Luận văn thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. trên một số loại đất ở Đăk Lăk

Chia sẻ: Trang Lê | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:234

Thêm vào BST

Báo xấu

325
lượt xem 97
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu đề tài: tuyển chọn được một số chủng Azotobacter sp. cố định đạm cao trên một số loại đất ở Đăk Lăk, đánh giá hiệu quả của một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp. đối với sự sinh trưởng của cây cải ngọt (Brassica juncea).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. trên một số loại đất ở Đăk Lăk

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN LÊ QUANG DŨNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO Azotobacter sp. TRÊN MỘT SỐ LOẠI ĐẤT Ở ĐĂK LĂK LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, ñược các ñồng tác giả cho phép sử dụng và chưa ñược công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Họ tên tác giả Lê Quang Dũng
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập nghiên cứu và ñể hoàn thành bản luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và kính trọng ñến: PGS.TS. Nguyễn Anh Dũng, người trực tiếp hướng dẫn khoa học, ñã tận tình chỉ dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp, TS. Võ Thị Phương Khanh, Thầy cô giáo trong bộ môn sinh học khoa KHTN&CN, cùng tập thể các thầy cô giáo của trường ñại học Tây Nguyên ñã giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và ñóng góp những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành luận văn này. Những anh chị lớp cao học Sinh Học Thực Nghiệm khóa 3, ñã cùng tôi san sẽ những buồn vui, cùng nhau học tập và trao ñổi kiến thức trong quá trình làm ñề tài. Các em sinh viên CN Sinh K07 và các anh chị làm việc trong bộ môn sinh học thực vật, bộ môn khoa học về ñất, ñã sẵn sàng giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những nhà khoa học trong ngành, các ñồng nghiệp, bạn bè và người thân ñã ñộng viên giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp. Đăk Lăk, tháng 10 năm 2011. Tác giả Lê Quang Dũng
DANH MỤC CÁC BẢNG 2.1 Nồng ñộ IAA thành lập ñồ thị ñường chuẩn 29 3.1 Ký hiệu, ñịa ñiểm phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường Ashby 34 3.2 Mô tả Hình thái khuẩn lạc của 24 chủng vi khuẩn phân lập ñược 36 3.3 Khả năng cố ñịnh nitơ của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. 40 3.4 Khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. 42 3.5 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. ñến số lá cây cải ngọt 44 3.6 Ảnh hưởng các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. ñến chiều cao cây cải ngọt 45 3.7. Ảnh hưởng của các chủng VK Azotobacter sp. ñến khối lượng rễ cây cải 47 3.8. Ảnh hưởng của các chủng VK Azotobacter sp. ñến năng suất cây cải ngọt 48 3.9. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp. ñến số lá cây cải ngọt 50 3.10. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp. ñến chiều cao cây cải ngọt 52 3. 11. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp. ñến khối lượng rễ cây cải ngọt 53 3.12. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn lên diện tích lá cây cải ngọt 55 3.13. Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn Azotobacter sp. ñến năng suất cây cải ngọt 56 3.14. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn nuôi cấy từ các nguồn carbon khác nhau. 58 3.15. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn nuôi cấy ở các nồng ñộ glucose khác nhau 61 3.16. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của bốn chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn nuôi cấy trên các khoản nhiệt ñộ khác nhau 63 3.17. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn ñược nuôi cấy ở các pH khác nhau 65 3.18. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn nuôi cấy ở các thời gian khác nhau 67
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của ñề tài Giữa ñất, vi sinh vật và cây trồng có mối quan hệ tác ñộng qua lại lẫn nhau. Quá trình hình thành ñất và ñộ phì của ñất chịu ảnh hưởng của các yếu tố vật lí, hóa học và vi sinh vật. Vi sinh vật tổng hợp và giải phóng vào ñất những chất hữu cơ cần thiết tạo ñộ phì cho ñất, ngược lại ñất là môi trường sống cần thiết cho vi sinh vật, ñất và vi sinh vật cùng tác ñộng rất lớn ñến cây trồng, ñặc biệt cung cấp nguồn dinh dưỡng, một trong các nguồn dinh dưỡng quan trọng cho cây trồng là nguồn nitơ [8]. Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy ñi khỏi ñất khoảng 30 kg nitơ [3]. Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy ñi khỏi ñất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ (G. Colar và Greenland) [3]. Trong khi ñó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù ñắp ñược một phần lượng nitơ mà cây lấy ñi khỏi ñất. Lạm dụng quá mức việc sử dụng phân hóa học làm ñất xấu ñi, mất cân ñối các chất dinh dưỡng và làm giảm hệ vi sinh vật có ích, hơn nữa việc sản xuất phân nitơ hóa học còn gặp nhiều khó khăn, giá thành khá cao. Vấn ñề ñặt ra là làm thế nào ñể bổ sung lượng dinh dưỡng nitơ cho ñất một cách có hiệu quả nhất, vừa tiết kiệm ñược chi phí sản xuất, bảo vệ ñược môi trường. Một trong những giải pháp ñang ñược áp dụng ñể cải tạo ñất hiện nay là sử dụng phân bón vi sinh vật. Nhóm vi sinh vật trong phân có tác dụng cải thiện ñộ phì, cân bằng dinh dưỡng trong ñất, cải thiện các tính chất lý, hóa của ñất, và ñặc biệt hạn chế ô nhiễm môi trường, cũng như ô nhiễm môi trường nước do quá trình rửa trôi [1]. Trong tự nhiên, ngoài nguồn nitơ ñược tạo ra cho ñất từ quá trình amon hóa, quá trình nitrat hóa, nguồn nitơ còn ñược tạo ra từ quá trình cố ñịnh nitơ phân tử ñược thực hiện bởi các nhóm vi sinh vật trong ñất, trong ñó có sự ñóng góp của nhóm vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do Azotobacter sp. Các vi sinh vật thuộc nhóm
này có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ mà cây trồng có khả năng hấp thụ ñược [3]. Azotobacter sp. là một loại vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong ñất, chúng có khả năng cố ñịnh ñạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ. Ngoài ñặc ñiểm trên thì một số chủng thuộc chi này còn có khả năng sinh tổng hợp nên IAA (chất kích thích sinh trưởng ở thực vật). Chính nhờ ñặc ñiểm quan trọng ñó vi khuẩn Azotobacter sp. ñược ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm phân bón vi sinh vật làm tăng năng suất cây trồng. Ở Việt Nam ñã có một số công trình nghiên cứu về vi sinh vật cố ñịnh nitơ tự do trên một số loại ñất ñể làm phân vi sinh, nhưng hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về thành phần loài thuộc chi Azotobacter sp. trên một số loại ñất ở Đăk Lăk. Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do Azotobacter sp. trên một số loại ñất ở Đăk Lăk”. 2. Mục tiêu của ñề tài - Tuyển chọn ñược một số chủng Azotobacter sp. cố ñịnh ñạm cao trên một số loại ñất ở Đăk Lăk. - Đánh giá hiệu quả của một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp. ñối với sự sinh trưởng của cây cải ngọt (Brassica juncea) 3. Ý nghĩa của ñề tài Ý nghĩa khoa học Đề tài góp phần phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp. bản ñịa có khả năng cố ñịnh ñạm cao trên một số loại ñất ở Đăk Lăk, góp phần vào công công tác bảo tồn ña dạng vi sinh vật ở Đăk Lăk và Tây Nguyên. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azotobacter sp. trên một số loại ñất ở Đăk Lăk có hoạt tính cố ñịnh nitơ cao ñể sản xuất phân vi sinh có hiệu
quả, nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây trồng và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên Trong nước, nitơ chủ yếu ở dạng hợp chất của NH4+, NO2-, NO3-. Trong ñất có 2 dạng nitơ tồn tại ñó là nitơ vô cơ trong các muối khoáng và nitơ hữu cơ trong xác, chất bài tiết từ sinh vật. Các hợp chất chứa nitơ trong xác, chất bài tiết của ñộng vật và thực vật bị một số loại nấm và vi khuẩn phân giải. Trong ñất amon hầu như chuyển hóa toàn bộ thành hợp chất nitrat. Phần lớn hợp chất nitrat ñược thực vật hấp thụ, phần còn lại bị mất ñi do mưa rửa trôi và tác dụng của phản nitrat hóa. Hợp chất ñạm mà thực vật hút từ ñất một phần như gốc rễ ñược trả lại ñất, phần còn lại ñược ñộng vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất bài tiết trả lại ñất. Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh vật, nấm bị khử thành ñạm ở dạng hữu hiệu. Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N2) chiếm khoảng 80%, ở dạng nguyên tử kép (N2) ñược khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N). Mặc dù rất cần nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ ñược nitơ ở dạng NO3- và NH4+ [3]. Để sử dụng ñược nguồn nitơ lớn từ không khí có 2 con ñường chính là hóa học và sinh học. Hóa học: Kể từ năm 1920, phương pháp công nghiệp Haber - Bosch ñã giúp con người phá vỡ liên kết ba này. Biện pháp này ñòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt ñộ rất cao (450 – 500oC), áp suất là 125 atm và Fe3+ là chất xúc tác. Các hợp chất nitơ ñược tổng hợp hóa học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ lớn và ổn ñịnh. Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân ñạm tổng hợp hóa học cho nông nghiệp có thể làm tăng năng suất cây trồng thì cũng ñem lại những tác hại cũng không nhỏ, vì trung bình chỉ có 40 – 50 % lượng ñạm bón ñược cây hấp thu, phần còn lại gây ô nhiễm môi trường ñất, nước, không khí… từ ñó gây hại thậm chí là tiêu diệt các sinh vật có lợi. Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa học gây hại rất lớn ñối với cá, ñộng vật thân mềm và kể cả con người.
Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase ñể thực hiện quá trình sinh học ñặc biệt - quá trình cố ñịnh nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này ñược gọi là các vi sinh vật cố ñịnh nitơ. Việc sử dụng phân bón vi sinh làm ñất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo ñất do các hệ sinh vật có ích hoạt ñộng mạnh làm cho ñất tơi xốp hơn, cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn. Ngoài ra, còn có các con ñường tạo nitơ khác như do sấm chớp hay cháy [12]. 1.2. Vai trò của nitơ ñối với thực vật Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao ñộng từ 1 – 3%. Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý ñặc biệt quan trọng trong ñời sống sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của cây trồng. Thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophyll không ñược tổng hợp ñầy ñủ, lá vàng, ñẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt ñộng quang hợp nên năng suất giảm. Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng ñến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây trồng. như cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ ñổ, thu hoạch gặp nhiều khó khăn. 1.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên 1.3.1. Quá trình khoáng hóa Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác ñộng của quần thể vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy thuộc vào ñiều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau. Giai ñoạn này có sự tham gia của các chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa những hợp chất chứa nitơ thành nitrat (NO3-), một dạng thích hợp ñể cho cây trồng hấp thu.
Vi khuẩn amon hóa Hợp chất hữu cơ NH4+ Vi khuẩn nitrat hóa + NH4 NO2- Nitrosomonas Nitrobacter NO2- NO3- 1.3.2. Quá trình phản nitrat hóa Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong ñiều kiện yếm khí dưới tác dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ. Vi khuẩn phản nitrat hóa NO3- N2 1.3.3. Quá trình cố ñịnh nitơ phân tử Quá trình này ñược thực hiện do các vi sinh vật cố ñịnh nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ cây họ ñậu hay Azotobacter sống tự do, sẽ biến ñổi N2 trong không khí thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và ñồng thời làm giàu thêm nitơ cho ñất. Để quá trình này xảy ra thì phải có lực khử mạnh, ATP và thực hiện ở ñiều kiện kỵ khí (do chỉ trong ñiều kiện này enzyme nitrogenase mới hoạt ñộng). Nitrogenase H2O N 2 + H2 NH3 NH4+ Vi khuẩn cố ñịnh ñạm Cơ chế hóa sinh của quá trình cố ñịnh nitơ của vi khuẩn sống tự do trong ñất.
Cơ chế hóa sinh của quá trình cố ñịnh N2 của vi sinh vật cho ñến nay vẫn chưa ñược sáng tỏ hoàn toàn, nhưng ña số các nhà nghiên cứu ñồng ý với giả thuyết cho rằng NH3 là sản phẩm ñồng hóa sơ cấp của N2 và có thể nêu ra giả thuyết về 2 con ñường cố ñịnh N2 của vi khuẩn sống tự do trong ñất như sau: Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng cố ñịnh N2 ñược giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16 – 20 Kcal/M, song lượng năng lượng vẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật. Tốc ñộ phản ứng nhanh chóng trong tế bào vi sinh vật ở nhiệt ñộ thấp nhờ có hệ thống hydrogenase hoạt hóa H2 và nitrogenase hoạt hóa N2. Năm 1961 – 1962, người ta ñã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu phần hoạt hóa H2 và N2. Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter cũng có các tiểu phần ñó. Trong quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố khoáng Mo và Fe.
Nguồn hydro ñể khử N2 có thể là hydro phân tử (H2). Trong trường hợp này thì dưới tác dụng của hydrogenase, ñiện tử ñược chuyền theo hệ thống: Nguồn cho ñiện tử và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình chuyền ñiện tử có sự tham gia tích cực của feredoxine (Fd). Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzyme hydrogenase và nitrogenase ñể cố ñịnh N2. Sự cố ñịnh N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ ñồ phức tạp hơn. Trong các nốt sần có một chất có bản chất HEM rất giống với hemoglobin trong máu gọi là leghemoglobin. Nó dễ dàng liên kết với O2 ñể biến thành oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ ñược tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ ñậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố ñịnh ñược N2. Những nghiên cứu gần ñây về quá trình cố ñịnh N2 cho thấy quá trình cố ñịnh này ñòi hỏi: Có sự tham gia của enzyme nitrogenase. Có thể coi ñây là nhân tố chìa khóa cho quá trình này. Enzyme này hoạt ñộng trong ñiều kiện yếm khí. Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP,...)
Có năng lượng ATP ñủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng. Nhóm hoạt ñộng của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe. Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họ ñậu thường có hiệu quả rất cao. Tiến hành trong ñiều kiện yếm khí. Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với năng lượng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp. Sự cố ñịnh N2 cần rất nhiều năng lượng, cần 16 ATP ñể khử 1 N2. NH3 tạo thành trong quá trình cố ñịnh N2 ñược sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các cetoacid ñể tổng hợp một cách nhanh chóng các acid amine, từ ñó tham gia vào tổng hợp protein và nhiều quá trình trao ñổi chất khác. Phản ứng cố ñịnh nitơ ñược xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau: N2 + 8 H+ + 8 e- +16 ATP → 2 NH3 + H2 +16 ADP +16 Pi Như phương trình trên, nitrogenase xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3 trong sự hiện diện của ATP và chất khử như dithionite trong phòng thí nghiệm hay ferredoxin trong cơ thể sống. Nitrogenase là một phức hệ enzyme ñược cấu tạo bởi 2 thành phần, ñó là protein có phân tử nhỏ. Một thành phần gọi là protein sắt – molypden (Mo – Fe protein) còn gọi là thành phần I, thành phần kia gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử hay thành phần II. Thành phần I và thành phần II của nitrogenase ñều rất mẫn cảm với oxy, vì vậy nên hoạt ñộng cố ñịnh nitơ của vi sinh vật diễn ra trong ñiều kiện kỵ khí [18]. 1.4 . Tổng quan về vi khuẩn cố ñịnh Nitơ Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy ñi khỏi ñất khoảng 30 kg nitơ [3]. Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy ñi khỏi ñất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ (G. Colar và Greenland) [3]. Trong khi ñó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù ñắp ñược một phần lượng nitơ mà cây lấy ñi khỏi ñất, những tổn thất về nitơ ñược bù ñắp bởi một quá trình sinh học ñặc biệt gọi là quá trình cố ñịnh nitơ do vi sinh vật thực hiện, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các
hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn ñạm trong ñất, có thể xếp chúng thành ba nhóm lớn: + Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật. + Nhóm vi khuẩn sống tự do. + Nhóm vi khuẩn lam. 1.4.1. Nhóm Vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật 1.4.1.1. Vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ ñậu Nhà khoa học Hà Lan M.W. Beijrinck ñã phân lập ñược loài vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ ñậu và ông ñặt tên là Bacillus radicicola, vi khuẩn này ñược xếp vào chi riêng Rhizodium. Trên môi trường ñặc, vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, vô màu. Khi còn non tế bào của chúng có dạng hình que hoặc cầu 0,5 – 0,9 x 1,2 – 3,0µm, có khả năng di ñộng nhờ tiêu mao; khi già tế bào trở nên bất ñộng kích thước lớn phân nhánh gọi là thể giả khuẩn [3], [8]. Đây là các loài hiếu khí, tuy nhiên vi khuẩn nốt sần vẫn có thể sử dụng ñược ngay cả ở trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0.01atm. ña số chúng thích hợp ở pH = 6,5 – 7,5, bị cản trở khi pH= 4,5 – 5,0 hoặc lớn o o hơn 8.0 nhiệt ñộ thích hợp 24 – 26 C, ở 37 C sự phát triển của chúng bị cản trở [6], [7]. Vi khuẩn nốt sần xâm nhiễm vào rễ cây bộ ñậu thông qua lông hút, ñôi khi thông qua vết thương ở vỏ rễ. Người ta nhận thấy muốn xâm nhiễm tốt thì vi khuẩn nốt sần cần ñạt tới 104 tế bào/gam ñất. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polylacturonase phân hủy thành lông hút, tạo ñiều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ. Hằng năm vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây bộ ñậu có thể làm giàu cho ñất khoảng 50 – 600 kg nitơ/ha [3].
1.4.1.2. Vi sinh vật cố ñịnh ñạm cộng sinh trong một số cây không thuộc bộ ñậu Ngoài những loại cây thuộc bộ ñậu thì những loài cây không thuộc bộ ñậu cũng có khả năng tạo nốt sần như: một số thực vật thuộc ngành hạt trần: Bowenia, Cycas...một số thực vật hai lá mầm: Coffee, Coriaria,... Ngoài ra một số thực vật còn có khả năng tạo nốt sần trên lá. Qua nghiên cứu cho thấy, ngoài vi khuẩn nốt sần một số loài xạ khuẩn thuộc chi Frankia (cộng sinh trong rễ loài Casuarina) nhiều loài nấm rễ (khuẩn căn hay mycorhiza ) cũng có khả năng cố ñịnh nitơ phân tử, tạo nốt sần. Có nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ tác dụng của nấm rễ mà ñất thông Pinus radiala ở Mỹ hằng năm làm giàu thêm khoảng 50 kg nitơ/ha [3]. Ngày nay, các nhà khoa học có thể phân lập, nuôi cấy vi khuẩn cố ñịnh nitơ cộng sinh Rhizobium ñể sản xuất chế phẩm Nitragin ñể xử lý hạt giống ñậu trước khi gieo. Vi khuẩn sẽ ñược nuôi cấy trên môi trường thích hợp sau ñó hấp phụ vào chất mang là ñất, than bùn ñể bảo quản và sử dụng. 1.4.2. Nhóm Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do 1.4.2.1. Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do kỵ khí Clostridium Clostridium ñược phát hiện lần ñầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Tế bào Clostridium hình que có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 µm, có thể ñứng riêng rẽ hoặc kẹp ñôi thành chuỗi ngắn. Khi còn non có khả năng di ñộng, khi già mất khả năng di ñộng, bào tử nằm ở trung tâm, khuẩn lạc nhẵn và trắng có khả năng chịu ñược nhiệt ñộ cao và khô hạn [5]. Vi khuẩn Clostridium có nhiều loài có khả năng cố ñịnh nitơ phân tử như: Cl. pasteurianum, Cl. butylicum .... nhưng loài có khả năng cố ñịnh ñạm cao nhất là Clostridium pasteurianum. Chúng có khả năng cố ñịnh ñược 5 – 10 mg nitơ khi tiêu thụ hết 1g carbon. Phạm vi hoạt ñộng cố ñịnh nitơ của Clostridium trong khoảng pH khá rộng 4,7 – 8,5, tối thích là 6,9 – 7,3.
1.4.2.2. Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do hiếu khí Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp. và Azotobacter sp. 1.4.2.2.1. Nhóm vi khuẩn thuộc chi Beijerinskia sp. Beijerinskia sp. là loài vi khuẩn hiếu khí cố ñịnh nitơ rất giống với Azotobacter sp. Chúng ñược phân lập bởi R. J. Starkey (1939), tế bào có hình dạng thay ñổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục. Beijerinski là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử và bào xác, ñặc ñiểm chung của vi khuẩn thuộc chi này là chịu chua cao. Có khả năng sống tốt trong môi trường acid (pH=3), và nhiệt ñộ từ 16 – 37OC. Trên môi trường vô ñạm, sau 3 ngày nuôi cấy xuất hiện khuẩn lạc nhầy. Lồi. Vi khuẩn có khả năng cố ñịnh ñược 16 – 20 mg nitơ khi ñồng hóa hết 1g dinh dưỡng carbon. Ngoài khả năng cố ñịnh nitơ chúng còn có khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng. 1.4.2.2.2. Nhóm vi khuẩn thuộc chi Azotobacter sp. Azotobacter sp. ñuợc phân lập lần ñầu tiên vào năm 1901 (M. Beijerinck). Chúng thuộc vi khuẩn hiếu khí nhưng chúng có thể phát triển trong ñiều kiện kỵ khí. Hầu hết các loài Azotobacter sp. ñều sống dị dưỡng. Azotobacter sp. là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố ñịnh nitơ tự do. Khi chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, kích thước 2,0 – 7.0 x 1,0 – 2,5 µm, sinh sản bằng cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao. Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu ñược bao bọc bởi một lớp nhầy. Trong môi trường không chứa nitơ, Khuẩn lạc của Azotobacter sp. có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo. Khi nuôi cấy trong môi trường ñặc. Khuẩn lạc có màu hồng hoặc nâu ñen, sinh sắc tố hình quang màu vàng lục hoặc lam lục, sắc tố khuếch tán vào môi trường [5], [16].
Azotbacter sp. rất nhạy cảm với ñộ ẩm của ñất và hàm lượng của các nguyên tố khoáng có trong ñất (P, K, MO, B, Cu...) Nhiều nghiên cứu cho biết Azotobacter sp. có thể phát triển ñươc trên môi trường có pH trong khoảng 4,5 – 9. quá trình cố ñịnh nitơ chỉ ñược thực hiện trong khoảng pH 5,5 – 7,2. Nhiệt ñộ thích hợp nhất từ 26 – 30oC [6], [7]. Các chủng phân lập từ tự nhiên có khả năng cố ñịnh 10 – 15 mg nitơ khi tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng Carbon. Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố ñịnh tới 30 mg/1 g dinh dưỡng Carbon. Trong ñất, Azotobacter sp. tập trung ở vùng ñất xung quanh rễ cây. Ngoài khả năng cung cấp dinh dưỡng nitơ cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm, kích thích sinh trưởngTrong ñất, Azotobacter sp. thường phổ biến các chủng sau: + Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả năng di ñộng khi còn non. Khi già hình thành nang xác, khuẩn lạc có màu nâu hoặc ñen khi về già, không khuếch tán ra môi trường [24], [25]. + Azotobacter beijerinckii: Có kích thước 2,4 x 4,6 µm. Không có khả năng di ñộng và hình thành nang xác. Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy. + Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 µm, có khả năng di ñộng và hình thành nang xác. Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường [19], [26]. + Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 µm, có khả năng di ñộng, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường [2].
1.4.3. Nhóm vi khuẩn lam Năm 1928, Drewes (Đức) lần ñầu tiên chứng minh một cách xác ñáng khả năng cố ñịnh nitơ của ba loại khuẩn lam và ñã phân lập chúng một cách thuần khiết. Đa số các loài khuẩn lam có khả năng cố ñịnh nitơ sống tự do trong ñất, trong nước nhưng cũng có một số sống cộng sinh trong thực vật. Đây là vi sinh vật hiếu khí, chúng thích hợp phát triển trong môi trường trung tính hoặc kiềm. Nhiệt ñộ thích hợp từ 28 – 30oC. Chúng có khả năng cung cấp cho ñất khoảng 50 kg nitơ/ha/năm [2]. Ngoài các nhóm vi sinh vật cố ñịnh nitơ chủ yếu nói trên người ta còn thấy nhiều vi sinh vật thuộc nhóm khác cũng có khả năng ñồng hóa nitơ như: Tảo xanh Lục, một số ñại diện của nấm men và nấm mốc (Saccharomyces apiculatus, Oidium Lactic...) Có thể nói vi sinh vật ñóng vai trò hết sức quan trọng ñối với nông nghiệp trong việc cung cấp ñạm sinh học cho ñất. Vấn ñề ñặt ra cho các nhà khoa học hiện nay là nghiên cứu phương pháp nuôi cấy hiệu quả nhất ñể tăng sinh khối tế bào. Từ ñó ứng dụng vào nông nghiệp, hướng ñến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái vững bền trong cả nước nói chung và ở tỉnh Tây Nguyên nói riêng. 1.5. Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter sp. cho ñất và hạt giống, cây con ñã ñược chứng minh trên các thí nghiệm ñồng ruộng. Theo nghiên cứu của Puneet (1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp. kích thích nẩy mầm của hạt, kích thích ra rễ và sinh trưởng, năng suất lúa mỳ, ngô tăng 10 – 15 % so với ñối chứng [27], [28] Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ cho thấy sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ 30 – 60 kg nitơ /ha/năm và tổng lượng nitơ do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể ñạt ñến 240 triệu tấn/năm. Vi khuẩn cố ñịnh nitơ tự do
Azotobacter còn có khả năng tổng hợp B1, giberellin, cytokinin, IAA kích thích tăng trưởng cây trồng. Theo Subba Rao (1988) công bố Ấn Độ tiến hành bón chế phẩm Azotobacter cho lúa mì 3 lần trong năm: - Lần 1: bón 20 kg chế phẩm Azotobacter/ha vào tháng 4 – 5. - Lần 2: bón 15 kg/ha vào tháng 7. - Lần 3: bón 15 kg/ha vào tháng 10. Với qui trình bón như vậy, có thể ñáp ứng ñược 30 % nhu cầu nitơ của cây trồng ñể giảm lượng bón phân hóa học, góp phần phát triển bền vững nông nghiệp. Bagyaraj và Menger (1978) ñã nghiên cứu tương tác giữa Azotobacter chroococcum và các vi sinh vật vùng rễ và sinh trưởng của cà chua. Kết quả cho thấy cà chua ñược ủ với chủng cố ñịnh nitơ Azotobacter sẽ tăng sinh khối khô của cà chua lên 65 % so với ñối chứng. Fulchieri (1994) nghiên cứu sử dụng 3 chủng Azospirillum ñể xử lý hạt cho ngô. Kết quả cho thấy ñã làm chiều cao cây, tăng sinh khối và tăng năng suất ngô lên 59 % so với ñối chứng [16]. Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp Azotobacter sp. với các chủng phân giải photpho như Aspergillus niger sẽ làm tăng năng suất lúa mì tăng 17,7 %, trong khi Azotobacter chỉ tăng 9 % [20]. Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp. với các chủng phân giải phosphat như Bacillus sp., Pseudomonas sp. Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông vải lên 10 – 20 % [21]. El–Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố ñịnh nitơ Azospirillum và phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì. Kết quả cho thấy hàm lượng nitơ trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37 – 53 %; hàm lượng photpho trong thân tăng 48,6 %; hàm lượng kali tăng
10 – 14,3 % so với ñối chứng không xử lý. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý ñơn chủng [18]. Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng A. lipoferum cho ngô. Kết quả cho thấy khi sử dụng chủng này ñã làm giảm 50 % lượng nitơ cho cây mà năng suất vẫn ñảm bảo. 1.6. Nghiên cứu trong nước Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng công nghệ sinh học vào nông nghiệp, trong những năm gần ñây Việt Nam có khá nhiều nghiên cứu về Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh học [5]. Phạm Bích Hiên và cộng sự (2003) ñã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter của Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố ñịnh nitơ chúng còn có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA. Nhiệt ñộ thích hợp của các chủng này là 25 – 30oC, pH thích nghi rộng từ 5,5 – 8,0 [8]. Phạm Ngọc Lan (1999) ñã phân lập ñược 37 chủng Azotobacter trên ñất gò ñồi vùng Thừa Thiên- Huế. Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn ñược hai chủng có khả năng kháng sinh, tồn tại ñược ở pH kiềm (pH=8). Kết quả thử nghiệm gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm ñã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng nitơ trong lá cũng cao hơn so với ñối chứng [12]. Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố ñịnh nitơ tự do Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter, Pseudomonas aeruginosa. Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh trưởng chiều cao mạ 7,47 – 16,93 %, và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85 % [2]. Vũ Thúy Nga và Nguyễn Ngọc Quyên (2003) nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA và phân giải phosphate khó tan của vi khuẩn Bradyrhizobium. Kết quả