enzyme chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarius

và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dược.

Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu có

công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme

chitinase của các chủng nấm mốc Trichodrema sp. Năm 2004, tác giả Tô Duy Khương thực hiện đề

tài khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp. và khả năng đối kháng với một số nấm

gây bệnh. Năm 2008, tác giả Nguyễn Đình Nga và cộng sự khảo sát khả năng tác động lên nấm

Candida albicans của enzyme chitinase thu nhận từ thực vật và từ nấm Trichoderma.

Trên đối tượng thực vật, năm 2008, tác giả Đặng Trung Thành đã nghiên cứu quá trình thu

nhận enzyme chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas, thu enzyme chitinase có hoạt tính khá

cao (hoạt độ đạt 192 UI/ml)

Nhìn chung, những nghiên cứu về chitinase trong nước chưa nhiều, chủ yếu vẫn trên nấm

Trichoderma, ứng dụng chủ yếu mới đề cập đến trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và khởi đầu trong

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

lĩnh vực y dược.

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Giống vi sinh vật

Các chủng nấm sợi Aspergillus niger và Aspergillus awamori, Aspergillus sp., Trichoderma

harzianum do phòng thí nghiệm, bộ môn Sinh hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố

Hồ Chí Minh và bộ môn Vi sinh, trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.

2.1.2 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm

2.1.2.1. Môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm sợi

MT 1: Cao nấm men agar – Yeast Extract Agar (YEA) [1, 12]

Cao nấm men 4g

Agar 20g

Glucose 20g

Nước 1000ml

pH = 5,5 – 6,0

Khử trùng 1atm/30 phút

MT 2: Thạch khoai tây Dextrose (PDA) [6, 10, 26]

Nước chiết khoai tây 200ml

Agar 20g

Glucose 20g

Nước 1000ml

pH = 5,5 – 6,0

Khử trùng 1atm/30 phút

MT 3: Malt Extract Agar (YEA) [11,26]

Cao Malt 20g

Pepton 1g

Agar 20g

Glucose 20g

Nước 1000ml

pH = 5,5 – 6,0

Khử trùng 1atm/30 phút

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

2.1.2.2. Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase [12, 13, 29]

MT 4:

3,5g NaNO3

1,5g K2HPO4

0,5g MgSO4.7H2O

KCl 0,5g

0,01g FeSO4.7H2O

Bột chitin 10g

Agar 20g

Nước 1000ml

pH = 6,5

Khử trùng 1atm/30phút

2.1.2.3. Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy phân chitinase từ

các chủng nấm sợi [12,15, 34, 36]

MT 5:

Trấu 50g

Cám 40g

Đường vàng 4g

0,1g (NH4)2HPO4

Urê 2,2g

0,1g CaCl2

KCl 0,05g

0,05g MgSO4.7H20

HCl 0,05g

Bột chitin 10g

Nước 60%

MT 6:

Trấu 50g

Cám 40g

Cao nấm men 1g

0,1g (NH4)2SO4

0,1g CaCl2

KCl 0,05g

0,05g MgSO4.H20

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Bột chitin 10g

Nước 60%

* Thay thế bột chitin bằng nguyên liệu giàu chitin khác (bột vỏ tôm, bột vỏ cua) để nghiên

cứu ảnh hưởng cơ chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của chủng nấm sợi

chọn nghiên cứu.

2.2 DỤNG CỤ THIẾT BỊ HÓA CHẤT

2.2.1 Dụng cụ

- Thước đo khuẩn lạc.

- Bình tam giác các kích cỡ khác nhau (250ml, 500ml, 1000ml).

- Ống nghiệm 5ml, 10ml.

- Đĩa petri.

- Pipetman các loại.

- Buồng đếm hồng cầu.

- Đèn cồn, diêm quẹt, que cấy, giấy lọc, giấy báo cũ, bông không thấm nước, bông thấm

nước, đũa khuấy, phễu, ống đong, vải lọc …

- Nồi nấu môi trường, lò điện.

2.2.2 Thiết bị

- Nồi hấp vô trùng.

- Tủ cấy vô trùng. - Tủ sấy 300C – 1800C.

- Tủ ấm.

- Máy đo pH.

- Máy li tâm.

- Cân phân tích điện tử.

- Máy chụp ảnh kỹ thuật số.

- Máy nghiền mẫu.

- Máy đo độ ẩm.

- Máy đo quang phổ UV / Visible Spectrophometre ...

- Tủ lạnh.

2.2.3 Hóa chất và vật liệu

Glucose, cao nấm men, chitin, agar, cồn, nước cất, khoai tây, trấu, cám; NaNO3, K2HPO4,

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4, Urê, CaCl2, HCl, NaH2PO4, Na2HPO4,

N-acetyl-β-D-Glucosamine, Lugol, thuốc thử DNS, và các hóa chất khác sử dụng trong từng

phương pháp sẽ nêu cụ thể.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống nấm sợi [1, 6, 12]

Thực hiện: Chuẩn bị môi trường PGA, cho vào các ống nghiệm, đem hấp khử trùng, lấy ra để

nguội tạo môi trường thạch nghiêng. Thực hiện trong buồng cấy: cấy bào tử chủng nấm nghiên cứu lên bề mặt thạch trong ống nghiệm. Để ống vừa cấy chuyền ở nhiệt độ phòng (28 – 300C) trong thời gian 7 ngày, sau đó đem vào tủ giữ giống 40C. Sau 2 tháng cấy chuyền một lần.

2.3.2 Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo

đường kính vòng phân giải [1, 12, 22]

Nguyên tắc: khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung chitin, nấm sợi sinh enzyme

chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn và N-acetyl- D- glucosamine.

Các dạng này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ

lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi. Phương

pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp chitinase chứ chưa xác định

chính xác hoạt độ chitinase.

Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase (MT 4), hấp khử trùng ở 121OC trong 30 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng (sấy ở 1600C trong 120 phút) có kích thước

bằng nhau, cho 20ml môi trường từ ống nghiệm vào đĩa, để nguội, sau 1-2 ngày kiểm tra sự tạp

nhiễm. Cấy chấm điểm chủng nấm sợi nghiên cứu vào đĩa, có thể chấm một điểm giữa hoặc 3 điểm trên đĩa petri. Ủ ở nhiệt độ phòng (28-300C) trong 2-3 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để 5 phút rồi

đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo khuẩn lạc.

Nếu D – d ≥ 25mm : hoạt tính enzyme mạnh

D – d ≥ 20mm : hoạt tính enzyme khá mạnh

D – d ≥ 15mm : hoạt tính enzyme trung bình

D – d ≤ 10mm : hoạt tính enzyme yếu

Từ đó chọn chủng có tạo hệ enzyme thủy phân chitinase từ khá trở lên tiếp tục nghiên cứu tối

ưu hóa.

Cách pha dung dịch Lugol

Iod 2,5g

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

KI 5g

Nước 1000ml

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy nấm sợi trên môi trường bán rắn thu enzyme chitinase

[12, 34]

Nguyên tắc: Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường để sinh trưởng, tổng

hợp một lượng lớn enzyme ngoại bào lẫn trong môi trường, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn

enzyme thô từ canh trường.

Thực hiện: Cân 10 gam môi trường bán rắn nuôi cấy nấm sợi thu enzyme chitinase (MT 5) vào các bình tam giác 250 ml, hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút, sau đó để nguội. Dùng giống

trong ống thạch nghiêng, cho 10ml nước cất vô trùng vào mỗi ống, dùng que cấy cà đều bề mặt lấy

hết bào tử tạo dạng huyền phù.Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hống cầu. Cho 2ml huyền phù bào tử vào mỗi bình tam giác chứa môi trường đã chuẩn bị (mật độ bào tử là 105 đến 106 bào

tử/1 gam môi trường). Nuôi ở nhiệt độ phòng. Canh trường nuôi cấy được thu nhận sau từng

khoảng thời gian, điều kiện nhiệt độ, pH nhất định theo mục đích nghiên cứu cụ thể.

2.3.4 Phương pháp tách chiết dịch enzyme thô và thu nhận chế phẩm enzyme từ canh

trường nuôi cấy [1, 12, 15]

Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzyme, dùng nước cất hòa tan

tạo dịch enzyme, sau đó dùng các tác nhân kết tủa khác nhau để kết tủa enzyme. Kết tủa enzyme được sấy ở nhiệt độ dưới 400C, tạo sản phẩm enzyme dạng bột khô.

Thực hiện: Sau khi nuôi cấy trong các điều kiện môi trường cụ thể, cho vào mỗi bình tam

giác (chứa 10 gam môi trường) 80ml nước cất. Lắc trong 1 giờ, tốc độ 200 vòng/ phút, lọc qua vải,

thu dịch lọc. Đem dịch lọc li tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi, ta được dịch enzym thô. Để thu được chế phẩm enzyme (CPE) dạng bột khô, sử dụng tác nhân tủa là Etanol 960 với tỉ lệ

1/3 – 1/4 (dung dịch Enzyme/Etanol) để kết tủa enzyme, ly tâm thu tủa enzyme, sấy nhiệt độ dưới 400C được sản phẩm (CPE).

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương pháp so màu

với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) [11,12]

 Định nghĩa

Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của

dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Dùng

phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất, phương pháp này cho phép tiết kiệm

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

thời gian cùng kết quả chính xác cao so với các phương pháp khác.

 Nguyên tắc

+ đường khử → + đường oxi hóa

3,5-dinitrosalicylic acid 3-amino-5-nitrosalicylate

Khi enzyme phân hủy chitin tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, sản phẩm tạo thành là

N-acetyl-β-D-Glucosamine được hiện màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalisylic acid) và đem đo

mật độ quang ở bước sóng 535nm.

 Hóa chất

* Dung dịch đệm phosphat 0,2M, pH 6,5

- Dung dịch NaH2PO4 0,2M: cân 31,2g NaH2PO4.2H2O hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml.

- Dung dịch Na2HPO4 0,2M: cân 71,6g Na2HPO4.12H2O hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml.

* Thuốc thử DNS

- Dung dịch A: hòa tan 300g muối Na-K tartrat kép vào trong 500ml nước cất.

- Dung dịch B: hòa tan 10g 3,5-dinitrosalicylic acid vào 200ml dung dịch NaOH 2N.

- Thuốc thử DNS dùng trong phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nước cất cho

đủ 1 lít. Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, bảo quản trong chai

nâu và tránh không khí.

 Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1%

Do chitin không hòa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần

huyền phù hóa chitin: Lấy 5 gam chitin hòa tan trong 50ml HCl đậm đặc. Khuấy đều trong vòng 3

phút ở 40C. Sau đó cho nước cất lạnh 5C từ từ tới 500ml, chitin sẽ tạo huyền phù màu trắng sữa.

Huyền phù sẽ được lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút). Rửa nước cất nhiều

lần để pH đạt trung tính, bảo quản huyền phù ở tủ lạnh (2-6C).

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

 Dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn Glucosamine

1 2 4 5 Ống nghiệm số 0 3 6 7

Nồng độ N-acetyl-β-D-

1 2 4 5 Glucosamine 10µmol/ml 0 3 6 7

chuẩn (µmol/ml)

Thể tích dung dịch N-acetyl-β- 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 D-Glucosamine (ml)

1 Thể tích nước cất (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3

1 1 1 1 1 1 1 1 DNS (ml)

Lắc đều, đun sôi 5 phút

5 5 5 5 5 5 5 5 H2O (ml)

Lắc đều, để yên 5 phút, đo OD ở bước sóng 535 nm

Chuẩn bị dung dịch N-acetyl-β-D-Glucosamine chuẩn 10µmol/ml: cân chính xác 0,0221g N-

acetyl-β-D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 10ml.

Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ N-acetyl-β-D-Glucosamine và giá

trị OD.

 Xác định hoạt độ enzyme chitinase

Nguyên tắc: hoạt độ enzyme chitinase được xác định đựa trên phương pháp định lượng

glucosamine trong quá trình phân giải chitin. Lượng glucosamine tạo ra được xác định theo phương

pháp Elson- Morgan.

Tiến hành

 Đối với enzyme làm thí nghiệm

Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày.

Cho vào ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml huyền phù chitin 1% và 1ml dịch enzyme

chitinase. Hỗn hợp này được ủ ở 50C trong vòng 60 phút.

Ngừng phản ứng bằng 1ml NaOH 1N và đun sôi cách thủy trong 5 phút.

Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút hoặc lọc, thu dịch nổi.

Cho 1ml dịch nổi và 1ml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh

trong bồn làm lạnh.

Thêm 5ml nước cất, lắc đều và đo OD với bước sóng 535nm.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

 Đối với dịch enzyme làm đối chứng

Cho 1ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 1ml NaOH 1N, sau đó cho thêm 1ml dịch

huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên.

 Cách tính [16]

Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1g

N-acetyl-β-D-Glucosamine (NAG) từ chitin huyền phù trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ phản ứng (500C).

Vna .. t

Tổng hoạt tính (đvht) =

'.. vna mtv ..

Hoạt tính chung (đvht/g.CP.E ) =

Trong đó

a: hàm lượng glucosamine (g /ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng

n: hệ số pha loãng

V: thể tích dịch môi trường nuối cấy (ml)

v’: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml)

v : thể tích enzyme thí nghiệm (ml)

t : thời gian phản ứng (phút)

m : khối lượng enzyme (g)

2.3.6 Phương pháp khảo sát sự biến thiên hoạt độ của hệ enzyme chitinase của các

chủng nấm sợi theo các điều kiện nuôi cấy khác nhau (nhiệt độ, thời gian, chất

cảm ứng) khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn [12, 23]

Nguyên tắc

Yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi như thời

gian nuôi cấy, nhiệt độ môi trường nuôi, loại cơ chất cảm ứng ... Khảo sát các yếu tố trên nhằm

chọn ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng nấm sợi nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase có hoạt

độ cao nhất.

2.3.6.1. Xác định thời gian thích hợp để thu nhận chitinase có hoạt độ cao nhất ở các chủng nấm

sợi nghiên cứu

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy (mục 2.3.3). Cấy các chủng nấm sợi.

Thu dịch chiết enzyme (mục 2.3.4) tại các thời điểm nuôi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ,

72 giờ, 84 giờ, 96 giờ.

Xác định sự biến thiên hoạt độ enzyme (mục 2.3.5) chitinase theo thời gian nuôi cấy các

chủng nấm sợi nghiên cứu.

2.3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi đối với đối với khả năng sinh tổng hợp

chitinase ở các chủng nấm sợi nghiên cứu

Sử dụng Môi trường 5 (mục 2.1.2), nuôi cấy trong thời gian tối ưu đã khảo sát ở trên ở các

nhiệt độ môi trường 20OC, 25OC, 30OC, 35OC, 40OC, 450C.

Tiến hành thu dịch chiết enzyme, tiến hành xác định hoạt độ enzyme (theo mục 2.3.5)

2.3.6.3. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng (chitin) đến khả năng sinh tổng hợp

chitinase của các chủng nấm sợi

Sử dụng Môi trường 5 (mục 2.1.2), lần lượt bổ sung chitin ở các nồng độ 0,0%, 5%, 10%,

15%, 20%. Nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian tối ưu đã khảo sát ở mục 2.3.6.1 và 2.3.6.2.

Tiến hành thu dịch chiết enzyme, xác định hoạt độ chitinase.

2.3.6.4. Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase ở các chủng

nấm sợi nghiên cứu

Sử dụng Môi trường 4 (mục 2.1.2), trong đó sử dụng thay thế lần lượt bột chitin, bột vỏ tôm,

bột vỏ cua (tương ứng lượng chitin là 10%). Nuôi cấy trong thời gian và nhiệt độ tối ưu đã khảo sát

ở trên, thu dịch enzyme thô, tiến hành xác định hoạt độ enzyme (theo mục 2.3.5)

2.3.7 Phương pháp tối ưu điều kiện môi trường nuôi cấy nấm sợi bằng qui hoạch thực

nghiệm [2]

Để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy chủng nấm sợi chọn thu chế phẩm

enzyme chitinase, chúng tôi dùng thực nghiệm yếu tố toàn phần. Từ các kết quả thí nghiệm nghiên

cứu ảnh hưởng riêng lẻ từng yếu tố, chúng tôi chọn 3 yếu tố là thời gian nuôi cấy, nhiệt độ môi

trường nuôi cấy và nồng độ chitin trong môi trường nuôi cấy để nghiên cứu tối ưu hóa theo

phương pháp qui hoạch thực nghiệm.

- Lập ma trận đầy đủ với số thí nghiệm N = 23 = 8. Vì không làm thí nghiệm song song nên

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

để xác định phương sai tái hiện, chúng tôi làm 3 thí nghiệm ở tâm (mức cơ sở).

Bảng 2.2. Ma trận qui hoạch thực nghiệm

y x1 x2 x3 STT thí nghiệm

1 + + + y1

2 + + - y2

3 + - + y3

4 + - - y4

5 - + + y5

6 - + - y6

7 - - + y7

8 - - - y8

9 0 0 0 y0(1)

10 0 0 0 y0(2)

11 0 0 0 y0(3)

- Dùng PTHQ tuyến tính dạng:

ŷ = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3

trong đó ŷ: hoạt độ chitinase theo phương trình hồi qui (PTHQ)

N

b



j

yx ji

i

- Tính b0, b1, b2, b3 ... bj - các hệ số của phương trình hồi qui bằng công thức:



1 N

i

1 

N

(

)

y

xx j

l

i

i

b

 i  1

jl

N

- Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số PTHQ theo tiêu chuẩn Student

3

u

1 u

+ Giá trị trung bình của thông số tối ưu hóa (hoạt độ chitinase) của 3 thí nghiệm tại tâm:

)0( y 3

+ Phương sai tái hiện:

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

ŷ0 =

n

2

(

y

y

)



)0(

0

u



u

1 

s



với n: số thí nghiệm tại tâm (ở đây n=3)

2 th

n

1



+ Sai số tính cho bi:

s

s

bi 

th N

+ Tính các giá trị t:

| |bj tj = sbj

với tlt: p=0,05; bậc tự do f = n-1 = 2 → t(0,05;2)= 4,3 (Tra bảng Student)

Hệ số có ý nghĩa phải thỏa mãn điều kiện tj > tlt

- Kiểm định sự tương thích của PTHQ theo tiêu chuẩn Fisher

+ Flt: giá trị chuẩn Fisher ở mức p = 0,05; f1 = N-l; f2 = n-1; trong đó N=8, l: số hệ số có ý

nghĩa, n = 3.

2

y

(

)ˆ y



i



F  tn

s



với

+ Ftn:

2 du

lN 

2 s du 2 s th

PTHQ thu được tương thích với thực nghiệm khi Ftn < Flt

Từ PTHQ, nhận xét ảnh hưởng các yếu tố lên quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng

nấm sợi chọn nghiên cứu. Sau đó tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp đường dốc

nhất, bắt đầu từ điểm không, là mức cơ sở. Từ kết quả thu được chọn điều kiện môi trường nuôi cấy

thích hợp cho chủng nấm sợi chọn nghiên cứu sinh trưởng và tạo chitinase có hoạt tính cao nhất.

 sth

2.3.8 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase

thu nhận từ một số chủng nấm sợi nghiên cứu

2.3.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với khả năng xúc tác của chế phẩm enzyme

Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 10ml nước cất. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ ủ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên của sản phẩm tạo thành (glucosamine)

theo nhiệt độ, tìm ra nhiệt độ hoạt động tối ưu của chế phẩm enzyme.

chitinase

pH = 3,0 – 4,0: sử dụng đệm citrate

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

2.3.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với khả năng xúc tác của chế phẩm enzyme chitinase

pH = 4,5 – 5,5: sử dụng đệm acetate

pH = 6,0 – 9,0: sử dụng đệm phosphate

Cân mỗi 0,1g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 5ml dung dịch đệm ở các pH 3,0; 3,5; 4,0;

4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0.

Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong điều kiện nhiệt độ ủ tối ưu đã xác định ở mục

2.3.7a. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên của lượng sản phẩm tạo thành (glucosamine) theo

pH, tìm ra pH tối ưu của hoạt động chế phẩm.

2.3.8.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên sản phẩm tạo thành của chế phẩm

Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 10ml nước cất.

Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu (mục

2.3.7a, b); thời gian phản ứng thay đổi từ 10 phút đến 90 phút, mỗi lần cách nhau 10 phút. Từ đó vẽ

đồ thị biễu diễn sự biến thiên hàm lượng glucosamine tạo ra theo thời gian phản ứng, tìm ra thời

gian phản ứng tối ưu của chế phẩm enzyme chitinase.

enzym chitinase

2.3.9 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng bước đầu của chế phẩm chitinase thu nhận từ

chủng nấm sợi được chọn

Chọn các đối tượng sâu khác nhau, xử lý dung dịch chế phẩm enzyme ở các nồng độ 0%,

1%, 2%. Theo dõi tỉ lệ sâu chết qua các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150

phút. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, thống kê số liệu. Đánh giá khả năng diệt côn trùng, sâu hại của chế

phẩm enzyme.

2.3.9.1 Ứng dụng bước đầu trong diệt côn trùng sâu hại

Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 10ml dung dịch đệm có pH tối ưu đã xác định ở

mục 2.3.8.2.

Sử dụng cơ chất chitin dạng bột 10% và chitin huyền phù 1%, tiến hành phản ứng enzyme

trong nhiệt độ tối ưu, thời gian 70 phút.

Xác định hàm lượng glucosamine tạo thành, đánh giá hiệu suất tạo glucosamine.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

2.3.9.2 Ứng dụng bước đầu trong sản xuất glucosamine

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT SƠ BỘ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA MỘT SỐ

CHỦNG NẤM SỢI

Chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ (phương pháp định tính) khả năng tổng hợp chitinase của

một số chủng nấm sợi gồm Trichoderma harzianum, Aspergillus niger, Aspergillus awamori,

Aspergillus sp. (hình 3.1) qua việc xác định đường kính vòng phân giải (theo phương pháp đã giới

thiệu ở mục 2.3.4). kết quả biểu thị ở bảng 3.1 và hình 3.2.

Th2: Trichoderma harzianum

As: Aspergillus sp.

AA: Aspergillus awamori

AN: Aspergillus niger

Hình 3.1. Các chủng nấm được chọn nghiên cứu

Bảng 3.1. Đường kính vòng tròn phân giải

19,8

20.9

19.7

20,13

Chủng nấm Đường kính trung bình vòng enzyme phân giải D – d (mm)

24.6

24.5

24.8

Aspergillus niger

21.6

21.3

21.2

Aspergillus awamori 24,60

21,2

20,5

22,7

Aspergillus sp. 21,36

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Trichoderma harzianum 21,46

Kết quả cho thấy cả bốn chủng chọn nghiên cứu đều có khả năng phân giải chitin, trong đó

chủng Aspergillus niger có khả năng tổng hợp enzyme chitinase thấp nhất. Từ đó chúng tôi chọn

ba chủng Aspergillus awamori, Aspergillus sp., Trichoderma harzianum tiếp tục nghiên cứu.

Asp. awamori

Asp. niger

T. harzianum

Aspergillus. sp.

Hình 3.2. Vòng phân giải enzyme chitinase của các chủng nấm sợi nghiên cứu

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CÁC YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH

TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI NUÔI CẤY

TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN

Thí nghiệm tiến hành với mục đích xác định thời gian nuôi cấy thích hợp để thu enzym

chitinase có hoạt độ cao nhất. Quá trình nuôi cấy các chủng tiến hành theo mục 2.3.3 nhằm thu nhận

canh trường, tiến hành khảo sát hoạt độ hệ enzyme thủy phân của canh trường tại các thời điểm

nuôi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ, 108 giờ với điều kiện nuôi cấy là: nhiệt độ 300C, 10 gam môi trường/bình tam giác 250ml. Pha loãng dịch chiết enzyme 10 lần (hệ số

pha loãng n=1) trước khi đem xác định hoạt độ chitinase theo mục 2.3.5. Kết quả thu được trình bày

ở bảng 3.3 và đồ thị 3.1

3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

 Nhận xét:

Từ kết quả khảo sát, chúng tôi nhận thấy hệ enzyme chitinase của canh trường đối với chủng

nấm sợi Aspergillus awamori có hoạt độ cao nhất ở khoảng thời gian nuôi cấy là 36 giờ, chitinase

của Aspergillus sp. có hoạt độ cao nhất ở khoảng thời gian nuôi cấy là 72 giờ và Trichoderma

harzianum có hoạt độ cao nhất ở khoảng thời gian nuối cấy là 60 giờ. Trong cả ba chủng thì

Aspergillus awamori tổng hợp chitinase có hoạt độ cao nhất trên môi trường nuôi cấy thí nghiệm,

hoạt độ đạt 1,02 UI/gCT, ngoài ra thời gian thu nhận enzyme đạt hoạt độ cao ngắn (36 giờ), đây là

ưu điểm cần chú ý đến vì sẽ nâng cao hiệu suất thu nhận enzyme nhờ tiết kiệm thời gian nuôi.

Bảng 3.2. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase của các chủng nấm sợi theo thời gian nuôi cấy

24

0,035

10,179

0,51

Chủng ∆OD‹535nm› Thời gian nuôi cấy (giờ) Lượng Glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCT)

48

0,064

18,792

0,94

60

0,049

14,486

0,72

36 0,069 20,358 1,02

72

0,028

8,124

0,41

84

0,018

5,383

0,27

96

0,013

3,915

0,20

108

0,007

2,153

0,11

24

0,018

5,383

0,27

36

0,029

8,515

0,43

48

0,038

11,158

0,56

60

0,048

14,192

0,71

Aspergillus awamori

84

0,048

14,094

0,70

96

0,035

10,375

0,52

108

0,014

4,013

0,20

24

0,012

3,426

0,17

36

0,024

7,145

0,36

48

0,043

12,626

0,63

Aspergillus sp. 72 0,059 17,226 0,86

60 0,061 18,009 0,90

72

0,056

16,541

0,83

84

0,048

13,996

0,70

96

0,040

11,647

0,58

108

0,028

8,124

0,41

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Trichoderma harzianum

1.40

1.20

) T C g

1.02

/ I

U

1.00

0.90

0.86

A. awamori

0.80

Aspergillus sp.

T.harzianum

0.60

0.40

( e s a n i t i h c ộ đ t ạ o H

0.20

0.00

24

36

48

60

72

84

96

108

Thời gian (giờ)

Đồ thị 3.1. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường theo thời gian nuôi cấy

Từ kết quả thu được ở mục 3.2.1, chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy đối với chủng

Aspergillus awamori là 36 giờ, chủng Aspergillus sp. là 72 giờ và Trichoderma harzianum là 60 giờ

để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của

các chủng.

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy (MT5) như phương pháp trình bày ở mục 2.3.3. Các bình tam giác nuôi cấy được đặt ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C. Tùy từng chủng chúng tôi tiến hành thu nhận dịch enzyme thô từ canh trường nuôi cấy tại thời điểm thời gian tối ưu nêu trên, tiến hành xác định hoạt độ enzyme chitinase trong dịch enzyme

thô.

Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.3 và đồ thị 3.2.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy

môi trường nuôi cấy

Bảng 3.3. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase của canh trường các chủng nấm sợi theo nhiệt độ

20

0,013

3,719

0,19

25

0,044

13,017

0,65

30

0,069

20,162

1,01

∆OD‹535nm› Chủng Nhiệt độ (0C) Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Lượng glucosamine tạo thành (µG/ml)

40

0,055

16,149

0,81

45

0,023

6,753

0,34

50

0,005

1,370

0,07

20

0,019

5,677

0,28

25

0,047

13,898

0,69

30

0,057

16,835

0,84

35

0,061

18,009

0,90

35 0,078 22,805 1,14 Aspergillus awamori

Aspergillus sp.

45

0,048

14,094

0,70

50

0,032

9,396

0,47

20

0,015

4,502

0,23

25

0,040

11,843

0,59

40 0,066 19,281 0,96

35

0,057

16,639

0,83

30 0,064 18,890 0,94

40

0,039

11,549

0,58

45

0,025

7,439

0,37

50

0,012

3,426

0,17

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Trichoderma harzianum

1.40

1.20

1.14

) T C g

/ I

0.96

1.00

U

0.94

A. awamori

0.80

0.60

Aspergillus. sp. T. harzianum

0.40

( e s a n i t i h c ộ đ t ạ o H

0.20

0.00

20

25

30

35

40

45

50

Nhiệt độ (độ C)

cấy

Đồ thị 3.2. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường các chủng nấm sợi theo nhiệt độ nuôi

Khi nhiệt độ tăng dần trong khoảng 250C đến 350C, hoạt độ chitinase của các chủng nấm sợi

cũng tăng, trong đó chủng Aspergilllus awamori đạt hoạt độ chitinase cao nhất (1,14UI/gCT) tại khoảng nhiệt độ 350C, nhưng cao hơn nhiệt độ này, tại khoảng nhiệt độ 400C, hoạt độ chitinase

giảm đáng kể.

Trong khi đó, chủng Aspergillus sp. thể hiện có khả năng chịu nhiệt, theo dõi quá trình sinh

trưởng của nấm ở các khoảng nhiệt độ biến thiên ở trên, chúng tôi nhận thấy hệ sợi nấm phát triển tốt bám chặt cơ chất, tuy nhiên hoạt độ chitinase cao nhất tại nhiệt độ nuôi 400C là 0,96UI/gCT,

thấp hơn so với Aspergilllus awamori. So sánh với nghiên cứu của Jin-Ian Xia và Jing Xiong (2009)

trên nấm Aspergillus fumigatus thì nhiệt độ tối ưu cho nấm này sinh chitinase hoạt độ cao nhất (0,118UI/ml) là 550C. Tác giả Phakapob Setthakaset và cộng sự (2008) thu nhận chitin từ Aspergillus sp thì ở nhiệt độ tối ưu là 450C, hoạt độ chitinase cao nhất đạt 3,1UI/ml.

Đối với Trichoderma harzianum, hoạt độ chitinase cao nhất ở khoảng nhiệt độ 300C, đạt

0,94UI/gCT, thấp nhất trong ba chủng nghiên cứu.

 Nhận xét:

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với mục đích xác định hàm lượng chitin trong môi trường

nuôi cấy thích hợp để thu enzyme chitinase có hoạt độ cao nhất. Quá trình nuôi cấy các chủng tiến

hành theo mục 2.3.2 nhằm thu nhận canh trường tại thời điểm tối ưu tương ứng, tiến hành khảo sát

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitin trong môi trường nuôi cấy

hoạt độ hệ enzyme thủy phân với các hàm lượng khác nhau của chitin trong môi trường nuôi cấy là

0,0%, 5%; 10%; 15%; 20% với 10 gam môi trường/bình tam giác 250ml. Pha loãng dịch chiết

enzyme 10 lần (hệ số pha loãng n=1) trước khi đem xác định hoạt độ chitinase theo mục 2.3.5. Kết

quả thể hiện ở bảng 3.4 và đồ thị 3.3.

Khi không có mặt chitin trong môi trường nuôi cấy, các chủng nấm sợi vẫn sinh tổng hợp

chitinase nhưng hoạt độ thấp, sản lượng không đáng kể. Điều này thể hiện chitinase vừa là enzyme

cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng.

Khi bổ sung bột chitin vào môi trường bán rắn, chitin là chất cảm ứng kích thích nấm sợi sản

sinh nhiều chitinase. Theo kết quả thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy, ở nồng độ chitin trên môi

trường bán rắn là 10 – 15% hoạt độ chitinase đạt giá trị cao nhất, vượt qua nồng độ chitin 15%, hoạt

độ enzyme chitinase có xu hướng giảm. Trong các chủng nấm sợi nghiên cứu, Aspergillus awamori

vẫn thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitinase có hoạt tính cao, đạt 1,16UI/gCT ở nồng độ chitin là

15%, từ nồng độ chitin 10% đến 15%, hoạt độ chitinase tăng không đáng kể. Chủng Aspergillus sp.

thể hiện nhu cầu chất cảm ứng chitin không cao, vượt qua tỉ lệ chitin bổ sung vào môi trường nuôi

10% thì hoạt độ enzyme giảm. Còn ở nấm sợi Trichoderma harzianum, khi môi trường không có

chitin thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitinase cao hơn hẳn hai chủng nấm còn lại. Tuy nhiên khi

nồng độ chitin tăng, hoạt độ enzyme tăng đáng kể và đạt giá trị cao nhất ở nồng độ chitin trong môi

trường bán rắn là 1,04UI/gCT, vẫn thấp hơn so với Aspergillus awamori.

 Nhận xét:

trong môi trường nuôi cấy

Bảng 3.4. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase của các chủng nấm sợi theo hàm lượng chitin

0

0,016

4,796

0,24

5

0,026

7,732

0,39

10

0,078

22,805

1,14

∆OD‹535nm› Chủng Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Hàm lượng chitin (%) Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml)

20

0,043

12,724

0,64

00

0,013

3,915

0,20

5

0,038

11,158

0,56

Aspergillus awamori 15 0,079 23,196 1,16

15

0,066

19,281

0,96

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Aspergillus sp. 10 0,067 19,673 0,98

0,049

14,388

0,72

20

0,027

8,026

0,40

0

0,052

15,171

0,76

5

0,065

19,086

0,95

10

0,054

15,856

0,79

20

1.40

Trichoderma harzianum 0,071 20,847 1,04 15

1.16

1.20

) T C g

/ I

1.04

0.98

U

1.00

A.awamori

0.80

Aspergillus sp.

T. harzianum

0.60

0.40

( e s a n i t i h c ộ đ t ạ o H

0.20

0.00

0

5

10

15

20

Hàm lượng chitin (%)

Đồ thị 3.3. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường các chủng nấm sợi theo hàm

lượng chất cảm ứng (chitin) trong môi trường nuôi cấy

3.2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp chitinase của

Từ kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy Aspergillus awamori thể hiện khả năng sinh tổng

hợp chitinase có hoạt độ cao nhất trong ba chủng nghiên cứu, thời gian nuôi cấy ngắn (36 giờ). Do

đó, chúng tôi quyết định chọn chủng Asprgillus awamori để nghiên cứu tiếp tục nhằm thu nhận

enzyme. Trước hết, chúng tôi khảo sát chất cảm ứng phù hợp để chủng này sinh tổng hợp chitinase

có hoạt độ cao nhất, chất cảm ứng được sử dụng gồm: bột chitin, bột vỏ tôm và bột vỏ cua, với hàm

lượng chitin 16%, từ đó suy ra lượng chất cảm ứng cần bổ sung (phụ lục 2). Kết quả thu được thể

hiện ở bảng 3.5 và đồ thị 3.4.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

chủng Aspergillus awamori

chất cảm ứng

Bảng 3.5. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus awamori theo loại

Bột vỏ tôm

0,057

16,639

Chủng Chất cảm ứng ∆OD‹535nm› Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Bột chitin 0,079 23,196 1,16 Aspergillus

Bột vỏ cua

0,055

16,052

0,83 awamori

0,80

Chủng Aspergillus awamori

1.40

1.16

1.20

) T C g

/ I

U

1.00

(

0.83

0.80

0.80

e s a n i t i

0.60

h c

0.40

ộ đ t ạ o H

0.20

0.00

Bột chitin

Bột vỏ tôm

Bột vỏ cua

Loại chất cảm ứng

bổ sung

Biểu đồ 3.1. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường Asp. awamori theo loại chất cảm ứng

Hoạt độ chitinase cao nhất (1,16UI/gCT) khi sử dụng chất cảm ứng là bột chitin. Như vậy,

chất chitin dạng bột là chất cảm ứng tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của

Aspergillus awamori. Điều này có thể giải thích do trong vỏ của tôm cua còn chứa nhiều khoáng,

ảnh hưởng đến hoạt động sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi.

 Nhận xét

Từ các kết quả thu được, có thể thấy hoạt độ enzyme chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus

awamori cao nhất, ngoài ra thời gian nuôi cấy chủng này ngắn, thuận lợi cho việc thu nhận enzyme,

do đó chúng tôi chọn chủng này nghiên cứu tối ưu bằng qui hoạch thực nghiệm

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

 Thảo luận

3.3 KẾT QUẢ QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM NHẰM TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN MÔI

TRƯỜNG NUÔI CẤY ẢNH HƯỞNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE

Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành làm quy hoạch thực nghiệm, chọn các yếu tố ảnh hưởng

với các giới hạn và miền khảo sát như ở bảng 3.6

CỦA ASPERGILLUS AWAMORI

Bảng 3.6. Các mức và khoảng biến thiên

30

42

6

36

X1 : thời gian (giờ)

30

40

5

35

X2 : nhiệt độ (độ C)

10

20

5

15

X3 : nồng độ chitin (%)

Thiết lập ma trận thí nghiệm, ma trận mở rộng sau khi đưa thêm cột biến ảo x0 = +1 và các

hệ số tương tác. Thu được kết quả như bảng 3.7.

Các mức Khoảng biến Yếu tố Mức dưới Tâm Mức trên thiên (-) (+) (0)

enzyme chitinase của canh trường Asp. awamori

Các yếu tố theo tỉ lệ xích tự nhiên

Các yếu tố trong hệ mã hóa

Bảng 3.7. Ma trận mở rộng và kết quả quy hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ

1,64

42

40

1

+

+

+

20

0,67

42

40

2

+

+

-

10

1,20

42

30

3

+

-

20

+

0,20

42

30

4

+

-

-

10

0,58

30

40

5

-

+

+

20

0,10

30

40

6

-

+

-

10

1,27

30

30

7

-

-

+

20

0,92

30

30

8

-

-

-

10

1,31

36

35

9

0

0

0

10

1,34

36

35

10

0

0

0

10

1,31

36

35

11

0

0

0

10

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

y x1 x2 x3 Z1 Z2 Z3 STT thí nghiệm

Ghi chú:

Z1: Thời gian nuôi cấy (giờ) Z2: Nhiệt độ môi trường nuôi cấy (0C)

Z3: Hàm lượng chitin trong môi trường nuôi cấy (%)

x1, x2, x3: biến số mã hóa của biến thực Z1,Z2, Z3

(-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên.

y là hoạt độ enzyme chitinase thu được sau đo OD535.

Phương trình biểu diễn mối quan hệ có dạng y = f (x1, x2, x3)

Hàm mục tiêu có dạng:

ŷ=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b12x1x2+b13x1x3+b23x2x3+b123x1x2x3

trong đó b0, b1,b2, b3, b12, b13, b23, b123 là các hệ số của phương trình hồi qui.

ŷ là hoạt độ enzyme chitinase ước tính.

Các hệ số trong PTHQ được xác định theo công thức mục 2.3.7.

Kết quả tính được:

0,82

0,11

-0,08

0,35

0,30

0,14

0,01

-0,02

b0 b1 b2 b3 b12 b13 b23 b123

Hệ số có ý nghĩa phải thỏa mãn điều kiện: tj > tlt

tlt tính theo công thức ở mục 2.3.7

147,60

18,92

13,64

62,91

54,33

25,74

2,42

t0 t1 t2 t3 t12 t13 t23 t123

-3,52

So sánh các hệ số tj với tlí thuyết ta thấy các hệ số của phương trình đều có nghĩa, ngoại trừ hệ

số t 23 và t123.

Như vậy, sau khi giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương trình hồi

quy, ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student với p = 0,05, số bậc tự do f = 3-1 =

2, chúng tôi thu được phương trình hồi quy

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Kiểm tra sự tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher với

Ftính = 6,19; F0.95(5;1;2) = 19,296. Do Ftính < F0.95(5;1;2) nên phương trình hồi quy thu được tương thích

với thực nghiệm.

Từ PTHQ thu được, ta thấy muốn tăng giá trị của thông số tối ưu hóa cần tăng giá trị x1 (thời

gian) và x3 (hàm lượng chitin), giảm giá trị x2 (nhiệt độ). Từ đó chúng tôi tiến hành tối ưu hóa quá

trình khảo sát hàm mục tiêu bằng phương pháp leo dốc (phương pháp Box-Wilson). Đối với thời

gian nuôi, chúng tôi chọn bước nhảy là 2 giờ, đối với nhiệt độ, chúng tôi chọn bước nhảy (giảm

dần) là 1, còn đối với hàm lượng chitin, chúng tôi chọn bước nhảy là 2 (tăng dần). Tiến hành bố trí

thí nghiệm và kết quả thu được như bảng 3.8.

ŷ=0.82 + 0.11x1 - 0.08x2 + 0.35x3 + 0.30x1x2+0.14x1x3

y

Z1

Z3

Z2

STT TN

1

36

10

1,15

35

2

38

12

1,38

34

3

40

14

1,42

33

4

Bảng 3.8. Kết quả nuôi cấy Aspergillus awamori theo kế hoạch leo dốc

5

44

18

1,41

31

6

46

20

1,23

30

7

48

22

1,19

29

Kết quả cho thấy, điều kiện nuôi cấy trên môi trường bán rắn thích hợp cho Aspergillus

awamori sinh trưởng và tạo chitinase là chất cảm ứng là chitin, thời gian nuôi cấy 42 giờ, nhiệt độ môi trường nuôi cấy là 320C, hàm lượng chitin trong môi trường là khoảng 16%, ta tiếp tục nuôi

cấy đồng loạt để thu enzyme chitinase.

42 16 1,69 32

3.4 THU NHẬN ENZYME CHITINASE

Khối lượng môi trường vào bình tam giác lớn, khoảng 50-60gMT/bình (hoặc có thể sử dụng bịch nilon chịu nhiệt). Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 320C, bổ sung lượng chitin vào môi trường là 16%, sau 42 giờ thu chế phẩm.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

3.4.1 Nuôi Aspergillus awamori trên môi trường bán rắn

Hình 3.3. Nuôi Asp. awamori trên môi trường bán rắn trong bình tam giác 1000ml để thu nhận

enzyme

Trong ngày đầu tiên (sau 24 giờ) thì sự xuất hiện sợi nấm mốc chưa thấy rõ, sau đó xuất

hiện những sợi trắng mờ mọc lan ra, chủ yếu là ở bề mặt, càng sâu vào trong môi trường thì càng ít.

Sau đó sợi nấm lan ra mạnh, bám chặt cơ chất, thấy rõ màu trắng hơi đục của hệ sợi trên môi

trường. Sau khoảng 36 giờ trở đi thì thấy rõ bào tử màu nâu xuất hiện khắp trên bề mặt môi trường.

 Nhận xét

Sau 42 giờ nuôi cấy trong bình tam giác 1000ml, ta tiến hành trích ly enzyme bằng nước cất

với tỷ lệ môi trường/nước là ¼. Dịch chứa enzyme này sẽ được ly tâm lạnh để loại bỏ bào tử và tơ

nấm, ta sẽ thu được dịch enzyme thô gồm có chitinase, nước và các chất hòa tan khác.

3.4.2 Thu nhận chế phẩm enzyme chitinase

Dịch trích ly enzyme

Dịch enzyme sau ly tâm

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Chọn ethanol làm tác nhân kết tủa trong thời gian 12 giờ. Ly tâm để thu tủa, đem sấy ở nhiệt độ thấp (dưới 300C) cho đến khô, lượng chế phẩm enzyme chitinase bán tinh sạch dạng bột khô

được đóng gói và đem bảo quản trong tủ lạnh.

Hình 3.4. Dịch chiết enzyme chitinase

Hình 3.5. Dịch enzyme khi tủa bằng cồn

trên môi trường bán rắn

Bảng 3.9. Kết quả thu nhận chế phẩm enzyme chitinase dạng bột khi nuôi cấy Aspergillus awamori

80

0,7

102,39

Hoạt độ Canh trường CPE (gam) Lần thí nghiệm (UI/gCPE) (gam)

80

1,0

101,67

1

80

0,9

100,95

2

3

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Trung bình 80 0,86 101,67

Hình 3.6. Tủa enzyme thu được sau khi ly tâm (trái) và sau khi sấy khô (phải)

Hình 3.7. Chế phẩm enzyme bán tinh sạch đem bảo quản trong tủ lạnh

3.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN HOẠT

ĐỘNG XÚC TÁC CỦA CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THU NHẬN TỪ

ASPERGILLUS AWAMORI

Sau khi tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.8, xác định lượng glucosamine tạo thành sau khi

thủy phân bởi chế phẩm chitinase, kết quả thể hiện trên bảng 3.10 và đồ thị 3.5.

3.5.1 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme chitinase

Asp.awamori theo nhiệt độ phản ứng

Bảng 3.10. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành dưới tác động chế phẩm chitinase

Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) ∆OD‹535nm› Chủng

30

0,101

29,558

40

0,115

33,767

Nhiệt độ phản ứng (0C)

60

0,061

17,813

70

0,032

9,494

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

50 0,125 36,801 Aspergillus awamori

80

0,008

2,447

A. awamori

) l

40

/

36.801

30

m m a g o r c i m

i

20

l

10

( e n m a s o c u g g n ợ ư L

0

30

40

50

60

70

80

Nhiệt độ phản ứng (độ C)

awamori theo nhiệt độ phản ứng

Đồ thị 3.4. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành dưới tác động chế phẩm chitinase Asp.

Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ thích hợp cho chitinase của chủng Aspergillus awamori trong phản ứng thủy phân dao động từ 300C – 500C và nhiệt độ tối ưu là 500C.

 Nhận xét:

Sau khi chuẩn bị dung dịch đệm ở các pH khác nhau từ 3,0 đến 9,0 (xem phụ lục), chúng tôi

hòa tan 0,1 gam chế phẩm trong 5 ml mỗi dung dịch đệm. Đem ủ với chitin huyền phù ở nhiệt độ

tối thích ở mục 3.5.1 trong thời gian 60 phút. Kết quả xác định lượng glucosamine tạo thành thể

hiện ở bảng 3.11 và đồ thị 3.6.

3.5.2 Kết quả xác định pH thích hợp cho hoạt động của enzyme

chitinase Asp. awamori ở các pH khác nhau

Bảng 3.11. Sự biến thiên hoạt lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm

3,0

0,097

28,384

3,5

0,088

25,741

∆OD‹535nm› Chủng Giá trị pH Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml)

4,5

0,118

34,746

4,0 0,157 46,197

5,0

0,130

38,073

5,5

0,100

29,265

6,0

0,073

21,533

6,5

0,066

19,252

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Aspergillus awamori

7,0

0,036

10,668

Asp. Awamori

50

46.197

40

i

) l

/

30

l

20

m m a g o r c i m

(

10

e n m a s o c u G g n ợ ư L

0

3.0

3.5

4.0

4.5

5.5

6.0

6.5

7.0

5.0

pH

Asp. awamori ở các pH khác nhau

Đồ thị 3.5. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase

Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy pH thích hợp cho chitinase của chủng

Aspergillus awamori trong phản ứng thủy phân dao động từ 3,0 – 5,0 và pH tối ưu là 4,0.

 Nhận xét

Sau khi tiến hành thí nghiệm thủy phân chitin bằng CPE chitinase ở các thời gian khác nhau

(mục 2.3.8.3) và tiến hành xác định lượng glucosamine tạo thành, chúng tôi thu được kết quả như

bảng 3.12 và đồ thị 3.7.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

3.5.3 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng lên lượng sản phẩm tạo thành

Asp. Awamori theo thời gian phản ứng

Bảng 3.12. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase

10,473

10

0,036

21,533

20

0,073

34,746

30

0,118

43,554

40

0,148

48,252

50

0,164

Thời gian phản ứng Chủng ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) (phút)

49,721

70

0,169

49,525

80

0,169

49,427

90

0,168

60

Aspergillus awamori 49,818 60 0,170

) l

49.818

/

50

i

m g o r c m

40

(

i

30

20

l

10

e n m a s o c u G g n ợ ư L

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Thời gian phản ứng (phút)

Asp. awamori theo thời gian phản ứng

Đồ thị 3.6. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase

Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy trong giai đoạn đầu lượng glucosamine tạo ra tỉ

lệ thuận với thời gian phản ứng, tại thời gian 60 phút đạt đạt lượng glucosamine là 49,818µg/ml.

Tuy nhiên từ khoảng thời gian 70 phút trở lên, lượng glucosamine tạo ra hầu như không tăng.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

 Nhận xét

3.6 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THU

NHẬN TỪ ASPERGILLUS AWAMORI

Chúng tôi chọn hai loại sâu khác nhau để thử nghiệm khả năng phân giải chitin của chế phẩm

enzyme chitinase thu nhận từ nấm sợi Aspergillus awamori.

Loại sâu chúng tôi chọn gồm sâu gạo (tên khoa học là Zoophobas mario) là loại sâu được

dùng làm thức ăn cho chim cảnh trên thị trường; loại sâu thứ hai chúng tôi thử nghiệm là sâu trên lá

cây lạc tiên (còn gọi là cây Chùm bao hay dây nhãn lồng Passiflora foetida). Mục đích sử dụng các

loại sâu này nhằm bước đầu đánh giá tác động của chitinase lên sâu hại, đối tượng có lớp vỏ chitin

bao bọc.

Cho số lượng sâu 20 con/đĩa petri (đối với sâu 1) và 10 con/đĩa petri (đối với sâu 2), đĩa đối

chứng chỉ cho lượng nước cất tương đương lượng dung dịch chế phẩm sử dụng thí nghiệm (1ml/đĩa

petri). Cho mỗi đĩa thí nghiệm 1ml dịch CPE chitiase nồng độ 1% và 2%. Theo dõi số lượng sâu

chết qua các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần,

tính giá trị trung bình. So sánh kết quả với mẫu đối chứng, đánh giá sơ bộ khả năng diệt sâu của

CPE.

B

A

A-SÂU 1: Sâu gạo

B-SÂU 2: Sâu cây lạc tiên

C

D

C-Mẫu sâu 2 làm thí nghiệm

D-Thí nghiệm đối chứng trên sâu 1

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

3.6.1 Ứng dụng bước đầu trong phòng trừ sâu

F

E

E-Xử lý sâu 1 với dung dịch CPE 1% F-Xử lý sâu 1 với dung dịch CPE 2%

H

G

G-Thí nghiệm trên sâu 2

H-Thí nghiệm đối chứng trên sâu 2

Hình 3.8. Thử nghiệm tác dụng CPE chitinase Asp. Awamori trên sâu

awamori theo thời gian phản ứng

Nồng độ

Thời gian tác động

Tỉ lệ trung bình sâu chết

Loại sâu

CPE (%)

(phút)

(%)

13,3

0%

90

SÂU 1

78,3

1%

90

85,0

2%

90

5,4

0%

90

SÂU 2

70,0

1%

90

93,3

2%

90

Bảng 3.13. Sự biến thiên hoạt độ dịch chiết enzyme chitinase thu nhận từ chủng Asp.

Qua bảng số liệu trích dẫn 3.13, chúng tôi nhận thấy CPE chitinase thu nhận từ Aspergillus

awamori thể hiện khả năng tác động khá mạnh lên lớp vỏ chitin của sâu hại, côn trùng. Sau cùng

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

 Nhận xét

khoảng thời gian 90 phút, trung bình có khoảng trên 70% sâu chết khi xử lý dung dịch chế phẩm

nồng độ 1% và trên 85% sâu chết khi xử lý dung dịch chế phẩm 2%, cao hơn nhiều so với tỉ lệ chết

của thí nghiệm đối chứng (khoảng 5-13%). từ đó mở ra hướng ứng dụng sâu hơn của CPE chitinase

thu nhận từ nấm Aspergillus awamori trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

Chúng tôi sử dụng hai loại nguyên liệu khác nhau là chitin dạng bột và chitin huyền phù để

thử nghiệm ứng dụng bước đầu chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ nấm sợi Aspergillus

awamori trong sản xuất glucosamine.

Điều kiện hoạt động chế phẩm là điều kiện tối ưu đã thu được từ kết quả nghiên cứu ở mục 3.5 (pH = 4, nhiệt độ ủ là 500C, thời gian thủy phân là 70 phút), nồng độ CPE là 0,2%, bột chitin là

1,6g/10ml (16%) nước cất, chitin huyền phù 1%. Tỉ lệ dung dịch CPE và nguyên liệu là 1 : 1.

Kết quả thu nhận được thể hiện trên bảng 3.13

3.6.2 Ứng dụng bước đầu trong sản xuất glucosamine

thu nhận từ chủng Aspergillus awamori

Bảng 3.14. Hàm lượng glucosamine thu được từ phản ứng thủy phân chitin bằng CPE chitinase

Chitin dạng

0,041

11,79

Thấp

bột

Chitin huyền

0,123

35,55

Trung bình

phù

Lượng ∆OD glucosamine Hiệu suất Nguyên liệu <535nm> (µg/ml)

Số liệu bảng 3.13 chỉ ra rằng, hiệu suất thủy phân chitin của chitinase ở nồng độ CPE 2%, nhiệt độ phản ứng 500C và thời gian phản ứng 70 phút cho hàm lượng glucosamin đạt 10,81µg/ml

từ nguyên liệu chitin dạng bột và 35,55 µg/ml khi sử dụng nguyên liệu là chitin dạng huyền phù.

Hiệu suất thủy phân của CPE thấp nhưng nguồn enzyme chitinase từ nấm sợi dễ thu nhận, chi phí

thấp, cũng đáng để nghiên cứu sử dụng.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

 Nhận xét

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

- Đã nghiên cứu điều kiện môi trường tối ưu cho sự sinh tổng hợp chitinase của ba chủng

nấm sợi là:

Aspergillus awamori: nhiệt độ thích hợp nhất là 350C; thời gian thu enzyme tốt nhất là 36-40

giờ.

Aspergillus sp.: nhiệt độ thích hợp nhất là 400C; thời gian thu enzyme tốt nhất là 72 giờ.

Trichoderma harzianum: nhiệt độ thích hợp nhất: 300C; thời gian thu enzyme tốt nhất là 60

giờ.

- Chitin là chất cảm ứng tốt để nuôi cấy nấm sợi nhằm thu nhận chitinase

- Đã tiến hành qui hoạch thực nghiệm, phương trình hồi qui thu được tương thích với thực

nghiệm: ŷ=0.82 + 0.11x1 - 0.08x2 + 0.35x3 + 0.30x1x2+0.14x1x3 Từ đó suy ra điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng Aspergillus awamori là thời gian nuôi cấy 42 giờ, nhiệt độ nuôi là 320C, lượng chitin bổ sung thích hợp là 16%.

- Đã nghiên cứu điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ

chủng nấm sợi Aspergillus awamori là nhiệt độ 500C, pH = 4,0.

- Đã bước đầu thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme thu nhận từ Aspergillus awamori

trong diệt trừ sâu hại và sản xuất glucosamine.

4.1 KẾT LUẬN

- Tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của một số chủng nấm mốc khác.

- Tiếp tục nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi enzyme này trong lĩnh vực sản xuất thuốc

trừ sâu sinh học.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

4.2 KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số

chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, trường Đại

học Sư phạm TP Hồ Chí Minh.

[2]. Nguyễn Cảnh, Quy hoạch thực nghiệm. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

[3]. Tạ Kim Chỉnh (1996), Tuyển chọn một số chủng vi nấm diệt côn trùng gây hại ở Việt Nam và

khả năng ứng dụng. Luận án Phó Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học.

[4]. Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm của vi nấm. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà

Nội.

[5]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học. NXB Giáo

dục.

[6]. Nguyễn Lân Dũng và các tác giả khác (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

học (tập 2, tập 3). NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

[7]. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm. NXB Khoa học và Kỹ

thuật, Hà Nội.

[8]. Bùi Xuân Đồng (1982), Nhóm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam (tập1). NXB Khoa học và Kỹ

thuật, Hà Nội.

[9]. Bùi Xuân Đồng (1997), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học. NXB Khoa học và kỹ thuật,

Hà Nội.

[10]. Đinh Minh Hiệp (2004), Nghiên cứu quy trình tách chiết và ứng dụng nguồn enzyme

chitinase từ nấm mật (coprinus fimentarius). Báo cáo tổng kết nghiệm thu, Sở khoa học và

công nghệ TP. HCM, tr153-160.

[11]. Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase của Trichoderma và vai trò trong kiểm soát sinh học.

Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí

Minh.

[12]. Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzym thủy phân amylase,

cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc

khu vực Miền Đông Nam Bộ. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên

TP Hồ Chí Minh.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Tài liệu tiếng Việt

[13]. Tô Duy Khương (2004), Khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp và khả năng

đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học

Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh.

[14]. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh (tập 2). NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí

Minh.

[15]. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm

công nghệ sinh học (tập 2- thí nghiệm vi sinh vật học). NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí

Minh.

[16]. Nguyễn Đức Lượng và các tác giả (2004), Công nghệ enzym. NXB Đại học Quốc gia TP.

Hồ Chí Minh.

[17]. Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ Trichoderma

reesei và Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn. Luận văn Thạc sĩ sinh học,

Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh.

[18]. Trần Thị Thanh (2000), Công nghệ vi sinh. NXB Giáo dục.

[19]. Đặng Trung Thành (2008), Bước đầu nghiên cứu thu nhận enzym chitinase trong cây khoai

lang (Ipomoea batatas) tại Khánh Hòa. Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy sản – số

03/2008.

[20]. Đồng Thị Thanh Thu (2008), Sinh hóa ứng dụng. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

[21]. Trần Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng, (1990-1995). Kết quả nghiên cứu bước đầu

về nấm Trichoderma, Tuyển tập các công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật, tr 202- 210.

[22]. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học. NXB Giáo dục.

[23]. Lê Ngọc Tú và các tác giả khác (1982), Enzym vi sinh vật (tập 1, tập 2). NXB Khoa học và

kỹ thuật, Hà Nội.

[24]. Nguyễn Văn Tuân (2009), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp

Endo-β-1,4-Glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của Endo-β-1,4-Glucanase. Luận văn

Thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên.

[25]. Nguyễn Minh Tuyển (2004), Quy hoạch thực nghiệm. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

[26]. A. Kapat, T. Panda, S.K. Rakshit (1996), Parameters optimization of chitin hydrolysis by

Trichoderma harzianum chitinase under assay conditions. Bioprocess Engineering 14,

p.275-279.

[27]. A. A. Shubakov and P. S. Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi.

Applied Biochemistry and Microbiology Vol. 40 No. 5, p.445-447.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Tài liệu tiếng Anh

[28]. Azaliza Safarida Wasli, madihah Md. Salleh, Suraini Abd-Aziz, Osman Hassan and Nor

Muhammad Mahadi (2009), Medium Optimization

for Chitinase Production

from

Trichoderma virens using Central Composite Design. Biotechnology and Bioprocess

Engineering Vol. 14, No 6, p. 781-787.

[29]. Brinda Mahadevan and Don L. Crawford (1997), Properties of the chitinase of the antifugal

biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108. Enzyme and Microbial Technology 20,

p.489-493.

[30]. Crispinus A. Omumasaba, Naoto Yoshida, and Kihachiro Ogawa (2001), Purification and

characterization of a chitinase from Trichoderma viride. The Journal of Genaral anh Applied

Microbiology Vol 47 No 2, p.53-61.

[31]. Daizo Koga (2005), Application of Chitinase in Agriculture. Journal of Metals, Materials anh

Minerals Vol. 15 No. 1, p.33-36.

[32]. Jennifer L. Guthrie, Sagal Khalif, Alan J. Castle (2005), An improved method for detection

anh quantification of chitinase activities. Canadian Journal of Microbiology Vol. 51 Iss. 6,

p.491-495.

(2007),

[33]. Maria Swiontek-Brzezinska, Elzbieta Lalke-Porczyk, Wojciech Donderski

Chitinolytic activity of bacteria and fungi isolated from shrimp exoskeletons. International

Journal of Oceanography and Hydrobiology Vol. XXXVI, No.3, p.101-111.

[34]. Neetu Dahiya, Rupinder Tewari, Gurinder Singh Hoodal (2006), Biotechnological aspects of

chitinolytic enzymes: a review. Applied Microbiology Biotechnology, p.773-782.

[35]. N.N. Nawani, B.P. Kapadnis (2005), Optimization of chitinase production using statistics

based experimental designs. Process Biochemistry 40, p.651-660.

[36]. Nopakarn Rattanakit, Abhinya Plikomol, Shigekazu Yano, Mamoru Wakayama, and

TakashiTachiki (2002), Ultilization of Shrimp Shellfish Waste as a Substrate for Solid-State

Cultivation of Aspergillus sp. S1-13: Evaluation of a Culture Based on Chitinase Formation

Which is Necessary for Chitin-Assimilation. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.

93, No. 6, p. 550-556.

[37]. P. Arthur Felse, T. Panda (1999), Self-directing optimization of parameters for extracellular

chitinase production by Trichoderma harzianum in batch mode. Process Biochemistry 34,

p.563-566.

[38]. Reetarani S.Patil, Vandana ghormade, mukund V. Deshpande (1999), chitinolitic enzymes an

exploration.

[39]. Sahai and Manocha, (1993), Chitinase of fungi and plants their in morphogenesis and host

parasite interattion. FEMS microbiol rev 11, p 317-338.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

[40]. S.M. Akhir, S. Abd-Aziz, M.M. Salleh, R.A. Rahman, R.M. Ilias and M.A. Hassan (2009),

Medium Optimisation of Chitinase Enzyme Production from Shrimp Waste Using Bacillus

licheniformis TH-1 by Responnse Surface Methods. Biotechnology 8 (1), p. 120-1205.

[41]. Takuya Koseki, Shinji Furuse, Kimio Iwano, Hiroshi Sakai and Hiroshi Matsuzawa (1997),

An Aspergillus awamori acetylesterase: purification of the enzym, and cloning and

sequencing of the gene.Bio chem. J. 326, p.485-490.

[42]. Zofia Olempska-Beer (2008), Asparaginase from Aspergillus niger expressed in A. Niger.

Chemical and Technical Assessment.

[43]. www.coe.drexel.edu/.../researchfocus.html

[44]. http://www.yduocngaynay.com/8-8TK_TrVHung_cua.htm

[45]. http://www.moit.gov.vn/vsi_portlets/UserFiles/File/Danhsachtuyenchon.doc.

[46]. http://www.lboro.ac.uk/departments/cg/Projects/2001/clarke/introduction.html

[47]. http://www.vnn.vn/khoahoc/suckhoe/2005/01/370883/

[48]. .http://www.fistenet.gov.vn.

[49]. http://www.nutrifood.com.vn

[50]. http://www.vnexpress.net

[51]. http://www.webtretho.com/forum/register.php

[52]. http://Psre.usm.edu

[53]. http://www.meronbiopolymers.com

[54]. http://www.oligophar.ru

[55]. http://www.ozemail.com.au/zadco/trichoderma.htm

[56]. http://www.moi.gov.vn

[57]. http://www.Roorthing-biochem.com/default.htlm.

[58]. http://hoahocvietnam.com.vn

[59]. http://vietnam.net.

[60]. http://wdcm.nig.ac.jp/catalogue/ncim/document/Ncim_s_fungi.pdf

[61]. http://www.ecfg10.info/images/Asperfest7Program.pdf

[62]. http://www.igb.fraunhofer.de/www/gf/molbiotech/weissebiotech/en/Chitin.en.html

[63]. http://www.palaeos.com/Eukarya/Units/StemMetazoa/Microsporidia.html

[64]. http://www.moldbacteria.com/Aspergillus_niger.gif

[65]. http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/fungi/a/Aspergillus_niger_colony.htm

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Internet

[66]. http://www.mold.ph/trichoderma.htm

[67]. http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html#buffer

[68]. http://www.spices.res.in/spicebioinfo/project/chitinase/result.php

[69]. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learning-

center/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

1.1. PHỤ LỤC

1.2. PHỤ LỤC 1 - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE

Bảng P.1. Đường chuẩn Glucosamine có nồng độ từ 0-70µg/ml

0

1

2

3

4

5

6

7

Ống số

Nồng độ

0

10

20

30

40

50

60

70

Glucosamine

(µg/ml)

0,115

0,148

0,165

0,216

0,561

0,297

0,325

0,340

OD535nm

0,000

0,033

0,054

0,101

0,146

0,182

0,210

0,225

∆OD

1.3.

0.30

y = 0.0344x - 0.0359 R2 = 0.9873

0.20

0.10

> m n 5 3 5 < D O a t l e D

0.00

0

10

20

30

40

50

60

70

Nồng độ Glucosamine (micromol/ml)

1.4.

GLUCOSAMINE

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

Đồ THị P.1-ĐƯờNG CHUẩN GLUCOSAMINE BIểU DIễN MốI TƯƠNG QUAN GIữA ∆OD VÀ HÀM LƯợNG

1.5. PHỤ LỤC 2 - THU NHẬN CHITIN TỪ VỎ TÔM

Khối lượng vỏ tôm ban đầu là 100 gam, xay nhỏ và tiến hành thu nhận chitin theo các bước ở 2.4.5. Cân khối lượng

chitin, xác định tỉ lệ chitin có trong vỏ tôm.

Bảng P.2- Khối lượng chitin thu được từ vỏ tôm

Số lần thí nghiệm

Khối lượng chitin thu được

(g/100g nguyên liệu)

1

18,65

2

19,25

2

18,95

Trung bình

18,95

Hình P.2. Chitin từ vỏ tôm

Khối lượng chitin thu được là 18,95/100 g vỏ tôm, tỷ lệ này có thể thấp hơn thực tế (khoảng 30%) do kỹ thuật tách chiết còn

hạn chế, có sự mất mát trong quá trình lọc, rửa…; nguyên liệu còn lẫn tạp chất…

Chitin trong vỏ tôm là 18,95 %, khoảng 81 % thành phần còn lại chủ yếu là khoáng và protein.

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

 Nhận xét kết quả

PHỤ LỤC 3

Hình P.3 - Huyền phù chitin

ống thử thật

ống thử không

Hình P.3 - Hiện màu thuốc thử DNS trên ống nghiệm thử thật và ống thử không của enzyme chitinase từ chủng

Aspergillus awamori

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

PHỤ LỤC 4 – PHA DUNG DỊCH ĐỆM [67]

4a. Dung dịch đệm acetate( pH= 3,6-5,6)

a. Dung dịch acid acetic 0,2 M: 11,55 ml CH3COOH đặc, dẫn nước đến 1000ml.

b. Dung dịch Natriacetate 0,2 M: 16,4g CH3COONa hoặc 27,2g CH3COONa.3H2O được hòa tan và dẫn nước đến 1000ml nước

cất.

Giá trị pH dung dịch đệm phụ thuộc vào số ml dung dịch a và số ml dung dịch (b) dẫn đến 100ml

a (ml)

b (ml)

a (ml)

b (ml)

pH

pH

46,3

3,7

25,5

24,5

4,6

3,6

44

6

20

30

4,8

3,8

4b. Dung dịch đệm Cacbonat (pH = 9,2- 10,7)

a. Dung dịch Natricacbonate 0,2M: 21,2 g Na2CO3 được hòa tan và dẫn nước cất đến 1000ml.

b. Dung dịch Natrihydrocacbonat 0,2M: 16,8 g NaHCO3 được hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml.

Dung dịch đệm cacbonat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) dẫn nước đến

200ml.

a (ml)

b (ml)

a (ml)

b (ml)

pH

pH

4

46

27,5

22,5

9,2

10

7,5

42,5

30

20

9,3

10,1

9,5

40,5

33

17

9,4

10,2

13

37

35,5

14,5

9,5

10,3

16

34

38,5

11,5

9,6

10,4

19,5

30,5

40,5

9,5

9,7

10,5

22

28

42,5

7,5

9,8

10,6

25

25

45

5

9,9

10,7

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18

PHỤ LỤC 5

Bảng P.5 - KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM CHITINASE

TRÊN SÂU

TN1

TỈ LỆ SÂU CHẾT TN2

TN3

TB

LOẠI SÂU

SỐ LƯỢNG SÂU TN (CON)

NỒNG ĐỘ CPE (%) 0 0 0 0 0

20

SÂU 1

1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0

10 CON/TN

SÂU 2

THỜI GIAN (PHÚ T) 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150

SL % 0 0 10 2 15 3 15 3 25 5 8 40,0 12 60,0 16 80,0 17 85,0 18 90,0 10 50,0 14 70,0 18 90,0 100 20 100 20 0 0 0 0 10 1 20 2 40 4 30,0 3 60,0 6 70,0 7 70,0 7 90,0 9 60,0 6 70,0 7 90,0 9 100 10 100 10

SL % SL % 0 0 0 0 5 1 10 2 15 3 10 2 20 4 20 4 20 4 20 4 35 7 7 35,0 55 12 60,0 11 80 15 75,0 16 80 16 80,0 16 85 16 80,0 17 55 12 60,0 11 70 14 70,0 14 80 17 85,0 16 95 19 100 20 100 20 100 20 0 0 0 0 0 0 0 0 10 1 0 0 10 1 30 3 30 3 40 4 40 4 40,0 4 70 7 60,0 6 80 8 60,0 6 80 8 80,0 8 90 9 100 10 70 7 70,0 7 90 9 80,0 8 90 100 10 9 100 10 100 10 100 10 100 10

1 1 1 1 1 2 2 2 2 2

SL % 0 0,0 8,3 1,7 13,3 2,7 18,3 3,7 21,7 4,3 7,3 36,7 11,7 58,3 15,7 78,3 16,3 81,7 17,0 85,0 11,0 55,0 14,0 70,0 17,0 85,0 19,7 98,3 100 20,0 0 0,0 0 0,0 6,7 0,7 20 2,0 36,7 3,7 36,7 3,7 63,3 6,3 70,0 7,0 76,7 7,7 93,3 9,3 66,7 6,7 80,0 8,0 93,3 9,3 100 10,0 100 10,0

Luaän vaên thaïc só

Cao hoïc K18