Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHAN THỊ THÚY

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐÔNG HẦU VÀNG (TURNERA ULMIFOLIA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, NĂM 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHAN THỊ THÚY

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY ĐÔNG HẦU VÀNG (TURNERA ULMIFOLIA)

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM THỊ THANH NHÀN

THÁI NGUYÊN, NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn: “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro

cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia)” là công trình nghiên cứu của riêng

tôi. Mọi kết quả thu được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu

khác. Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018

Tác giả luận văn

Phan Thị Thúy

iii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp

đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn,

người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong

quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin được cảm ơn các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, bộ phận

Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên

đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Trần Thị Hồng, cán bộ phòng

thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học

Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi tiến hành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân trong

gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi

trong suốt thời gian học tập.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018

Tác giả luận văn

Phan Thị Thúy

iv

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................... iii

LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... iv

MỤC LỤC ........................................................................................................... v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... iv

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v

DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2

3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1.1. Giới thiệu chung về cây Đông hầu vàng ...................................................... 3

1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học ....................................................... 3

1.1.2. Giá trị cây Đông hầu vàng ................................................................................ 5

1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây Đông hầu vàng trên thế giới và ở Việt Nam ........ 7

1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng ....................................... 8

1.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................... 9

1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro .................................................... 9

1.2.3. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro ............................................... 12

1.3. Thành tựu của nhân giống in vitro ............................................................. 15

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 17

2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu .................................... 17

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 17

2.1.2. Hóa chất nghiên cứu ....................................................................................... 17

2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................................... 17

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 17

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 17

2.2.1. Phương pháp pha môi trường ......................................................................... 17

v

2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro ....................................................................... 17

2.2.3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu ........................................................... 22

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23

3.1. Nghiên cứu công thức vô trùng mẫu .......................................................... 23

3.2. Nghiên cứu môi trường kích thích hạt Đông hầu vàng nảy mầm .............. 24

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây

Đông hầu vàng ................................................................................................... 25

3.4. Nghiên cứu tạo đa chồi cây Đông hầu vàng ............................................... 28

3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi cây Đông

hầu vàng ..................................................................................................................... 28

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh chồi cây

Đông hầu vàng ........................................................................................................... 30

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng phát

sinh chồi cây Đông hầu vàng .................................................................................... 32

3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát sinh

chồi cây Đông hầu vàng ............................................................................................ 34

3.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng phát sinh chồi cây

Đông hầu vàng ........................................................................................................... 36

3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ cây Đông

hầu vàng ............................................................................................................. 39

3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng .. 39

3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng .... 40

3.6. Nghiên cứu giá thể thích hợp đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên .. 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 45

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ ĐƯỢC CÔNG

BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .............................................................. 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 47

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

Murashige and Skoog Môi trường MS MS

Khử trùng KT

Công thức CT

6- Benzylamino purine BAP

Kinetin 6- Fururolamino purine

Gibberellic acid 3 GA3

α- Naphthaleneacetic acid NAA

3- Indolebutyric acid IBA

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2,4- D

Nhà xuất bản NXB

Cộng sự cs

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Công thức khử trùng hạt cây Đông hầu vàng ................................... 18

Bảng 2.2. Công thức giá thể ra cây Đông hầu vàng .......................................... 22

Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt cây Đông hầu vàng ....................................... 23

Bảng 3.2. Tỷ lệ nảy mầm của hạt Đông hầu vàng ở các môi trường ................ 25

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông

hầu vàng .......................................................................................... 26

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng . 29

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng .... 31

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng phát sinh chồi

cây Đông hầu vàng .......................................................................... 33

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát sinh chồi

cây Đông hầu vàng .......................................................................... 35

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng tạo mô sẹo ở lá Đông hầu vàng .... 37

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây

Đông hầu vàng ................................................................................. 38

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng ...... 40

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng ....... 41

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu sau 8 tuần ............ 43

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây Đông hầu vàng ............................................................................. 3

Hình 1.2. Hoa và hạt cây Đông hầu vàng ............................................................ 4

Hình 3.1. Hạt Đông hầu vàng sau khử trùng ..................................................... 24

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nước dừa 100 ml/l và than hoạt tính 1,5 g/l đến sự

sinh trưởng của cây Đông hầu vàng .................................................. 27

Hình 3.3. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT2 sau 4 tuần......... 30

Hình 3.4. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT3 .......................... 30

Hình 3.5. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT2 .......................... 34

Hình 3.6. Hình ảnh mô sẹo và chồi tái sinh từ mô sẹo sau 4 tuần .................... 38

Hình 3.7. Kết quả tạo rễ cây Đông hầu vàng trên môi trường CT3 .................. 42

Hình 3.8. Cây Đông hầu vàng sau khi lấy ra khỏi bình .................................... 43

Hình 3.9. Cây Đông hầu vàng in vitro trong vườn ươm ................................... 43

Hình 3.10. Sơ đồ quy trình nuôi cấy in vitro cây Đông hầu vàng ..................... 44

vi

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Dược liệu có vai trò rất quan trọng trong đời sống con người. Từ xưa,

ông cha ta đã biết sử dụng, chế biến dược liệu để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe.

Ngày nay, nhu cầu sử dụng dược liệu của người dân ngày càng gia tăng bởi ít

tác dụng phụ và phù hợp với quy luật sinh lý của cơ thể. Theo Tổ chức Y tế

Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay trên thế giới vẫn dựa vào thuốc

có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng [43]. Theo số liệu

thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30-50 tấn các loại

dược liệu khác nhau để sử dụng trong y học cổ truyền làm nguyên liệu cho

công nghiệp Dược và xuất khẩu. Trong đó, trên 2/3 khối lượng này được khai

thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn

cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới trên 20.000 tấn mỗi năm [1]. Do không có

chính sách quản lí chặt chẽ nên nhiều loài cây dược liệu tự nhiên bị khai thác ồ

ạt, không chú ý tới bảo vệ, tái sinh làm cho nguồn tài nguyên dược liệu giảm

sút nghiêm trọng, nhiều loài đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Yêu cầu đặt

ra là cần phải bảo tồn nguồn gen, nhân nhanh các loài cây dược liệu quý hiếm

và tìm ra những loài cây dược liệu thay thế.

Hiện nay, nhu cầu làm đẹp của phái nữ ngày một gia tăng mạnh mẽ. Tuy

nhiên, các mỹ phẩm tổng hợp và pha chế được bán trên thị trường thường gây

hại cho da sau một thời gian sử dụng. Vì vậy, các công ty dược- mỹ phẩm phải

tìm đến những hợp chất được chiết xuất từ những cây cỏ tự nhiên. Ở Việt Nam

có rất nhiều cây thuốc quý được sử dụng để cải thiện sắc đẹp như: trinh nữ

hoàng cung, ngưu tất, hà thủ ô, cây rau sam, diệp hạ châu, cây lá bỏng, lá dâu

tằm, lá trầu không,…[47]. Cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) là loài cây

có nhiều công dụng đối với cơ thể, đặc biệt có tác dụng làm đẹp cho phụ nữ

như làm trắng da, kéo dài tuổi thanh xuân. Tuy nhiên, ở nước ta hiện nay, cây

1

Đông hầu vàng là cây nhập nội với số lượng hạn chế, cần được nhân nhanh để

tạo nguồn giống.

Nuôi cấy mô tế bào là một kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh

học thực vật. Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào đạt được đã chứng tỏ

khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn

những loài quý hiếm.

Từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Xây dựng quy trình

nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia)” nhằm phát triển

cây Đông hầu vàng làm thuốc ở Việt Nam.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera

ulmifolia).

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu công thức khử trùng hạt Đông hầu vàng.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây

Đông hầu vàng.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin, tổ hợp nhóm cytokinin và

auxin, 2,4- D đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ cây Đông

hầu vàng.

- Nghiên cứu giá thể thích hợp để đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên.

2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Đông hầu vàng

1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học

Cây Đông hầu vàng có tên tiếng Anh là Yellow Turnera, Yellow Alder,

Yellow Elder, West Indian Holly hay Sage Rose. Tên tiếng Việt là Đông hầu

vàng, Kim ngân, Dừa thái vàng hay Dừa vàng. Tên khoa học là Turnera

ulmifolia, là một loài thực vật thuộc chi Đông hầu (Turnera), phân họ Hoa thời

chung hay phân họ Đông hầu (Turneroideae), họ Lạc tiên (Passifloraceae)

(trước đây chi này được đặt trong họ Đông hầu (Turneraceae), bộ Sơ ri

(Malpighiales) [2], [6]. Cây Đông hầu vàng có nguồn gốc từ Châu Mỹ. Ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhất là châu Mỹ và châu Phi có 20 họ và 120 loài.

Một số loài thuộc chi Đông hầu như Turnera arcuata, Turnera

angustifolia Mill., Turnera aurelii, Turnera caerulea, Turnera candida, Turnera

chamaedryfolia, Turnera difusa Willd. Ex Schult., Turnera ulmifolia L., Turnera

velutina, Turnera weddelliana…[44].

Hình 1.1. Cây Đông hầu vàng

Các cây thuộc họ Đông hầu từ lâu đã được biết đến như một loại thảo

dược nổi tiếng ở châu Mỹ với công dụng tăng cường sức khỏe sinh sản, được

người Maya cổ và người Mexico sử dụng rộng rãi. Y học hiện đại thì coi đây

như một loại trà kích thích khả năng sinh lý. Lá Đông hầu còn có lợi ích tốt cho

phụ nữ trong thời kỳ kinh nguyệt, giảm chuột rút, mệt mỏi, lo lắng và đau đầu

3

do khả năng điều tiết và cân bằng nội tiết tố nữ [40]. Đại diện duy nhất của họ

này tại Việt Nam là cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) có nguồn gốc ở

Mexico và Tây Ấn [42].

Cây Đông hầu vàng là một loại cây có phân bố địa lý rộng. Cây được

nhập cư rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Cây thích nghi với

nhiều loại đất, điều kiện môi trường và có khả năng sinh sản cao nên định cư

được ở các môi trường sống mới. Sự phân tán hạt trong loài này là do khả năng

thu hút kiến làm cho những con kiến vận chuyển hạt giống trong khoảng cách

tương đối ngắn tạo thuận lợi cho việc hình thành quần thể dày đặc và tăng khả

năng tạo ra hạt [16], [18], [45].

Cây Đông hầu vàng là cây bụi nhỏ, cao khoảng 1m, phân nhiều cành. Lá

đơn, mọc so le, hình trái xoan hẹp, dài khoảng 5-6cm, rộng 2,5cm, hai đầu nhọn,

mép khía răng cưa nhọn, gân lá hình lông chim, nổi rõ, gốc phiến lá có 2 tuyến

nhỏ, cuống ngắn có lông mềm, vò lá có mùi hăng nhẹ [6].

Hoa cây Đông hầu vàng là hoa đơn, thường nở vào buổi sáng, tàn vào

buổi trưa, hoa mẫu năm, đường kính hoa 5-6cm, cuống ngắn, mọc ra từ cuống

lá, 2 lá bắc hẹp dài, 5 lá đài hình mũi mác nhọn, do các lá đài và cánh hoa họp

lại tạo thành, các thùy của tràng xếp vặn, nhị 5 xen kẽ với cánh hoa và không có

vành phụ, vòi nhụy rời và xẻ nhiều ở đỉnh (mỗi vòi có dạng bút lông), 5 cánh

hoa hình bầu dục, màu vàng, mặt trong gốc cánh hoa màu vàng nâu, có 5 nhị rời

và bầu nhẵn. Ra hoa quanh năm, rộ nhất vào mùa hè [6].

Hình 1.2. Hoa và hạt cây Đông hầu vàng

4

Quả Đông hầu vàng có hình cầu, nhiều hạt, quả bế, khi già nở tung tạo

điều kiện cho hạt phát tán ở khảng cách ngắn [41]. Hạt Đông hầu vàng nhỏ,

màu nâu sẫm, nảy mầm vào mùa xuân, được bảo quản ở nhiệt độ thường.

1.1.2. Giá trị cây Đông hầu vàng

Cây Đông hầu vàng có hương thơm nồng, vị hơi đắng. Lá được dùng

làm hương liệu cho mùi rượu. Ở Mexico, người ta dùng để thay thế cho cây trà.

Tác dụng của cây là bồi bổ, xổ nhẹ và lợi tiểu, chống suy nhược, làm thuốc kéo

dài tuổi thanh xuân cho cả nam và nữ [41], [46].

Thành phần chính của cây Đông hầu vàng gồm: Flavonoid (22 hợp chất

khác nhau), arbutin (chiếm 7%), tinh dầu (khoảng 0,5%), deltacadinee (10%),

thymol (4%), cyanogenic glycosides (tetraphyllin, 7 hợp chất khác nhau), maltol

glucoside, phenolics, monoterpenoids, sesquiterpenoid, triterpenoid, polyterpene

ficaprenol-11, axit béo, caffeine, ethanol, nhựa thông, chất nhựa, alkaloid [34],

[38], [46].

Flavonoid có tác dụng chống đông máu, phòng ngừa viêm loét niêm mạc

dạ dày và tá tràng, giảm thương tổn dạ dày do sự kết hợp của indomethacin và

bethanechol, giảm chứng loét dạ dày do stress gây ra [24].

Khả năng kích thích tình dục có thể do một loại alkaloid trong cây thuốc

có tác dụng như hormone sinh dục testosterone ở nam [48].

Dịch chiết Đông hầu vàng có khả năng bảo vệ gan, chống lại tổn thương

gan gây bởi carbon tetrachloride [46].

Arbutin trong cây Đông hầu vàng có tác dụng làm trắng da nhờ khả năng

ức chế enzyme sản sinh melanin mà không có tác dụng phụ, chống lão hóa và

ngăn các gốc tự do. Tinh dầu giúp tinh thần sảng khoái, giảm đau bụng kinh,

kinh nguyệt không đều, chống nhiễm trùng, làm căng da, mịn da [41].

Cây Đông hầu vàng chứa chất thymol có tác dụng kích thích lên cơ thể

và giúp hồi phục hệ thần kinh. Chất này được dùng cho các bệnh nhân bị bệnh

suy nhược hay suy nhược thần kinh ở mức độ nhẹ cho đến vừa phải [41].

5

Cây Đông hầu vàng có khả năng cải thiện sức khỏe sinh sản, giúp trị

xuất tinh sớm và bất lực ở nam, điều hòa nội tiết và kinh nguyệt ở nữ [41].

Cây Đông hầu vàng có đặc tính lợi tiểu và khử trùng nước tiểu, do đó nó

được dùng để trị các bệnh nhiễm trùng các cơ quan tiết niệu như bệnh viêm

bàng quang, viêm ống dẫn nước tiểu. Bên cạnh đó, chất nhựa trong cây có tác

dụng như dịch vị dạ dày giúp tiêu hóa tốt, do đó, cây cũng được dùng để trị

bệnh táo bón do cơ ruột co bóp kém [24], [46].

Chiết xuất của Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) cùng với Parkia

platycephala Benth và Dimorphandra Gardneriana được sử dụng trong chống

nhiễm trùng giun sán ở các loại gia súc nhai lại nhỏ như ở dê [31].

Chiết xuất từ Đông hầu vàng và Mentha arvensis L. khi kết hợp với thuốc

chống nấm Metronidazole làm cho khả năng kháng nấm Candida tropicalis

được tăng cường [36].

Cao Đông hầu được cô đặc từ hơn 7 loại cây thuốc quý hiếm như Đông

hầu vàng, Thành ngạnh, Dây cóc,… có tác dụng làm căng da, mờ nhăn, kích

thích quá trình tăng sinh collagen gấp 8 lần so với bình thường, phục hồi da,

làm trẻ hóa da và chống lão hóa, làm se khít lỗ chân lông, cân bằng độ ẩm và

trị mụn hiệu quả cao [49].

Ngoài ra, các loài trong chi Đông hầu còn được sử dụng để điều trị các

bệnh như thiếu máu, viêm phế quản, ho, tiểu đường, giảm đau, phổi và các

bệnh đường hô hấp, rối loạn da [46].

Cây thuốc, vị thuốc Đông hầu vàng có thể có những dạng bào chế như

thuốc viên, bột, cao, trà, rượu thuốc. Cây thuốc này thường được dùng kết hợp

với các thuốc khác để tăng cường tác dụng của thuốc. Liều dùng khác nhau đối

với từng bệnh nhân, lứa tuổi và tình trạng sức khỏe. Thuốc không được dùng

cho trẻ em, phụ nữ mang thai hoặc đang cho con bú, những người bị bệnh gan,

tiểu đường hoặc quá mẫn cảm với các thành phần trong cây [48].

6

1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây Đông hầu vàng trên thế giới và ở Việt Nam

Công trình nghiên cứu đầu tiên về đặc tính viagra của cây Damiana

(thuộc họ Đông hầu) (1999) cho thấy rằng sức khỏe sinh sản của chuột được

cải thiện khi được uống chất chiết từ cây này[41].

Năm 2002, theo các nhà khoa học Brazil, hoạt chất chủ yếu của cây Đông

hầu vàng (ở thân và lá) là các hợp chất flavonoid, có tác dụng chống oxy hóa

và chống các vết loét. Thử trên chuột, cho thấy hoạt chất của cây này có tác

dụng phòng chống viêm loét dạ dày và hành tá tràng. Trong bệnh viêm loét dạ

dày do stress, chất chiết trong môi trường nước của cây này cũng có tác dụng

làm giảm từ 50-58% với liều 0,5-1 g/kg thể trọng. Các kết quả nghiên cứu

trong phòng thí nghiệm phù hợp với kinh nghiệm dân gian ở Brazil là dùng trà

Đông hầu vàng để chữa các bệnh chủ yếu liên quan đến viêm loét dạ dày và

hành tá [24].

Năm 2006, các nhà khoa học thuộc Khoa Phân tích lâm sàng và Chất

sinh học Brazil đã nghiên cứu sơ bộ về hoạt động chống oxi hóa của Turnera

ulmifolia. Nghiên cứu sử dụng chiết xuất hydroethanol 50% được đánh giá

bằng hệ thống oxy hóa kết hợp axit beta-carotene/linoleic để ức chế quá trình

oxy hóa và ức chế peroxidation lipid ở chuột đồng, có sử dụng các chất phản

ứng thiobarbituric acid và chemiluminescence. Kết quả cho thấy chiết xuất này

có hoạt tính chống oxy hoá (77,4 ± 10%) cao hơn alpha-tocopherol (vitamin E)

(58,4 ± 3,7%) [30].

Cũng trong năm 2006, các nhà khoa học thuộc Khoa Dược, Đại học

Granada, Tây Ban Nha đã nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm đường ruột của

thân, lá Đông hầu vàng. Nghiên cứu được thử nghiệm trong mô hình viêm đại

tràng chuột do axit trinitrobenzenesulphonic (TNBS) gây ra. Kết quả thu được

cho thấy việc sử dụng chiết xuất Turnera ulmifolia đối với chuột cống ở 250 và

500 mg/kg, làm giảm đáng kể tổn thương đại tràng gây ra bởi TNBS. Tác dụng

có lợi này có liên quan đến sự cải thiện tình trạng oxy hóa đại tràng, hiệu quả

7

phòng ngừa do truyền tĩnh mạch của Turnera ulmifolia trong mô hình TNBS

của bệnh viêm đại tràng ở chuột có lẽ liên quan đến tính chất chống oxy hoá do

hàm lượng flavonoid có trong cây [23].

Năm 2009, hai nghiên cứu về khả năng kháng sinh trên các chủng vi

khuẩn đã kháng thuốc kháng sinh nhóm aminoglycosides. Dựa trên các kết quả

thực nghiệm đã chứng minh, dịch chiết từ cây Đông hầu vàng có khả năng

diệt các chủng Escherichia coli và Staphylococcus aureus đã kháng kháng sinh

nhóm aminoglycosides và có tác dụng hiệp đồng khi dùng kết hợp cùng với các

loại thuốc kháng sinh như kanamycin, gentamicin, neomycin, tobramycin và

amikacin [20], [21].

Năm 2012, Brito và cs (Đại học Liên bang Rio Grande do Norte, Brazil)

đã nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa (chống carbon tetrachloride gây oxy

hóa) và tác dụng bảo vệ của Đông hầu vàng ở chuột. Kết quả nghiên cứu cho

thấy, các chất glutathione và hoạt động của enzyme chống oxy hóa (glutathione

peroxidase, superoxide dismutase và catalase) đã được tăng cường đáng kể

trong chuột do uống thuốc được chiết từ lá Đông hầu vàng và có sự hiện diện

của chất flavonoid, là chất trung gian ảnh hưởng của stress oxy hóa [19].

Ở Việt Nam, nghiên cứu của các bác sĩ và giáo sư tại Viện nghiên cứu Y

học Bản địa Việt Nam (Thái Nguyên và Hà Giang) đã tạo ra sản phẩm cao

Đông hầu với nhiều tác dụng tốt cho da [49].

1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật quan

trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công

nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua hơn 100 năm

phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong lĩnh vực nhân giống,

bảo quản nguồn gen cây trồng.

8

1.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính

toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo quan điểm của

sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân

hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cơ thể sinh

vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ

thể hoàn chỉnh. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực

vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Như vậy, kĩ

thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình

thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô

trùng) một cách định hướng. Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ sở

đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện những kĩ thuật tiên tiến cho

việc lựa chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [5].

1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro

Mẫu nuôi cấy

Các nhân tố khi chọn lọc mẫu cấy bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn,

tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu [5].

Điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng phát

triển của mẫu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là

từ 20-27oC. Điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux. Độ pH là 5,7-5,8 [5].

Chất kích thích sinh trưởng thực vật

Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kĩ thuật

nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích ở một

mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được quá trình phát sinh hình thái

của mẫu nuôi cấy.

Auxin và cytokinin là hai nhóm chất kích thích sinh trưởng được sử

dụng phổ biến nhất hiện nay. Cytokinin là hormone phân bào ảnh hưởng đến

9

sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy

mô tế bào thực vật. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là: BAP,

kinetin và zeatin. Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,5-2

mg/l. Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình

thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Hoạt

lực của BAP cao hơn và bền vững hơn zeatin dưới tác dụng của nhiệt độ cao.

BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước

của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi

chất [5], [7], [37]. GA (Gibberellic acid) là loại gibberellin được sử dụng thường

xuyên nhất, muốn sử dụng GA ta thường phải lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó

đưa vào môi trường nuôi cấy. Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin,

GA3 là chất được sử dụng nhiều nhất trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài

chồi và nảy mầm của phôi vô tính, kéo dài thân và đòng lúa, kéo dài đốt thân

(với các cây lùn), phá ngủ hạt giống hoặc củ giống (phá ngủ khoai tây sau khi

thu hoạch) [5], [7], [28].

Agar

Agar có vai trò rất cần thiết đối với mẫu nuôi cấy, làm đặc môi trường,

giúp mô không bị chìm. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 đến 1% [5].

Chất phụ gia

Nước dừa chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, được sử dụng để cung cấp

dinh dưỡng cho mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nước dừa được sử dụng để

kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường

được lấy từ quả để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa được một số

công ty hóa chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản. Thông

thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng

lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nước dừa

không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có

10

thể dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc bỏ

hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn [5].

Ngoài nước dừa, chuối xanh, khoai tây và cà chua cũng là những chất tự

nhiên giàu dinh dưỡng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật. Ngày

nay, nhiều nghiên cứu để giảm thiểu chi phí cần thiết cho công nghệ nuôi cấy

mô được tiến hành, trong đó có nghiên cứu của Daud và cs. Mục đích của

nghiên cứu này là khảo sát ảnh hưởng các chất phụ gia (nước dừa già, nước

dừa non, dịch chiết đu đủ, dịch chiết chuối và dịch chiết cà chua) ở 4 nồng độ

(20; 30; 50 và 70 ml/l) đến khả năng tạo đa chồi của cây Celosia sp. (chi Mào

gà) trong 8 tuần nuôi cấy. Trong số các dịch chiết được sử dụng, nước dừa non

với nồng độ 70 ml/l tạo ra tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất (14,21 ± 8,26

chồi/mẫu), tiếp theo là nước dừa già với nồng độ 50 ml/l cho tỷ lệ phát sinh

chồi là 13,14 ± 10,33 chồi/mẫu. Dịch chiết chuối và dịch chiết cà chua ở nồng

độ 50 ml/l cho tỷ lệ chồi thấp (9,57 ± 4,68 và 9,28 ± 5,82 chồi/mẫu). Trong khi

nồng độ thấp nhất của nước đu đủ (20 ml/l) cho thấy tỷ lệ phát sinh chồi là

10,50 ± 3,45 chồi/mẫu [22].

Than hoạt tính cũng là một chất phụ gia có nhiều tác dụng tích cực trong

nuôi cấy mô, có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản

phẩm trao đổi thứ cấp, kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn

Vụ, 2006). Trong thí nghiệm ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tạo rễ

của Lan kim tuyến, các tác giả Nguyễn Thị Nhật Linh và cs đã sử dụng than

hoạt tính với các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường Knud + sucrose

20 g/l và agar 7g/l. Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy,

nồng độ than hoạt tính khác nhau rõ ràng có ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo rễ, chiều

dài rễ và số lượng rễ của lan Kim tuyến nuôi cấy mô theo hướng tích cực. Ở tất

cả các môi trường bổ sung than hoạt tính đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Bổ sung

than hoạt tính ở nồng độ 5% cho số lượng rễ nhiều nhất (4,22 rễ/mẫu) và chiều

dài rễ là 3,5cm, rễ mập và rất khỏe [8].

11

1.2.3. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân giống

vô tính cổ điển như giâm cành, chiết cành, ghép cành... Nhân giống in vitro là

một trong bốn lĩnh vực của công nghệ tế bào thực vật (làm sạch virus, nhân

nhanh các giống cây quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợp chất tự nhiên

và cải biến về mặt di truyền các giống cây trồng) và mang lại hiệu quả kinh tế

lớn [5]. Có ba phương thức tạo cây in vitro:

a. Hoạt hóa chồi nách

Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi

cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự

hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách:

Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi

nuôi cấy loài cây hai lá mầm như cây thuốc lá, hoa cúc, ...)

Cách 2: Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy

cây một lá mầm như lúa, mía...)

Các chồi được tách và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung

cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế ưu thế ngọn

để chồi bên phát triển. Các chồi này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới

có bổ sung cytokinin thì các chồi mới tiếp tục được tạo ra. Sau đó, các chồi này

được chuyển sang môi trường tạo rễ và được đưa ra vườn ươm khi đã có rễ

hoàn chỉnh [5].

Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: (1) Nhu

cầu về loại và nồng độ cytokinin khác nhau. Nồng độ cytokinin thay đổi tùy theo

giai đoạn nuôi cấy, thông thường trong quá trình tạo chồi người ta sử dụng auxin

với nồng độ thấp, phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao. Không nên cảm

ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quá cao vì có thể tạo ra chồi bất định

mang các đột biến. (2) Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì

cần phải cắt bỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt

động. (3) Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [5].

12

Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng

rộng rãi ở nhiều loài thực vật, quá trình nhân chồi thường được thực hiện theo

các bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ.

Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch virut và ở giai đoạn sinh

trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với

chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ

làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu.

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy in vitro. Các giai đoạn này cần

đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn tại và

sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển

của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi

hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.

Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số

lượng thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo

phôi vô tính. Chúng ta cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại

cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có

nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25-27 oC,

thời gian chiếu sáng 16h/ngày với cường độ ánh sáng 2000-4000lux. Tuy

nhiên, đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy

khác nhau.

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang

môi trường tạo rễ. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi

trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích

sinh trưởng.

13

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh

trưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những

tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Có giá thể tiếp nhận

cây in vitro thích hợp. Giá thể phải sạch đủ dinh dưỡng và độ ẩm, tơi xốp, thoát

nước [5], [12].

b. Tạo chồi bất định

Chồi bất định là chồi mọc ra từ các cơ quan, bộ phận khác của cây,

không phải là phôi, ví dụ chồi hình thành từ callus (mô sẹo). Để tạo chồi bất

định ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành...

Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và quá trình phân

hóa để tế bào soma hình thành trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát

triển mô sẹo [5], [12].

c. Tạo phôi vô tính

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào

soma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn

chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo.

Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cần thực hiện hai quá

trình phản phân hóa và quá trình phân hóa để tách các tế bào soma hình thành

phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn mô sẹo. Sự hình thành phôi

trải qua hai bước chính:

Bước 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá

trình này cần môi trường giàu auxin, vì auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các

tế bào phôi, đồng thời nó còn giúp kích thích cho quá trình phát triển số lượng

tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát

sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế

bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin.

14

Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trường nuôi cấy của

giai đoạn này phải nghèo hoặc không có auxin, với nồng độ auxin cao kích

thích sự tạo thành phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và quá trình phát triển

tiếp theo của phôi này. Như vậy, với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý

là rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp. Nếu nồng độ thấp có thể gây sốc

cho phản ứng, nếu nồng độ quá cao sẽ gây ức chế hoặc gây độc [5], [12].

1.3. Thành tựu của nhân giống in vitro

Ngày nay nhiều nguồn gen thực vật có nguy cơ tuyệt chủng, nhiều giống

cây trồng bị thoái hóa không giữ được đặc điểm nguyên sơ ban đầu như chất

lượng hay khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi, việc sử dụng kỹ thuật

nhân giống in vitro để nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen là hết sức cần thiết.

Một số thành tựu nhân giống in vitro đạt được là:

Năm 2003, Bedir và cs đã vi nhân giống thành công giống Hydrastis

Canadensis, một loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền Bắc nước Mỹ [17].

Cũng năm 2003, Part và cs đã thành công trong việc nhân nhanh và bảo

tồn cây thuốc Anemopaegma arvense trong ống nghiệm trên môi trường MS có

chứa 4% đường sorbitol, kết quả sau 6 tháng mới phải cấy chuyển một lần [33].

Năm 2008, Balaraju và cs đã nhân giống và tái sinh in vitro thành công

cây thuốc Vitex agnus castus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào từ mô phân sinh

trên môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l [15].

Gần đây đạt được thành tựu trong việc hoàn thiện quy trình nuôi cấy in

vitro các cây thuốc đang có nguy cơ bị tuyệt chủng như Gynura procumbens,

Crotalaria verrucosa, Momordica tuberosa. Năm 2009, bằng kỹ thuật nhân giống

in vitro các nhà khoa học đã thành công trong việc nhân nhanh nhiều cây thuốc

quý hiếm như Phyllanthus urinaria hay Givotia rottleriformis [26], [35]. Park và

cs (2009) tái sinh thành công loài Rehmannia glutinosa quý hiếm đang bị khai

thác quá mức [32].

15

Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các loài thực vật nhiệt

đới quý hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm, bắt

đầu từ cây Thông (Taxus sps.) là một loài có chứa các hoạt chất chữa ung thư

hiệu quả như taxoid [13].

Cây Màng tang (Litsea verticillata) là loại cây thân gỗ có chứa một số

hợp chất có khả năng kháng HIV và một số chất kháng sinh. Năm 2004, Lê

Xuân Đắc và cs đã thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng

tang của vườn quốc gia Cúc Phương [5], [25], [39].

Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) được biết là một vị

thuốc quý trong việc chữa một số bệnh ung thư. Năm 2005, Lưu Trường Sinh

và cs đã tạo ra cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro có chất

lượng tương đương với cây trồng theo phương pháp truyền thống [11].

Nguyễn Thanh Danh và cs (2005) đã nghiên cứu thành công bước đầu của

quy trình nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.), sử

dụng phôi hạt của quả Vù hương xanh thu hái trước khi chín 30 ngày đã nhân

giống được cây Vù hương bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh [3].

Năm 2010, Lê Ánh Nguyệt và cs đã ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế

bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt châu (Micromelum hisutum Oliv.)

của vườn quốc gia Cúc Phương [10].

16

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Hạt cây Đông hầu vàng được viện Y học bản địa, tỉnh Thái Nguyên cung cấp.

2.1.2. Hóa chất nghiên cứu

Đề tài sử dụng các hóa chất như cồn, javen, thủy ngân clorua, môi trường

MS cơ bản, đường sucrose, agar, các hóa chất điều hòa sinh trưởng (BAP, GA3,

Kinetin, NAA, IBA) có nguồn gốc từ Việt Nam, Trung Quốc và Đức.

2.1.3. Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị chính dùng trong nghiên cứu gồm có: Nồi hấp tiệt trùng

Hariyama HV-50-220, tủ sấy (Thuận Phong Phát-Việt Nam), tủ lạnh, tủ cấy vô

trùng esco (singapore), phòng nuôi cấy, cân điện tử, máy cất nước một lần

(Trung Quốc), pipetman (Eppendort-Đức). Các dụng cụ thí nghiệm: bình nuôi

cấy, ống falcon, đũa thủy tinh…

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào,

Khoa Sinh học, Trường đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp pha môi trường

Pha môi trường đặc với thành phần và nồng độ các chất phù hợp. Môi

trường cơ bản là MS, có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin... Các

hóa chất phải tan đều, không kết tủa. Môi trường cơ bản có bổ sung agar 8,5

g/l, sucrose 30 g/l, chất kích thích sinh trưởng với các nồng độ khác nhau, pH

5,7- 5,8. Khử trùng môi trường theo phương pháp Pasteur.

2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro

2.2.2.1. Phương pháp khử trùng hạt

Chuẩn bị mẫu: Trước khi khử trùng phải tiến hành chọn lọc những hạt

tốt, không lép, màu nâu sẫm và được ngâm trong nước cất để loại lớp vỏ

17

lụa mỏng bao ngoài. Sau đó rửa lại mẫu bằng nước cất và khử trùng theo

công thức.

Sử dụng các hóa chất (như cồn, javen, HgCl2 0,1% và axit HCl đặc) với

nồng độ và thời gian khác nhau để tìm công thức vô trùng mẫu hiệu quả nhất.

Đối với công thức KT1 và KT2, việc khử trùng được thực hiện trong bình kín

và đặt trong box cấy vô trùng. Đối với công thức KT3, KT4 và KT5, hạt sau

khi bỏ lớp vỏ lụa được đặt trong các đĩa bằng giấy thấm, xếp vào chuông thủy

tinh, sử dụng khí Clo (được tạo bởi dung dịch javen 20ml và axit HCl đặc 5ml)

để khử trùng hạt trong các khoảng thời gian 4, 5 và 6 giờ, thí nghiệm được tiến

hành trong chuông thủy tinh và đặt trong tủ hút. Sau khi được khử trùng, hạt

được gieo trên môi trường gồm MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l và agar

8,5 g/l. Thí nghiệm gồm 5 công thức. Mỗi công thức gieo 5 bình, mỗi bình 25

hạt. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi là: tỷ lệ hạt nhiễm và tỷ lệ

hạt không nhiễm nảy mầm. Công thức khử trùng được thể hiện ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Công thức khử trùng hạt cây Đông hầu vàng

Thời gian xử lý (phút) Công thức Cồn 70o Javen 70% Clo HgCl2 0,1%

KT1 1 0 0 20

KT2 1 5 0 20

KT3 0 0 240 0

KT4 0 0 300 0

KT5 0 0 360 0

2.2.2.2. Phương pháp nghiên cứu môi trường kích thích hạt nảy mầm

Hạt sau khi khử trùng được cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung

sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l và các chất kích thích sinh trưởng (BAP, GA3) với

các nồng độ lần lượt là 0,5 mg/l và 1,0 mg/l. Tất cả các thí nghiệm được tiến

hành trong điều kiện: Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng 12/24h, cường độ

chiếu sáng 2000lux, pH 5,7-5,8. Thí nghiệm gồm 4 công thức. Mỗi công thức

18

môi trường gieo 5 bình, mỗi bình 25 hạt. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Chỉ

tiêu theo dõi là: Tỷ lệ hạt nảy mầm.

2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh

trưởng của cây Đông hầu vàng

Để thấy được ảnh hưởng của loại chất phụ gia đến sự sinh trưởng, phát

triển của cây Đông hầu vàng, các loại môi trường được khảo sát gồm: (1) môi

trường bổ sung nước dừa; (2) môi trường bổ sung dịch chiết chuối; (3) môi

trường bổ sung dịch chiết khoai tây; (4) môi trường bổ sung dịch chiết cà chua;

(5) môi trường bổ sung than hoạt tính. Môi trường được sử dụng trong các thí

nghiệm này là MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + chất phụ

gia (nồng độ lần lượt là 50; 100; 150 và 200 ml/l đối với các loại dịch chiết

hoặc nồng độ lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 g/l đối với than hoạt tính). Trong

đó, mỗi loại dịch chiết được tạo ra bằng cách nghiền 200g chất chiết dạng tươi

đun sôi trong 1000ml nước cất. Cắt thân của cây Đông hầu vàng thành các

đoạn dài khoảng 1-1,5cm, mỗi đoạn chứa một nách lá mầm, cắt bỏ lá, đem cấy

vào môi trường đã chuẩn bị sẵn. Mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 6

mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Theo dõi sự phát triển của cây sau 2, 4, 6 và

8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi là: Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, số chồi/mẫu, chiều cao

chồi và chất lượng chồi. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện:

Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu sáng 12/24h, cường độ chiếu sáng 2000lux,

pH 5,7-5,8.

2.2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin, tổ hợp nhóm

cytokinin và auxin đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng

(1) Ảnh hưởng của nhóm cytokinin: Để tìm được môi trường nhân

giống phù hợp đối với cây Đông hầu vàng, chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh

hưởng của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi của cây Đông hầu vàng.

Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm này là môi trường MS cơ bản có bổ

sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP (nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5

19

mg/l) hoặc kinetin (nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 mg/l). Đối chứng là môi

trường MS cơ bản bổ sung sucrose 30 g/l và agar 8,5 g/l.

(2) Ảnh hưởng của tổ hợp nhóm cytokinin và nhóm auxin: Từ kết quả

nồng độ BAP và kinetin tốt nhất cho sự hình thành chồi, chúng tôi tiếp tục

nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm

cytokinin và nhóm auxin đến sự hình thành chồi của cây Đông hầu vàng. Dùng

nồng độ cytokinin (BAP hoặc kinetin) tối ưu ở thí nghiệm trên kết hợp với

NAA hoặc IBA nồng độ 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7 mg/l. Đối chứng là môi trường MS

cơ bản không bổ sung chất kích thích sinh trưởng.

Phương pháp: Cắt thân của cây Đông hầu vàng thành các đoạn dài

khoảng 1-1,5cm, mỗi đoạn chứa một nách lá mầm. Cắt bỏ lá, đem cấy vào môi

trường đã chuẩn bị sẵn. Mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu. Thí

nghiệm được lặp lại 3 lần. Theo dõi sự phát triển của cây sau 2, 4, 6 và 8 tuần. Chỉ

tiêu theo dõi là: Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất

lượng chồi. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện: Nhiệt độ 25-

27oC, thời gian chiếu sáng 12/24h, cường độ chiếu sáng 2000lux, pH 5,7- 5,8.

2.2.2.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng tạo đa

chồi cây Đông hầu vàng

Lá cây Đông hầu vàng được lấy từ nguồn vật liệu sạch nuôi cấy in vitro.

Sau đó, cắt bỏ phần rìa lá, cắt lá thành các mảnh có kích thước dài 1cm, rộng

1cm rồi đặt úp mảnh lá vào môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l +

agar 8,5 g/l và 2,4- D với các nồng độ lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l. Mỗi

công thức tiến hành trên 6 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu, các công thức bố trí ngẫu

nhiên và lặp lại 3 lần. Đặt các bình nuôi cấy trong bóng tối 1 tuần sau đó chuyển

ra môi trường sáng. Theo dõi khả năng tạo mô sẹo của mẫu, chọn ra môi

trường cho mẫu mô sẹo tốt nhất cung cấp nguyên liệu cho thí nghiệm tái sinh

chồi từ mô sẹo.

20

Sau khi có nguồn mô sẹo, tiến hành tái sinh chồi từ mô sẹo trong các

môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l và BAP (nồng

độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 mg/l). Mỗi công thức tiến hành trên 6 bình, mỗi

bình cấy 5 mẫu và lặp lại thí nghiệm 3 lần. Đánh giá kết quả sau 2, 4, 6 và 8

tuần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, số chồi/mẫu, chiều cao chồi

và chất lượng chồi.

2.2.2.6. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo

rễ cây Đông hầu vàng

Môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm này là MS cơ bản có bổ

sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA)

với các nồng độ lần lượt là 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 mg/l. Môi trường đối chứng là

môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 mg/l và agar 8,5 g/l. Tất cả các

thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện: Nhiệt độ 25-27oC, thời gian chiếu

sáng 12/24h, cường độ chiếu sáng 2000lux, pH 5,7- 5,8.

Phương pháp: Cắt chồi ngọn của cây Đông hầu vàng khoảng 2-3cm, cắt

bớt lá, cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn. Mỗi công thức cấy 5 bình, mỗi

bình 6 chồi. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau đó theo dõi sự phát triển của

cây sau 6 tuần và 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi là: Tỷ lệ mẫu ra rễ, số rễ/mẫu, chất

lượng rễ.

2.2.2.7. Phương pháp nghiên cứu giá thể thích hợp để đưa cây Đông hầu vàng

ra ngoài tự nhiên

Sử dụng các thành phần: đất thịt trung bình, cát, phân vi sinh EM làm

giá thể nghiên cứu. Xử lý bằng vôi và phơi ải đối với thành phần đất thịt trung

bình, rửa sạch, phơi khô đối với cát. Sau đó phối trộn các thành phần với nhau

theo các công thức nghiên cứu ở bảng 2.2.

Đóng giá thể thành các bầu, mỗi loại giá thể tạo 30 bầu, mỗi bầu trồng 1

cây. Chọn cây đã được cấy trong môi trường tạo rễ sau 8 tuần có đủ rễ (≥ 3 rễ),

đủ lá (≥ 8 lá), đủ chiều cao (≥ 7cm), mập và khỏe, đặt trong điều kiện nhiệt độ

21

phòng bình thường, bỏ nắp giấy và nút bông, để khoảng 24h. Sau đó lấy cây ra

khỏi bình đem trồng trong các giá thể nghiên cứu. Theo dõi sự phát triển của

cây sau thời gian 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi là: Tỷ lệ cây sống và chiều cao cây.

Bảng 2.2. Công thức giá thể ra cây Đông hầu vàng

Công Tỷ lệ các thành Thành phần giá thể thức phần

ĐC Đất thịt trung bình 1

CT1 Cát 1

CT2 Đất thịt trung bình : Cát 2:1

CT3 2:1 Đất thịt trung bình : Phân vi sinh

CT4 Đất thịt trung bình: Cát : Phân vi sinh 2:1:1

2.2.3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Các số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel theo Chu Văn

Mẫn [9] các giá trị thống kê về giá trị trung bình ( ), sai số trung bình mẫu

(mx) với P<0,05, α= 0,05.

22

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu công thức vô trùng mẫu

Muốn có cây non vô trùng, sạch bệnh để tiến hành các thí nghiệm sau

này. Hạt hay các bộ phận của cây phải được khử trùng trước khi đưa vào bình

nuôi cấy. Trước khi khử trùng, hạt được chọn lọc cẩn thận, loại bỏ lớp vỏ lụa

bên ngoài. Sau đó, khử trùng hạt theo các công thức. Sau mỗi lần ngâm hóa

chất, hạt được rửa sạch bằng nước cất đã khử trùng 3 đến 5 lần. Mọi thao tác

được thực hiện trong box cấy vô trùng. Sau khi được khử trùng, hạt được gieo

trên môi trường đã chuẩn bị. Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy được thể

hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt cây Đông hầu vàng

Thời gian xử lý (phút) Tỷ lệ hạt Tỷ lệ hạt không Công nhiễm nhiễm nảy Cồn Javen HgCl2 Clo thức 70o 70% 0,1% (%) mầm (%)

1 20 0 0 0 40,00 ± 1,93 KT1

1 20 5 0 0 33,33 ± 1,92 KT2

0 0 0 240 2,22 35,67 ± 2,67 KT3

0 0 0 300 0 38,89 ± 2,25 KT4

0 0 0 360 0 27,56 ± 1,63 KT5

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, hầu hết các công thức khử trùng trên đều

cho mẫu sạch bệnh không bị nhiễm khuẩn, mốc. Các công thức KT1, KT2,

KT4, KT5 đều đạt yêu cầu. Hạt được khử trùng theo công thức KT1 có tỷ lệ

hạt nảy mầm (40,00%) cao hơn hạt được khử trùng theo các công thức còn lại.

Tỷ lệ nảy mầm của hạt được khử trùng theo công thức KT2 (33,33%) thấp hơn

công thức KT1 có thể do thủy ngân clorua là chất kim loại nặng độc, ảnh

hưởng đến mẫu nuôi cấy.

23

Hạt Đông hầu vàng có kích thước nhỏ, việc khử trùng bằng dung dịch

(công thức KT1, KT2) gặp khó khăn, dễ bị mất hạt trong quá trình khử trùng.

Do đó, phương pháp khử trùng bằng khí Clo được lựa chọn để nghiên cứu. Kết

quả thí nghiệm khử trùng hạt bằng khí Clo trong các khoảng thời gian 4, 5 và 6

giờ cho thấy, tỷ lệ nhiễm của hạt giảm khi thời gian khử trùng tăng lên. Khử

trùng hạt bằng khí Clo trong 5 giờ cho hiệu quả khử trùng và tỷ lệ hạt không

nhiễm nảy mầm là 38,89% thấp hơn công thức KT1, nhưng không đáng kể.

Với thời gian khử trùng là 6 giờ, các hạt không bị nhiễm, tỷ lệ hạt nảy mầm

(27,56%) thấp hơn so với hạt được khử trùng trong 5 giờ, đồng thời tốn thời

gian khử trùng hơn. Như vậy trong các công thức khử trùng thì phương pháp

khử trùng hạt bằng khí Clo trong khoảng thời gian 5 giờ là thích hợp nhất, tạo

nguồn nguyên liệu sạch cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.1. Hạt Đông hầu vàng sau khử trùng

3.2. Nghiên cứu môi trường kích thích hạt Đông hầu vàng nảy mầm

Từ kết quả thí nghiệm nghiên cứu công thức khử trùng hạt cho thấy: hạt

Đông hầu vàng khi được cấy trong môi trường MS cơ bản bổ sung sucrose 30

g/l + agar 8,5 g/l có tỷ lệ hạt nảy mầm thấp (38,89%). Một số chất kích thích

sinh trưởng như BAP hay GA3 có khả năng phá ngủ, kích thích sự nảy mầm

của hạt. Do đó các chất kích thích sinh trưởng này được sử dụng với các nồng

độ khác nhau để theo dõi khả năng nảy mầm của hạt Đông hầu vàng. Thí

nghiệm gồm 4 công thức và được thực hiện lặp lại 3 lần. Sau 4 tuần thu được

kết quả trong bảng 3.2.

24

Bảng 3.2 cho thấy, trong môi trường có GA3, tỷ lệ hạt nảy mầm trong

CT3 và CT4 lần lượt là 43,33 và 40%, chênh lệch không nhiều so với tỷ lệ hạt

nảy mầm trong môi trường đối chứng (môi trường không có chất kích thích

sinh trưởng). Như vậy, GA3 ở nồng độ 0,5 – 1 mg/l không có tác dụng phá ngủ

và kích thích nảy mầm đối với hạt Đông hầu vàng. Trong môi trường bổ sung

BAP, tỷ lệ hạt nảy mầm trong CT1 và CT2 lần lượt là 75,56% và 64,44% cao

hơn so với môi trường đối chứng (38,89%) và môi trường bổ sung GA3 (40-

43,33%). Như vậy, BAP có tác dụng kích thích hạt Đông hầu vàng nảy mầm và

công thức CT1 cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (75,56%) được chọn làm môi

trường kích thích hạt nảy mầm để tạo nguồn nguyên liệu in vitro cho các thí

nghiệm tiếp theo.

Bảng 3.2. Tỷ lệ nảy mầm của hạt Đông hầu vàng ở các môi trường

Nồng độ chất kích thích sinh trưởng Công thức

Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ GA3 (mg/l)

0 0 38,89 ± 2,25 ĐC

0,5 0 75,56 ± 4,84 CT1

1,0 0 64,44 ± 4,84 CT2

0 0,5 43,33 ± 1,93 CT3

0 1,0 40,00 ± 1,93 CT4

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây

Đông hầu vàng

Trước khi nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến

khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng, các môi trường MS cơ bản có bổ

sung chất phụ gia (bao gồm nước dừa, dịch chiết chuối, dịch chiết khoai tây,

dịch chiết cà chua và than hoạt tính) được khảo sát. Kết quả theo dõi ảnh

hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông hầu vàng sau 8 tuần

được thể hiện trong bảng 3.3.

25

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông

hầu vàng

Công thức Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi

Nồng độ chất phụ gia (ml/l) 0 ĐC +++ 1,65 ± 0,10

++ ++ ++ ++ 50 100 150 200 CT1 CT2 CT3 CT4 1,52 ± 0,21 1,60 ± 0,19 1,51 ± 0,13 1,44 ± 0,03

+ + + + 50 100 150 200 CT1 CT2 CT3 CT4 1,23 ± 0,21 1,14 ± 0,22 1,10 ± 0,11 1,20 ± 0,03

1,27 ± 0,13 1,34 ± 0,11 1,37 ± 0,12 1,33 ± 0,05 CT1 CT2 CT3 CT4 50 100 150 200 + + + +

1,34 ± 0,23 1,28 ± 0,08 1,45 ± 0,11 1,24 ± 0,19 CT1 CT2 CT3 CT4 50 100 150 200 + + + +

1,47 ± 0,21 1,52 ± 0,10 1,65 ± 0,10 1,39 ± 0,14 0,5 g/l 1,0 g/l 1,5 g/l 2,0 g/l CT1 CT2 CT3 CT4 ++ ++ ++ ++

1,00 ± 0,00 Nước dừa 1,13 ± 0,12 1,20 ± 0,16 1,07 ± 0,04 1,13 ± 0,13 Dịch chiết chuối 1,17 ± 0,14 1,10 ± 0,15 1,17 ± 0,04 1,20 ± 0,12 Dịch chiết khoai tây 1,23 ± 0,13 1,15 ± 0,15 1,27 ± 0,14 1,15 ± 0,04 Dịch chiết cà chua 1,10 ± 0,18 1,17 ± 0, 16 1,22 ± 0,07 1,13 ± 0,12 Than hoạt tính 1,00 ± 0,00 1,00 ± 0,00 1,00 ± 0,00 1,00 ± 0,00 Ghi chú: (+): chồi yếu, lá to, màu xanh nhạt; (++): chồi khỏe, lá nhỏ, màu

xanh nhạt; (+++): chồi khỏe, lá to xanh đậm, phát triển cân đối.

26

Kết quả bảng 3.3 cho thấy, tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo

chồi là 100%. Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy nồng độ các chất phụ gia

khác nhau thì khả năng phát sinh chồi có sự khác nhau, chứng tỏ các chất phụ

gia có ảnh hưởng đến sự hình thành chồi của cây Đông hầu vàng. Trong các

loại dịch chiết bổ sung vào môi trường nuôi cấy thì dịch chiết khoai tây có

nồng độ 150 ml/l cho số chồi/mẫu cao nhất (1,27 chồi/mẫu). Tuy nhiên, chiều

cao chồi của mẫu cấy trong môi trường này thấp hơn so với mẫu cấy trong môi

trường có bổ sung than hoạt tính 1,5 g/l và môi trường đối chứng. Trong các

môi trường có bổ sung nước dừa, nồng độ nước dừa càng cao thì chất lượng

chồi càng kém, có hiện tượng xoăn lá và chồi yếu. Trong môi trường có bổ

sung các loại dịch chiết khác, mẫu cấy cho chồi yếu, lá vàng úa và có hiện

tượng “thủy tinh hóa”. Xét về chất lượng chồi thì môi trường đối chứng cho

chất lượng chồi tốt nhất, chồi khỏe, lá to xanh đậm, phát triển cân đối.

Hình 3.2. Ảnh hưởng của nước dừa 100 ml/l và than hoạt tính 1,5 g/l đến sự

sinh trưởng của cây Đông hầu vàng

Như vậy, các chất phụ gia như nước dừa, dịch chiết chuối, dịch chiết

khoai tây, dịch chiết cà chua và than hoạt tính có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng,

phát triển của cây Đông hầu vàng tuy nhiên mức ảnh hưởng chưa lớn. Qua thí

nghiệm trên môi trường đối chứng là môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng,

phát triển của cây Đông hầu vàng.

27

3.4. Nghiên cứu tạo đa chồi cây Đông hầu vàng

Trong môi trường nuôi cấy in vitro, bên cạnh các chất đa lượng, vi

lượng, vitamin còn bổ sung nhiều loại kích thích sinh trưởng thuộc nhóm

auxin, cytokinin, gibberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát

triển và phân hóa cơ quan cung cấp dinh dưỡng cho mẫu phát triển. Tuy nhiên

yêu cầu với những chất này thay đổi tùy theo loài cây, loại mô, mục đích

nghiên cứu. Việc tìm ra công thức môi trường với nồng độ và tỷ lệ chất kích

thích sinh trưởng phù hợp cho từng loại cây, từng giai đoạn phát triển là cơ sở

cho những nghiên cứu tiếp theo.

3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi cây Đông

hầu vàng

BAP (6-benzyl Amino Purin) là hoocmon thuộc nhóm cytokinin. Cytokinin

là hoocmon phân bào, là dẫn xuất của adenin, có ảnh hưởng tới sự phân chia tế

bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực

vật. Chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trò quan trọng

trong tạo đa chồi của mẫu nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng

của BAP đến khả năng tạo đa chồi của cây Đông hầu vàng sau 2, 4, 6 và 8 tuần

được thể hiện trong bảng 3.4 (với P<0,05, α= 0,05) và hình 3.3.

Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy, tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu

tạo chồi là 100%, chất lượng chồi tốt, chồi khỏe, mập và phát triển cân đối. Ở

công thức môi trường đối chứng, sau 2, 4, 6 và 8 tuần, số chồi/mẫu chỉ đạt 1,00

chồi. Sau 2 tuần, môi trường CT1, CT3, CT4, CT5 cho số chồi/mẫu trung bình

lần lượt là 1,14; 1,14; 1,14; 1,18 chồi, cao hơn so với công thức đối chứng. Môi

trường CT2 cho số chồi/mẫu là 1,36 chồi, cao hơn môi trường đối chứng và

các công thức môi trường khác. Sau 4, 6 và 8 tuần, công thức môi trường CT2

vẫn là công thức môi trường cho số chồi/mẫu cao nhất trong các công thức môi

trường. Sau 8 tuần, công thức môi trường CT2 cho số chồi/mẫu là 1,46 chồi,

trong khi đó, các công thức môi trường CT1, CT3, CT4, CT5 cho số chồi/mẫu

lần lượt là 1,25; 1,29; 1,29; 1,29 chồi.

28

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi

cây Đông hầu vàng

Công thức Số chồi/mẫu Nồng độ BAP (mg/l) Chiều cao chồi (cm)

Sau 2 tuần

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,00 ± 0,00 1,14 ± 0,07 1,36 ± 0,11 1,14 ± 0,07 1,14 ± 0,07 1,18 ± 0,07 0,52 ± 0,05 0,61 ± 0,05 0,74 ± 0,09 0,82 ± 0,09 0,89 ± 0,08 0,83 ± 0,09

Sau 4 tuần

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,00 ± 0,00 1,18 ± 0,07 1,46 ± 0,12 1,14 ± 0,07 1,25 ± 0,10 1,29 ± 0,10 1,04 ± 0,07 0,97 ± 0,08 1,26 ± 0,14 1,29 ± 0,14 1,35 ± 0,12 1,24 ± 0,13

Sau 6 tuần

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,00 ± 0,00 1,21 ± 0,08 1,46 ± 0,12 1,29 ± 0,09 1,29 ± 0,11 1,29 ± 0,10 1,36 ± 0,08 1,19 ± 0,10 1,69 ± 0,18 1,53 ± 0,17 1,75 ± 0,15 1,61 ± 0,16

Sau 8 tuần

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,00 ± 0,00 1,25 ± 0,08 1,46 ± 0,12 1,29 ± 0,09 1,29 ± 0,11 1,29 ± 0,10 1,65 ± 0,10 1,39 ± 0,12 1,98 ± 0,20 1,85 ± 0,20 2,18 ± 0,19 2,27 ± 0,27

29

Hình 3.3. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT2 sau 4 tuần Theo Kalimuthu và Preeetha, nồng độ thích hợp cho sự hình thành đa

chồi là BAP 2,22µM [27]. Vậy trong thí nghiệm này, môi trường thích hợp tạo

đa chồi là CT2 (môi trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l). Từ thí nghiệm trên ta

thấy, tỷ lệ tạo đa chồi cây Đông hầu vàng khi sử dụng chất kích thích sinh

trưởng là BAP chưa cao.

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh chồi cây

Đông hầu vàng

Tương tự như BAP, kinetin cũng là chất kích thích sinh trưởng thuộc

nhóm cytokinin, có khả năng kích thích tạo đa chồi và được sử dụng phổ biến.

Cắt thân cây Đông hầu vàng thành các đoạn có một nách lá mầm có kích thước

từ 1-1,5cm. Cắt bỏ lá, đem cấy vào môi trường MS có bổ sung kinetin ở các

nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 mg/l). Theo dõi sự sinh trưởng và

khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng sau 2, 4, 6 và 8 tuần. Kết quả được thể

hiện trong bảng 3.5, hình 3.4.

Sau 4 tuần Sau 8 tuần Hình 3.4. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT3

30

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo đa chồi cây

Đông hầu vàng

Công thức Số chồi/mẫu Nồng độ kinetin (mg/l) Chiều cao chồi (cm)

Sau 2 tuần

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,00 ± 0,00 1,39 ± 0,11 1,36 ± 0,12 1,43 ± 0,12 1,07 ± 0,05 1,32 ± 0,10 0,52 ± 0,05 0,78 ± 0,07 0,73 ± 0,05 0,87 ± 0,09 0,66 ± 0,06 0,58 ± 0,06

Sau 4 tuần

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,00 ± 0,00 1,39 ± 0,11 1,36 ± 0,12 1,50 ± 0,12 1,25 ± 0,10 1,36 ± 0,11 1,04 ± 0,07 1,16 ± 0,10 1,19 ± 0,09 1,20 ± 0,11 0,92 ± 0,09 0,92 ± 0,09

Sau 6 tuần

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,00 ± 0,00 1,50 ± 0,11 1,39 ± 0,12 1,54 ± 0,12 1,32 ± 0,12 1,36 ± 0,11 1,36 ± 0,08 1,41 ± 0,13 1,52 ± 0,12 1,53 ± 0,13 1,38 ± 0,12 1,30 ± 0,13

Sau 8 tuần

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,00 ± 0,00 1,5 ± 0,11 1,39 ± 0,12 1,54 ± 0,12 1,32 ± 0,12 1,36 ± 0,01 1,65 ± 0,10 1,78 ± 0,16 1,87 ± 0,15 1,90 ± 0,16 1,79 ± 0,15 1,77 ± 0,17

31

Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, tất cả các môi trường đều cho tỷ lệ mẫu tạo

chồi là 100%, chất lượng chồi tốt, khỏe, mập và phát triển cân đối. Sau 8 tuần

nuôi cấy, số chồi/mẫu thu được lần lượt trên các môi trường CT1, CT2, CT4,

CT5 là 1,5; 1,39; 1,32 và 1,36 chồi. Riêng môi trường CT3 cho số chồi/mẫu

cao nhất (1,54 chồi) và chiều cao chồi cao nhất (1,90cm). Do đó, công thức

môi trường thích hợp nhất tạo đa chồi cây Đông hầu vàng ở thí nghiệm này là

CT3 (môi trường MS bổ sung kinetin 1,5 mg/l).

Từ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc

nhóm cytokinin (BAP và kinetin) cho thấy, môi trường thích hợp nhất cho sự

phát sinh chồi cây Đông hầu vàng là MS cơ bản bổ sung BAP 1,0 mg/l hoặc

kinetin 1,5 mg/l. Sau 8 tuần, môi trường sử dụng BAP 1,0 mg/l cho số chồi/mẫu

là 1,46 chồi và chiều cao chồi là 1,98 cm, môi trường sử dụng kinetin 1,5 mg/l

cho số chồi/mẫu đạt 1,54 chồi, cao hơn so với môi trường có BAP 1,0 mg/l, tuy

nhiên sự chênh lệch này không lớn. Xét BAP có giá thành bằng ¼ so với

kinetin và lượng BAP cần sử dụng ít hơn kinetin nên môi trường thích hợp cho

sự phát sinh chồi cây Đông hầu vàng là môi trường MS cơ bản bổ sung sucrose

30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 1,0 mg/l.

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng phát

sinh chồi cây Đông hầu vàng

Từ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của từng loại chất kích thích

sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) cho thấy, sự phát sinh chồi

cây Đông hầu vàng trong các môi trường này còn thấp. Để tăng số chồi/mẫu,

ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và

auxin tiếp tục được nghiên cứu, cụ thể là ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA

hoặc tổ hợp của BAP và IBA đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng.

NAA và IBA là các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên (IAA

– Axit Indolyl acetic) và không bị oxy hóa bởi các auxin oxidase. Mẫu được

cấy trong môi trường MS cơ bản bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP

32

1,0 mg/l và NAA nồng độ 0,1; 0,3; 0,5 hoặc 0,7 mg/l. Kết quả thu được sau 2,

4, 6 và 8 tuần được thể hiện trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng phát sinh

chồi cây Đông hầu vàng

Công thức Nồng độ NAA (mg/l) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi (cm)

Sau 2 tuần

ĐC 0 1,00 ± 0,00 0,52 ± 0,05

CT1 0,1 1,34 ± 0,05 0,65 ± 0,07

CT2 0,3 1,57 ± 0,09 0,69 ± 0,12

CT3 0,5 1,27 ± 0,12 0,50 ± 0,11

CT4 0,7 1,33 ± 0,15 0,47 ± 0,14

Sau 4 tuần

ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,04 ± 0,07

CT1 0,1 1,41 ± 0,20 1,31 ± 0,17

CT2 0,3 1,62 ± 0,11 1,37 ± 0,09

CT3 0,5 1,32 ± 0,04 1,24 ± 0,05

CT4 0,7 1,39 ± 0,08 1,18 ± 0,07

Sau 6 tuần

ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,36 ± 0,08

CT1 0,1 1,44 ± 0,14 1,87 ± 0,12

CT2 0,3 1,67 ± 0,06 1,94 ± 0,05

CT3 0,5 1,37 ± 0,22 1,67 ± 0,13

CT4 0,7 1,45 ± 0,15 1,43 ± 0,07

Sau 8 tuần

ĐC 0 1,00 ± 0,00 1,65 ± 0,10

CT1 0,1 1,46 ± 0,06 2,24 ± 0,05

CT2 0,3 1,71 ± 0,21 2,27 ± 0,14

CT3 0,5 1,43 ± 0,09 1,85 ± 0,11

CT4 0,7 1,49 ± 0,17 1,73 ± 0,04

33

Qua bảng 3.6 cho thấy, môi trường có bổ sung BAP và NAA cho tỷ lệ

mẫu phát sinh chồi là 100%, chồi khỏe, mập, lá xanh đậm và phát triển cân đối.

Sau 2, 4, 6 và 8 tuần, công thức CT2 (môi trường bổ sung NAA 0,3 mg/l) đều

cho số chồi/mẫu và chiều cao chồi cao nhất. Sau 8 tuần, công thức CT2 cho số

chồi/mẫu là 1,71 chồi/mẫu, cao hơn so với môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l

(1,46 chồi/mẫu), chứng tỏ tổ hợp BAP và NAA có tác dụng kích thích tạo đa

chồi tốt hơn khả năng kích thích tạo đa chồi của BAP riêng rẽ. Kết quả này cho

thấy nghiên cứu ảnh hưởng tạo đa chồi theo hướng tổ hợp nhóm cytokinin và

auxin khả quan hơn tác động của cytokinin riêng rẽ.

3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát

sinh chồi cây Đông hầu vàng

IBA cũng là một auxin có hoạt tính rất mạnh. Do vậy, tổ hợp chất kích

thích sinh trưởng BAP và IBA được nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng tới sự

phát sinh chồi cây Đông hầu vàng. Mẫu cấy là đoạn thân mang 1 nách lá mầm

được cấy trong môi trường MS cơ bản bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l +

BAP 1,0 mg/l và IBA với nồng độ 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7 mg/l. Kết quả ảnh hưởng

của tổ hợp BAP và IBA sau 2, 4, 6 và 8 tuần theo dõi được thể hiện trong bảng

3.7 và hình 3.5.

Hình 3.5. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT2

34

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát sinh chồi

cây Đông hầu vàng

Công thức Nồng độ IBA (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm)

Sau 2 tuần

ĐC 0,52 ± 0,05 0 1,00 ± 0,00

CT1 0,48 ± 0,11 0,1 2,15 ± 0,16

CT2 0,63 ± 0,11 0,3 2,35 ± 0,10

CT3 0,49 ± 0,13 0,5 2,25 ± 0,23

CT4 0,50 ± 0,15 0,7 2,10 ± 0,14

Sau 4 tuần

ĐC 1,04 ± 0,07 0 1,00 ± 0,00

CT1 1,06 ± 0,03 0,1 2,20 ± 0,23

CT2 1,22 ± 0,15 0,3 2,38 ± 0,19

CT3 1,10 ± 0,22 0,5 2,29 ± 0,11

CT4 1,17 ± 0,09 0,7 2,13 ± 0,25

Sau 6 tuần

ĐC 1,36 ± 0,08 0 1,00 ± 0,00

CT1 1,67 ± 0,19 0,1 2,22 ± 0,14

CT2 1,75 ± 0,17 0,3 2,41 ± 0,07

CT3 1,52 ± 0,12 0,5 2,32 ± 0,21

CT4 1,34 ± 0,05 0,7 2,17 ± 0,15

Sau 8 tuần

ĐC 1,65 ± 0,10 0 1,00 ± 0,00

CT1 1,96 ± 0,17 0,1 2,22 ± 0,24

CT2 2,09 ± 0,22 0,3 2,43 ± 0,17

CT3 1,86 ± 0,17 0,5 2,34 ± 0,12

1,77 ± 0,09 0,7 2,17 ± 0,15

CT4

Kết quả bảng 3.7 cho thấy, khả năng tạo đa chồi của tổ hợp BAP và IBA

cao hơn rất nhiều so với môi trường đối chứng và cao nhất trong các môi

35

trường kích thích tạo đa chồi. Sau 8 tuần, môi trường CT2 (bổ sung IBA 0,3

mg/l) cho số chồi/mẫu là 2,43 chồi/mẫu, trong khi đó môi trường đối chứng chỉ

cho 1,00 chồi/mẫu, môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l cho 1,46 chồi/mẫu và môi

trường bổ sung BAP 1,0 mg/l và NAA 0,3 mg/l là 1,71 chồi/mẫu. Số chồi/mẫu

tăng lên khi nồng độ IBA tăng từ 0,1 đến 0,3 mg/l, khi nồng độ IBA tiếp tục

tăng lên thì số chồi/mẫu giảm dần. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên

cứu của các tác giả trước đó như Mohammad và cs (2013) [29],

Adhikarimayum và cs (2011) [14] sử dụng môi trường bổ sung đồng thời các

chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin và cytokinin kích thích phát sinh chồi tốt

hơn môi trường bổ sung riêng rẽ chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm

cytokinin.

Như vậy môi trường kích thích tạo đa chồi cây Đông hầu vàng tốt nhất

khi sử dụng đoạn thân là môi trường MS cơ bản bổ sung sucrose 30 g/l + agar

8,5 g/l + BAP 1,0 mg/l và IBA 0,3 mg/l.

3.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng phát sinh chồi cây

Đông hầu vàng

3.4.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng tạo mô sẹo của lá cây

Đông hầu vàng

Kết quả nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo từ lá Đông hầu vàng trên môi

trường MS cơ bản bổ sung 2,4- D với nồng độ 0,5 đến 2,5 mg/l sau 3 tuần được

thể hiện trong bảng 3.8.

Đối với mảnh lá trong môi trường 2,4- D sau 1 tuần để tối, 2 tuần để

sáng bắt đầu có sự tạo thành mô sẹo ở tất cả các ngưỡng nồng độ, nhưng có sự

khác nhau về tỷ lệ cụ thể. Sau khoảng 3 tuần nuôi cấy, các khối mô sẹo được

hình thành ở mép cắt. Về hình thái, mô sẹo hơi xốp có màu trắng đục, sau

chuyển màu vàng trong khi kéo dài thời gian nuôi cấy. Mẫu lá nuôi ở các nồng

độ 2,4- D 1,5 mg/l và 2,0 mg/l, cho thấy khả năng tạo các khối mô sẹo với tỷ lệ

tăng trưởng nhanh nhất (lần lượt là 93,33% và 90,0%) và chất lượng khối mô

36

sẹo tốt. Trong khi đó, nồng độ 2,4- D quá cao sẽ ức chế hoạt động tạo mô sẹo,

cụ thể, tại các bình bổ sung nồng độ 2,4- D lên tới 2,5 mg/l tỷ lệ hình thành

khối mô sẹo giảm (17,26 %).

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng tạo mô sẹo

ở lá Đông hầu vàng

Nồng độ 2,4- D Tỷ lệ tạo mô Khối lượng mô Chất lượng mô sẹo (mg/l) sẹo (%) sẹo (g/mẫu)

0 0 Không tạo mô sẹo 0

Mô sẹo vàng đục, hơi 0,5 76,56 1,56 ± 0,00 khô, rời rạc

Mô sẹo vàng trong, hơi 1,0 86,67 1,92 ± 0,01 xốp, mọng nước

Mô sẹo vàng trong, hơi 1,5 93,33 2,18 ± 0,01 xốp, mọng nước

Mô sẹo xanh nhạt, 2,0 90,00 2,06 ± 0,00 chắc, mọng nước

Mô sẹo ít, màu trắng 2,5 17,26 1,19 ± 0,00 nhạt, rời rạc

Mô sẹo ở tất cả các ngưỡng bổ sung 2,4- D sau 8 tuần nuôi cấy có sự

tăng sinh từ những khối mô sẹo có sẵn phát triển lan nhanh ra toàn bộ bề mặt

phiến lá, những phần lá không tạo mô sẹo có xu hướng úa vàng đi. Khối mô

sẹo trong môi trường 2,4- D 2,0 mg/l tuy có sự tăng sinh chậm hơn, nhưng chất

lượng mô sẹo và độ ổn định tốt hơn khối mô sẹo trong môi trường 2,4- D 1,5

mg/l. Mô sẹo được hình thành trên môi trường bổ sung 2,4- D 2,0 mg/l có dạng

chắc, xanh nhạt, mọng nước và ở một số bình có hình thành rễ bất định. Do đó,

môi trường tạo mô sẹo phù hợp cho lá Đông hầu vàng là môi trường MS cơ

bản bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l và 2,4- D 2,0 mg/l. Mô sẹo được lựa

37

chọn đem cắt thành những mảnh nhỏ và cấy chuyển sang môi trường mới để

tiếp tục nghiên cứu tái sinh chồi.

3.4.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

cây Đông hầu vàng

Mô sẹo được tạo ra từ môi trường bổ sung 2,4- D 2,0 mg/l sẽ được chọn

và tái sinh trên môi trường bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0;

1,5; 2,0 và 2,5 mg/l). Sau 4 tuần nuôi cấy kết quả thu được thể hiện qua bảng

3.9 và hình 3.6.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

cây Đông hầu vàng

Nồng độ BAP (mg/l) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Số chồi/ mẫu 0,65 ± 0,10 1,32 ± 0,11 1,81 ± 0,10 3,03 ± 0,22 1,97 ± 0,19 Chất lượng chồi Chồi yếu Chồi nhỏ, xoăn, mọng nước Chồi nhỏ, xanh nhạt Chồi to, khỏe, xanh đậm Chồi to, khỏe, xanh đậm

Kết quả cho thấy môi trường có bổ sung BAP 0,5 mg/l và 1,0 mg/l có

khả năng tái sinh chồi thấp (0,65 và 1,32 chồi/mẫu), chất lượng chồi không đáp

ứng, chồi yếu. Ở nồng độ cao BAP cao hơn, khả năng tái sinh cao hơn, lá phát

triển mạnh, xuất hiện rễ bất định (đặc biệt là ở nồng độ BAP 2,0 mg/l cho 3,03

chồi/mẫu). Do đó, môi trường MS cơ bản bổ sung sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l

và BAP 2,0 mg/l là môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi từ mô sẹo ở cây

Đông hầu vàng.

Hình 3.6. Hình ảnh mô sẹo và chồi tái sinh từ mô sẹo sau 4 tuần

38

3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ cây Đông

hầu vàng

Ra rễ là khâu cuối cùng của giai đoạn nghiên cứu in vitro. Chất kích

thích sinh trưởng được dùng chủ yếu ở giai đoạn này thuộc nhóm auxin. IBA

và NAA là những chất kích thích chủ yếu tác động lên quá trình phân chia tế

bào và sự hình thành rễ.

NAA là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, có tác dụng làm

tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh hưởng

mạnh đến trao đổi nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi

trường nuôi cấy. NAA có tác dụng tạo rễ mạnh hơn các auxin khác.

3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng

Các chồi đỉnh của cây Đông hầu vàng được nuôi cấy trong môi trường

có chứa NAA ở các nồng độ khác nhau để nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA

đến sự hình thành rễ. Trong thí nghiệm này sẽ nghiên cứu ảnh hưởng của NAA

đến sự hình thành rễ cây Đông hầu vàng trong 4 công thức môi trường với

nồng độ NAA tương ứng là 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 mg/l. Cây trong môi trường tạo

đa chồi được sử dụng để cắt lấy các chồi, mỗi chồi cao khoảng 2-3cm, cắt bỏ

bớt lá, cấy vào môi trường tạo rễ. Mỗi công thức môi trường cấy 30 chồi. Theo

dõi sự hình thành rễ của các chồi sau 6 và 8 tuần. Kết quả theo dõi được thể

hiện trong bảng 3.10.

Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, chồi Đông hầu vàng có thể tạo rễ trên tất

cả môi trường. Tuy nhiên trong mỗi môi trường, tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ/mẫu và

chất lượng rễ của các chồi là khác nhau. Trong môi trường đối chứng không có

chất kích thích sinh trưởng, tỷ lệ chồi ra rễ là rất thấp, rễ mảnh và ngắn. Trong

môi trường có chất kích thích sinh trưởng, tỷ lệ chồi ra rễ nhiều hơn và rễ dài

hơn môi trường đối chứng. Sau 6 tuần, môi trường CT1, CT2 và CT4, tỷ lệ

chồi ra rễ vẫn còn thấp, tương ứng là 28,89; 33,33 và 35,00%. Môi trường CT3

là môi trường có tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất (42,86%), số lượng rễ nhiều, rễ dài.

Sau 8 tuần, môi trường CT3 vẫn là môi trường cho tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất

39

(75,00%), rễ dài và nhiều, cây phát triển tốt, thân mập, lá xanh và to bản. Môi

trường CT4 (NAA 1,0 mg/l) cho tỷ lệ ra rễ thấp hơn vì nồng độ chất kích thích

sinh trưởng cao gây ức chế quá trình phát sinh rễ. Vì vậy trong thí nghiệm này,

nồng độ NAA 0,6 mg/l thích hợp để tạo rễ. Tuy nhiên, khả năng kích thích ra

rễ ở chồi cây Đông hầu vàng của NAA chưa cao.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng

Công Nồng độ NAA Tỷ lệ chồi Chất lượng Số rễ/mẫu thức (mg/l) ra rễ (%) rễ

Sau 6 tuần

0,10 ± 0,04 28,89 + 0 ĐC

1,21 ± 0,29 33,33 ++ 0,2 CT1

1,46 ± 0,33 32,14 ++ 0,4 CT2

1,36 ± 0,31 42,86 +++ 0,6 CT3

1,11 ± 0,31 35,00 ++ 0,8 CT4

Sau 8 tuần

0,32 ± 0,12 44,45 + 0 ĐC

1,36 ± 0,32 50,00 ++ 0,2 CT1

1,64 ± 0,41 64,23 +++ 0,4 CT2

1,39 ± 0,24 75,00 +++ 0,6 CT3

1,79 ± 0,35 50,00 +++ 0,8 CT4

(Ghi chú: +: Rễ mảnh, ngắn; ++: Rễ mảnh, dài; +++: Rễ mảnh, dài, nhiều)

3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng

Cũng như thí nghiệm trên, thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của IBA

đến khả năng hình thành rễ cây Đông hầu vàng được tiến hành với các nồng độ

khác nhau, kết quả thu được sau nuôi cấy 6 và 8 tuần được thể hiện trong bảng

3.11, hình 3.7.

40

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng

Nồng độ Tỷ lệ chồi Chất lượng Công thức Số rễ/ mẫu IBA (mg/l) ra rễ (%) rễ

Sau 6 tuần

ĐC 28,89 0,10 ± 0,04 0 +

CT1 45,50 0,43 ± 0,15 0,2 +

CT2 50,50 0,82 ± 0,30 0,4 +

CT3 60,71 0,86 ± 0,26 0,6 +

CT4 46,43 0,64 ± 0,26 0,8 +

Sau 8 tuần

ĐC 44,45 0,32 ± 0,12 0 +

CT1 50,00 1,11 ± 0,25 0,2 +

CT2 53,57 1,62 ± 0,38 0,4 +++

CT3 75,00 1,89 ± 0,34 0,6 +++

CT4 67,86 1,29 ± 0,32 0,8 +++

(Ghi chú: +: Rễ mảnh, ngắn; ++: Rễ mảnh, dài; +++: Rễ mảnh, dài và nhiều)

Từ kết quả trình bày ở bảng 3.11 cho thấy, tất cả các môi trường đều

hình thành rễ, tuy nhiên khả năng hình thành rễ của chồi cây Đông hầu vàng

khác nhau ở các môi trường khác nhau. Các môi trường có chất kích thích sinh

trưởng IBA đều cho tỷ lệ chồi ra rễ cao hơn nhiều so với môi trường đối chứng

(môi trường không có chất kích thích sinh trưởng IBA). Trong các công thức

môi trường có chất kích thích sinh trưởng thì môi trường CT3 (môi trường có

IBA 0,6 mg/l) là môi trường cho tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất (sau 8 tuần đạt

75,00%). Môi trường CT4 có nồng độ IBA 1,0 mg/l cao hơn môi trường CT3

có nồng độ IBA 0,6 mg/l nhưng tỷ lệ chồi ra rễ thấp hơn. Kết quả này cho thấy,

nồng độ IBA cao gây ức chế khả năng hình thành rễ cây Đông hầu vàng. Vì

vậy, trong thí nghiệm này, công thức môi trường CT3 là môi trường chứa IBA

thích hợp cho sự tạo rễ cây Đông hầu vàng.

41

Hình 3.7. Kết quả tạo rễ cây Đông hầu vàng trên môi trường CT3

Từ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng

thuộc nhóm auxin (NAA, IBA) cho thấy, môi trường có NAA 0,6 mg/l và môi

trường có IBA 0,6 mg/l đều cho tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất là 75,00%, nhưng môi

trường có IBA 0,6 mg/l cho số lượng rễ/mẫu trung bình (1,89 rễ/mẫu sau 8

tuần) cao hơn môi trường có NAA 0,6 mg/l (1,39 rễ/mẫu sau 8 tuần). Do vậy,

môi trường thích hợp cho sự tạo rễ cây Đông hầu vàng là MS cơ bản bổ sung

sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + IBA 0,6 mg/l.

Các cây được tạo thành sau khi cấy trong môi trường tạo rễ sẽ được chọn

lọc để đưa ra ngoài môi trường. Chọn các cây có đủ rễ (≥ 3 rễ), đủ lá (≥ 8 lá),

đủ chiều cao (≥ 7cm), mập và khỏe để đưa ra môi trường bên ngoài.

3.6. Nghiên cứu giá thể thích hợp đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên

Lựa chọn giá thể thích hợp để đưa cây ra ngoài vườn ươm cũng là một

khâu quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi

trong điều kiện ổn định về nguồn dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ... Khi chuyển

ra ngoài môi trường tự nhiên hoàn toàn khác nên cây con dễ bị chết do mất

nước, nhiệt độ cao... Vì thế cây con phải được thích nghi dần với điều kiện

ngoài tự nhiên. Trước khi đem cây ra trồng ngoài vườn ươm, đưa cây ra khỏi

phòng cây, đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng bình thường, bỏ nắp giấy và nút

bông, để khoảng 24h. Sau đó lấy cây ra khỏi bình, đem trồng trong các giá thể

nghiên cứu. Trong thời gian cây con thích nghi với điều kiện môi trường (tối

thiểu là khoảng 2-3 tuần), cây con cần được chăm sóc và bảo vệ cẩn thận.

Cây con sau khi được đưa ra khỏi bình (Hình 3.8) sẽ được trồng vào các

loại giá thể. Các bầu này được cho vào các khay, đặt nơi ánh sáng khuếch tán,

42

thoáng mát, tưới đủ ẩm mỗi ngày để cây con dần thích nghi với điều kiện bên

ngoài. Tỷ lệ cây con sống sau 8 tuần trên các loại giá thể khác nhau thu được ở

bảng 3.12 và hình 3.9.

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu sau 8 tuần

Công thức ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 Số cây trồng 30 30 30 30 30 Số cây sống 24 17 25 15 27 Tỷ lệ cây sống (%) 80,00 56,67 83,33 50,00 90,00 Chiều cao cây (cm) 6,06 ± 0,60 4,01 ± 0,66 6,25 ± 0,53 6,10 ± 1,15 9,19 ± 0,65

Kết quả bảng 3.12 cho thấy, giá thể là đất thịt trung bình: phân vi sinh có

tỷ lệ cây sống rất thấp (50,00%), do cây con đang còn non yếu mà lại được

trồng trong giá thể có lượng phân vi sinh lớn nên cây không thích nghi được.

Kết quả có 15 cây sống trên tổng số 30 cây được trồng.

Hình 3.8. Cây Đông hầu vàng sau khi lấy ra khỏi bình

ĐC CT2 CT5

Hình 3.9. Cây Đông hầu vàng in vitro trong vườn ươm

43

Đối với giá thể là cát, tỷ lệ cây sống thấp (56,67%) do cây con đang còn

non được trồng trong giá thể không tơi xốp, khi tưới nước, cát nén chặt xuống

làm cây phát triển kém và không thích nghi được với loại giá thể này.

Đối với giá thể là đất thịt trung bình và đất thịt trung bình: cát, tỷ lệ cây

sống đạt lần lượt là 80,00; 83,33%. Tỷ lệ này tương đối cao nhưng đây không

phải là giá thể thích hợp để trồng cây vì một số cây con không thích nghi được

đã bị chết và cây con phát triển còn chậm.

Trên giá thể đất thịt trung bình: cát: phân vi sinh, tỷ lệ cây con sống cao

(đạt 90,00%), cây mập, khỏe, lá to, xanh thẫm, dày bản, chiều cao cây trung

bình đạt 9,19cm. Như vậy, trong phạm vi của thí nghiệm này, giá thể phù hợp

giai đoạn luyện cây trong vườn ươm là giá thể gồm đất thịt trung bình: cát:

phân vi sinh theo tỷ lệ 2:1:1.

Như vậy, dựa trên kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất kích

thích sinh trưởng và chất phụ gia đến sự sinh trưởng, phát triển của cây in

vitro, quy trình nuôi cấy in vitro cây Đông hầu vàng phù hợp là:

Khử trùng hạt Đông hầu vàng bằng khí Clo trong 5 giờ

Gieo hạt Đông hầu vàng trong môi trường MS cơ bản +

sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 0,5 mg/l để hạt nảy mầm

Tạo đa chồi cây Đông hầu vàng trong môi trường MS cơ bản

+ sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 1,0 mg/l + IBA 0,3 mg/l

Tạo rễ cây Đông hầu vàng trong môi trường MS cơ bản +

sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + IBA 0,6 g/l

Đưa cây ra vườn ươm trong giá thể có thành phần: Đất thịt

trung bình: Cát: Phân vi sinh theo tỷ lệ 2:1:1

Hình 3.10. Sơ đồ quy trình nuôi cấy in vitro cây Đông hầu vàng

44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Quy trình nuôi cấy in vitro cây Đông hầu vàng được nghiệm thu là:

1.1. Công thức khử trùng hạt cây Đông hầu vàng thích hợp là khử trùng bằng

khí Clo trong 5 giờ. Tỷ lệ hạt không nhiễm là 100%.

1.2. Công thức môi trường kích thích hạt Đông hầu vàng nảy mầm trong ống

nghiệm thích hợp là môi trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 8,5

g/l + BAP 0,5 mg/l Tỷ lệ hạt nảy mầm là 75,56%.

1.3. Công thức môi trường tạo đa chồi cây Đông hầu vàng thích hợp là môi

trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + BAP 1,0 mg/l + IBA

0,3 mg/l. Sau 8 tuần, số chồi/mẫu là 2,43, chất lượng các chồi tốt (chồi

mập, khỏe).

1.4. Công thức môi trường tạo rễ và cây Đông hầu vàng hoàn chỉnh là môi

trường MS cơ bản + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + IBA 0,6 g/l. Sau 8

tuần, số rễ/mẫu là 1,89, chất lượng các rễ tốt (rễ dài, nhiều).

1.5. Công thức giá thể phù hợp để đưa cây Đông hầu vàng ra vườn ươm là

đất thịt trung bình: cát: phân vi sinh theo tỷ lệ 2:1:1. Tỷ lệ sống sót là

90%, sau 8 tuần thu được cây cao 9,19 cm.

2. Kiến nghị

Tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây Đông hầu vàng

đến giai đoạn ra hoa, thu quả. So sánh và phân tích hàm lượng dược chất trong

cây tự nhiên và cây in vitro.

45

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. Phan Thi Thuy, Pham Thi Thanh Nhan (2018), “Study on sterilizing plant

materials and effects of cytokinin and 2,4- D on shoot formation of “Yellow alder”

(Turnera ulmifolia)”, The 5th Academic Conference on Natural Science for Young

Scientists, Master and PhD. Students from Asean Countries, 177-183.

2. Phan Thị Thúy, Phạm Thị Thanh Nhàn (2018), “Nghiên cứu ảnh hưởng của

chất phụ gia và tổ hợp kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng của cây Đông

hầu vàng (Turnera ulmifolia L.) in vitro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ,

184(08): 65-70.

46

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bộ Y tế và Bộ Khoa học & công nghệ (2009), Báo cáo Hội nghị tổng kết

20 năm thực hiện nhiệm vụ “Bảo tồn nguồn gen và giống cây thuốc (1998 -

2008)”, 189 trang.

2. Danh lục các loài thực vật Việt Nam, tập II, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội

3. Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân (2005), “Kết quả bước

đầu nhân giống in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.)

bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học”,

Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, báo cáo khoa

học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật: 450-453.

4. Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị

Xuân, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2004), “Nhân nhanh và bảo tồn cây

Màng tang (Litsea verticillata) được tìm thấy ở vường quốc gia Cúc

Phương bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”, Tạp chí Công nghệ

Sinh học – Journal of Biotechnology, 2(4): 479-486.

5. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa

học và kĩ thuật.

6. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Quyển I, NXB Trẻ, TP Hồ Chí

Minh.

7. Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều

hòa sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục Việt Nam.

8. Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Kim Yến, Lê Kim

Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2012), “Ảnh hưởng của than

hoạt tính lên khả năng định hướng rễ ở cây Hồng môn và cây Cúc nuôi cấy

in vitro”, Tạp chí Sinh học, 34(3): 377-388.

9. Chu Văn Mẫn (2000), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB Đại học quốc

gia Hà Nội.

47

10. Lê Ánh Nguyệt, Điêu Thị Mai Hoa, Trần Thị Thanh Huyền và Lê Xuân

Đắc (2010), “Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân

nhanh và bảo tồn cây Mắt châu (Micromelum hisutum Oliv.) của vườn quốc

gia Cúc Phương”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và

Công nghệ, 26(2): 180-186.

11. Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), “Nghiên cứu hoàn thiện qui

trình nhân giống cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro”,

Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa

học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 722-724.

12. Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thị Thu Thủy (2016), Công nghệ tế bào thực vật và

ứng dụng, NXB Đại học Thái Nguyên.

13. Lê Thị Xuân, Schemluck M, Mai Văn Trì (1996), “Cây Thông đỏ Lâm Đồng

(Taxus walli chiana) một nguồn nguyên liệu quí để sản xuất các thuốc chữa

ung thư nhóm Taxoid”, Tạp chí hóa học, 34(1): 80-81.

Tiếng Anh

14. Adhikarimayum H, Kshetrimayum G, Huidrom S, Maibam D (2011), “In

vitro propagation of Citrus megaloxycarpa”, Environmental and Experimental

Biology, (9): 129-132.

15. Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, “Ignacimuthu S (2008),

“Micropropagation of Vitex agnus catus (Verbenaceae) A valuable medicinal

phant”, In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 44(5): 436-441.

16. Barrett SCH (1978), “Heterostyly in a tropical weed: the reproductive biology

of the Turnera ulmifolia complex (Turneraceae)”, Canadian Journal of Botany,

56(15): 1713-1725.

17. Bedir E, Lata H, “Schaneberg B, Khan IA, Morase RM (2003), “Micropropagation of

Hydrastis canadensis: Goldenseal a North American endangered species”, Planta

Med: 86-88.

48

18. Benitez-Vieyra S, Ordano M, Fornoni J, Boege K, Domínguez CA (2010),

“Selection on signal–reward correlation: limits and opportunities to the

evolution of deceit in Turnera ulmifolia L.”, J Evol Biol, 23(12): 2760-7.

19. Brito NJ, López JA, do Nascimento MA, Macêdo JB, Silva GA, Oliveira

CN, de Rezende AA, Brandão-Neto J, Schwarz A, Almeida Md (2012),

“Antioxidant activity and protective effect of Turnera ulmifolia Linn. var.

elegans against carbon tetrachloride-induced oxidative damage in rats”,

Food Chem Toxicol, 50(12): 4340-7.

20. Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira JP Jr (2009),

“Herbal therapy associated with antibiotic therapy: potentiation of the

antibiotic activity against methicillin–resistant Staphylococcus aureus by

Turnera ulmifolia L.”, BMC Complement Altern Med, 9: 13.

21. Coutinho HD, Costa JG, Lima EO, Falcão-Silva VS, “Siqueira-Júnior JP

(2010), Increasing of the aminoglicosyde antibiotic activity against a multidrug-

resistant E. coli by Turnera ulmifolia L. and chlorpromazine”, Biol Res Nurs,

11(4): 332-5.

22. Daud N, Taha RM, Noor NN, Alimon H (2011), “Effects of different organic

additives on in vitro shoot regeneration of Celosia sp”, Pak J Biol Sci, 14(9):

546-51.

23. Galvez J, de Souza Gracioso J, Camuesco D, Galvez J, Vilegas W,

Monteiro Souza Brito AR, Zarzuelo A (2006), “Intestinal antiinflammatory

activity of a lyophilized infusion of Turnera ulmifolia in TNBS rat colitis”,

Fitoterapia, 77(7-8): 515-20.

24. Gracioso Jde S, Vilegas W, Hiruma-Lima CA, Souza Brito AR (2002),

“Effects of tea from Turnera ulmifolia L on mouse gastric mucosa support

the Turneraceae as a new source of antiulcerogenic drugs”, Biol Pharm

Bull, 25(4): 487-91.

49

25. Hoang VD, Tan GT, Zhang HJ, Tamex PA, Hung NV, Cuong NM,

Soejarto Đ, Fong HH, Pezzuto JM (2002), “Natural anti – HIV agents part

I: (+)- demethoxyepiexcelsin and verticillatol from Litsea verticillata”,

Phytochemistry, 59(3): 325-329.

26. Kalidass C, Mohan VR (2009), “In vitro Rapid clonal propagation of

Phyllanthus urinaria Linn (Euphorbiaceae)”, A Medicinal Plant, 1(4): 56-59.

27. K Kalimuthu R Prabakaran and V Preeetha (2014), “Antibacterial activity

of diferent solvent extracts of Ceropegia pusillain in vitro tuber (wight and

ARN.) an andemic, medicinal plant”, World Journal of pharmacy and

pharmaceutical sciences, 3(8): 785-793.

28. Liu X, Hou X (2018), “Antagonistic Regulation of ABA and GA in Metabolism

and Signaling Pathways”, Front Plant Sci, 9:251.

29. Mohammad HR (2013), “In vitro regeneration of sour orange (Citrus aurantium L.)

via direct organogenesis”, Plant Knowledge Journal, Southern Cross Publishing

Group, 2(4): 150-156.

30. Nascimento MA, Silva AK, França LC, Quignard EL, López JA, Almeida

MG (2006), “Turnera ulmifolia L. (Turneraceae): Preliminary study of its

antioxidant activity”, Bioresour Technol, 97(12): 1387-91.

31. Oliveira AF, Costa Junior LM, Lima AS, Silva CR, RibeiroMN, Mesquista

JW, Rocha CQ, Tangerina MM, Vilegas W (2017), “Anthelmintic activity

of plant extracts from Brazilian savanna”, Veterinary Parasitology, 236:

121- 127.

32. Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), “Improved in vitro plant regeneration

and micropropagation of Rehmannia glutinosa L.”, Journal of Medicinal

Plants, 3(1): 031-034.

33. Park AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003),

“Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered

medicinal plant”, Planta Med, 69(6): 571-573.

50

34. Pino JA (2010), “Essential oil of Turnera ulmifolia leaves from Cuba”, Nat

Prod Commun, 5(11): 1829-30.

35. Samuel K, Debashish D, Madhumita B, Padmaja G, Siva RP, Murthy BRV,

Rao PS (2009), “In vitro germination and micropropagation of Givotia

rottleriformis Griff”, In vitro Cellular & Developmental Biology.

36. Santos KK, Matias EF, Souza CE, Tintino SR, Braga MF, Guedes GM,

Nogueira LF, Morais EC, Costa JG, Menezes IR, Coutinho HD (2012),

“Anti-Candida activity of Mentha arvensis and Turnera ulmifolia”, J Med

Food, 15(3): 322-4.

37. Savelieva EM, Oslovsky VE, Karlov DS, Kurochkin NN, Getman IA, Lomin

SN, Sidorov GV, Mikhailov SN, Osolodkin DI, Romanov GA (2018),

“Cytokinin activity of N6-benzyladenine derivatives assayed by interaction with

the receptors in planta”, in vitro, and in silico, Phytochemistry, 149: 161-177.

38. Szewczyk K, Zidorn C (2014), “Ethnobotany, phytochemistry, and

bioactivity of the genus Turnera (Passifloraceae) with a focus on damiana-

Turneradiffusa”, J Ethnopharmacol, 152(3): 424-43.

39. Zhang HJ, Tan GT, Santarsiero BD, Mesecar AD, Hung NV, Cuong NM,

Soejarto Đ, Pezzuto JM, Fong HH (2003), “New Sesquiterpenes from Litsea

verticillata”, J Nat Prod, 66(5): 609-615.

Tài liệu Internet

40. http://www.banbuonduoclieu.com/blog/cao-kho-dong-hau-damiana-extract.

41. http://www.bachkhoatrithuc.vn/encyclopedia/4667.02.633929315971288750.

42. “Phân họ hoa thời chung”, http://vi.wikipedia.org.

43. http://vienduoclieu.org.vn/tin-chi-tiet/-/chi-tiet/su-can-thiet-phat-trien-

duoc-lieu-354-677.html.

44. “Chi Đông hầu”, https://vi.wikipedia.org.

45. “Turnera ulmifolia (West Indian holly)”, https://www.cabi.org.

46. “Cây Đông hầu”, http://yhocbandia.vn/cay-dong-hau.html.

51

47. “Một số cây thuốc nam có tác dụng trị mụn làm đẹp da”, https://www.meo

trimuntrungca.com/mot-so-cay-thuoc-nam-co-tac-dung-tri-mun-lam-dep-

da.html.

48. Trần Phạm (2016), “Đông hầu là gì”, Hello Health Group, https://hellobac

si.com/thao-duoc/dong-hau/, ngày 11/6/2016.

49. http://skinmedicine.vn/cao-cang-da-dong-hau-my-pham-thien-nhien-lam-

cang-da-vinh-vien/.

52