BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *********
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Tên đề tài:
“Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và khí canh để nhân nhanh giống sắn KM94
(Manihot esculanta Crantz)”
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60 42 01 14
Năm bảo vệ : 2017
Học viên: Nguyễn Hùng
Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Anh Vũ
Hà Nội, 2017
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo tham gia giảng dạy
ở Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời
gian học tập tại Viện.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Anh Vũ người thầy đã tận
tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và
thực hiện luận văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên làm
việc tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện
Di truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.
Và lời cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới sự hỗ trỡ từ dự án SATREPS (Dự
án phát triển hệ thống sản xuất sắn bền vững thông qua quản lý sâu bệnh hại tại
Việt Nam, Campuchia, Thái Lan).
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 11 năm 2017
Học viên
Nguyễn Hùng
Mục lục
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn .................................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại .................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây sắn ........................................................................ 4
1.1.3. Giá trị của cây sắn ............................................................................................ 9
1.2. Giống Sắn KM94: .................................................................................................. 10
1.3. Hình thức nhân giống sắn truyền thống .............................................................. 11
1.4. Phƣơng pháp nhân in vitro ................................................................................... 13
1.4.1. Các bƣớc thực hiện nhân in vitro .................................................................. 14
1.4.2. Các ƣu nhƣợc điểm......................................................................................... 15
1.4.3. Các nghiên cứu về in vitro cây sắn trên thế giới .......................................... 16
1.4.4. Các nghiên cứu về in vitro cây sắn ở Việt Nam ............................................ 18
1.5. Giới thiệu và đánh giá về hệ thống trồng cây bằng khí canh ............................ 20
1.5.1. Giới thiệu về hệ thống khí canh .................................................................... 20
1.5.2. So sánh sơ bộ về hệ thống khí canh với các phƣơng pháp trồng cây khác
.................................................................................................................................... 22
1.5.2.1. So sánh với phƣơng pháp trồng đất ........................................................... 22
1.5.2.2. So sánh với phƣơng pháp thuỷ canh ......................................................... 22
CHƢƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 24
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................ 24
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................... 24
2.1.2. Môi trƣờng nuôi cấy và môi trƣờng ra cây bằng khí canh......................... 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................... 25
2.2.1. Phƣơng pháp nhân giống in vitro .................................................................. 25
2.2.2. Phƣơng pháp đƣa cây ra vƣờn ƣơm bằng khí canh .................................... 26
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá chi phí cho việc nhân cây giống sắn ...................... 28
CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 30
3.1. Kết quả một số cái tiến trong một số bƣớc nhân giống in vitro ......................... 30
3.2. Kết quả đƣa cây ra vƣờn ƣơm bằng hệ thống khí canh .................................... 35
3.3. Đánh giá chi phí cho việc nhân nhanh và đƣa ra đất để tạo thành một cây
giống hoàn chỉnh ........................................................................................................... 44
CHƢƠNG IV – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 53
4.1. Kết luận .................................................................................................................. 53
4.2. Kiến nghị ................................................................................................................ 53
Danh mục hình
Hình 1.1 Cây sắn ………………….……………………………….…….……….3
Hình 1.2 Hình ảnh rễ và củ sắn…………………………………..….…..…..…..5
Hình 1.3 Một số kiểu hình thân sắn……………….…….....………….…..…….6
Hình 1.4 Một số kiểu hình lá sắn……………………..………..………...………7
Hình 1.5 Hoa Sắn…………………………………………..……..…….…...……8
Hình 1.6 Quả và hạt sắn.. ………………………………………...………....…...9
Hình 2.1 Sơ đồ nguyên lý của hệ thống khí canh……………….……….…..…27
Hình 3.1 Cây KM 94 hoàn chỉnh phát sinh từ chồi đỉnh và chồi nách…….…32
Hình 3.2 Cây non đƣợc cấy trong túi nilon và bình thủy tinh cùng môi trƣờng
MS …………………………………………………………………………….......34
Hình 3.3 Sơ đồ hệ thống khí canh……………………...…………...…..…...…..35
Hình 3.4 Máy bơm piston………………………………………….……..….…..36
Hình 3.5 Thùng Xốp ……..……....……………………………….………..…….37
Hình 3.6 Giá trồng cây non ...…....……………………………….……….…….38
Hình 3.7 Hệ thống khí canh……………………………………….……..…..…..38
Hình 3.8 Chụp khí canh từ trên xuống ở trong màng bọc nilon……….…..….42
Hình 3.9 Cây non thích nghi trong hệ thống khí canh………………..….....….43
Hình 3.10 Cây non đƣợc ra đất trực tiếp bọc kín để giữ độ ẩm……….…..…..43
Hình 3.11 Cây non 7 ngày sau khi ra đất đƣợc bỏ màng bọc để thích nghi….44
Danh mục bảng
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của 1L MS………………………………………………….…24
Bảng 2.2 Thành phần hóa học của 1L Hydroponic ( Dung dịch thủy canh)………………..25
Bảng 3.1 So sánh mắt phát sinh giữa chồi đỉnh và chồi nách đƣợc nuôi cấy trong bình thủy
tinh và theo dõi ghi tại các thời điểm 21-28 ngày……………………………………………..30
Bảng 3.2 So sánh hệ số tạo rễ giữa chồi đỉnh và chồi nách trong môi trƣờng 17N sau 7 ngày
và 10 ngày…………………………………………………………………………………....…..31
Bảng 3.3 So sánh sự phát sinh mắt chồi giữa hai cƣờng độ sáng khác nhau……………..…33
Bảng 3.4 So sánh sự phát sinh ở hai điều kiện nuôi cấy khác nhau………………...………..34
Bảng 3.5 Tỉ lệ phần trăm cây sống giữa hai hình thức ra cây vào môi trƣờng tự nhiên …..39
Bảng 3.6 Tỉ lệ phần trăm sống của cây non với thời gian ở môi trƣờng ra rễ khác nhau …40
Bảng 3.7 Tỉ lệ sống của cây non phát sinh từ chồi đỉnh và chồi nách bằng cách ra đất trực
tiếp ………………………………………………………………………………………….……41
Bảng 3.8 Tỉ lệ sống của cây non đƣợc phát sinh từ chồi đỉnh và chồi nách đƣợc thích nghi
qua hệ thống khí canh trƣớc khi ra đất………………………………………………………..41
Bảng 3.9 Tổng hợp tỉ lệ sống của cây non ở hai hình thức ra cây khác nhau……...………..42
Bảng 3.10 Chi phí đánh giá một cây non đã thích nghi ngoài tự nhiên………………..…….45
Bảng 3.11 Giá thành hóa chất và giá thành 1L MS………………………………………...…48
Bảng 3.12 So sánh chi phí giữa việc dùng cả chôi nách trong quá trình ra rễ…………..….49
Bảng 3.13 So sánh chi phí tiền điện duy trì phòng nuôi cây……………………………...…..50
Bảng 3.14 So sánh chi phí giữa việc sử dụng túi nilon và bình thủy tinh……………...…….50
Bảng 3.15 Tổng hợp chi phí giữa việc sử dụng quy trình cũ và quy trình cải tiến……….…51
Danh mục từ viết tắt
Kí hiệu/viết tắt Tên đầy đủ
6-Benzyl amino purin BAP
Food and Agriculture Organization of the United Nations FAO
Acid-β-indolacetic IAA
1 lux là độ rọi có được của một bề mặt có diện tích 1 mét Lux
vuông có thông lượng chiếu sáng 1 lumen.
Murashige and Skoog 1962 MS
Napthanele acetic acid NAA
Độ lệch chuẩn SD
Việt Nam Đồng VND
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay vấn đề tái cơ cấu nền nông nghiệp đang được Đảng nhà nước và
chính phủ quan tâm và coi trọng. Với việc ra quyết định quy hoạch vùng sản xuất
nông nghiệp của thủ tướng chính phủ đã bước đầu hình thành một nền sản xuất
nông nghiệp quy mô lớn sản xuất theo hình thức công nghiệp. Những cây lương
thực chủ yếu luôn là ưu tiên hàng đầu trong quyết định. Trong đó cây sắn là cây
lương thực quan trọng thứ ba sau lúa, ngô với những ưu điểm vượt trội như có khả
năng thích nghi rộng, dễ trồng và dễ chăm sóc có thể canh tác trên nền đất dốc
trong khi đó ở Việt Nam thì diện tích đồi núi chiếm một khoảng lớn. Không chỉ có
vậy sản phẩm từ cây sắn còn rất đa dạng và phong phú từ đơn giản là làm nguồn
thực phẩm hay thức ăn chăn nuôi, đến phức quan trọng như sản xuất tinh bột, và
đặc biệt là để sản xuất xăng sinh học. Với những ưu thế lớn như vậy cây sắn đang
dần dần góp phần rất lớn vào nền nông nghiệp nước ta. Thủ tướng chính phủ đã
quy hoạch vùng diện tích trồng sắn đến năm 2020 tầm nhìn 2030 là 450 nghìn
ha.Tuy nhiên với phương thức canh tác truyền thống năng suất củ chưa cao. Đặc
biệt hiện tại việc đối mặt với các loại sâu bệnh hại đang rất phức tạp. Việc sử dụng
thân sắn vụ trước làm hom giống cho vụ sau đang làm cơ hội lây lan và phát sinh
nhiều loại bệnh như khảm sắn, chổi rồng … Nguồn thân sắn bị nhiễm bệnh vụ
trước phải tiêu hủy làm ảnh hưởng tới nguồn cung cấp giống cho vụ sau, vì vậy
việc cung cấp nguồn giống ổn định sạch bệnh để sản xuất bền vững với diện tích
lớn là một yêu cầu cấp thiết cần đặt ra. Ứng dụng khoa học kĩ thuật vào nền nông
nghiệp luôn là ưu tiên của chính phủ. Việc nhân giống bằng nhân in vitro đã được
thực hiện trên nhiều loại cây trồng và cho thấy hiệu quả. Nhân giống bằng in vitro
có thể tạo ra một lượng lớn cây giống đồng đều sạch bệnh trong thời gian ngắn.
Nhưng nhân giống in vitro chi phí cao, tỉ lệ sống của cây từ in vitro ra môi trường
tự nhiên chưa cao lại càng đẩy ra giá thành sản xuất cây giống lên cao. Để khắc
phục vấn đề về tỉ lệ sống của cây non chúng tôi đã áp dụng kĩ thuật nuôi cây bằng
1
khí canh. Kĩ thuật này đã được Học viện Nông nghiệp Việt Nam ứng dụng cho một
số cây trồng như khoai tây và cà chua cho kết quả tốt với nhiều đề tài về vấn đề
này. Chính vì những lý do trên tôi chọn đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và
khí canh để nhân nhanh giống sắn KM94 (Manihot esculanta Crantz)”.
Mục đích đề tài:
Cải tiến một số bước trong quy trình nhân nhanh nhằm giảm chi phí sản xuất
in vitro giống sắn KM94.
Nội dung nghiên cứu đề tài:
• Xác định vật liệu khởi đầu cho qua trình nhân nhanh in vitro giống sắn
KM94.
• Xác định điều kiện chiếu sáng cho quá trình nhân nhanh in vitro giống sắn
KM94.
• So sánh hệ số nhân nhanh trong túi nilon và bình thủy tinh của giống KM94.
• Thử nghiệm các phương pháp thích nghi cây in vitro trước khi ra đất.
• Đánh giá chi phí sản xuất ở quy mô nghiên cứu khoa học.
Ý nghĩ thực tiễn của đề tài:
Đánh giá chi phí cho việc sản xuất cây in vitro.
Đưa ra giải pháp kỹ thuật giúp sản xuất được cây giống sắn sạch bệnh để
phục vụ sản xuất với chi phí giảm.
2
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây sắn (Manihot esculanta Crantz) là cây đóng vai trò quan trọng trong kinh
tế nông nghiệp của nước ta. Nó không chỉ đóng vai trò cung cấp nguồn thực phẩm
cho con người, nguồn thức ăn cho chăn nuôi mà còn là mặt hàng nông sản xuất khẩu
chủ chốt, thu về nguồn ngoại tệ đáng kể cho đất nước[10].
Tất cả 98 loài thuộc chi Manihot đều sống ở vùng nhiệt đới và đã được di
canh đến nhiều khu vực khác nhau trên thế giới. Sắn thuộc họ Euphorbiaceae bao
gồm 7200 loài, được đặc trưng bởi các hệ thống tuyến mủ do các tế bào tiết mủ tạo
thành. Hình thái của họ này rất đa dạng, từ nhóm thân cao như cao su đến nhóm
thân bụi, cũng như các nhóm thực vật có
giá trị kinh tế cao, như thầu dầu [6].
Sắn sống tự nhiên ở vùng nhiệt đới,
phân bố phổ biến từ 33° vĩ bắc đến 33° vĩ
nam. Trong số 98 loài đã được mô tả, chỉ
có sắn được trồng trên diện rộng vì giá trị
kinh tế của chúng. Sắn được biết đến với
hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào
địa lý nơi chúng được trồng. Ở Mỹ Latinh,
sắn có tên gọi là yuca (theo tiếng Tây Ban
Nha) hoặc mandioca (tiếng Bồ Đào Nha),
trong khi tại Brazin, chúng được chia thành
2 loại, sắn ngọt (sweet cassava) hay sắn
đắng (bitter cassava) theo người trồng [6]. Hình 1.1 Cây sắn
3
Về nguồn gốc của sắn vẫn chưa khẳng định được chính xác, tuy nhiên, với
những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định rằng sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt
đới của châu Mỹ Latinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người trồng cách
đây 5000 năm. Trung tâm phát sinh sắn ở Đông Bắc Brazin và một trung tâm khác
ở Trung Mỹ và Mexico. Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật củ sắn đã
được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Venezuela, và
khoảng 2000 năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong khi đó, những lò
nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước công nguyên đã được
tìm thấy ở phía bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900-200
trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng
một số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như
một loại cây nông nghiệp từ rất lâu đời [11].
Sắn được người Bồ Đào Nha đưa vào châu Phi lần đầu tiên vào giữa thế kỷ
16. Trải qua thế kỷ 17 phát triển chậm chạp, sắn được du nhập vào đảo Bourbon và
Ilede (Pháp) vào các năm 1738-1739, và đưa sang Madagasca vào năm 1875, Xri
lanca (1786), Calcutta (1794) và một số nước phía đông châu Phi như Zambiar
(1799), Uganda (1878). Ở châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ 17,
Việt Nam và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ 18 [4].Tuy
nhiên, mãi đến thế kỷ 19, nghề trồng sắn và tiêu thụ mới thực sự phát triển với sự du
nhập các kỹ thuật chế biến ở Brazin bởi các nô lệ được phóng thích. Từ đó đến nay,
diện tích, năng suất và sản lượng sắn ngày một tăng [5].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây sắn
Rễ sắn
Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ
lại làm giống cho vụ kế tiếp). Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ cọc mọc thẳng cắm
xuống đất sau đó các rễ phụ mọc ra. Cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển
4
thành củ. Rễ mọc ra từ hom thì đầu tiên mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống
đất.
Hình 1.2 Hình ảnh rễ và củ sắn
Rễ sắn có hai chức năng chính là đồng hóa và dự trữ. Rễ đồng hóa thường
cắm sâu trong lòng đất có thể dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp
cho cây vững chắc. Rễ dự trữ (rễ củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành.
Khi cây mới ra rễ thì có rất nhiều rễ con nhưng sau đó chỉ một số rễ con được tập
trung dinh dưỡng phát triển thành củ. Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới
30 cm, có hoặc không có cuống củ [6],[9]
5
Thân cây
Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1-3 m. Chiều cao của cây phụ thuộc vào
giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng. Thân sắn
có khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của
cây. Hiện tại ngoài một số giống sắn truyền thống với các hình thái cũ thì có thêm
các giống thân thẳng không phân cành hình thái rất đặc biệt.
Thân và cành già đã hóa gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng. Số
lượng thân phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom. Về mặt cấu tạo, lớp cắt
ngang thân sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ;
mô mềm của vỏ và ngoài cùng là lớp biểu bì rất mỏng. Khi nhân vô tính sắn người
ta sử dụng các đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngoài việc lựa chọn các đoạn hom
đẹp, sạch bệnh phải giữ cho lớp biểu bì không bị sây sát vì lớp này có chức năng
bảo vệ cho hom không bị mất nước [6], [12].
Hình 1.3 Một số kiểu hình thân sắn
6
Lá sắn
Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến
lá. Cuống lá dài từ 3-30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tùy theo giống (màu
vàng, xanh vàng, hồng, đỏ tươi...). Phiến lá thường chia 5-7 thùy nhưng cũng có
khi không chia thùy. Lá của những cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên
vẹn hoặc chia thùy không đều. Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thùy của
phiến lá thường giảm. Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin
dày, tầng mô dậu, tầng mô hổng và biểu bì. Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng 30 µm và có khoảng 700 lỗ/mm2 [5], [12].
Hình 1.4 Một số kiểu hình lá sắn
Hoa sắn
Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc ra từ chỗ
phân cành, ngọn thân. Một số giống sắn không có hoa do không có sự phân hóa hoa
hoặc do mầm hoa rụng đi. Những cụm sinh ra từ những cành thấp thường rụng sớm.
Cụm hoa gồm một trục dài 2-10 cm và các trục bên hợp lại thành chùy [5], [6].
Hoa cái có năm lá đài và có màu sặc sỡ, ngoài rìa có lông. Giữa hoa cái có
một bầu hoa có 6 cánh, chứa 3 lá noãn nằm ở trên đài. Trên bầu có 3 vòi nhụy ngắn
với đầu nhụy uốn cong. Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài,
nhẵn ở bên trong và có lông ở phía ngoài. Có khoảng 8-10 nhị đực xếp thành hai
7
vòng và mọc lên từ các thùy của một đĩa phía dưới. Bao phấn mềm, hạt phấn 3
ngăn, dày dính, màng ngoài hạt phấn có gai nhỏ.
Hình 1.5 Hoa Sắn
Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều
hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ
phấn. Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây. Hoa
đực thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào nửa cuối buổi chiều.
Bao phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở được khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn
trước khi hoa nở 1 giờ; sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ
phấn là trong khoảng 30 cm. Tuổi thọ của hạt phấn là một tuần còn thời gian tiếp 8
nhận hạt phấn của đầu nhụy trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo,
chuyển sang màu nâu, khô đi và rụng chậm nhất là sau 1 ngày. Thời gian từ lúc thụ
phấn đến thụ tinh kéo dài từ 8-19 giờ [5], [6].
Quả và hạt
Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1-1,5 cm. Quả có 3
ngăn, được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa một hạt. Màu sắc quả
thường biến đổi từ lục nhạt, hơi vàng đến lục hay đỏ tía khá đậm. Cuống quả phình
lên ở chỗ tiếp xúc với quả. Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả.
Hạt sắn hình trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết
màu nâu đỏ trên nền màu kem hoặc xám nhạt [5], [6].
Hình 1.6 Quả và hạt sắn
1.1.3. Giá trị của cây sắn
Sắn là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất thế giới bên cạnh lúa và
ngô [8]. Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84-87% trọng lượng khô, là
nguồn cung cấp carbohydrate cho hơn 500 triệu người ở các vùng nhiệt đới, cận
nhiệt đới cũng như hơn 1 tỷ người trên thế giới. Trong củ sắn cũng có một số loại
acid amin chứa lưu huỳnh tuy lượng không nhiều và hàm lượng thấp các protein,
chất béo, một số chất khoáng (P, K, Mg,...) và vitamin (B1, B2,...) [7], [9]. Tại
Châu Á, Châu Phi và Mỹ Latinh, có khoảng 600 triệu người với cuộc sống phụ
9
thuộc vào cây sắn. Ở những khu vực này, cây sắn được coi là cây lương thực xóa
đói giảm nghèo quan trọng do là cây trồng phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng
và có khả năng chịu hạn cao. Ở Đông Nam Á, sắn là một nguồn năng lượng chính
cho người dân như tại Campuchia, Lào và Myanmar. Củ sắn cũng là nguồn thức ăn
quan trọng để sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Lá sắn chứa nhiều chất dinh dưỡng với hàm lượng protein cao hơn trong củ từ
6-7% trọng lượng tươi và 21-25% trọng lượng khô. Hàm lượng lipit ở lá gấp 6 lần ở
củ. Ngoài ra, lá sắn chứa nhiều canxi, carotene, vitamin B1, vitamin C, nhiều acid
amin không thay thế đặc biệt lizin và triptophan nhưng thiếu methionin. Lá sắn được
ủ chua làm thức ăn cho trâu, bò,… hoặc thức ăn tươi cho cá, tằm….
Bên cạnh vai trò cung cấp tinh bột làm thức ăn cho người và động vật, sắn
còn góp phần vào sự đa dạng về kinh tế và tạo cơ hội cho phát triển công nghiệp
công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học với hơn 80 quốc
gia có khả năng phát triển ngành công nghiệp từ sắn [4]. Tinh bột sắn được dùng để
sản xuất các loại bánh, kẹo, bột ngọt, mì ăn liền, làm phụ gia dược phẩm và đặc
biệt, sắn được sử dụng làm nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất cồn sinh học
đem lại hiệu suất và hiệu quả kinh tế cao. Thân sắn dùng để sản xuất nấm, nguyên
liệu cho công nghiệp xenlulozơ và nguyên liệu để sản xuất một số sản phẩm khác
như màng phủ sinh học, chất giữ ẩm, bao bì và phụ gia dược phẩm.
1.2. Giống Sắn KM94:
Giống sắn KM94 là con lai của tổ hợp lai Rayong1 x Rayong90. Giống được
nhập nội vào Việt Nam trong nguồn gen khảo nghiệm Liên Á. Giống sắn KM94
được công nhận quốc gia tại Quyết định số 97/NN-QLCN/QĐ ngày 25/11/1995.
KM94 thuộc nhóm sắn đắng, thân cong ở phần gốc, ngọn tím, không phân
nhánh ở vùng đồng bằng nhưng lại phân nhánh cấp một ở những tỉnh miền núi;
giống ít bị nhiễm bệnh cháy lá, củ đồng đều, thịt củ màu trắng, năng suất củ tươi
10
28,1 tấn/ha, hàm lượng tinh bột 27,4-29,0%, thời gian thu hoạch 9-12 tháng sau
trồng.
Giống KM94 thích hợp với nhiều chân đất khác nhau. Đất tốt và trung bình
trồng với khoảng cách 1,0 m x 1,0 m tương đương với 10.000 cây/ha, đất xấu trồng
với khoảng cách 1,0 m x 0,9 m hoặc 1,0 m x 0,8 m (tương đương với 11.080-
12.500 cây/ha). Tùy theo các loại đất mà bón với các công thức khác nhau, có thể
kết hợp giũa bón phân vô cơ với phân hữu cơ. Công thức phân bón NPK: 80 kg N
+ 40 kg P2O5 + 80 kg K2O/ha trên đất đỏ. Trên đất xám và đất có dinh dưỡng thấp
120-160 kg N + 60-80 kg P2O5 + 120-160 kg K2O kg/ha (tỷ lệ phối trộn N:P:K =
2:1:2) kết hợp với 5 tấn-10 tấn phân chuồng hoặc phân hữu cơ vi sinh.
Giống sắn KM94 là giống sắn được trồng phổ biến nhất trên phạm vi toàn
quốc và đang phát triển rộng ra hai nước Lào và Campuchia với diện tích trên 500
ngàn ha. Điển hình tại Tây Ninh và Đồng Nai, đã áp dụng giống KM94 với diện
tích hàng trăm ha/hộ, đạt năng suất từ 30-40 tấn/ha.
KM94 là giống có hàm lượng HCN cao (219 mg/kg vật chất khô) nên chỉ
thích hợp cho hướng sử dụng cho chế biến công nghiệp. Hiện nay giống đang bị
nhiễm nặng bệnh Chổi rồng (Phytoplasma) tại các tỉnh Đồng Nai, Bình Thuận,
Bình Phước, Gia Lai, Kon Tum, Bình Định, Quảng Ngãi và Quảng Trị.
1.3. Hình thức nhân giống sắn truyền thống
Có rất nhiều phương pháp để nhân giống cây trồng, đó là nhân giống hữu
tính bằng hạt; nhân giống vô tính: giâm, cắt, ghép, chiết cành. Đối với nhân giống
sắn thì có thể áp dụng phương pháp nhân giống bằng hạt hoặc giâm hom. Tuy
nhiên, phương pháp nhân bằng hạt rất hiếm gặp mà hiện nay nhân dân sử dụng
rộng rãi phương pháp giâm hom. Thân của cây sắn được 8-10 tháng tuổi sau vụ thu
hoạch sẽ được giữ lại, lựa chọn những đoạn thân tốt và được giâm trồng cho vụ kế
tiếp. Hom sắn được trồng lấy từ đoạn giữa thân cây, chiều dài mỗi hom từ 15-20
11
cm. Hom phải đảm bảo sạch bệnh, có dấu hiệu rõ ràng của mắt ngủ. Số lượng mắt
ngủ trên mỗi đoạn hom phải đảm bảo từ 6-8 mắt. Đoạn hom không bị khô, trầy
xước.
Có hai cách thức trồng sắn bằng hom: trồng nằm ngang với những vùng đất
bằng phẳng, thoát nước và trồng xiên, thẳng đứng với những vùng đất mưa nhiều
hay ngập úng. Trước khi trồng, đoạn hom cần được xử lý với thuốc diệt nấm, sâu
bệnh thông thường hoặc dải thuốc vào hốc đất. Để hom nảy mầm tốt không nên
trồng sắn vào thời điểm mưa nhiều hoặc khô hạn. Ở Tây Nguyên, mùa xuống giống
thường là đầu mùa mưa (từ tháng 4 đến tháng 5). Sắn cũng thường được trồng vào
vụ Thu – Đông (từ giữa tháng 9 đến giữa tháng 10) [4].
Kỹ thuật nhân nhanh giống sắn bằng hom ít mắt đã được nghiên cứu ứng
dụng trên giống sắn mới Sa06. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Nhân bằng hom có 2
mắt đạt hệ số nhân giống cao và chất lượng cây giống tương tự như nhân giống
bằng hom thông thường có 5-6 mắt, dài 15-20cm. Kỹ thuật nhân giống tóm tắt như
sau: cắt hom giống có 2 mắt cấy trong bầu đất cho ra rễ rồi trồng ra ruộng, sau 4
tháng cắt cây để lấy hom nhân lần 2 và tiếp tục khai thác cây tái sinh từ gốc. Áp
dụng kỹ thuật này đã thụ được 1.400 hom giống có 5 mắt thông thường từ 1 cây
giống ban đầu sau một chu kỳ nhân giống 9-10 tháng, trong khi nhân giống từ hom
thường chỉ thu được 100 hom giống.
Ưu điểm:
Dễ làm, dễ thao tác. -
- Giảm chi phí cho vụ trồng mới do tận dụng được thân cây sắn từ vụ trước.
- Nhân giống vô tính ổn định về mặt di truyền.
Nhược điểm:
- Thời gian bảo quản hom sắn sau thu hoạch ngắn (60 ngày).
12
- Trong thời gian bảo quản, cây giống dễ bị rệp sáp, côn trùng tấn công, dễ bị
trầy xước trong quá trình vận chuyển.
- Việc bảo quản, xuống giống và sự nảy mầm của hom phụ thuộc lớn vào thời
tiết, ảnh hưởng tới chất lượng giống cây trồng.
- Hệ số nhân giống thấp vì một đoạn thân chỉ lấy được 4-6 đoạn hom.
Nói tóm lại, nhân giống bằng giâm hom dễ dàng thao tác, không đòi hỏi cao về
kỹ thuật nhưng lại khó có thể đáp ứng được nhu cầu về giống cho một quy mô sản
xuất lớn. Đặc biệt, kỹ thuật bảo quản còn thấp kém nên yêu cầu về nguồn giống
sạch bệnh là rất khó khăn. Phương pháp nuôi cấy in vitro lại có thể khắc phục được
những hạn chế trên.
1.4. Phƣơng pháp nhân in vitro
Nuôi cấy in vitro là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên
liệu sinh vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo,
trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống
(Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ
nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:
- Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành.
- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus).
- Nuôi cấy tế bào đơn.
- Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong tế bào thực vật sau khi đã tách
vỏ còn gọi là phương pháp nuôi cấy tế bào trần.
13
Đây là phương pháp thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương
pháp nuôi cấy trong ống nghiệm.
1.4.1. Các bƣớc thực hiện nhân in vitro
Bước 1: Chọn cây mẹ phải sạch bệnh, sạch virus.
Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Đây là giai đoạn khử trùng vào mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu
tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả giai đoạn này
phụ thuộc vào cách lấy mẫu, mục đích nuôi cấy, vị trí lấy mẫu. Khi nuôi cấy cần
chọn đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi
nách sau đó là đỉnh chồi hoa cuối cùng là đoạn thân mảnh lá. Đồng thời cũng phải
chọn đúng phương pháp khử trùng và hóa chất khử trùng.
Bước 3: Giai đoạn nhân nhanh
Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số nhân lớn. Hệ số nhân phụ thuộc vào
số lượng chồi tạo ra từ một chồi ban đầu. Để có được hệ số nhân lớn thì phải tối ưu
hóa các điều kiện nuôi cấy, môi trường, chất dinh dưỡng và hàm lượng các chất
kích thích sinh trưởng đặc biệt là cytokinin. [3]
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh tạo ra một số lượng chồi lớn, những chồi này
được chuyển tiếp sang giai đoạn hoàn chỉnh, tạo rễ với môi trường có bổ sung
auxin.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỉ lệ cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo các yếu tố sau:
14
- Cây phải có hình thái thích hợp (chiều cao, đủ thân, lá, rễ,...).
- Cho cây làm quen với môi trường trước khi đưa ra trồng.
- Đưa cây vào giá thể thích hợp giúp cây sinh trưởng tốt.[1],[2]
1.4.2. Các ƣu nhƣợc điểm
Ưu điểm:
- Phương pháp có khả năng hình thành cây giống từ một mô, cơ quan rất nhỏ,
trong khi các phương pháp nhân giống truyền thống phải sử dụng đến cả một
bộ phận sinh dưỡng.
- Phương pháp này cho hệ số nhân cho một lượng giống nhiều trong khoảng
thời gian ngắn.
- Phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh nên có thể tiến
hành quanh năm.
- Có thể chủ động điều chỉnh được các yếu tố, tác nhân nhiệt độ, ánh sáng.
- Phương pháp được tiến hành trong điều kiện vô trùng nên có thể tạo được
giống hoàn toàn sạch bệnh.
- Từ một vật liệu nhiễm virus có khả năng tạo và nhân hàng loạt cây sạch virus.
- Cây giống in vitro nếu chưa sử dụng thì có thể bảo quản trong thời gian dài
bằng điều kiện in vitro.
Nhược điểm:
Tuy phương pháp này có rất nhiều ưu điểm nhưng nó cũng có một số nhược
điểm sau:
- Mặc dù phương pháp này có hệ số nhân cao nhưng kích thước cây rất nhỏ,
đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn.
- Cây được nhân trong điều kiện tối ưu về dinh dưỡng, độ ẩm, ánh sáng... nên
khi đưa ra môi trường cây khó thích nghi, dễ bị mất nước và chết.
15
- Phương pháp yêu cầu đòi hỏi đầu tư trang thiết bị cao, nguồn lực có kỹ thuật.
- Những vấn đề còn tồn tại trong vi nhân giống: tính bất định về mặt di truyền,
sự nhiễm mẫu, việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy, hiện tượng
thủy tinh hóa.
- Chuyển cây từ môi trường in vitro ra tự nhiên thường gặp khó khăn
Để khắc phục một số nhược điểm của nhân giống in vitro như tỉ lệ cây non khi
chuyển ra môi trường tự nhiên bị chết nhiều thì chúng tôi đã ứng dụng hệ thống
khí canh điều kiện thích nghi trước khi chuyển ra đất.
1.4.3. Các nghiên cứu về in vitro cây sắn trên thế giới
Theo nghiên cứu về vi nhân bằng kỹ thuật in vitro sắn bằng nuôi cấy mô chi
phí thấp [13], công nghệ nuôi cấy mô có thể được sử dụng để tạo ra cây giống có
chất lượng cao thay vì sử dụng theo cách truyền thống. Nó có thể tạo ra hàng ngàn
cây không giống như các kỹ thuật thông thường. Công nghệ nuôi cấy mô thực vật
đã được sử dụng rộng rãi để nhân rộng sắn trên khắp thế giới. Điều này là bởi vì nó
là phương pháp tốt nhất để sản xuất vật liệu trồng sắn. Một số giống sắn không có
hoa và sản lượng hạt thấp làm ảnh hưởng tới việc nhân giống [14]. Do đó, cây sắn
được nhân lên chủ yếu bằng sinh sản sinh dưỡng là sử dụng các thân cây vụ trước
làm giống cho vụ sau [15]. Những hộ nông dân sản suất quy mô nhỏ nhận vật liệu
trồng từ các vùng bệnh, rồi đem trồng ở các vùng khác dần dần làm lây lan và phát
tán các loại bệnh [16],[17]. Điều này làm cho việc nuôi cấy mô là một công nghệ
quan trọng trong việc thiết lập hệ thống giống sắn. Nuôi cấy mô đã được áp dụng
có hiệu quả trong việc loại bỏ virus và các bệnh. Cây in vitro sắn cho phép trao đổi
và bảo tồn các vật liệu nhân giống [18]. Tuy nhiên, chi phí sản xuất cây in vitro là
một trở ngại cho việc tiếp cận nông dân. Do đó, cần có những nỗ lực để phát triển
các công nghệ chi phí thấp [19]. Nghiên cứu này đã tìm cách thiết lập một quy trình
hiệu quả về chi phí cho việc nhân giống bằng sắn sử dụng các vật liệu sẵn có tại địa
phương.
16
Một nghiên cứu khác về tối ưu hóa việc nhân giống các giống sắn khác
nhau (Manihot esculenta Crantz) [20] có chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng đến nhân
giống sắn của Ethiopia. Sắn là một loại cây nhân vô tính và khả năng nhân giống
của nó nói chung là mất nhiều thời gian và chậm [21]. Những giống có những đặc
tính như khả năng sinh trưởng và chi phí phân phối cao, tỉ lệ nhân thấp và nguồn
hom giống khó bảo quản [22]. Các kỹ thuật in vitro đã được sử dụng để tạo ra các
giống năng suất cao, các vật liệu trồng không kháng bệnh và kháng bệnh, ngay cả
từ các cây mẹ bị nhiễm bệnh [23]. Việc sản xuất một giống cây mà sẽ giữ được các
đặc tính phân biệt khi nuôi cấy với cùng một loại vật liệu trồng cây cũng có thể đạt
được thông qua việc nhân giống trong ống nghiệm. Phương pháp nhân giống này
có thể được thực hiện bất kể mùa vụ nào, cho phép sự sẵn có của vật liệu trồng trọt
quanh năm và do đó đảm bảo sự mở rộng sản xuất. Nuôi cấy mô đã được khai thác
để nhân nhanh, chuyển đổi và bảo tồn sắn với sản lượng cao hơn. Tuy nhiên, cần
phải phát triển mô hình có chi phí thấp hoặc tối ưu hóa sản xuất in vitro.
Nghiên cứu về các giống sắn ở Ethiopia [24] có chỉ ra các yếu tố ảnh hưởng
đến 2 giống sắn phổ biến ở quốc gia này. Mặc dù các nghiên cứu khác nhau đã
được thực hiện về nuôi cấy tế bào sắn [25], [28], [26] có rất ít công việc đã được
thực hiện trên các yếu tố ảnh hưởng đến việc nhân vi mao sắn. Hơn nữa, chỉ có một
báo cáo về vi nhân giống của hai giống đã được công bố ('Kello' và 'Qulle') ở
Ethiopia [27]. Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là đánh giá nảy mầm của hai
giống ở nhiệt độ khác nhau trong nhà kính và để điều tra các yếu tố khác nhau ảnh
hưởng đến nhân chúng trong ống nghiệm.
Hai giống 'Kello' và 'Qulle' nhận từ Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp
Hawassa, Phòng Nghiên cứu Cây có củ. Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra các
điều kiện tối ưu cho vi nhân giống của hai giống sắn được chuyển giao cho nông
dân để sản xuất các vật liệu trồng chất lượng cao. Các nghiên cứu này bao gồm xác
định ảnh hưởng của nhiệt độ lên chồi của cây mẹ, sự khác biệt về nồng độ muối,
17
sucrose và thidiazuron trong môi trường MS bán cứng, pH, môi trường MS hai lần
và nuôi cấy lặp đi lặp lại. Số lượng chồi nách trung bình trên mỗi cây là cao nhất
(10,8) ở 26°C đối với Kello và 9,8 ở 30°C đối với 'Qulle'. Số lượng chồi trung bình
cao nhất được trên môi trường MS chứa 0,2 mg/l thidiazuron cho cả hai giống trên
cả hệ thống nuôi cấy vừa giữa bán cứng và hai bước. Số chồi trung bình lớn nhất
đạt được trên môi trường MS 1/4 cho 'Kello' và 'Qulle' tương ứng. Số lượng chồi
nách trung bình trên mỗi cây cho 'Kello' (4.10) và 'Qulle' (2.40) đã đạt được ở pH
5.6 và 6.6 tương ứng. 'Kello' phát sinh 3,70 chồi/mẫu trên môi trường MS chứa
1,5% sucrose. Việc tái các nuôi cấy của 'Qulle' dẫn đến việc mất dần tỷ lệ nhân từ
lần thứ ba trở lên.
1.4.4. Các nghiên cứu về in vitro cây sắn ở Việt Nam
Trong nghiên cứu mới nhất về nghiên cứu hệ thống tái sinh cây sắn (Manihot
esculenta Crantz.) thông qua phôi soma từ lá chưa trưởng thành [29] có nói rằng
các hệ thống tái sinh cây sắn thông qua quá trình tạo phôi soma đã được cải tiến
[31]. Đối với bất cứ quá trình vi nhân giống nào, giai đoạn sinh trưởng cũng quyết
định hiệu suất của quá trình. Các thùy lá non ( lá chưa trưởng thành) được cảm ứng
bởi 2,4- D và NAA để tạo phôi [32], [30]. Thay vì được cảm ứng bằng 2,4-D, mô
phân sinh đỉnh và thùy lá chưa trưởng thành được cảm ứng tạo phôi soma sơ cấp
bởi picloram [33], [34]. Các mảnh lá mầm màu xanh được tách từ phôi giai đoạn lá
mầm được đặt lên môi trường P-CIM để cảm ứng phôi soma thứ cấp. Cách cấy
chuyển phôi soma đối với phát sinh phôi thứ cấp ảnh hưởng tới hình thái của mô
phát sinh phôi [35]. Các phôi soma thứ cấp được chuyển sang môi trường bổ sung
NAA hoặc BA để phôi trưởng thành [30], hoặc có thể bổ sung thêm AgNO3 vào
môi trường đã có BA nhằm kéo dài chồi.
Nghiên cứu này nhằm mục đích tái sinh cây sắn (Manihot esculenta Crantz.)
thông qua phôi soma từ lá chưa trưởng thành. Vật liệu được sử dụng là các mảnh lá
chưa trưởng thành của các cây in vitro từ 2-3 tuần tuổi. Phôi soma được cảm ứng
18
tạo thành trên môi trường MS có bổ sung picloram với các nồng độ khác nhau. Kết
quả nghiên cứu cho thấy, trên môi trường MS bổ sung 12 mg/l picloram, cả hai
giống đều cho tỉ lệ hình thành phôi soma cao nhất. Sau 4 tuần, giống KM94 cho tỷ
lệ hình thành phôi cao hơn 11,4% so với giống KM140. Tuy nhiên, khi cụm phôi
được chuyển sang môi trường MS có bổ sung 0,3 mg/l BAP để nảy mầm tạo cây
con, tỷ lệ tạo cây con ở giống KM140 lại cao hơn với giống KM 94. Chồi cây được
tạo ra đạt chiều dài khoảng 1,0 - 1,5 cm được chuyển sang môi trường MS không
có chất kích thích sinh trưởng cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%, rễ sinh trưởng tốt nhất.
Những cây tái sinh in vitro có bộ rễ hoàn chỉnh được trồng trong bầu giá thể trấu
hun: đất cát (4: 6) đạt tỷ lệ cây sống 100%. Quy trình tạo cây non hoàn chỉnh trong
16 - 18 tuần là cơ sở quan trọng cho xây dựng quy trình chuyển gene ở cây sắn.
Theo nghiên cứu của Vũ Văn Kiên và Nguyễn Du Sang (2011) [36] về việc
cải tiến các giống hiện có cho mục đích tăng năng suất, tăng hàm lượng protein và
giảm acid cyanhydric. Điều kiện quan trọng cho quy trình cải tiến giống thông qua
các kỹ thuật hiện đại như chuyển gen, dung hợp tế bào, đột biến lý học cần một hệ
thống tái sinh cây hoàn chỉnh [37]. Trong những năm gần đây, bộ môn Sinh lý
Thực vật, Trường đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành
một số nghiên cứu trên cây khoai mì như: ghép giữa mì cao su và khoai mì, tạo mô
sẹo và dịch treo tế bào, phát sinh chồi, phát sinh hình thái phôi thể hệ từ mô sẹo có
nguồn gốc lá khoai mì dòng Cuống Trầu.
Phôi thế hệ ở khoai mì dòng KM297 từ khúc cắt thùy lá non in vitro hay
khúc cắt lá mầm phôi thể hệ được cảm ứng trên môi trường MS bổ sung picloram
8mg/l, sau 13 ngày nuôi cấy trong tối. Các giai đoạn noãn phát triển phôi được ghi
nhận sau 10 ngày nuôi cấy ở ngoài sáng trên môi trường MS bổ sung BA 0,1mg/l
và NAA 0,01mg/l. Hoạt tính AIA và Zeatin nội sinh của giai đoạn noãn phôi hình
cầu đã được phân tích.
19
Hiện nay việc tạo ra một quá trình nhân sắn với số lượng lớn và chi phi thấp
ở Việt Nam chưa được chú ý đến dẫn tới việc phát triển các giống sắn mới có tiềm
năng vào sản xuất gặp khó khăn. Việc áp dụng một số kĩ thuật và giải pháp canh tác
khác như khí canh có thể là một biện pháp giúp cho việc nhân giống sắn sạch bệnh
với chi phí thấp.
1.5. Giới thiệu và đánh giá về hệ thống trồng cây bằng khí canh
Khí canh là một kỹ thuật trồng cây kết hợp với công nghệ mới thuộc trong
nhóm kỹ thuật trồng cây không sử dụng đất (Hydroponic). Trong đó, kỹ thuật trồng
cây không sử dụng đất có 6 hệ thống cơ bản là:
- Wick - Hệ thống dạng bấc
- Water culture - Hệ thống thuỷ canh
- Ebb and Flow - Hệ thống ngập và rút nước
- Drip - Hệ thống nhỏ giọt và hoàn lưu nước
- N. F. T - Kỹ thuật màng dinh dưỡng (Nutrient Film Technique)
- Aeroponic- Kỹ thuật khí canh.
1.5.1. Giới thiệu về hệ thống khí canh
Ở đây chúng ta sẽ đi sâu vào kỹ thuật khí canh, được đánh giá là tiên tiến và
hiệu quả nhất hiện nay trên thế giới. Khí canh thực chất là một ý tưởng hình thành
từ lâu chứ không phải chỉ mới được lên ý tưởng vài năm gần đây. Hoa lan nhiệt đới
mọc lơ lửng trên cây trong tự nhiên có lẽ là cảm hứng để các nhà khoa học trong
những năm 1920 nghĩ đến khí canh nhằm tạo điều kiện dễ dàng để nghiên cứu sự
phát triển của cây trồng. Tuy nhiên khí canh không được phát triển cho đến những
năm 1970, và đến nay, khí canh đã chứng tỏ rất thích hợp để nhân giống, nghiên
cứu sinh lý phát triển cây trồng và phát triển nông nghiệp đô thị. Với lịch sử phát
triển từ năm 1942 khi W. Carter, được biết là người đầu tiênđã mô tả một phương
pháp trồng cây trong hơi nước để thuận tiện cho việc kiểm soát rễ. Rồi năm 1944,
20
L. J. Klotz lần đầu tiên nghiên cứu bệnh rễ trên cây có múi qua cách trồng trong
sương mù. Năm 1952, G. F. Trowel đã trồng táo trong sương phun. Năm 1957, F.
W. Went, người đầu tiên gọi phương pháp trồng cây trong không khí
là “aeroponics”, đã trồng cà phê và cà chua với rễ lơ lửng trong không khí và phun
sương mù chứa chất dinh dưỡng lên rễ cây. Năm 1966, B. Briggs lần đầu tiên giới
thiệu khí canh và đưa công nghệ này từ phòng thí nghiệm ra thương mai. Hè năm
1976, John Prewer, nhà nghiên cứu người Anh đã trồng thực nghiệm cải xà lách
(lettuces) lớn lên trong 22 ngày trong ống nhựa và không khí được phun sương
chứa chất dinh dưỡng. Năm 1982 tại Disney Epcot Center, hệ thống khí canh xuất
hiện lần đầu trước công chúng. Kỹ thuật này trở nên phổ biến hơn khi Cơ quan
Hàng không và Vũ trụ Mỹ (NASA - National Aeronautics and Space
Administration) đặc biệt quan tâm và bắt đầu nghiên cứu khí canh trong môi trường
không trọng lực trên các tàu con thoi và trạm không gian. Cũng trong năm này, ở
Israel, Nir Isaac sáng chế thiết bị khí canh áp suất thấp cung cấp dưỡng chất cho
cây treo lơ lửng được giữ bằng chất dẻo xốp (styrofoam) trên khay. Năm 1983,
Richard J. Stoner đã nộp đơn đăng ký sáng chế thiết bị và quy trình khí canh đầu
tiên được gọi là “Genesis Growing System” (tạm dịch “Hệ thống sáng tạo của
Chúa”) và được coi là sự đột phá trong việc trồng trọt. Trong năm này, Richard J.
Stoner cũng đã nộp đơn đăng ký sáng chế bộ vi xử lý đầu tiên phân phối đồng thời
nước và dưỡng chất đến khay trồng. Năm 1985, công ty Genesis Technology INC
(Gti - công ty của Stoner) lần đầu tiên sản xuất, đưa ra thị trường hệ thống "Genesis
Growing System" quy mô lớn, là hệ thống khép kín, tuần hoàn và được kiểm soát
bằng vi xử lý để trồng cây thương mại. Stoner đã khởi đầu công nghiệp khí canh, là
người đứng đầu trong nghiên cứu và là tác giả nhiều bằng sáng chế về khí canh của
NASA, ông còn là thành viên hiệp hội BioServe Space Technology. Công ty Stoner
hiện có mặt trên thị trường với nhãn hàng True Aeroponics™. Và từ đó tới nay
công nghệ khi canh đã được phổ biến và phát triển rộng rãi hơn.
21
Khí canh ngày nay có thay thế một số việc mà trước kia chúng ta chỉ có thể
làm trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô. Hệ thống khí canh giúp cây nhân có thể
thích ứng nhanh với môi trường ngay cả khi trồng ra đất thì rễ và lá cũng không bị
héo. Hệ thống có thể giúp nhân nhanh một số giống cây, cây khoai tây hiện nay đã
được nhân nhanh bằng hệ thống khí canh với dự án “Hoàn thiện và phát triển công
nghệ sản xuất củ giống khoai tây chế biến bắt nguồn từ công nghệ nuôi cấy mô kết
hợp với công nghệ khí canh”, do các nhà khoa học của Viện Sinh học Nông nghiệp,
Học viện Nông nghiệp Hà Nội thực hiện (2015).
1.5.2. So sánh sơ bộ về hệ thống khí canh với các phƣơng pháp trồng cây khác
1.5.2.1. So sánh với phƣơng pháp trồng đất
Cùng trong điều kiện nhà kính và các điều kiện chăm sóc khác thì phương pháp
khí canh đã cho thấy kết quả và ưu điểm hơn so với trồng ở trong đất, cụ thể là:
- Năng suất ít nhất cao gấp 2 lần, thậm chí nếu làm nhiều tầng hơn năng suất
có thể nhân theo cấp số nhân 3-4 thậm chí 10 lần.
- Sức tăng trưởng cũng nhanh gấp 1,5 lần. Nhờ vào hệ thống đèn chiếu sáng,
cây sinh trưởng theo thời gian ảo, tức là 1 ngày 24h của con người tương
đương 3 ngày, mỗi ngày chỉ kéo dài 8h của cây.
- Tiết kiệm hơn 70% nước tưới. Sẽ không còn lo thiếu nước vào mùa khô, hạn
hán nhất là ở miền trung, nơi hạn hán mùa hè thường kéo dài.
- Trồng đất phải tốn công và thời gian cải tạo đất như xới đất, cày đất, ủ phân
vào đất. Nhưng với khí canh, sau một vụ mùa ta có thể ngay lập tức bắt đầu
trồng lại vụ mùa mới mà không cần tốn công cải tạo đất.
1.5.2.2. So sánh với phƣơng pháp thuỷ canh
Thực tế trồng cây bằng khí canh là bản vá lỗi của trồng cây bằng thuỷ canh.
Vì sao được gọi là bản vá lỗi. Đó là do trồng cây bằng thuỷ canh cũng có những ưu
điểm như đối với trồng cây bằng đất như đã nêu ở trên nhưng thuỷ canh lại hay gặp
22
vấn đề là các loại vi khuẩn gây mầm bệnh ở rễ sẽ dễ lây lan vì toàn bộ phần rễ đều
được nhúng thẳng vào chung một bồn chứa. Tạo điều kiện không thể thuận lợi hơn
để vi khuẩn gây bệnh lan ra toàn bộ hệ thống.
Khí canh đã giải quyết rất tốt sự lây lan bằng cách phun khí ở dạng sương, vi
khuẩn khó có thể tiếp cận nhiều cây một lúc, khi có cây bị bệnh chỉ việc loại bỏ cây
bệnh và thay nước ở bồn máy bơm.
23
CHƢƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Giống sắn phổ biến tại Việt Nam KM94 (tên gốc là KU50) được nhập nội từ
CIAT/Thái Lan trong bộ giống khảo nghiệm liên Á năm 1990. Giống KM94 là
giống sắn chủ lực của Việt Nam có diện tích thu hoạch năm 2008 chiếm 75,54%
tổng diện tích toàn quốc.
2.1.2. Môi trƣờng nuôi cấy và môi trƣờng ra cây bằng khí canh
- MS: Pha theo công thức của Murashige và Skoog, 1962
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của 1L MS
Lượng hóa chất 1L MS
Hóa chất (g/L)
1,65 NH4NO3
1,9 KNO3
0,37 MgSO4.H2O
0,17 KH2PO4
0,0062 H3BO3
0,02176 MnSO4.H2O
0,0086 ZnSO4.7H2O
Na2MO4.2H2O 0,00025
0,000025 CUSO4.5H2O
0,000025 CoCl2.6H2O
KI 0,00075
0,45 CaCl2.2H2O
24
Lượng hóa chất 1L MS
Hóa chất (g/L)
0,0373 Na2EDTA
0,02785 FeSO4.7H2O
Thiamin-HCl 0,0005
M-inositol 0,05
Đường 20
AGAR 7
- 4E : ( MS +0,1mg NAA/L + 0,1mg GA3/L)
- 17N: ( 1/3MS +0,1mg NAA/L + 0,1mg GA3/L)
- Hydroponic ( Dung dịch thủy canh)
Bảng 2.2 Thành phần hóa học của 1L Hydroponic ( Dung dịch thủy canh)
Lượng hóa chất cho 1L – Hydroponic (g/L)
0,4086 1,04 0,511 1,05 2,26 0,334 0,022 0,016 0,008 0,008 0,004 Hóa chất NH4NO3 K2SO4 Na2HPO4 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O Na2EDTA H3Bo3 MnSO4 ZnSO4 CuSO4 Na2Mo4
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp nhân giống in vitro
Xác định vật liệu khởi đầu cho qua trình nhân nhanh in vitro giống sắn
KM94: Cây in vitro có sẵn được bắt đầu đưa vào quy trình nhân. Sau khi cây
con có đủ độ lớn nhất định thì phần chồi đỉnh và chồi nách được cắt chuyển
qua môi trường ra rễ, phân chồi đỉnh được cắt từ đỉnh và thêm 2-3 mắt xuống
25
phía dưới gốc, chồi nách được cắt từng mắt một. Cả phần chồi đỉnh và chồi
nách cùng được cấy chuyển vào môi trường 17N. Sau khi các cây từ chồi
nách và chồi đỉnh phát sinh thành cây hoàn chỉnh (theo quan sát bằng mắt
thường cây có đủ các bộ phận rễ thân lá) sẽ được chuyển ra ngoài vườn ươm.
Ở đây sẽ đánh giá sự tạo rễ và sự phát triển của cây. Sự tạo rễ sẽ được đánh
giá bằng 2 chỉ tiêu là phần trăm cây ra rễ và số rễ tạo ra. Sự phát triển của
cây sẽ được đánh giá bằng số mắt mới phát sinh.
- Xác định điều kiện chiếu sáng cho quá trình nhân nhanh in vitro giống
sắn KM94: Kiểm tra sự phát sinh của cây trong điều kiện chiếu sáng khác
nhau xem độ sinh trưởng khác nhau như thế nào. Thí nghiệm được tiến hành
với một khu vực được chiếu sáng với độ sáng là 10000-11000 Lux và một
khu vực có độ sáng là 2000-2200 Lux. Sau đó cây được cấy vào cùng điều
kiện môi trường, sau 4 tuần sinh trưởng sẽ đếm số mắt trên 30 cây của mỗi
điều kiện chiếu sáng khác nhau. Cách đếm số mắt được đếm ngược từ gốc
lên tới đỉnh chồi. Thí nghiệm sẽ được tiếp tục với 30 cây con ở lần thí
nghiệm trên để cắt cấy chuyển nhân cây tiếp theo để đánh giá khả năng bật
trồi của cây in vitro trong điều kiện sáng khác nhau.
- So sánh hệ số nhân nhanh trong túi nilon và bình thủy tinh của giống
KM94: Cây in vitro sẽ được nuôi cấy trong bình thủy tinh và túi nilon với
cùng môi trường nuôi cấy để đánh giá sự sinh trưởng và phát triển. Sự sinh
trưởng và phát triển sẽ dựa vào số mắt mới phát sinh.
2.2.2. Phƣơng pháp đƣa cây ra vƣờn ƣơm bằng khí canh
Thiết kế hệ thống khí canh để thích nghi cây non trước khi đưa cây ngoài ra đất
Dựa vào sơ đồ nguyên lý của hệ thống khí canh để thiết kế hệ thống thích nghi cây:
26
Hình 2.1 Sơ đồ nguyên lý của hệ thống khí canh
Thử với các nồng độ khoáng khác nhau
17N không có thành phần đường và M-inositol.
Dung dịch thủy canh.
Thời gian cây non ra rễ trong in vitro cho tỉ lệ sống cao nhất:
Năm tuần sau khi cắt chuyển vào môi trường ra rễ.
Sáu tuần sau khi cắt chuyển vào môi trường ra rễ.
Mỗi quá trình sẽ được làm với 50 cây cho một nồng độ khoáng thử nghiệm
lặp lại 3 lần với đối cây đối chứng được ra trong bầu đất giữ ẩm kéo dài thời
gian trong 1 tuần, sau đó mở dần dần để cây thích nghi với môi trường ngoài.
- Sự phát triển và tỉ lệ cây cây sống thích nghi được ngoài vườn ươm giữa cây
ra rễ từ chồi đỉnh và cây ra rễ từ chồi nách. Tỉ lệ cây sống và thích nghi ngoài
vườn ươm sẽ được theo dõi ghi lại 7 ngày, 14 ngày.
- Tỉ lệ cây sống của các quá trình trên để được tính theo công thức sau
27
x là số cây sống của từng thí nghiệm riêng biệt.
y là tổng số cây đưa vào từng lần làm thí nghiệm.
Ở đây cây non sẽ đưa ra vườn ươm theo hai cách một là: theo phương pháp
ra đất, hai là thích nghi bằng khí canh trước khi trồng ra đất thời gian thích
nghi ở khí canh là 7 ngày.
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá chi phí cho việc nhân cây giống sắn
- Từ việc phương pháp nhân cây in vitro ở trên sẽ tính toán hệ số được hệ số
nhân cây sau đó đưa vào tính toán chi tiết các chi phí cấu thành giá của một
cây in vitro được sản xuất ra:
Với công thức tính tổng số cây nhân của quá trình như sau:
A =
A là tổng số cây nhân trong suốt quá trình.
n là số tháng nhân cây.
x là hệ số nhân cây hiện tại ở phòng tôi đang làm thí nghiệm.
Các chi phí để có thể tạo thành một cây nhân in vitro bao gồm:
+ Chi phí hóa chất: Một lít môi trường MS sẽ đổ được 14 bình tam giác, một
bình tam giác sẽ cấy 6 mẫu cây.
+ Chi phí công lao động (ở đây tính với định mức công kĩ thuật viện 180.000
VND theo thông tư 55/2017/TT-BTC của bộ tài chính ban hành).
28
Công chuẩn bị dụng cụ: sẽ được tính bằng 1 ngày lao động chuẩn bị được
số bình tam giác có sẵn môi trường để chuyển mẫu chuẩn bị chuyển mẫu
cấy.
Công cấy chuyển mẫu: thời gian 1h lao động cấy được số mẫu mới.
Công rửa dọn dụng cụ: thời gian 1 ngày lao động rửa dọn dụng cụ thí
nghiệm.
+ Chi phí cho điện sử dụng vận hành máy móc:
Chi phí điện cho đèn chiếu phòng nuôi cây: Với 4 bóng đèn 28W chiếu
sáng được cho 65 bình mỗi bình cấy 6 mẫu được chiếu sáng 16h/ngày.
Chi phí chi điện cho nồi khử trùng: một lần khử trùng được 40 bình tam
giác. Công suất 2kW thời gian khử trùng 1,5h.
Chi phí cho tiền điện điều hòa ở phòng nuôi cây: gồm 2 điều hòa công
suất 5kW chạy liên tục 16 tiếng cùng thời gian đèn chiếu sáng để luôn giữ
nhiệt độ ổn định. Phòng có 63 giàn đèn mỗi giàn có thể chứa được 65
bình, 1 bình 5- 6 cây.
- Sau đó cây in vitro sẽ được chuyển ra môi trường vườn ươm để tiếp tục tính
toán giá thành cho đoạn thích nghi cây. Tiền đất vật tư hóa chất và công lao
động sẽ được tính ra với số cây một lần nhân ra.
- Giá thành cây con được tính bằng tổng chi phí nhân in vitro cộng tổng chi
phí thích nghi cây ngoài vườn ươm chia cho số cây con sống thích nghi
ngoài vườn ươm.
29
CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả một số cái tiến trong một số bƣớc nhân giống in vitro
Xác định vật liệu khởi đầu cho qua trình nhân nhanh in vitro giống sắn
KM94:
Để xác định vật liệu khởi đầu cho quá trình nhân nhanh giống sắn KM 94,
chúng tôi sử dụng các mẫu vật liệu khác nhau bao gồm: chồi đỉnh và chồi nách.
Đánh giá vật liệu cho quá trình nhân thông qua chỉ tiêu số mắt chồi phát sinh và tỉ
lệ tạo rễ của giống KM 94. Kết quả được tổng hợp tại bảng 3.1 và bảng 3.2
Bảng 3.1 So sánh mắt phát sinh giữa chồi đỉnh và chồi nách đƣợc nuôi cấy
trong bình và theo dõi ghi tại các thời điểm 21-28 ngày
Sau 21 ngày Sau 28 ngày
Vật liệu
SD SD Trung bình Trung bình
Chồi đỉnh 3,0 0,05 4,2 0,12
Chồi nách 3,1 0,05 4,1 0,09
Kết quả thu được trên bảng cho thấy trung bình sau 7 ngày sẽ phát sinh một
mắt chồi đối với giống KM 94. Sau 28 ngày sẽ có 4 mắt chồi được hình thành. Số
mắt chồi trung bình được hình thành từ vật liệu ban đầu là chồi đỉnh và chồi nách
không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Như vậy, tốc độ sinh trưởng ở chồi đỉnh
và chồi nách là như nhau.
30
Bên cạnh đánh giá tốc độ sinh trưởng của cây qua số lượng mắt chồi hình
thành, chúng tôi xác định số rễ tạo thành khi nuôi cấy hai bộ phận khác nhau trong
cùng một thời gian. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2 So sánh hệ số tạo rễ giữa chồi đỉnh và chồi nách trong môi trƣờng
17N sau 7 ngày và 10 ngày
Sau 7 ngày Sau 10 ngày
Vật liệu %Số cây ra rễ Số rễ tạo ra %Số cây ra rễ Số rễ tạo ra
TB SD TB SD TB SD TB SD
68 5 2,5 0,0.5 100 3,8 0,12 0 Chồi đỉnh
70 5 2.6 0,11 100 3,7 0,09 0 Chồi nách
Kết quả so sánh số rễ tạo giữa phần chồi đỉnh và chồi nách cho thấy:
Tỉ lệ số cây ra rễ ở giống KM 94 sau 4 ngày chỉ đạt 5% (phần chồi đỉnh) và
6% (phần chồi nách) với số rễ trung bình từ 1,5-1,7 rễ. Sau 7 ngày tỉ lệ số cây ra rễ
tăng lên từ 68% -70%, số rễ trung bình đạt được ở giống KM 94 là 2,5-2,6 rễ. Sau
10 ngày, 100% số cây ra rễ khi nuôi cấy từ vật liệu ban đầu là chồi đỉnh và chồi
nách. Như vậy, tỉ lệ tạo rễ giữa chồi đỉnh và chồi nách không có sự khác biệt.
31
Hình 3.1 Cây KM 94 hoàn chỉnh được phát sinh từ chồi đỉnh và chồi nách
A. Bình nuôi cây chứa cả chổi đỉnh và chồi nách.
B. Ảnh chụp so sánh 2 cây phát sinh từ chồi đỉnh và chồi nách.
C. Cây phát sinh từ chồi đỉnh.
D. Cây phát sinh từ chồi nách.
Xác định điều kiện chiếu sáng cho quá trình nhân nhanh in vitro giống
sắn KM94:
Hệ thống phòng nuôi cấy được trang bị các dàn đèn chiếu sáng. Do hạn chế
về diện tích sử dụng nên mẫu cấy sẽ đặt ở các dàn chiếu sáng với các cường độ
chiếu sáng khác nhau. Để xác định ảnh hưởng của cường độ sáng khác nhau lên tốc
độ sinh trưởng của cây, chúng tôi thử nuôi cấy giống KM 94 tại 2 điều kiện chiếu
sáng khác nhau là 11000 Lux và 2200 Lux. Kết quả thu được tại bảng 3.3.
32
Bảng 3.3 So sánh sự phát sinh mắt chồi giữa hai cƣờng độ sáng khác nhau
Cắt chuyển lần 1 (30 ngày sau cấy chuyển) Cắt chuyển lần 2 (30 ngày sau cắt chuyển lần 1) Cắt chuyển lần 3 (30 ngày sau cắt chuyển lần 2) Độ sáng
Trung bình SD Trung bình SD Trung bình SD
11000 Lux 4,2 0,12 4,1 0,12 4,0 0,09
2200 Lux 4,1 0,09 3,9 0,09 4,3 0,09
Với cả hai cường độ chiếu sáng khác nhau thì số mắt chồi phát sinh ở cây
sắn không có sự khác biệt nhưng khi quan sát bằng mắt thường sự khác biệt xảy ra
ở khoảng cách giữa các mắt ở cây. Với những cây cường độ chiếu sáng thấp chiều
dài lóng dài hơn so với những cây được chiếu sáng ở cường độ cao. Khoảng cách
giữa các mắt lớn giúp cho việc cắt chuyển các mẫu cấy dễ dàng và đơn giản hơn.
Nhưng đồng thời việc này làm cho cây sẽ cao rất nhanh trong bình hoặc túi nuôi
cấy, cho nên các mẫu cây cấy chuyển cần theo dõi cắt chuyển đúng thời gian đảm
bảo sự sinh trưởng tốt nhất cho cây.
So sánh hệ số nhân nhanh trong túi nilon và bình thủy tinh của giống
KM94
Để giảm thiểu chi phí cho nhân in vitro đang tương đối đắt đỏ, chúng tôi đã
nghiên cứu hai dụng cụ chứa môi trường khác nhau là bình tam giác và túi nilon.
Bình tam giác là dụng cụ được sử dụng thường xuyên trong các phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô với ưu điểm: có thể tái sử dụng nhiều lần, chịu được điều kiện áp suất
và nhiệt độ cao khi khử trùng, cây sinh trưởng và phát triển tốt. Tuy nhiên, nhược
33
điểm mất nhiều thời gian và công lao động trong việc chuẩn bị dụng cụ trước khi
cấy mẫu cũng như tiêu hao nhiều điện năng khi hấp khử trùng do phải hấp nhiều
lần để đảm bảo đủ số bình cho nuôi cấy. Do đó, túi nilon sẽ khắc phục được nhược
điểm này. Tuy nhiên, do e ngại lớn nhất đó là túi nilon có đảm bảo được sự sinh
trưởng tốt nhất cho cây như bình tam giác, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh
hưởng này thông qua đánh giá sự phát sinh số mắt chồi khi nuôi cấy giống KM 94
trên hai điều kiện túi nilon và bình tam giác. Kết quả thu được tại bảng 3.4.
Bảng 3.4 So sánh sự phát sinh ở hai điều kiện nuôi cấy khác nhau
Thí nghiệm lần 1 Thí nghiệm lần 2 Thí nghiệm lần 3 Dụng cụ
Trung bình SD Trung bình SD Trung bình SD
3,9 0,12 3,8 0,1 4,2 0,11 Bình thủy tinh
Túi nilon 4,0 0,11 4,1 0,12 3,9 0,1
Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy trong hai điều kiện nuôi cấy khác nhau là
bình thủy tinh và túi nilon, không có sự khác biệt về số mắt chồi phát sinh. Như
vậy, chúng tôi sử dụng túi nilon cho quá trình nhân in vitro đối với giống KM 94.
Hình 3.2 Cây non được cấy trong túi nilon và bình thủy tinh cùng môi trường
MS
34
3.2. Kết quả đƣa cây ra vƣờn ƣơm bằng hệ thống khí canh
Dựa vào sơ đồ chung chúng tôi thiết kế ra hệ thống khí canh riêng nhằm đáp
ứng các mục tiêu thí nghiệm.
Hình 3.3 Sơ đồ hệ thống khí canh
Sau khi dựa vào sơ đồ nguyên lý chúng tôi đã thiết kế một hệ thống khí canh nhỏ để tiện cho việc sử dụng và vận chuyển. Những trang thiết bị được sử dụng để thiết kế hệ thống khí canh gồm:
- Máy bơm piston AT-8399 - Thùng xốp - Khay xốp 84 lỗ ươm cây non - Hệ thống ống dẫn - Hệ thống đầu phun (hay còn gọi là béc phun)
35
- Xuất xứ: TAIWAN - Model:8399 - Điện áp sử dụng: 24 V - Lưu lượng bơm: 1,8 L/P - Phun sương: 10-25 béc - Áp lực nước: 150 PSI - Công suất bơm: 30 W - Trọng lượng: 1,8 Kg
Máy bơm piston:
Hình 3.4 Máy bơm piston
36
Thùng Xốp:
Kích thước 45 x 55x 55 cm
Hình 3.5 Thùng Xốp
Xốp là chất liệu cách nhiệt tốt, nhẹ và bền việc sử dụng thùng xốp làm thùng
chứa dung dịch nuôi cây giúp làm giảm việc tác động nhiệt độ của môi trường bên
ngoài lên vùng dung dịch nuôi cây. Nhiệt độ ở môi trường rễ ổn định có thể giúp
cây phát triển ổn định hơn.
Giá ươm cây bằng xốp loại 84 được mua ngoài thị trường, sau khi về được
cải tạo cắt bớt một phần theo bề dày của khay ươm để thích hợp cho việc sử dụng
với cây in vitro khi ra khí canh.
37
Hình 3.6 Giá trồng cây non
Hình 3.7 Hệ thống khí canh
38
Quá trình vận hành dung dịch dinh dưỡng chứa trong thùng xốp được máy
bơm hút rồi phun qua các đầu vòi được cây non hấp thụ còn lại sẽ ngưng tụ rơi
xuống qua trở lại thùng xốp, tạo thành vòng khép kín. Với sơ đồ hệ thống như trên
ta có thể lắp thêm nhiều hệ thống thùng xốp để giúp tăng số lượng cây.
Việc thích nghi cây từ in vitro ra tới ngoài đất luôn gặp khó khăn nhất vì cây
non đang được trồng trong môi trường nhân nhanh giàu dinh dưỡng và đặc biệt có
đường trong thành phần môi trường làm cho rễ cây non hoạt động kém vậy nên khi
chuyển ra môi trường tự nhiên cây thích nghi kém dễ bị chết. Thông qua hệ thống
khí canh có thể giúp rễ của cây non có thể thích nghi dần với môi trường ngoài tự
nhiên vì thành phần môi trường của dung dịch khí canh cũng gần tương tự với môi
trường trong nhân nhanh nhưng bỏ đi thành phần được và một vitamin (vì đường
và vitamin sẽ gây nấm bệnh khi ở ngoài điều kiện tự nhiên). Chúng tôi đã làm thí
nghiệm với 2 nồng độ khoáng khác nhau và cùng so sánh với việc trồng cây ra đất
trực tiếp. Kết quả thử được ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5 Tỉ lệ phần trăm cây sống giữa hai hình thức ra cây vào môi trƣờng tự
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Thích nghi khí canh
Ra đất trực tiếp
Thích nghi khí canh
Ra đất trực tiếp
Thích nghi khí canh
Ra đất trực tiếp
Loại môi trường
SD
SD
SD
SD
SD
SD
Trung bình
Trung bình
Trung bình
Trung bình
Trung bình
Trung bình
75%
4%
43%
4%
78%
5%
47%
4%
76%
3%
45%
5%
74%
5%
43%
3%
75%
6%
48%
3%
75%
5%
46%
3%
17N không đường không M- inositol Dung dịch thủy canh
nhiên
39
Cây được thích nghi qua hệ thống khí canh đã giúp tăng tỉ lệ sống cho cây
non khi được thích nghi ngoài tự nhiên. Việc dùng dùng hai thành phần nồng độ
khoáng khác nhau cho việc thích nghi cây bằng khí canh đều cho kết quả không
khác biệt. Nhưng chi phí hóa chất để tạo nên hai dung dịch khí canh đó có sự khác
nhau. Với 10L dung lịch 17N không có thành phần đường và M-inositol thì mất chi
phí là 34.500 VND còn dung dịch thủy canh là 5.800 VND.
Khi cây non sinh trưởng phát triển trong môi in vitro thành cây hoàn chỉnh
thì sẽ được chuyển ra ngoài môi trương tự nhiên. Nhưng việc lưu trữ cây non trong
môi trường in vitro thời gian bao lâu sẽ ảnh hưởng tới tỉ lệ sống của cây non được
thích nghi ngoài tự nhiên và đồng thời cũng là phần cấu thành chi phí sản xuất cây
in vitro. Các mẫu cấy được chuyển vào môi trường ra rễ từ 5 tuần và 6 tuần tuổi
được đưa ra ngoài vườn ươm bằng 2 cách là ra đất trực tiếp và thích nghi bằng hệ
thống khi canh trước khi đưa ra đất trồng:
Bảng 3.6 Tỉ lệ phần trăm sống của cây non với thời gian ở môi trƣờng ra rễ
khác nhau
Lần 1 Lần 2 Lần 3
Thích nghi khí canh Ra đất trực tiếp Thích nghi khí canh Ra đất trực tiếp Thích nghi khí canh Ra đất trực tiếp
SD SD SD SD SD SD Thời gian lưu trữ cây non Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình
77% 5% 42% 6% 73% 4% 44% 5% 72% 3% 46% 5%
Năm Tuần Sáu tuần 78% 4% 45% 5% 75% 3% 48% 4% 75% 4% 47% 5%
Sau khi mẫu cấy được chuyển vào môi trường ra rễ sau thời gian 5 tuần và 6
tuần thì đã phát triển thành cây sắn hoàn chỉnh với đủ ngọn lá thân rễ rồi chuyển ra
ngoài môi trường trồng tự nhiên thì thấy rằng sự thích nghi ở ngoài môi trường từ
40
nhiên không có nhiều khác biệt. Việc này sẽ giảm đi 16% tiền điện duy trì cây
trong phòng nuôi cấy.
Tỉ lệ sống của cây non phát sinh từ chồi đỉnh và chồi nách ngoài vườn ươm
bằng cách ra đất thẳng trực tiếp:
Bảng 3.7 Tỉ lệ sống của cây non phát sinh từ chồi đỉnh và chồi nách bằng cách
ra đất trực tiếp
Sau 7 ngày Sau 14 ngày Sau 21 ngày
Vật liệu tạo cây non SD SD SD
Chồi đỉnh Chồi nách Trung bình 85% 84% Trung bình 5% 51% 5% 53% 4% 3% Trung bình 38% 41% 4% 4%
Tỉ lệ cây sống khi được thích nghi qua khí canh rồi mới chuyển ra đất như
sau:
Bảng 3.8 Tỉ lệ sống của cây non đƣợc phát sinh từ chồi đỉnh và chồi nách đƣợc
thích nghi qua hệ thống khí canh trƣớc khi ra đất
Sau 7 ngày Sau 14 ngày Sau 21 ngày
Vật liệu tạo cây non SD SD SD
Chồi đỉnh Chồi nách Trung bình 85% 85% 5% 5% Trung bình 80% 79% Trung bình 4% 80% 5% 79% 4% 4%
Các bảng trên cho thấy tỉ lệ cây non được ra từ chồi nách và chồi đỉnh không
sự khác biệt, việc ra cây non từ chồi nách sẽ giúp giảm thời gian nhân cũng như
giảm một số cây nguyên liệu trong quá trình nhân. Còn việc cây non được đưa qua
hệ thống khí canh để thích nghi giúp làm tăng khả năng thích nghi và tỉ lệ cây non
đưa ra đất sống cao hơn đáng kể.
41
Bảng tổng hợp so sánh tỉ lệ cây non sống ngoài vườn ươm giữa trồng trực
tiếp ra đất và thích nghi cây qua hệ thống khí canh.
Bảng 3.9 Tổng hợp tỉ lệ sống của cây non ở hai hình thức ra cây khác nhau
Sau 7 ngày Sau 14 ngày Sau 21 ngày
Hình thức thích nghi
SD SD SD Trung bình Trung bình Trung bình
85% 4% 80% 5% 80% 5% Hệ thống khí canh
73% 4% 52% 3% 39,5% 3% Ra đất trực tiếp
Hình 3.8 Chụp khí canh từ trên xuống ở trong màng bọc nilon
42
Hình 3.9 Cây non thích nghi trong hệ thống khí canh
Hình 3.10 Cây non được ra đất trực tiếp bọc kín để giữ độ ẩm
43
Hình 3.11 Cây non 7 ngày sau khi ra đất
Thông qua hệ thống khí canh giúp rễ cây non có tỉ lệ sống cao hơn. Ở hệ
thống khí canh vẫn dùng dung dịch dinh dưỡng gần tương tự với môi trường trong
in vitro nên rễ cây non dễ thích nghi và phát sinh các rễ mới với điều kiện sống
mới, làm tăng khả năng sống sót của cây non ngoài môi trường đất.
3.3. Đánh giá chi phí cho việc nhân nhanh và đƣa ra đất để tạo thành một cây
giống hoàn chỉnh
Sau quá trình ghi chép, theo dõi và đánh giá cụ thể tại phòng thí nghiệm
chúng tôi đưa ra một bạn đánh giá chi phí để sản xuất một cây giống ngoài tự nhiên
từ in vitro như sau:
44
Bảng 3.10 Chi phí đánh giá một cây non đã thích nghi ngoài tự nhiên
STT Nội dung Tổng Ghi chú
Tổng chi phí cho một cây
Với tỉ lệ chuyển cây từ môi trường in non từ in vitro đã đƣợc
vitro ra tự nhiên có tỉ lệ sống 100%. thích nghi ngoài tự nhiên 5726
Chi phí trong quá trình
1 nhân in vitro 1698
1L MS 19.637 VND và nuôi cấy
được trung bình 80 mẫu cây non. Chi phí tiền hóa chất 245
Chi phí công lao động 935
Chuẩn bị 140 và đổ hết 10L môi
trường trong 1 công lao đông 8h. Mỗi
Chuẩn bị dụng cụ bình nuôi cấy được 6 cây in vitro. 200
1 ngày công lao động được cấy
Cắt chuyển mẫu cấy chuyển được 500 mẫu. 360
1h lao động chuẩn bị dọn vệ sinh và
Rửa dọn dẹp dụng cụ rửa bình được 60 chiếc. 375
Chi phí cho tiền điện nƣớc 518
Không thể tính toán được vì còn
Tiền nước dùng chung trong nhiều thí nghiệm. 0
Cây được nuôi trong vòng 30 ngày Tiền đèn nuôi cây 207 với 4 bóng đèn 28W cho độ sáng
45
11000 Lux được chiếu sáng 16h/ngày
cho 390 cây in vitro.
Hai điều hòa 18000BTU công suất
tiêu thu 10 kW/h chạy liên tục 16h
cho phòng nuôi cấy được 24000
Tiền điều hòa cho phòng nghìn cây non (cây non được duy trì
nuôi cây tính trong 30 ngày). 293
Với công suất 1,5 kW/h mỗi lần khử
trùng mất 2h được 40 bình môi
Tiền điện sử dụng cho nồi trường môi bình môi trường cấy được
khủ trùng 13 6 cây.
Với tổng công suất là 220 W/h sử
Tiền điện sử dụng cho box dụng trong 8h để cấy được 500 mẫu
cấy 5 cây.
Quá trình ra rễ để chuẩn bị chuyển
cây từ môi trường in vitro ra vườn
ươm chỉ sử dụng chồi đỉnh của các Chi phí quá trình ra rễ
2 cây trong quá trình nhân in vitro. của cây non 1594
Môi trường ra rễ có chứa nồng độ
Chi phí tiền hóa chất khoáng chất 1/3 MS. 142
Chi phí công lao động 935
Do quá trình cần lữu trữ cây ra rễ là
42 ngày nên chi phí tiền điện để duy Chi phí cho tiền điện nước 718 mẫu cấy sẽ được tính với 42 ngày
46
chứ không phải 30 ngày.
Không tính vì sử dụng trang thiết bị Chi phí trang thiết bị
3 của phòng. phòng ốc và khấu hao 0 0
Chi phí cho quá trình
trồng cây in vitro ngoài tự
4 nhiên 2233
Sử dụng đất giá thể mỗi bầu đất trồng
cây sử dụng 0,4kg đất 10kg đất giá
Đất trồng cây 25.000 VND. 1000
50.000 VND cho 1kg túi bầu được
Túi bầu bằng nilon 150 cái. 333
1 ngày công trồng ra được 200 cây
Công trồng và chăm sóc non từ in vitro. 900
Những tính toán trên đang tính ở điều kiện lý tưởng tỉ lệ cây non sống được
thích nghi ngoài vườm là 100%. Vì vậy khi giá cây non cấu thành sẽ được tính
bằng:
Giá cây non = Tổng chi phí / tỉ lệ sống của cây non ngoài vườn ươm
Từ phương pháp nhân cây in vitro ở trên sẽ tính toán hệ số nhân cây là 4 theo
từng tháng và đưa ra được công thức tỉnh tổng số cây nhân của quá trình như sau:
A =
Chi phí hóa chất được tính cho một cây in vitro như sau :
47
Bảng 3.11 Giá thành hóa chất và giá thành 1L MS
Lượng hóa chất 1L Giá cho 1g hóa Giá thành 1L
Hóa chất MS MS chất
1,65 3633,63 2202,2 NH4NO3
2331,875 4430,5625 1,9 KNO3
0,37 1792,9275 4845,75 MgSO4.H2O
0,17 556,1465 3271,45 KH2PO4
0,0062 2093 12,9766 H3BO3
0,02176 2916,55 63,464128 MnSO4.H2O
0,0086 27,93882 3248,7 ZnSO4.7H2O
0,00025 1,740375 6961,5 Na2MO4.2H2O
0,000025 0,0762125 3048,5 CUSO4.5H2O
0,000025 0,3731 14924 CoCl2.6H2O
KI 0,00075 5,084625 6779,5
0,45 1044,225 2320,5 CaCl2.2H2O
0,0373 261,3611 7007 Na2EDTA
0,02785 78,56485 2821 FeSO4.7H2O
Thiamin-HCl 0,0005 22067,5 11,03375
M-inositol 0,05 10738 536,9
48
Đường 20 9,04 180,8
AGAR 7 1000 7000
Tổng 19637,80506
Với 1 lít dung dịch MS sẽ sử dụng nuôi cấy được 75 mẫu cấy vậy giá thành
hóa chất cho 1 cây là 26.183 VND. Việc sử dụng cả chồi đỉnh và chồi nách để ra rễ
tạo cây non chuẩn bị ra ngoài vườm ươm làm giảm hẳn chi phí việc nhân cây đi
loại bỏ khâu ra rễ giảm chi phí đi:
Bảng 3.12 So sánh chi phí giữa việc dùng cả chồi nách trong quá trình ra rễ
STT Nội dung Tổng chi phí STT Tổng chi phí
5726 3931
Tổng chi phí cho một cây non từ in vitro đã được thích nghi ngoài tự nhiên Chi phí trong quá trình nhân in vitro 1698 1 Nội dung Tổng chi phí cho một cây non từ in vitro đã được thích nghi ngoài tự nhiên Chi phí trong quá trình nhân in vitro 1 1698
1794 2 2 0
Chi phí quá trình ra rễ của của cây non Chi phí cho quá trình trồng cây in vitro ngoài tự nhiên 2233 Chi phí quá trình ra rễ của của cây non Chi phí cho quá trình trồng cây in vitro ngoài tự nhiên 3 3 2233
Việc sử giảm cường đồ chiếu sáng giúp tăng diện tích sử dụng của phòng
nuôi cây cũng như giảm việc phát sinh nhiệt độ trong phòng giúp giảm việc sử
dụng điều hòa. Với vấn đề này thì chi phí phát cho tiền điện nuôi cây hiện nay mới
chỉ tính toán được tới vấn đề là tăng gấp đôi diện tích nuôi cấy so với phòng cũ. Vì
diện tích nuôi cấy tăng gấp đôi nên việc tiền điện sử dụng sẽ giảm đi một nửa.
49
Bảng 3.13 So sánh chi phí tiền điện phòng nuôi cấy
Tiền đèn nuôi cây 207 Tiền đèn nuôi cây 103,5
Tiền điều hòa cho phòng nuôi Tiền điều hòa cho phòng nuôi
cây 293 cây 146,5
Tổng 500 Tổng 250
Việc sử dụng túi nilon làm dụng cụ nuôi cấy làm giảm chi nhân công cho
việc rửa dọn dụng cụ thí nghiệm. Chi phí đầu tư ban đầu vào 1 bình thủy tinh là
50.000 VND và 300 túi nilon (tương đương 1kg túi nilon) cũng là 50.000 VND,
cho nên chi phí khấu hao của túi nilon sẽ bù lại cho chi phí tái sử dụng của bình
thủy tinh nên việc tái sử dụng bình thủy tinh sẽ không gây ảnh hưởng tới việc tính
giá thành.
Bảng 3.14 So sánh chi phí giữa việc sử dụng túi nilon và bình thủy tinh
Chi phí công lao động 935 Chi phí công lao động 560
Chuẩn bị dụng cụ 200 Chuẩn bị dụng cụ 200
Cắt chuyển mẫu cấy 360 Cắt chuyển mẫu cấy 360
Rửa dọn d p dụng cụ 375 Rửa dọn d p dụng cụ 0
Việc so sánh giá giảm chi phí ở các quá trình trên vẫn đang được tính với
điều kiện lý tưởng khi cây in vitro được thích nghi sống ngoài tự nhiên đạt 100%.
Nhưng thực tế làm thì không được như tỉ lệ sống của cây thích nghi ngoài tự nhiên
được ghi nhận qua kết quả về việc đánh giá cây thông qua hệ thống khí canh và ra
đất trực tiếp. Kết quả thông qua khí canh tỉ lệ cây non sống đặt từ 75-80% còn ra
50
đất trực tiếp từ 39,5% - 45,0%. Việc thích nghi cây thông qua hệ thống khí canh
còn giúp cây có tỉ lệ sống ổn định không phụ thuộc vào thời tiết của thời điểm ra
cây. Tỉ lệ sống của cây non trong quyết định đến giá thành của cây non sau khi
được thích nghi ngoài tự nhiên.
Bảng 3.15 Tổng hợp chi phí giữa việc sử dụng quy trình cũ và quy trình cải
tiến
Tổng Tổng
STT Nội dung chi phí STT Nội dung chi phí
Tổng chi phí cho một cây non Tổng chi phí cho một cây non
từ in vitro đã được thích nghi từ in vitro đã được thích nghi
ngoài tự nhiên 5726 ngoài tự nhiên 3306
Chi phí trong quá trình nhân Chi phí trong quá trình nhân
1 in vitro 1698 1 in vitro 1073
Chi phí quá trình ra rễ của cây Chi phí quá trình ra rễ của cây
2 non 1794 2 non 0
Chi phí cho quá trình trồng Chi phí cho quá trình trồng
3 cây in vitro ngoài tự nhiên 2233 3 cây in vitro ngoài tự nhiên 2233
Giá cây giống từ in vitro Giá thành cây in vitro : tỉ lệ sống của cây non
Giá cây non từ in vitro theo quy trình cũ: Giá cây non từ in vitro theo quy trình mới:
5.726 : 45%=12.724 3.306 : 80% = 4.132
(Tất cả chi phí giá thành của các công việc đều được tiến hành tính toàn
trong khuôn khổ tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bảo
51
thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, vào thời điểm từ tháng 6 tới tháng 9 năm
2017).
52
CHƢƠNG IV – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
- Việc dùng cả chồi đỉnh và chồi nách trong quá trình nhân in vitro để giảm
chi phí đi 1.794 VND.
- Việc thích nghi cây bằng hệ thống khi canh đã giúp tăng tỉ lệ sống của cây
non ra ngoài tự nhiên lên 80%.
- Giá cây non từ in vitro sản xuất theo quy trình cải tiến còn 4.132 VND giảm
đi được tới 66% chi phi so với quy trình cũ.
4.2. Kiến nghị
- Cần phải tiếp tục nghiên cứu và cải tiến quy trình để có hệ số nhân cao hơn.
- Tiếp tục nghiên cứu hệ thống khi canh trong viêc sản xuất cây giống.
- Tiếp tục đưa ra các giải pháp để có thể giảm thiểu chi phí sản xuất cây in
vitro.
53
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Huy Hàm (2015) báo cáo tổng hợp đề tài “Ứng dụng các công nghệ tiên
tiến phục vụ chọn giống phân tử ở sắn trong khu vực Châu Á”
2. Nguyễn Văn Đồng, Lê Thị Thủy (2013). “Ứng dụng công nghệ Nuôi cấy mô
tế bào trong việc nhân nhanh một số giống sắn sạch bệnh” Tạp chí nông
nghiệp và phát triển nông thôn(9), 17-24.
3. Lê Văn Hoàng, Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, Đại học Đà Nẵng,
2008, Chương 4.
4. Phạm Văn Biên, Hoàng Kim(1995), Cây sắn, NXB Nông nghiệp, TP. Hồ Chí
Minh.
5. Trần Ngọc Ngoạn (2007), Giáo trình cây sắn, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
54
Tài liệu tiếng nƣớc ngoài:
6. Ceballos, H. and G.d.l. Cruz (2012), "Cassava Taxonomy and Morphology",
in Cassava in the Third Millenium Modern: Production, Processing, Use and
Market System, (Eds). CIAT. Vol. 377, CIAT Publication: Colombia, pp. 15-
28.
7. Fresco, L.O. (1986), "Cassava in shifting cultivation. A systems approach to
agricultural technology development in Africa", Royal Tropical Institute,
Netherland.
8. HoangKim, N.V. Bo, N. Phuong, H. Long, T.C. Khanh, N.T. Hien, H.
Ceballos, R. Lefroy, K. Fahrney, R. Howeler, and T.M. Aye (2010), "Current
situation of cassava in Vietnam and the breeding of improved cultivars",
retrieved from: http://foodcrops.blogspot.com/2010/05/current-situation-of-
cassava-in vietnam.html.
9. Jones, W.O. (1959), "Manioc in Africa", Stanford University Press.
10. Kim, H., P.V. Bien, and R.H. Howeler (2000), "Status of cassava in Viet
Nam: Implications for future research and development", in Proceedings of
the validation forum on the global cassava development strategy. A review of
cassava in Asia with country case studies on Thailand and Viet Nam. Rome.
11. Rogers, D.J. (1965), "Studies of Manihot esculenta Crantz and Related
Species", Bulletin of the Torrey Botanical Club, 90(1), pp. 43-54.
12. Tribadi, Suranto, and Sajidan (2010), "Variation of morphological and
protein pattern of cassava (Manihot esculenta) varieties of Adira1 and Cabak
makao in Ngawi, East Java ".Bioscience, 2(1), pp. 14-22.
55
13. Kwame O. Ogero, Gitonga N. Mburugu, Maina Mwangi, Omwoyo Omboriand Michael Ngugi (2012). In vitro Micropropagation of Cassava Through Low Cost Tissue Culture, Asian Journal of Agricultural Sciences 4(3): 205-209.
14. Santana, M.A., G. Romay, J. Matehus, J. VicenteVillardón & J.R. Demey, 2009. A simple and lowcost strategy for micropropagation of cassava (Manihot esculenta Crantz). Afr. J. Biotechnol., 8(16): 3789-3897
15. Mussio, I., M. Chaput, I. Serraf, G. Ducreux & D. Sihachakr, 1998. Adventitious shoot regeneration from leaf explants of an African clone of cassava (Manihot esculenta Crantz) and analysis of the conformity of regenerated plants. Plant Cell Tissure. Org. Cult., 53: 205-211.
16. Mutegi, R.W., 2009. Towards identifying the physiological and molecular basis of drought tolerance in cassava (Manihot esculenta Crantz). Ph.D. Thesis, GeargAugust University Gottingen.
17. Escobar, R., A. Hern, N. Larrahondo, G. Ospina, J. Restrepo, L. Mu Noz, J. Tohme & W. Roca, 2006. Tissue culture for farmers: Participatory adaptation of low-input cassava propagation in Colombia. Exper. Agric., 42: 103-120.
18. Jorge, V., M. Fregene, M. Duque, M. Bonierbale, J. Tohme and V. Verdier, 2000. Genetic mapping of resistance to bacterial blight disease in cassava (Manihot esculenta Crantz). Theor. Appl. Gen., 101: 865-872.
19. Thro, M.A., W. Roca, J. Restrepo, H. Caballero, S. Poats, R. Escobar, G. Mafla and C. Hernández, 1999. Can In vitro biology have farm-level impact for small Scale Cassava Farmers in Latin America? Cell. Dev. Biol. Plant, 35: 382-387.
20. Mapayi E. F., Ojo D. K., Oduwaye O. A. & Porbeni J. B. O (2013).
Optimization of In-Vitro Propagation of Cassava (Manihot esculenta Crantz)
Genotypes, Journal of Agricultural Science, 5, 3.
21. Taye, B. (1998). Cassava Africa’s food security crop. International Institute
of Tropical Agriculture (IITA), Ibadan.
56
in
22. Mahungu, N. M. (2004). Contribution of SARRNET (Southern African Root the SADC (Southern to foodsecurity Crops Research Network) Development Community) region. African Crop Science Journal, 12(3), 312.
23. Acedo, V. Z. (2006). Improvement of in-vitro techniques for rapid meristem development and mass propagation of Philippine cassava (Manihot esculenta Crantz). Journal of Food, Agriculture and Environment, 4(1), 220-224.
24. Roza Berhanu & Tileye Feyissa (2013). Optimization of In-Vitro
Propagation of Cassava (Manihot esculenta Crantz.) Genotypes, Ethiop. J.
Biol. Sci. 12(1): 25-39.
25. Bhagwat, B., Vieira, L.G.E. & Erickson, L.R. (1996). Stimulation of In vitro thidiazuron,
shoot proliferation from nodal explants of cassava by benzyladenine and gibberellic acid. Plant Cell Tiss. Org. 46: 1-7.
26. Danso, K.E. & Ford-Llyod, B.V. (2008).The effect of abscisic acid and sucrose on postthaw embryogenic competence and subsequent plant recovery from embryogenic calli of cassava. Am-Eurasian J. Agric. Environ. Sci., 3: 663-671.
27. Dawit Beyene, Tileye Feyissa and Girma Bedada (2010). Micropropagation of selected cassava (Manihot esculenta Crantz.) varieties from meristem culture. Ethiop. J. Biol. Sci., 9(2): 127-142.
28. Mathews, H., Schopke, C., Carcamo, R., Chavarriaga, P., Fauquet, C. and Beachy, R.N. (1993). Improvement of somatic embryogenesis and plant recovery in cassava. Plant Cell Rep., 12: 328-333.
29. Lan D, Binh Le, Son Le & Ha Chu (2017), Establishment of Plant
Regeneration Protocol for Cassava (Manihot esculenta Crantz) via Somatic
Embryogenesis from Immature Leaves, Vietnam J. Agri. Sci. 2017, Vol. 15,
No. 1: 1 - 6
30. Joseph T., Yeoh H. -H., Loh C. -S. (2001). Somatic embryogenesis, plant regeneration and cyanogenesis in Manihot glaziovii Muell. Arg. (ceara rubber). Plant Cell Reports, 19(5): 535-53.
57
31. Schopke, C., Taylor, N., Carcamo, R., Konan, N.K., Marmey, P., Henshaw, G.G. (1996). Regeneration of transgenic cassava plants (Manihot esculenta Crantz) from microbombarded embryogenic suspension cultures. Nature Biotechnology, 14: 731-735.
32. Guohua Ma & Qiusheng Xu (2002). Induction of somatic embryogenesis and adventitious shoots from immature leaves of cassava. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 70: 281-288.
33. Li, H.Q., Sautter, C., Potrykus, I. and Puonti-Kaerlas, J. (1996). Genetic esculenta Crantz). Nature (Manihot cassava of
transformation Biotechnology, 14: 736-740.
34. Zhang Peng, Salak Phansiri & Johanna PuontiKaerlas (2001). Improvement of cassava shoot organogenesis by the use of silver nitrate In vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 67: 47-54.
35. Raemakers C.J.J.M., Sofiari E., Jacobsen E. and Visser R.G.F. (1997).
Regeneration and transformation of cassava. Euphytica, 96: 153-161.
36. Vũ Văn Kiên & Nguyễn Du Sanh 2011), Khảo sát sự phát sinh phôi thể hệ ở khoai mì (Manihot esculenta crantz.), Science & Technology Development, Vol 14, No.T3- 2011.
37. Taylor, N.J., Edwards, M., Kiernan, R.J., Davey, C.D.M., David Blakesley, D., and Henshaw, G.G. Development of friable embryogenic callus and embryogenic suspension culture systems in cassava (Manihot esculenta Crantz). Natural Biotechnology,14: 721- 230 (1996).
![Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Khoa học cây trồng: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, kỹ thuật nhân giống và trồng trọt cây bảy lá một hoa [Paris vietnamensis (Takht.) H. Li] tại Sa Pa, Lào Cai](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250403/vihashirama/135x160/5471743661799.jpg)
