Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ bằng kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:69

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nội dung của nghiên cứu là sử dụng phương pháp PCR-DGGE và tạo dòng để xác định cộng đồng vi khuẩn trong rơm trước và sau ủ. Nhằm phân tích đánh giá khả năng biến động đa dạng vi khuẩn có trong nguồn rơm ủ dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử. Tạo nền tảng cho việc phân lập, tuyển chọn những loài vi khuẩn như chịu nhiệt, sinh cellulase và các định hướng nghiên cứu ứng dụng cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học trong tương lai.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân hủy rơm rạ bằng kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS HOÀNG QUỐC KHÁNH Thành phố Hồ Chí Minh- 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những thông tin đƣợc viết trong luận văn này là do tôi thực hiện và sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts Hoàng Quốc Khánh. Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng, cùng với các thông tin nghiên cứu khác đƣợc trích dẫn rõ ràng, cụ thể trong luận văn. Nội dung trong đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ bất cứ Hội đồng khoa học bảo vệ luận văn Thạc sĩ nào và chƣa đƣợc công bố. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan trên. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019 Ngƣời cam đoan Ngô Đức Duy i
LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành nhờ vào sự hƣớng dẫn nhiệt tình của Ts Hoàng Quốc Khánh và tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Thầy. Cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi nhất hoàn thành khóa học, Thầy cô Giảng viên và Học Viện Khoa học và Công nghệ. Cảm ơn Gs Yasuo Igarashi, Gs Masahura Ishii của Trƣờng GSALS (The Graduate School of Agricultural and Life Sciences), Đại học Tokyo Nhật Bản, đã hỗ trợ kỹ thuật và tài chính cho nghiên cứu này thuộc dự án “Kết hợp bền vững nền nông nghiệp địa phƣơng với công nghiệp chế biến biomass” của JICA (Japan International Cooperation Agency), JST (Japan Science and Technology Agency) và Đại học Bách Khoa TP.HCM. Lời cảm ơn những Anh Chị đồng nghiệp; Ts Kouji Yoshida, Ts Mannix Pedro, Makoto Ato, Chihaya Yamada, Đào Thị Thu Hiền, Hoàng Ngọc Phƣơng Thảo, Nguyễn Hoàng An, Nguyễn Ngọc Liên, Ts Nguyễn Hoàng Dũng và các Em trong phòng Vi sinh đã hỗ trợ nhiều trong nghiên cứu. Với những chia sẽ vui buồn từ các bạn Học viên Cao học là động lực cho tôi hoàn thành luận văn. Đặc biệt gửi lời cảm ơn tới Mẹ Cha, vợ Trần Thị Hồng Vân, con Ngô Đức Anh, Ngô Đức Dũng rất nhiều và Anh Chị trong Gia đình đã luôn ủng hộ tôi trong mọi điều kiện. Ngô Đức Duy ii
LỜI NÓI ĐẦU Hiện nay định danh chủng vi sinh không còn nhiều khó khăn nhƣ trƣớc, vì sự phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với những phƣơng pháp đa dạng và độ chính xác cao. Phần lớn định loại loài trƣớc đây luôn dựa vào quá trình phân lập thuần chủng hoặc sàng lọc đặc tính quan trọng cho mục đích nghiên cứu. Tuy nhiên có những nghiên cứu đỏi hỏi biết rõ các thành phần loài vi sinh tồn tại trong mẫu vật, quá trình thay đổi thành phần, số lƣợng chủng loài phụ thuộc nhiều vào thành phần cơ chất, điều kiện sống và quá trình trao đổi chất. Trong tự nhiên vi sinh vật rất đa dạng, mức độ thay đổi theo điều kiện môi trƣờng, phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh thông qua việc xác định gene trƣớc tiên dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử. Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã và đang đƣợc sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực nghiên cứu về gene của công nghệ sinh học, trong đó có kỹ thuật phân tích PCR-DGGE cơ bản tách độc lập riêng biệt mỗi trình tự gene với độ chuẩn xác khác biệt 1 nuclotide. Chính vì vậy mà có thể sử dụng kỹ thuật DGGE xác định cộng đồng vi khuẩn trong mẫu mà không cần giai đoạn phân lập làm thuần chủng, bên cạnh đó có thể kết hợp với kỹ thuật Tạo dòng trong nghiên cứu sẽ giúp hiệu suất nghiên cứu cao hơn và tăng tính ứng dụng đa dạng phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân tích cộng đồng vi sinh vật. Mục tiêu nội dung của nghiên cứu là sử dụng phƣơng pháp PCR- DGGE và tạo dòng để xác định cộng đồng vi khuẩn trong rơm trƣớc và sau ủ. Nhằm phân tích đánh giá khả năng biến động đa dạng vi khuẩn có trong nguồn rơm ủ dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử . Tạo nền tảng cho việc phân lập, tuyển chọn những loài vi khuẩn nhƣ chịu nhiệt, sinh cellulase và các định hƣớng nghiên cứu ứng dụng cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học trong tƣơng lai. iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT APS: Ammonium Persulfate BA: Bis-Acrylamine bp: base pairs CTAB: Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide DFB: Diffusion buffer DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DNA: Deoxylribonucleic acid dNTPs: Deoxyrinonucleotide triphosphates EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid PCR: Polymerase Chain Reaction PFGE: Pulse Field Gel Electrophoresis RAPD: Random amplified polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms RNA: Ribonucleic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate TAE: Tris Acetic TEMED: Tetramethyl ethylene diamine UF: Urea Formamide UV: Ultra violet iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới. .............................. 1 Bảng 1.2. Thành phần cấu tạo chung của rơm rạ. ............................................. 4 Bảng 1.3. Thành phần hóa học chính của rơm rạ. ............................................ 4 Bảng 1.4. Số liệu thống kê sản lƣợng gạo và rơm rạ trên thế giới. .................. 7 Bảng 1.5. Phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt xác định một số bệnh trên lúa mì. .............................................................................................................. 17 Bảng 2.1. Các cặp mồi cho vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu. ................... 23 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR . ........................................................... 27 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR. ...................................................... 27 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR vùng gene V3. .................................... 28 Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gene V3. ........................................... 29 Bảng 2.6. Chuẩn bị cách pha nồng độ bảng gel polyacrylamine. ................... 30 Bảng 2.7. Tỷ lệ phối trộn nồng độ gel polyacrylamide vào hai xilanh........... 31 Bảng 2.8: Thành phần Big – dye PCR ............................................................ 35 v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1.Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Việt Nam……….3 Hình 1.2. Qui trình phân giải cellulose thành glucose. ................................... 10 Hình 2.1. Một số hình ảnh thu nhận lấy mẫu rơm. ......................................... 22 Hình 2.2. Qui trình thực hiện trong nghiên cứu. ............................................. 25 Hình 2.3. Qui trình ly trích và thu nhận DNA từ mẫu rơm. ........................... 26 Hình 2.4. Qui trình thu nhận gene V3 từ gel polyacrylamdie......................... 33 Hình 2.5. Cấu trúc pGEM@-T Easy vector của hãng Omega. ........................ 34 Hình 3.1. Biểu đồ thay đổi nhiệt độ trong qúa trình ủ rơm............................. 38 Hình 3.2. Kết quả ly trích thu nhận DNA bộ gene vi sinh trong mẫu R. ....... 39 Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu R. ........ 40 Hình 3.4. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu R. ...................................... 41 Hình 3.5. Kết quả sản phẩm PCR và DGGE đoạn gene V3 của mẫu Rn. ...... 43 Hình 3.6. Kết quả thu nhận sản phẩm tạo dòng. . ........................................... 44 Hình 3.7. Kết quả 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 . ..................................... 45 Hình 3.8. Kết quả 30 sản phẩm DGGE chạy trên hệ thống BioRad .............. 46 Hình 3.9. Cây phát sinh loài vi khuẩn trong mẫu Rn. .................................... 47 Hình 3.10. Thử khả năng sinh cellulase trên đĩa CMC của mẫu Rn. ............. 48 vi
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii LỜI NÓI ĐẦU ................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ....................................................... vi MỤC LỤC ...................................................................................................... vii CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 1 1.RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ .............. 1 1.1. Rơm rạ ............................................................................................... 1 1.2. Thành phần cấu tạo rơm rạ ................................................................ 3 1.3. Giá trị kinh tế của rơm rạ .................................................................. 6 1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM 9 1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose ........................... 9 1.2.2. Hệ vi sinh phân giải cellulose ........................................................... 11 1.3.KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH LOÀI VI SINH ............... 12 1.3.1. Các phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA vi sinh vật................... 12 1.3.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh ................................ 14 1.3.2.1. Kỹ thuật PCR trong trong định danh vi khuẩn........................................................ 16 1.3.2.2. Kỹ thuật PCR-DGGE trong định danh vi khuẩn ..................................................... 18 1.3.2.3. Kỹ thuật tạo dòng .................................................................................................... 20 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 21 2.1.VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................... 22 Hóa chất....................................................................................................... 23 Thiết bị và dụng cụ...................................................................................... 24 2.2.CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 24 vii
2.2.1.Phƣơng pháp ly trích và thu nhận DNA ............................................ 26 2.2.2. Phƣơng pháp PCR nhân bản gene 16S rDNA và vùng gene V3 ...... 27 2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm gene V3 ....................................... 29 2.2.4. Phƣơng pháp thực hiện kỹ thuật DGGE ........................................... 30 2.2.4.1. Qui trình chuẩn bị gel polyacrylamine và thực hiện DGGE ................................... 30 2.2.4.2. Quy trình thu nhận sản phẩm DGGE từ gel polyacrylamide .................................. 32 2.2.4.3. PCR gene V3 sau khi thu nhận từ DGGE với cặp mồi 357F và 517R .................... 33 2.2.5. Phƣơng pháp tạo dòng ...................................................................... 34 2.2.6. Giải trình tự gene V3 và xây dựng cây phát sinh loài ...................... 35 2.3. Khảo sát sinh cellulase phƣơng pháp đĩa CMC ................................... 36 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 38 3.1. Kết quả kiểm tra nhiệt độ ..................................................................... 38 3.2. Kết quả thu nhận DNA genome của vi sinh vật trong mẫu rơm ......... 39 3.3. Kết quả thu nhận gene 16S rDNA và gene V3 của mẫu R .................. 40 3.4. Kết quả phân tích dữ liệu cộng đồng vi khuẩn của mẫu R .................. 41 3.5. Kết quả DNA, gene 16S rDNA và gene V3 mẫu Rn........................... 42 3.6. Kết quả tạo dòng trên vector pGEM@-T Easy của hãng Promega ...... 43 3.7. Kết quả thu nhận vùng gene V3 sau khi đã tạo dòng .......................... 44 3.8. Kết quả kiểm tra gene V3 sau khi tạo dòng bằng kỹ thuật DGGE ...... 45 3.9. Kết quả sơ bộ định tính enzyme cellulase trong mẫu Rn .................... 48 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 50 4.1. Kết luận ................................................................................................ 50 4.2. Kiến nghị .............................................................................................. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 51 viii
1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. RƠM RẠ, THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ 1.1. Rơm rạ Theo thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng của Liên Hợp Quốc (FAO- Food and Agriculture Organization) [1], sản xuất lúa gạo trên thế giới chạm mức kỷ lục 759,6 triệu tấn lúa (503,9 triệu tấn gạo) trong năm 2017 và năm 2018 tiếp tục tăng sản lƣợng thêm 10,3 triệu tấn lên mức cao mới 769,9 triệu tấn lúa (510,6 triệu tấn gạo). Dự báo sản lƣợng sẽ tăng trƣởng 1,4% trong năm 2019, khu vực sản xuất lúa gạo tập trung ở Châu Á là chính, trong đó 2 vùng sản xuất lớn là Nam Á và Đông Nam Á với mức tăng sản lƣợng tuyệt đối lớn nhất đƣợc dự đoán sẽ là Ấn Độ, sản xuất tăng đáng kể ở các nƣớc nhƣ Bangladesh, Sri Lanka, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Philippines và Thái Lan, Việt Nam xem bảng 1.1. Tƣơng ứng với việc tăng trƣởng sản xuất lúa gạo hàng năm thì sản lƣợng rơm rạ đƣợc thải ra ngoài đồng ruộng trên toàn cầu cực kỳ lớn, nhƣng tới nay chƣa có thống kê chính xác về lƣợng rơm rạ thải ra sau thu hoạch lúa, vì tùy thuộc vào văn hóa bản địa, loại giống lúa trồng trọt, vùng canh tác và điều kiện thổ nhƣỡng. Nhƣng tổng thể ƣớc lƣợng trung bình sản xuất ra 1 tấn gạo thì sẽ thải ra khoảng 1,5 tấn rơm rạ. Bảng 1.1. Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất trên Thế giới. Khu vực/Quốc gia Số lƣợng gạo Khu vực/Quốc gia Số lƣợng gạo (triệu tấn) (triệu tấn) Thế giới 758.9 Châu Phi 30.7 Châu á 686.4 Ai Cặp 6.2 Trung Quốc 210.1 Nigeria 5.3 Ấn Độ 165.3 Madagascar 3.5 Indonesia 74.2 Tanzania 3.1 Bangladesh 53.1 Mali 2.8 Việt Nam 44 Guinea 2.2 Thai Lan 33.3 Nam Mỹ 24.9
2 Myanmar 28.3 Brazil 11.9 Philippines 18.6 Colombia 2.6 Nhật Bản 10.7 Peru 3.1 Pakistan 10.3 Bắc Mỹ 9.1 Camphuchia 9.7 Mỹ 9.1 Triều Tiên 5.5 Trung Mỹ 2.9 Nepal 5.4 Châu Âu 4.1 Lào 4 Nga 1.1 Malaysia 3.1 Úc 0.9 Sri Lanka 3 Việt Nam đã trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu gạo đứng đầu trên thế giới hiện nay, tốc dộ tăng trƣởng sản xuất lúa gạo từ những năm 2012 đạt sản lƣợng 43,7 triệu tấn lúa. Đến năm 2018, sản lƣơng tăng lên khoảng 55 triệu tấn, xuất khẩu gạo đạt 6,1 triệu tấn, nâng giá trị 3,06 tỷ USD. Theo dữ liệu thống kê những năm gần đây của Bộ Nông nghiệp Phát Triển Nông thôn Việt Nam, vụ mùa 2015/16 đạt 44,13 triệu tấn lúa, vụ mùa 2016/17 đạt 44,52 triệu tấn và vụ mùa 2017/18 đạt đƣợc 44,96 triệu tấn. Dự kiến năm 2019 diện tích trồng lúa trên cả nƣớc là 7,53 triệu ha, sản lƣợng gạo dự kiến tƣơng đƣơng năm 2018. Bên cạnh đó thống kê của tổ chức GAIN (Global Agriculture Information Network) của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ về diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Viêt Nam từ năm 1993 đến 2017 tăng trƣởng liên tục cả về diện tích và năng suất xem hình 1.1. Những nỗ lực đem lại lợi ích từ sản xuất lúa gạo ngày càng gia tăng và tăng thu nhập cho nông dân, nhƣng song song với đó là lƣợng rơm rạ thải ra hàng năm ở nƣớc ta trung bình khoảng 55 triệu tấn. Đây cũng là một thách thức cho việc xử lý giảm thiểu ô nhiễm rơm, bên cạnh đó tận dụng nguồn tài nguyên phế phụ phẩm nông nghiệp ở nƣớc ta. Trong 55 triệu tấn Rơm thải ra hàng năm có khoảng 20% đƣợc sử dụng cho gia sức gia cầm, trồng nấm rơm, phân ủ, còn lại là đốt hoặc bỏ lại trên đồng ruộng gây ô nhiễm môi trƣờng đồng ruộng và lãng phí nguồn tài nguyên tái sinh dồi dào.
3 Hình 1.1. Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lƣợng gạo Việt Nam Vấn đề đặt ra làm nhƣ thế nào và làm sao để tận dụng nguồn tài nguyên tái tạo và dồi dào nhƣ rơm rạ. Để đạt hiệu quả cao thì trƣớc tiên sẽ phân tích phân tích về thành phần cấu tạo và dinh dƣỡng trong rơm. 1.2. Thành phần cấu tạo Rơm Thành phần cellulose, lignocellulose và lignin là nguồn sinh khối chính của tế bào thực vật nói chung và rơm rạ nói riêng. Rơm là nguồn nguyên liệu đƣợc tái sinh trong tự nhiên, các thành phần cấu tạo rơm có sự thay đổi dựa vào sự phát triển trong các chủng loại lúa, điều kiện thổ nhƣỡng canh tác khác nhau, các yếu tố môi trƣờng khắc nghiệt, côn trùng và mầm bệnh. Thành phần hóa học của rơm tính theo khối lƣợng khô gồm cellulose 60%, lignin 14%, đạm hữu cơ (protein) 3%, chất béo (lipid) 2%. Nếu tính theo nguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hydro (H) 5%, oxygen (O) 49%, nitơ (N) khoảng 0,92%, một lƣợng rất nhỏ photpho (P), lƣu huỳnh (S) và kali (K). Theo kết quả phân tích thành phần đƣờng cơ bản chính trong rơm bao
4 gồm hexose (glucose, galactose, mannose), pentose (xyloza, arabinose), lignin (cả axit hòa tan và không hòa tan), tro, silica. Ngoài ra còn có các thành phần phi cấu trúc chủ yếu bao gồm protein (khoảng 3%) và pectin (khoảng 2,8%) cùng với một lƣợng nhỏ đƣờng tự do, diệp lục, chất béo, dầu và sáp đƣợc nêu trong bảng Bảng 1.2 và 1.3 [2, 3, 4, 5] . Bảng 1.2. Thành phần cấu tạo chung của rơm rạ. Thành phần Hàm lƣợng (w/w%) Glucose 34.0 - 43.7 Xylose 19.0 - 22.0 Arabinose 2.0 - 3.6 Mannose 1.8 -2.0 Galactose 0.4 Acid soluble lignin 2.2 - 6.0 Acid insoluble lignin 13.0 - 22.7 Ash and silica 7.8 - 20.3 Extractive (i.e., protein, pectin,) 16.1- 19.3 other nonstructural components) Bảng 1.3. Thành phần hóa học chính của Rơm. Thành phần Đơn vị tính Hàm lƣợng Carbon wt% 47.92 Hydrogen wt% 6.54 Nitrogen wt% 0.53 Sulphur wt% 0.09 Oxygen wt% 44.80 Tổng wt% 100.00 Thành phần hóa học Nguyên tố halogen Chlorine (Cl) mg/kg 1,109.4 Bromine (Br) mg/kg 0.0 Fluorine (F) mg/kg 0.0 Nguyên tố chính Aluminium (Al) mg/kg (dry) 143.0 Potassium (K) mg/kg (dry) 8,668.0 Sodium (Na) mg/kg (dry) 162.0 Calcium (Ca) mg/kg (dry) 3,899.0
5 Silicon (Si) mg/kg (dry) 6,734.0 Magnesium (Mg) mg/kg (dry) 571.0 Iron (Fe) mg/kg (dry) 100.0 Phosphorus (P) mg/kg (dry) 558.0 Titanium (Ti) mg/kg (dry) 3.6 Nguyên tố phụ Cadmium (Cd) mg/kg (dry) 0.0 Cobalt (Co) mg/kg (dry) 15.0 Chromium (Cr) mg/kg (dry) 1.7 Copper (Cu) mg/kg (dry) 3.0 Manganese (Mn) mg/kg (dry) 17.0 Nickel (Ni) mg/kg (dry) 1.5 Lead (Pb) mg/kg (dry) 1.0 Vanadium (V) mg/kg (dry) 0.3 Zinc (Zn) mg/kg (dry) 6.6 Barium (Ba) mg/kg (dry) 22.5 Nguyên tố khác Strontium (Sr) mg/kg (dry) 26.0 Boron (B) mg/kg (dry) 2.7 Tungsten (W) mg/kg (dry) 13.0 Những kết quả đã phân tích cho thấy rằng thành phần chất xơ trong rơm rạ chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin. Cellulose gồm nhiều chuỗi thẳng ghép nhau thành bó dài nhờ mạch nối hydrogen tạo cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharide gọi là cellobiose, có cấu tạo từ hai phân tử D-glucose. Các đơn vị D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 và đƣợc giữ chặt bởi liên kết hydro liên chuỗi và liên chuỗi mạnh để tạo thành các vi sợi. Chúng cung cấp độ bền cơ học cho thành tế bào thực vật và có thể dài vài µm trong rơm và đƣờng kính khoảng 12-35nm [6, 7]. Các công bố cho thấy mức độ trùng hợp D-glucose của rơm rạ cao hơn một chút so với dƣ lƣợng nông nghiệp khác nhƣ rơm lúa mì và bã mía nhƣng nó thấp hơn đáng kể so với gỗ cứng và gỗ mềm [8]. Hemicellulose là những heteropolysaccharide cùng với cellulose có ở màng tế bào thực vật, không hòa tan đƣợc trong nƣớc nhƣng hòa tan đƣợc trong dung dịch kiềm và bị thủy phân bởi acid dễ dàng hơn so với cellulose.
6 Hemicellulose liên kết một phần với lignin bởi các liên kết cộng hóa trị, trong khi đó mối liên kết giữa hemicelluloses và cellulose là thông qua liên kết hydro. Trong dạ cỏ loài động vật nhai lại có những vi khuẩn đặc biệt chứa enzyme cellulase phân giải đƣợc cellulose. Cellulose và hemicellulose là những hợp chất có thể tiêu hóa đƣợc.Nhƣng cấu tạo cellulose trong của vách tế bào rơm rạ qua nhiều liên kết và cấu trúc không gian phức tạp, nên enzyme của hệ vi sinh vật không dễ dàng tác động đƣợc. Lớp ngoài thành tế bào đƣợc tạo thành chủ yếu từ các phức chất lignohemicellulose mà các enzyme vi sinh dạ cỏ phân giải chậm làm cản trở những lớp cellulose bị tác động của hệ enzyme vi sinh vật. Để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa của rơm rạ và các chất xơ khác, các nhà nghiên cứu đã tiến hành xử lý rơm bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ: lý học, hóa học, vi sinh vật [9, 10]. Thành phần thứ ba đáng chú ý trong xơ là lignin, lignin luôn đi kèm với cellulose và hemicellulose trong thành phần tế bào, không hòa tan trong nƣớc, trong các dung môi hữu cơ bình thƣờng và rất bền vững bởi enzyme của hệ sinh vật dạ cỏ. Nhƣng dƣới tác dụng của kiềm thì lignin một phần bị phân giải và chuyển vào dung dịch. Lignin là polymer có nhiều thứ hai trên trái đất sau cellulose, lignin chủ yếu bao gồm ba loại cấu trúc chủ yếu là monolignols, hydroxycinnamyl (p- coumaryl, coniferyl và rƣợu sinapyl) liên kết với nhau bằng các loại liên kết ether và carbon-carbon khác nhau nhƣ β-O-4, 4-O- 5, -, β- 1 và β- 5 để tạo ra các đơn vị phenylpropanoid nhƣ p - hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) và syringyl (S). Trong số này, liên kết β-O-4 là liên kết ether chiếm ƣu thế nhất (khoảng 40 - 60%) trong rơm rạ. Lignin đƣợc gắn vào carbohydrate bởi este benzyl, ete benzen và phenyl glycoside. Do các mối liên kết hóa học và liên kết vật lý chặt chẽ này, rất khó để loại bỏ lignin ở dạng nguyên sinh của nó [11]. 1.3. Giá trị kinh tế của rơm rạ Thành phần đã phân tích ở trên cho thấy nguồn giá trị từ rơm chƣa đƣợc quan tâm đúng mức trong thời gian dài, phần lớn rơm rạ thƣờng để mục, tự phân hủy ở ngoài đồng ruộng hay đốt tại chỗ để trả lại khoáng chất cho ruộng, phần còn lại đƣợc đem về làm thức ăn cho gia súc, phục vụ đun nấu
7 trong gia đình hay trồng nấm rơm. Hơn 20% rơm đƣợc sử dụng trong khi khoảng 50% rơm bị đốt cháy hoặc để lại trên đồng ruộng, họ sẵn sàng cho vụ mùa tiếp theo. Đốt rơm không những ảnh hƣởng khí nhà kính mà còn ô nhiễm độc hại đã đƣợc báo cáo mà còn góp phần đến hen suyễn và các rối loạn hô hấp khác ở trẻ nhỏ và ngƣời già [12, 13]. Do đó, cần phải phát triển các giải pháp nghiên cứu mới nhằm tận dụng rơm để nông dân nhận đƣợc lợi nhuận cao hơn cho việc thu gom từ ruộng và kềm chế đốt rơm gây thêm ô nhiễm môi trƣờng. Năm 2009, dữ liệu báo cáo của Tổ chức Nông Lƣơng của Liên Hợp Quốc lúa đƣợc trồng chủ yếu ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, tuy nhiên một số ít sản xuất lúa ở vùng khí hậu Địa Trung Hải. Khu vực sản xuất lúa gạo tập trung ở Châu Á là chính, trong đó 2 vùng sản xuất lớn là Nam Á và Đông Nam Á. Đối với lúa mì, các nhà sản xuất chính đƣợc đặt tại Nam Á, Đông Âu, Bắc Mỹ và Đông và Trung Á. Đối với Liên minh châu Âu, lúa mì là loại cây trồng chiếm ƣu thế hơn so với trồng lúa gạo.Thống kê sản lƣợng lúa gạo và sản lƣợng rơm đƣợc tạo ta trên toàn thế giới nêu trong bảng 1.4. Bảng 1.4. Số liệu thống kê sản lƣợng gạo và rơm rạ trên thế giới (FAO). Diện tích(ha) Gạo (tấn) Rơm rạ (tấn) Thế giới 158,511 684,595 727,400 Nam Á 59,449 202,889 215,600 Đông Nam Á 48,203 197,777 210,100 Tây Á 32,999 216,630 230,200 Đông Á 5,114 10,392 11,000 Nam Mỹ 5,253 25,568 27,200 Đông Phi 3,147 6,701 7,100 Trung Phi 691 663 700 Bắc Phi 590 5,593 6,000 462 3,152 3,350 Liên Minh Châu
8 Âu Caribbean 456 1,246 1,300 Nam Âu 418 2,906 3,100 Trung Mỹ 326 1,228 1,300 Đông Âu 225 1,183 1,250 Trung Á 193 696 740 Tây Á 153 927 990 Tây Âu 24 138 150 Châu Đại Dƣơng 14 82 90 Nam Phi 1 3 3 Lƣợng lớn rơm hàng năm trên toàn cầu xem nhƣ là nguồn nhiên liệu vô cùng lớn. Nhiều khía cạnh phân tích đã công bố về thành phần rơm đã cho thấy những giá trị kinh tế nguồn phụ phẩm nông nghiệp đem lại rất lớn và đa dạng để sản xuất dầu sinh học, than sinh học và khí sinh học từ rơm rạ. Dầu sinh học rơm rạ đã đƣợc báo cáo bao gồm một số thành phần phụ nhƣ ketone, aldehyd, axit carboxylic, phenol, furfural và levoglucosan, ngoài ra than sinh học đƣợc sản xuất từ rơm tạo độ phì của đất, tăng lƣu trữ carbon và giảm phát thải khí nhà kính. Năng suất, chất dinh dƣỡng, hàm lƣợng chất dễ bay hơi, khả năng trao đổi ion dƣơng, kali và phốtpho có sẵn hàm lƣợng than sinh học giảm khi tăng nhiệt độ nhiệt phân, độ kềm và hàm lƣợng chất thơm. Than sinh học có nguồn gốc từ rơm cho thấy khả năng hấp thụ ion Cu (II) và cyromazine, một loại thuốc trừ sâu hữu cơ [14, 15, 16]. Quá trình khí hóa rơm rạ để xử lý chất thải gần đây đã thu hút đƣợc sự quan tâm để sản xuất khí Hydro và Metan. Rơm cũng đƣợc sử dụng làm nhiên liệu cho nồi hơi để sản xuất điện và phân tích kinh tế kỹ thuật cho thấy rằng đó là một lựa chọn khả thi để tạo ra điện nông thôn dựa trên lƣới điện nhỏ ở vùng sâu vùng xa và các Quốc gia đang phát triển. Khi mà vấn đề biến đổi khí hậu toàn cầu trở nên nóng bỏng thì việc sử dụng khối lƣợng lớn rơm cho hợp lí là điều mà các nhà khoa học đang quan
9 tâm đến, trong đó các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc tận dụng nguồn nhiên liệu cellulose trong rơm để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học (biofuels) cho tƣơng lai nhằm thay thế nguồn tài nguyên dầu mỏ ngày cạng kiệt. Trong thành phần chính của rơm chủ yếu vẫn là cellulose và sản phẩm phân giải cuối cùng có giá trị là D-glucose, cho nên việc phân giải và thu nhân sản phẩm glucose làm nguồn nguyên liệu khác đã đƣợc quan trong nhiều nghiên cứu. Trong đó có phƣơng pháp hóa học là phân hủy và thu nhận cellulose mà còn phƣơng pháp sinh học là sử dụng sự phân giải tự nhiên của hệ enzyme đƣợc sinh ra từ hệ vi sinh vật đƣợc quan tâm nhiều hơn. 1.2. HỆ ENZYME CELLULASE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI RƠM RẠ 1.2.1. Hệ Enzyme cellulase và cơ chế phân giải cellulose Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật trong điều kiện yếm khí và hiếu khí trong thời gian dài và sản phẩm phân giải cuối cùng là glucose. Quá trình này diễn ra do nhiều nhóm vi sinh vật sinh tổng hợp các loại enzyme có trong phức hệ enzyme cellulase phân giải cellulose. Chính vì thế, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thƣờng rất chậm và không triệt để. Sự tham gia enzyme phân hủy cellulose đƣợc các nhà khoa học chia ra làm ba nhóm chủ yếu nhƣ sau [17, 18]. 1,4 β-D-Glucan cellobiohydrolase: enzyme cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có một loạt tên khác nhƣ: cellobiosehydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng. 1,4β-D-glucan 4 glucanohydrolase: enzyme này tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin và β-Dglucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose.Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh.
10 Enzyme này còn có tên khác nhƣ: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase và C- cellulase. β-D-glucoside glucohydrolase: enzyme này tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose. Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là cellobiase và β-glucosidase. Sự thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme exoglucanase, endoglucanase, β-glucosidase. Trong những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đƣa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay nhau thủy phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose xem hình 1.2. Hình 1.2. Qui trình phân giải cellulose thành glucose. Phân giải cellulose cơ bản là quá trình sinh học đƣợc tạo ra và kiểm soát bởi các enzyme cellulase. Cellulase là enzyme đa dạng với chức năng xúc tác cho một phản ứng đơn, nó đóng vai trò trong phản ứng thủy phân cầu