Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu ứng dụng các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm để sản xuất phân vi sinh cải tạo đất trồng rau trên quần đảo Trường Sa

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:92

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là tuyển chon được bộ chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa Trường Sa, có hoạt tính cố định đạm, phân giải phosphate và đồng thời sinh chất kích thích sinh trưởng IAA( Indole -3- axetic axit); xây dựng được quy trình lên men thu nhận sinh khối các chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn nhằm sản xuất phân vi sinh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu ứng dụng các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm để sản xuất phân vi sinh cải tạo đất trồng rau trên quần đảo Trường Sa

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Thị Nguyệt PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHỊU MẶN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CẢI TẠO ĐẤT TRỒNG RAU TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Thị Nguyệt PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHỊU MẶN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CẢI TẠO ĐẤT TRỒNG RAU TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: TS. Lê Đức Anh Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Ngọc Lan Hà Nội - 2020
i Lời cam đoan Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Lê Đức Anh, TS. Nguyễn Ngọc Lan và Ths. Vũ Văn Dũng. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Học viên Trần Thị Nguyệt
ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đức Anh, TS. Nguyễn Ngọc Lan và ThS. Vũ Văn Dũng đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện Luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, các cô, cán bộ Học viện Khoa học và công nghệ, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành các học phần trong Chương trình đào tạo. Em cũng xin cảm ơn Đảng ủy, Lãnh đạo Viện Hóa học- vật liệu, Viện Khoa học và công nghệ quân sự, Bộ Quốc phòng và tập thể phòng Hóa học các hợp chất nhiên đã cho phép, tạo điều kiện về thời gian, thiết bị nghiên cứu, động viên tinh thần cho em trong quá trình học tập nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn đề tài ĐTĐL.CN - 11/19- C đã giúp đỡ một phần kinh phí để tôi hoàn thành Luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đinh, người thân, bạn bè đã hết lòng ủng hộ tôi về cả tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập và thực hiện Luận văn.
iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan .................................................................................................... i Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................ iii Danh mục các bảng ....................................................................................... vii Danh mục các hình vẽ, đồ thị ........................................................................ ix MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 1.1. ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN VÀ TÌNH HÌNH TRỒNG RAU TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA ......................................................................... 4 1.1.1. Điều kiện tự nhiên quần đảo Trường Sa ......................................... 4 1.1.2. Tình hình trồng rau trên quần đảo Trường Sa ................................ 5 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT CỐ ĐINH NITƠ............................. 6 1.3. PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN THU SINH KHỐI VI SINH VẬT ......... 9 1.3.1. Phương pháp lên men chìm........................................................... 10 1.3.2. Phương pháp lên men bề mặt. ....................................................... 10 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỐI QUÁ TRÌNH LÊN MEN THU SINH KHỐI CỦA VI SINH VẬT CHỤI MẶN CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM................................................................................................. 10 1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon....................................................... 10 1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ............................................................ 11 1.4.3. Các nguyên tố khoáng ................................................................... 11 1.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm ......................................................... 11 1.4.5 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi sinh vật chụi mặn có khả năng cố định đạm. ............................................................................ 12 1.4.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự phát triển của vi sinh vật chụi mặn có khả năng cố định đạm ................................................................. 12
iv 1.5 THỰC TRẠNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN CHỊU MẶN VÀO CÁC CHẾ PHẨM VI SINH TRÊN THẾ GIỚI ..................... 13 1.6 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VÀ SẢN XUẤT PHÂN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG NƯỚC ................................................................................ 16 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................... 18 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ......................................................................... 18 2.1.1. Vật liệu .......................................................................................... 18 2.1.2. Hóa chất và môi trường................................................................. 19 2.1.3 Dụng cụ và thiết bị ......................................................................... 20 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU ....................................................... 20 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu ..................................................................... 20 2.2.2. Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật chịu mặn và bảo quản ........................................................................................................ 20 2.2.3. Khảo sát hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn .......... 21 2.2.4. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn .......... 21 2.2.5 Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn ............................................. 22 2.2.6. Khuếch đại gen 16S rRNA............................................................ 23 2.2.7. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng cố định nitơ ................ 23 2.2.8. Sàng lọc các chủng có khả năng phân giải phosphate khó tan ..... 24 2.2.9. Phương pháp xác định khả năng sinh IAA của các chủng chọn lọc ................................................................................................................. 25 2.2.10. Phương pháp xác định đường tổng bằng phenol và acid sulfuric ................................................................................................................. 26 2.2.11. Phương pháp định lượng protein bằng phương pháp Lowry ...... 27 2.2.12. Phương pháp lên men .................................................................. 28 2.2.13. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ..... 29 2.2.13.1 Ảnh hưởng của NaCl lên sinh trưởng, cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA ...................................................................................... 29 2.2.13.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm ........... 29
v 2.2.13.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................ 30 2.2.14.4 Ảnh hưởng của pH ................................................................ 30 2.2.13.5 Ảnh hưởng của thời gian nhân sinh khối .............................. 30 2.2.14 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm phân vi sinh chịu mặn cố định đạm .......................................................................................................... 31 2.2.15. Thử nghiệm, đánh giá chế phẩm vi sinh ..................................... 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 33 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI SINH VẬT CHỊU MẶN CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ MẪU ĐẤT LẤY TẠI CÁC ĐẢO THUỘC QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA .................................................................................... 33 3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN PHOSPHATE VÀ SINH IAA CỦA CÁC CHỦNG CHỌN LỌC ............. 34 3.3 GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RRNA CỦA HAI CHỦNG CHỌN LỌC N4.1 VÀ STT 3 3.1 ..................................................................................... 37 3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA NACL LÊN KHẢ NĂNG SINH IAA CỦA CHỦNG N 4.1 VÀ KHẢ NĂNG SINH AMONI CỦA CHỦNG STT3 3.1 ............................................................................. 38 3.5. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG N4.1 VÀ STT 3 3.1 ..................................................................................... 40 3.5.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 .................................................................. 40 3.5.2 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 ......................................................................................................... 41 3.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 ................................................................................... 42 3.5.4 Ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan ban đầu đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 .................................................................. 43 3.5.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 ................................................................................... 43
vi 3.5.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hai chủng N4.1 và STT 3 3.1 ............................................................................................ 46 3.6 ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN NHÂN SINH KHỐI .............. 48 3.6.1 Động học quá trình lên men nhân sinh khối chủng N4.1 .............. 48 3.6.2 Động học quá trình lên men nhân sinh khối chủng STT3.3.1 ....... 49 3.7. QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN SINH KHỐI CHỦNG CỐ ĐỊNH ĐẠM ............................................................................................................ 50 3.8. SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH TỪ HAI CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM CHỊU MẶN N4.1 VÀ STT3 3.1 ..................................... 52 3.9 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM PHÂN VI SINH CỐ CHỊU MẶN CỐ ĐỊNH ĐẠM ................................................................................................ 54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 57 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 57 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 59 PHỤ LỤC
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kí hiêu và vị trí lấy mẫu đất trên quần đảo Trường Sa .................. 18 Bảng 2.2: Kết quả các phép đo OD ................................................................ 24 Bảng 3.1: Hình thái khuẩn lạc của các chủng cố định đạm ............................ 33 Bảng 3.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của chủng N 4.1 và STT3 3.1 ......................................................................................................................... 37 Bảng 3.3: Môi trường lên mem sinh khối của hai chủng N4.1 và STT3 3.1 .. 51 Bảng 3.4: Kết quả sau 30 ngày thử nghiệm trồng rau với giá thể là đất nền cổ trên đảo Trường Sa và phân vi sinh cố định đạm chịu mặn qui mô phòng thí nghiệm ............................................................................................................. 54
viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Phần viết đầy đủ 1 ATP Adensine triphosphate ( năng lượng của tế bào) 2 N nitơ 3 NH3 Amoniac 4 VSV Vi sinh vật 5 IAA 3-indole aceticacid (chất kích thích sinh trưởng)
ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Chu trình nitơ trong tự nhiên ........................................................... 7 Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định N2 ................................................... 8 Hình 1.3 Mô hình cấy trúc các gen nif ............................................................. 8 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn ammonium sử dụng dung dịch chuẩn (NH4)2SO4 ....................................................................................................... 24 Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn phosphate sử dụng dung dịch chuẩn KH2PO4.25 Hình 2.3 Đường chuẩn IAA ............................................................................ 26 Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn glucose ........................................................... 27 Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn biển điễn protein. ........................................... 28 Hình 3.1 Hình ảnh sàng lọc các chủng vi sinh vật trên môi trường Burk’s ............................................................................. Error! Bookmark not defined. Bảng 3.1: Hình thái khuẩn lạc của các chủng cố định đạm ............................ 33 Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và tế bào (phải) của chủng STT3 3.1 .... 33 Hình 3.3: Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và tế bào (phải) của của chủng N 4.1 ... 34 Hình 3.4: Đồ thị thể hiện hàm lượng amoni tổng hợp của 36 chủng............. 34 Hình 3.5. So sánh khả năng phân giải phosphate của các chủng phân lập..... 35 Hình 3.6.So sánh khả năng sinh IAA của 36 chủng vi khuẩn. ....................... 36 Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự 16S rRNA của hai chủng vi khuẩn N4.1 và STT3 3.1. ............................................................................ 38 Hình 3.8: Ảnh hưởng NaCl lên sinh trưởng và tổng hợp IAA của chủng N4.1 ................................................................................................................. 39 Hình 3.9 : Ảnh hưởng NaCl lên sinh trưởng và tổng hợp amoni của chủng STT3 3.1 .......................................................................................................... 40 Hình 3.10. Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ......................................................................... 41 Hình 3.11 : Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ............................................................................... 42
x Hình 3.12: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ................................................................... 43 Hình 3.13: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ........... Error! Bookmark not defined. Hình 3.14: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ................................................................... 45 Hình 3.15. Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của đường glucose đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ................................................................... 45 Hình 3.16 : Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT3 3.1. ......................................................................... 46 Hình 3.17: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của cao nấm men đối với sự sinh trưởng của chủng N 4.1 và chủng STT3 3.1. .................................................. 47 Hình 3.18: Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của nguồn ni tơ kết hợp bổ sung NH4NO3 đến sự sinh trưởng của hai chủng N 4.1 và STT 3.3.1 ..................... 48 Hình 3.19 Động học quá trình lên men thu sinh khối của chủng N 4.1. ....... 49 Hình 3.20 Động học quá trình lên men thu sinh khối của chủng STT3 3.1. . 50 Hình 3.21: Sơ đồ quy trình nhân sinh khối chủng cố định đạm ..................... 51 Hình 3.22: Sơ đồ quy trình sản xuất phân bón vi sinh từ hai chủng vi khuẩn cố định đạm chịu mặn N4.1 và STT3 3.1. ........................................................... 52 Hình 3.23: Hình ảnh phân bón vi sinh sản xuất từ hai chủng vi khuẩn N4.1 và STT3.3.1 .......................................................................................................... 53 Hình 3.24: Hình ảnh đất nên cổ phối trộn với phân vi sinh sản xuất từ hai chủng vi khuẩn cố định đạm chịu mặn bản địa. .............................................. 54 Hình 3.25: Hình ảnh giá thể phân đất 6:4 ....................................................... 54 Hình 3.26: Rau muống trồng với phân vi sinh cố định đạm chụi mặn ........... 55 Hình 3.27: Hình ảnh rễ , lá, và chiều dài cây của lô thí nghiệm và mẫu đối chứng ............................................................................................................... 56
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết chọn đề tài Quần đảo Trường Sa, thuộc tỉnh Khánh Hòa, nằm ở trung tâm biển Đông, về phía Đông Nam nước ta, là một trong những khu vực có nhiều tuyến đường biển nhất trên thế giới nối liền Thái Bình Dương với Ấn Độ Dương và Đại Tây Dương, một tuyến đường huyết mạch có lưu lượng tàu thuyền tấp nập vào hàng thứ 2 trên thế giới, trung bình mỗi ngày có 250-300 tàu biển các loại đi qua biển Đông. Giá trị vận chuyển tuyến đường này lên tới 31 tỷ USD. Trong tương lai, việc vận chuyển khối lượng hàng hóa qua biển đông sẽ tăng gấp 2-3 lần, khi đó biển Đông nói chung và vùng biển Trường Sa nói riêng sẽ có vai trò rất lớn trong thương mại và an ninh quốc tế. Từ vị trí quan trọng của biển, đảo, Đảng và Nhà nước ta luôn coi trọng giải quyết tốt mối quan hệ giữa phát triển kinh tế xã hội gắn với củng cố quốc phòng an ninh và xây dựng thế trận quốc phòng toàn dân trên các vùng biển, đảo. Ngày nay, với xu thế tốc độ tăng trưởng kinh tế và dân số, nguồn tài nguyên thiên nhiên, nhất là nguồn tài nguyên không tái tạo được trên đất liền sẽ dần bị cạn kiệt, sự tồn tại và phát triển của con người đang hướng về đại dương. Vì vậy, vị trí và vai trò của biển đảo càng trở nên quan trọng, việc tranh chấp, xác định chủ quyền biển, đầu tư phát triển kinh tế biển, củng cố quốc phòng an ninh trên biển đang trở thành vấn đề nóng bỏng và có tính cấp bách cho các quốc gia có biển. Là một quốc gia có biển, đó là một lợi thế lớn, chúng ta cần tiếp tục phát huy những thành tựu đã đạt được, tăng cường hơn nữa phát triển kinh tế biển với chiến lược toàn diện, có trọng tâm, trọng điểm, sớm đưa nước ta thành một quốc gia mạnh về kinh tế biển trong khu vực, gắn với đảm bảo quốc phòng an ninh và hợp tác quốc tế. Đất trồng rau ở trên các đảo nổi thuộc Quần đảo Trường Sa chủ yếu là lớp cát san hô, rất thô, kém giữ nước, giữ màu. Có thể phân biệt hai loại: đất cát san hô thường thấy ở ven đảo, đất phân chim, rất phổ biến ở các đảo lớn, thường có màu nâu đen, phủ kín các mặt đảo. Nói tóm lại, điều kiện tự nhiên ở quần đảo Trường Sa rất khắc nghiệt, thiếu nước ngọt cho sinh hoạt và trồng
2 trọt, đất đai cằn cỗi, chỉ có rất ít loài thực vật có thể sinh trưởng. Việc canh tác trồng rau xanh, hoặc phủ xanh cho đảo trong điều kiện tự nhiên là không thể, do vậy cần sử dụng các biện pháp kỹ thuật để cải tạo đất và các phương pháp trồng cây hiện đại để cải thiện diện tích rau xanh và hệ thực vật trên các đảo là việc làm cần thiết. Chính vì vậy, cần phải phát triển một loại phân vi sinh có khả năng chịu mặn được với điều kiện khí hậu khắc nghiệt của quần đảo Trường Sa để phục vụ cải tạo đất trồng rau xanh và cây xanh trên đảo là rất cần thiết. Xuất phát từ ý tưởng trên đề tài tập trung nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm, phân giải phosphate và đồng thời sinh chất kích thích sinh trưởng để sản xuất được phân bón vi sinh phục vụ trồng rau xanh và cây xanh trên đảo Trường Sa. Mục đích của đề tài - Tuyển chon được bộ chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa Trường Sa, có hoạt tính cố định đạm, phân giải phosphate và đồng thời sinh chất kích thích sinh trưởng IAA( Indole -3- axetic axit). - Xây dựng được quy trình lên men thu nhận sinh khối các chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn nhằm sản xuất phân vi sinh. Đối tượng Các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm, phân giải phosphate, sinh chất kích thích sinh trưởng được phân lập từ các mẫu đất được lấy tại các vị trí khác nhau trên các đảo thuộc quần đảo Trường Sa. 2. Phạm vi nghiên cứu Các chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm trong các mẫu đất lấy tại các đảo thuộc quần đảo Trường Sa Bước đầu thử nghiệm hiệu quả của phân bón vi sinh sản xuất được so sánh với đối chứng.
3 3. Ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn. Ý nghĩa khoa học: Đề tài phân lập, tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn bản địa có khả năng cố định đạm, phân giải phosphate, sinh IAA trên một số mẫu đất thu được tại các đảo thuộc quần đảo Trường Sa, góp phần vào công tác cải tạo đất trồng rau và việc chăm sóc cây xanh. Ngoài ra còn tham gia bảo tồn nguồn gen đa dạng vi sinh vật tại các đảo thuộc quần đảo Trường Sa. Giá trị thực tiễn: Kết quả của đề tài tham gia phục vụ cải tạo đất trồng rau và chăm sóc cây xanh phủ xanh quần đảo Trường Sa góp phần cải thiện đời sống của bộ đội trên đảo và phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN VÀ TÌNH HÌNH TRỒNG RAU TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA 1.1.1. Điều kiện tự nhiên quần đảo Trường Sa “Quần đảo Trường Sa thuộc tỉnh Khánh Hòa là một trong những khu vực có nhiều tuyến đường biển nhất trên thế giới nối liền Thái Bình Dương với Ấn Độ Dương và Đại Tây Dương, một tuyến đường huyết mạch có lưu lượng tàu thuyền tấp nập vào hàng thứ hai trên thế giới, trung bình mỗi ngày có 250-300 tàu biển các loại đi qua biển Đông. Với vị trí đặc biệt quan trọng Đảng và Nhà nước ta luôn coi củng cố quốc phòng an ninh trên các vùng biển, đảo đặc biệt là quần đảo Trường Sa. Tuy nhiên, điều kiện tự nhiên của quần đảo Trường Sa rất khắc nghiệt, thiếu nước ngọt cho trồng trọt, đất đai cằn cỗi, chỉ có rất ít loài thực vật có thể sinh trưởng. Vì vậy, việc canh tác trồng rau xanh, hoặc phủ xanh cho đảo trong điều kiện tự nhiên là việc khó khăn, do vậy cần sử dụng các biện pháp kỹ thuật để cải tạo đất và các phương pháp trồng cây hiện đại để cải thiện diện tích rau xanh và hệ thực vật trên các đảo là việc làm cần thiết...” “Về khí hậu thời tiết tại quần đảo có 2 mùa là mùa mưa và mùa khô. Về cơ bản, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 1 năm sau, mùa khô từ tháng 2 đến tháng 4. Nhiệt độ trung bình từ 29oC-31oC. Đổ ẩm không khí trung bình ở Trường Sa khá cao khoảng 82-83%. [1] Độ muối trong nước biển Trường Sa khá cao. Hàm lượng muối ở tầng nước mặt thường không quá 3,5%. Tuy nhiên, ở ven các đảo nổi hoặc trong lòng các đảo chìm do quá trình bốc hơi lớn, việc lưu thông nước với toàn vùng lại kém, do vậy độ muối ở đây có thể cao hơn. Theo số liệu thống kê nhiều năm của Tổng Cục Khí tượng Thủy văn, độ muối tại trạm Trường Sa Lớn và Song Tử Tây lên tới 3,5%. Vào các tháng 8, 9, và 10, độ muối tầng mặt dao động trong khoảng 32,7%–33,5%. Ở độ sâu 100m, độ muối thường có giá trị từ 34,4% – 34,5%. [1]
5 Tất cả các đảo đều không có đất trồng. Trên mặt các đảo nổi ở Trường Sa thường hình thành một lớp đất phủ đặc trưng của đảo san hô vùng khơi. Có thể phân biệt hai loại: - đất cát san hô thường thấy ở ven đảo, - đất phân chim, rất phổ biến ở các đảo lớn, thường có màu nâu đen, phủ kín các mặt đảo, đây là loại rất giàu hữu cơ, đặt biệt là hàm lượng P2O5 có khi từ 15-20%. Đất phân chim có lượng phân chim chiếm khoảng từ 30-40% như ở Trường Sa Lớn và Song Tử Tây. Đất có phản ứng kiềm yếu. Hàm lượng muối tổng số của đất tới 8,5%, đạm tổng số tới 0,65–0,85%. [2] Điều kiện khí hậu của đảo Trường Sa gây khó khăn cho công tác tăng gia sản xuất tại đảo nhất là gió mặn gây chết cây và mưa nhiều làm dập nát cây. Diện tích của từng đảo là rất nhỏ nên gió lớn có thể tạt bọt nước biển như mưa phùn vào tận giữa đảo. Vì vậy, nhà kính là phương tiện tốt nhất giúp che chắn được mưa, hơi muối và bọt nước biển. Bộ đội thường tận dụng các các khoảng trống để trồng rau. Tuy nhiên, vì vườn rau rất sát mực nước biển nên thường xuyên bị nước biển tạt làm cháy lá và nhiễm mặn đất trồng. 1.1.2. Tình hình trồng rau trên quần đảo Trường Sa Chủng loại rau ở đảo hiện khá nghèo nàn chủ yếu là rau muống, mồng tơi, cải xanh, cải củ, bầu, mướp, rau dền, đu đủ, rau khoai lang, rau bầu đất và rau má. Trong đó, mùa khô rau muống, mồng tơi, cải xanh chiếm khoảng 80% diện tích, mùa mưa gần như chỉ còn rau muống, mồng tơi và rau lang. Riêng đu đủ, nơi nào trồng được thì cho thu hoạch quanh năm. Đa số đất trồng rau tại đảo hiện nay là phối trộn giữa đất đỏ hoặc phù sa từ đất liền chở ra với cát san hô tại đảo, phần nào được tưới nhiều phân gia súc và nước tiểu thì còn màu mỡ, phần nào được tưới ít thì nay đã bạc màu và không cho năng suất cao. [3] Một số nguyên nhân hạn chế đến sự phát triển của rau bao gồm: - Gió mặn: gió mùa Đông Bắc từ tháng 11 năm trước đến tháng 2 năm sau mang hơi muối mặn, nếu che chắn không đầy đủ rau bị cháy lá. - Mưa dầm: từ tháng 6 đến tháng 9 mưa gió nhiều, nếu không che chắn rau sẽ bị giập nát. Thêm nữa đất luôn trong tình trạng ướt, cây rau kém phát
6 triển. Nếu không có biện pháp che chắn hạn chế tác hại của mưa sẽ không phát triển được rau mùa mưa. - Thiếu đất trồng và thiếu không gian. Lớp đất mặt tại chỗ thực ra là lớp cát san hô, rất thô, kém giữ nước, giữ màu. Việc trồng rau chủ yếu nhờ đất từ đất liền mang ra. Tuy nhiên, nếu không có biện pháp tăng cường chất hữu cơ, đất sẽ ngày càng nghèo kiệt. Thiếu không gian, tức thiếu nơi trồng, không chỉ ở đảo chìm mà ở đảo nổi cũng thiếu. Vì vậy cần suy nghĩ phát triển rau ở đây theo hướng thâm canh, không tăng thêm nhiều diện tích mà nâng cao hiệu suất canh tác trên mỗi mét vuông mặt bằng. Nói tóm lại, điều kiện tự nhiên ở quần đảo Trường Sa rất khắc nghiệt, thiếu nước ngọt cho sinh hoạt và trồng trọt, đất đai cằn cỗi, chỉ có rất ít loài thực vật có thể sinh trưởng. Việc canh tác trồng rau xanh, hoặc phủ xanh cho đảo trong điều kiện tự nhiên là không thể, do vậy cần sử dụng các biện pháp kỹ thuật để cải tạo đất và các phương pháp trồng cây hiện đại để cải thiện diện tích rau xanh và hệ thực vật trên các đảo là việc làm cần thiết. Trong những năm gần đây, các kỹ thuật trồng rau xanh trên đảo đã được bộ đội áp dụng. Tuy nhiên, hiện nay năng suất rau trồng trên đảo chưa cao, chất lượng rau chưa ổn định, một phần là do chưa có quy trình kỹ thuật kiểm soát chất lượng đất trồng rau. 1.2. VI SINH VẬT CỐ ĐINH NITƠ Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu để thực vật sinh trưởng và phát triển. Tuy nhiên, nguồn N chính trong tự nhiên là nitơ khí quyển (N2) thì hầu hết các sinh vật sống, bao gồm cả sinh vật nhân chuẩn không sử dụng được. Cố định nitơ sinh học là quá trình khử N2 thành ammoniac và được thực hiện ở các vi sinh vật cố định nitơ, nhờ đó mà thực vật có thể hấp thụ được nguồn dinh dưỡng nitơ. [4]
7 Hình 1.1. Chu trình nitơ trong tự nhiên [4] Vi sinh vật có thể cố định nitơ thông qua cộng sinh (hình thành các nốt sần rễ cây đặc biệt là cây họ đậu) và không cộng sinh (sống tự do trong đất). Với sự tham gia của năng lượng ATP, các vi sinh vật cố định nitơ thực hiện quá trình cố định nitơ nhờ phức hệ enzyme nitrogenase. Phức hệ enzyme nitrogenase, bao gồm 2 thành phần protein : - “Dinitrogenase (MoFe-protein): có trọng lượng phân tử khoảng 240 KDa, cấu tạo từ 2 tiểu đơn vị khác nhau chứa nhân Fe, Mo và tâm oxy hóa khử. Dinitrogenase có chứa cofactor MoFe hoặc MoFe-co.” - “Dinitrogenase reductase (Fe-protein): protein nhỏ hơn, có trọng lượng phân tử khoảng 60 KDa, gồm 2 tiểu đơn vị giống nhau, chứa tâm oxy hóa - khử Fe4-S4, có 2 vị trí gắn ATP. * Cơ chế cố định đạm Theo Kneip và cộng sự (2007) [5], trong suốt quá trình cố định đạm, nitơ giảm trong hệ thống vận chuyển điện tử, kết quả tạo NH3 và phóng thích H2. NH3 sau đó được sử dụng để tổng hợp các chất khác. Quá trình chuyển N2 thành NH3 được xúc tác bởi phức hệ enzyme nitrogenase với sự tham gia của năng lượng ATP. Enzyme dinitrogenase reductase và dinitrogenase có các tiểu đơn vị nif (γ2 homodimeric azoferredoxin) và NifD/K (α2ß2 heterotetrameric molybdoferredoxin). Điện tử chuyển từ ferredoxin (hoặc flavodoxin) đến dinitrogenase reductase và chuyển đến dinitrogenase, cung cấp điện tử dưới dạng H2 đến các N2 tạo thành NH3. Mỗi mol N2 được cố định
8 cần có 16 ATP và có sự tham gia của protein nifH. Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase tổng hợp N2 thành NH3 theo sơ đồ sau: Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định N2 [5] Vi sinh vật cố định nitơ thuộc nhiều chi khác nhau như, Rhizobium, Bradyrhizobium, Herbaspirillum, Azospirillum, Burkholderia, Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter, Klebsiella, … Klebsiella oxytoca M5a1 là vi sinh vật cố định đạm đầu tiên mà các gen liên quan đến quá trình tổng hợp nitơ và chức năng của enzyme nitrogenase được xác định và mô tả. Trong bộ gen của vi sinh vật này, 20 gen nif được nhóm lại trong vùng nhiễm sắc thể 24 kb, được tổ chức thành 8 operon: nifJ, nifHDKTY, nifENX, nifUSVWZ, nifM, nifF, nifLA, và nifBQ. Gen nifD và nifK mã hóa cho FeMo-protein, gen nifH mã hóa cho Fe-protein [6] Hình 1.3 Mô hình cấy trúc các gen nif [6]