Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli" với mục tiêu sản xuất Pfu DNA polymerase chất lượng cao góp phần tích cực trong việc phục vụ các nghiên cứu về sinh học phân tử trong nước.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN HÀ XUYÊN Nghiên cứu sản xuấ t, tinh sa ̣ch Pfu DNA polymerase tái tổ hơ ̣p từ Escherichia coli Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật i
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Hà Xuyên Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật ii
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy đã luôn hướng dẫn, định hướng và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Thái Nguyên cũng như các thầy cô thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn để thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cô chị, các bạn đồng nghiệp và các em sinh viên phòng Kỹ thuật Gen đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong qua trình làm việc tại phòng thí nghiệm. Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những người sinh thành, nuôi dưỡng tôi là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới anh chị, bạn bè tôi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Một lần nữa tôi vô cùng cảm ơn. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Hà Xuyên CÁC CHỮ VIẾT TẮT Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật iii
Tên viết tắt Tên đầy đủ a.a Amino acid APS Amonium persulphate Bp Base pair CBB Coomassie brilliant blue DNA Pol Deoxyribonucleic acid Polymerase Dntp Deoxynucleoside triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide EtOH Ethanol IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside Kb Kilo base KDa Kilo Dalton KLPT Khối lượng phân tử LB Luria – Bertani OD Mật độ quang học (optical density) PCR Polymerase chain reaction PLysS plasmid plysS mã hóa cho T7 lysozyme PMSF Phenyl methyl sulphonyl fluoride RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis ssDNA Sợi đơn DNA (single stranded DNA) TAE Tris-acetate-EDTA TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl ethylendiamine MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................................................... i Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật iv
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................................. iii CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................................................... iii MỤC LỤC................................................................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ................................................................ vi DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ................................................................ vii MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................................... 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về DNA polymerase.................................................................................................... 2 1.1.1. DNA polymerase ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn ............................................... 3 1.1.2. Tổng quan về DNA polymerase bền nhiệt ............................................................................ 4 1.2. Tổng quan về Pfu DNA polymerase ............................................................................................. 6 1.2.1. Cấu trúc của Pfu DNA polymerase ....................................................................................... 6 1.2.2. Cơ chế hoạt động sửa sai của Pfu DNA polymerase ............................................................ 8 1.2.3. Một số tính chất của Pfu DNA polymerase ........................................................................ 10 1.2.4. Ứng dụng của Pfu DNA polymerase .................................................................................. 13 1.2.5. Tình hình nghiên cứu Pfu DNA polymerase tái tổ hợp ...................................................... 15 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 18 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị ........................................................................................................... 18 2.1.1. Vật liệu ................................................................................................................................ 18 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................................. 20 2.2. Phương pháp ............................................................................................................................... 21 2.2.1. Tách chiết plasmid .............................................................................................................. 21 2.2.2. Nhân đoạn gen mã hóa cho Pfu DNA pol bằng phản ứng PCR .......................................... 21 2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose ............................................................................................. 23 2.2.4. Tinh sạch bằng kit Wizard SV Gel ..................................................................................... 23 2.2.5. Ghép nối gen ...................................................................................................................... 23 2.2.6. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ................................................ 24 2.2.7. Xác định trình tự DNA........................................................................................................ 25 2.2.8. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol .................................................... 26 2.2.9. Biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol ............................................................................. 26 2.2.10. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE ........................................................... 26 2.2.11. Sắc ký ái lực qua cột amylose ............................................................................................. 27 2.2.12. Tinh sạch protein đuôi Histag bằng Ni-charged Magbeads ................................................ 28 2.2.13. Kiểm tra hoạt độ tổng hợp DNA của Pfu DNA pol tái tổ hợp ............................................ 28 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật v
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................................. 29 3.1. Xác định trình tự gen mã hóa cho Pfu DNA pol từ tế bào mang vector pET 11a ...................... 29 3.2. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol ............................................................ 36 3.3. Xây dựng quy trình tạo vector biểu hiện ..................................................................................... 38 3.4. Lựa chọn chủng biểu hiện gen mã hóa cho Pfu DNA pol........................................................... 42 3.5. Tinh sạch protein Pfu DNA pol tái tổ hợp .................................................................................. 44 3.6. Thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp ........................................................................................ 47 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 49 PHỤ LỤC………………………………………………………………………………………………...51 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………………… 55 DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Tiêu đề Trang Bảng 1.1 So sánh độ chính xác của các DNA polymerase bền nhiệt trong 11 PCR Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật vi
Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong luận văn 19 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hóa Pfu DNA pol 22 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép 24 Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 25 Bảng 2.5 Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE 27 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp 29 DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình Tiêu đề Trang Hình1.1 Cấu trúc tổng thể của Pfu DNA polymerase 8 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật vii
Hình 1.2 So sánh trình tự acid amin và cấu trúc của motif β –hairpin (vùng 9 exonulcease) và motif Y-GG/A (vùng ngón tay cái) Hình 1.3 Cơ chế hoạt động và sửa sai của Pfu DNA polymerase 11 Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid mang đoạn gen Pfu 32 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn gen mã hóa 31 cho Pfu DNA pol trong vector pET11a trên gel agarose 1%. Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa Pfu 32 DNA pol bằng 2 cặp mồi T7- F/ Pfu - R1 và Pfu – F1/ T7- R Hình 3.4 Kết quả giải trình tự đoạn gen mã hóa Pfu DNA pol từ vector pET11a tái 36 tổ hợp Hình 3.5 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Pfu DNA pol 38 Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt Pfu và vector pMAL - c5X bằng enzyme 39 giới hạn trên gel agarose 1% Hình 3.7 Kết quả PCR sàng lọc và tách chiết plasmid các dòng khuẩn lạc mang 41 plasmid pMAL c5X –Pfu điện di trên gel agarose 1% Hình 3.8 Kết quả biểu hiện protein Pfu DNA pol trong tế bào E. coli BL21(DE3) 43 và E. coli BL21(DE3) pLysS điện di trên gel polyacrylamide 8% Hình 3.9 Kết quả tinh sạch protein MBP – Pfu bằng xử lý nhiệt điện di trên gel 45 polyacrylamide 8% Hình 3.10 Kết quả tinh sạch Pfu DNA pol tái tổ hợp điện di trên gel polycrylamide 46 Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp trên 47 gel agarose 1% Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật viii
MỞ ĐẦU Hiện nay PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm lên hàng triệu bản sao. Kỹ thuật này có ứng dụng rất nhiều trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: chẩn đoán bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống… Do tính chất lặp lại nhiều chu kỳ phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau, đặc biệt là sự biến tính DNA ở 95oC nên PCR đòi hỏi phải có các enzyme DNA polymerase bền nhiệt để đảm bảo việc xúc tác quá trình nhân bản DNA được thực hiện dễ dàng và đặc hiệu. Pfu DNA polymerase được tách từ vi khuẩn cổ siêu ưa nhiệt Pyrococcus furiosus sinh trưởng tối ưu ở 100°C. Pfu DNA polymerase cực kỳ bền nhiệt, vẫn giữ được hơn 95% hoạt độ ban đầu ở 95°C trong một giờ. Ngoài hoạt tính tổng hợp mạch Pfu DNA polymerase còn có hoạt tính đọc sửa 3’- 5’ exonuclease làm tăng độ chính xác của quá trình tổng hợp DNA. Hiện nay Pfu DNA polymerase thương mại có xác suất gắn sai một nucleotide khoảng 1,3.10-6. Độ chính xác trong quá trình tổng hợp DNA của Pfu DNA polymerase cao hơn nhiều so với Taq DNA polymerase và được xem là một trong số ít enzyme có tốc độ tổng hợp ít lỗi nhất trong tất cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được nghiên cứu. Chính vì vậy, Pfu DNA polymerase được sử dụng phổ biến để khuyếch đại các sản phẩm dùng cho mục đích nhân dòng, biểu hiện hay nghiên cứu các đột biến cũng như tổng hợp gen [25]. Pfu DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR nên việc thu nhận enzyme này từ vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết. Tuy vậy, việc thu nhận chế phẩm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là không đơn giản vì các vi khuẩn này thường yêu cầu môi trường sinh trưởng đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp. Trên thế giới đã có nhiều các công trình khoa học nghiên cứu và tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp nhưng vẫn gặp khó khăn do sử dụng các biện pháp tinh sạch chưa tối ưu như Heparin có giá thành đắt [22], cột P11 phosphocellulose và cột mono Q qui trình sử dụng phức tạp [12]…. Ở Việt Nam cho đến nay chỉ có công trình nghiên cứu sản xuất Pfu DNA pol từ E. coli của Giáo sư Phan Tuấn Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 1
Nghĩa được thực hiện vào năm 2005 với qui trình tinh sạch qua sắc ký ái lực với Ni2+ và Heparin Sepharose [1, 2]. Tuy nhiên Pfu DNA pol tạo ra lại ở dạng dung hợp với 20 a.a của vector nên có thể ảnh hưởng đến khả năng kéo dài DNA trong phản ứng PCR và hơn nữa qui tình tinh sạch bằng Heparin khá tốn kém mà lại không đặc hiệu. Trước những nhược điểm và khó khăn trong việc tinh sạch để thu được Pfu DNA pol tinh khiết, hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm cải thiện khả năng hòa tan của protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli, cũng như khả năng tinh sạch cao khi sử dụng hệ biểu hiện tạo hexahistidine-tagged maltose-binding protein qua việc sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL [5, 39]. PMAL là hệ vector biểu hiện cho phép protein tạo ra ở trạng thái tan do được dung hợp với maltose - binding proein (MBP). Ngoài khả năng tạo dạng tan của protein, MBP có ái lực với amylose nên có thể dễ dàng tinh sạch protein dung hợp qua viêc sử dụng cột amylose. Điểm cắt của Factor Xa ngay trước Pfu DNA pol giúp hoàn nguyên Pfu DNA pol. Bên cạnh đó việc sử dụng Histag để tinh sạch bằng Ni2+ ở đầu N lại không ảnh hưởng đến hoạt tính của Pfu DNA tái tổ hợp [15]. Với những ưu điểm trên, chúng tôi sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL kết hợp đuôi His để thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuấ t, tinh sa ̣ch Pfu DNA polymerase tái tổ hơ ̣p từ Escherichia coli’’ với mục tiêu sản xuất Pfu DNA polymerase chất lượng cao góp phần tích cực trong việc phục vụ các nghiên cứu về sinh học phân tử trong nước. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về DNA polymerase Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 2
DNA polymerase là nhóm enzyme xúc tác cho sự tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide từ các cơ chất là DNA sợi đơn làm khuôn, cặp mồi, các deoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) và trong môi trường có ion Mg2+. Mồi là một đoạn oligonucleotide dài từ 5 đến vài chục nucleotide có bản chất DNA hoặc RNA. Trong điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp, DNA polymerase kéo dài mồi theo hướng 5’→ 3’ bằng cách nối các nucleotide qua liên kết phosphodiester theo trình tự bổ sung với sợi làm khuôn tạo nên chuỗi DNA mạch kép. Ngoài hoạt tính kéo dài chuỗi oligonucleotide hay còn được gọi là hoạt tính DNA polymerase, một số DNA polymerase còn có hoạt tính của nuclease với vai trò sửa chữa hoặc giúp cho quá trình tổng hợp DNA được thực hiện chính xác. Trên thực tế để đảm bảo tính chuẩn xác cho quá trình sao chép DNA tế bào phải sử dụng không chỉ một loại DNA polymerase [8, 20, 25]. 1.1.1. DNA polymerase ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn Cho đến nay, rất nhiều loại DNA polymerase (DNA pol) khác nhau ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn đã được phát hiện và nghiên cứu kỹ về tính chất, cấu trúc cũng như chức năng. Ở sinh vật nhân sơ điển hình là E. coli có tới 5 DNA pol khác nhau và được ký hiệu là DNA pol I, II, III, IV và V. Ở sinh vật nhân chuẩn các DNA pol được phát hiện sớm nhất là DNA pol α, β, δ, ε và γ. Trong những năm gần đây, một loạt các DNA pol mới cũng được phát hiện ở sinh vật nhân chuẩn, đó là các DNA pol có khả năng sửa chữa các vị trí hỏng như DNA pol ξ, DNA pol η, DNA pol ι, DNA pol κ, Revl và một nhóm các DNA pol khác được gọi là DNA pol θ, DNA pol λ, DNA pol μ, DNA pol σ, DNA pol Ф thực hiện các chức năng khác. Việc phát hiện và nghiên cứu tính chất của các DNA pol khác nhau đã khẳng định rằng một loại DNA pol có thể không chỉ có một chức năng và quá trình tổng hợp DNA trong các cơ thể có thể cần đến không chỉ một DNA pol, mà tế bào có thể sử dụng đồng thời một số DNA pol khác nhau cùng thực hiện một chức năng [14]. Phần lớn các DNA pol ở dạng phức hệ gồm nhiều chuỗi polypeptide chứa các tiểu đơn vị chức năng khác nhau, trong đó không thể thiếu tiểu đơn vị polymer hoá. Các tiểu đơn vị khác chịu trách nhiệm cho hoạt tính xúc tác khác ví dụ họat tính đọc sửa 3 ’-5’ exonuclease, 5’-3’ exonuclease, hoạt tính tổng hợp các mồi RNA (primase) hay tương tác với yếu tố sao chép, phối hợp với kháng nguyên nhân tế bào đang phân hóa (proliferating Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 3
cell nuclear antigen - PCNA) với mục đích cuối cùng là làm cho quá trình tổng hợp DNA diễn ra nhanh chóng và chính xác [20]. Dựa vào tính tương đồng về trình tự và sự giống nhau về cấu trúc, các DNA pol được chia thành 7 họ khác nhau là: A, B, C, D, X, Y và RT [40]. Mặc dù các DNA pol ở các họ khác nhau có sự sai khác về mặt cấu trúc nhưng chúng cũng có một vài đặc điểm chung, chúng cuộn gấp thành hình dạng giống với bàn tay phải của người bao gồm 3 vùng khác biệt: “lòng bàn tay” (palm), “ngón tay cái” (thumb) và “các ngón tay” (fingers). Trên cơ sở trình tự của DNA pol α, người ta đã phát hiện có 6 trình tự (I-VI) mang tính bảo thủ cao trên các DNA pol ở cả sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus với trật tự trên chuỗi polypeptide là IV-II-VI-III-I-V, còn khoảng cách giữa các trình tự bảo thủ là khác nhau ở các loài khác nhau. Trình tự I nằm ở vùng “lòng bàn tay” gần với vùng “ngón tay cái” và chứa một trong các gốc axit aspartic bảo thủ tạo thành trung tâm xúc tác của tất cả các DNA pol họ B đã biết (với motif YGDTDS). Axit aspartic khác thuộc trình tự II có dạng DxxSLYPS nằm ở đầu của lá gấp β cũng thuộc vùng “lòng bàn tay”. Thuộc vùng này còn có SLYP-II mang tính bảo thủ cao, giữ vai trò quan trọng cho quá trình liên kết dNTP. Mặc dù các motif này là tuyệt đối bảo thủ ở các dưới họ DNA pol α và DNA pol δ nhưng ở DNA pol ε lại có sự khác nhau đáng kể, motif trình tự I của DNA pol ε là ELDTDG còn trình tự II là DxxAMYPN. Các gốc khác có vai trò trong quá trình liên kết dNTP nằm ở trình tự III và chúng cuộn gấp thành xoắn α nằm ở dưới vùng “các ngón tay”. Trình tự IV nằm ở đầu N thuộc vùng có hoạt tính 3’- 5’ exonuclease. Hai trình tự bảo thủ khác V và VI tương ứng nằm ở các dưới vùng “ngón tay cái” và “các ngón tay” [20, 24]. Mức độ bảo thủ cao về trình tự và cấu trúc của các vùng giữa các DNA pol sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus chứng tỏ các DNA pol này xuất phát từ một gen tổ tiên chung. Cấu trúc của chúng đã được tối ưu hoá qua quá trình tiến hoá để thích hợp với các chức năng chuyên hoá mà mỗi DNA pol thực hiện trong tế bào. Các vùng bảo thủ nhất chịu trách nhiệm cho các chức năng xúc tác cơ bản và cần thiết, trái lại các phần khác nhau giữa các DNA pol tiến hóa một cách độc lập để thực hiện các vai trò chuyên biệt [14,20]. 1.1.2. Tổng quan về DNA polymerase bền nhiệt Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 4
Việc ra đời và ứng dụng của kỹ thuật PCR để nhân bản gen in vitro đã tạo ra sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu đến các DNA pol bền nhiệt. Hàng loạt DNA pol bền nhiệt từ các vi khuẩn ưa nhiệt đã được phát hiện, nghiên cứu và sử dụng cho PCR cũng như các nghiên cứu khác của sinh học phân tử. Hầu hết các DNA pol này đều hoạt động tốt ở nhiệt độ cao và bền với nhiệt. Chúng có khả năng xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA ở nhiệt độ thậm chí trên 70°C, cần thiết cho sự nhân bản đặc hiệu các đoạn DNA, cũng như chịu được nhiệt độ thậm chí trên 90°C, thích hợp cho việc biến tính DNA (tách các chuỗi DNA thành các sợi đơn). Các loại DNA polymerase bền nhiệt  Vent DNA pol được phân lập đầu tiên từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt Thermococcus litoralis được tìm thấy ở đáy đại dương với nhiệt độ khoảng 98°C. Vent DNA pol là một DNA pol thuộc họ B, có trình tự giống với DNA pol α của người và DNA pol II của E. coli hơn là DNA polymerase I của E. coli [9]. Enzyme này là một protein có KLPT 90 - 93 kDa, enzyme kéo dài mồi với tốc độ 67 nucleotide/giây. Vent™ DNA polymerase bền nhiệt hơn so với Taq DNA polymerase và có khả năng kéo dài mồi để thu được các sản phẩm có độ dài 8-13 kb. Vent™ DNA pol có hoạt tính 3’-5’ exonuclease đảm bảo độ chính xác cao hơn 5-15 lần so với Taq DNA polymerase. Vent™ DNA polymerase cũng tạo ra trên 90% các đoạn DNA đầu bằng nhờ đó làm đơn giản hóa quá trình nhân dòng trực tiếp các sản phẩm PCR. Tma DNA polymerase là một protein có 893 a.a với KLPT 103 kDa, được tách ra từ khuẩn Gram âm Thermotoga maritima siêu ưa nhiệt, sống kỵ khí ở suối nước nóng, sinh trưởng ở nhiệt độ trên 90°C. Tma DNA polymerase giống DNA polymerase I ở E. coli ở chỗ có cả hoạt tính 3’- 5’ exonuclease và 5’- 3’exonuclease. Khi Tma DNA polymerase bị cắt đi một phần đầu thì tạo thành dạng enzyme thiếu hoạt tính 5’- 3’ exonuclease, giống như mảnh Klenow và Stoffel, protein này vẫn còn hoạt tính polymerase cũng như hoạt tính 3’- 5’ exonuclease. Các nghiên cứu bước đầu cho thấy độ chính xác trong PCR của enzyme này gần như 100% nhờ có hoạt tính đọc sửa [6].  Pfu DNA polymerase được tách từ vi khuẩn cổ siêu ưa nhiệt Pyrococcus furiosus (Pfu) chiếm ưu thế trong các chất lắng đọng của biển nóng ở Italia, sinh trưởng tối ưu ở Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 5
100°C. Pfu DNA pol thuộc họ B, là một protein có 775 a.a với KLPT khoảng 91 kDa. Trình tự a.a của Pfu DNA pol tương đồng với DNA pol α. DNA polymerase này cực kỳ bền nhiệt, vẫn giữ được hơn 95% hoạt độ ban đầu ở 95°C trong một giờ. Hoạt tính đọc sửa 3’- 5’ exonuclease của Pfu DNA pol làm tăng độ chính xác của quá trình tổng hợp DNA. Xác suất gắn sai một nucleotide của Pfu DNA pol khoảng 1,3.10-6. Độ chính xác trong quá trình tổng hợp DNA của Pfu DNA pol cao hơn 8 lần so với Taq DNA pol và được xem là enzyme có tốc độ tổng hợp ít lỗi nhất trong tất cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được nghiên cứu. Chính vì vậy, Pfu DNA pol được sử dụng phổ biến để khuyếch đại các sản phẩm dùng cho mục đích nhân dòng biểu hiện hay nghiên cứu các đột biến. Pfu DNA pol cũng có thể phối hợp cùng với Taq DNA pol để khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước lớn với độ chính xác lớn hơn nhiều so với khi sử dụng Taq DNA pol đơn lẻ [1,38]. 1.2. Tổng quan về Pfu DNA polymerase 1.2.1. Cấu trúc của Pfu DNA polymerase Pfu DNA pol là một phân tử có hình donut với tổng kích thước khoảng 50A˚× 80A˚×100 A˚. Cấu trúc của Pfu DNA pol cũng gần giống với cấu trúc kinh điển của các DNA pol họ B. Pfu pol là một chuỗi đơn polypeptide của 775 a.a được phân thành 5 vùng cấu trúc riêng biệt: vùng N - terminal (1 - 130, 327 - 368), vùng 3’- 5’ exonuclease (131 - 326), vùng lòng bàn tay (369 - 450 và 501 - 588), vùng các ngón tay (451 - 500) và vùng ngón tay cái (589 - 775) (Hình 1.1). Vùng các ngón tay và ngón tay cái được xoay ra ngoài 33˚ và 24˚, vì vậy cấu hình tổng thể của Pfu DNA pol tương tự như cấu trúc của KOD1 DNA polymerase [17]. Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 6
Hình1.1: Cấu trúc tổng thể của Pfu DNA polymerase [41] Trong đó có 5 vùng riêng biệt: màu xanh da trời - vùng exonuclease, màu tím - vùng N - terminal, màu cam - vùng lòng bàn tay, màu xanh lá cây - vùng ngón tay, màu đỏ - vùng ngón tay cái. Mặc dù cấu trúc của một vài DNA pol cổ đã được xác định nhưng những tìm hiểu chi tiết về độ trung thực và hoạt tính tổng hợp vẫn chưa được biết đến một cách đầy đủ. Gần đây nghiên cứu về cấu trúc và đột biến của Pfu DNA pol đã chỉ ra rằng cơ chế phối hợp giữa hoạt tính đọc sửa và hoạt tính tổng hợp liên quan đến sự tương tác giữa vùng loop của miền exonuclease và phần gờ tích điện dương của vùng ngón tay cái. Tuy nhiên sự phá vỡ liên kết giữa hai vùng này cho phép Pfu DNA pol có một cấu hình mở phù hợp với chức năng sửa chữa hơn là chức năng tổng hợp. Phần gờ của miền các ngón tay có vị trí tương đương với phần loop của exonuclease trong cấu trúc tinh thể của Pfu DNA pol. Nhưng trong cấu hình mở tự nhiên lại không có bất kỳ sự tương tác trực tiếp nào giữa các vùng này.  Cấu trúc của Pfu DNA pol khi liên kết với DNA Cấu hình đóng (khi liên kết với DNA) của Pfu DNA pol được mô hình hóa dựa trên cấu trúc của protein Gp43 có hoạt tính gắn DNA [7]. Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 7
Từ mô hình cấu tạo đóng, vòng loop của miền exonuclease và phần gờ của miền ngón tay cái nằm trong khoảng cách liên kết hydro. Trong mô hình cấu tạo đóng, motif - hairpin (phần dư 243-248) của miền exonuclease được cho là nằm gần và cho phép tiếp xúc trực tiếp với miền ngón tay cái [37]. Trình tự a.a của các motif β -hairpin cũng là duy nhất được tìm thấy trong DNA polymerase cổ (Hình 1.2). Các motif -hairpin nằm ở khe nối của vùng liên kết DNA khuôn và vùng chỉnh sửa đóng một vai trò quan trọng trong chuyển đổi đầu kết thúc 3’ của sợi mồi giữa vị trí trùng hợp và chỉnh sửa đang hoạt động để việc nhân bản được nhanh chóng và chính xác [17]. Hình 1.2: So sánh trình tự a.a và cấu trúc của motif β –hairpin (vùng exonulcease) và motif Y-GG/A (vùng ngón tay cái). Trong đó: KOD, Thermococcus kodakaraensis DNA polymerase; D. TOK, Desulfurococcus tok DNA polymerase; TGO, Thermococcusgorgonarious DNA polymerase; 9◦N-7, Thermococcus sp.DNA polymerase; PFU, Pyrococcusfuriosus DNA polymerase [41]. Hầu hết các loop của DNA polymerase trong từng vùng từ cổ khuẩn ưa nhiệt được rút ngắn so với các loài khác sống ở nhiệt độ thấp hơn hoặc trong môi trường ấm hơn (ví dụ sinh vật nhân chuẩn), nhưng phần gờ của miền ngón tay cái trong vi khuẩn cổ vẫn giữ lại một đoạn của vòng loop dài mặc dù gặp phải áp lực tiến hóa về khả năng chịu nhiệt như thế nào. Các gờ được bảo tồn của miền ngón tay cái cho phép tương tác chặt chẽ với các khu vực khác nhau của miền exonuclease, hỗ trợ vai trò điều phối quan trọng của việc đọc sửa và trùng hợp [41]. 1.2.2. Cơ chế hoạt động sửa sai của Pfu DNA polymerase Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 8
Mỗi DNA polymerase có thể được phân vào lớp có chức năng nhân bản hay sửa chữa, cũng như là có lỗi hay dễ bị lỗi dựa trên đặc điểm riêng của từng DNA pol. Các chức năng khác nhau của DNA pol trong sự tái bản DNA gồm việc polymerase gắn vào khuôn, vận chuyển nucleotide, đảm bảo độ chính xác và kéo dài chuỗi đã được đề xuất dựa vào cấu trúc bậc 2/ bậc 3 của DNA pol trong phức hợp với các khuôn DNA khác nhau [11]. Vùng các ngón tay và vùng ngón tay cái thay đổi vị trí phụ thuộc vào việc polymerase được liên kết với DNA khuôn hay không [30]. Những DNA pol không bị ràng buộc tạo thành những cấu trúc mở của vùng các ngón tay và vùng ngón tay cái, khi khuôn được gắn vào 2 vùng này di chuyển xuôi về phía lòng bàn tay để giữ sợi khuôn/ mồi chặt hơn. Sự tồn tại của những vùng bổ sung ví dụ như vùng exonuclease là thay đổi giữa các DNA pol. Trong trường hợp các DNA pol từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt bao gồm Pfu DNA pol, có 5 vùng gồm: vùng các ngón tay, vùng lòng bàn tay, vùng ngón tay cái, exonuclease và vùng N - terminal [17, 19]. Vùng exonuclease thay đổi cấu trúc của nó tùy thuộc vào trạng thái của việc DNA pol đang thực hiện tái bản hay sửa chữa DNA. Khi một nucleotide bắt cặp sai được liên kết vào sợi DNA tổng hợp mới, sợi khuôn/mồi gắn vào polymerase yếu hơn hoặc bị lệch với vị trí hoạt động của polymerase. Cuối cùng chuỗi xoắn kép tháo ra và nucleotide đã bắt cặp nhầm được di chuyển tới vị trí hoạt động của vùng exonuclease và được cắt bỏ (Hình 1.3) [36]. Hình 1.3: Cơ chế hoạt động và sửa sai của Pfu DNA polymerase [27, 41] Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 9
Tại DNA pol bị ràng buộc, cấu trúc đóng của vùng ngón tay cái làm cho đầu 3’ của sợi mồi không thể gắn vào vùng exonuclease do trở ngại về không gian chủ yếu gây ra bởi phần gờ của vùng ngón tay cái. Chỉ có cấu trúc mở của vùng ngón tay cái mới cho phép việc gắn sợi đơn DNA mồi (ssDNA) vào vị trí hoạt động của exonuclease. Vì vậy cấu trúc tổng thể của mỗi vùng là sự kết hợp chặt chẽ với các vùng khác để thực hiện quá trình sao chép DNA. Cấu trúc vòng (loop) của vùng exonuclease là vùng bảo tồn mà chỉ có trong DNA pol của vi khuẩn cổ ưa nhiệt [27]. Khi gây đột biến điểm vùng exonuclease làm cho vị trí của vùng này gần hơn với vùng ngón tay cái, sẽ ngăn cản sự liên kết đầu 3’ của ssDNA với vị trí hoạt động của vùng exonulcease, do vậy làm giảm hoạt tính 3’- 5’ exonuclease. Vì vậy cấu trúc mở tự nhiên của vùng ngón tay cái là cần thiết cho chức năng sửa chữa của polymerase [41]. 1.2.3. Một số tính chất của Pfu DNA polymerase  Độ chính xác và khả năng kéo dài chuỗi của Pfu DNA pol Pfu DNA polymerase được cho là hữu ích trong việc khuyếch đại gen với độ chính xác cao những mục tiêu DNA lên đến 2,5 kb [22]. Nghiên cứu tối ưu hóa bộ đệm với Pfu DNA pol để đánh giá xem sự chính xác của Pfu DNA pol có thể được tăng cường hơn nữa đã được nghiên cứu qua tỷ lệ gây lỗi trong PCR được so sánh khi thay đổi nồng độ MgSO4, dNTP và giá trị pH khác nhau. Kết quả cho thấy rằng, Pfu DNA pol tạo lỗi ít nhất khi phản ứng PCR được thực hiện với sự có mặt của 2 – 3 mM MgSO4, 100 – 300 µM mỗi loại dNTP và khoảng pH từ 8,5 – 9,1 ở 25ºC (tương ứng với pH 7,1 – 7,7 ở 72ºC). Những điều kiện trên cũng là tối ưu để thu được lượng sản phẩm PCR cao. Trong khi đó, với cùng điều kiện về nồng độ dNTP là 800 µM, sự có mặt của 1 mM MgSO4 lại tạo ra tỷ lệ lỗi cao hơn 3 lần so với 2 – 10 mM MgSO4 [21]. Pfu là DNA pol có độ trung thực cao thường được sử dụng cho PCR và có tỷ lệ lỗi trung bình là 1,3.10-6 đột biến/bp/phản ứng, chính xác hơn Taq DNA pol 8 lần [21]. Độ trung thực cao này là do Pfu pol có hoạt tính đọc sửa 3’–5’ exonuclease. Khi loại bỏ hoạt tính 3’–5’ exnonuclease (exo – Pfu), trong điều kiện PCR có mặt của đệm Pfu PCR (2mM MgSO4, 200 µM mỗi loại dNTP, pH 8,8) thì exo – Pfu có tỷ lệ lỗi là 4,7.10-5 cao hơn Pfu Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 10
DNA pol 40 lần trong cùng điều kiện phản ứng. Cũng trong điều kiện phản ứng trên nhưng khi thay đổi pH của đệm từ 8,8 xuống 8,0 thì tỷ lệ lỗi của exo – Pfu DNA pol chỉ cao hơn Pfu DNA pol 7 lần. Những kết quả trên cho thấy rằng, khi có hoạt tính 3’- 5’ exonuclease và thực hiện PCR trong những điều kiện thích hợp Pfu DNA pol là một trong số ít các enzyme DNA pol bền nhiệt cho tỷ lệ lỗi thấp nhất (Bảng 1.1). Bảng 1.1: So sánh độ chính xác của các DNA polymerase bền nhiệt trong PCR [21,38] Các DNA Tỷ lệ sao chép lỗi Tỷ lệ sản phẩm polymerase bền nhiệt (×10-6) PCR bị đột biến (%) UlTma 55 ± 2-e 110 Taq 8 ± 3,9 16 Vent 2,8 ± 0,9 5,6 Deep Vent 2,7 ± 0,2 5,4 Pfu 1,3 ± 0,2 2,6 Khả năng nhân bản các đoạn DNA có kích thước khác nhau là một điểm đáng lưu ý đối với các DNA polymerase. Mặc dù Taq DNA pol là enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong PCR nhưng lại bị hạn chế bởi thiếu hoạt tính đọc sửa. Pfu DNA pol có hoạt tính đọc sửa 3’–5’ exonuclease nhưng lại có hiệu quả thấp trong việc khuếch đại DNA do khả năng kéo dài thấp. Khi sử dụng Pfu DNA pol lẻ để nhân đoạn gen 5 kb không cho kết quả dương tính. Taq DNA pol có khả năng tổng hợp đoạn 5 kb nhưng lại không tổng hợp được đoạn 7,4 kb. Khi kết hợp hai enzyme trên với tỷ lệ 4 Taq: 1 Pfu cho phép tổng hợp được cả 2 đoạn 5 và 7,4 kb [2]. Hiện tượng này liên quan đến hoạt tính 3’- 5’ exonuclease của Pfu DNA pol, khi có mặt cùng với Taq DNA pol trong phản ứng th Pfu DNA pol đã giúp loại bỏ những nucleotide bị đưa nhầm vào và làm cho quá trình kéo dài chuỗi được tiếp tục, nhờ đó nâng cao khả năng kéo dài chuỗi. Tuy nhiên khi kết hợp Taq DNA pol và Pfu DNA pol theo tỷ lệ 16 Taq: 1 Pfu để khuếch đại đoạn 30 kb, hỗn hợp 2 enzyme này cho tỷ lệ lỗi 5,6.10-6 (sử dụng Taq PCR buffer). Tỷ lệ lỗi trên cao hơn tỷ lệ của Pfu pol 6 lần nhưng lại thấp hơn tỷ lệ lỗi của Taq DNA pol đơn lẻ 30% trong cùng một điều kiện PCR [21]. Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 11
 Ảnh hưởng của một số chất khác nhau lên hoạt động tổng hợp DNA của Pfu DNA pol Sự có mặt của các chất có trong phản ứng PCR có ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt tính tổng hợp của Pfu DNA pol. Nồng độ dNTP thường được sử dụng trong phản ứng PCR là 20 – 200 μM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu. Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Tuy nhiên Pfu DNA pol hoạt động tốt khi có mặt của 100 – 250 µM mỗi loại dNTP [26]. Nồng độ MgCl2 là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Pfu DNA pol, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Mg2+ là Co – factor của Pfu DNA pol nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Pfu DNA pol sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài, hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định sợi đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, nồng độ Mg2+ cao có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra nhiều hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biệt thấp. Pfu DNA pol hoạt động tối ưu trong môi trường có 2 mM Mg2+ [33, 44]. NaN3 từ lâu được biết đến là một chất kháng khuẩn tốt với nồng độ hiệu quả là 0,02% (w/v) tức 3 mM, trong khi đó với phản ứng PCR có 0,1 – 3 mM NaN3 không làm ức chế hoạt động của Pfu DNA pol. Điều này cho phép bổ sung NaN3 ở nồng độ 3 mM vào chế phẩm Pfu DNA pol để chống nhiễm khuẩn khi cần thiết mà không làm ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme [1,3]. Tương tự như vậy thì NaF ở nồng độ 1-50 mM, monocaprin ở nồng độ 2-50 mM, heptyl paraben ở nồng độ 10- 80 mM đều không ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp DNA của Pfu DNA pol. Ngược lại, kẽm sunphat (ZnSO4) ở nồng độ 0,5 mM và EDTA ở nồng độ 2 mM trở lên đã ức chế mạnh hoạt động của Pfu DNA pol. Tác dụng ức chế của EDTA liên quan đến hoạt tính tạo phức của EDTA với ion Mg2+ vốn rất cần cho hoạt động tổng hợp DNAcủa Pfu DNA pol cũng như các DNA pol khác [1]. Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 12