Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym Amylase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH

Nguyeãn Thò Thanh Bình

NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM AMYLASE CUÛA

MOÄT SOÁ CHUÛNG NAÁM SÔÏI PHAÂN LAÄP TÖØ RÖØNG

NGAÄP MAËN CAÀN GIÔØ

Chuyeân ngaønh: Vi sinh vaät hoïc

Maõ soá: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC:

TS. TRAÀN THANH THUÛY

Thaønh phoá Hoà Chí Minh, Thaùng 8 - 2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến TS. Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình học tập và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành

luận văn này.

Tôi xin ghi nhớ công ơn tất cả Quý Thầy Cô trong Khoa Sinh, và trong phòng thí nghiệm Vi

sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn

thành công việc nghiên cứu thực hiện luận văn.

Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khóa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học,

Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành

thực nghiệm.

Cuối cùng tôi xin gởi lời biết ơn đến Ba Má, hai em và bạn bè đã luôn yêu thương và ủng hộ

tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2010

NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu, kết quả trong luận văn

này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Bình

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CMC Carboxymethy cellulose

dd Dung dịch

DNS 3, 5 – dinitrosalicylic acid

Hoạt độ amylase Hđamylase

HST Hệ sinh thái

KL Khuẩn lạc

KS Kháng sinh

MT Môi trường

NS Nấm sợi

NXB Nhà xuất bản

OD Optical density (mật độ quang)

PTN Phòng thí nghiệm

RNM Rừng ngập mặn

SV Sinh vật

VK Vi khuẩn

VSV Vi sinh vật

MỞ ĐẦU

Amylase là một loại enzym thủy phân tinh bột quan trọng nhất trong công nghệ sinh học. Nó

có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside, α-1,6 glucoside của amylose và amilopectin, làm

tăng tốc độ đường hóa tinh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chóng, rút ngắn thời

gian hình thành sản phẩm.

Amylase thu nhận từ VSV nói chung, từ NS nói riêng có nhiều ưu điểm nổi bật hơn các loại

amylase từ thực vật và động vật như: hoạt tính enzym cao hơn, khả năng chịu nhiệt cao, thời gian

thu enzym nhanh, giá thành rẻ, có thể sản xuất ở quy mô công nghiệp với nguồn nguyên liệu đơn

giản và rẻ tiền. Với những ưu thế nổi trội, NS trở thành nguồn nguyên liệu dồi dào, đầy hứa hẹn cho

ngành công nghiệp sản xuất enzym. Do đó, trong vòng 50 năm trở lại đây, các chế phẩm enzym từ

NS đã dần thay thế enzym từ động vật. Các chủng NS sinh amylase cao như: Aspergillus oryzae,

Aspergillus niger, Rhizopus,...

Với phạm vi ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực phẩm, dược

phẩm, công nghệ lên men, công nghiệp dệt nên khối lượng chế phẩm amylase được sản xuất hàng

năm trên thế giới lên tới hàng chục vạn tấn và ngày một gia tăng. Chính vì vậy, việc tìm kiếm các

chủng NS sinh amylase cao luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước.

Trong quá trình tìm kiếm ấy, con người luôn quan tâm đến NS sống trong các hệ sinh thái đặc biệt.

Nằm giữa đất liền và biển cả, RNM Cần Giờ có môi trường sống vốn khắc nghiệt, mang tính

cạnh tranh cao, làm tăng khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học giúp SV thích nghi tốt với

điều kiện sống. Nơi đây lưu trữ, bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá của vùng ven

biển nhiệt đới từ thực vật, động vật và cả VSV.

Hơn nữa, Việt Nam là nước có nguồn tinh bột và phụ phẩm nông nghiệp khá dồi dào là điều

kiện thuận lợi để ứng dụng amylase thu nhiều sản phẩm.

Có thể nói cho đến nay, sự hiểu biết về khu hệ NS ở RNM và vai trò của chúng trong hệ sinh

thái này còn quá ít và chưa đầy đủ. Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn enzym từ các NS,

cũng như mong muốn thu nhận được các chủng NS mang đặc tính quý, chúng tôi tiến hành đề tài:

ngập mặn Cần Giờ”.

“Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng NS phân lập từ rừng

 Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn và khảo sát được một số chủng NS sinh α-amylase và glucoamylase cao từ RNM

Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh

 Nhiệm vụ của đề tài

- Phân lập các chủng NS thu nhận từ RNM Cần Giờ.

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase các chủng NS phân lập được

- Tuyển chọn 2 chủng sinh amylase cao tiếp tục khảo sát

- Phân loại đến chi các chủng NS đã tuyển chọn

- Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn

- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thu nhận amylase

- Thu nhận chế phẩm amylase thô và so sánh với enzym thương mại trên thị trường.

- Khảo sát các đặc tính sinh học khác

 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng là các chủng NS phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây, …ở RNM Cần Giờ

- Phạm vi nghiên cứu gồm 5 xã: Bình Khánh, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Long Hòa, Lý

Nhơn thuộc RNM huyện Cần Giờ.

 Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài

- Thời gian: Từ tháng 8/2009 – 7/ 2010

- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh - Sinh hóa, Khoa Sinh học,

Trường Đại học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. KHÁI QUÁT VỀ RNM CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH

1.1.1. Đặc điểm các nhân tố sinh thái cơ bản

RNM Cần Giờ là một hệ sinh thái ngập mặn có vai trò và vị trí đặc biệt quan trọng đối với

MT và cộng đồng dân cư địa phương trong vùng. Là rừng mới tái sinh nhưng RNM Cần Giờ là Khu

Dự trữ Sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam với hệ thực vật và động vật rất phong phú mang tính đa

dạng sinh học cao [34], [39].

Hình 1.1. Rừng ngập mặn Cần Giờ

Về vị trí địa lý khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu hệ thống sông

Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp. Hồ Chí Minh. Tọa độ: 10°22’ – 10°40’ độ vĩ

Bắc và 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đông. Cách trung tâm Tp. Hồ Chí Minh khoảng 70km, phía Bắc

Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An,

phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35 km, từ Đông

sang Tây là 30 km [39].

Ở RNM Cần Giờ, nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 – 70C. Khí hậu nóng ẩm và chịu sự chi phối của quy luật gió mùa xích đạo. Nhiệt độ không khí có ảnh

hưởng khá lớn đến sinh trưởng, phát triển của sinh vật RNM. Chapman (1977) cho rằng RNM chỉ phát triển khi biên độ nhiệt ở tháng lạnh nhất cao hơn 200C, và biên độ dao động theo mùa không quá 100C [36], [34], [39].

Trong các nhân tố khí hậu ở RNM thì lượng mưa là nhân tố quan trọng. Ở đây, mùa mưa từ

tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 1 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400 mm

hàng năm. Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu vực Tp.Hồ Chí Minh: mùa mưa là 70 – 83%, mùa

khô là 74 – 77%; ẩm nhất vào tháng 9, khô nhất vào tháng 4. Lượng nước bốc hơi bình quân 4mm/

ngày và 1204mm/tháng [34].

Ngoài ra, gió cũng là nhân tố tác động tới sự phân bố của thực vật RNM qua sự ảnh hưởng

tới độ thoát hơi nước và tác động tới sự phát tán bào tử VSV [36].

Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hoá, quá trình nhiễm

mặn đồng thời nó được phát triển trên một đầm mặn mới do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai

mang đến lắng đọng tạo thành nền bùn ngập mặn.

Độ mặn của nước ở Cần Giờ phụ thuộc rất nhiều yếu tố như gió mùa, thuỷ triều, mưa, nước

dâng và đặc biệt chịu ảnh hưởng rõ rệt từ nguồn nước ngọt ở thượng nguồn chảy xuống (do hoạt

động của hồ Trị An, Dầu Tiếng…) đã làm thay đổi qui luật hoạt động nhiễm mặn ở Cần Giờ. Độ

mặn nơi đây dao động 1,8 – 3%.

Độ mặn là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, tỉ lệ sống của các loài cây ngập

mặn và phân bố của RNM. Hầu hết cây ngập mặn sinh trưởng tốt ở nước có độ mặn từ 25% đến

50% độ mặn nước biển. Nhiều ý kiến cho rằng, muối là nhân tố quan trọng, tác động thông qua quá

trình chọn lọc tự nhiên thích nghi, tạo điều kiện để cây ngập mặn tồn tại, phát triển [36].

RNM Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển Đông. Mỗi tháng

có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch. Mực

nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [39]. Chế

độ bán nhật triều với biên độ triều cao là một trong những nhân tố thuận lợi cho RNM sinh trưởng

so với vùng có nhật triều. Các dòng hải lưu ở đây là nhân tố chính giúp phát tán quả, hạt, trụ mầm

và SV dọc theo các vùng ven biển.

1.1.2. Đặc điểm của các khu hệ SV tại RNM Cần Giờ

RNM Cần Giờ có hệ SV vô cùng đa dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài đem lại

những giá trị kinh tế cao.

Về thực vật: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 150 loài thực vật, các

loài chủ yếu như Bần trắng, Mấm trắng, các quần hợp Đước đôi - Bần trắng cùng Xu, Ổi, Trang,

Đưng… Các loại cây nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm – ôrô, dừa lá, ráng… Thảm cỏ

biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp [66].

Động vật: bao gồm động vật thủy sinh không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên

130 loài, 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách

đỏ Việt Nam như: tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nước (Varanus salvator), trăn đất (Python molurus),

trăn gấm (Python reticulatus) … Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ [66].

Thảm động thực vật nơi này trở thành nguồn cung cấp thức ăn và nơi trú ngụ cho rất nhiều

loài thủy sinh, các động vật có xương sống và hệ VSV.

Vi sinh vật rất đa dạng gồm có: vi khuẩn, nấm, tảo

 Vi khuẩn

VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV

phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong hệ sinh thái này. Số lượng VK

trong rừng ngập mặn chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng

nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát. Nhiều

loài sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt

mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển [36].

 Nấm

Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng, phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích

thước lớn. Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh

xác lá thực vật (Fell và cộng sự, 1975). Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM:

trên tán cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai

MT trở lên [36].

Người ta tìm thấy trên lá cây ngập mặn có các loài nấm ký sinh và hoại sinh như: Ascomycetes,

Bacidomycetes và Deuteromycetes. Người ta đã tìm thấy 6 chi nấm có mặt trên lá cây Đước đỏ (R.

mangle) khi còn trên cây: Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium và

Aureobacidium [36].

Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho các cây

chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium và Cercospora. Hầu hết các loài nấm trên đất liền

đều có trên lá cây ngập mặn, còn các loài nấm biển thì có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước

mặn. Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm phân huỷ phát triển. Các

mẫu gỗ để ngâm trong nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao [36]

Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là sinh vật phân huỷ đầu tiên nhờ khả năng phân giải

cellulose, lignin. Fell và Masters (1973) đã nghiên cứu toàn bộ quá trình phân hủy của lá cây ngập

mặn đồng thời phân lập được 66 chi nấm, đại diện là các chi Phycomycetes, Thraustochytrium,

Aspergillus, Penicillium, Tricoderma, Fusarium… Đa số các loại nấm được phân lập trên lá, gỗ và

cây con thường là nấm hoại sinh góp phần phân huỷ xác thực vật. Chúng còn góp phần phân huỷ cỏ

biển, bùn và đầm lầy mặn. Những loài này chịu được điều kiện mặn của RNM [36].

 Tảo

Tảo mọc ở RNM thường làm thành lớp phủ màu hồng, nâu hoặc lục nhạt phát

triển trên các MT: bề mặt bùn, bề mặt thân cây, rễ, những cành và tán phía trên. Trong đó trên bề

mặt bùn gồm cả tảo đơn bào, tảo đa bào mà chủ yếu là tảo xanh lục. Người ta liệt kê có khoảng 41

loài tảo silic trên mặt bùn quần xã RNM; Chúng không hình thành trên các vùng rõ ràng mà tùy

thuộc vào độ ngập triều [36].

Tảo bùn có tầm quan trọng trong kinh tế đất vì nó làm tăng hàm lượng hữu cơ trong đất nhờ

quá trình quang hợp. Tảo còn tạo ra độ thoáng khí giữa các hạt đất, tiết ra các chất nhầy hình thành

phức hệ keo, tảo xanh lục dị dưỡng làm tăng hàm lượng đạm cho đất nhờ khả năng cố định đạm

[36].

Các SV trong RNM làm nên sự đa dạng sinh học của các quần xã RNM, chúng là một mắt

xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật

chất ở RNM Cần Giờ.

1.1.3. Vai trò của RNM đối với hệ sinh thái

RNM có liên quan mật thiết với các đầm lầy mặn, các bãi bùn, bãi cỏ ven biển hoặc các quần

xã cửa sông khác. Dòng nước ngọt đổ từ thượng nguồn ra biển, dòng nước triều từ biển lên xuống

các vùng cửa sông đều đi qua RNM. Các dòng nước này vận chuyển vật chất, SV từ quần xã này tới

quần xã khác và như vậy hệ sinh thái RNM chính là nơi giao lưu của các quần xã, tạo nên sự phong

phú về thành phần SV cho nơi này [36].

Hệ thực vật RNM bao gồm các loài thực vật (Sú, Vẹt, Mắm, Đước, Bần,…) sống trong vùng

nước mặn, hệ rễ của cây góp phần vào việc làm giảm tốc độ dòng chảy của thủy triều, tạo điều kiện

lắng đọng bùn, các vật chất lơ lửng, chúng góp phần bảo vệ vùng ven bờ; cung cấp các giá trị về

lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc,…Bên cạnh đó, hệ thực vật còn đóng vai trò quan trọng

trong việc điều hòa khí hậu, cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển [34].

RNM còn là nơi kiếm ăn, sinh sản và cư trú của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như

tôm, cua, cá,... Mới đây, Bell và cộng sự (1984) khẳng định RNM là vườn ươm quan trọng cho các

loài cá sống ở cửa sông. Khi so sánh thành phần các loài cá và tôm trong một vùng có RNM vào các

mùa vụ trong năm đều thấy lượng con non của các loài này đều cao hơn hẳn các vùng đất, cát ở

ngoài đầm. Từ đây cho thấy RNM là nơi nuôi dưỡng chính cho con non của nhiều loài hải sản [36]

Các loài động thực vật, VSV sống trong MT tự nhiên của RNM Cần Giờ liên kết với nhau

thông qua các quá trình trao đổi chất và đồng hóa năng lượng nhằm khép kín chu trình dinh dưỡng

của hệ sinh thái này. Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật

chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng đều chịu sự ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngoài

như: thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa. RNM phát triển tốt nhất ở nước có nồng độ muối 15 - 25‰

[36]

Tuy nhiên, hiện nay RNM đang có những thay đổi đáng kể trước áp lực của việc đánh bắt cá,

tôm,… khai thác gỗ, củi, nhiên liệu, nuôi trồng thủy sản, du lịch… Sự tác động này nếu quản lý

không tốt thì các vùng đất RNM sẽ bị suy thoái và không thể tồn tại lâu bền.

1.2. TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI

1.2.1. Đặc điểm sinh học của NS

NS là VSV có nhân chuẩn. Hệ nấm có cấu tạo khuẩn ty dạng sợi, sợi nấm (hypha) là những

ống dài phân nhánh hay không phân nhánh, có hay không có vách ngăn ngang (septum), đường kính

sợi từ 3-3,5 µm. Các sợi nấm phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo

Hình1.2. Cấu trúc sợi nấm

thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể [58].

Cấu trúc sợi nấm gồm có thành tế bào, màng, tế bào chất và nhân. Thành tế bào NS chứa

kitin-cellulose hoặc kitin-glucan [58].

Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm.

Khuẩn lạc NS thường có dạng hình tròn hoặc gần tròn.

Bề mặt KL có thể mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những

vết khứa xuyên tâm hoặc lồ lõm không đều. Mép KL trơn, răng cưa [60]

Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm.

Các đặc điểm hình thái khác có tính đặc trưng cho loài như bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt

tiết, sắc tố hòa tan [58],...

Phương thức dinh dưỡng của NS là hấp phụ qua màng, không có cơ quan tiêu hóa, không có

khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và

động thực vật.

Hình1.3: Hình thái khuẩn ty NS

Hình1.4 Hình thái khuẩn lạc NS

Hình1.5: Hình thái một số dạng bào tử của NS

NS sinh sản chủ yếu bằng bào từ, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính.

Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất. Trong

sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [59].

NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt

tính sinh học như: enzym, các chất KS, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích

kinh tế cao. Bên cạnh đó, từ NS còn có các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro ứng

dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất [1], [57], [59].

 Khả năng sinh các enzym ngoại bào

NS đã trở thành nguồn VSV chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzym. Hiện nay, từ NS người

ta đã sản xuất được trên 80 loại enzym khác nhau, trong đó có 10 enzym được ứng dụng rộng rãi

trong kỹ thuật. Một số enzym ngoại bào từ NS được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến

như cellulase, protease, amylase, pectinase và chitinase [21], [26], [29].

 Cellulase là enzym xúc tác phân giải các hợp chất lingo –cellulose thành glucose.

Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemi-

cellulose và lignin (15-30%). Các chủng NS Trichoderma, Penicillium, Aspergillus…có khả năng

sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất thải hữu cơ,

các xác bã thực vật chứa cellulose ở RNM [21].

 Protease là enzym thủy phân các phân tử protein tạo thành các chuỗi polypeptide

ngắn. NS có khả năng phân giải mạnh protein chứa trong các xác bã động vật ở RNM thường gặp

thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,…Protease còn được sử dụng nhiều trong công nghiệp bột

giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp

thực phẩm, xử lý chất thải...[29].

 Amylase là enzym xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực

vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và glucoamylase)

sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucpside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm

cuối cùng là glucose. NS có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là những tác nhân không thể

thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor… Amylase được ứng

dụng rộng rãi trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế

biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt....[21].

 Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên kết với nhau bởi

mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua, ốc rất nhiều. Nhiều

loài NS thuộc chi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… có khả năng sinh chitinase, giúp tăng

cường khả năng tiêu diệt các loài nấm gây bệnh và chống các loài côn trùng có vỏ kitin. [21].

Các chủng NS thuộc chi Acremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả năng sinh các

enzym phân giải dầu góp phần xử lý ô nhiễm dầu giúp bảo vệ MT tự nhiên và SV sống ở RNM

Cần Giờ [35].

 Khả năng sinh KS của NS

KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện trượng một VSV với sản phẩm

trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác.

Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỷ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn. Chất KS

được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí

chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu

thuật, chúng được dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương [11].

Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những

phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS. Những vấn đề về chất KS được

sinh ra từ VSV đang là mối quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc

sống ngày nay [11].

Ngoài ra, trước nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều trong công nghệ thực phẩm,

công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học. Axit hữu cơ sản xuất từ NS

được nghiên cứu nhiều hơn: Năm 2004, Võ Thị Hạnh nghiên cứu sản xuất axit citric bằng NS

Aspergillus niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì; các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp chất kích

thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum [29].

Bên cạnh những lợi ích trên, nhiều loài NS là nguyên nhân gây hư hỏng hoặc giảm chất

lượng của thực phẩm, dụng cụ quang học,... Một số NS tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung

thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số NS gây bệnh cho người và động

vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm chân tay…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ

bông ở lúa…[6], [7].

1.2.2. Vị trí phân loại

Cho đến nay, người ta ước tính trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng

mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài.

Riêng các loài nấm thuộc lớp Nấm bất toàn ở nước ta hiện chỉ mới phát hiện được 338 loài thuộc

306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Việc phân loại NS chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình

thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản [6].

Về phân loại nấm, hiện nay có hai hệ thống phân loại nấm được sử dụng phổ biến hơn cả là:

Hệ thống phân loại hình thái học và hệ thống phân loại phát sinh, với nhiều khóa phân loại được sử

dụng như: Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Barnett và cộng sự (1972), Ainsworth G.C và cộng

sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995). Trong luận

văn này, chúng tôi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại của

Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Nguyễn Lân Dũng (2006) [57].

Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của sinh học phân tử đã đem lại phương pháp mới

cho việc nghiên cứu phân loại học. Người ta sử dụng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen

(PCR-Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả phân loại nhanh và chính xác [40].

1.2.3. Tình hình nghiên cứu khu hệ NS ở RNM nói chung và NS sinh amylase ở RNM nói

riêng.

Hiện nay có khoảng 800 – 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995 ;

Jones, 1995), trong khi đó một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu

biết về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu hệ sinh thái này còn quá ít và chưa đầy đủ. Có

thể nói đây là một mảng rỗng của ngành VSV học (Agate A.D., Subraramnian, C. V and Anuci, V,

1998) [43]. Sự nghiên cứu về nấm RNM chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950. Những

năm đầu, việc nghiên cứu xác định tính đa dạng của nấm trong RNM còn rất lẻ tẻ, nhưng sau này

các nhà khoa học đã thành lập hội nghiên cứu nấm toàn thế giới trong đó có nấm biển ở RNM.

Nhiều nước trên thế giới đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hóa các loài

nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ. Ví dụ : Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông 170

loài, Đài Loan 7 loài, Singapore 156 loài, Nhật 26 loài, Úc 67 loài, Mexico 94 loài, Đức 4 loài, Thái

Lan 83 loài,…[49]

Năm 1979, Kohlmeyer phân lập 42 loài vi nấm RNM thuộc các ngành phụ Ascomycotina,

Deuteromycotina và Basidiomycotina

Năm 1987, Hype và cộng sự công bố phát hiện được 89 loài nấm từ cây Rhizophora

mucronata lanak ở RNM Ấn Độ [48].

Năm 1988, Agate A. D., Subramania C. V và Vanuci M., đã nêu ra 8 lĩnh vực nghiên cứu cấp

bách của VSV ở RNM cần các nhà khoa học giải quyết, trong

đó có sự phân loại, hệ thống hóa cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới [43].

Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới. Trong đó bao gồm 87 loài

thuộc Ascomycetes, 31 loài thuộc Deuteromycetes và 2 loài thuộc Basidiomycetes.

Năm 1994, Newell S.Y phân lập được các loài nấm nhày (Oomycetes) ưa mặn từ lá cây mục

ở RNM, có khả năng phân hủy xác động vật, thực vật ở đó.

Năm 1995, Hyde và Lee ; Kohlmeyer et al., đưa ra nhận định các nấm RNM đóng vai trò

quan trọng đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM.

Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị Hằng và cộng sự về

nấm sợi RNM Giao Thủy, Nam Định. Năm 2001, tác giả này tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh

enzym ngoại bào của 144 chủng phân lập từ RNM Giao Thủy. Năm 2002, Mai Thị Hằng nghiên

cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi RNM ở hai tỉnh Nam

Định, Thái Bình [52].

Với rừng RNM, những phát hiện khoa học đầy thú vị chưa dừng lại ở đó. Các nghiên cứu

VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được: ở

các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ

khác nhau. Đó là các loài NS thuộc một số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium,

Paecilomyces, Canninghamela có khả năng phân giải dầu DO rất mạnh [69].

Theo nhóm nghiên cứu của Phan Nguyên Hồng và Nguyễn Hoàng Trí, những chất thải rắn

trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với các hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông

ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ sinh vật ở đây, làm

trong sạch nước biển. Chính vì thế “người ta đã ví RNM là quả thận khổng lồ lọc các chất thải cho

MT vùng ven biển” [69].

Năm 2004, Phan Thị Phương Hoa nghiên cứu phân loại 67 chủng NS thuộc chi Aspergillus

phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình. Đây là một nghiên cứu được đánh giá cao trong số các

nghiên cứu về NS ở RNM Việt Nam [8].

Đến năm 2007 mới có tác giả Khưu Phương Yến Anh“Nghiên cứu khả năng

sinh enzym cellulase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ” [1]

Năm 2009, có tác giả Nguyễn Thị Bích Viên “Khảo sát một số đặc tính sinh học của một số

chủng NS thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân lập được từ RNM Cần Giờ” [41].

Bên cạnh việc tìm kiếm những chủng NS mới ở RNM, người ta còn nghiên cứu các đặc tính

sinh học của chủng này. Ví dụ, để thu nhận amylase thì dùng các chủng Aspergillus, Rhizopus. Một

số loài của Neurospora, Mucor tổng hợp rất mạnh cả hai loại α-amylase và glucoamylse (Rodzevits,

Butova 1965, Fennkxova. Rư-zakova 1966 ; Phillips, Caldwell 1951. Corman Lanalu-ke, 1948)

[17].

Một số công trình nghiên cứu của Azarova (1981) ; Jerebtxov, Pankratove (1977) cho thấy

glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối tới

glucose [17].

Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B.N. Okolo đã tiến hành tinh sạch và xác định một số tính

chất của amylase phân giải tinh bột sống mới từ A. cacbonarius

Năm 2008, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công trình “Nghiên cứu

về α-amylase ngoại bào của chi Aspergillus” của Baldwin, Toby M, …cho thấy sự liên quan giữa

việc sinh α- amylase và glucoamylase của chi nấm này [15].

Tại Việt Nam, năm 1974, tác giả D. V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ A.

niger. Năm 1977, tác giả L. V. Chứ, Đ. T. T Thu nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase với

đối tượng A. awamorii .

Đến năm 1984, N. B Ngà và N. L Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài A.

oryzae, A. niger, A. awamorii có hoạt tính α-amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột

sắn.

Năm 1993, có công trình : “Nghiên cứu chọn lọc chủng Asp. niger TH3 – 19K của Nhật

Bản có hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” của tác giả D. V Hợp và cộng

sự.

Năm 1998, Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy có công trình “Thu

nhận amlyse từ nấm mốc Aspergillus sp” [2].

Ở Việt Nam, viện Sinh học Nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII,

BioIII… có dạng bột, chứa các enzym protease, cellulase, amylase và các VSV dùng bổ sung vào

thức ăn cho cá, heo, bò. Chế phẩm có tác dụng phòng chống chứng rối loại tiêu hóa, kích thích tăng

trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao…[57].

Năm 2002, Mai Thị Hằng và cộng sự cũng có những khảo sát về khả năng sinh enzym

amylase của NS phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình [10]

Năm 2009 tác giả Nguyễn Thị Lan Hương “Nghiên cứu về khả năng sinh enzym amylase của

một số chủng NS ở RNM Cần Giờ” [15].

Có thể nói những nghiên cứu về NS sinh amylase trên đất liền khá phong phú và đa dạng, còn

những nghiên cứu về amylase của NS từ RNM Cần Giờ vẫn còn khá ít ỏi, chưa tương xứng với tiềm

năng.

1.3. TINH BỘT VÀ HỆ ENZYM AMYLASE

1.3.1. Tinh bột

Tinh bột không phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và

amilopectin [5].

 Thành phần cấu trúc của amylose.

Amilose là loại mạch thẳng, chuỗi dài từ 500-2000 đơn vị glucozơ, liên kết nhau bởi liên kết

Hình1.6 – Phân tử Amilose

α−1,4 glicozit.

 Thành phần cấu trúc của amilopectin

Amilopectin là polyme có mạch nhánh, ngoài mạch chính có liên kết α-1,4 glucozit còn có

nhánh liên kết với mạch chính bằng liên kết α-1,6 glucozit.

Cấu tạo của amilopectin còn lớn và dị thể hơn amilose nhiều. Trong tinh bột tỉ lệ

amiloza/amilopectin khoảng ¼. Tỉ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ và cách chăm

sóc.

Hình1.7 – Phân tử amilopectin

Ở nước ta, nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú. Nhưng để phù

hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần

phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm [5], [23], [28].

1.3.2. Hệ enzym amylase

Amylase là tên gọi của một nhóm enzym có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside

trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và

glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin [15], [31],

[44].

Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là:

1.3.2.1. α – amylase hay α-1,4-glucohydrolase

Là enzym phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amilose và amilopectin một cách

ngẫu nhiên không theo trật tự nào cả. Việc tác dụng α – amylase lên hồ tinh bột làm giảm nhanh khả

năng bắt màu của tinh bột với iod và độ nhớt của dịch hồ, amilose tạo thành maltose và maltotriose.

Nếu trong thời gian dài thì sản phẩm thủy phân của amilose chứa 13% glucose và 87% maltose. Còn

amilopectin sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose [5], [21].

α – amylase thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành maltose và dextrin phân tử thấp không tạo

màu với iod. Chúng có ở thực vật, động vật và đặc biệt là ở rất nhiều VSV.

α – amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối, rượu loãng. Tất cả các α – amylase đều chứa

từ 1-30 nguyên tử gam canxi (Ca)/mol. Nếu tách hoàn toàn Ca

khỏi phân tử enzym thì α – amylase mất khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia

hình thành và ổn định enzym. Ca còn tác dụng đảm bảo α – amylase có độ bền cực

lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các enzym phân giải protein [21]

α – amylase từ các nguồn thu nhận khác nhau thường không giống nhau.

+ pH thích hợp cho hoạt động của đa số α – amylase từ NS là 4,5 – 5,5; của đại mạch nảy

mầm và thóc mầm là 4,7 – 5,4; và của VK là 5,5 – 6. pH tối thích của α – amylase từ A. oryzae là

4,8 – 5,8 [26].

+ Độ bền của α – amylase với tác dụng của axit từ NS được sắp xếp theo thứ tự sau: A.

batatae > A. usamii> A. oryzae> A. awamori> B. subtilis> thóc mầm [21].

+ α – amylase của NS rất nhạy cảm với hoạt động của nhiệt độ tối thích khoảng 40 - 500C,

thóc mầm và malt là 58 – 600C và VK là 70 – 750C [21].

α – amylase hầu như không tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tinh bột

rất nhanh. Thủy phân tinh bột bằng α – amylase thường xảy ra hai giai đoạn:

* Giai đoạn đầu: (Giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt từ hồ

α-amylase

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

tinh bột giảm

Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide

Amylase oligosacharide poliglucose

Maltose maltotriose maltotetrose

* Giai đoạn 2: (Giai đoạn đường hóa) thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành [17]

1.3.2.2. β – amylase hay β (1 - 4) glucomaltohydrolase

Là ngoại enzym chỉ phân cắt các liên kết α – 1,4 glucoside ở đầu mạch. Chỉ phổ biến ở thực

vật, nhiều ở hạt nảy mầm. Vi khuẩn không có enzym này, còn NS chưa được chứng minh hoàn toàn

về sự hiện diện của enzym này [5], [21].

β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vô hoạt hoàn toàn ở 700C nhưng trong dịch nấu thì nhiệt độ tối thích là 60 – 650C. Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3-4. Đa số β – amylase hoạt động

mạnh hơn ở MT pH 4,5-5 và vẫn giữ được hoạt

tính khi không có canxi.

Điểm khác biệt của enzym này so với α-amylase là hầu như không tác dụng

lên tinh bột sống mà chỉ phân giải hồ tinh bột. Chúng phân giải 100% amilose và 54-58%

amilopectin thành maltose [26].

1.3.2.3. Glucoamylase hay amyloglucozidaza, còn gọi là γ-amylae

Đây là enzym đường hóa quan trọng nhất trong hệ amylase. Glucoamylase xúc tác thủy phân

các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử trên mạch amilose và amilopectin tạo

sản phẩm cuối cùng là glucose. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen,

dextrin và maltose thành glucose [21], [26], [44].

Trong số các VSV có khả năng sinh glucoamylase đã được biết cho đến nay, chi Aspergillus

là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rất cao, đặc biệt là loài Aspergillus

niger.

Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 –

5,0. Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH

kiềm. Ví dụ glucoamylase của loài Coniphora cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH=9,

glucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH=8 [21], [44].

Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 – 600C. Tuy nhiên, cũng có trường hợp glucoamylase

hoạt động tốt nhất ở 65 – 700C, ví dụ như glucoamylase của loài C. thermosaccharolytium.

Glucoamylase bị ức chế mạnh bởi Hg+ nhưng các ion Mn2+ và Fe2+ lại có tác dụng kích thích

sự hoạt động của enzym này [5], [21], [29].

1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của NS

a. Giống nấm sợi

Trong các yếu tố thì chủng giống NS là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình

thành và hàm lượng amylase. Không phải tất cả các chủng nấm đều có khả năng tổng hợp amylase

như nhau. Ngày cả những chủng cùng chi, thậm chí cùng loài cũng rất khác nhau về lượng enzym

do chúng sản sinh ra. Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng NS có khả năng tạo nhiều amylase là

điều vô cùng quan

trọng [26], [31].

Bên cạnh việc tuyển chọn được chủng NS có khả năng sinh amylase cao, cần

phải đồng thời tiến hành nuôi cấy trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp

enzym cao nhất và ổn định nhất. Sau đó, cần phải tiến hành bảo quản giống một cách cẩn thận để

giữ được hoạt tính ban đầu.

b. Nguồn dinh dưỡng

Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn tới hoạt động sống và sự tạo thành enzym

của NS. Vì vậy, trong MT nuôi cấy cần bảo đảm đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất

dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với từng loại NS [26]

 Nguồn dinh dưỡng cacbon

Trong MT nuôi cấy NS sinh amylase nhất thiết phải có nguồn tinh bột làm chất cảm ứng và

nguồn cacbon. NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat

dễ hấp thu nhất với NS là glucose - là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào chu trình chuyển hóa:

con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [26].

Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác nhau cũng có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành

các enzym riêng biệt của hệ amylase. Ví dụ như để đảm bảo hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh

bột, còn với glucoamylase là 2% [26].

Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn

gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Trong đó cám

gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho

VSV phát triển. Mặt khác, khi chế tạo MT, các nguyên liệu này chúng thường có tính chất vật lý rất

thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong

khối nguyên liệu [26].

 Nguồn dinh dưỡng nitơ

Nguồn dinh dưỡng nitơ để nuôi NS tạo amylase thường được dùng dưới các dạng muối vô cơ

chủ yếu là NaNO3 hoặc NH4NO3 với hàm lượng 0,91% có hiệu quả cao hơn các loại muối khác.

Các hợp chất N hữu cơ thường dưới dạng nguyên

liệu giàu đạm như: cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô dầu,…[21], [26].

Khi sử dụng nguồn nitơ nhất định cho vào MT có thể kích thích tổng hợp

amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hóa, quá

trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức

chế tổng hợp α-amylase.

Tỉ lệ giữa cacbon và nitơ trong MT có ý nghĩa rất lớn đối với sự tạo thành amylase. Chỉ khi

nào trong MT có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết mới tích lũy được enzym cực lớn. Trong MT

Czapeck tỉ lệ giữa tinh bột và NaNO3 là 18:1 [21].

 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Cu…có vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình

chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia vào thành phần cấu tạo protein, enzym,

điều hòa các chất trong tế bào…[26]

Một số chất khoáng có vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp enzym amylse như:

Canxi là thành phần không thể thiếu được trong cấu tạo amylase vì nó cần cho quá trình tổng hợp và

ổn định α-amylase, bảo vệ enzym này khỏi tác động của protease; Magie (Mg) ảnh hưởng đến độ

bền nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hưởng đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova,

Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cần cho sự tổng hợp α-amylase và glucoamylase là

0,05%.

Phospho ảnh hưởng đến sự sinh sản của NS, khi bổ sung phospho hữu cơ vào MT sẽ làm

tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2-3 lần; Tuy nhiên, nếu trong MT có

nhiều Mn, Cu, Hg thì sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase [21].

c. Điều kiện nuôi cấy

Ngoài các yếu tố dinh dưỡng, trong MT nuôi cấy VSV các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH,

thời gian nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp amylase của VSV.

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng đa số NS trên MT rắn là 28-320C. Chu kỳ sinh trưởng của

NS có thể chia làm 3 thời kì: Thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (10-11 giờ đầu tiên), nhiệt độ cần ở 23-300C. Thời kì sinh trưởng nhanh hệ sợi (4-18 giờ), nấm hô hấp mạnh nên giữ nhiệt độ phóng ở 28-290C. Và ở thời kì sinh amylse mạnh (10-12 giờ) ở nhiệt độ 28-290C [26].

- Ảnh hưởng của độ ẩm

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với NS là 60-65%, VK là khoảng

70%, độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thoáng

khí của MT, còn khi độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV.

- Ảnh hưởng của pH

Đa số NS phát triển và tạo amylase ở MT axit yếu trong khi vi khuẩn lại phát triển và sinh

enzym cao ở MT trung tính. pH môi trường không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà

còn ảnh hưởng đến chủng loại enzym được tổng hợp. Ví dụ, A. oryzae khi MT có pH=6,5 thì ưu thế

tổng hợp thuộc về α – amylase, trong khi đó ưu thế thuộc về glucoamylase khi pH của MT là 4,5.

- Ảnh hưởng của độ mặn

Muối ăn NaCl ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của VSV, ngoài tác dụng cung cấp nguồn ion Cl- còn có tác dụng làm thay đổi sức thẩm thấu của màng tế bào, tạo điều kiện cho

việc tiết các chất ra MT [26].

Hầu hết các chủng nấm sợi RNM đều có khả năng phát triển tốt ở nồng độ muối từ 3-5%

(Mai Thị Hằng, 2001). Một số chủng có nguồn gốc tại RNM là có khả năng chịu mặn thì sinh

trưởng tốt ở nồng độ muối 10%. Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng từ 20 - 30% thì một số NS có thể

sống được nhưng mọc rất yếu [12]

- Ảnh hưởng của thời gian

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzym. Trong quá trình nuôi cấy NS,

sự hình thành amylase cực đại thường kết thúc khi NS bắt đầu sinh bào tử. Thời gian kết thúc sự tạo

thành amylase thường từ 30 đến 42 giờ. Còn đối với vi khuẩn sự tạo thành amylase tốt nhất là trong

khoảng từ 40 đến 50 giờ [21]

1.3.4. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận amylase

 Phương pháp nuôi cấy chìm – MT nuôi dạng lỏng.

NS được nuôi trong dung dịch đường hay dịch thủy phân cellulose, tinh bột có bổ sung

nguồn nitơ vô cơ (NaNO3). Để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều

amylase, người ta thường bổ sung thêm vào MT một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch,

nước chiết ngô,… Phương pháp này đòi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung

cấp ôxy cho NS phát triển. Để thu nhận enzym, dịch enzym được cô đặc ở nhiệt độ thấp [26], [28].

Phương pháp này có ưu điểm:

-NS được gieo cấy và phân tán khắp mọi điểm trong MT, nên bề mặt xung quanh NS dễ tiếp

xúc với dịch dinh dưỡng.

- Các thiết bị lên men dễ cơ khí hóa và tự động hóa.

Song phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau:

- Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối

- Trong quá trình nuôi cấy phải thổi khí và khuấy liên tục

- Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ

- Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất

cảm ứng để NS sinh enzym ở mức tối đa.

 Phương pháp nuôi cấy bề mặt – MT bán rắn

Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT. Nguyên liệu chính thường

là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, tấm gạo,…được bổ sung lượng nhỏ (10-20%) trấu, hạt

ngũ cốc, mạt cưa,… để làm tăng độ thoáng khí. MT được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng

khác, rồi tiến hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 – 60%. Hấp thanh trùng ở 1-1,5

atm/45-60 phút, để nguội rồi cho bào tử nấm hay NS vào. MT đã cấy giống được tãi lên các khay

sạch với chiều dày từ 2 – 5cm và nuôi ở các điều kiện thích hợp. Sau khoảng thời gian nuôi cấy, người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 400C để đạt độ ẩm 8-12%, nghiền nhỏ. Đây chính là chế phẩm

enzym dạng thô [26].

Phương pháp này có nhược điểm là:

- Tốn diện tích mặt bằng

- Khó cơ khí hóa và đặc biệt là khó tự động hóa được toàn bộ quá trình

- Chi phí nhân công, điện nước...cho một đơn vị sản phẩm cao

Trong hai phương pháp trên, thì nuôi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao hơn, vì

NS là VSV hiếu khí bắt buộc do đó nuôi trên MT này thì độ thoáng khí cao. Nồng độ enzym tạo

thành cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm. MT không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm

VSV lạ cũng dễ dàng xử lý. Chế phẩm dễ sấy khô, bảo quản, dễ vận chuyển và ít tổn hao hoạt tính

enzym. Là phương pháp sử dụng trong điều kiện không cần thu enzym tinh khiết, rất dễ thực hiện,

quy trình công nghệ đơn giản không đòi hỏi quá cao về trang thiết bị [28].

 Phương pháp thu nhận amylase

- Từ phương pháp nuôi cấy chìm: Sau khi lọc bỏ sinh khối VSV và các tạp chất rắn không tan

còn khoảng 1-3% chất khô hòa tan, trong đó có enzym. Thu dịch lọc, sau đó cô đặc cho giảm thể tích từ 4-10 lần trong điều kiện chân không ở 25 – 300C, rồi tiến hành tách enzym.

- Từ môi trường nuôi cấy bề mặt: Chế phẩm enzym thô được bổ sung lượng nước gấp 4 – 5 lần khối lượng canh trường để hòa tan enzym. Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 10-120C. Dịch

chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong.

Dịch chiết được cô đặc chân không tới 50-55% chất khô hòa tan, dịch đậm đặc này có thể

bảo quản lâu dài mà không mất hoạt lực và rất dễ hòa tan.

- Tinh sạch amylase: Sử dụng cồn lạnh (40C) lượng gấp 2 – 2,5 lần lượng dịch enzym đổ từ

từ vào dịch lọc, khuấy nhẹ để cồn hòa đều với dịch lọc enzym. Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh. Sau 15 –

24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp. Đem ly tâm hay lọc để thu enzym dạng tủa. Sấy khô nhẹ ở nhiệt độ < 400C để thu chế phẩm enzym bán tinh khiết [26]

1.3.4. Ứng dụng của enzym amylase

Amylase là hệ enzym thủy phân quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học. Hiện nay,

việc sản xuất chế phẩm amylase đã được khai thác theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng trong

nhiều lãnh vực khác nhau [29].

a. Trong công nghệ rượu, cồn, bia

Trong vài chục năm gần đây, các nhà sản xuất đã sử dụng chế phẩm amylse từ NS A. oryzae

hay A. awamori, B. subtilis để thay thế malt trong việc đường hóa tinh bột sản xuất rượu, bia từ

nguyên liệu có chứa tinh bột. Việc thay thế này giúp tiết kiệm được hàng vạn tấn tinh bột loại tốt,

giảm giá thành sản phẩm và rút ngắn quá trình sản xuất. Người Nhật đã biết sử dụng enzym của

nấm mốc trong quá trình

đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm. Người Trung Quốc thì

đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu từ cách đây 4000 năm. Còn

người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm [29], [31].

Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang

mới biết sử dụng enzym của nấm này thay amylase của malt để sản xuất cồn [29].

b. Sản xuất bánh mì

Để rút ngắn thời gian ủ bột, khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ

nâng cao chất lượng bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp. Nhiệt độ vô hoạt α- amylase của NS tương đối cao (700C) nên có thể dùng enzym này với liều lượng lớn mà không có

hiện tượng dextrin hóa khi nướng. Hơn nữa, hoạt độ α-amylase lại cao nên có thể đạt đến độ đường

hóa cần thiết rất nhanh chóng, sau đó bị vô hoạt ngay. Tuy nhiên, chế phẩm enzym nấm mốc thường

là một phức hệ enzym, trong đó protease có thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi [29].

c. Công nghiệp dệt

Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Trong vải thô

thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác. Để làm vải mềm, có khả năng nhúng nước,

tẩy trắng và bắt màu tốt người ta thường sử dụng 1 lượng chế phẩm amylase (từ VK hay nấm mốc) khỏang 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 900C. Phương pháp này không

làm hại vải, độ mao dẫn tốt, đồng thời đảm bảo vệ sinh.

Ngoài ra, amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản

xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở

quy mô công nghiệp [29].

d. Trong sản xuất thức ăn gia súc

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn với thành

phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường sử

dụng chế phẩm amylase của A. oryzae, A. owamorii thêm enzym amylase vào khẩu phần ăn của

động vật, nhất là động vật

non làm tăng khả năng đồng hóa dẫn đến tăng trọng nhanh [31].

e. Nghiên cứu sinh học, y học

Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng

của amylase. Chế phẩm amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ

nhạy cao

Amylase cùng các enzym khác, được dùng trong chữa bệnh do thiếu enzym, kém khả năng

chuyển hóa chất, bệnh về tiêu hóa, tim, thần kinh,…

Ngoài ra, chế phẩm enzym được dùng để điều chế MT nuôi VSV phục vụ cho công tác

nghiên cứu khoa học, chuẩn trị bệnh [29], [31].

 Một số chế phẩm enzym amylase trên thế giới và Việt Nam

Bảng 1.1 : Một số chế phẩm enzym amylase thương mại [21]

STT Chế phẩm enzym Tên thương mại Hãng sản xuất

Tenase Miles lab

α-amylase vi khuẩn Optiamyl Miles Kali-chemie 1

BAN Novo-nordisk

Termamyl Novo-nordisk

α-amylase vi khuẩn Opti-therm Miles Kali-chemie 2

chịu nhiệt Maxamyl Gist-brocades

Diazym Miles lab

Novo-nordisk Amyloglucosidase AMG 3

Spezym Fiun Biochemical

β-amylase Dextrozym (chứaAMG) Novo-nordisk 4

Promozym Novo-nordisk

Biozym Amano

5 MKC. Fugal amylase Novo-nordisk

Fungamyl clarase Miles lab

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu

- Các chủng NS phân lập từ mẫu đất, thân, lá cây tại 5 xã của RNM Cần Giờ

- Các VSV kiểm định: E. coli, B. subtilis từ viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh

- Chế phẩm amylase từ viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh

- Nguồn nguyên liệu thu nhận enzym: Cám mì, trấu, bột ngô, đậu tương mua từ chợ Tân

Bình.

 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm

* MT1 - MT Czapek – Dox cải tiến: dùng để phân lập NS [9], [22], [43]

NaNO3 3.5g; KH2PO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.01g (vết); glucose

20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút; Cloramphenicol 1% MT.

*MT2 - MT cao nấm men (YEA) (Yeast Extraxt Agar) Dùng để nuôi cấy và giữ giống NS [15]

, [54]

Cao nấm men 4g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5.5 – 6.0; khử trùng 1atm/

30 phút.

*MT3 - MT Malt Extract Agar (MEA): Dùng để bảo quản NS [22], [54]

Pepton 1g; Malt Extract 20g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5 – 6; khử

trùng 1amt/30 phút.

*MT4 - MT cảm ứng tổng hợp amylase: Dùng để phân lập nhanh các chủng NS sinh

amylase[11], [13], [21]

NaNO3 3.5g; K2HPO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.1g (vết); tinh bột tan

10g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút

*MT5 - MT cảm ứng tổng hợp cellulose [1]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g tinh bột tan

bằng 10g CMC.

*MT6 - MT cảm ứng tổng hợp protease [26]: Tương tự MT4 nhưng không sử dụng NaNO3

và thay 10g tinh bột tan bằng 10g casein.

*MT7 - MT cảm ứng tổng hợp chitinase[26]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g

tinh bột tan bằng 10g chitin.

*MT8 - MT cảm ứng tổng hợp pectinase[26]:

200g cà rốt gọt vỏ, xay nhỏ, đun với 1000ml nước biển trong 60 phút, thêm 1 ít CaCO3 để

trung hòa MT. Sau đó lọc lấy nước trong, bổ sung 20g agar; pH = 6,5; khử trùng 1atm/30 phút.

*MT9 - MT Meat Peptone Agar (MPA): MT nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn kiểm định [11]

Pepton 5g; NaCl 5g; cao thịt 5g; agar 20g; nước cất 1000ml; pH = 7.5; khử trùng 1atm/ 30

phút.

*MT10 – MT thử khả năng phân giải dầu [1],[11], [35]:

KH2PO4 0,3g; MgSO4 0,4g; KNO3 3g; Na2HPO4 0,7g; Dầu DO 50ml; nước biển 950ml; khử

trùng 1atm/ 30 phút

 Một số MT bán rắn khảo sát khả năng sinh amylase

*MT11 [1], [11], [26]: Cám mì 65g; trấu 25g; bột bắp 7,5g; NaNO3 2g; MgSO4 0,05g;

KH2PO4 0,2g; KCl 0,05g; urê 0,2g; độ ẩm 50 - 60%, pH = 5 – 6, khử trùng 1atm/ 30 phút.

*MT12 [21], [26]: Trấu 55g; cám 30g; bột bắp 5g; bã khoai mì 5g; đường 4g; (NH4)2HPO4

0,1g; ure 0,2g; CaCl20,1g; KCl 0,05g; HCl 0,05g; độ ẩm 50 – 60%; khử trùng 1atm/45 phút.

*MT13 [21], [26]: 90% bã khoai mì; 10% trấu, bổ sung dung dịch khoáng (KH2PO4 0,1%;

NH4Cl 0,1%; KNO3 0,3%; MgSO4 0,05%) cho đủ độ ẩm 60%; khử trùng 1atm/30 phút.

*MT14 [15]: 50% cám gạo; 33% bã khoai mì; 17% trấu; độ ẩm 60%; pH 5-5,5; khử trùng

1atm/30 phút.

*MT15 [15]: Cám 60%; bột đậu nành 30%; bột ngô 10%; trấu 25%; độ ẩm 60%; pH 5,0-5,5;

khử trùng 1atm/60 phút.

2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1. Hóa chất

- Cồn, NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, NaCl, HCl,...

- Glucose, cao nấm men, nước chiết khoai tây, tinh bột tan, agar, peptone,

cao thịt, casein, thuốc thử lugol, HgCl2, Dinitrosalysilic, lactophenol…

- Chất KS: Cloramphenycol (Ấn Độ)

2.2.2. Dụng cụ

Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, que cấy, que gạt, bông mỡ, đèn cồn, cốc thủy

tinh,

2.2.3. Thiết bị

Tủ cấy vô trùng (Việt Nam), tủ lạnh (National - Nhật), tủ giữ mẫu (Sanyo - Nhật), máy giập

mẫu (Đức), máy lắc Gerhardt (Đức), cân điện Sartorius (Đức), tủ sấy Memmert (Đức), nồi hấp áp

lực Autoclave (Đài Loan), máy đo quang phổ UV – Visible spectrophometer (Nhật), máy chụp hình

kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật), máy đo pH (Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc), máy ly tâm Rotina

(Đức), cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ), máy đo độ ẩm Startorius (Đức),...

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ (Theo A. D. Agate, 1988) [42]

Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: Xã Bình Khánh, xã Tam Thôn Hiệp, xã

An Thới Đông, xã Long Hòa…Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2km, các điểm lấy mẫu

cách nhau khoảng 200m. Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ có độ mặn 3%, nhiệt độ khoảng 290C; pH 7,02

Lấy các mẫu đất mặt, đất sâu 5-10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thần cành chết khô

còn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất.

Cách lấy: Dùng dao, kéo vô trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi ni lông vô trùng buộc kín,

đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C. Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 24 giờ [43].

2.3.2. Phương pháp vi sinh

2.3.2.1. Phân lập mẫu theo phương pháp pha loãng mẫu (F. Uyenco, 1988)

* Lấy mẫu và pha loãng

Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ vô trùng. Sau

đó dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/ phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngoài. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1.

Lắc đều, hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được

dung dịch pha loãng nồng độ 10-2.

Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4…

* Cấy mẫu

Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nông độ lên đĩa petri chứa MT czapek- dox cải tiến. Dùng que

trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đó sử dụng que trang đó trang tiếp hai đĩa tiếp theo.

http://www.saigonesl.com/City_Maps_Collection/pages/County_Can_Gio_gif.htm

Hình 2.1. Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và các vị trí lấy mẫu

* Ủ mẫu

Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Chọn khuẩn lạc riêng

rẽ cấy chuyền vào ống thạch nghiêng.

* Làm thuần

Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước cất, trải

đều trên mặt đĩa lần 2. Nếu các dạng khuẩn lạc đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển

vi đều có 1 dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết.

Sau đó chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền vào 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên

cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa.

2.3.2.2. Giữ giống trên MT thạch dưới lớp dầu khoáng (Lumiere và Chevrotier – 1914)

Chuẩn bị ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp. Dầu khoáng chứa trong ống eppendorf hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khô ở 1700C trong 1-2 giờ, để nguội. Dùng

que cấy lấy bào tử NS cho vào eppendorf chứa dầu khoáng vô trùng. Hàn kín eppendorf bằng paraffin, bảo quản ở nhiệt độ 40C.

Phương pháp này có thể bảo quản trong 1-3 năm.

2.3.2.3. Quan sát đại thể NS [6], [7]

NS sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ như sau

- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng.

- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm. Lắc đều

tạo dung dịch huyền phù.

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm

vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2-3 hộp.

- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL. Hàng ngày lấy ra quan sát

- Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm:

+ Hình thái, kích thước KL

+ Màu sắc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc của KL

+ Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra.

+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT, đặc điểm của mép KL

+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt Kl……

2.3.2.4. Quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch [8]

- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri.

- Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8mm, khoan các khối thạch.

- Chuẩn bị đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất vô

trùng.

- Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề mặt xung quanh khối

thạch. Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt các khối thạch.

- Các phiến kính có khối thạch cấy NS nghiên cứu được đặt trong các hộp petri có sẵn một ít

bông thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Các hộp petri này được bao và giữ trong tủ

ấm 3 - 4 ngày.

- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch có một giọt dung dịch lactophenol, ta được

tiêu bản thứ nhất.

- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactyophenol, đậy lá kính

lên trên ta được tiêu bản thứ hai.

- Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm

+ Hình dạng cuống sinh bào tử.

+ Hình dạng thể bình.

+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn.

+ Đặc điểm bào từ đính, màu sắc, kích thước bào tử…

2.3.2.5. Định danh NS bằng kĩ thuật di truyền phân tử (PCR).[40]

 Nguyên tắc:

Dùng phương pháp PCR để khuếch đại một trình tự gen lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt là NK28s-F và NK28s-R đặc hiệu một đoạn ADN dài 260 bps có chứa các trình tự đặc

hiệu giống. Các phân đoạn ADN sẽ được phân tách qua điện di trên gel agarose 2%. Giải trình tự

sản phẩm này và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gen NCBI để định danh NS [40].

 Các bước tiến hành:

- Nuôi cấy chủng NS trong ống nghiệm từ 2-3 ngày rồi lấy một lượng mẫu NS khoảng ½ hạt gạo

cho vào một tube eppendorf - Cho thêm 180µl TE1X và 20µl Prokprep rồi đem ủ ở 560C qua đêm - Thêm 500µl Phenol Buffer và 500µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi ở 1000C trong

15 phút.

- Sấy nhẹ rồi thêm vào 250µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex, lắc đều rồi ly tâm 14,000

vòng/phút trong 10 phút

- Hút 450µl dịch nổi sang một tube eppendorf mới. Sau đó thêm vào 500µl Isopropanol. Giữ tube ở nhiệt độ -200C trong 1 – 2 giờ - Ly tâm 14,000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch nổi

- Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500µl Ethanol 70% vào, úp ngừa tube 3-4 lần.

- Ly tâm 14,000 vòng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi - Làm khô cặn DNA ở 560C trong 10 – 15 phút

- Hòa tan cặn DNA trong 50µl TE1X. Lấy 5µl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuật PCR

nấm

- Lấy 5µl DNA của NS sau khi ly trích của vào PCR mix.

-Tiến hành điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio

Analyzer. Sản phẩm PCR có độ dài 260 bps.

- Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch thì tiến hành giải trình tự gen 28S rRNA

và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định chi và loài của chủng nghiên cứu [40]

2.3.2.6. Xác định hoạt tính enzym ngoại bào: bằng khuyếch tán trên MT thạch (William,

1983).

 Nguyên tắc:

Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ không tạo màu

mà tạo vòng phân giải trong suốt quanh khuẩn lạc

 Cách tiến hành:

Dùng MT định tính đo khả năng phân giải các hệ enzym.

+ Phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và MT thử hoạt tính

enzyme tương ứng (MT4, MT5, MT6, MT7, MT8) cấy chấm điểm (3 điểm/đĩa), giữ các đĩa trong 28-30oC, 3-4 ngày.

+Phương pháp đục lỗ trên thạch:

- Thu dịch nuôi cấy NS: dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng que cấy NS vào bình tam giác

chứa 50ml MT lỏng vô trùng. Nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút), 4 ngày, 25-28oC

- Ly tâm dịch nuôi cấy 3000 tốc độ vòng/phút trong 20 phút.

- Lọai bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng là dịch

enzym thô, bổ sung 0,04% NaNO3 để khử trùng; có thể giữ dịch ly tâm 1 tháng trong tủ lạnh sâu ở -20oC.

- Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 8mm) khoan các lỗ thạch trên MT nghiên cứu tương ứng

trong các đĩa.

- Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym thô vào các lỗ khoan trên các MT thử hoạt tính tương ứng. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 4 - 6 giờ. Sau đó chuyển sang tủ ấm 28-300C trong

24giờ.

- Thuốc thử lugol (hỗn hợp 0,05% I2 với 2,65%KI) cho amylase, cellulose, kitinase; dung

dịch 10% HgCl2 cho protease, nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo

KL.

 Kiểm tra kết quả

- Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase:

+ Nếu NS có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa

dịch enzym. Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm.

+ Nếu NS có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa

dịch enzym. Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt.

+ Nếu NS có hoạt tính kitinase sẽ tạo vòng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa

dịch enzym. Vùng kitin chưa bị phân giải có màu nâu đỏ nhạt.

- Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu NS có hoạt tính

protease sẽ tạo vòng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym. Vùng chứa protein chưa

bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 protein bị kết tủa.

 Đánh giá kết quả

- Đặt sấp hộp petri. Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đường kính KL (d), hoặc

đường kính lỗ thạch (d = 8mm)

- Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng NS

Quy ước: D-d ≥ 25 mm: hoạt tính enzym mạnh; D-d ≥ 20 mm: hoạt tính enzym khá mạnh; D-d ≥

15 mm: hoạt tính enzym trung bình; D-d ≤ 10 mm: hoạt tính enzym

yếu.

2.3.2.7. Xác định hoạt tính KS (Egorov và cộng sự, 1969)

 Nguyên tắc:

Chất KS do NS sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV không phát

triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch KS hay khối thạch chứa nấm tạo vòng vô khuẩn trong

suốt.

 Cách tiến hành (Phương pháp khối thạch) :

+ Cấy các chủng NS nghiên cứu vào MT2 (thay nước biển bằng nước cất)

ủ trong tủ ấm từ 3 – 4 ngày.

+ Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cho vào 3ml nước cất lắc đều tạo dung dịch huyền

phù.

+ MT9 sau khi hấp khử trùng để nguội 40oC, cho dung dịch huyền phù chứa VSV kiểm định

vào lắc đều và đổ một lớp mỏng lên đĩa petri, để nguội.

+ Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có NS cần thử hoạt tính KS. Đặt các

khối thạch vào đĩa petri có MT9 đã cấy VSV kiểm định

 Kết quả kiểm tra

-Khả năng sinh KS được đánh giá bằng hiệu số (D - d, mm). Trong đó D: đường kính vòng phân

giải, d: đường kính KL (lỗ thạch)

- Quy ước: D-d ≥ 25 mm: hoạt tính KS rất mạnh; D-d ≥ 20 mm: hoạt tính KS mạnh; D-d ≥ 15

mm : hoạt tính KS trung bình; D-d ≤ 10 mm: hoạt tính KS yếu

2.3.2.8. Khảo sát khả năng phân giải dầu

 Cách tiến hành:

Cấy NS trong bình tam giác 250ml chứa 50ml dầu khoáng (MT10). Sau 15 ngày nuôi cấy

tĩnh ở nhiệt độ phòng, đo sinh khối của NS, kiểm tra sự phân bố các giọt dầu và mùi để đánh giá

khả năng phân giải dầu của NS [35]

 Cách đo sinh khối NS:

- Cấy bào tử NS vào bình tam giác. - Sau 15 ngày nuôi cấy, lọc lấy sinh khối NS và đem sấy khô ở 1050C

- Cân trọng lượng của tờ giấy thấm, sau đó cân sinh khối NS trên tờ giấy. Lấy kết quả sau trừ

kết quả trước ta thu được kết quả sinh khối NS [32].

2.3.2.9. Phương pháp nuôi cấy NS trên MT lên men bán rắn (MT11)

 Mục đích: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng NS nghiên cứu

 Cách tiến hành:

- Cho vào mỗi bình tam giác (250ml) 15g MT xốp, hấp khử trùng 1atm/ 30 phút.

- Cho 10ml nước cất vô trùng vào mỗi ống nghiệm nuôi NS. Dùng que cấy cà nhẹ lên bề mặt

thạch để lấy hết bào tử, lắc đều cho bào tử ở dạng huyền phù.

- Lấy 3ml dịch bào tử (khoảng 105 – 106 bào tử/1g MT) cho vào MT xốp đã chuẩn bị. Nuôi

cấy ở điều kiện thích hợp.

2.3.3. Phương pháp hóa sinh

2.3.3.1. Phương pháp tách chiết dịch amylase thô từ canh trường nuôi cấy

 Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của amylase, dùng nước cất vô trùng hòa

tan tạo dịch enzym amylase thô.

 Cách tiến hành:

Cho 100ml nước cất vào mỗi bình tam giác chứa MT xốp đang nuôi NS. Lắc đều, giữ ở nhiệt độ 3 – 40C trong 30 - 45 phút để enzym khuếch tán. Sau đó, đem hỗn hợp lọc qua vải và ly tâm dịch lọc

5000vòng/ 15phút. Thu dịch ly tâm, định mức 100ml. Ta thu được enzym thô và đem xác định hoạt

độ amylase

2.3.3.2. Phương pháp thu enzym bán tinh khiết

Chế phẩm enzym thô được nuôi cấy theo phương pháp bề mặt được giã bằng cối, chày sứ với

sự trợ giúp của cát thạch anh hay bột thủy tinh. Sau đó, bổ sung lượng nước gấp 4 – 5 lần khối lượng canh trường để hòa tan enzym. Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 40C.

Dùng cồn lạnh (40C) lượng gấp 2 – 2,5 lần lượng dịch enzym đổ từ từ vào dịch lọc, khuấy

nhẹ để cồn hòa đều với dịch lọc enzym. Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh.

Sau 15 – 24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp. Đem ly tâm hay lọc để thu enzym dạng tủa. Sấy

khô nhẹ ở nhiệt độ < 400C để thu chế phẩm enzym bán tinh khiết.

2.3.3.3. Phương pháp xác định hoạt độ α - amylase (Phương pháp Henkeil, 1956)

 Nguyên tắc:

Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của

hỗn hợp phản ứng với dung dịch iod. Đơn vị hoạt độ của enzym là lượng enzym có khả năng thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút ở 30oC, pH = 6,0.

 Hóa chất:

+ Dung dịch NaCl 0,1%: hòa tan 0,1g NaCl vào nước thành 100ml

+ Dung dịch iod: hòa tan 1g iod vào 5ml dung dịch chứa 2g KI thêm nước cất đến 100ml.

Khi dùng pha loãng dung dịch này 500 lần.

+ Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6,0

+ Dung dịch HCl 0,1N

+ Dung dịch tinh bột 1,0%: hòa tan 10g tinh bột trong 500ml dung dịch đệm phosphate

0,05M, pH = 6,0 đem đun sôi trong 3 phút để tinh bột hòa tan rồi định mức 1000ml, bảo quản trong

tủ lạnh.

+ Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1%

 Cách tiến hành:

Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch tinh bột 1,0%, 1ml dung dịch NaCl 0,1% và 2ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6,0. Lắc đều để ở 300C trong 15-20 phút để dung dịch đạt đến 300C, thêm vào hỗn hợp 1ml dung dịch enzym đã đạt đến 300C, lắc đều và giữ ở 300C trong 30

phút. Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm cho ngay vào 5ml dung dịch HCl 0,1N làm ngừng phản ứng.

Song song mẫu thật, làm mẫu không cũng tương tự như trên nhưng cho dung dịch HCl 0,1N

vào trước rồi cho enzym vào sau.

Lấy 1ml mẫu thử thật và mẫu không cho vào ống nghiệm, thêm 9ml dung dịch iod đã pha

loãng 500 lần. Lắc đều rồi so màu ở bước sóng 560nm. Lấy hiệu số đọc được trên máy giữa mẫu

không và mẫu thật, đối chiếu đường cong tiêu chuẩn tính số mg tinh bột bị phân giải.

 Đường chuẩn tinh bột:

Từ dung dịch tinh bột 1,0%, xây dựng đường chuẩn với dung dịch tinh bột có nồng độ 0 –

10mg/ml. Xây dựng đường chuẩn tinh bột (mg/l)

Ống số 0 1 2 3 4 5

Nồng độ tinh bột (mg/l) 0 2 4 6 8 10

Dung dịch tinh bột (ml) 0 1 2 3 4 5

Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0

- Vẽ đồ thị sự biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ tinh bột (mg/ml) ở bước sóng

560nm.

- Tính kết quả:

Hoạt độ (UI/g) =

Trong đó

X: số mg tinh bột bị thủy phân (mg/ml)

n: độ pha loãng

V: thể tích enzym ban đầu (ml)

10: thể tích hỗn hợp phản ứng (ml)

M: khối lượng canh trường (g)

2.3.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (theo Miller)

 Nguyên tắc:

Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của

hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo đồ thị đường chuẩn glucose tinh

khiết với thuốc thử dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.

 Hóa chất:

Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất

và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức đến 100ml.

Dung dịch glucose mẫu (500μg/ml) cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1 lít.

 Cách tiến hành:

Lấy 3 ống nghiệm, dùng pipet cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dung dịch hồ tinh bột 1%, thêm vào 0,5ml nước cất rồi đặt vào nồi cách thủy (t=300C). Sau 10 phút ta cho vào mỗi ống 0,5ml dịch chiết enzym (đã pha loãng 100 lần), khuấy nhẹ và giữ ở 300C trong 30 phút. Tiếp theo, lấy ngay ống

nghiệm ra và cho vào mỗi ống nghiệm 0,5ml dung dịch HCl 1N để ngừng hoạt động của enzym.

Bảng xác định hoạt độ đường khử

Mẫu thật Mẫu không

Tinh bột 1% (ml) 2ml 2ml

Nước cất (ml) 0,5 ml 0,5 ml

Để cách thủy 10 phút để đạt nhiệt độ 300C

Dung dịch enzym (ml) 0,5ml 0

Để cách thủy 30 phút cho enzym phản ứng với tinh bột

Dung dịch HCl 1N (ml) 0,5 ml 0,5ml

Dung dịch enzym (ml) 0 0,5m

 Dựng đồ thị chuẩn glucose

Từ dung dịch glucose 500μ/ml chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 50 - 250

μ/ml. Bảng: Xây dựng đường chuẩn glucose

Ống số 0 1 2 3 4 5

Nồng độ glucose ( μ /ml) 0 50 100 150 200 250

Thể tích dung dịch glucose mẫu (ml) 0 10 20 30 40 50

Nước cất 100 90 80 70 60 50

Cho 0,5ml dung dịch glucose chuẩn vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5 ml thuốc

thử DNS. Đun cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Thêm vào mỗi ống 5ml nước

cất và đo mật độ quang ở bước sóng 530nm với ống đối chứng là nước cất.

Vẽ đường chuẩn là glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose.

+ Mẫu thí nghiệm: Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được

tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn.

Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng.

 Tính kết quả:

Hoạt độ (UI/g) =

Trong đó

X: số mg glucose (µg/ml)

n: độ pha loãng

V: thể tích enzym ban đầu (ml)

3,5: thể tích hỗn hợp phản ứng (ml)

M: khối lượng canh trường (g)

2.3.3.5. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ amylase của

2 chủng NS

a. Ảnh hưởng của thời gian

- Xác định sự sinh trưởng: Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 trong đĩa petri. Quan sát sự

phát triển KL sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Đo đường kính mỗi ngày để xác định tốc độ sinh trưởng

của KL các chủng NS

- Xác định hoạt độ amylase: Cấy mỗi chủng NS vào MT xốp (MT11) nuôi trong tủ ấm ở các

thời gian khác nhau: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 giờ. Sau đó tiến hành thu dịch enzym để tiến

hành đo OD xác định thời gian sinh enzym tối ưu của từng chủng

b. Ảnh hưởng của nhiệt độ

- Xác định sự sinh trưởng: Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 trong đĩa.

Để các đĩa petri trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 25, 30, 35, 40, 45, 500C. Ủ sau 3 ngày thì đo

đường kính khuẩn lạc d (mm)

- Xác định hoạt độ amylase: Cấy mỗi chủng NS vào MT xốp (MT11) nuôi trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 25, 30, 35, 40, 45, 500C. Ủ trong tủ ấm theo thời gian đã xác định ở trên rồi thu

dịch enzym để tiến hành đo OD xác định nhiệt độ sinh enzym tối ưu của từng chủng

c. Ảnh hưởng của pH

- Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT1, điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay

HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Thanh trùng MT rồi đổ ra đĩa petri. Sau đó,

cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng NS dựa vào

đường kính KL d (mm). Mẫu đối chứng là có pH 6,5

- Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay HCl

10% để có các giá trị pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS, ủ

trong điều kiện thời gian, nhiệt độ đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác

định pH sinh enzym tối ưu của từng chủng. Mẫu đối chứng là có pH 6,5

d. Ảnh hưởng của độ ẩm

- Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT1, bổ sung các lượng nước biển khác nhau để đạt được

độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70%. Thanh trùng MT rồi đổ ra đĩa petri, cấy chấm điểm chủng NS

nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng NS dựa vào đường kính KL d (mm)

- Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), bổ sung các lượng nước biển khác nhau

để đạt được độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70%. Thanh trùng MT, để nguội, rồi cấy chủng NS nghiên

cứu, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ, pH đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo

OD xác định độ ẩm sinh enzym tối ưu của từng chủng.

e. Ảnh hưởng của độ mặn

- Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT2 không dùng nước biển, bổ sung các nồng độ muối khác

nhau: 1, 3, 5, 10, 20%. Thanh trùng MT đổ đĩa petri, rồi cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu lên

MT với các nồng độ muối. Ủ ấm 3 ngày

Đo đường kính KL d (mm) để đánh giá khả năng chịu mặn. Mẫu đối chứng sử dụng nước cất độ

mặn 0%

Quy ước: d = 0 mm : Không mọc, d = 1÷ 2 mm: Mọc yếu, d = 2,1 ÷ 5 mm: Mọc trung bình, d =

5,1 ÷ 10 mm: Mọc tốt, d = 11 ÷ 30 mm: Mọc rất tốt

- Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), bổ sung các nồng độ muối khác nhau: 1,

3, 5, 10, 20%. Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện thời gian,

nhiệt độ, pH, độ ẩm đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định độ mặn sinh

enzym tối ưu của từng

chủng. Mẫu đối chứng sử dụng nước cất độ mặn 0%

2.3.4. Phương pháp toán học

- Các kết quả thu được là trung bình của ba lần lặp lại thí nghiệm

Phương pháp tính giá trị trung bình

Trong đó : : Giá trị trung bình kết quả n lần thí nghiệm

: Giá trị lần thí nghiệm thứ i

n : Số lần lặp lại thí nghiệm

Phương pháp tính khoảng ước lượng :

Trong đó : tra bảng phân phối Student với n-1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng 2 phía.

Là phương sai mẫu

- Số liệu được xử lý bằng các hàm Avegare (Giá trị trung bình), Stud (Phương sai), Var (Sai số)

trong excel.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh amylase từ RNM Cần Giờ 3.1.1. Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ

Tiến hành lấy mẫu từ lá vàng, lá mục, cành khô, cành mục, đất mặt và đất sâu 5-10 cm, chúng

tôi đã phân lập được 409 chủng NS khác nhau (xem phụ lục1) và trình bày tóm tắt trong bảng 3.1

dưới đây.

Bảng 3.1. Sự phân bố các chủng NS

Cơ chất phân lập Số lượng chủng Tỷ lệ %

Lá: 152 37,2%

- Lá vàng 71 17,4%

- Lá mục 81 19,8%

Cành: 140 34,2%

- Cành khô 59 14,4%

- Cành mục 81 19,8%

Đất: 117 28,6%

- Đất mặt 64 15,6%

- Đất sâu 5-10 cm 53 13%

(Ghi chú: Kết quả bảng 3.1 được tổng hợp từ phụ lục 1)

Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy, hệ NS ở RNM Cần Giờ vô cùng phong phú. Chúng phân bố

rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên lá, cành, trên đất và có cả trong đất sâu 5-10 cm.

Các chủng NS phân lập tập trung nhiều trên nguồn cơ chất lá (152/409 chủng) chiếm 37,2%

tổng số chủng NS phân lập được, còn ở cành là (140/409 chủng) chiếm 34,2%, trên đất là (117/409

chủng) chiếm 28,6%. Kết quả này cho thấy, có lẽ hầu hết các chủng NS ở RNM là các chủng du

nhập từ đất liền (Nguyễn Hoàng Trí, 1999). Còn các loài nấm biển chủ yếu có trên rễ cây hoặc phần

gỗ ngâm

trong nước mặn. Đây là những nấm góp phần phân hủy xác thực vật ở RNM Cần Giờ [36].

Đặc biệt, trên cơ chất lá mục, thân cành mục số lượng NS nhiều hơn, vì đây là những nguồn

hữu cơ đang bị phân hủy, một phần đã phân giải thành glucose là nguồn cacbon mà nấm dễ hấp thụ

nhất. Kết quả này thống nhất với nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) và Nguyễn Thị Lan

Hương (2009) về khảo sát sự phân bố của các chủng NS.

Ngoài ra, trên lớp đất mặt số chủng NS chiếm (15,6%) nhiều hơn lớp đất sâu (13%) vì NS là

VSV hiếu khí mà lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn dồi dào (xác lá, cành, động vật,

vỏ xác tôm cua, giáp xác,…) đang phân hủy. Đồng thời, với điều kiện thủy triều lên xuống hàng

ngày nên lớp đất mặt luôn giữ độ ẩm thích hợp cho các chủng NS sinh trưởng phát triển.

Có thể thấy MT sống ở RNM Cần Giờ mặc dù rất khắc nghiệt nhưng có đầy đủ các yếu tố

cần thiết cho NS sinh trưởng và phát triển. Chúng sử dụng các chất hữu cơ có sẵn để tồn tại, đồng

thời tham gia phân hủy các chất thải, giúp giảm bớt ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ.

Từ các chủng phân lập được nói trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng NS dựa trên

khả năng sinh amylase của chúng.

3.1.2. Tuyển chọn những chủng NS có khả năng sinh amylase

 Tuyển chọn lần 1

Kiểm tra khả năng sinh enzym amylase của 409 chủng NS theo phương pháp 2.3.2.6. Kết

quả trình bày ở bảng 3.2

Phân tích số liệu từ bảng 3.2 cho thấy:

- Tổng số chủng có enzym: 261/409 chủng chiếm 63,81%

+ Chủng sinh enzym mạnh : 0/261 chiếm 0%

+ Chủng sinh enzym khá mạnh : 3/261 chiếm 1,15%

+ Chủng sinh enzym trung bình : 43/ 261 chiếm 16,48%

+ Chủng sinh enzym yếu : 156/261 chiếm 59,77%

Kí hiệu

D-d

STT

chủng

(mm)

11,5

8,5

11,5

L11

15,5

L12

13,5

L13

11,5

L14

L15

L16

L17

16,5

L18

L19

2,5

L20

L21

L22

L23

Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân lập

Kí hiệu

D-d

Kí hiệu

D-d

Kí hiệu

D-d

STT

chủng

(mm)

chủng

(mm)

chủng

(mm)

141

CK53

CM43

15,5

176

LM32

142

CK54

177

CM44

LM33

143

CK55

2,5

178

CM46

LM35

144

CK57

179

CM48

LM36

145

CK58

180

CM52

LM37

146

CK59

181

CM53

LM38

4,5

147

CM2

182

CM54

LM39

15,5

148

CM3

183

CM63

LM40

4,5

149

CM8

184

CM66

LM41

150

CM9

16,5

185

CM73

LM45

13,5

151

CM10

186

CM76

LM46

10,5

152

CM11

187

CM77

LM47

153

CM13

188

CM78

LM48

17,5

154

CM14

189

CM79

LM50

3,5

155

CM15

190

CM80

LM51

156

CM16

191

Đ2

LM52

157

CM17

192

Đ3

LM53

18,5

158

CM18

193

Đ5

16,5

LM54

159

CM20

194

Đ8

LM56

160

CM21

195

Đ10

20,5

LM57

161

CM22

5,5

196

Đ12

LM58

5,5

162

CM23

197

Đ13

LM59

5,5

163

CM26

198

Đ14

LM61

1,5

164

CM28

14,5

199

Đ16

LM62

7,5

165

CM29

200

Đ17

LM68

166

CM31

201

Đ18

LM78

167

CM32

202

Đ19

CK1

11,5

168

CM33

16,5

203

Đ20

CK2

169

CM34

204

Đ21

CK3

170

CM35

205

Đ22

CK4

100

171

CM36

206

Đ23

CK6

101

172

CM38

6,5

207

Đ24

CK8

102

16,5

173

CM39

208

Đ25

16,5

CK11

103

174

CM40

209

Đ26

CK12

104

175

CM41

210

Đ28

CK14

105

Kí hiệu

D-d

STT

chủng

(mm)

L52

10,5

L57

2,5

L58

1,5

L59

11,5

L61

L62

L63

L64

L65

L66

L67

L69

L70

LM1

LM2

LM5

16,5

LM6

LM8

LM9

LM10

Kí hiệu

D-d

STT

chủng

(mm)

Đ29

211

Đ31

212

Đ33

213

8,5

Đ34

214

Đ35

215

Đ36

216

Đ37

217

Đ39

218

LM11

Đ41

219

Đ42

220

Đ43

221

5,5

Đ44

222

Đ45

223

2,5

Đ46

224

Đ47

225

Đ48

226

Đ51

227

LM12

LM13

LM16

Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân

LM18

17,5

Kí hi

LM21

STT

chủng

LM22

16,5

106

CK15

LM23

107

CK16

LM24

9,5

108

CK17

LM25

109

CK18

LM26

110

CK19

LM28

16,5

111

CK20

LM29

112

CK21

LM30

113

CK22

LM31

114

CK23

115

CK24

116

CK25

117

CK26

118

CK27

119

CK28

120

CK29

121

CK30

Kí hiệu

D-d

122

CK31

Kí hiệu

D-d

STT

chủng

(mm)

123

CK32

chủng

(mm)

Đ52

228

124

CK33

ĐS19

245

Đ53

229

125

CK34

ĐS20

246

Đ54

230

126

CK35

ĐS21

247

7,5

Đ55

231

127

CK36

ĐS24

248

Đ56

232

128

CK38

ĐS25

249

Đ58

233

129

CK39

ĐS26

250

Đ61

234

130

CK40

ĐS28

251

Đ64

235

131

CK41

ĐS29

252

ĐS2

236

132

CK4

ĐS30

253

ĐS4

237

133

CK43

ĐS32

15,5

254

ĐS5

238

134

CK44

ĐS33

14,5

255

ĐS8

239

135

CK46

ĐS34

256

ĐS9

240

136

CK47

ĐS36

257

ĐS14

241

137

CK48

ĐS39

258

ĐS15

242

138

CK49

ĐS42

259

ĐS17

243

139

CK51

ĐS43

260

7,5

ĐS18

244

140

CK52

ĐS50

261

lập (tiếp theo)

Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân lập (tiếp theo)

- Trong đó:

+ Số chủng trên lá là : 96/261 chiếm 36,8%

+ Số chủng trên cành là : 94/261 chiếm 36%

+ Số chủng trên đất là : 71/261 chiếm 27,2%

Từ bảng 3.2 cho thấy các chủng NS ở RNM cần Giờ có khả năng sinh enzym amylase khá

cao (261/409) chiếm 63,81% số chủng NS phân lập được. Phần lớn các chủng này tập trung ở lá

chiếm 36,8% và cành chiếm 36% . Do nguồn thức ăn chủ yếu của NS sinh amylase là tinh bột - sản

phẩm chuyển hóa của quá trình quang hợp, nên các VSV sinh amylase tập trung ở lá và cành nhiều

hơn.

Kết quả này cũng cho thấy số lượng chủng NS ở RNM Cần Giờ có hoạt tính amylase mạnh

đến khá mạnh chiếm tỉ lệ ít (1,15%), trong khi đó tỉ lệ các chủng có hoạt tính yếu chiếm rất cao

(59,77%). Kết quả này trùng hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương (2009) về khả năng

sinh amylase các chủng NS phân lập được từ RNM [15].

Sở dĩ như vậy, là vì nguồn cơ chất tinh bột ở RNM chiếm một tỉ lệ rất nhỏ so với lượng chất

hữu cơ giàu cellulose và chitine. Đồng thời, quá trình phân giải các hợp chất chứa tinh bột trong tự

nhiên diễn ra chậm. Do đó, quá trình phân giải các chất trong MT không chỉ dựa vào hệ NS mà còn

có sự tham gia của nhiều VSV khác như VK, xạ khuẩn.

Trong 261/409 chủng NS sinh enzym amylase, chúng tôi bước đầu chọn 10 chủng có hiệu số

D-d (mm) cao nhất để tiếp tục nghiên cứu (xem bảng 3.3)

Bảng 3.3: 10 chủng NS có khả năng sinh amylase cao

Kí hiệu

Nguồn gốc phân

D-d

STT

lập

(mm)

chủng

L45

Lá vàng

19,5

LM23

Lá mục

LM53

Lá mục

18,5

LM54

Lá mục

CK11

Cành khô

CM8

Cành mục

CM10

Cành mục

CM26

Cành mục

Đ10

Đất mặt

20,5

Đ56

Đất mặt

(Số liệu rút ra từ bảng 3.2 và phụ lục 1)

 Tuyển chọn lần 2

Để đánh giá chính xác khả năng sinh enzym amylase của 10 chủng làm cơ sở cho sự tuyển

chọn tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ α – amylase theo phương pháp Heinken trong

phần 2.3.3.1 và xác định lượng đường khử trong phần 2.3.3.2 Kết quả trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4. Hoạt độ α – amylase và lượng đường khử của 10 chủng NS (đơn vị IU/g)

Hoạt độ α- Kí hiệu Nguồn gốc D-d Hoạt độ STT chủng phân lập (mm) Glucoamylase (UI/g) amylase (UI/g)

1 L45 Lá vàng 19,5 42.628 273.467

2 LM23 Lá mục 18 49.038 380.800

3 LM53 Lá mục 18,5 79.487 1015.467

4 LM54 Lá mục 18 39.423 866.133

5 CK11 Cành khô 23 34.615 516.133

6 CM8 Cành mục 21 76.282 264.133

7 CM10 Cành mục 19 53.846 418.133

8 CM26 Cành mục 18 73.077 492.800

9 Đ10 Đất mặt 20,5 166.026 1164.800

Đ56 Đất mặt 19 268.590 10 1612.800

Qua bảng 3.4 cho thấy kết quả định tính và định lượng enzym amylase của 10 chủng NS thu

được có sự khác biệt. Đó là, khi khảo sát khả năng sinh amylase các chủng tập trung nhiều ở lá và

thân nhưng chủng có hoạt độ amylase cao lại là chủng ở đất (Chủng Đ10, Đ56). Theo chúng tôi, có

thể bào tử của các chủng NS có khả năng sinh amylase từ lá, thân đã phát tán ra MT và rơi xuống

đất.

Mặc khác, khi nuôi NS trong MT xốp chứa cơ chất cảm ứng, có nguồn gốc tự nhiên dễ làm

phát huy khả năng sinh amylase tối đa của một số chủng NS.

Đồ thị 3.1. Hoạt độ α- amylase của 10 chủng NS Cuối cùng, hai chủng NS đều có nguồn gốc từ đất mặt và đều có họat độ α-amylase,

glucoamylase cao nhất nên được chúng tôi lựa chọn để nghiên cứu tiếp theo đó là chủng Đ10 và

Kết quả được minh họa Đ56.

thị 3.1 và 3.2 bằng đồ

Đồ thị 3.2. Hoạt độ glucoamylase của10 chủng NS

3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và phân loại hai chủng NS

3.2.1. Phân loại NS đến chi

 Chủng Đ10: Sau 3 ngày nuôi cấy trên MT Czapek Dox cải tiến và môi trường YEA ở nhiệt độ

300C, KL đạt đường kính 9mm. KL có dạng tròn, bột rời, bề mặt KL nhung mịn.

Chủng Đ10

Mặt trước

Mặt sau

Hinh 3.1. Hình thái đại thể và vi thể chủng Đ10

Sau 5 ngày nuôi cấy đường kính đạt 16,5mm; KL có viền màu trắng, bên trong có màu xanh

đậm, không tiết sắc tố vào MT. Bào tử trần hình cầu, có màu trong đến xanh nhạt.

Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái đại thể, vi thể và phân loại đến chi của hai chủng NS

Đặc điểm hình thái 2 chủng NS Đặc điểm phân loại tương ứng

nghiên cứu theo Bùi Xuân Đồng (2004)

- Hình thái đại thể: KL tròn, nhung -Hình thái đại thể: KL

mịn, bột rời. Màu xanh đậm, mép viền tròn, dạng nhung mịn trắng, mặt trái có màu trắng. Không có hay bột rời. Hệ sợi nấm

s u l l i g r e p s A

0 1 Đ g n ủ h C

giọt tiết và sắc tố (Hình 3.1) gồm các sợi có vách - Hình thái vi thể: Sợi nấm ngăn vách. ngăn, phân nhánh, không

Cuống sinh bào tử không phân nhánh, màu hay màu nhạt.

khối bào tử trần, hình cầu nhẵn -Hình thái vi thể: Khối

- Hình thái đại thể: KL tròn, bề mặt bào tử trần, đỉnh bọng có

trơn, nhung mịn, có màu nâu nhạt, mặt hình cột, giá bào trần hay

trái màu vàng nhạt, tiết sắc tố màu nâu ráp. Bọng đỉnh giá hình

cam vào MT. (Hình 3.2) chùy hay chỉ thể bình.

- Hình thái vi thể: Khối bào tử trần, Bào từ hình cầu hay elip,

6 5 Đ g n ủ h C

đỉnh bọng hình hoa cúc, cuống bào tử nhẵn, ráp hay mịn

không phân nhánh, đầu phình to thành

bọng ngắn, bào tử trần hình cầu nhẵn.

 Chủng Đ56:

Sau 3 ngày nuôi cấy trên MT Czapek Dox cải tiến và môi trường YEA ở nhiệt độ 300C, KL

đạt đường kính 16mm. KL có dạng tròn, bột rời, bề mặt KL nhung mịn. sau 5 ngày nuôi cấy đường

kính đạt 40,5mm; KL có viền màu trắng, bên trong có màu nâu đỏ, tiết sắc tố màu cam nâu vào MT.

Hệ sợi màu trắng, cuống bào tử không phân nhánh, đầu phình to thành bọng ngắn, đỉnh bọng

Chủng Đ56

hình hoa cúc, bào tử trần, hình cầu, nhẵn.

Khuẩn ty

Bào tử

Hinh 3.2. Hình thái đại thể và vi thể chủng Đ56

Mặt trước Mặt sau

3.2.2. Phân loại NS đến loài bằng kĩ thuật di truyền phân tử (PCR)

Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành định danh đến loài hai chủng nấm tại NK – Biotek (Công

ty Nam Khoa)

 Kết quả xác định trình tự gen của chủng Đ10

Sau khi tiến hành so sánh, đối chiếu với trình tự gen phân loại của loài này trên ngân hàng

NCBI, độ trùng khớp là 258/258 (100%). Từ đó kết luận chủng Đ10 có tên loài là Aspergillus

protuberus (Phụ lục 19 )

 Kết quả xác định trình tự gen của chủng Đ10

Sau khi tiến hành so sánh, đối chiếu với trình tự gen phân loại của loài này trên ngân hàng

NCBI, độ trùng khớp là 257/258 (99%). Từ đó kết luận chủng Đ56 có tên loài là Aspergillus terreus

(Phụ lục 20).

3.3. Khảo sát một số yếu MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của NS

3.3.1. Khảo sát thời gian sinh trưởng của hai chủng NS

Mỗi chủng NS có sự sinh trưởng và phát triển ở những thời gian khác nhau. Chúng tôi tiến

hành cấy 2 chủng NS tuyển chọn vào MT1, mỗi ngày đo đường kính KL từ ngày thứ 1, 2, 3, 4, 5, 6,

7. Thực hiện theo phương pháp 2.3.3.4 để khảo sát thời gian sinh trưởng của chúng. Kết quả trình

bày ở bảng 3.6 và đồ thị 3.3

Bảng 3.6. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng của hai chủng NS

1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày)

Chủng Đường kính khuẩn lạc (mm)

1,4

4,5

8,7

16,2 16,8

A. protuberus

3,2

9,1

15,5 27,5 40,1 40,5

A. terreus

Từ bảng 3.6 cho thấy từ ngày 1-5 hai chủng NS nghiên cứu có KL lớn dần theo thời gian,

trong đó chủng A. protuberus có tốc độ sinh trưởng chậm, đến ngày thứ 5 là giai đoạn hình thành

bảo tử thì sự sinh trưởng của chủng này chậm lại hẳn và kích thước KL nhỏ.

Chủng A. terreus có tốc độ sinh trưởng rất mạnh và nhanh, tạo KL có kích thước lớn song

đến ngày thứ 7 thì sự sinh trưởng cũng chậm dần, do thời gian này bắt đầu sinh bào tử. Đây là điểm

đặc trưng của nấm sợi RNM, vì nơi đây điều kiện sống khắc nghiệt đã phần nào hạn chế sự sinh

trưởng của NS.

Trong khi đó, các chủng NS trên đất liền có thời gian sinh trưởng nhanh hơn, chỉ sau 3

ngày là có khả năng tạo bào tử. Còn các chủng NS ở RNM thì phải sau 5-7 ngày mới bắt đầu sinh

bào tử. Điều này cho thấy, điều kiện sống khắc nghiệt ở RNM cũng ảnh hưởng rất nhiều đến sự sinh

trưởng và phát triển của các chủng NS nói riêng và hệ SV tồn tại ở đây nói chung.

Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.3

Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng của hai chủng NS

3.3.2. Khảo sát nhiệt độ sinh trưởng của hai chủng NS

Để xác định khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn,

chúng tôi cấy các chủng NS trên MT2, sau khi ủ 3 ngày ở các nhiệt độ khác nhau, chúng tôi thu

được kết quả như bảng 3.7

Bảng 3.7. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS

250C

300C

350C

400C

450C

Chủng

Đường kính khuẩn lạc (mm)

Nhiệt độ

A. protuberus

A.terrus

Qua kết quả trên cho thấy, 2 chủng NS sinh trưởng tốt ở nhiệt độ dao động trong khoảng 35 – 400C và cao hơn nhiệt độ trung bình ở RNM Cần Giờ (30 - 320C). Có lẽ đây là những chủng NS có

khả năng thích nghi khá tốt với điều kiện sống nơi này nên sinh trưởng được với cả giới hạn nhiệt

độ cao hơn mức bình thường. Điều đó hoàn toàn phù hợp với nhận định của tác giả Nguyễn Thị Huệ, Từ Thị Hường (1997) [14] và nhiều tác giả khác cho rằng NS có nhiệt độ tối ưu 20 – 390C, và

có khả năng sống ở nhiệt độ cao hơn trong giới hạn cho phép. Từ đó, cho thấy 2 chủng NS tuyển

chọn có khả năng chịu nhiệt cao và thích nghi tốt với điều kiện sống ở RNM Cần Giờ.

Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.4 và hình 3.2

Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS

3.3.3. Khảo sát pH sinh trưởng của hai chủng NS

Để xác định pH thích hợp cho sự sinh trưởng của 2 chủng NS, chúng tôi tiến hành nuôi

chủng NS theo phương pháp ở phần 2.3.3.3. Sau khi ủ NS 5 ngày trên các MT có pH khác nhau và

mẫu đối chứng là MT1 pH 6,5. Kết quả xem ở bảng 3.8 và đồ thị 3.5

Chủng NS

Đường kính khuẩn lạc (mm)

Bảng 3.8. Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng của hai chủng NS

13,5

16,5

31,5

18,5

A. protuberus

A.terrus

Từ bảng trên cho thấy, 2 chủng NS có khả năng mọc tốt trong khoảng pH rất

rộng từ 3-8, nhưng pH thích hợp nhất cho sinh trưởng của 2 chủng là pH 5-6.

So sánh với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng pH đến một số chủng NS ở RNM Cần Giờ của

Khưu Phương Yến Anh (2007) [1] và Nguyễn Thị Lan Hương (2009) [15] thì pH thích hợp nhất

cho sinh trưởng đều nằm ở khoảng pH 6-7, nhưng tất cả các chủng NS ở RNM đều có phổ hoạt

động pH rất rộng 3-8.

Trong khi đó, pH của RNM Cần Giờ tại thời điểm thu mẫu là pH 7,02. Như vậy ta có thể kết

luận 2 chủng nấm A. protuberus và A. terreus thích nghi tốt với điều kiện MT của RNM Cần Giờ.

Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.5

Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của hai chủng NS

3.3.4. Khảo sát khả năng chịu mặn của hai chủng NS

Một đặc điểm nổi bật ở RNM Cần Giờ là hệ NS phải chịu tác động của nồng độ NaCl khá

cao. Để xác định khả năng sinh trưởng của 2 chủng NS nghiên cứu trong các nồng độ muối NaCl

khác nhau, chúng tôi nuôi cấy NS trên MT1 theo phương pháp 2.3.3.3 có nồng độ NaCl thay đổi từ

0-20%. Kết quả xem ở bảng 3.9

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng của hai chủng NS

0 1 3 5 10 20 Độ mặn (%)

Chủng NS Đường kính khuẩn lạc (mm)

A. protuberus

A. terreus

Từ bảng 3.9 cho thấy 2 chủng NS tuyển chọn đều có khả năng sinh trưởng tốt (d>10mm) trên

MT nước ngọt lẫn nước mặn.

Hai chủng này có thể sinh trưởng ở độ mặn 10-20%, tuy nhiên A. protuberus chỉ chịu được

độ mặn cao nhất ở 3%, còn A. terreus chịu được độ mặn cao hơn từ 3-5%. Cả 2 chủng đều có nguồn

gốc phân lập từ đất. Đây là các chi điển hình thường gặp ở đất liền (Tadayoshi I., Akira N.,

Tanichatoen and Leka M., 2001). Vì vậy, có thể chúng là các chủng NS du nhập, lâu dần thích ứng

với MT nước lợ trong RNM Cần Giờ nên không phải là NS ưa mặn vì các nấm biển ưa mặn thường

có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn (Nguyễn Hoàng Trí, 1999) [36]

Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với quan điểm của Mai Thị Hằng và cộng sự (2001) [10],

[12]; Nguyễn Thị Lan Hương (2009) [15] khi khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng NS, và kết

luận hầu hết đây là các chủng du nhập từ đất liền.

Khả năng chịu mặn của các chủng NS cho thấy chúng là những VSV thường trú của RNM,

thậm chí ngay cả khi triều rút đất bị phơi nắng và trở nên mặn hơn. Chúng là tác nhân không thể

thiếu và rất quan trọng của hệ sinh thái RNM.

3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng nguồn Cacbon đến sự sinh trưởng của hai chủng NS

Cacbon có vai trò kích thích hoạt động của VSV và cung cấp môi trường thuận lợi hơn để

VSV tổng hợp enzyme rồi tích lũy nó trong đất của RNM (Dinesh et al., 1998). Nuôi cấy 2 chủng NS

tuyển chọn lên MT1, thay glucose bằng các nguồn cacbon khác nhau để khảo sát khả năng đồng hóa

cacbon của chúng. Sau thời gian ủ 5 ngày, tiến hành đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm bằng

cách đo đường kính KL d (mm). Kết quả trình bày ở bảng 3.10

Bảng 3.10. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của hai chủng NS

8,3

9,7

6,9

8,2

10,2

7,1

17,4

12,1

11,2

6,2

Lactose Sucrose Maltose Sorbitol Galactose Glucose Nguồn cacbon Chủng NS Đường kính khuẩn lạc (mm)

A. protuberus A. terreus

Kết quả cho thấy cả hai chủng NS đều có khả năng sinh trưởng trên các nguồn cacbon khác

nhau. Tuy nhiên chúng sinh trưởng yếu, chỉ có A. terreus có khả năng sinh trưởng khá tốt trên

nguồn cacbon sucrose (d=17,4mm). So với nuôi trên MT1 làm đối chứng có chứa nguồn cacbon là

glucose cho thấy chúng sinh trưởng mạnh hơn hẳn. Sở dĩ, có sự khác nhau này do glucose là nguồn

cacbon dễ đồng hóa nhất của hầu hết các VSV. Ngoài ra, giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của

Hình 3.4. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng A. protuberus

NS còn phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần hóa học của nguồn cacbon, tùy vào từng chủng NS.

Hình 3.5. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng A. terreus

3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hai chủng NS

NS cũng như tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ để xây dựng tế bào. Tuy nhiên, mỗi

loại NS lại hấp thụ được những nguồn nitơ khác nhau. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đồng

hóa các nguồn thức ăn nitơ khác nhau của 2 chủng NS tuyển chọn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.

Bảng 3.11. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của hai chủng NS

Nguồn nitơ Bột đậu Cao thịt Casein Ure NH4NO3 NaNO3 nành

13,4

11,8

10,1

9,1

10,8

Chủng NS Đường kính khuẩn lạc (mm)

A. protuberus A. terreus 12,3 38,5 15,7 7,2 12,7 31

Kết quả cho thấy cả hai chủng NS đểu có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ

khác nhau. Trong đó, mỗi chủng có sự sinh trưởng khác nhau theo từng loại nitơ. Sở dĩ có sự khác

nhau này là do giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của NS phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần

hóa học của từng loại nitơ và tùy vào từng chủng NS.

Với chủng A. protuberus sinh trưởng mạnh ở bột đậu nành (d=13,4mm), còn

chủng A. terreus lại sinh trưởng rất mạnh ở nguồn nitơ cao thịt (d=38,5mm). Một

điều dễ nhận ra là cả 2 chủng NS đều sử dụng nguồn nitơ hữu cơ dễ hấp thụ. Nguồn nitơ ở đây là

các hợp chất protein vừa làm nguồn N và nguồn C, đồng thời còn cũng cấp các chất sinh trưởng cần

thiết cho sự tổng hợp các sản phẩm và hệ enzym để tiến hành các phản ứng sinh hóa theo hướng có

lợi (Nguyễn Đức Phẩm, 2004) [26].

Ở lô đối chứng với nguồn nitơ NaNO3 cho thấy 2 chủng NS này phát triển khá tốt vì đây là

nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với hầu hết các chủng NS.

Hình 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của 2 chủng NS

RNM Cần Giờ là nơi có nhiều xác động thực vật phân hủy, là nguồn cung cấp thức ăn nitơ

cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng NS.

 Tổng hợp kết quả nghiên cứu từ mục 3.3.1 đến mục 3.3.6 chúng tôi có thể rút ra những điều kiện

ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của 2 chủng NS là:

Các yếu tố

Nhiệt độ A. protuberus 350C A. terreus 400C

pH 5 - 6 5 - 6

Độ mặn 3% 3 - 5%

Nguồn cacbon Galactose Sucrose

Nguồn nitơ Bột đậu Cao thịt

Hai chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ thích nghi rất tốt với điều kiện MT khắc nghiệt nơi

đây: chịu được ảnh hưởng của biên độ nhiệt cao, thích ứng lâu dài với MT nước lợ trong RNM.

Chúng là các VSV chịu mặn tùy tiện; có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon và nitơ khác nhau

nên tham gia vào vòng tuần hoàn vật chất, khép kín chu trình sinh địa hóa, duy trì sự cân bằng sinh

thái nơi này.

3.4. Ảnh hưởng các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS

3.4.1. Tuyển chọn MT bán rắn thích hợp

Tiến hành tuyển chọn MT bán rắn thích hợp dựa trên đặc điểm của 2 chủng NS nghiên cứu

từ một số MT bán rắn sau:

Bảng 3.12: Khảo sát khả năng sinh amylase trên một số MT bán rắn

A. protuberus A. terreus Môi trường α-amylase glucoamylase glucoamylase α-amylase 1268,810 273,253 311,612 1339,713

214,532 644,754 252,563 745,246

233,182 648,852 153,346 813,244

167,308 723,244 189,359 1070,131

185,567 459,689 242,799 578,765 MT11 MT12 MT13 MT14 MT15

Hầu hết các MT tuyển chọn đều chứa hàm lượng tinh bột cao, nhưng có các

thành phần khác nhau. Tùy vào tính đặc điểm sinh học của từng chủng mà thích hợp

với những MT khác nhau. Từ số liệu của bảng 3.12, ta thấy trên MT11 hai chủng

NS tuyển chọn cho hoạt độ amylase cao nhất. Trên cơ sở đó ta chọn MT này sử dụng chung trong

các khảo sát về khả năng sinh amylase ở các điều kiện khác nhau.

3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS

Thí nghiệm nhằm mục đích xác định thời gian nuôi cấy để thu nhận enzym amylase có hoạt

độ cao nhất. Quá trình nuôi cấy hai chủng NS được thực hiện trên MT11 theo mục 2.3.4. Chúng tôi

tiến hành khảo sát hoạt độ hệ enzym thủy phân tại các thời điểm nuôi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60

giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ, 108 giờ với các điều kiện nuôi cấy như sau:

- Nhiệt độ 300C

- Khối lượng canh trường là 15g/một erlen - Lượng giống cho vào canh trường: 105 – 106 bào tử/1g MT

- Độ ẩm 50 - 60%

- Pha loãng dịch chiết enzym 100 lần trước khi đem xác định hoạt độ amylase theo mục 2.3.3

Tiến hành thí nghiệm theo mục 2.3.4, kết quả được trình bày trong bảng 3.13

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ hai loại amylase của 2 chủng NS

Hoạt độ amylase (UI/g)

Thời gian (h) A. protuberus A. terreus

α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase

24 77,35 192,58 209,29 52,58

36 85,36 475,69 216,77 130,36

858,36 408,55 774,36 48 196,47

189,53 60 1301,69 416,56 1787,02

72 185,26 1010,80 369,02 1412,13

84 172,97 912,80 366,88 995,24

96 159,62 864,58 365,28 816,36

108 140,92 779,02 361,54 740,13

Kết quả cho thấy, hai chủng nấm sợi RNM đều có hoạt độ amylase tăng dần từ 24-48 giờ

theo thời gian, sau đó đạt cực đại ở 60 giờ và giảm dần từ 60-108 giờ.

Chủng A. protuberus có thời gian nuôi cấy thích hợp giao động từ 48-60 giờ với hoạt độ a-

amylase là 196,47 UI/g canh trường ở 48 giờ; hoạt độ glucoamylase là 1302,69 UI/g canh trường ở

60 giờ.

A. terreus có thời gian nuôi cấy thích hợp là 60 giờ với hoạt độ a-amylase là 416,56 UI/g

canh trường; hoạt độ glucoamylase là 1787,02 UI/g canh trường.

Như vậy, thời gian sinh enzym của A. terreus chậm hơn A. protuberus. Căn cứ vào mục 3.3.1

khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của 2 chủng NS ta thấy điều này là hợp lí vì

chủng A. protuberus tạo bào tử sớm hơn chủng A. terreus mà để thu nhận enzym có hoạt độ cao

nhất, người ta thường ta chọn nấm mốc ở giai đoạn mới bắt đầu tạo bào tử. Ở giai đoạn bào tử đã

già thì hoạt độ enzym giảm mạnh.

Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α-amylase 2chủng NS

Đồ thị 3.8: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ glucoamylase 2 chủng NS

3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS

Sau khi xác định được thời gian nuôi cấy NS để thu nhận amylase có hoạt độ cao nhất.

Chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS theo thời

gian trên. Quá trình nuôi cấy hai chủng NS được thực hiện trên MT11 theo mục 2.3.4. Kết quả được

trình bảy trong bảng 3.14

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ amylase hai chủng NS

Hoạt độ amylase (UI/g)

Nhiệt độ (0C) A. protuberus A. terreus

α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase

203,953 268,800 208,761 439,911 25

212,500 674,800 231,731 477,244 30

733,911 241,346 813,244 253,632 35

217,308 1163,244 249,359 1180,133 40

66,667 419,689 232,799 681,022 45

Từ bảng 3.14 ta thấy chủng A. protuberus cho hoạt độ α-amylase cao ở nhiệt độ 350C và cho hoạt độ glucoamylase cao ở 400C. Còn chủng A. terreus ở nhiệt độ 400C cho hoạt độ 2 loại amylase

cao nhất.

Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ-amylase của 2 chủng NS

Đồ thị 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ glucoamylase hai chủng NS

Tuy nhiên, hai chủng NS ở RNM Cần Giờ có khả năng sinh trưởng tốt trong khoảng nhiệt độ từ 30 – 400C, cho nên chúng cũng tạo enzym có hoạt độ cao trong thời gian này là điều hợp lí, và có

thể đây cũng là nét đặc trưng của chủng NS sống ở RNM Cần Giờ (nơi có khí hậu cận xích đạo).

3.4.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS

Tiếp theo, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS theo

thời gian và nhiệt độ đã nghiên cứu ở trên trên. Quá trình nuôi cấy hai chủng NS được thực hiện

trên MT11 theo mục 2.3.4.

Dùng HCl 1N, NaOH 1N điều chỉnh pH về các độ pH 3, 4, 5, 6, 7, 8. Ly trích và đo hoạt độ 2

loại amylase, ta thu được kết quả theo bảng sau

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS

Hoạt độ amylase (UI/g)

pH A. protuberus A. terreus

α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase

566,132 1150,800 36,752 141,244 3

608,868 1241,022 394,124 1208,356 4

1284,578 435,256 1402,800 630,235 5

626,496 1314,133 470,513 1650,133 6

612,073 1115,022 458,226 937,689 7

591,239 1065,244 373,291 782,133 8

Ta thấy cả 2 chủng NS đều có khả năng sinh amylase trên phổ pH rộng từ 3-8. Với chủng A.

protuberus hoạt độ amylase cao ở các mức pH khác nhau và cao nhất ở pH = 5-6. Tuy nhiên, với

chủng A. terreus cho hoạt độ hai loại amylase thấp ở pH = 3, nguyên nhân do điều kiện pH thấp sẽ

làm bất hoạt amylase và làm cố định enzym này bên trong khuẩn ty NS, enzym không tiết ra ngoài

NS nên hoạt độ giảm.

Bên cạnh đó, pH sinh trưởng và pH cho hoạt độ amylase cao đều nằm trong khoảng 5-6.

Chứng tỏ 2 chủng NS tuyển chọn đều sinh trưởng tốt và sinh enzym tốt ở MT hơi nghiêng về axit,

là MT thích hợp để amylase có hoạt độ cao. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Forgaty W. M

và Kelly C.T. (1990) là các chủng NS sinh a-amylase thường cao trong khoảng pH 5,5- 6,5.

Đồ thị 3.11: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ α-amylase 2 chủng NS

Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ glucoamylase 2 chủng NS

Khi pH tăng lên trung tính hoặc kiềm thì hoạt độ amylase giảm dần, nhưng 2 chủng NS vẫn

có khả năng sinh amylase. Điều này, chứng tỏ 2 chủng NS này thích nghi rất tốt với điều kiện ở

RNM Cần Giờ vì pH của RNM tại lúc thu mẫu là 7,02.

3.4.5. Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS

Độ ẩm là yếu tố có ảnh hưởng quan trọng đối với sự lên men bề mặt thu enzym từ NS. Nếu

MT nuôi cấy quá khô sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của NS. Ngược lại, nếu độ

ẩm quá cao thì sẽ gây ức chế sinh trưởng NS vì làm giảm độ thoáng khí của MT và hoạt độ amylase

cũng giảm. Tiến hành nuôi cấy 2 chủng:

o A. protuberus ở nhiệt độ 350C, pH 6 o A. terreus ở nhiệt độ 400C, pH 6

Điều chỉnh độ ẩm MT bằng nước biển vô trùng về các độ ẩm 50%. 55%, 60%, 65%, 70%.

Sau 36 – 48 nuôi cấy NS, đo hoạt độ hai loại amylase. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.16

Bảng 3.16: Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS

Hoạt độ amylase (UI/g)

Độ ẩm (%) A. protuberus A. terreus

α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase

199,145 197,244 289,957 214,356 50%

252,030 268,800 318,803 422,800 55%

257,906 429,022 335,897 452,356 60%

292,094 732,356 351,923 517,689 65%

280,876 618,800 338,034 455,467

70%

Hoạt độ α-amylase và glucoamylase tăng dần trong điều kiện MT có độ ẩm từ 50 - 65%,

giảm dần ở 70% và đạt giá trị cao nhất ở độ ẩm 65%. Đây cũng là độ ẩm thích hợp nhất cho sự sinh

trưởng của chúng và cũng là độ ẩm thường thấy ở RNM Cần Giờ. Chúng tôi cho rằng hai chủng NS

này dần dần thích nghi nên sinh trưởng và sinh enzym tốt trong điều kiện sống ở Cần Giờ.

Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Lê Văn Nhương (2009)

cho rằng: “Khả năng tích tụ enzym của những loài NS trên MT cám sẽ thuận lợi nhất khi độ ẩm

nguyên liệu khoảng 65 – 68%” [21].

Đồ thị 3.13: Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ α-amylase 2 chủng NS

Đồ thị 3.14: Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ glucoamylase hai chủng NS

3.4.6. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS

Một đặc điểm nổi bật ở RNM Cần Giờ là hệ NS phải chịu tác động của nồng độ muối NaCl

khá cao. Vì vậy, để khảo sát ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ amylase, chúng tôi nuôi cấy NS

trên MT11 theo phương pháp 2.3.3.5 có nồng độ NaCl từ 0 - 20%.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.17

Bảng 3.17: Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ amylase 2 chủng NS

Hoạt độ amylase (UI/g) Độ mặn (%) A. protuberus A. terreus

α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase

132,372 183,244 110,133 0% 203,953

138,782 242,356 163,022 1% 285,150

191,132 254,800 432,133 3% 323,611

272,863 207,692 481,911 533,244 5%

133,974 167,689 500,578 10% 153,739

50,641 149,022 131,911 20% 93,910

Kết quả cho thấy cả hai chủng NS đều có khả năng sinh amylase ở các nồng độ muối từ 0 –

20 %. Điều này chứng tỏ, đây là chủng nấm du nhập từ đất liền vào RNM Cần Giờ và rất thích nghi

với điều kiện sống tại đây.

Chúng là các chủng NS có khả năng chịu mặn cao, A. protuberus sinh enzym cao ở nồng độ

muối 3 - 5%; A. terreus sinh enzym cao ở nồng độ 5%, đặc biệt hoạt độ glucoamylase giảm rất

chậm ở 10%. Kết quả này, là hoàn toàn hợp lí vì đây cũng là nồng độ muối thích hợp cho sinh

trưởng của hai chủng nấm đồng thời là độ mặn thường thấy tại RNM cần Giờ. Chính điều kiện ngập

mặn ở đây là một trong những yếu tố tác động đến sự hình thành những đặc điểm thích nghi chịu

mặn cho các chủng NS có nguồn gốc từ đất liền như A. protuberus và A. terreus.

Nhận định này của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan

Hương (2009) về khả năng chịu mặn của các NS sinh amylase tại RNM Cần Giờ.

Từ đó, có thể kết luận rằng điều kiện RNM Cần Giờ tuy rất khắc nghiệt, nhưng nó chứa đựng

đầy đủ các yếu tố thuận lợi cần cho sinh trưởng và phát triển, giúp các NS khi du nhập vào đây vẫn

có thể tồn tại, thích nghi tốt.

Đồ thị 3.15. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ α-amylase của 2 chủng NS

Đồ thị 3.16. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

3.5. Sự biến thiên hoạt độ amylase theo thời gian

Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ amylase của 2 chủng nấm sợi ở RNM.

Chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng NS này trong những điều kiện tối ưu đã nghiên cứu, để xác định

lại thời điểm thu amylase tốt nhất của chúng.

 Chủng A. protuberus

- Nhiệt độ thu α-amylase là 350C, glucoamylase 400C

- Độ mặn là 3-5%

- Độ ẩm 65%

- pH 5-6

 Chủng A. terreus

- Nhiệt độ thu α-amylase và glucoamylase 400C

- Độ mặn là 5%

- Độ ẩm 65%

- pH 6

Kết quả được trình bày ở bảng 3.18 và minh họa bằng đồ thị 3.17 và 3.18

Bảng 3.18. Sự biến thiên hoạt độ amylase của 2 chủng NS theo thời gian

Kết quả Hoạt độ amylase (UI/g) Thời

bảng 3.18 cho A. protuberus A. terreus gian

thấy chủng A. (giờ) α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase

protuberus 24 172,970 382,356 182,585 575,244

cho hoạt độ 36 244,017 688,800 236,004 618,800

hai loại 1035,689 249,359 998,356 48 297,970 amylase có 250,427 1057,467 60 1206,800 267,521 giá trị cao tại 240,812 791,467 227,457 72 1286,133 thời điểm 48 – 84 230,128 663,911 199,145 659,467 60 giờ, trùng 96 203,953 303,022 191,132 511,911 với thời gian

lúc khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ amylase. Như vậy, đối với chủng A. protuberus

khả năng sinh tổng hợp amylase khá ổn định, ít bị thay đổi theo thời gian từ 24 – 96 giờ. Đây là kiểu

gen đáng quý mà chúng ta cần nghiên cứu thêm.

Chủng A. terreus cho hoạt độ α-amylase cao ở 60 giờ và hoạt độ glucoamylase cao ở 72 giờ.

Kết quả này thay đổi so với kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ amylase. Điều

này được giải thích như sau: khi tập trung các điều kiện tối ưu lại thì các yếu tố MT sẽ tác động

đồng thời lên chủng A. terreus làm thời gian cho hoạt độ α-amylase và glucoamylase tăng lên.

Đồ thị 3.17: Sự biến thiên hoạt độ α-amylase và glucoamylase theo thời gian

của chủng A. protuberus

Trước tối ưu (20,5mm)

Sau tối ưu (26mm)

Đồ thị 3.18: Sự biến thiên hoạt độ α-amylase và glucoamylase theo thời gian

của chủng A. terreus

Kết luận

Kết quả trên khẳng định lại một lần nữa thời điểm tốt nhất để thu mỗi loại enzym của từng

chủng như sau

 Chủng A. protuberus: Thời gian thu α-amylase tốt nhất ở 48 giờ

Thời gian thu glucoamylase tốt nhất ở 60 giờ.

 Chủng A. terreus: Thời gian thu α-amylase tốt nhất ở 60 giờ

Thời gian thu glucoamylase tốt nhất ở 72 giờ.

3.6. So sánh khả năng sinh amylase của hai chủng tuyển chọn trước và sau khi tối ưu.

Chúng tôi tiến hành thu enzym của hai chủng tuyển chọn ở điều kiện tối ưu, tiến hành các

phản ứng đường hóa và dextrin hóa của hai chủng này ở điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu. So sánh kết

quả trước và sau khi tối ưu để đánh giá hiệu quả của quá trình tối ưu hóa.

Bảng 19. Khả năng sinh amylase của hai chủng NS trước và sau khi tối ưu hóa

α-amylase(UI/g) Glucoamylase(UI/g) Chủng Trước khi tối ưu Sau khi tối ưu Trước khi tối ưu Sau khi tối ưu

A. protuberus 166,026 1164,800 426,496 1324,433

A.terrus 268.590 1612.800 767,521 2961,214

Đối với A. protuberus sau khi tối ưu, khả năng sinh α-amylase tăng 626,496/166,026 = 2,7

lần; còn khả năng sinh glucoamylase tăng 1324,433/1164,800 = 1,14 lần.

Đối với A.terreus, kết quả sau khi tối ưu, khả năng sinh α-amylase tăng 767,521/268,590 =

2,9 lần; còn khả năng sinh glucoamylase tăng 2961,214/1612,800 = 1,8 lần.

Hình 3.7: Đường kính khuẩn lạc chủng A. protuberus trước và sau khi tối ưu hóa

Như vậy, sau khi tiến hành tối ưu một số yếu tố MT và điều kiện nuôi cấy, hoạt tính amylase

của hai chủng tuyển chọn có phần tăng đáng kể.

3.7. So sánh chế phẩm enzym amylase của các chủng tuyển chọn với enzym đang lưu hành

trên thị trường.

Chế phẩm amylase của Viện sinh học Nhiệt đới được pha loãng tới 2000 lần trước khi đo

hoạt độ. Kết quả thể hiện ở bảng sau

Bảng 3.20: So sánh hoạt độ enzym của chế phẩm thô thu được với chế phẩm amylase của Viện sinh

học nhiệt đới

Hoạt độ enzym Nguồn gốc chế phẩm α-amylase(UI/g) Glucoamylase(UI/g)

539,957 4290,222 A. protuberus

635,577 4321,333 A.terreus

Chế phẩm amylase (VSHNĐ) 6514,957 229848,889

Kết quả trên cho thấy chế phẩm enzym bán tinh khiết thu được có hoạt độ enzym rất thấp so

với enzym của Viện sinh học Nhiệt đới. Khả năng dịch hóa của chế phẩm này cao gấp 10 – 12 lần

và khả năng đường hóa cao gấp 53 – 54 lần so với chế phẩm enzym bán tinh khiết thu được từ hai

chủng NS tuyển chọn.

Sự chênh lệch về hoạt độ α-amylase và glucoamylase giữa chế phẩm enzym bán tinh khiết từ

hai chủng NS của chúng tôi với chế phẩm enzym đang được lưu hành trên thị trường là có thể chấp

nhận được vì:

- Chủng NS sinh amylase cao ở Viện sinh học Nhiệt đới là chủng đã được chọn lọc và cải tiến di

truyền, đáp ứng được yêu cầu công nghiệp trong sản xuất enzym. Hơn nữa, chế phẩm enzym tinh

khiết này được thu nhận từ các chủng NS và cả từ VK có hoạt tính amylase cao.

- Chủng NS phân lập của chúng tôi có nguồn gốc tự nhiên từ đất mặt ở RNM Cần Giờ, chưa trãi

qua quá trình nghiên cứu đột biến để nâng cao chất lượng giống. Ngoài ra, chế phẩm enzym thu

được từ chúng là chế phẩm bán tinh khiết nên hoạt độ còn hạn chế.

3.8. Các đặc tính sinh học khác

Để có thể hiểu được vai trò của các chủng NS tuyển chọn đối với hệ sinh thái

RNM Cần Giờ và khả năng ứng dụng thực tiễn, chúng tôi đã tìm hiểu một số hoạt

tính sinh học của các chủng vi nấm này.

 Khả năng sinh các enzym ngoại bào

Bên cạnh khả năng sinh amylase, hai chủng NS nghiên cứu còn có khả năng sinh các enzym

thủy phân ngoại bào khác. Kết quả được trình bày ở bảng 3.21

Bảng 3.21: Khả năng sinh enzym ngoại bào của hai chủng NS

Cellulase Protease Chitinase Pectinase Tên chủng (D-d)mm (D-d)mm (D-d)mm (D-d)mm

A. protuberus 2,0 17,0 14,0 27,0

A. terreus 19,0 4,0 12,0 24,0

Kết quả cho thấy khả năng sinh cả bốn loại enzym ngoại bào với mức độ khác nhau ở cả hai

chủng NS nghiên cứu. Đặc biệt, chủng A. protuberus sinh cellulase rất mạnh (27mm); chủng A.

terreus sinh chitinase rất mạnh (24mm). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với thực tiễn tại RNM Cần

Giờ với nguồn thức ăn dồi dào: lá thân cây, xác bã động vật cùng vỏ tôm, cua…

Hình3.8: Khả năng sinh enzym ngoại bào của hai chủng NS

Nhờ hệ enzym ngoại bào phong phú giúp phân giải tốt nguồn cơ chất nơi đây, các chủng NS

này là mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và góp phần khép kín chu trình sinh địa hóa của

RNM. Điều này cũng nhấn mạnh vai trò của NS đối với hệ sinh thái RNM Cần Giờ.

 Khả năng sinh KS

NS là một trong các nhóm VSV có tiềm năng sinh các chất hoạt tính sinh học quý, trong đó

có các chất kháng sinh với ý nghĩa thực tiễn cao (Conception and et., 2001). Trước tình hình VSV

gây bệnh nhờn thuốc trầm trọng như hiện nay (Amorbile-Cuevas and et., 1995; Kenneth), nhiều

biện pháp đang được nghiên cứu để chống lại sự nhờn thuốc của VSV gây bệnh. Một trong các biện

pháp hữu hiệu là tìm KS mới từ VSV trong tự nhiên. Đối tượng hấp dẫn lại chính là nấm trong

RNM và nấm biển (Conception, 2001 and et., Dave, 2000; www.aphios.com) vì các nhà nghiên cứu

tin rằng trong các MT sống đặc biệt này, con đường trao đổi chất của VSV sẽ khác các VSV trên

cạn, nên có thể hoạt tính KS sẽ khác hơn [11]. Chính vì vậy, chúng tôi thử khảo sát khả năng sinh

KS của hai chủng NS nghiên cứu. Kết quả như sau:

 Bảng 3.22 : Khả năng sinh KS của hai chủng NS

Hoạt tính đối kháng (D-d) mm Tên chủng E. coli (-) B. subtilis (+)

A. protuberus - -

24,0 26,0 A. terreus

Trong hai chủng NS nghiên cứu thì A. protuberus không có khả năng sinh KS, còn chủng A.

terrus có khả năng sinh KS kháng VK gram âm E. coli (-) với hoạt tính mạnh (D-d = 24 > 20mm)

và kháng VK gram dương (B. subtilis (+) Với hoạt tính rất mạnh (D-d = 26 >25 mm). Đây là một

đặc điểm rất đáng quan tâm của A. terreus, vì hầu hết các chủng nấm sợi ở RNM có hoạt tính KS

cao đều thuộc các chi Trichoderma, Penicillium, Cephalosporium, Paecilomyces.

Từ đó có thể cho thấy A. terreus là một chủng NS có tiềm năng trong ứng dụng, cần được

tiếp tục nghiên cứu sâu hơn. Các chủng NS góp phần đáng kể vào quá trình chuyển hóa các hợp

chất hữu cơ trong RNM và tham gia làm sạch MT bởi sự ô nhiễm VSV. Vì vậy cần có biện pháp

bảo quản và khảo sát thêm về khả năng sinh KS của chủng này.

Hình 3.9: Hoạt tính kháng E. coli, B. subtilis của 2 chủng NS

 Khả năng phân giải dầu

Một đặc tính quý khác của NS là chúng có thể sinh các enzym phân giải các chất độc hại

trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng trong phân tử. Hai chủng NS được

nuôi cấy trong MT10 và theo dõi sự phát triển của KL.

Kết quả cho thấy chỉ có A. terreus là có khả năng phát triển tốt trên MT10.

MT10 chứa nguồn cacbon duy nhất là dầu DO nên chủng A. terreus phát triển được, chứng

Đối chứng

Thực nghiệm

Hình 3.10. Khả năng phân giải dầu của hai chủng NS

tỏ chủng này có khả năng phân giải nguồn hydrat cacbon này.

Sau 15 ngày nuôi cấy, qua quan sát chúng tôi thấy bình MT chứa chủng A. protuberus vẫn

còn các giọt dầu, còn trong bình MT chứa chủng A. terreus đã hết giọt dầu, mùi dầu giảm đi đáng

kể, sinh khối tăng.

A.terreus là một chủng NS được phân lập từ đất RNM, nó có khả năng chịu mặn cao (5%), là

một trong những chi quen thuộc như Aspergillus, Penicillium, Fusarium…là những chủng đã được

thông báo có khả năng phân giải dầu tìm thấy ở những vùng sinh thái khác (Huy và cs., 2001; Philip

và Robert, 1994; Thảo và cs., 1997) [35]

Khả năng phân giải dầu của chủng A. terreus không chỉ có ý nghĩa rất lớn trong lưới thức ăn

của RNM cần Giờ mà còn là tác nhân tự nhiên góp phần làm sạch MT trước sự ô nhiễm dầu hàng

ngày, đặc biệt khi có sự cố tràn dầu. Chúng là những nguồn gen quý có triển vọng cho nghiên cứu

công nghệ bảo vệ môi trường RNM nói riêng và MT biển nói chung. Mẫu NS này đang được bảo

quản tại phòng thí nghiệm Vi sinh-Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh để tiếp tục

đánh giá và khai thác tiềm năng ứng dụng.

 Kết luận:

Qua khảo sát các đặc tính sinh học của 2 chủng nấm sợi ở RNM, ta thấy rằng cả 2 chủng A.

protuberus và A. terreus ngoài khả năng sinh amylase cao còn có khả năng sinh các loại enzym thủy

phân ngoại bào (cellulase, protease, chitinase, pectinase). Điều này có ý nghĩa quan trọng trong

RNM Cần Giờ, vì chúng là tác nhân tham gia tích cực vào quá trình phân giải các cơ chất lingo-

cellulose và chitin trong RNM, khép kín chu trình năng lượng của HST này.

Ngoài ra chủng A. terreus có khả năng sinh kháng sinh cao và khả năng phân giải dầu tốt và

với khả năng chịu mặn khá cao (5%), sẽ hứa hẹn nhiều nghiên cứu thú vị với hệ gen quý này.

Trên thế giới A. terreus là chủng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid hữu cơ

như acid itaconic và acid cis-acotinis; chứa thành phần statin có tác dụng làm giảm cholesteron, có

khả năng kháng nấm cao. Nhưng bên cạnh đó, A. terreus cũng sinh ra các độc tố như patulin và

citrinin gây nhiều mầm bệnh cho người và động vật [71], [72]. Vì vậy với chủng A. terrus thu được

từ RNM Cần Giờ

cần có những nghiên cứu sâu hơn để tìm hiểu thêm những đặc tính khác của chủng này.

Nguyên liệu

Xử lý nguyên

Hấp thanh trùng

Giống VSV

Nhân giống

Làm nguội

Trộn giống VSV

Giống cho sản

xuất

Nuôi cấy

Thu nhận phế

phẩm enzym thô

Nghiền mịn

Bảo quản

Chế phẩm enzym

thô đem sử dụng

 Tóm tắt qui trình nghiên cứu thu nhận amylase từ NS

Chương 4

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Qua các kết quả thí nghiệm, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:

1. Đã phân lập được 409 chủng NS khác nhau từ RNM Cần Giờ. Trong đó có 152 chủng phân lập

từ lá, 140 chủng phân lập từ thân cành và 117 chủng phân lập từ đất.

2. Xác định được 261/409 chủng có khả năng sinh amylase (chiếm 63,81%). Trong đó, chủng

sinh enzym mạnh (0%); khá mạnh (1,15%); trung bình (16,48%); yếu (59,77%). Bước đầu xác

định 10 chủng có hoạt tính amylase cao nhất. Kết quả khảo sát hoạt độ α-amylase,

glucoamylase cho phép chọn hai chủng tốt nhất là Đ10 và Đ56.

3. Kết quả định danh 2 chủng NS tuyển chọn bằng phương pháp di truyền phân tử đã xác định

được

o Chủng Đ10: Thuộc loài Aspergillus protuberus

o Chủng Đ56: Thuộc loài Aspergillus terreus

4. Đã xác định được điều kiện MT tối ưu cho sinh trưởng của hai chủng NS là: - A. protuberus: Có nhiệt độ ở 350C, pH = 6, độ mặn là 3%, có khả năng đồng hóa tốt nguồn

cacbon là galactose, và nguồn nitơ là bột đậu nành.

- A. terreus: Ở nhiệt độ 400C, pH = 4 và độ mặn dao động từ 3 – 5%; có khả năng đồng hóa tốt

nguồn cacbon là sucrose và nguồn nitơ là cao thịt.

5. Đã xác định được điều kiện tối ưu cho hoạt độ amylase của hai chủng NS là:

A. protuberus A. terreus Các điều kiện

α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase

35 40 40 tối ưu Nhiệt độ (0C)

5-6 6 pH

65 65 Độ ẩm (%)

3-5 5 Độ mặn (%)

Thời gian (giờ) 48 60 60 72

6. Kết quả so sánh hoạt độ amylase trước và sau khi tối ưu cho thấy: Đối với A. protuberus sau

khi tối ưu, khả năng sinh α-amylase tăng 2,7 lần; khả năng sinh glucoamylase tăng 1,14 lần;

Đối với A.terreus: khả năng sinh α-amylase tăng 2,9 lần; còn khả năng sinh glucoamylase tăng

1,8 lần.

7. Chế phẩm enzym amylase của Viện sinh học nhiệt đới có khả năng dịch hóa gấp 10 – 12 lần và

khả năng đường hóa cao gấp 53 – 54 lần so với chế phẩm enzym bán tinh khiết thu được từ hai

chủng NS tuyển chọn

8. Đã xác định được một số đặc điểm sinh học của hai chủng NS cho thấy chúng đều có khả năng

sinh 4 loại enzym ngoại bào là protease, cellulase, chitinase và pectinase. Đặc biệt chủng A. terreus có khả năng đối kháng rất mạnh với cả hai loại VSV kiểm định (G+, G-) là E.coli và B.

subtilis và có khả năng phân giải dầu tốt, hoạt tính cellulase rất cao và protease khá cao.

4.2. Đề nghị

Chúng tôi cho rằng chủng A. terreus là một trong những chủng NS có những phẩm chất rất

đặc biệt hơn hẳn hầu hết các chủng NS đã tuyển chọn và khảo sát trước đó ở RNM Cần Giờ. Chủng

này cần được bảo quản và tiếp tục đi sâu, nghiên cứu sớm có những ứng dụng tốt trong thực tiễn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulose của một số chủng

nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHSP Tp. Hồ Chí Minh, trang 27 – 32. 2. Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy (1998), Thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus sp., TC Công nghệ sinh học, số 1, tập 1, trang 101-108. 3. Trần Văn Ba, Phan Nguyên Hồng, Hoàng Thị Sản, Lê Thị Trễ, Nguyễn Hoàng Trí, Mai Sĩ Tuấn,

Lê Xuân Tuấn (1997), Vai trò của rừng ngập mặn Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

4. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chính, Ngô Đại Nghiệp (2004), Thực tập lớn sinh hóa, NXB Đại

học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.

5. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học, tập ba, enzyme và ứng

dụng, NXB Giáo dục.

6. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, NXB Khoa học Kỹ thuật, Tp.HCM. 7. Bùi Xuân Đồng, Hà Huy Kế (2004), Nguyên lý phóng chống nấm mốc và mycotoxin, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 8. Phan Thị Phương Hoa (2004), Nghiên cứu phân loại các chủng thuộc chị Aspergillus phân lập từ rừng ngập mặn Nam Định và Thái Bình, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Sư phạm Hà Nội 9. Mai Thị Hằng, Phan Nguyên Hồng (2002), Đánh giá vai trò của vi sinh vật trong hệ sinh thái

rừng ngập mặn, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, trang 5-15.

10. Mai Thị Hằng (2002), Tổng kết kết quả nghiên cứu về tính đa dạng và vai trò của nhóm nấm sợi

phân lập từ một số RNM ở hai tỉnh Nam Đinh và Thái Bình, Hội thảo khoa học lần thứ hai, Đánh

giá vai trò của VSV trong hệ sinh thái RNM, Đề tài cấp bộ - Mã số: B2001-75-03 TĐ, Trường Đại

học Sư phạm Hà Nội trang 86-97.

11. Mai Thị Hằng, Lê Thanh Huyền (2002), Khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng

của các chủng nấm sợi phân lập từ một số khu rừng ngập mặn Nam Định và Thái Bình, Hội thảo

khoa học lần thứ hai, Đánh giá vai trò của VSV trong hệ sinh thái RNM, Đề tài cấp bộ - Mã số:

B2001-75-03 TĐ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội trang 100-106.

12. Mai Thị Hằng, Trần Thị Thúy, Phạm Thị Phương Hoa, Phan Thị Trang (2001), Một số kết quả

nghiên cứu về các vi nấm hiếu khí phân lập từ các mẫu lấy ở rừng ngập mặn Giao Thủy, Nam Định,

Hội thảo Khoa học đề án EP-DRC/MERD năm 2001.

13. Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát họat tính một số hệ enzym thủy phân amylase,

cellulose, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ miền đông nam bộ, Luận văn Thạc sĩ

Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. HCM.

14. Nguyễn Thị Huệ, Từ Thị Hường (1997), Kỹ thuật kiểm nghiệm VSV và nấm trong thực phẩm,

Viện vệ sinh y tế công cộng – tài liệu nghiệp vụ, trang 35-39.

15. Nguyễn Thị Lan Hương (2009), Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số

chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHSP Tp.

HCM

16. Lê Duy Linh (chủ biên) (2001), Thực tập vi sinh cơ sở, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM

17. Nguyễn Thị Hồng Loan (2003), Nghiên cứu tận dụng bã khoai mì sản xuất chế phẩm amylase và

protease, Luận văm Thạc sĩ Khoa học Sinh học, Trường ĐH khoa học Tự nhiên Tp. HCM, trang 5 -

18. Nguyễn Đức Lượng (1996), Công nghệ vi sinh vật tập 1, 2, 3, NXB Đại học Quốc gia, Tp.

HCM.

19. Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ sinh học, NXB Đại học Quốc gia, Tp. HCM.

20. Nguyễn Đức Lượng (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập1, thí nghiệm hóa sinh học,

NXB Đại học quốc gia, Tp. HCM.

21. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia, Tp. HCM, tr. 228-308,

410-414

22. Đặng Vũ Hồng Miên, Bảng phân loại các loài nấm mốc thường gặp, trang 330 – 431

23. Lương Đức Phẩm (2006), Công nghệ sinh học trong bảo quản và chế biến thực phẩm, NXB

Nông nghiệp, trang 22,98-309

24. Lương Đức Phẩm (2005), Vi sinh vật học và an tòan vệ sinh thực phẩm, NXB Nông nghiệp, Hà

Nội, trang 26-34

25. Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, trang

282-287.

26. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội

27. Trần Minh Tâm (2000), Công nghệ vi sinh ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Tp. HCM.

28. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh.

29. Đồng Thị Thanh Thu (2003), Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM, trang 210-

218.

30. Trần Linh Thước (chủ biên) (2001), Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM

31. Đoàn Văn Thược (2005), Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh

amylaza trên bã sắn phế thải để sản xuất enzim cho chăn nuôi gia súc, Luận văn Thạc sĩ Sinh học,

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.

32. Phạm Thị Thanh Thúy (2007), Nghiên cứu khả năng phân giải Carbuahydro của một số chủng

nấm sợi phân lập từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp.

HCM

33. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Tp. HCM.

34. Phạm Trọng Thịnh, Lê Trình (1997), Phân vùng sinh thái, quy hoạch môi trường gắn kết phát

triển kinh tế- xã hội và bảo vệ hệ sinh thái rừng ngập mặn huyện cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh.

HỘI THẢO TQ, P.177

35. Phan Thị Trang, Mai Thị Hằng (2002), Khả năng phân giải cacbua hydro của một số chủng nấm

sợi phân lập từ rừng ngập mặn khu vực rừng trồng cây trang ở một số rừng ngập mặn Nam Định,

Thái Bình, Hội thảo khoa học lần thứ hai, Đánh giá vai trò của VSV trong hệ sinh thái RNM, Đề tài

cấp bộ - Mã số: B2001-75-03 TĐ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, trang 128-134.

36. Nguyễn Hoàng Trí (1999), Sinh thái học Rừng ngập mặn, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 21-

37, 128 – 138

37. Lê Ngọc Tú (chủ biên) (2005), Hoá sinh công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

38. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzym vi sinh vật, NXB

Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội

39. Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ, NXB Nông nghiệp Tp.

HCM, trang 6-17

40. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp,

NXB Y học chi nhánh Tp. HCM

41. Nguyễn Thị Bích Viên (2009), Khảo sát một số đặc tính sinh học của một số chủng NS phân lập

được từ RNM Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM

42. Đa dạng sinh học, kinh tế xã hội và tuyên truyền giáo dục ở các vùng ven biển có rừng ngập

mặn phục hồi tại Thái Bình và Nam Định (2001), Trung tâm nghiên cứu hệ sinh thái rừng ngập

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

mặn, Hội thảo khoa học đề án EP-DRC/MERD năm 2001.

43. A.D.Agate C.V.Subramania M.Vannucci, 1988, Mangrove microbiology, UNDP/UNESCO

Reginal Project RAS/ 86/ 1998.p 29-34

44. FuJi M., Kawamura Y. Action of α – amylase and glucoamylase on hydrolysis of starch.

Biotechnol. Bioeng., Vol 27, 1985

45. Hanafusa. H, Ikenaka T., Akaboris. Studies on takamylase A. III. Carbohydrate component in

take amylase J. Biochem, p42, 2005.

46. Hans C.B. Enzyme in starch processing. Cereal Food World, Vol 21, 1986.

47. Horgath P.J, 1999, The biology of mangroves, Biololy of habitals, p.222.

48. Hyde K.D. and Jones E.B.G, 1988, Marine mangrove fungi, Mar. Ecology 9, p 15-33

49. Mangroves of India, 2002, Centre of Advanced Study in Marine Biology, Annamalai University,

Parangipettai - 608 502, Tamil Nadu, India. Sponsored by Ministry of Environment & Forests,

Government of India, New Delhi

50. Nam Sun Wang, Sucrose assay by the dinitrosalicylic colorimetric method. Department of

Chemical & Biomolecular Engineering University of Maryland College Park, MD 20742-2111

ENCH485

51. Pandey Ashok ,1988, Solid state fermentation for the production of industrial enzyme, Microbial

Technology, p68-76

52. Phan Nguyen Hong, 2004, Mangrove Ecosystem in the Red River Coastal Zone, Agricultural

Publishing House Hanoi

53. Phan Nguyen Hong, 2006, The role of mangrove and coral reef ecosystems in nature disaster

mitigation and coastal life improvement, Agricultural Publishing House Hanoi 54. Pitt J. I. and Hocking A. D., 2000, Fungi and food spoilage. 2nd edition. Blakie Academic and

Professional,.p 1-469.

55. Rehm H.J and Greed. Biomass and microorganism for special application. Biotechnology, Vol

3, 1983

56. Rose A.H. Microbial enzymes and bioconversion. Economic microbiology, Vol 5. Acad. Press,

London, 1980.

NGUỒN INTERNET

57. UNDP/UNESCO Regional Mangroves Project RAS/86/1998, June 1988, New Delhi.

58. http://vietsciences.org

59. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/namsoi01.htm

60. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/namsoi02.htm

61. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/namsoi03.htm

62. http://www.sinhhocvietnam.com

63. http://www.engr.umd.edu/~nsw/ench485/lab9d.htm

64. http://www.automation.org.vn/default.asp?xt=xt1&page=newsdetail&newsid=3

65. http://www.qhkt.hochiminhcity.gov.vn/web/data/news/2006/6/626/QD-6995.doc

66. http://vi.wikipedia.org/wiki/Khu_dự_trữ_sinh_quyển_rừng_ngập_mặn_Cần_Giờ

67. http://www.nea.gov.vn/html/phobienkienthuc/GIS/DatabaseGIS/ngapmanCanGio.htm

68. http://kacc.rda.go.kr/search/img_list_resultnew_result.asp?l_code=2759-10-1-3-6-9-3-1-8

69. http://quanlymt.blogspot.com/2005_04_01_archive.html

70. http://www.hcmbiotech.com.vn.

71. http://www.mycology.adelaide.edu.au/virtual/2007/ID2-Mar07.html

72. http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus

73. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomeopj/9561

PHỤ LỤC

1. Kết quả phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ

L1,L2,L3,L4,L5,L6,L7,L8,L9,L10,L11,L12,L13,L14,L15,L16,L17,L18,L19,L20,L21,L22,L23,

Địa điểm Kí hiệu chủng lấy mẫu

L24,L25,L26,L27,L28,L29,L30,L31,L32,L33,L34,L35,L36,L37,L38,L39,L40,L41,L42,L43,L44,

Lá vàng

L45,L46,L47,L48,L49,L50,L51,L52,L53,L54,L55,L56,L57,L58,L59,L60,L61,L62,L63,L64,L65,

L66,L67,L68,L69,L70,L71

LM1,LM2,LM3,LM4,LM5,LM6,LM7,LM8,LM9,LM10,LM11,LM12,LM13,LM14,LM15,LM16,

LM17,LM18,LM19,LM20,LM21,LM22,LM23,LM24,LM25,LM26,LM27,LM28,LM29,LM30,

71 chủng

LM31,LM32,LM33,LM34,LM35,LM36,LM37,LM38,LM39,LM40,LM41,LM42,LM43,LM44,

Lá mục

LM45,LM46,LM47,LM48,LM49,LM50,LM51,LM52,LM53,LM54,LM55,LM56,LM57,LM58,

LM59,LM60,LM61,LM62,LM63,LM64,LM65,LM66,LM67,LM68,LM69,LM70,LM71,LM72,

LM73,LM74,LM75,LM76,LM77,LM78,LM79,LM80,LM81

CK1,CK2,CK3,CK4,CK5,CK6,CK7,CK8,CK9,CK10,CK11,CK12,CK13,CK14,CK15,CK16,

CK17,CK18,CK19,CK20,CK21,CK22,CK23,CK24,CK25,CK26,CK27,CK28,CK29,CK30,

81 chủng

CK31,CK32,CK33,CK34,CK35,CK36,CK37,CK38,CK39,CK40,CK41,CK42,CK43,CK44,

Cành khô

CK45,CK46,CK47,CK48,CK49,CK50,CK51,CK52,CK53,CK54,CK55,CK56,CK57,CK58,CK59.

CM1,CM2,CM3,CM4,CM5,CM6,CM7,CM8,CM9,CM10,CM11,CM12,CM13,CM14,CM15,

CM16,CM17,CM18,CM19,CM20,CM21,CM22,CM23,CM24,CM25,CM26,CM27,CM28,CM29,

59 chủng

CM30,CM31,CM32,CM33,CM34,CM35,CM36,CM37,CM38,CM39,CM40,CM41,CM42,CM43,

Cành

CM44,CM45,CM46,CM47,CM48,CM49,CM50,CM51,CM52,CM53,CM54,CM55,CM56,CM57,

CM58,CM59,CM60,CM61,CM62,CM63,CM64,CM65,CM66,CM67,CM68,CM69,CM70,CM71,

mục

CM72,CM73,CM74,CM75,CM76,CM77,CM78,CM79,CM80,CM81

ĐM1,ĐM2,ĐM3,ĐM4,ĐM5,ĐM6,ĐM7,ĐM8,ĐM9,ĐM10,ĐM11,ĐM12,ĐM13,ĐM14,ĐM15,

ĐM16,ĐM17,ĐM18,ĐM19,ĐM20,ĐM21,ĐM22,ĐM23,ĐM24,ĐM25,ĐM26,ĐM27,ĐM28,ĐM29,

81 chủng

ĐM30,ĐM31,ĐM32,ĐM33,ĐM34,ĐM35,ĐM36,ĐM37,ĐM38,ĐM39,ĐM40,ĐM41,ĐM42,ĐM43,

Đất mặt

ĐM44,ĐM45,ĐM46,ĐM47,ĐM48,ĐM49,ĐM50,ĐM51,ĐM52,ĐM53,ĐM54,ĐM55,ĐM56,ĐM57,

ĐM58,ĐM59,ĐM60,ĐM61,ĐM62,ĐM63,ĐM64

ĐS1,ĐS2,ĐS3,ĐS4,ĐS5,ĐS6,ĐS7,ĐS8,ĐS9,ĐS10,ĐS11,ĐS12,ĐS13,ĐS14,ĐS15,ĐS16,ĐS17,

64 chủng

ĐS18,ĐS19,ĐS20,ĐS21,ĐS22,ĐS23,ĐS24,ĐS25,ĐS26,ĐS27,ĐS28,ĐS29,ĐS30,ĐS31,ĐS32,ĐS33,

Đất sâu

ĐS34,ĐS35,ĐS36,ĐS37,ĐS38,ĐS39,ĐS40,ĐS41,ĐS42,ĐS43,ĐS44,ĐS45,ĐS46,ĐS47,ĐS48,ĐS49,

5-10cm

ĐS50,ĐS51,ĐS52,ĐS53

53 chủng

Kí hiệu

D-d

Kí hiệu

D-d

Kí hiệu

D-d

STT

chủng

(mm)

STT

chủng

(mm)

STT

chủng

(mm)

LM54

175

CM41

11,5

LM56

176

CM43

15,5

LM57

177

CM44

2. Kết quả khảo sát khả năng sinh amylase của 261 chủng NS

8,5

LM58

5,5

178

CM46

11,5

LM59

5,5

179

CM48

LM61

1,5

180

CM52

L11

15,5

LM62

7,5

181

CM53

L12

13,5

LM68

182

CM54

L13

11,5

LM78

183

CM63

L14

CK1

11,5

184

CM66

L15

CK2

185

CM73

L16

CK3

186

CM76

L17

16,5

100

CK4

187

CM77

L18

101

CK6

188

CM78

L19

2,5

102

CK8

16,5

189

CM79

L20

103

CK11

190

CM80

L21

104

CK12

191

Đ2

L22

105

CK14

192

Đ3

L23

106

CK15

193

Đ5

16,5

L24

107

CK16

194

Đ8

L25

108

CK17

195

Đ10

20,5

L29

109

CK18

196

Đ12

L30

110

CK19

197

Đ13

L32

111

CK20

15,6

198

Đ14

L33

13,5

112

CK21

199

Đ16

L35

113

CK22

200

Đ17

L36

114

CK23

201

Đ18

L38

115

CK24

202

Đ19

L40

5,5

116

CK25

203

Đ20

L42

117

CK26

16,5

204

Đ21

L43

118

CK27

205

Đ22

L44

119

CK28

206

Đ23

Kí hiệu

D-d

Kí hiệu

D-d

Kí hiệu

D-d

STT

chủng

(mm)

chủng

(mm)

chủng

(mm)

L45

19,5

120

CK29

14,5

207

Đ24

L48

12,5

121

CK30

208

Đ25

16,5

L49

122

CK31

209

Đ26

L52

10,5

123

CK32

210

Đ28

L57

2,5

124

CK33

211

Đ29

L58

1,5

125

CK34

212

Đ31

L59

11,5

126

CK35

213

Đ33

8,5

L61

127

CK36

214

Đ34

L62

128

CK38

11,5

215

Đ35

L63

129

CK39

216

Đ36

L64

130

CK40

217

Đ37

L65

131

CK41

1,5

Đ39

218

L66

132

CK42

Đ41

219

L67

133

CK43

Đ42

220

L69

134

CK44

Đ43

5,5

221

L70

135

CK46

Đ44

222

LM1

136

CK47

Đ45

2,5

223

LM2

137

CK48

Đ46

224

LM5

16,5

138

CK49

Đ47

225

LM6

139

CK51

Đ48

226

LM8

140

CK52

12,5

Đ51

227

LM9

141

CK53

Đ52

228

LM10

142

CK54

Đ53

229

LM11

143

CK55

2,5

Đ54

230

LM12

144

CK57

Đ55

7,5

231

LM13

145

CK58

Đ56

232

LM16

146

CK59

Đ58

233

LM18

17,5

147

CM2

Đ61

234

LM21

148

CM3

Đ64

235

LM22

16,5

149

CM8

ĐS2

236

LM23

150

CM9

16,5

ĐS4

237

LM24

9,5

151

CM10

ĐS5

238

LM25

152

CM11

ĐS8

239

LM26

153

CM13

ĐS9

240

LM28

16,5

154

CM14

241

ĐS14

Kí hiệu

D-d

Kí hiệu

D-d

Kí hiệu

D-d

STT

chủng

(mm)

chủng

(mm)

chủng

(mm)

LM29

155

CM15

242

ĐS15

LM30

156

CM16

243

ĐS17

LM31

157

CM17

244

ĐS18

7,5

LM32

158

CM18

245

ĐS19

LM33

159

CM20

246

ĐS20

LM35

160

CM21

247

ĐS21

LM36

161

CM22

5,5

248

ĐS24

LM37

162

CM23

249

ĐS25

LM38

4,5

163

CM26

250

ĐS26

LM39

15,5

164

CM28

14,5

251

ĐS28

LM40

4,5

165

CM29

252

ĐS29

LM41

166

CM31

253

ĐS30

LM45

13,5

167

CM32

254

ĐS32

15,5

LM46

10,5

168

CM33

16,5

255

ĐS33

14,5

LM47

169

CM34

256

ĐS34

LM48

17,5

170

CM35

257

ĐS36

LM50

3,5

171

CM36

258

ĐS39

LM51

172

CM38

6,5

259

ĐS42

LM52

173

CM39

260

ĐS43

LM53

18,5

174

CM40

261

ĐS50

3. Hoạt tính amylase của hai chủng NS tuyển chọn

Số lần Chủng Trung bình 1 2 3 nấm

Chủng Đ10 20,5 20 21 20,5

Chủng Đ56 18,5 19 19,5 19

4. Đồ thị đường chuẩn tinh bộ để xác định hoạt độ α-amylase

(THEO PHƯƠNG PHÁP HENKEIL)

Ống số

Hàm lượng tinh bột (mg/ml)

OD (560nm)

0.002

0.087

0.171

0.25

0.342

0.415

Delta OD

0.085

0.169

0.248

0.340

0.413

D O a t l e D

Hàm lượng tinh bột (mg/ml)

 Bảng 4.1: Đồ thị đường chuẩn tinh bột 1mg/ml

Đồ thị 4.1: Sự tương quan giữa giá trị OD560nm và hàm lượng tinh bột (mg/ml)

5. Đồ thị đường chuẩn glucose để xác định hoạt độ glucoamylase theo phương pháp so màu

Số ống

Nồng độ Glucose

(μg/ml)

100

150

200

250

300

350

400

450

500

OD (530nm)

0.035 0.054 0.082 0.107 0.132 0.166 0.187 0.214

0.24 0.269 0.292

Delta OD

0 0.019 0.047 0.072 0.097 0.131 0.152 0.179 0.205 0.234 0.257

với thuốc DNS (MILLER)

D O a t l e D

Nồng độ Glucose (µg/ml)

 Bảng 5.1: Đường chuẩn glucose có nồng độ từ 0 - 500 µg/m

Đồ thị 5.1: Sự tương quan giữa giá trị OD530nm và nồng độ glucose (µg/ml)

6. PHỤ LỤC 6

Số lần

Trung

Chủng Đ10 (α)

Phương sai

Sai số

bình

Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS

Thời gian (Giờ)

OD

0,052 0,051 0,046 0,050 0,0000 0,003

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

1,216 1,192 1,072 1,160 0,0060 0,077 24 81,090 79,487 71,474 77,350 26,5382 5,152

OD

0,048 0,056 0,060 0,055 0,0000 0,006

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

1,120 1,313 1,409 1,280 0,0216 0,147 36 74,679 87,500 93,910 85,363 95,8799 9,792

OD

0,121 0,122 0,129 0,124 0,0000 0,004

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

2,875 2,899 3,067 2,947 0,0110 0,105 48 191,667 193,269 204,487 196,474 48,7960 6,985

OD

0,123 0,115 0,121 0,120 0,0000 0,004

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

2,923 2,731 2,875 2,843 0,0100 0,100 60 194,872 182,051 191,667 189,530 44,5157 6,672

OD

0,121 0,112 0,118 0,117 0,0000 0,005

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

2,875 2,659 2,803 2,779 0,0121 0,110 72 191,667 177,244 186,859 185,256 53,9324 7,344

OD

0,116 0,107 0,105 0,109 0,0000 0,006

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

2,755 2,538 2,490 2,595 0,0198 0,141 84 183,654 169,231 166,026 172,970 88,1753 9,390

0,102 0,104 0,097 0,101 0,0000 0,004

6, PHỤ LỤC 6 (tt)

Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS

Chủng Đ56 (α)

Thời gian (Giờ)

Số lần Trung Phương Sai số bình sai 1 2 3

OD

0,133 0,126 0,137 0,132 0,000 0,006

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,163 2,995 3,260 3,139 0,018 0,134

Hoạt độ (UI/g)

210,897 199,679 217,308 209,295 79,615 8,923

OD

0,146 0,144 0,120 0,137 0,000 0,014

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,476 3,428 2,851 3,252 0,121 0,348

Hoạt độ (UI/g)

231,731 228,526 190,064 216,774 537,612 23,186

OD

0,257 0,248 0,264 0,256 0,000 0,008

Lượng tinh bột (mg/ml)

6,144 5,928 6,313 6,128 0,037 0,193

Hoạt độ (UI/g)

409,615 395,192 420,833 408,547 165,222 12,854

OD

0,250 0,263 0,271 0,261 0,000 0,011

Lượng tinh bột (mg/ml)

5,976 6,288 6,481 6,248 0,065 0,255

Hoạt độ (UI/g)

398,397 419,231 432,051 416,560 288,496 16,985

OD

0,228 0,228 0,239 0,232 0,000 0,006

Lượng tinh bột (mg/ml)

5,447 5,447 5,712 5,535 0,023 0,153

Hoạt độ (UI/g)

363,141 363,141 380,769 369,017 103,585 10,178

OD

0,231 0,239 0,221 0,230 0,000 0,009

7. PHỤ LỤC 7

Số lần

Trung

Phương

Chủng Đ10 (glucoamylase)

Sai số

Thời gian (Giờ)

bình

sai

0,035

0,036

0,039

0,037

0,000

0,002

OD

79,200

81,200

87,200

82,533

17,333

4,163

Nồng độ Glucose (μg/ml)

184,800

189,467

203,467

192,578

94,370

9,714

Hoạt độ (UI/g)

0,101

0,094

0,097

0,000

0,004

OD

211,200

197,200

203,200

203,867

49,333

7,024

Nồng độ Glucose (μg/ml)

492,800

460,133

474,133

475,689

268,593

16,389

Hoạt độ (UI/g)

0,140

0,213

0,185

0,179

0,001

0,037

OD

289,200

435,200

379,200

367,867

5425,333

73,657

Nồng độ Glucose (μg/ml)

674,800 1015,467

884,800

858,356 29537,926 171,866

Hoạt độ (UI/g)

0,264

0,281

0,278

0,274

0,000

0,009

OD

537,200

571,200

565,200

557,867

329,333

18,148

Nồng độ Glucose (μg/ml)

1253,467 1332,800 1318,800 1301,689

1793,037

42,344

Hoạt độ (UI/g)

0,211

0,218

0,207

0,212

0,000

0,006

OD

431,200

445,200

423,200

433,200

124,000

11,136

Nồng độ Glucose (μg/ml)

1006,133 1038,800

987,467 1010,800

675,111

25,983

Hoạt độ (UI/g)

0,197

0,189

0,187

0,191

0,000

0,005

OD

403,200

387,200

383,200

391,200

112,000

10,583

Nồng độ Glucose (μg/ml)

940,800

903,467

894,133

912,800

609,778

24,694

Hoạt độ (UI/g)

0,179

0,178

0,185

0,181

0,000

0,004

OD

367,200

365,200

379,200

370,533

57,333

7,572

Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

7. PHỤ LỤC 7 (tt)

Số lần

Trung

Phương

Chủng Đ56 (Glucoamylase)

Sai số

Thời gian (Giờ)

bình

sai

0,010

0,006

0,004

0,007

0,000

0,003

OD

29,200

21,200

17,200

22,533

37,333

6,110

Nồng độ Glucose (μg/ml)

68,133

49,467

40,133

52,578

203,259

14,257

Hoạt độ (UI/g)

0,003

0,040

0,027

0,023

0,000

0,019

OD

15,200

89,200

63,200

55,867

1409,333

37,541

Nồng độ Glucose (μg/ml)

35,467

208,133

147,467

130,356

7673,037

87,596

Hoạt độ (UI/g)

0,158

0,167

0,159

0,161

0,000

0,005

OD

325,200

343,200

327,200

331,867

97,333

9,866

Nồng độ Glucose (μg/ml)

758,800

800,800

763,467

774,356

529,926

23,020

Hoạt độ (UI/g)

0,340

0,419

0,376

0,378

0,002

0,040

OD

689,200

847,200

761,200

765,867

6257,333

79,103

Nồng độ Glucose (μg/ml)

1608,133 1976,800 1776,133 1787,022 34067,704 184,574

Hoạt độ (UI/g)

0,314

0,287

0,293

0,298

0,000

0,014

OD

637,200

583,200

595,200

605,200

804,000

28,355

Nồng độ Glucose (μg/ml)

1486,800 1360,800 1388,800 1412,133

4377,333

66,161

Hoạt độ (UI/g)

0,218

0,209

0,199

0,209

0,000

0,010

OD

445,200

427,200

407,200

426,533

361,333

19,009

Nồng độ Glucose (μg/ml)

1038,800

996,800

950,133

995,244

1967,259

44,354

Hoạt độ (UI/g)

0,171

0,184

0,156

0,170

0,000

0,014

OD

Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

8. PHỤ LỤC 8

Chủng Đ10 (α)

Số lần

Trung

Phương

Sai

bình

sai

số

Nhiệt độ

OD

0,131

0,128

0,127

0,129 4,333E-06 0,002

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,115

3,043

3,019

3,059 2,504E-03 0,050

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS

Hoạt độ (UI/g)

207,692 202,885 201,282

203,953

11,129 3,336

OD

0,129

0,137

0,136

0,134 1,900E-05 0,004

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,067

3,260

3,236

3,188 1,098E-02 0,105

Hoạt độ (UI/g)

204,487 217,308 215,705

212,500

48,796 6,985

OD

0,155

0,165

0,159

0,160 2,533E-05 0,005

3,692

3,933

3,788

3,804 1,464E-02 0,121

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

246,154 262,179 252,564

253,632

65,061 8,066

OD

0,139

0,138

0,134

0,137 7,000E-06 0,003

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,308

3,284

3,188

3,260 4,045E-03 0,064

Hoạt độ (UI/g)

220,513 218,910 212,500

217,308

17,977 4,240

Chủng Đ56 (α)

Số lần

Trung

Phương

Sai số

bình

sai

Nhiệt độ

OD

0,127

0,136

0,132

0,132 2,033E-05

0,005

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,019

3,236

3,139

3,131 1,175E-02

0,108

Hoạt độ (UI/g)

201,282 215,705 209,295

208,761

52,220

7,226

OD

0,155

0,135

0,148

0,146 1,030E-04

0,010

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,692

3,212

3,524

3,476 5,952E-02

0,244

Hoạt độ (UI/g)

246,154 214,103 234,936

231,731

264,526 16,264

OD

0,136

0,164

0,156

0,152 2,080E-04

0,014

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,236

3,909

3,716

3,620 1,202E-01

0,347

Hoạt độ (UI/g)

215,705 260,577 247,756

241,346

534,188 23,113

OD

0,153

0,157

0,161

0,157 1,600E-05

0,004

3,644

3,740

3,837

3,740 9,246E-03

0,096

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

242,949 249,359 255,769

249,359

41,091

6,410

OD

0,147 1,633E-05

0,146

0,143

0,151

0,004 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

9. PHỤ LỤC 9

Số lần

Trung

Phương

Chủng Đ10 (glucoamylase)

Sai số

Nhiệt độ

bình

sai

OD

0,056

0,042

0,061

0,053

0,000

0,010

121,200

93,200

131,200

115,200

388,000 19,698

Nồng độ Glucose (μg/ml)

282,800

217,467

306,133

268,800 2112,444 45,961

Hoạt độ (UI/g)

OD

0,145

0,134

0,141

0,140

0,000

0,006

299,200

277,200

291,200

289,200

124,000 11,136

Nồng độ Glucose (μg/ml)

698,133

646,800

679,467

674,800

675,111 25,983

Hoạt độ (UI/g)

OD

0,153

0,143

0,162

0,153

0,000

0,010

315,200

295,200

333,200

314,533

361,333 19,009

Nồng độ Glucose (μg/ml)

735,467

688,800

777,467

733,911 1967,259 44,354

Hoạt độ (UI/g)

OD

0,258

0,231

0,245

0,000

0,014

525,200

471,200

499,200

498,533

729,333 27,006

Nồng độ Glucose (μg/ml)

1225,467 1099,467 1164,800 1163,244 3970,815 63,014

Hoạt độ (UI/g)

OD

0,083

0,082

0,091

0,085

0,000

0,005

175,200

173,200

191,200

179,867

97,333

9,866

Nồng độ Glucose (μg/ml)

408,800

404,133

446,133

419,689

529,926 23,020

Hoạt độ (UI/g)

Ụ

LỤC 9 (tt)

Số lần

Trung

Phương

Chủng Đ56 (glucoamylase)

Sai số

Nhiệt độ

bình

sai

OD

0,090

0,092

0,087

0,090

0,000

0,003

189,200 193,200 183,200

188,533

25,333

5,033

Nồng độ Glucose (μg/ml)

441,467 450,800 427,467

439,911

137,926 11,744

Hoạt độ (UI/g)

OD

0,094

0,097

0,102

0,098

0,000

0,004

197,200 203,200 213,200

204,533

65,333

8,083

Nồng độ Glucose (μg/ml)

460,133 474,133 497,467

477,244

355,704 18,860

Hoạt độ (UI/g)

OD

0,178

0,166

0,165

0,170

0,000

0,007

365,200 341,200 339,200

348,533

209,333 14,468

Nồng độ Glucose (μg/ml)

852,133 796,133 791,467

813,244

1139,704 33,759

Hoạt độ (UI/g)

OD

0,181

0,184

0,187

0,184

0,000

0,003

371,200 377,200 383,200

377,200

36,000

6,000

Nồng độ Glucose (μg/ml)

866,133 880,133 894,133

880,133

196,000 14,000

Hoạt độ (UI/g)

OD

0,137

0,148

0,139

0,141

0,000

0,006

283,200 305,200 287,200

291,867

137,333 11,719

Nồng độ Glucose (μg/ml)

660,800 712,133 670,133

681,022

747,704 27,344

Hoạt độ (UI/g)

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

10. PHỤ LỤC 10

Chủng Đ10 (α)

Số lần

Trung

Phương

Sai số

bình

sai

OD

0,339

0,378

0,347

0,355

0,0004

0,021

Lượng tinh bột (mg/ml)

8,115

9,053

8,308

8,492

0,2452

0,495

Hoạt độ (UI/g)

541,026

603,526 553,846 566,132 1089,778 33,012

OD

0,384

0,376

0,381

0,0000

0,005

Lượng tinh bột (mg/ml)

9,197

9,005

9,133

0,0123

0,111

Hoạt độ (UI/g)

613,141

613,141 600,321 608,868

54,789

7,402

OD

0,395

0,392

0,397

0,395

0,0000

0,003

9,462

9,389

9,510

9,454

0,0037

0,060

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

630,769

625,962 633,974 630,235

16,265

4,033

0,409

0,391

0,392

0,0003

0,016

OD

0,377

Lượng tinh bột (mg/ml)

9,029

9,798

9,365

9,397

0,1487

0,386

Hoạt độ (UI/g)

601,923

653,205 624,359 626,496

660,886 25,708

OD

0,384

0,388

0,378

0,383

0,0000

0,005

Lượng tinh bột (mg/ml)

9,197

9,293

9,053

9,181

0,0146

0,121

Hoạt độ (UI/g)

613,141

619,551 603,526 612,073

65,061

8,066

OD

0,369

0,371

0,370

0,0000

0,001

Lượng tinh bột (mg/ml)

8,837

8,885

8,869

0,0008

0,028

Hoạt độ (UI/g)

589,103

592,308 592,308 591,239

3,424

1,850

Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS

10. PHỤ LỤC 10 (tt)

Chủng Đ56(α)

Số lần

Trung

Phương

Sai số

bình

sai

OD

0,034

0,011

0,028

0,024

0,0001

0,012

Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS

Lượng tinh bột (mg/ml)

0,784

0,231

0,639

0,551

0,0822

0,287

Hoạt độ (UI/g)

52,244

15,385

42,628

36,752

365,5421 19,119

0,249

0,246

0,247

0,0000

0,002

OD

0,247

Lượng tinh bột (mg/ml)

5,904

5,952

5,880

5,912

0,0013

0,037

Hoạt độ (UI/g)

393,590 396,795 391,987 394,124

5,9925

2,448

OD

0,281

0,266

0,272

0,273

0,0001

0,008

Lượng tinh bột (mg/ml)

6,721

6,361

6,505

6,529

0,0329

0,181

Hoạt độ (UI/g)

448,077 424,038 433,654 435,256

146,3881 12,099

OD

Lượng

tinh

bột

0.286 0.301 0.298 0.295 0.000 0.008

(mg/ml)

6 6.841 7.202 7.130 7.058 0.036 0.191

Hoạt độ (UI/g)

456.090 480.128 475.321 470.513 161.797 12.720

OD

0.285 0.285 0.292 0.287 0.000 0.004

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

OD

0,255

0,207

0,241

0,234

0,0006

0,025

Lượng tinh bột (mg/ml)

6,096

4,942

5,760

5,599

0,3521

0,593

6.817 6.817 6.986 6.873 0.009 0.097 7 454.487 454.487 465.705 458.226 41.947 6.477

Hoạt độ (UI/g)

406,410 329,487 383,974 373,291 1564,8970 39,559

11. PHỤ LỤC 11

Số lần

Trung

Chủng Đ10 (glucoamylase)

Phương sai Sai số

bình

0,211

0,274

0,241

0,242

0,001

0,032

431,200

557,200

491,200

493,200

3972,000

63,024

Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

1006,133 1300,133 1146,133 1150,800

21625,333 147,056

OD Nồng độ Glucose (μg/ml)

0,252

0,274

0,258

0,261

0,000

0,011

Hoạt độ (UI/g)

513,200

557,200

525,200

531,867

517,333

22,745

OD

1197,467 1300,133 1225,467 1241,022

2816,593

53,072

Nồng độ Glucose (μg/ml)

0,233

0,308

0,271

0,001

0,038

OD

475,200

625,200

551,200

550,533

5625,333

75,002

1108,800 1458,800 1286,133 1284,578

30626,815 175,005

0,209

0,345

0,277

0,005

0,068

427,200

699,200

563,200

18496,000 136,000

996,800 1631,467 1314,133 1314,133 100700,444 317,333

0,203

0,271

0,229

0,234

0,001

0,034

415,200

551,200

467,200

477,867

4709,333

68,625

968,800 1286,133 1090,133 1115,022

25639,704 160,124

0,197

0,261

0,213

0,224

0,001

0,033

403,200

531,200

435,200

456,533

4437,333

66,613

940,800 1239,467 1015,467 1065,244

24158,815 155,431

Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g)

Hoạt độ (UI/g)

11. PHỤ LỤC 11 (tt)

Số lần

Trung

Chủng Đ56 (glucoamylase)

Phương sai Sai số

bình

0,032

0,021

0,024

0,026

0,000

0,006

Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

73,200

51,200

57,200

60,533

129,333

11,372

Nồng độ Glucose (μg/ml)

170,800

119,467

133,467

141,244

704,148

26,536

Hoạt độ (UI/g)

0,231

0,279

0,253

0,254

0,001

0,024

OD

471,200

567,200

515,200

517,867

2309,333

48,056

Nồng độ Glucose (μg/ml)

1099,467

1323,467 1202,133 1208,356

12573,037 112,130

Hoạt độ (UI/g)

0,276

0,326

0,286

0,296

0,001

0,026

OD

561,200

661,200

581,200

601,200

2800,000

52,915

Nồng độ Glucose (μg/ml)

1309,467

1542,800 1356,133 1402,800

15244,444 123,468

Hoạt độ (UI/g)

0,391

0,322

0,334

0,349

0,001

0,037

OD

791,200

653,200

677,200

707,200

5436,000

73,729

Nồng độ Glucose (μg/ml)

1846,133

1524,133 1580,133 1650,133

29596,000 172,035

Hoạt độ (UI/g)

0,141

0,276

0,172

0,196

0,005

0,071

OD

291,200

561,200

353,200

401,867

20001,333 141,426

Nồng độ Glucose (μg/ml)

679,467

1309,467

824,133

937,689 108896,148 329,994

Hoạt độ (UI/g)

0,124

0,198

0,167

0,163

0,001

0,037

OD

257,200

405,200

343,200

335,200

5524,000

74,324

Nồng độ Glucose (μg/ml)

600,133

945,467

800,800

782,133

30075,111 173,422

Hoạt độ (UI/g)

OD

12. PHỤ LỤC 12

Chủng Đ10 (α)

Số lần

Trung

Phương

Sai số

bình

sai

Độ ẩm (%)

OD

0,126

0,125

0,126

3,333E-07

0,001

50%

Lượng tinh bột (mg/ml)

2,995

2,971

2,995

2,987

1,926E-04

0,014

Hoạt độ (UI/g)

199,679 198,077 199,679 199,145

8,561E-01

0,925

OD

0,154

0,165

0,157

0,159

3,233E-05

0,006

55%

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,668

3,933

3,740

3,780

1,868E-02

0,137

Hoạt độ (UI/g)

244,551 262,179 249,359 252,030 8,304E+01

9,113

OD

0,145

0,176

0,166

0,162

2,503E-04

0,016

60%

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,452

4,197

3,957

3,869

1,447E-01

0,380

Hoạt độ (UI/g)

230,128 279,808 263,782 257,906 6,429E+02 25,356

OD

0,188

0,178

0,185

0,184

2,633E-05

0,005

65%

4,486

4,245

4,413

4,381

1,522E-02

0,123

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

299,038 283,013 294,231 292,094 6,763E+01

8,224

OD

0,178

0,179

0,173

0,177

1,033E-05

0,003

70%

Lượng tinh bột (mg/ml)

4,245

4,269

4,125

4,213

5,971E-03

0,077

Hoạt độ (UI/g)

283,013 284,615 275,000 280,876 2,654E+01

5,152

Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS

12. PHỤ LỤC 12 (tt)

Chủng Đ56 (α)

Số lần

Trung

Phương

Sai số

bình

sai

Độ ẩm (%)

OD

0,179

0,182

0,186

0,182

1,233E-05

0,004

50%

Lượng tinh bột (mg/ml)

4,269

4,341

4,438

4,349

7,127E-03

0,084

Hoạt độ (UI/g)

284,615 289,423 295,833 289,957 3,167E+01

5,628

OD

0,197

0,206

0,198

0,200

2,433E-05

0,005

55%

Lượng tinh bột (mg/ml)

4,702

4,918

4,726

4,782

1,406E-02

0,119

Hoạt độ (UI/g)

313,462 327,885 315,064 318,803 6,249E+01

7,905

OD

0,198

0,223

0,212

0,211

1,570E-04

0,013

60%

Lượng tinh bột (mg/ml)

4,726

5,327

5,063

5,038

9,072E-02

0,301

Hoạt độ (UI/g)

315,064 355,128 337,500 335,897 4,032E+02 20,080

OD

0,209

0,233

0,221

1,440E-04

0,012

65%

4,990

5,567

5,279

8,321E-02

0,288

Lượng tinh bột (mg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

332,692 371,154 351,923 351,923 3,698E+02 19,231

OD

0,198

0,228

0,211

0,212

2,263E-04

0,015

70%

Lượng tinh bột (mg/ml)

4,726

5,447

5,038

5,071

1,308E-01

0,362

Hoạt độ (UI/g)

315,064 363,141 335,897 338,034 5,813E+02 24,110

Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS

13. PHỤ LỤC 13

Số lần

Trung

Phương

Sai số

Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

bình

sai

Độ ẩm (%)

OD

0,034

0,042

0,037

0,038

0,000

0,004

Nồng độ Glucose (μg/ml)

77,200

93,200

83,200

84,533

65,333

8,083

50%

Hoạt độ (UI/g)

180,133 217,467 194,133 197,244

355,704 18,860

OD

0,056

0,042

0,061

0,053

0,000

0,010

Nồng độ Glucose (μg/ml) 121,200

93,200 131,200 115,200

388,000 19,698

Chủng Đ10 (glucoamylase)

Hoạt độ (UI/g)

282,800 217,467 306,133 268,800 2112,444 45,961

OD

0,082

0,107

0,073

0,087

0,000

0,018

Nồng độ Glucose (μg/ml) 173,200 223,200 155,200 183,867 1241,333 35,233

55%

Hoạt độ (UI/g)

404,133 520,800 362,133 429,022 6758,370 82,209

OD

0,153

0,142

0,162

0,152

0,000

0,010

315,200 293,200 333,200 313,867

401,333 20,033

Nồng độ Glucose (μg/ml)

60%

Hoạt độ (UI/g)

735,467 684,133 777,467 732,356 2185,037 46,744

Chủng Đ56 (glucoamylase)

Số lần

Trung

Phương

Sai số

Độ ẩm (%)

bình

sai

OD

0,036

0,041

0,047

0,041 3,03E-05

0,006

Nồng độ Glucose (μg/ml)

81,2

91,2

103,2

91,867 1,21E+02

11,015

65%

Hoạt độ (UI/g)

189,467

212,8

240,8 214,356 6,61E+02

25,702

OD

0,083

0,082

0,093

0,086 3,70E-05

0,006

Nồng độ Glucose (μg/ml)

175,2

173,2

195,2 181,200 1,48E+02

12,166

50%

Hoạt độ (UI/g)

408,8

404,13 455,467 422,800 8,06E+02

28,386

OD

0,092

0,087

0,098

0,092 3,03E-05

0,006

Nồng độ Glucose (μg/ml)

193,2

183,2

205,2 193,867 1,21E+02

11,015

60%

Hoạt độ (UI/g)

450,8

427,47

478,8 452,356 6,61E+02

25,702

OD

0,104

0,112

0,103

0,106 2,43E-05

0,005

217,2

233,2

215,2 221,867 9,73E+01

9,866

Nồng độ Glucose (μg/ml)

55%

Hoạt độ (UI/g)

506,8

544,13 502,133 517,689 5,30E+02

23,020

65%

14. PHỤ LỤC 14

Chủng Đ10 (α)

Số lần

Trung

Phương sai Sai số

bình

Độ mặn (%)

0,131

0,128

0,127

0,129

4,333E-06

0,002

3,115

3,043

3,019

3,059

2,504E-03

0,050

Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS

207,692 202,885 201,282

203,953

1,113E+01

3,336

0,178

0,181

0,179

2,333E-06

0,002

OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g)

4,245

4,317

4,269

4,277

1,348E-03

0,037

283,013 287,821 284,615

285,150

5,992E+00

2,448

0,207

0,199

0,204

0,203

1,633E-05

0,004

4,942

4,750

4,870

4,854

9,438E-03

0,097

329,487 316,667 324,679

323,611

4,195E+01

6,477

0,178

0,165

0,172

4,233E-05

0,007

Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Lượng tinh bột (mg/ml)

4,245

3,933

4,101

4,093

2,446E-02

0,156

283,013 262,179 273,397

272,863

1,087E+02 10,427

0,107

0,088

0,097

9,033E-05

0,010

10%

2,538

2,082

2,298

2,306

5,220E-02

0,228

169,231 138,782 153,205

153,739

2,320E+02 15,231

0,092

0,021

0,067

0,060

1,297E-03

0,036

Hoạt độ (UI/g) OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD

OD

14. PHỤ LỤC 14 (tt)

Chủng Đ56 (α)

Số lần

Trung

Phương sai Sai số

bình

Độ mặn (%)

0,083

0,097

0,072

0,000157

0,013

0,084

1,962

2,298

1,697

0,091

0,301

1,986

130,769 153,205 113,141

132,372

403,209 20,080

0,086

0,087

0,091

7E-06

0,003

Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ α-amylase của hai chủng NS

0,088

2,034

2,058

2,154

0,004

0,064

2,082

OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD

135,577 137,179 143,590

138,782

17,977

4,240

0,122

0,121

0,119

0,121 2,33333E-06

0,002

2,899

2,875

2,827

2,867

0,001

0,037

193,269 191,667 188,462

191,132

5,992

2,448

0,132

0,123

0,138

5,7E-05

0,008

0,131

3,139

2,923

3,284

0,033

0,181

3,115

Hoạt độ (UI/g) OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g)

209,295 194,872 218,910

207,692

146,388 12,099

0,099

0,07

0,086

0,000211

0,015

0,085

10%

2,346

1,649

2,034

0,122

0,349

2,010

156,410 109,936 135,577

133,974

541,893 23,279

0,014

0,046

0,039

0,000283

0,017

0,033

20%

0,303

1,072

0,904

0,164

0,404

0,760

OD Lượng tinh bột (mg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Lượng tinh bột (mg/ml)

Lượng tinh bột (mg/ml)

5. PHỤ LỤC 15

Chủng Đ10 (glucoamylase)

Số lần

Trung

Phương sai Sai số

bình

Độ mặn (%)

0,025

0,042

0,037

0,035

0,000

0,009

Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

59,200

93,200

83,200

78,533

305,333

17,474

138,133 217,467 194,133 183,244

1662,370

40,772

0,029

0,081

0,032

0,047

0,001

0,029

67,200 171,200

73,200 103,867

3409,333

58,389

156,800 399,467 170,800 242,356

18561,926 136,242

0,056

0,041

0,053

0,050

0,000

0,008

Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml) 121,200

91,200 115,200 109,200

252,000

15,875

282,800 212,800 268,800 254,800

1372,000

37,041

0,113

0,090

0,093

0,099

0,000

0,013

235,200 189,200 195,200 206,533

625,333

25,007

548,800 441,467 455,467 481,911

3404,593

58,349

0,022

0,038

0,034

0,031

0,000

0,008

10%

53,200

85,200

77,200

71,867

277,333

16,653

Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g)

124,133 198,800 180,133 167,689

1509,926

38,858

0,012

0,041

0,029

0,027

0,000

0,015

OD

20%

33,200

91,200

67,200

63,867

849,333

29,143

77,467 212,800 156,800 149,022

4624,148

68,001

Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g)

OD

15. PHỤ LỤC 15 (tt)

Chủng Đ56 (glucoamylase)

Số lần

Trung

Phương sai Sai số

bình

Độ mặn (%)

0,021

0,017

0,019

0,000

0,002

51,200

43,200

47,200

16,000

4,000

119,467 100,800 110,133

110,133

87,111

9,333

0,029

0,030

0,032

0,030

0,000

0,002

Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ glucoamylase của hai chủng NS

67,200

69,200

73,200

69,867

9,333

3,055

156,800 161,467 170,800

163,022

50,815

7,128

OD Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml)

0,090

0,086

0,088

0,000

0,002

185,200 189,200 181,200

185,200

16,000

4,000

432,133 441,467 422,800

432,133

87,111

9,333

0,109

0,097

0,123

0,110

0,000

0,013

228,533

677,333 26,026

530,133 595,467 474,133

533,244

3687,704 60,726

OD Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml) 227,200 255,200 203,200 Hoạt độ (UI/g) OD

0,100

0,107

0,101

0,103

0,000

0,004

10%

209,200 211,200 223,200

214,533

57,333

7,572

Hoạt độ (UI/g)

488,133 492,800 520,800

500,578

312,148 17,668

0,024

0,021

0,026

0,024

0,000

0,003

20%

57,200

51,200

61,200

56,533

25,333

5,033

133,467 119,467 142,800

131,911

137,926 11,744

Hoạt độ (UI/g) OD Nồng độ Glucose (μg/ml) Hoạt độ (UI/g)

Nồng độ Glucose (μg/ml)

16. PHỤ LỤC 16

Chủng Đ10 (α)

Số lần

Trung

Phương

Sai số

bình

sai

Tổng hợp

OD

0,114

0,109

0,105

0,109 2,033E-05

0,005

Lượng tinh bột (mg/ml)

2,707

2,587

2,490

2,595 1,175E-02

0,108

Hoạt độ (UI/g)

180,449 172,436 166,026

172,970 5,222E+01

7,226

OD

0,158

0,149

0,154

0,154 2,033E-05

0,005

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,764

3,548

3,668

3,660 1,175E-02

0,108

Hoạt độ (UI/g)

250,962 236,538 244,551

244,017 5,222E+01

7,226

OD

0,187

0,186

0,189

0,187 2,333E-06

0,002

Lượng tinh bột (mg/ml)

4,462

4,438

4,510

4,470 1,348E-03

0,037

Hoạt độ (UI/g)

297,436 295,833 300,641

297,970 5,992E+00

2,448

OD

0,157

0,153

0,163

0,158 2,533E-05

0,005

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,740

3,644

3,885

3,756 1,464E-02

0,121

Hoạt độ (UI/g)

249,359 242,949 258,974

250,427 6,506E+01

8,066

OD

0,167

0,147

0,141

0,152 1,853E-04

0,014

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,981

3,500

3,356

3,612 1,071E-01

0,327

Hoạt độ (UI/g)

265,385 233,333 223,718

240,812 4,760E+02 21,817

OD

0,149

0,137

0,145 4,800E-05

0,007

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,548

3,260

3,452 2,774E-02

0,167

Hoạt độ (UI/g)

236,538 236,538 217,308

230,128 1,233E+02 11,103

OD

0,133

0,128

0,125

0,129 1,633E-05

0,004

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,163

3,043

2,971

3,059 9,438E-03

0,097

Đông học quá trình sinh α-amylase của hai chủng NS

16. PHỤ LỤC 16 (tt)

Chủng Đ56 (α)

Số lần

Trung

Phương

Sai số

bình

sai

Tổng hợp

OD

0,115

0,117

0,114

0,000

0,002

0,115

Lượng tinh bột (mg/ml)

2,731

2,779

2,707

0,001

0,037

2,739

Đông học quá trình sinh α-amylase của hai chủng NS

Hoạt độ (UI/g)

182,051 185,256 180,449

182,585

5,992

2,448

OD

0,155

0,145

0,146

0,000

0,006

0,149

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,692

3,452

3,476

0,018

0,132

3,540

Hoạt độ (UI/g)

246,154 230,128 231,731

236,004

77,902

8,826

OD

0,146

0,172

0,153

0,000

0,013

0,157

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,476

4,101

3,644

0,105

0,323

3,740

Hoạt độ (UI/g)

231,731 273,397 242,949

249,359

464,846 21,560

OD

0,179

0,162

0,164

0,000

0,009

0,168

Lượng tinh bột (mg/ml)

4,269

3,861

3,909

0,050

0,223

4,013

Hoạt độ (UI/g)

284,615 257,372 260,577

267,521

221,722 14,890

OD

0,163

0,129

0,138

0,000

0,018

0,143

Lượng tinh bột (mg/ml)

3,885

3,067

3,284

0,179

0,423

3,412

Hoạt độ (UI/g)

258,974 204,487 218,910

227,457

797,002 28,231

0,000

0,002

0,126

OD

0,124

0,127

0,126

0,001

0,037

2,987

Lượng tinh bột (mg/ml)

2,947

3,019

2,995

Hoạt độ (UI/g)

196,474 201,282 199,679

199,145

5,992

2,448

0,000

0,003

0,121

0,123

0,118

OD

0,004

0,060

2,867

Lượng tinh bột (mg/ml)

2,875

2,923

2,803

17. PHỤ LỤC 17

Chủng Đ10 (glucoamylase)

Số lần

Trung

Phương sai Sai số

bình

Tổng hợp

0,094

0,062

0,076

0,077

0,000

0,016

Đông học quá trình sinh glucoamylase của hai chủng NS

Nồng độ Glucose (μg/ml)

197,200

133,200

161,200

163,867

1029,333

32,083

Hoạt độ (UI/g)

460,133

310,800

376,133

382,356

5604,148

74,861

0,152

0,136

0,141

0,143

0,000

0,008

OD

Nồng độ Glucose (μg/ml)

313,200

281,200

291,200

295,200

268,000

16,371

Hoạt độ (UI/g)

730,800

656,133

679,467

688,800

1459,111

38,198

0,217

0,222

0,213

0,217

0,000

0,005

OD

Nồng độ Glucose (μg/ml)

443,200

453,200

435,200

443,867

81,333

9,018

Hoạt độ (UI/g)

1034,133 1057,467 1015,467 1035,689

442,815

21,043

0,166

0,334

0,262

0,254

0,007

0,084

OD

341,200

677,200

533,200

517,200

28416,000 168,570

Nồng độ Glucose (μg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

796,133 1580,133 1244,133 1206,800 154709,333 393,331

0,247

0,086

0,162

0,165

0,006

0,081

OD

Nồng độ Glucose (μg/ml)

503,200

181,200

333,200

339,200

25948,000 161,084

Hoạt độ (UI/g)

1174,133

422,800

777,467

791,467 141272,444 375,862

0,109

0,167

0,137

0,138

0,001

0,029

OD

Nồng độ Glucose (μg/ml)

227,200

343,200

283,200

284,533

3365,333

58,011

Hoạt độ (UI/g)

530,133

800,800

660,800

663,911

18322,370 135,360

0,049

0,069

0,063

0,060

0,000

0,010

OD

Nồng độ Glucose (μg/ml)

107,200

147,200

135,200

129,867

421,333

20,526

OD

17. PHỤ LỤC 17 (tt)

Chủng Đ56 (glucoamylase)

Số lần

Trung

Phương

Sai số

bình

sai

Tổng hợp

0,119

0,118

0,119

0,000

0,001

Đông học quá trình sinh glucoamylase của hai chủng NS

Nồng độ Glucose (μg/ml)

247,200

245,200

247,200

246,533

1,333

1,155

Hoạt độ (UI/g)

576,800

572,133

576,800

575,244

7,259

2,694

0,142

0,117

0,125

0,128

0,000

0,013

OD

Nồng độ Glucose (μg/ml)

293,200

243,200

259,200

265,200

652,000

25,534

Hoạt độ (UI/g)

684,133

567,467

604,800

618,800

3549,778

59,580

OD

0,254

0,158

0,216

0,209

0,002

0,048

Nồng độ Glucose (μg/ml)

517,200

325,200

441,200

427,867

9349,333

96,692

Hoạt độ (UI/g)

1206,800

758,800 1029,467

998,356 50901,926 225,615

0,205

0,234

0,227

0,222

0,000

0,015

OD

Nồng độ Glucose (μg/ml)

419,200

477,200

463,200

453,200

916,000

30,265

Hoạt độ (UI/g)

978,133 1113,467 1080,800 1057,467

4987,111

70,619

0,297

0,255

0,261

0,271

0,001

0,023

OD

603,200

519,200

531,200

551,200

2064,000

45,431

Nồng độ Glucose (μg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

1407,467 1211,467 1239,467 1286,133 11237,333 106,006

0,065

0,113

0,073

0,084

0,001

0,026

OD

Nồng độ Glucose (μg/ml)

93,200

127,200

113,200

111,200

292,000

17,088

Hoạt độ (UI/g)

217,467

296,800

264,133

259,467

1589,778

39,872

0,042

0,059

0,052

0,051

0,000

0,009

OD

Nồng độ Glucose (μg/ml)

139,200

235,200

155,200

176,533

2645,333

51,433

OD

. PHỤ LỤC 18

So sánh hoạt độ amylase của chế phẩm thu được với chế phẩm amylase đang lưu hành trên

Khả năng dịch hóa

Số lần

Trung

Phương sai

Enzyme

Chỉ số

Sai số

bình

0.356

0.347

0.338

0.001

0.023

0.312

OD

Chủng Đ10

Lượng tinh bột (mg/ml)

8.524

8.308

8.099

0.312

0.559

7.466

Hoạt độ (UI/g)

568.269

553.846

539.957

1387.690

37.252

497.756

0.413

0.378

0.398

0.000

0.018

0.403

OD

Chủng Đ56

Lượng tinh bột (mg/ml)

9.894

9.053

9.534

0.188

0.433

9.654

Hoạt độ (UI/g)

659.615

603.526

635.577

834.669

28.891

643.590

0.223

0.215

0.205

0.001

0.025

0.176

OD

Chế phẩm

Lượng tinh bột (mg/ml)

4.197

5.327

5.135

4.886

0.365

0.604

VSHNNĐ

Khả năng đường hóa

Số lần

Trung

Phương sai

Enzyme

Chỉ số

Sai s

bình

0.087

0.000

0.018

OD

0.082

0.107

0.073

Chủng Đ10

173.200

223.200

155.200

183.867

1241.333

35.233

Nồng độ Glucose (μg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

4041.333

5208.000

3621.333

4290.222

675837.037

822.093

0.088

0.000

0.003

OD

0.086

0.087

0.091

Chủng Đ56

181.200

183.200

191.200

185.200

28.000

5.292

Nồng độ Glucose (μg/ml)

Hoạt độ (UI/g)

4228.000

4274.667

4461.333

4321.333

15244.444

123.468

0.242

0.001

0.023

OD

0.217

0.245

0.263

Chế phẩm

492.533

2149.333

46.361

Nồng độ Glucose (μg/ml)

443.200

499.200

535.200

thị trường

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym Amylase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

Nguyeãn Thò Thanh Bình

NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM AMYLASE CUÛA

MOÄT SOÁ CHUÛNG NAÁM SÔÏI PHAÂN LAÄP TÖØ RÖØNG

NGAÄP MAËN CAÀN GIÔØ

Chuyeân ngaønh: Vi sinh vaät hoïc

Maõ soá: 60 42 40

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sử dụng thông tin di truyền trên vùng gen ITS DNA trong định loại các mẫu sâm (Panax L.) thu thập ở tỉnh Hà Giang

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok