Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym Amylase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:110

Thêm vào BST

Báo xấu

122
lượt xem 17
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của việc thực hiện luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym Amylase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ là nhằm tuyển chọn và khảo sát được một số chủng NS sinh α-Amylase và Glucoamylase cao từ RNM Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym Amylase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

THƯ BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO VIỆN TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH Nguyeãn Thò Thanh Bình NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM AMYLASE CUÛA MOÄT SOÁ CHUÛNG NAÁM SÔÏI PHAÂN LAÄP TÖØ RÖØNG NGAÄP MAËN CAÀN GIÔØ Chuyeân ngaønh: Vi sinh vaät hoïc Maõ soá: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: TS. TRAÀN THANH THUÛY Thaønh phoá Hoà Chí Minh, Thaùng 8 - 2010
LỜI CẢM ƠN Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến TS. Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận văn này. Tôi xin ghi nhớ công ơn tất cả Quý Thầy Cô trong Khoa Sinh, và trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành công việc nghiên cứu thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khóa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học, Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm. Cuối cùng tôi xin gởi lời biết ơn đến Ba Má, hai em và bạn bè đã luôn yêu thương và ủng hộ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2010 NGUYỄN THỊ THANH BÌNH
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu, kết quả trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Bình
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC Carboxymethy cellulose dd Dung dịch DNS 3, 5 – dinitrosalicylic acid Hđamylase Hoạt độ amylase HST Hệ sinh thái KL Khuẩn lạc KS Kháng sinh MT Môi trường NS Nấm sợi NXB Nhà xuất bản OD Optical density (mật độ quang) PTN Phòng thí nghiệm RNM Rừng ngập mặn SV Sinh vật VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật
MỞ ĐẦU Amylase là một loại enzym thủy phân tinh bột quan trọng nhất trong công nghệ sinh học. Nó có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside, α-1,6 glucoside của amylose và amilopectin, làm tăng tốc độ đường hóa tinh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chóng, rút ngắn thời gian hình thành sản phẩm. Amylase thu nhận từ VSV nói chung, từ NS nói riêng có nhiều ưu điểm nổi bật hơn các loại amylase từ thực vật và động vật như: hoạt tính enzym cao hơn, khả năng chịu nhiệt cao, thời gian thu enzym nhanh, giá thành rẻ, có thể sản xuất ở quy mô công nghiệp với nguồn nguyên liệu đơn giản và rẻ tiền. Với những ưu thế nổi trội, NS trở thành nguồn nguyên liệu dồi dào, đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất enzym. Do đó, trong vòng 50 năm trở lại đây, các chế phẩm enzym từ NS đã dần thay thế enzym từ động vật. Các chủng NS sinh amylase cao như: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Rhizopus,... Với phạm vi ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực phẩm, dược phẩm, công nghệ lên men, công nghiệp dệt nên khối lượng chế phẩm amylase được sản xuất hàng năm trên thế giới lên tới hàng chục vạn tấn và ngày một gia tăng. Chính vì vậy, việc tìm kiếm các chủng NS sinh amylase cao luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước. Trong quá trình tìm kiếm ấy, con người luôn quan tâm đến NS sống trong các hệ sinh thái đặc biệt. Nằm giữa đất liền và biển cả, RNM Cần Giờ có môi trường sống vốn khắc nghiệt, mang tính cạnh tranh cao, làm tăng khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học giúp SV thích nghi tốt với điều kiện sống. Nơi đây lưu trữ, bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá của vùng ven biển nhiệt đới từ thực vật, động vật và cả VSV. Hơn nữa, Việt Nam là nước có nguồn tinh bột và phụ phẩm nông nghiệp khá dồi dào là điều kiện thuận lợi để ứng dụng amylase thu nhiều sản phẩm. Có thể nói cho đến nay, sự hiểu biết về khu hệ NS ở RNM và vai trò của chúng trong hệ sinh thái này còn quá ít và chưa đầy đủ. Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn enzym từ các NS, cũng như mong muốn thu nhận được các chủng NS mang đặc tính quý, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”.  Mục tiêu đề tài Tuyển chọn và khảo sát được một số chủng NS sinh α-amylase và glucoamylase cao từ RNM Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh  Nhiệm vụ của đề tài - Phân lập các chủng NS thu nhận từ RNM Cần Giờ.
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase các chủng NS phân lập được - Tuyển chọn 2 chủng sinh amylase cao tiếp tục khảo sát - Phân loại đến chi các chủng NS đã tuyển chọn - Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn - Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thu nhận amylase - Thu nhận chế phẩm amylase thô và so sánh với enzym thương mại trên thị trường. - Khảo sát các đặc tính sinh học khác  Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng là các chủng NS phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây, …ở RNM Cần Giờ - Phạm vi nghiên cứu gồm 5 xã: Bình Khánh, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Long Hòa, Lý Nhơn thuộc RNM huyện Cần Giờ.  Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài - Thời gian: Từ tháng 8/2009 – 7/ 2010 - Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh - Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. KHÁI QUÁT VỀ RNM CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH 1.1.1. Đặc điểm các nhân tố sinh thái cơ bản RNM Cần Giờ là một hệ sinh thái ngập mặn có vai trò và vị trí đặc biệt quan trọng đối với MT và cộng đồng dân cư địa phương trong vùng. Là rừng mới tái sinh nhưng RNM Cần Giờ là Khu Dự trữ Sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam với hệ thực vật và động vật rất phong phú mang tính đa dạng sinh học cao [34], [39]. Hình 1.1. Rừng ngập mặn Cần Giờ Về vị trí địa lý khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp. Hồ Chí Minh. Tọa độ: 10°22’ – 10°40’ độ vĩ Bắc và 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đông. Cách trung tâm Tp. Hồ Chí Minh khoảng 70km, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35 km, từ Đông sang Tây là 30 km [39]. Ở RNM Cần Giờ, nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 – 70C. Khí hậu nóng ẩm và chịu sự chi phối của quy luật gió mùa xích đạo. Nhiệt độ không khí có ảnh hưởng khá lớn đến sinh trưởng, phát triển của sinh vật RNM. Chapman (1977) cho rằng RNM chỉ phát triển khi biên độ nhiệt ở tháng lạnh nhất cao hơn 200C, và biên độ dao động theo mùa không quá 100C [36], [34], [39]. Trong các nhân tố khí hậu ở RNM thì lượng mưa là nhân tố quan trọng. Ở đây, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 1 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400 mm hàng năm. Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu vực Tp.Hồ Chí Minh: mùa mưa là 70 – 83%, mùa
khô là 74 – 77%; ẩm nhất vào tháng 9, khô nhất vào tháng 4. Lượng nước bốc hơi bình quân 4mm/ ngày và 1204mm/tháng [34]. Ngoài ra, gió cũng là nhân tố tác động tới sự phân bố của thực vật RNM qua sự ảnh hưởng tới độ thoát hơi nước và tác động tới sự phát tán bào tử VSV [36]. Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hoá, quá trình nhiễm mặn đồng thời nó được phát triển trên một đầm mặn mới do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai mang đến lắng đọng tạo thành nền bùn ngập mặn. Độ mặn của nước ở Cần Giờ phụ thuộc rất nhiều yếu tố như gió mùa, thuỷ triều, mưa, nước dâng và đặc biệt chịu ảnh hưởng rõ rệt từ nguồn nước ngọt ở thượng nguồn chảy xuống (do hoạt động của hồ Trị An, Dầu Tiếng…) đã làm thay đổi qui luật hoạt động nhiễm mặn ở Cần Giờ. Độ mặn nơi đây dao động 1,8 – 3%. Độ mặn là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, tỉ lệ sống của các loài cây ngập mặn và phân bố của RNM. Hầu hết cây ngập mặn sinh trưởng tốt ở nước có độ mặn từ 25% đến 50% độ mặn nước biển. Nhiều ý kiến cho rằng, muối là nhân tố quan trọng, tác động thông qua quá trình chọn lọc tự nhiên thích nghi, tạo điều kiện để cây ngập mặn tồn tại, phát triển [36]. RNM Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển Đông. Mỗi tháng có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch. Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [39]. Chế độ bán nhật triều với biên độ triều cao là một trong những nhân tố thuận lợi cho RNM sinh trưởng so với vùng có nhật triều. Các dòng hải lưu ở đây là nhân tố chính giúp phát tán quả, hạt, trụ mầm và SV dọc theo các vùng ven biển. 1.1.2. Đặc điểm của các khu hệ SV tại RNM Cần Giờ RNM Cần Giờ có hệ SV vô cùng đa dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài đem lại những giá trị kinh tế cao. Về thực vật: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 150 loài thực vật, các loài chủ yếu như Bần trắng, Mấm trắng, các quần hợp Đước đôi - Bần trắng cùng Xu, Ổi, Trang, Đưng… Các loại cây nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm – ôrô, dừa lá, ráng… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp [66]. Động vật: bao gồm động vật thủy sinh không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên 130 loài, 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nước (Varanus salvator), trăn đất (Python molurus), trăn gấm (Python reticulatus) … Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ [66]. Thảm động thực vật nơi này trở thành nguồn cung cấp thức ăn và nơi trú ngụ cho rất nhiều loài thủy sinh, các động vật có xương sống và hệ VSV.
Vi sinh vật rất đa dạng gồm có: vi khuẩn, nấm, tảo  Vi khuẩn VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong hệ sinh thái này. Số lượng VK trong rừng ngập mặn chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát. Nhiều loài sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển [36].  Nấm Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng, phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích thước lớn. Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác lá thực vật (Fell và cộng sự, 1975). Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai MT trở lên [36]. Người ta tìm thấy trên lá cây ngập mặn có các loài nấm ký sinh và hoại sinh như: Ascomycetes, Bacidomycetes và Deuteromycetes. Người ta đã tìm thấy 6 chi nấm có mặt trên lá cây Đước đỏ (R. mangle) khi còn trên cây: Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium và Aureobacidium [36]. Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho các cây chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium và Cercospora. Hầu hết các loài nấm trên đất liền đều có trên lá cây ngập mặn, còn các loài nấm biển thì có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn. Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm phân huỷ phát triển. Các mẫu gỗ để ngâm trong nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao [36] Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là sinh vật phân huỷ đầu tiên nhờ khả năng phân giải cellulose, lignin. Fell và Masters (1973) đã nghiên cứu toàn bộ quá trình phân hủy của lá cây ngập mặn đồng thời phân lập được 66 chi nấm, đại diện là các chi Phycomycetes, Thraustochytrium, Aspergillus, Penicillium, Tricoderma, Fusarium… Đa số các loại nấm được phân lập trên lá, gỗ và cây con thường là nấm hoại sinh góp phần phân huỷ xác thực vật. Chúng còn góp phần phân huỷ cỏ biển, bùn và đầm lầy mặn. Những loài này chịu được điều kiện mặn của RNM [36].  Tảo Tảo mọc ở RNM thường làm thành lớp phủ màu hồng, nâu hoặc lục nhạt phát triển trên các MT: bề mặt bùn, bề mặt thân cây, rễ, những cành và tán phía trên. Trong đó trên bề mặt bùn gồm cả tảo đơn bào, tảo đa bào mà chủ yếu là tảo xanh lục. Người ta liệt kê có khoảng 41
loài tảo silic trên mặt bùn quần xã RNM; Chúng không hình thành trên các vùng rõ ràng mà tùy thuộc vào độ ngập triều [36]. Tảo bùn có tầm quan trọng trong kinh tế đất vì nó làm tăng hàm lượng hữu cơ trong đất nhờ quá trình quang hợp. Tảo còn tạo ra độ thoáng khí giữa các hạt đất, tiết ra các chất nhầy hình thành phức hệ keo, tảo xanh lục dị dưỡng làm tăng hàm lượng đạm cho đất nhờ khả năng cố định đạm [36]. Các SV trong RNM làm nên sự đa dạng sinh học của các quần xã RNM, chúng là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật chất ở RNM Cần Giờ. 1.1.3. Vai trò của RNM đối với hệ sinh thái RNM có liên quan mật thiết với các đầm lầy mặn, các bãi bùn, bãi cỏ ven biển hoặc các quần xã cửa sông khác. Dòng nước ngọt đổ từ thượng nguồn ra biển, dòng nước triều từ biển lên xuống các vùng cửa sông đều đi qua RNM. Các dòng nước này vận chuyển vật chất, SV từ quần xã này tới quần xã khác và như vậy hệ sinh thái RNM chính là nơi giao lưu của các quần xã, tạo nên sự phong phú về thành phần SV cho nơi này [36]. Hệ thực vật RNM bao gồm các loài thực vật (Sú, Vẹt, Mắm, Đước, Bần,…) sống trong vùng nước mặn, hệ rễ của cây góp phần vào việc làm giảm tốc độ dòng chảy của thủy triều, tạo điều kiện lắng đọng bùn, các vật chất lơ lửng, chúng góp phần bảo vệ vùng ven bờ; cung cấp các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc,…Bên cạnh đó, hệ thực vật còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa khí hậu, cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển [34]. RNM còn là nơi kiếm ăn, sinh sản và cư trú của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá,... Mới đây, Bell và cộng sự (1984) khẳng định RNM là vườn ươm quan trọng cho các loài cá sống ở cửa sông. Khi so sánh thành phần các loài cá và tôm trong một vùng có RNM vào các mùa vụ trong năm đều thấy lượng con non của các loài này đều cao hơn hẳn các vùng đất, cát ở ngoài đầm. Từ đây cho thấy RNM là nơi nuôi dưỡng chính cho con non của nhiều loài hải sản [36] Các loài động thực vật, VSV sống trong MT tự nhiên của RNM Cần Giờ liên kết với nhau thông qua các quá trình trao đổi chất và đồng hóa năng lượng nhằm khép kín chu trình dinh dưỡng của hệ sinh thái này. Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng đều chịu sự ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngoài như: thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa. RNM phát triển tốt nhất ở nước có nồng độ muối 15 - 25‰ [36] Tuy nhiên, hiện nay RNM đang có những thay đổi đáng kể trước áp lực của việc đánh bắt cá, tôm,… khai thác gỗ, củi, nhiên liệu, nuôi trồng thủy sản, du lịch… Sự tác động này nếu quản lý không tốt thì các vùng đất RNM sẽ bị suy thoái và không thể tồn tại lâu bền.
1.2. TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI 1.2.1. Đặc điểm sinh học của NS NS là VSV có nhân chuẩn. Hệ nấm có cấu tạo khuẩn ty dạng sợi, sợi nấm (hypha) là những ống dài phân nhánh hay không phân nhánh, có hay không có vách ngăn ngang (septum), đường kính sợi từ 3-3,5 µm. Các sợi nấm phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể [58]. Hình1.2. Cấu trúc sợi nấm Cấu trúc sợi nấm gồm có thành tế bào, màng, tế bào chất và nhân. Thành tế bào NS chứa kitin-cellulose hoặc kitin-glucan [58]. Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm. Khuẩn lạc NS thường có dạng hình tròn hoặc gần tròn. Bề mặt KL có thể mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khứa xuyên tâm hoặc lồ lõm không đều. Mép KL trơn, răng cưa [60] Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm. Các đặc điểm hình thái khác có tính đặc trưng cho loài như bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hòa tan [58],... Phương thức dinh dưỡng của NS là hấp phụ qua màng, không có cơ quan tiêu hóa, không có khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật.
Hình1.3: Hình thái khuẩn ty NS Hình1.4 Hình thái khuẩn lạc NS Hình1.5: Hình thái một số dạng bào tử của NS NS sinh sản chủ yếu bằng bào từ, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính. Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất. Trong sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [59]. NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học như: enzym, các chất KS, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích kinh tế cao. Bên cạnh đó, từ NS còn có các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro ứng dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất [1], [57], [59].  Khả năng sinh các enzym ngoại bào NS đã trở thành nguồn VSV chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzym. Hiện nay, từ NS người ta đã sản xuất được trên 80 loại enzym khác nhau, trong đó có 10 enzym được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật. Một số enzym ngoại bào từ NS được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như cellulase, protease, amylase, pectinase và chitinase [21], [26], [29].  Cellulase là enzym xúc tác phân giải các hợp chất lingo –cellulose thành glucose. Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemi- cellulose và lignin (15-30%). Các chủng NS Trichoderma, Penicillium, Aspergillus…có khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất thải hữu cơ, các xác bã thực vật chứa cellulose ở RNM [21].  Protease là enzym thủy phân các phân tử protein tạo thành các chuỗi polypeptide ngắn. NS có khả năng phân giải mạnh protein chứa trong các xác bã động vật ở RNM thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,…Protease còn được sử dụng nhiều trong công nghiệp bột
giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải...[29].  Amylase là enzym xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucpside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. NS có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là những tác nhân không thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor… Amylase được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt....[21].  Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua, ốc rất nhiều. Nhiều loài NS thuộc chi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… có khả năng sinh chitinase, giúp tăng cường khả năng tiêu diệt các loài nấm gây bệnh và chống các loài côn trùng có vỏ kitin. [21]. Các chủng NS thuộc chi Acremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả năng sinh các enzym phân giải dầu góp phần xử lý ô nhiễm dầu giúp bảo vệ MT tự nhiên và SV sống ở RNM Cần Giờ [35].  Khả năng sinh KS của NS KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện trượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác. Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỷ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn. Chất KS được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu thuật, chúng được dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương [11]. Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS. Những vấn đề về chất KS được sinh ra từ VSV đang là mối quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [11]. Ngoài ra, trước nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều trong công nghệ thực phẩm, công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học. Axit hữu cơ sản xuất từ NS được nghiên cứu nhiều hơn: Năm 2004, Võ Thị Hạnh nghiên cứu sản xuất axit citric bằng NS Aspergillus niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì; các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum [29]. Bên cạnh những lợi ích trên, nhiều loài NS là nguyên nhân gây hư hỏng hoặc giảm chất lượng của thực phẩm, dụng cụ quang học,... Một số NS tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung
thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số NS gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm chân tay…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bông ở lúa…[6], [7]. 1.2.2. Vị trí phân loại Cho đến nay, người ta ước tính trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài. Riêng các loài nấm thuộc lớp Nấm bất toàn ở nước ta hiện chỉ mới phát hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Việc phân loại NS chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản [6]. Về phân loại nấm, hiện nay có hai hệ thống phân loại nấm được sử dụng phổ biến hơn cả là: Hệ thống phân loại hình thái học và hệ thống phân loại phát sinh, với nhiều khóa phân loại được sử dụng như: Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Barnett và cộng sự (1972), Ainsworth G.C và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995). Trong luận văn này, chúng tôi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại của Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Nguyễn Lân Dũng (2006) [57]. Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của sinh học phân tử đã đem lại phương pháp mới cho việc nghiên cứu phân loại học. Người ta sử dụng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen (PCR-Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả phân loại nhanh và chính xác [40]. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu khu hệ NS ở RNM nói chung và NS sinh amylase ở RNM nói riêng. Hiện nay có khoảng 800 – 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995 ; Jones, 1995), trong khi đó một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu biết về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu hệ sinh thái này còn quá ít và chưa đầy đủ. Có thể nói đây là một mảng rỗng của ngành VSV học (Agate A.D., Subraramnian, C. V and Anuci, V, 1998) [43]. Sự nghiên cứu về nấm RNM chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950. Những năm đầu, việc nghiên cứu xác định tính đa dạng của nấm trong RNM còn rất lẻ tẻ, nhưng sau này các nhà khoa học đã thành lập hội nghiên cứu nấm toàn thế giới trong đó có nấm biển ở RNM. Nhiều nước trên thế giới đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hóa các loài nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ. Ví dụ : Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông 170 loài, Đài Loan 7 loài, Singapore 156 loài, Nhật 26 loài, Úc 67 loài, Mexico 94 loài, Đức 4 loài, Thái Lan 83 loài,…[49] Năm 1979, Kohlmeyer phân lập 42 loài vi nấm RNM thuộc các ngành phụ Ascomycotina, Deuteromycotina và Basidiomycotina
Năm 1987, Hype và cộng sự công bố phát hiện được 89 loài nấm từ cây Rhizophora mucronata lanak ở RNM Ấn Độ [48]. Năm 1988, Agate A. D., Subramania C. V và Vanuci M., đã nêu ra 8 lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV ở RNM cần các nhà khoa học giải quyết, trong đó có sự phân loại, hệ thống hóa cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới [43]. Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới. Trong đó bao gồm 87 loài thuộc Ascomycetes, 31 loài thuộc Deuteromycetes và 2 loài thuộc Basidiomycetes. Năm 1994, Newell S.Y phân lập được các loài nấm nhày (Oomycetes) ưa mặn từ lá cây mục ở RNM, có khả năng phân hủy xác động vật, thực vật ở đó. Năm 1995, Hyde và Lee ; Kohlmeyer et al., đưa ra nhận định các nấm RNM đóng vai trò quan trọng đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM. Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị Hằng và cộng sự về nấm sợi RNM Giao Thủy, Nam Định. Năm 2001, tác giả này tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh enzym ngoại bào của 144 chủng phân lập từ RNM Giao Thủy. Năm 2002, Mai Thị Hằng nghiên cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi RNM ở hai tỉnh Nam Định, Thái Bình [52]. Với rừng RNM, những phát hiện khoa học đầy thú vị chưa dừng lại ở đó. Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được: ở các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau. Đó là các loài NS thuộc một số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Canninghamela có khả năng phân giải dầu DO rất mạnh [69]. Theo nhóm nghiên cứu của Phan Nguyên Hồng và Nguyễn Hoàng Trí, những chất thải rắn trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với các hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ sinh vật ở đây, làm trong sạch nước biển. Chính vì thế “người ta đã ví RNM là quả thận khổng lồ lọc các chất thải cho MT vùng ven biển” [69]. Năm 2004, Phan Thị Phương Hoa nghiên cứu phân loại 67 chủng NS thuộc chi Aspergillus phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình. Đây là một nghiên cứu được đánh giá cao trong số các nghiên cứu về NS ở RNM Việt Nam [8]. Đến năm 2007 mới có tác giả Khưu Phương Yến Anh“Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ” [1] Năm 2009, có tác giả Nguyễn Thị Bích Viên “Khảo sát một số đặc tính sinh học của một số chủng NS thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân lập được từ RNM Cần Giờ” [41].
Bên cạnh việc tìm kiếm những chủng NS mới ở RNM, người ta còn nghiên cứu các đặc tính sinh học của chủng này. Ví dụ, để thu nhận amylase thì dùng các chủng Aspergillus, Rhizopus. Một số loài của Neurospora, Mucor tổng hợp rất mạnh cả hai loại α-amylase và glucoamylse (Rodzevits, Butova 1965, Fennkxova. Rư-zakova 1966 ; Phillips, Caldwell 1951. Corman Lanalu-ke, 1948) [17]. Một số công trình nghiên cứu của Azarova (1981) ; Jerebtxov, Pankratove (1977) cho thấy glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối tới glucose [17]. Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B.N. Okolo đã tiến hành tinh sạch và xác định một số tính chất của amylase phân giải tinh bột sống mới từ A. cacbonarius Năm 2008, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công trình “Nghiên cứu về α-amylase ngoại bào của chi Aspergillus” của Baldwin, Toby M, …cho thấy sự liên quan giữa việc sinh α- amylase và glucoamylase của chi nấm này [15]. Tại Việt Nam, năm 1974, tác giả D. V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ A. niger. Năm 1977, tác giả L. V. Chứ, Đ. T. T Thu nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase với đối tượng A. awamorii . Đến năm 1984, N. B Ngà và N. L Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài A. oryzae, A. niger, A. awamorii có hoạt tính α-amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn. Năm 1993, có công trình : “Nghiên cứu chọn lọc chủng Asp. niger TH3 – 19K của Nhật Bản có hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” của tác giả D. V Hợp và cộng sự. Năm 1998, Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy có công trình “Thu nhận amlyse từ nấm mốc Aspergillus sp” [2]. Ở Việt Nam, viện Sinh học Nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII, BioIII… có dạng bột, chứa các enzym protease, cellulase, amylase và các VSV dùng bổ sung vào thức ăn cho cá, heo, bò. Chế phẩm có tác dụng phòng chống chứng rối loại tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao…[57]. Năm 2002, Mai Thị Hằng và cộng sự cũng có những khảo sát về khả năng sinh enzym amylase của NS phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình [10] Năm 2009 tác giả Nguyễn Thị Lan Hương “Nghiên cứu về khả năng sinh enzym amylase của một số chủng NS ở RNM Cần Giờ” [15].
Có thể nói những nghiên cứu về NS sinh amylase trên đất liền khá phong phú và đa dạng, còn những nghiên cứu về amylase của NS từ RNM Cần Giờ vẫn còn khá ít ỏi, chưa tương xứng với tiềm năng. 1.3. TINH BỘT VÀ HỆ ENZYM AMYLASE 1.3.1. Tinh bột Tinh bột không phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và amilopectin [5].  Thành phần cấu trúc của amylose. Amilose là loại mạch thẳng, chuỗi dài từ 500-2000 đơn vị glucozơ, liên kết nhau bởi liên kết α−1,4 glicozit. Hình1.6 – Phân tử Amilose  Thành phần cấu trúc của amilopectin Amilopectin là polyme có mạch nhánh, ngoài mạch chính có liên kết α-1,4 glucozit còn có nhánh liên kết với mạch chính bằng liên kết α-1,6 glucozit. Cấu tạo của amilopectin còn lớn và dị thể hơn amilose nhiều. Trong tinh bột tỉ lệ amiloza/amilopectin khoảng ¼. Tỉ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ và cách chăm sóc. Hình1.7 – Phân tử amilopectin Ở nước ta, nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú. Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm [5], [23], [28]. 1.3.2. Hệ enzym amylase Amylase là tên gọi của một nhóm enzym có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và
glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin [15], [31], [44]. Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là: 1.3.2.1. α – amylase hay α-1,4-glucohydrolase Là enzym phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amilose và amilopectin một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào cả. Việc tác dụng α – amylase lên hồ tinh bột làm giảm nhanh khả năng bắt màu của tinh bột với iod và độ nhớt của dịch hồ, amilose tạo thành maltose và maltotriose. Nếu trong thời gian dài thì sản phẩm thủy phân của amilose chứa 13% glucose và 87% maltose. Còn amilopectin sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose [5], [21]. α – amylase thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành maltose và dextrin phân tử thấp không tạo màu với iod. Chúng có ở thực vật, động vật và đặc biệt là ở rất nhiều VSV. α – amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối, rượu loãng. Tất cả các α – amylase đều chứa từ 1-30 nguyên tử gam canxi (Ca)/mol. Nếu tách hoàn toàn Ca khỏi phân tử enzym thì α – amylase mất khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia hình thành và ổn định enzym. Ca còn tác dụng đảm bảo α – amylase có độ bền cực lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các enzym phân giải protein [21] α – amylase từ các nguồn thu nhận khác nhau thường không giống nhau. + pH thích hợp cho hoạt động của đa số α – amylase từ NS là 4,5 – 5,5; của đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 4,7 – 5,4; và của VK là 5,5 – 6. pH tối thích của α – amylase từ A. oryzae là 4,8 – 5,8 [26]. + Độ bền của α – amylase với tác dụng của axit từ NS được sắp xếp theo thứ tự sau: A. batatae > A. usamii> A. oryzae> A. awamori> B. subtilis> thóc mầm [21]. + α – amylase của NS rất nhạy cảm với hoạt động của nhiệt độ tối thích khoảng 40 - 500C, thóc mầm và malt là 58 – 600C và VK là 70 – 750C [21]. α – amylase hầu như không tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tinh bột rất nhanh. Thủy phân tinh bột bằng α – amylase thường xảy ra hai giai đoạn: * Giai đoạn đầu: (Giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt từ hồ tinh bột giảm α-amylase Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp * Giai đoạn 2: (Giai đoạn đường hóa) thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành [17] Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose 1.3.2.2. β – amylase hay β (1 - 4) glucomaltohydrolase
Là ngoại enzym chỉ phân cắt các liên kết α – 1,4 glucoside ở đầu mạch. Chỉ phổ biến ở thực vật, nhiều ở hạt nảy mầm. Vi khuẩn không có enzym này, còn NS chưa được chứng minh hoàn toàn về sự hiện diện của enzym này [5], [21]. β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vô hoạt hoàn toàn ở 700C nhưng trong dịch nấu thì nhiệt độ tối thích là 60 – 650C. Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3-4. Đa số β – amylase hoạt động mạnh hơn ở MT pH 4,5-5 và vẫn giữ được hoạt tính khi không có canxi. Điểm khác biệt của enzym này so với α-amylase là hầu như không tác dụng lên tinh bột sống mà chỉ phân giải hồ tinh bột. Chúng phân giải 100% amilose và 54-58% amilopectin thành maltose [26]. 1.3.2.3. Glucoamylase hay amyloglucozidaza, còn gọi là γ-amylae Đây là enzym đường hóa quan trọng nhất trong hệ amylase. Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử trên mạch amilose và amilopectin tạo sản phẩm cuối cùng là glucose. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, dextrin và maltose thành glucose [21], [26], [44]. Trong số các VSV có khả năng sinh glucoamylase đã được biết cho đến nay, chi Aspergillus là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rất cao, đặc biệt là loài Aspergillus niger. Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 – 5,0. Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH kiềm. Ví dụ glucoamylase của loài Coniphora cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH=9, glucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH=8 [21], [44]. Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 – 600C. Tuy nhiên, cũng có trường hợp glucoamylase hoạt động tốt nhất ở 65 – 700C, ví dụ như glucoamylase của loài C. thermosaccharolytium. Glucoamylase bị ức chế mạnh bởi Hg+ nhưng các ion Mn 2+ và Fe2+ lại có tác dụng kích thích sự hoạt động của enzym này [5], [21], [29]. 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của NS a. Giống nấm sợi Trong các yếu tố thì chủng giống NS là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình thành và hàm lượng amylase. Không phải tất cả các chủng nấm đều có khả năng tổng hợp amylase như nhau. Ngày cả những chủng cùng chi, thậm chí cùng loài cũng rất khác nhau về lượng enzym do chúng sản sinh ra. Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng NS có khả năng tạo nhiều amylase là điều vô cùng quan trọng [26], [31].
Bên cạnh việc tuyển chọn được chủng NS có khả năng sinh amylase cao, cần phải đồng thời tiến hành nuôi cấy trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzym cao nhất và ổn định nhất. Sau đó, cần phải tiến hành bảo quản giống một cách cẩn thận để giữ được hoạt tính ban đầu. b. Nguồn dinh dưỡng Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn tới hoạt động sống và sự tạo thành enzym của NS. Vì vậy, trong MT nuôi cấy cần bảo đảm đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với từng loại NS [26]  Nguồn dinh dưỡng cacbon Trong MT nuôi cấy NS sinh amylase nhất thiết phải có nguồn tinh bột làm chất cảm ứng và nguồn cacbon. NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat dễ hấp thu nhất với NS là glucose - là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [26]. Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác nhau cũng có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành các enzym riêng biệt của hệ amylase. Ví dụ như để đảm bảo hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh bột, còn với glucoamylase là 2% [26]. Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Trong đó cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt khác, khi chế tạo MT, các nguyên liệu này chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu [26].  Nguồn dinh dưỡng nitơ Nguồn dinh dưỡng nitơ để nuôi NS tạo amylase thường được dùng dưới các dạng muối vô cơ chủ yếu là NaNO3 hoặc NH4NO3 với hàm lượng 0,91% có hiệu quả cao hơn các loại muối khác. Các hợp chất N hữu cơ thường dưới dạng nguyên liệu giàu đạm như: cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô dầu,…[21], [26]. Khi sử dụng nguồn nitơ nhất định cho vào MT có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hóa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế tổng hợp α-amylase. Tỉ lệ giữa cacbon và nitơ trong MT có ý nghĩa rất lớn đối với sự tạo thành amylase. Chỉ khi nào trong MT có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết mới tích lũy được enzym cực lớn. Trong MT Czapeck tỉ lệ giữa tinh bột và NaNO3 là 18:1 [21].