Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hiệu quả chuyển phôi nang trữ đông và một yếu tố liên quan tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:83

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Nghiên cứu hiệu quả chuyển phôi nang trữ đông và một yếu tố liên quan tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc" trình bày các nội dung chính sau: Xác định được tỷ lệ sống và chất lượng sau rã đông của phôi nang tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc 2; Xác định tỷ lệ có thai và một số yếu tố liên quan hiệu quả chuyển phôi nang trữ đông tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hiệu quả chuyển phôi nang trữ đông và một yếu tố liên quan tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHÙNG THỊ SƠN Phùng Thị Sơn SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CHUYỂN PHÔI NANG TRỮ ĐÔNG VÀ MỘT YẾU TỐ LIÊN QUAN TẠI BỆNH VIỆN HỖ TRỢ SINH SẢN VÀ NAM HỌC ĐỨC PHÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ Sinh học thực nghiệm 2021 Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Họ và tên: Phùng Thị Sơn Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 842 0114 TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CHUYỂN PHÔI NANG TRỮ ĐÔNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN TẠI BỆNH VIỆN HỖ TRỢ SINH SẢN VÀ NAM HỌC ĐỨC PHÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : Cán bộ hướng dẫn 1 : TS. Nguyễn Trung Nam Cán bộ hướng dẫn 2 : TS. BS. Nguyễn Thị Liên Hương Hà Nội - 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi là Phùng Thị Sơn, học viên lớp Cao học - chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Học viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam, xin cam đoan: 1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Trung Nam và TS. Nguyễn Thị Liên Hương 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này. Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2021 Học viên Phùng Thị Sơn
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn được sự hướng dẫn giúp đỡ tận tình của các thầy cô, anh chị, bạn bè và nhà trường cùng những người thân trong gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.BS. Nguyễn Thị Liên Hương Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc Gia và TS. Nguyễn Trung Nam, Viện phó Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người thầy trực tiếp, tận tâm hết lòng hướng dẫn, tạo điều kiện và cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu tôi đã được sự hướng dẫn và giúp đỡ của rất nhiều của thầy cô và bạn bè để hoàn thành đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến: Tất cả thầy cô giáo, giảng viên và cán bộ nhân viên Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp tôi có lượng kiến thức cơ bản nhất định để hoàn thành các môn học cũng như đề tài luận văn này. Tập thể cán bộ, nhân viên Bệnh Viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thu thập số liệu và hoàn thành luận văn này . Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt trong cuộc sống, học tập và công tác. Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2021 Học viên Phùng Thị Sơn
DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ART: Assisted Reproductive Technologies CI: Confidence Interval DS: Diluent Solution FET: Frozen Embryo Transfer ICM: Inner Cell Mass (Khối tế bào mầm phôi) ICSI: Intra-cytoplasmic Sperm Injection (Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn) HTSS: Hỗ trợ sinh sản IVF: In-Vitro Fertilizaion (Thụ tinh trong ống nghiệm) IVM: In Vitro Maturation (Nuôi trứng non trưởng thành trong ống nghiệm) OR: Odds Ratio PVS: Perivitelline space (Khoang quanh noãn) TE: Trophectoderm (Tế bào lá nuôi) TS: Thawing Solution TTTON: Thụ tinh trong ống nghiệm VS: Vitrification Solution (thủy tinh hóa) WS: Washing Solution
DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1. Phân loại theo độ nở của khoang phôi nang .................................. 10 Bảng 1. 2. Phân loại theo khối tế bào ICM, TE .............................................. 11 Bảng 1. 3. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi nang của tổ chức Alpha .... 12 Bảng 1. 4. Bảng tóm tắt kết quả nghiên cứu của một số tác giả vào chuyển phôi nang ......................................................................................................... 21 Bảng 2. 1. Phân loại chất lượng hình thái phôi nang ...................................... 29 Bảng 3. 1.So sánh chất lượng phôi trước và sau rã đông................................ 37 Bảng 3. 2. Kết quả sau chuyển phôi nang trữ đông ........................................ 37 Bảng 3. 3. Sự liên quan chất lượng phôi chuyển và thai lâm sàng. ................ 38 Bảng 3. 4. Sự tương quan chất lượng phôi trong nhóm chuyển 2 phôi .......... 38 Bảng 3. 5. Sự tương quan chất lượng phôi trong nhóm chuyển 1 phôi .......... 39 Bảng 3. 6. Sự tương quan giữa chất lượng và số lượng phôi chuyển với thai lâm sàng........................................................................................................... 40 Bảng 3. 7. So sánh(OR) tương quan của nhóm 1 với nhóm 2,3,4,5 ............... 40 Bảng 3. 8. Sự tương quan giữa tuổi người mẹ với thai lâm sàng ................... 41 Bảng 4. 1. Tỷ lệ thai lâm sàng trong FET ở một số nghiên cứu ..................... 48 Bảng 4. 2. Kết quả chuyển phôi nang của một số trung tâm HTSS .............. 51 Bảng 4. 3. Số lượng phôi nang chuyển theo tuổi ............................................ 53
DANH MỤC HÌNH Hình 2. 1. Phôi thoát khỏi màng bao xung quanh ........................................... 25 Hình 2. 2. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................ 26 Hình 2. 3. Quy trình rã đông phôi ................................................................... 27 Hình 2. 4. Một số hình ảnh phôi nang. ............................................................ 29 Hình 3. 1. Phân bố nhóm tuổi bệnh nhân ........................................................ 33 Hình 3. 2. Chất lượng trước khi đông ............................................................. 34 Hình 3. 3. Số lượng phôi chuyển .................................................................... 34 Hình 3. 4. Tỷ lệ phôi sống sót ......................................................................... 35 Hình 3. 5. Chất lượng phôi chuyển ................................................................. 35 Hình 3. 6. Hình thái lá nuôi ............................................................................ 36 Hình 3. 7. Hình thái ICM ................................................................................ 36 Hình 3. 8. Kết quả thai theo nhóm tuổi ........................................................... 39
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. TRỮ LẠNH PHÔI ................................................................................... 3 1.1.1. Khái niệm trữ lạnh phôi ........................................................................ 3 1.1.2. Một số chỉ định về trữ lạnh phôi .......................................................... 3 1.1.3. Điều kiện của phôi để được trữ lạnh .................................................... 4 1.1.4. Đánh giá hiệu quả trữ lạnh phôi ........................................................... 4 1.2. CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI TIỀN LÀM TỔ ............ 4 1.2.1. Phôi ở giai đoạn phân chia (ngày 2-3 sau thụ tinh) .............................. 4 1.2.2. Phôi dâu (ngày 4 sau thụ tinh) .............................................................. 5 1.2.3. Phôi nang .............................................................................................. 5 1.3. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI PHÔI NANG ................................. 6 1.3.1. Sự phát triển của khoang phôi nang ..................................................... 7 1.3.2. Hình thái khối tế bào mầm phôi (ICM) ................................................ 8 1.3.3. Hình thái lớp nguyên bào lá nuôi (TE) ................................................. 8 1.3.4. Một số đặc điểm hình thái khác của phôi nang .................................... 9 1.4. NHỮNG TIÊU CHUẨN VÀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI CHẤT LƯỢNG PHÔI NANG .................................................................................... 10 1.4.1. Đồng thuận đánh giá phôi của Gardner D.K (1999) .......................... 10 1.4.2. Đồng thuận phân loại phôi nang của tổ chức Alpha (2011)............... 12 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH PHÔI ....................................... 13 1.5.1. Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification)………….………...…….13 1.5.2. Phương pháp hạ nhiệt độ chậm (slow Freezing)…….……………..14 1.5.3. Phương pháp hạ nhiệt độ nhanh (fast cooling)…………...…….…15 1.6. MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KẾT QUẢ CHUYỂN PHÔI ĐÔNG LẠNH ................................................................................................. 15 1.6.1. Tuổi mẹ ............................................................................................... 15 1.6.2. Chất lượng và số lượng phôi chuyển .................................................. 16 1.6.3. Giai đoạn phát triển của phôi.............................................................. 17 1.6.4. Hỗ trợ phôi thoát màng ....................................................................... 21 1.6.5. Một số yếu tố khác và xu hướng hiện nay .......................................... 21
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 23 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn ........................................................................... 23 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ .............................................................................. 23 2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ...................................... 23 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 23 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................ 23 2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ............................................................................. 23 2.4. QUY TRÌNH CHUYỂN PHÔI ĐÔNG LẠNH..................................... 24 2.4.1. Chuẩn bị niêm mạc tử cung ................................................................ 24 2.4.2. Rã đông phôi ....................................................................................... 24 2.4.3. Kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng (Hatching Assisted)........................ 24 2.5. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU .......................................... 26 2.5.4 Quản lý và xử lý số liệu ....................................................................... 31 2.5.5 Sai số và phương pháp khống chế sai số ............................................. 32 2.6. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU ................................................................... 32 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 33 3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH NHÂN ĐƯỢC CHUYỂN PHÔI NANG TRỮ LẠNH .............................................................................................................. 33 3.1.1. Tuổi ..................................................................................................... 33 3.1.2. Chất lượng phôi trước đông................................................................ 33 3.1.3. Số lượng phôi chuyển ......................................................................... 34 3.2. KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU ............................................. 35 3.2.1. Tỷ lệ sống của phôi sau rã đông ......................................................... 35 3.2.2. Chất lượng của phôi sau rã đông ........................................................ 35 3.2.3. Kết quả thai sau chuyển phôi.............................................................. 37 3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KẾT QUẢ CHUYỂN PHÔI TRỮ ĐÔNG .......................................................................................... 37 3.3.1. Liên quan giữa chất lượng phôi chuyển và tỷ lệ thai lâm sàng. ......... 37 3.3.2. Ảnh hưởng của tuổi người mẹ lên kết quả thai .................................. 39 3.3.3. Sự tương quan giữa chất lượng và số lượng phôi chuyển với thai lâm sàng................................................................................................................ ..40 3.3.4. Bảng sự tương quan giữa tuổi người mẹ với thai lâm sàng ............... 41
Chương 4: BÀN LUẬN .................................................................................. 42 4.1. BÀN LUẬN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 42 4.1.1. Bàn luận về đối tượng nghiên cứu...................................................... 42 4.1.2. Bàn luận về phương pháp đánh giá phôi nang ................................... 43 4.1.3. Bàn luận về chất lượng phôi trước đông ............................................ 43 4.2. BÀN LUẬN VỀ TỶ LỆ SỐNG VÀ CHẤT LƯỢNG PHÔI SAU RÃ ĐÔNG ............................................................................................................. 44 4.2.1. Bàn luận về tỷ lệ sống của phôi sau rã đông ...................................... 44 4.2.2. Bàn luận về chất lượng phôi sau rã đông ........................................... 44 4.3. TỶ LỆ THAI VÀ CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN PHÔI TRỮ ĐÔNG. ................................................... 46 4.3.1. Tỷ lệ thai ............................................................................................. 46 4.3. Ảnh hưởng của các yếu tố liên quan đến hiệu quả chuyển phôi trữ đông ....................................................................................................................... ..48 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 55 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 56 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦATÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .............................................................................. 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 58 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 66 HÌNH ẢNH PHÔI NANG THEO ĐỘ NỞ KHOANG PHÔI ........................ 71 HÌNH ẢNH MẦM PHÔI (INNER CELL MASS /ICM) ............................... 72 HÌNH ẢNH NGUYÊN BÀO LÁ NUÔI (TROPHECTODERM CELL /TE) 73
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ khi em bé đầu tiên ra đời bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON-IVF), ngành hỗ trợ sinh sản đã đạt được rất nhiều thành tựu đáng kể, biến hy vọng mang thai đứa con của chính mình cho nhiều cặp vợ chồng hiếm muộn thành hiện thực. Cho đến nay đã có hơn 8 triệu trẻ sơ sinh ra đời bằng phương pháp này trên toàn thế giới. Nhiều thay đổi đã được thực hiện trong thực hành lâm sàng trong hơn 40 năm qua. Để tăng tỷ lệ thành công cho các chu kỳ TTTON, kích thích buồng trứng (KTBT) đã trở thành thường quy nhằm tạo được nhiều noãn, nhiều phôi, tăng cơ hội có phôi chuyển cho bệnh nhân. Chuyển nhiều phôi giai đoạn phôi phân chia được ưu tiên trong những năm đầu của điều trị lâm sàng của ART do điều kiện nuôi cấy phôi đến giai đoạn phôi nang chưa tối ưu. Mặc dù cải thiện tỷ lệ mang thai và tỷ lệ trẻ sinh sống, nhưng việc chuyển nhiều phôi dẫn đến đa thai được coi là một biến chứng của TTTON do có liên quan đáng kể đến việc gia tăng các kết quả bất lợi về sức khỏe cho cả bà mẹ và trẻ sơ sinh, bao gồm tử vong mẹ, tiền sản giật, tăng huyết áp do thai nghén và đái tháo đường, sinh non, trẻ sinh nhẹ cân… [1] [2]. Trong những năm gần đây, hiệu quả của nuôi cấy và chuyển phôi ngày 5 đã được chứng minh trong các nghiên cứu trên thế giới. Một tổng kết dựa trên 27 nghiên cứu được đăng tải trên tạp chí Cochrance Review 2016 cho thấy tỷ lệ làm tổ, tỷ lệ thai lâm sàng và tỷ lệ sinh sống của chuyển phôi ngày 5, 6 cao hơn so với chuyển phôi ngày 3 trong khi tỷ lệ thai cộng dồn không khác biệt [3]. Như vậy có thể thấy việc nuôi cấy phôi ngày 5 là lựa chọn tốt để rút ngắn thời gian thành công của IVF. Ngoài ra, thành công của kỹ thuật trữ lạnh, rã đông và chuyển phôi đông lạnh với tỷ lệ sống sau rã có thể đạt gần 100% đã góp phần không nhỏ trong việc tiết kiệm được thời gian và nhân sự trong một đơn vị TTTON, đồng thời giảm chi phí điều trị và nâng cao tỉ lệ thành công cho người bệnh. Với khả năng nuôi cấy được nhiều phôi nang, kỹ thuật đông rã phôi nang đạt hiệu quả cao, đồng thời khả năng lựa chọn phôi tốt ngày càng được cải tiến, đa số các trung tâm có xu hướng chỉ chuyển 1-2 phôi và ưu tiên chuyển phôi giai đoạn phôi nang. Các nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới thành công của chu kỳ chuyển phôi nang đông
2 lạnh như tuổi của mẹ, chất lượng niêm mạc tử cung của mẹ và số lượng, chất lượng phôi sau rã đông…vv. Tuy nhiên, tại Việt Nam, kỹ thuật nuôi và chuyển phôi nang đông lạnh vẫn còn chưa được nghiên cứu nhiều, đặc biệt là với một trung tâm được đầu tư trang thiết bị và nhân lực tốt thì tỷ lệ phôi nang sống sau rã đông, kết quả có thai khi chuyển phôi nang có đạt chuẩn cao tương đương các lab tiên tiến trên thế giới hay không, yếu tố liên quan nhất đến kết quả có thai khi chuyển phôi nang là yếu tố nào? Để trả lời những câu hỏi này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu hiệu quả chuyển phôi nang trữ đông và một số yếu tố liên quan tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc” nhằm hai mục tiêu: 1. Xác định được tỷ lệ sống và chất lượng sau rã đông của phôi nang tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc 2. Xác định tỷ lệ có thai và một số yếu tố liên quan hiệu quả chuyển phôi nang trữ đông tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc.
3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TRỮ LẠNH PHÔI 1.1.1. Khái niệm trữ lạnh phôi Với việc sử dụng kỹ thuật kích thích buồng trứng (KTBT) để cải thiện và đơn giản hóa các quy trình TTTON người ta có thể thu nhận được một số lượng noãn lớn và kết quả là nhiều phôi được tạo thành cùng một lúc. Tuy nhiên không thể chuyển vào cơ thể người mẹ quá nhiều phôi, hoặc người mẹ chưa sẵn sàng để nhận phôi chuyển, vì thế các phôi tốtc ó khả năng làm tổ cao còn lại đã được trữ lạnh sau đó rã đông và chuyển phôi vào 1 chu kỳ khác. Từ đó quy trình trữ lạnh phôi ra đời đã góp phần nâng cao hiệu quả của các phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm. Mười năm sau khi Whitingham thành công trên việc trữ lạnh phôi chuột, năm 1983 Trounson và Mohr đã báo cáo trường hợp có thai đầu tiên từ phôi người trữ lạnh [4]. Kể từ đó, việc trữ lạnh phôi được biết đến và tiếp tục phát triển mạnh. Điều này thu hút các nhà khoa học tập trung nghiên cứu vào lĩnh vực này kéo theo sự thay đổi không ít của các trung tâm hỗ trợ sinh sản. Hiện tại kỹ thuật trữ lạnh – rã đông – chuyển phôi đông lạnh được thực hiện thường quy với tỷ lệ làm tổ của phôi đông lạnh cũng tương tự như của phôi tươi. Từ đó việc trữ lạnh phôi người phát triển nhanh chóng và trở thành hướng mở không thể thiếu trong TTTON. 1.1.2. Một số chỉ định về trữ lạnh phôi - Còn dư phôi chất lượng tốt sau chuyển phôi tươi. - Bệnh nhân có nguy cơ bị hội chứng quá kích buồng trứng nặng. - Xuất huyết nội. - Niêm mạc tử cung không thuận lợi để chuyển phôi: nghi ngờ polyp buồng tử cung, nhân xơ tử cung dưới niêm mạc, niêm mạc quá mỏng hoặc bị dính buồng tử cung, chu kỳ xin – cho noãn không hợp nhất được vòng kinh…vv - Không chuyển phôi đúng thời điểm do các lý do cá nhân hoặc các bệnh lý toàn thân như ung thư, điều trị hóa chất, tia xạ….
4 - Chuyển phôi khó do catheter không qua được cổ tử cung. - Hiến phôi. - Bệnh nhân đông phôi toàn bộ. 1.1.3. Điều kiện của phôi để được trữ lạnh Phôi được chọn phải có chất lượng tốt và có khả năng sống sót cao và tiếp tục phát triển tốt sau khi được rã đông. - Phôi có thể đông ở các giai đoạn khác nhau như phôi ngày 1 (hợp tử - zygote), các giai đoạn phân chia sớm hoặc giai đoạn phôi nang (blastocyte). Ở mỗi giai đoạn có các tiêu chuẩn khác nhau để phôi được trữ lạnh, các tiêu chuẩn này lại phụ thuộc vào mỗi trung tâm hỗ trợ sinh sản khác nhau. 1.1.4. Đánh giá hiệu quả trữ lạnh phôi Hiệu quả của việc trữ phôi được đánh giá trước tiên qua khả năng sống của phôi sau khi rã đông. Cấp độ thứ hai là khả năng phát triển của phôi trong môi trường nuôi cấy và cấp độ thứ ba là khả năng phát triển của phôi sau khi được chuyển vào tử cung người mẹ. - Ít nhất 2 giờ sau rã đông, kiểm tra và đánh giá phôi trên kính hiển vi đảo ngược. - Tính tỷ lệ sống sau rã đông phôi nang. - Theo dõi Beta hCG sau 14 ngày chuyển phôi. - Theo dõi thai lâm sàng, thai tiến triển. 1.2. CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI TIỀN LÀM TỔ 1.2.1. Phôi ở giai đoạn phân chia (ngày 2-3 sau thụ tinh) Khoảng 24 - 26 giờ sau khi diễn ra sự thụ tinh giữa noãn và tinh trùng, hợp tử bắt đầu sự phân chia đầu tiên đối xứng qua trục (symmetry). Một mặt phẳng xích đạo được tạo thành bởi đường thẳng định hướng theo các thể cực và phân chia phôi thành 2 cực gọi là cực phôi (embryonic pole) và cực đối phôi (abembryonic pole). Sự phân chia của hợp tử - một tế bào thành phôi có hai phôi bào xảy ra một cách chính xác để sau khi phân chia, một trong hai tế bào sẽ định hướng về cực phôi và tế bào còn lại sẽ định hướng về cực đối phôi. Tiếp theo, mỗi phôi bào lại phân chia đối xứng qua trục theo cơ chế phân bào
5 nguyên phân tạo thành phôi bốn tế bào. Các phôi bào sắp xếp thành hình tứ diện trong không gian hình cầu được tạo thành bởi màng trong suốt (Zona pellucida-ZP). Cứ mỗi 12 - 15 giờ, các phôi bào lại phân chia để nhân đôi số lượng. Lần phân bào đầu tiên thường kéo dài hơn những lần phân bào sau đó [5]. Thông thường, phôi sẽ mất khoảng 72 giờ để đạt đến giai đoạn 8 tế bào [5]. 1.2.2. Phôi dâu (ngày 4 sau thụ tinh) Khoảng đầu ngày thứ 4 sau thụ tinh, khi số lương phôi bào đã nhiều, có từ 12 - 16 phôi bào, bắt đầu xảy ra hiện tượng kết đặc dẫn đến hình thành các liên kết chặt chẽ giữa các phôi bào. Nhìn mặt ngoài đám phôi bào giai đoạn này là một khối xù xì, lổn nhổn những phôi bào, trông giống như một quả dâu nên gọi là phôi dâu. Các tế bào của phôi dâu không chỉ sẽ là nguồn gốc của phôi và các màng gắn chặt với phôi, mà còn là nguồn gốc của rau và một số cấu trúc liên quan. Bổ đôi một phôi dâu, vùng trung tâm chủ yếu là các đại phôi bào và được bao bọc bởi các tiểu phôi bào sắp xếp ở ngoại vi. Màng trong suốt vẫn tồn tại ở giai đoạn này, bọc ngoài phôi dâu. Do vậy, trong quá trình kết đặc, các phôi bào và các mảnh vụn tế bào không hình thành liên kết với các phôi bào khác sẽ bị đẩy ra ngoài khối phôi nhưng vẫn ở phía trong màng trong suốt cho tới khi phôi thoát màng [7]. Quan sát dưới kính hiển vi, khi mới hình thành, hình thái của phôi dâu được thể hiện bằng sự tăng tiếp xúc giữa các phôi bào, nhưng ranh giới giữa các phôi bào còn nhìn thấy. Khi quá trình kết đặc tăng dần, ranh giới giữa các phôi bào trở nên khó phân biệt do các phôi bào dàn phẳng ra và kết liền với nhau. Phôi dâu lúc ở giai đoạn này hoàn toàn trông như một tế bào có nhiều nhân [8]. 1.2.3. Phôi nang Vào khoảng cuối ngày thứ 4, đầu ngày thứ 5 (100 giờ) sau thụ tinh, phôi dâu từ vòi trứng di chuyển vào trong buồng tử cung và bị vùi trong chất dịch do nội mạc tử cung tiết ra. Chất dịch này thấm qua màng trong suốt, vào tới các khoảng gian bào xen giữa các tiểu phôi bào và đại phôi bào ở một cực của phôi, làm cho các khoảng gian bào thông với nhau và hợp thành một khoang ngày càng rộng gọi là khoang phôi nang. Thời điểm này phôi dâu trở thành phôi nang. Do áp lực thuỷ tĩnh trong khoang phôi nang ngày càng tăng cao, sẽ đẩy khối
6 đại phôi bào về một cực của phôi nang, cực này gọi là cực phôi (embryonic pole), còn cực đối lập với cực phôi là cực đối phôi (antiembryonic pole). Thành bên và khoang phôi nang được cấu tạo bởi một hàng tiểu phôi bào dẹt. Trần của khoang phôi nang là khối đại phôi bào, các tiểu phôi bào còn phủ cả mặt ngoài khối đại phôi bào và hướng về phía cực phôi. Những đại phôi bào sẽ tạo ra phôi chính thức và một số bộ phận phụ của phôi như màng ối, các túi noãn hoàng nguyên phát, thứ phát và niệu nang, do đó được gọi là nguyên bào phôi hay khối tế bào mầm phôi. Những tế bào dẹt có nguồn gốc từ tiểu phôi bào sẽ tạo thành lá nuôi và màng đệm, sẽ tham gia vào sự cấu tạo phần rau có nguồn gốc từ trứng thụ tinh, do đó được gọi là các tế bào lá nuôi [8]. Từ ngày thứ 5, phôi nang thoát ra khỏi màng trong suốt nhờ sự tác động của enzym tiêu hủy. Phôi nang bộc lộ hoàn toàn khối tế bào phôi nguyên thủy đang tiếp tục phân chia và tiếp xúc trực tiếp với nội mạc tử cung. Sau một khoảng thời gian ngắn lọt vào buồng tử cung, phôi nang dính chặt vào lớp biểu mô của nội mạc tử cung để bắt đầu giai đoạn làm tổ phôi từ ngày thứ sáu đến ngày thứ chín, cùng lúc các tế bào liên kết của lớp đệm nội mạc tử cung chịu sự biến đổi do sự hiện diện của phôi nang và sự tác động của progesteron do hoàng thể tiết ra bằng cách biệt hóa thành những tế bào chế tiết hay tế bào rụng. Phản ứng của lớp đệm được gọi là phản ứng màng rụng [9]. Để đảm bảo phôi phát triển và làm tổ, số lượng phôi bào của phôi nang và tỷ lệ giữa số lượng nguyên bào phôi và số lượng các tế bào lá nuôi được chi phối và điều hòa bởi hệ thống gen. Ở người, tốc độ phân chia của các tế bào lá nuôi nhanh hơn so với tốc độ phân chia của nguyên bào phôi. Phôi nang ngày 5 có khoảng 60 phôi bào, tăng đến 160 vào ngày 6 và trên 200 sau khi thoát màng vào ngày 7 [10]. 1.3. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI PHÔI NANG Trong vài năm gần đây, cùng với sự phát triển của hệ thống nuôi cấy phôi hiện đại dựa trên những hiểu biết đầy đủ về sự phát triển của phôi giai đoạn sau nén đã cho phép kéo dài thời gian nuôi cấy phôi trong ống nghiệm đến giai đoạn phôi nang. Bên cạnh đó, lý do mà đa số các nghiên cứu ủng hộ cho việc nuôi cấy phôi kéo dài và chuyển phôi giai đoạn phôi nang là có thể lựa chọn được phôi có sức sống tốt nhất, tiềm năng làm tổ cao nhất và khả năng đồng bộ với niêm mạc tử cung của mẹ để tăng kết quả của một chu kỳ thụ tinh trong ống
7 nghiệm đồng thời giảm số lượng phôi chuyển, giảm nguy cơ đa thai. Hiện nay, trên thế giới đã có những hướng nghiên cứu kết hợp sử dụng các đặc điểm hình thái của phôi nang và xét nghiệm sàng lọc di truyền của phôi với mục đích lựa chọn phôi tiềm năng nhất sử dụng chuyển phôi nhằm tăng hiệu quả của chu kỳ IVF [11]. Đa phần các nghiên cứu vẫn ủng hộ cho chuyển phôi giai đoạn phôi nang và chủ yếu sử dụng những tiêu chuẩn hình thái để lựa chọn phôi chuyển [12], [13]. Năm 2011, Maheshwari A. và cộng sự trong một nghiên cứu tổng hợp các kết quả chuyển phôi ở các quốc gia thuộc châu Âu và châu Mỹ, cũng nhận thấy có sự gia tăng tỉ lệ chuyển phôi giai đoạn phôi nang và đặc biệt là chuyển phôi đơn [14]. Hệ thống đánh giá hình thái phôi giai đoạn phôi nang được 2 tác giả là Gardner D. K. và Schoolcraft W. B. Đề cập lần đầu tiên vào năm 1999 đã nhanh chóng được áp dụng tại hầu hết các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm trên thế giới dựa trên 3 tiêu chí: sự phát triển của khoang phôi nang, đặc điểm của khối tế bào mầm phôi (ICM - Inner Cell Mass) và đặc điểm của nguyên bào lá nuôi (TE - Trophectoderm) [15]. 1.3.1. Sự phát triển của khoang phôi nang Sự phát triển của phôi nang được xác định khi bắt đầu xuất hiện những khoang chứa dịch của bản thân khối phôi. Lượng dịch tiết ngày một nhiều và tích tụ lại để hình thành một khoang, sau này sẽ phát triển thành khoang phôi nang. Cùng thời điểm này, khối tế bào trong phôi cũng có những thay đổi quan trọng, biệt hóa để hình thành 2 loại tế bào và số lượng tế bào cũng tăng lên nhanh chóng. Việc nghiên cứu thời điểm và mức độ phát triển của khoang phôi nang có vai trò rất quan trọng, các kết quả nghiên cứu của Gardner D. K. và cộng sự năm 2000; Ahlstrom A. và cộng sự năm 2011, đều cho cùng một kết luận về vai trò của khoang phôi nang gắn với tiềm năng phát triển của phôi nang [16] [17]. Năm 2013, Van den Abbeel E và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của các tiêu chuẩn về hình thái phôi nang đến khả năng tiên lượng thành công của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm, cũng nhận thấy có mối tương quan giữa độ giãn rộng của khoang phôi nang với tỉ lệ có thai sinh sống [18]. Cùng năm 2013, Thompson S. M. và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá độ giãn rộng của khoang phôi nang có liên quan đến việc tiên lượng tỉ lệ thai lâm sàng và thai sinh sống của một chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm [19]. Như vậy, đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá và kết luận vai trò của tốc độ phát triển khoang phôi nang đến kết
8 quả của quá trình tiên lượng cũng như dự kiến kết quả thành công của một chu kỳ chuyển phôi nang. 1.3.2. Hình thái khối tế bào mầm phôi (ICM) Ngay khi phôi nang phát triển đầy đủ, thể tích khoang chiếm toàn bộ thể tích khối phôi, cần có thêm những tiêu chí để phân loại chất lượng phôi nang rõ ràng hơn. Vì lúc này phôi nang đã hình thành 2 loại tế bào với các đặc trưng hình thái khác nhau. Các tế bào ở lớp phía ngoài của phôi nang sẽ có đặc điểm giống như một lớp tế bào biểu mô dạng dẹt. Chúng có xu thế dẹt lại để hình thành lớp "biểu mô" làm ranh giới của phôi nang với môi trường xung quanh. Lớp tế bào này là nguyên bào lá nuôi (TE - Trophectoderm). Những tế bào nằm trong lòng khoang phôi nang thường có kích thước lớn hơn, tập trung thành một cụm và nằm lệch về một cực của phôi nang, được gọi là khối tế bào mầm phôi (ICM - Inner Cell Mass) [9]. Nghiên cứu của Balaban B. Năm 2000, chỉ ra có mối liên hệ chặt chẽ giữa đặc điểm về hình thái của ICM với kết quả có thai lâm sàng. Nếu ICM càng lớn và các tế bào liên kết càng chặt thì tỉ lệ thành công khi chuyển những phôi này sẽ cao hơn [20]. Năm 2011, Ahlstrom A. và cộng sự đã tiến hành hồi cứu đánh giá vai trò độc lập của từng yếu tố ảnh hưởng đến việc đánh giá tiên lượng tỉ lệ có thai [16]. Kết quả cho thấy vai trò quan trọng của hình thái ICM trong việc đánh giá tiên lượng kết quả tỉ lệ thai sinh sống. Khi chuyển phôi nang có ICM tốt thì tỉ lệ thai sinh sống lên tới 45,3% và tỉ lệ này giảm dần khi chất lượng ICM kém đi. Tương tự trong nghiên cứu của Van den Abbeel E. và cộng sự về mối liên hệ giữa các đặc điểm hình thái của phôi nang và kết quả của chu kỳ chuyển phôi đơn, nhận thấy vai trò của việc phân loại ICM trong khả năng tiên lượng sảy thai sớm, phôi có ICM xấu cho tỉ lệ sảy thai cao hơn so với phôi có ICM tốt. 1.3.3. Hình thái lớp nguyên bào lá nuôi (TE) Nguyên bào lá nuôi (Trophectoderm - TE) là những tế bào có kích thước nhỏ hơn so với tế bào mầm phôi, nằm bọc phía ngoài ngay sát màng trong suốt. Nguyên bào lá nuôi có thể dễ dàng phân biệt so với khối tế bào mầm phôi khi phôi nang bắt đầu giãn rộng. Về mặt phôi thai học, TE giữ vai trò quan trọng trong việc giúp cho phôi làm tổ vào niêm mạc tử cung của mẹ. Đặc biệt những hiểu biết gần đây về vai trò của lớp TE tại cực phôi. Chúng tiết ra một số yếu
9 tố hỗ trợ, hoạt hóa với niêm mạc tử cung tại vị trí phôi làm tổ. Các tế bào lá nuôi này còn thực hiện chức năng giúp cho phôi thoát ra khỏi màng trong suốt vẫn bao bọc phôi trong suốt giai đoạn phôi phân chia và biệt hóa trước đó [8]. Năm 2012, Honnma H. và cộng sự đã công bố nghiên cứu trên 1087 chu kỳ rã đông và chuyển phôi nuôi cấy ngày 5 sau rã đông, khẳng định lại vai trò quan trọng của tế bào lá nuôi chứ không phải khối tế bào mầm phôi trong việc xem xét đánh giá lựa chọn phôi để chuyển. Phải chăng có sự vô lý khi đánh giá vai trò của TE quan trọng hơn so với ICM trong quá trình phát triển của phôi nang ở giai đoạn sớm [21]. Năm 2013, De Paepe C. và cộng sự, trong nghiên cứu của mình, đã phần nào giải thích vai trò quan trọng của tế bào lá nuôi ở giai đoạn phát triển sớm của phôi nang. Ngoài ra tác giả còn nhận thấy khi nuôi cấy độc lập phôi nang chỉ có các tế bào lá nuôi (đã tách bỏ khối tế bào phôi), các tế bào này sẽ tiếp tục biệt hóa để hình thành ICM mới [22]. Đây là một quan niệm mới và khác biệt với những hiểu biết trước đây về việc hình thành 2 khối tế bào có kích thước khác nhau ngay từ những ngày đầu của quá trình phân cắt phôi. 1.3.4. Một số đặc điểm hình thái khác của phôi nang Thoái hóa phôi bào: Phôi bào bị thoái hóa có thể do tổn thương không hồi phục (hoại tử) hoặc do chết theo chương trình (apoptosis). Các tế bào thoái hóa do hoại tử thường trương phồng, màng tế bào mất tính liên tục. Trong khi đó, tế bào chết theo chương trình thường teo đét lại, nhân tế bào vỡ ra thành nhiều mảnh, sau đó tế bào cũng phân rã làm nhiều mảnh nhỏ [8]. Nghiên cứu của Hardy năm 1989 cho thấy tỷ lệ tế bào thoái hóa xấp xỉ nhau ở TE và ICM, khoảng
10 (nhóm phôi có chất lượng tốt, tỷ lệ trẻ sinh sống là 45,2%), các nhóm phôi mang bất thường hình thái đem lại tỷ lệ sinh sống giảm. Cụ thể: phôi nang có mảnh vỡ bào tương và có tế bào TE thoái hóa tỷ lệ trẻ sinh sống là: 32,8%; phôi có tỷ lệ tế bào không tham gia vào khối phôi nang ≤20%: 16,7%; phôi có tế bào TE và ICM thoái hóa: 7,7% và phôi nang có kích thước rất nhỏ với tỷ lệ tế bào không tham gia tạo cấu trúc phôi nang >20% đem lại tỷ lệ sinh sống chỉ 1,2% [24]. 1.4. NHỮNG TIÊU CHUẨN VÀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI CHẤT LƯỢNG PHÔI NANG Dựa vào những đặc điểm của phôi nang: sự phát triển của khoang phôi nang, hình thái khối tế bào mầm phôi và hình thái của lớp tế bào lá nuôi, nhiều tiêu chuẩn phân loại chất lượng phôi nang đã ra đời và được áp dụng rộng rãi tại nhiều trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới. Hệ thống đánh giá hình thái phôi giai đoạn phôi nang được 2 tác giả là Gardner D. K. và Schoolcraft W. B. đề cập lần đầu tiên vào năm 1999 đã nhanh chóng được áp dụng tại hầu hết các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm trên thế giới [15]. 1.4.1. Đồng thuận đánh giá phôi của Gardner D.K (1999) * Đánh giá bước 1 dựa vào khoang phôi nang và hiện tượng thoát màng. (Hình ảnh ở phụ lục 1). Bảng 1.1. Phân loại theo độ nở của khoang phôi nang Độ Đặc điểm nở Phôi nang giai đoạn sớm (early blastocyst) khi khoang dịch chiếm dưới 50% tổng thể tích của phôi 1 Phôi nang (blastocyst) khi khoang dịch chiếm từ trên 50% tổng thể tích của phôi. 2 3 Phôi nang đầy: khoang dịch chiếm hầu hết thể tích của phôi