Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Bùi Thị Liên

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGÀNH: SINH HỌC

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC

TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ

(Taxus chinensis)

Hà Nội – 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Bùi Thị Liên

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG SINH VÀ GÂY ĐỘC

TẾ BÀO CỦA VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ

(Taxus chinensis)

Sinh học thực nghiệm

Chuyên ngành: Mã số: 842 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGÀNH: SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Phí Quyết Tiến

Hà Nội – 2021

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)” là do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Phí Quyết Tiến. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn chính xác, trung thực. Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này!

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Học viên

Bùi Thị Liên

ii

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Phí Quyết Tiến – Phó Viện Trưởng Viện Công nghệ sinh học; Giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, lên ý tưởng, định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Vũ Thị Hạnh Nguyên, TS. Quách Ngọc Tùng và các cán bộ Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em thực hiện các thí nghiệm trong phạm vi luận án và đồng thời truyền đạt nhiều kinh nghiệm thực tiễn quý giá trong hoạt động nghiên cứu khoa học ở lĩnh vực vi sinh vật học.

Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, các thầy, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học và Phòng Đào tạo, Quản lý Khoa học và Hợp tác quốc tế của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện, hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện.

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, là

hậu phương vững chắc giúp em có động lực học tập.

Luận văn được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: “Nghiên cứu khai thác nấm nội sinh trên cây dược liệu bản địa nhằm thu nhận một số hợp chất (paclitaxel hoặc một số hợp chất khác) có hoạt tính sinh học" cấp bởi Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số TĐCNSH.05/20- 22.

iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

Ung thư phổi ở người (human lung carcinoma) A-549

baccatin III:3-amino-3 phenylpropanoyltransferase bapt

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

Base pair bp

Virus cytomegalo CMV

taxane 10b-hydroxylase dbat

DMSO Dimethyl sulfoxide

Deoxyribonucleic Acid DNA

Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ FDA

Horizontal gene transfer – Chuyển gen ngang HGT

Nồng độ ức chế 50% IC50

Internal transcribed spacer ITS

kiloDalton kDa

Ung thư vú ở người (human breast carcinoma) MCF7

Minimun inhibitory concentrations – Nồng độ ức chế tối thiểu MIC

National Center for Biotechnology Information NCBI

Optical Density – Mật độ quang OD

Polymerase chain reaction PCR

SRB Sulforhodamine B

TCA Trichloracetic acid

TLTK Tài liệu tham khảo

ts taxadiene synthase

VSV Vi sinh vật

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi nấm

nội sinh trên thực vật ......................................................................................... 7

Bảng 2.1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu........................ 20

Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch

đại các gen dbat, bapt và ts ............................................................................. 24

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch

đại các gen dbat, bapt và ts ............................................................................. 24

Bảng 3.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư của 5 chủng vi nấm nội

sinh trên cây thông đỏ Bắc .............................................................................. 30

Bảng 3.2. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF6 với

các chủng tham chiếu ...................................................................................... 41

Bảng 3.3. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF25 với

các chủng tham chiếu ...................................................................................... 42

Bảng 3.4. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF6 với

các chủng tham chiếu ...................................................................................... 43

Bảng 3.5. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF7 với

các chủng tham chiếu ...................................................................................... 44

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Mối quan hệ giữa vi vật nội sinh và cây chủ .................................... 4

Hình 1.2. Một số các chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh ........................... 8

Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất kháng virus từ vi nấm nội sinh .............. 10

Hình 1.4. Cây thông đỏ bắc (Taxus chinensis) ............................................... 12

Hình 1.5. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel ............................................... 16

Hình 3.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A) và MRSE ATCC 35984 (B) của một số chủng vi nấm nội sinh ..................................... 27

Hình 3.2. Tỉ lệ ức chế của các chủng vi nấm nội sinh trên từng cùng VSV kiểm định................................................................................................ 28

Hình 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ. Ghi chú: 1. E. coli ATCC 11105; 2. C. albicans ATCC 10231; 3. B. cereus ATCC 11778; 4. MRSE ATCC 35984; 5. P. aeruginosa ATCC 9027; 6. MRSA ATCC 33591; 7. E. faecalis ATCC 29212. .................................................................................... 29

Hình 3.4. Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn ............................................................................................... 32

Hình 3.5. Điên di DNA tổng số của các chủng vi nấm tuyển chọn trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 1 kb (Thermo scientific, Mỹ). ................................................................................................................. 34

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen tham gia sinh tổng hợp paclitaxel của 4 chủng tuyển chọn trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm. .................................................................................................. 35

Hình 3.7. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TQF6 (a, b, c) và TQF25 (d, e, f) .............................................................................. 38

Hình 3.8. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TDF6 (a, b, c) và TDF7 (d, e, f) ................................................................................ 38

vi

Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm ....................................................................................... 39

Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại của các chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 với giá trị Boostrap 1000, sử dụng thuật toán Kimuar 2 với nhóm ngoài là Murco bainieri (NR 103628). ........................................... 45

vii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iii

DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... iv

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... v

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3

1.1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU .............................. 3

1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh ...................................................... 3

1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh 5

1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm ................................... 5

1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư ............................................ 8

1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus .............................................................. 9

1.2.1. Cây thông đỏ (Taxus spp.) ......................................................... 11

1.2.3. Các chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ ............................................................................ 15

1.2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong sàng lọc vi nấm nội sinh sinh paclitaxel và dẫn xuất của paclitaxel .................................................... 16

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI SINH ............................................................................................................ 17

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 19

2.1. ĐỐI TƯỢNG ....................................................................................... 19

2.1.1. Chủng giống .................................................................................. 19

2.1.2. Hóa chất, thiết bị ........................................................................... 19

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 20

2.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ....................... 20

2.2.2. Tách chiết các hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh ......... 21

viii

2.2.3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư ................................ 21

2.2.4. Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng tuyển chọn ............................................................................................... 23

2.2.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thông qua sàng các gen chỉ thị ................................................................................................ 23

2.2.6. Xác định đặc điểm hình thái và bào tử của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn ................................................................................. 24

2.2.7. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự vùng ITS .............................................................. 25

2.2.8. Xử lý thống kê số liệu ................................................................... 26

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 27

3.1. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ ............................................ 27

3.2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH ......................................................... 29

3.3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH CHIẾT THÔ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ........................................... 31

3.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ............................. 33

3.5. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 ....................................... 37

3.5.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và cuống sinh bào tử của các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn ............. 37

3.5.2. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự ITS ............................................................................ 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 47

KẾT LUẬN .................................................................................................. 47

KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 48

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 56

1

MỞ ĐẦU

Trong những thập kỷ qua, cây dược liệu luôn đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ và nâng cao sức khoẻ con người. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò của các hợp chất tách chiết từ cây dược liệu trong phòng và điều trị bệnh truyền nhiễm do vi sinh vật, kích thích hệ thống miễn dịch và ngăn ngừa ung thư. Tuy nhiên, vấn đề kháng thuốc kháng sinh và nạn chặt phá rừng bừa bãi đang là vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ con người và đa dạng sinh học của quốc gia. Do đó, việc tìm kiếm các hoạt chất mới mà không cần khai thác cây dược liệu đang là hướng đi mới được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm.

camptothecin, ergoflavin, podophyllotoxin,

Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật cư trú bên trong các mô tế bào thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ. Trong các nhóm vi sinh vật nội sinh, nấm nội sinh được chú ý hơn cả và đang được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y-dược học. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học của vi nấm nội sinh như: kháng khuẩn, kháng virus, ức chế tế bào ung thư, trị tiểu đường, chống viêm,.... Nhờ khả năng chuyển gen ngang, nấm nội sinh có thể sinh tổng hợp các hoạt chất như cây chủ. Nhiều chất kháng sinh và kháng tế bào ung thư mới đã được phát hiện gần đây từ nấm nội sinh bao gồm pestacin, benzopyran, paclitaxel, isopestacin, phloroglucinol, tetrahydroxy-1-methylxanthone, salidroside, borneol, dibenzofurane, methyl peniphenone, lipopeptide, peniphenone,… Gần đây, nấm nội sinh được đánh giá là nguồn nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp dược phẩm. Hiện nay, chỉ có khoảng 0,75–1,5% các loài thực vật được nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh. Vì vậy, tiềm năng khai thác nấm nội sinh nhằm tìm kiếm các hoạt chất mới là rất triển vọng

Cây thông đỏ (Taxus chinensis), thuộc họ Thủy tùng (Taxaceae), là cây dược liệu quý được liệt vào sách đỏ của Việt Nam và thế giới. Trong y học dân gian, cây thông đỏ được sử dụng trong điều trị bệnh truyền nhiễm và hiểm nghèo. Đặc biệt, lá và vỏ cây là nguồn nguyên liệu để tách chiết paclitaxel (paclitaxel), loại thuốc điều trị ung thư buồng trứng, vú và phổi được thông qua bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ (FDA) vào năm 1992. Tuy nhiên, sản xuất chất này vẫn là một thách thức trong ngành dược phẩm vì 1 kg vỏ cây chỉ sản xuất được 10 g paclitaxel. Xuất phát từ thực

2

tiễn, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ là nguồn nguyên liệu thay thế để sản xuất paclitaxel và chất kháng sinh mới. Đã có khoảng 60 chủng vi nấm nội sinh được công bố là có khả năng sinh paclitaxel cao. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiều báo cáo đề cập đến nấm nội sinh trên cây dược liệu nói chung và cây thông đỏ nói riêng tại Việt Nam, cũng như mối tương quan giữa các nấm này với các sản phẩm chuyển hóa của cây dược liệu. Với tiềm năng và thách thức trên, đề tài

“Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (Taxus chinensis)” được thực hiện nhằm tìm kiếm chủng vi nấm nội sinh có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất kháng sinh và kháng tế bào ung thư mới nhằm tạo nguyên liệu mới với giá thành thấp cho ngành dược, ứng dụng trong điều trị lâm sàng và đồng thời bảo tồn loài thông đỏ Taxus chinensis quý hiếm.

Mục tiêu của đề tài :

Tuyển chọn và đánh giá được tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (T. chinensis).

Nội dung nghiên cứu:

- Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng ức chế vi sinh vật gây

bệnh cao.

- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm tuyển

chọn.

- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa từ cao chiết tổng của các chủng vi

nấm tuyển chọn

- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp paclitaxel của các chủng nấm bằng chỉ

thị phân tử.

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi nấm nội sinh

tuyển chọn.

3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY DƯỢC LIỆU

1.1.1. Giới thiệu về vi nấm nội sinh

Vi nấm nội sinh là nhóm vi sinh vật sinh trưởng và phát triển trong các mô tế bào thực vật mà không cạnh tranh dinh dưỡng hay gây hại tới cây chủ. Vi nấm nội sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học để bảo vệ và giúp cây chủ chống lại tác nhân gây bệnh đồng thời thúc đẩy sự phát triển của thực vật [1]. Trong 10 năm qua, các nhà khoa học đã công bố khoảng 770 loại vi nấm nội sinh trên thực vật. Trong đó, các chi nấm phổ biến có thể được kể đến như Aspergillus, Colletrotrichum, Guignardia, Nigrospora, Altenaria, Penicillium, Phomopsis, Rhizoctonia và Xylaria [2].

Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về cơ chế nội sinh của vi nấm trên thực vật. Giả thuyết về sự xâm chiếm không triệu chứng khẳng định cơ chế nội sinh là sự cân bằng đối kháng giữa vật chủ và nội sinh vật (Hình 1.1) [3]. Vi sinh vật nội sinh và gây bệnh đều mang các gen độc tính, giúp vi sinh vật xâm nhiễm cây chủ. Nếu độc tính lây nhiễm của vi nấm và khả năng bảo vệ của cây chủ cân bằng, thì quá trình nội sinh sẽ diễn ra theo và không gây tác động xấu tới cây chủ. Ở trạng thái cân bằng này, các yếu tố môi trường đóng vai trò chính. Nếu quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra quá mạnh mẽ ở cây chủ thì nấm sẽ bị tiêu diệt bởi các chất và protein bảo vệ. Ngược lại, hiện tượng cây nhiễm bệnh nấm xảy ra khi cơ chế miễn dịch bảo vệ của cây không đủ để cân bằng hay tiêu diệt độc tính từ vi nấm (Hình 1.1). Hiện tượng này thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chủ quan và khách quan như bản thân cây chủ và môi trường [4].

Tương tác giữa vi nấm và cây chủ có thể không chỉ là trạng thái cân bằng giữa các yếu tố độc tính lây nhiễm và khả năng phòng vệ, mà là tương tác cộng sinh. Vi nấm nội sinh có thể bảo vệ các cây chủ khỏi các tác nhân gây bệnh bằng việc sản sinh các bằng cách bài tiết các chất đặc thù theo thuyết “hiệu ứng khảm”. Theo một giả thuyết khác, vi nấm có thể hỗ trợ và tăng cường khả năng miễn dịch của cây chủ [4]. Howitz và Sinclair đề xuất giả thuyết “xenohormesis” cho rằng ở trạng thái phòng vệ, cây chủ sản sinh các chất có khối lượng phân tử thấp truyền tín hiệu tới cộng đồng vi sinh vật dị dưỡng nội sinh. Nhờ đó, các vi sinh vật nội dinh có thể cảm nhận sự thay

4

đổi trong quá trình trao đổi chất của cây chủ và sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp hữu ích cho cây chủ. Dưới áp lực tiến hoá chọn lọc, nhiều vi sinh vật đã mất các gen mã hoá protein tham gia sinh tổng hợp các chất này. Một số cụm gen không bị ảnh hưởng bởi quá trình thích nghi và tiến hoá vì cần thiết cho tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật nội sinh hoặc giữa các vi sinh vật nội sinh với nhau. Ở giả thiết khác, các chất truyền tín hiệu từ thực vật cũng có thể là sản phẩm trao đổi chất của các vi sinh vật nội sinh được kích thích sinh tổng hợp bằng nhiều cơ chế điều hoà khác nhau của cây chủ [5].

Hình 1.1. Mối quan hệ giữa vi vật nội sinh và cây chủ [4]

Ước tính đã có khoảng 7% trong số 1,5 triệu loài nấm đã được công bố. Việc ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới trong nghiên cứu về vi sinh vật góp phần củng cố lập luận mới cho rằng: hiện có khoảng 3,5 - 5,1 triệu loài nấm tồn tại trên trái đất [6]. Nhận định này trái ngược với báo cáo trước đó vào năm 2017 của Hawksworth và Lücking cho rằng có khoảng 2,2 đến 3,1 triệu loài nấm [7]. Trong đó, vi nấm nội sinh trên cây dược liệu chiếu 1 phần khá khiêm tốn. Chính vì vậy, vi nấm nội sinh có nhiều tiềm năng khai thác và không chỉ đa dạng loài mà còn đa dạng về khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học.

5

1.1.2. Sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh

Vi nấm nội sinh khá đa dạng ở thực vật, đại diện cho nguồn tài nguyên sinh học dồi dào về hợp chất tự nhiên có tiềm năng khai thác trong lĩnh vực dược phẩm và nông nghiệp [8]. Tuy nhiên, vi nấm nội sinh vẫn chưa được khai thác nhiều [9]. Nhiều hợp chất được sản xuất bởi các loại vi nấm này có hoạt tính sinh học cao, thuộc các nhóm như alcaloid, flavonoid, steroid, terpenoid, peptide, polyketone, quinol và phenol. Cho đến năm 2003, khoảng 4.000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đã được thu nhận từ vi nấm [10]. Rất nhiều thông tin về đa dạng di truyền, cơ chế tương tác và các chất có hoạt tính sinh học khác nhau từ vi nấm nội sinh đã được nghiên cứu trong ba thập kỷ qua.

1.1.2.1. Hoạt chất kháng khuẩn và kháng nấm

Các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh được sinh tổng hợp từ vi nấm nội sinh, hoặc là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa nấm và thực vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và bảo vệ cây chủ khỏi những tác nhân gây bệnh. Đối với con người, các hợp chất kháng vi sinh vật không chỉ có thể được sử dụng làm trong lĩnh vực y-dược mà còn được sử dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và thực phẩm.

Trong những năm gần đây, số lượng các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật đã từ vi nấm nội sinh ngày càng nhiều (Bảng 1.1). Chủng vi nấm nội sinh Penicillium cataractum phân lập từ cây bạch quả (Ginkgo biloba) sản xuất penicimenolidyu AB, pasfonin có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trong khoảng 23–361 μM [6]. Nhiều chất kháng khuẩn từ chủng vi nấm nội sinh Armillaria mellea từ cây thiên ma (Gastrodia elata) đã được phân lập, thuộc một số lớp cấu trúc như alkaloid, peptit, steroid, terpenoit, phenol, quinin và flavonoid cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gram (+), nấm men và nấm sợi. Ba hoạt chất mới gồm phomoenamide, phomonitroester và peacetylphomoxanthone B tách chiết từ dịch lên men nấm nội sinh Phomopsis sp. PSU-D15 có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh mạnh [11]. Đặc biệt, phomoenamide đã thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Ra.

6

Hợp chất fusaripeptide A được phát hiện từ chủng Fusarium sp. phân lập từ rễ cây ngựa bạc hà (Mentha longifolia) có khả năng sinh kháng nấm men gây bệnh ngoài da (Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei) và nấm sợi (Aspergillus fumigates) [12]. Nấm nội sinh Phomopsis sp. YM 311483 từ cây Neem Ấn Độ (Azadirachta indica) sinh tổng hợp bốn loại lactone mới, có hoạt tính kháng nấm Aspergillus niger, Botrytis cinere và Fusarium sp. [9]. Chủng Fusarium nội sinh trên cây dương xỉ (Selaginella pollescens) được thu thập trong khu bảo tồn Guanacaste của Costa Rica được chứng minh có khả năng ức chế mạnh C. albicans [13]. Jesterone là hợp chất kháng nấm mới ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp được phân lập từ nấm Pestalotiopsis jester nội sinh trên cây gỗ trai (Fagraea bordenii Wernham) [14].

Chi Epichloë nội sinh trong các loài cỏ khác nhau có khả năng sản sinh nhiều alkaloid gây độc cho một số loài côn trùng gây hại và thậm chí cả động vật có xương sống [15]. Acid nodulisporic được sản xuất bởi nấm nội sinh Nodulisporium sp. cũng được báo cáo tác dụng kiểm soát côn trùng ăn cỏ vì với cơ chế kích hoạt glutamate trong các kênh clo của cơ và tế bào thần kinh côn trùng dẫn đến dòng chảy của các ion clo qua các kênh, dẫn đến tê liệt cơ thể [16].

Epicoccum nigrum cũng được biết đến với khả năng chống lại vi khuẩn và nấm gây bệnh trên thực vật [15]. E. nigrum đã cho thấy hoạt tính ức chế Pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi (Psv) trên nốt sần cây ô liu lên đến 96% [17]. Các E. nigrum phân lập từ mía đã cho thấy khả năng chống lại nấm bệnh Sclerotinia sclerotiorum trên cây hướng dương và chống lại nấm Pythium sp. trên cây bông; kháng lại Phytoplasma và Monilinia sp. trên quả đào và quả xuân đào.

7

Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi nấm nội sinh trên thực vật

Cây chủ

Chất kháng sinh

TLTK

Chủng vi nấm nội sinh

Hoạt tính kháng VSV gây bệnh

Fusarium solani

[18]

Thông đỏ (Taxus baccata)

1-tetradecene, 8-octadecanone, 8-pentadecanone, Octylcyclohexane, 10- nonadecanone

Oblongolide Y

[19]

Phomopsis liquidambaris

Dây càng cua (Cryptolepis buchanani)

S. aureus S. epidermidis B. subtilis Klebsiella pneumonia E. coli Shigella flexneri E. coli B. subtilis P. aeruginosa

Chaetomium sp.

[20]

Cây dưa muối (Senecio stapeliiformis)

p-hydroxybenzaldehyde, Uracil, 5 effectively

E. coli S. aureus

[6]

Penicillium cataractum

Cây bạch quả (Ginkgo biloba)

Penicimenolidyu A , Penicimenolidyu B, Rasfonin

Fusarium sp.

Fusaripeptide A

[12]

Ngựa bạc hà (Mentha longifolia)

S. aureus B. subtilis P. aeruginosa K. pneumonia E. coli C. albicans C. glabrata C. krusei A. fumigates

Penicillium sp.

F. graminearum

[21]

Trúc đào thơm (Nerium indicum)

3-O-methylviridicatin, Viridicatol

Rhizopycnin D, TMC-264

Magnaporthe oryzae

[22]

Rhizopycnis vagum

Thuốc lá (Nicotiana tabacum)

Pestalotiopsis sp.

A. fumigatus

[23]

Thạch hộc tía (Dendrobium officinale)

LL-P880γ, LL-P880α, Ergosta- 5,7,22-trien-3β-ol

8

1.1.2.2. Hoạt chất gây độc tế bào ung thư

Các sản phẩm trao đổi chất bậc hai thu được từ vi nấm nội sinh đã được chứng minh là nguồn cung cấp các chất gây độc tế bào ung thư mới. Năm 2000, Demain và Vaishnav, ước tính rằng khoảng 57% các hợp chất trong thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư là các sản phẩm tự nhiên và các dẫn xuất từ vi nấm [16]. Theo các nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng loạt các chất chuyển hóa thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao gồm: alkaloid, benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon, steroid, terpenoid, tetralon. Các báo cáo cho thấy rằng các hợp chất hoạt tính sinh học tự nhiên được phân lập từ vi nấm nội sinh có thể đóng vai trò là nguồn thay thế cho việc khám phá ra các loại thuốc chống ung thư mới [24].

Camptothecin Ergoflavin

P Phaeosphoramide Chaetominine A (R=αC6H11) và B (R=βC6H11)

Hình 1.2. Một số các chất kháng ung thư từ vi nấm nội sinh [24, 25]

Chất ergoflavin (Hình 1.2) được minh chứng là hoạt chất ức chế tế bào ung thư mới, được phân lập từ nấm nội sinh Claviceps purpurea phát triển trên lá của cây thuốc sến xanh (một loài thuộc họ hồng xiêm). Chủng nấm nội

9

sinh Penicillium brasilianum được tìm thấy ở vỏ rễ cây xoan, thúc đẩy sự sinh tổng hợp các amit phenylpropanoid (nhóm chất phenylpropanoid) hiệu quả trong điều trị ung thư. Chủng nấm Entrophospora infrequens SW116 được phân lập từ cây họ thụ đào (Nothapodytes foetida) - một cây thuốc có nguồn gốc từ Ghats, Ấn Độ, được phát hiện với khả năng sinh camptothecin (Hình 1.2) [25]. Camptothecin là một chất ức chế topoisomerase được biết đến với khả năng điều trị một loạt các ung thư: ung thư dạ dày, ung thư trực tràng, ung thư ruột kết, ung thư bàng quang,…

Hoạt tính gây độc tế bào liên quan đến bệnh bạch cầu ở người K562 và dòng tế bào SW1116 ung thư ruột kết được ghi nhận bởi một alkaloid chaetominine (Hình 2) thu được từ chủng vi nấm nội sinh Chaetomium sp. IFB-E015, phân lập trên cây sa sâm (Adenophora axiliflora) [26]. Nấm nội sinh Phaeosphaeri avenari sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học gồm: phaeosphoramides A và B, hiệu quả trong ức chế chất dẫn truyền tín hiệu và chất kích hoạt phiên mã (STAT) -3 của tế ung thư [27]. Chủng vi nấm nội sinh mới Trametes hirsuta đã được phát hiện với khả năng sản xuất podophyllotoxin và các lignans aryl tetralin liên quan khác có đặc tính chống ung thư mạnh [25].

Do như cầu sử dụng paclitaxel trong điều trị ung thư cao nên từ năm 1995, các nghiên cứu ngoài nước đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ quý hiếm ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Những chủng nấm phổ biến được phân lập từ cây thuộc các chi: Taxomyces sp., Pestolotiopsis sp., Penicillium sp. và Truncatella sp.. Các loại nấm này có khả năng sinh paclitaxel hoặc các dẫn xuất từ paclitaxel thấp nhưng việc áp dụng công nghệ giải trình tự gen và chỉnh sửa hứa hẹn triển vọng khai thác paclitaxel từ vi nấm ở quy mô công nghiệp trong tương lai. Các nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học khác từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ vẫn còn bỏ ngỏ.

1.1.2.3. Hoạt chất kháng virus

Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh còn là ứng cử viên tiềm năng trong nghiên cứu và tạo các thuốc kháng virus. Việc khảo sát sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp các chất kháng virus cũng là hướng đi có nhiều hứa hẹn, mặc dù có rất ít nghiên cứu được ghi nhận. Hai

10

hợp chất mới, acid cytonic A và B được phân lập từ Cytonaema spp. có khả năng ức chế virus cytomegalovirus (CMV) ở người [28]. Hợp chất kháng virus hinnuliquinone được sinh tổng hợp bởi vi nấm Nodulisporium hinnuleum cư trú ở lá cây sồi (Quercus coccifera) thể hiện hoạt tính ức chế HIV-1 [29]. Các hoạt chất pullularins AD (cyclo hexadepsi-peptides) được sản xuất bởi Pullularia spp. BCC 8613 được phát hiện có hoạt tính kháng virus herpes simplex (HSV) [29]. Nấm nội sinh Alternaria tenuissima QUE1Se sản sinh ra altertoxins, một hợp chất hiệu quả chống lại virus HIV-1. Một số hợp chất được sản xuất từ Emericella spp. (HK-ZJ), bao gồm emerimidine, dehydroaustin, austinol, bao gồm aspernidine, austin, emeriphenolicins và acetoxy dehydroaustin đã được báo cáo là có hoạt tính kháng virus cúm A (H1N1) [30].

pullularins AD

cytonic A

Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất kháng virus từ vi nấm nội sinh [29]

1.1.2.4. Các chất có hoạt tính sinh học khác

Chất chống oxi hóa (antioxidant) là những chất có thể ngăn ngừa hoặc làm giảm tổn thương cho các tế bào gây ra bởi sự mất cân bằng phản ứng oxy hóa khử (reactive oxygen species). Nếu tế bào không thể trung hòa và loại bỏ

11

coumarin, lapachol,

-2-furanocarboxylic acid,

các gốc tự do, các phân tử không ổn định, DNA và protein chức năng sẽ bị phá hủy, dẫn tới viêm, ung thư và bão cytokine. Trong y học hiện đại, chất chống oxy hóa đang trở thành một liệu pháp sinh học tự nhiên đầy hứa hẹn. Một số chất chống oxy hóa tự nhiên mới như pestacin, corynesidones AB, 2,14-dihydroxy-7-drimen-12,11-olide, 5- isopestacin, phloroglucinol, (hydroxymethyl) tetrahydroxy-1-methylxanthone, salidroside, p -tyrosol, borneol và rutin được tách chiết từ vi nấm nội sinh [31, 32].

Các vi nấm nội sinh còn được biết đến là một nguồn cung cấp các chất chống bệnh tiểu đường [33]. Các xét nghiệm in vivo và in vitro về hợp chất lectin (N-acetylgalactosamine, 64 kDa) được sinh ra bởi nấm nội sinh Alternaria spp. từ cây ghi (Viscum) cho thấy hoạt chất này làm giảm biểu [34]. Chất chuyển hóa phipeptidal hiện bệnh ở chuột bị bệnh demethylasterriquinone B-1 (L-783,281) có hoạt tính giống insulin được tạo ra bởi chủng Pseudomassaria spp. phân lập từ rừng nhiệt đới châu Phi cũng đã được báo cáo [35].

Ngoài ra, các vi nấm nội sinh cũng có tiềm năng khai thác thuốc trị sốt rét mới trong ngành dược phẩm. Sinh tổng hợp chất phomoxanthones AC, một sesquiterpene thơm, do nấm Phomopsis archeri từ cây Vani (Vanilla albindia) gần đây đang thu hút sự chú ý của các nhà khoa học [36]. Cercosporin chiết xuất bởi nấm Mycosphaerella sp. từ một cây họ Thiến thảo (Psychotoria verticalis) đã chứng minh hiệu quả trong việc ức chế ký sinh trùng Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciparum và Leishmania donovani [37].

1.2. CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ (Taxus spp.)

1.2.1. Cây thông đỏ (Taxus spp.)

Cây thông đỏ (Taxus spp.) thuộc họ thanh tùng (Taxaceae) là loài cây gỗ quý hiếm thuộc nhóm gỗ 1A. Cây thông đỏ phân bố hẹp ở các nước châu Á như: Trung Quốc, Myanma, Nêpan, Ấn Độ, Philipines, Indonesia và Việt Nam. Thông đỏ phân bố chủ yếu ở những vùng cận nhiệt đới với độ cao khoảng 1000-2000 m. Cây thông đỏ là loại cây chậm phát triển nhưng có thể phát triển tới độ cao trưởng thành khoảng 20 m, với thân cây có đường kính

12

lên đến 1,5 m. Cây phát triển tốt trong những khu vừng đặc trưng của họ Sồi Dẻ, Giẽ, đặc biệt là khu vực núi đá vôi. Chi Taxus được mô tả lần đầu tiên tại Việt Nam vào năm 1919, tuy nhiên số lượng tìm thấy là không nhiều, chỉ là các cá thể riêng lẻ, chưa tạo thành quần thể. Trong sách đỏ Việt Nam 2007, thông đỏ được xếp vào cấp VU – loài sẽ nguy cấp. Việt Nam có hai loại thông đỏ khác nhau là T. chinensis và T. wallichiana. T. wallichiana phân bố ở rừng thứ sinh ở tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam ở độ cao 1200–1400 m, trong khi T. chinensis phân bố ở rừng thường xanh trên núi đá vôi ở các tỉnh phía bắc Việt Nam ở độ cao 1000 –1900 m [38]. Cụ thể, T. chinensis chỉ xuất hiện ở những khoảnh rừng nhỏ lẻ, biệt lập ở các tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Hòa Bình, Sơn La. Sự phát triển từ một hạt giống thành một cây sinh sản phát triển đầy đủ cần hơn 35 năm.

Hình 1.4. Cây thông đỏ bắc (Taxus chinensis) [38]

Thông đỏ được biết đến là loại gỗ quý có giá trị kinh tế cao và thường dùng làm gỗ gia dụng. Theo y học dân gian, lá được dùng từ lâu đời để trị hen suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hoá không bình thường... Ngoài ra, cành, vỏ, lá với liều lượng thấp còn được dùng để trị thực tính, bệnh giun đũa, đau đầu và điều trị ung thư. Đặc biệt vào năm 1962, các nhà khoa học tại Mỹ đã công bố phát minh làm “chấn động’’ dư luận, khẳng định trong cây Thông đỏ có hoạt chất paclitaxel chữa bệnh ung thư - căn bệnh mà y học lúc đó còn đang bó tay. Năm 1992, bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược Phẩm Mỹ (FDA) đã chấp nhận paclitaxel là loại thuốc điều trị đặc hiệu bệnh ung thư buồng trứng, miệng, ung thư vú. Theo số liệu năm 2000, thị trường tiêu thụ paclitaxel toàn

13

cầu đạt 1,6 tỷ đô la. Các hoạt động khai hoang của con người trong vài thập kỷ qua đã làm giảm đáng kể diện tích rừng của thủy tùng, dẫn đến hậu quả là thông đỏ bị liệt vào danh sách loài có nguy cơ tuyệt và cần được bảo tồn.

Ngoài paclitaxel, nhiều chất có hoạt tính sinh học giá trị đã được nghiên cứu từ cây thông đỏ. Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ các cây T. chinensis, T. cuspidata và T. media tại vùng đông bắc Trung Quốc đã phát hiện 20 hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn và 9 chất có khả năng gây độc tế bào ung thư. Các chất chuyển hóa này chủ yếu được phát hiện chủ yếu trong lá của T. cuspidata và T. media. Trong số đó, dodecanol có tác dụng kháng nấm [39]. Phosphomycin, acid fumaric, acid caffeic, acid cis -2- hydroxycinnamic, acid 4-hydroxybenzoic và acid 3,4-dihydroxyphenylacetic có đặc tính kháng khuẩn phổ rộng. Phosphomycin, acid 4-hydroxybenzoic và acid 3,4-dihydroxyphenylaxetic có thể ức chế sự tổng hợp cấu trúc tế bào [40, 41]. Acid fumaric, acid cis -2-hydroxycinnamic và acid caffeic có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào. Ngoài ra, 9 chất được tìm thấy có tác dụng ức chế mạnh tế bào ung thư. Trong số đó, acid caffeic, 4- hydroxybenzoic acid, acid 3,4-dihydroxy, squalene, anandamide, acid dehydroshikimic và salicin được phát hiện chủ yếu ở T. media; chỉ có acid 2,3-dihydroxybenzoic và fucose được phát hiện ở T. cuspidate [42, 43]. Điều này khẳng định, các chất có hoạt tính sinh học từ cây không đỏ khá đa dạng và dao động mạnh tùy thuộc vào chi và môi trường phát triển.

1.2.2. Đa dạng và phân loại vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ

Cho đến nay, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu đa dạng sinh học và phân bố của vi nấm nội sinh trên các cây thuộc chi Thông đỏ. Caruso và cộng sự (2000) đã phân lập 150 chủng nấm từ cây T. baccata và T. brevifolia. Trong đó, các chủng thuộc chi Alternaria, Fusarium và Mucor chiếm ưu thế nhất. Wang và cộng sự (2008) đã phân lập được 40 chủng nấm nội sinh từ lá cây Taxus mairei ở Fushan, Đài Loan. Dựa trên các đặc điểm hình thái và phân loại bằng sinh học phân tử, phần lớn các chủng thuộc chi Colletotrichum và Fusarium [44].

Năm 2017, Jam và Fotouhifar đã nghiên cứu đa dạng vi nấm nội sinh trên cây thủy tùng T. baccata L. ở Iran. Từ 80 mẫu cành và vỏ cây, đã phân lập được 125 chủng vi nấm nội sinh. Hầu hết các loại vi nấm nội sinh đã được

14

xác định thuộc ngành Mycelia stelia (67,2%) và Ascomycota (32%) và những loài khác thuộc Zygomycota (0,8%). Trong đó, Cladosporium và Alternaria là những chi ưu thế. Nhiều loài nấm nội sinh mới lần đầu tiên được phát hiện trên cây thủy tùng như Pseudodictyosporium elegans, Cladosporium basiinflatum, C. perangustum, C. subtilissimum, Geniculosporium serpens, Phoma pratorum, Paraphoma fimeti, Phomopsis archeri, Sclerostagonospora cycadis và Seimatosporium cf. pezizoides [45].

Song song với đánh giá đa dạng và phân bố của vi nấm nội sinh, nhiều nghiên cứu đã tập trung đánh giá khả năng sinh paclitaxel của các chủng nấm phân lập được. Cho tới nay, đã có hơn 150 chủng vi nấm sinh sinh paclitaxel thuộc 26 chi nấm được ghi nhận. Một số chi nấm sinh paclitaxel chiếm ưu thế như Taxomyces, Pestolotiopsis, Penicillium, Pestalotiopsis, Colletotrichum và Fusarium [45].

Phân loại vi nấm đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu đa dạng nấm nội sinh. Hiện nay, nghiên cứu hình thái hệ sợi, cơ chế sinh bào tử và đặc điểm của bào tử là phương pháp chính dùng để phân loại vi nấm. Tuy nhiên, không phải tất cả các loài nấm nội sinh đều tạo ra bào tử bào tử trong suốt vòng đời của chúng. Theo một khảo sát, tỷ lệ các chủng không sinh bào tử đạt khoảng 41,3% [46], dẫn đến những khó khăn trong việc định danh vi nấm tới loài. Phân loại bằng sinh học phân tử cho thấy, việc định danh chỉ dựa trên đặc điểm hình thái tế bào và bào tử là không chính xác với mối quan hệ phát sinh loài thực sự của chúng. Ứng dụng các công cụ sinh học phân tử và tin sinh học cho phép định danh loài với độ nhạy và độ đặc hiệu cao dựa trên việc so sánh DNA ribosome (rDNA) của từng vi sinh vật nội sinh với cơ sở dữ liệu trình tự GenBank bằng cách sử dụng công cụ BLAST trên NCBI. Ribosome DNA là một bộ gen lớn nằm trong nhân và có trình tự bảo tồn cao nhất nhờ hàng nghìn đơn vị sao chép trong cấu trúc gen. Các đơn vị này bao gồm: trình tự gen mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ 18S; trình tự gen mã hóa cho tiểu đơn vị lớn 26S và một gen ngắn 5,8S giữa 18S và 26S và vùng đệm trong (ITS) giữa mỗi gen trên. Gen 26S có kích thước lớn nhất trong số chúng với tổng chiều dài hơn 3000 bp, gần gấp đôi chiều dài của gen 18S. Gen 5,8S là gen ngắn nhất với tổng số 165 bp. Chiều dài của các gen này vẫn ổn định giữa các loài tương đối trong khi gen ITS thường là 500-700 bp và dao động giữa các loài. Khi giải trình tự, kích thước lớn của gen 26S cũng như kích thước

15

quá nhỏ của gen 5.8S gây khó khăn cho việc phân tích dữ liệu. Ngược lại, gen ITS có kích thước trung bình và trình tự dao động cho phép giải quyết hiệu quả các vấn đề về xác định mối quan hệ phát sinh loài ở bậc phân loại gần. Do đó, khuếch đại và giải trình tự gen ITS được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về vi nấm gần đây.

1.2.3. Các chất kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ

Hiện nay, đa số các nghiên cứu trên thế giới đang tập trung khai thác paclitaxel từ vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ. Năm 1993, Taxomyces andreanae là chủng nấm đầu tiên có khả năng sinh paclitaxel được phân lập từ vỏ cây thông đỏ Thái Bình Dương. Đồng thời, paclitaxel từ chủng nấm này cũng thúc đẩy sự ổn định của các vi ống và kích thích sự polymer hóa in vitro tương tự như paclitaxel từ cây thông đỏ. Phát hiện này đã cung cấp một phương pháp thay thế để thu được paclitaxel có hoạt tính sinh học tương tự chất thu nhận từ cây với giá thành sản xuất thấp [51].

Cho đến nay, ít nhất 34 chi nấm nội sinh như Alternaria, Aspergillus, Botryodiplodia, Botrytis, Cladosporium, Ectostroma, Fusarium, Metarhizium, Monochaetia, Mucor, Ozonium, Pap Formulapora, Periconia, Pestalotia, Pestalotiopsis, Phyllosticta, Pithomyces, Taxomyces, Tubercularia được chứng minh là có khả năng sản xuất paclitaxel và các chất tương tự của nó (baccatin III, 10-deacetylbaccatin III). Fusarium solani được phân lập từ những mẩu thân Taxus celebica sau khi nuôi cấy trên môi trường lỏng có thể sản xuất 1,6 μg/l paclitaxel. Paclitaxel chiết xuất từ dịch lên men có thể gây độc tế bào Jurkat tới 60%, trong khi paclitaxel chuẩn chỉ có 51%. Ngoài paclitaxel, nấm này còn sản xuất ra các taxane, baccatin III và 10 deacetyl baccatin III, những tiền chất dùng trong bán tổng hợp paclitaxel công nghiệp. Tương tự, Aspergillus candidus MD3 được phân lập từ vỏ Taxus media có thể sinh tổng hợp 112 mg/g paclitaxel (tính theo khối lượng khô của sợi nấm). Chủng Aspergillus niger var. taxi HD86-9 phân lập từ Taxus cuspidata có thể sản xuất 273,46 μg/L. Đặc biệt, Metarhizium anisopliae, H-27, một trong 13 loài nấm được sàng lọc từ 115 dòng nấm được phân lập từ vỏ cây thông đỏ (T. chinensis) có thể sản xuất ra 846,1 μg/L paclitaxel.

16

Ngoài paclitaxel, hai chất kháng nấm thuộc nhóm polyketide, clavatol và patulin được tìm thấy bởi chủng nấm nội sinh Aspergillus clavatonanicus phân lập từ T. mairei. Những chất này có thể được sản sinh theo cơ chế bảo vệ cây chủ T. mairei khỏi lại sự tấn công của mầm bệnh thực vật [46].

1.2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong sàng lọc vi nấm nội sinh sinh paclitaxel và dẫn xuất của paclitaxel

5a-hydroxylase (THY5a),

taxa-4(20), 10b-hydroxylase taxane

III-10-O-acetyltransferase

Con đường sinh tổng hợp paclitaxel ở thông đỏ là quá trình phức tạp, đã được nghiên cứu trong thập kỷ qua. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định vai trò của 19 enzym tham gia sinh tổng hợp paclitaxel từ geranylgeranyl diphosphate (GGPP). Một số gen mã hóa enzym chức năng tham gia chính vào con đường sinh tổng hợp paclitaxel đã được tách dòng, biểu hiện như geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS), taxadiene synthase (TS), 11(12)-dien5a-ol-O- taxane acetyltransferase(TAT), taxane (DBAT), 13ahydroxylase (THY13a), taxane 2a-O-benzoyltransferase (TBT), 10- deacetylbaccatin (10-DABT), phenylalanine aminomutase (PAM), baccatin III:3-amino-3-phenylpropanoyltransferase (BAPT), and 30-N-debenzoyl-20-deoxypaclitaxel N-benzoyltransferase (DBTNBT). Tuy nhiên, con đường sinh tổng hợp và cơ chế cảm ứng điều hòa paclitaxel vẫn chưa được nghiên cứu ở vi nấm nội sinh (Hình 1.5).

Hình 1.5. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel [46]

17

Khả năng sinh tổng hợp paclitaxel ở vi nấm nội sinh được giả thuyết là do cơ chế chuyển gen ngang (HGT-horizontal gene transfer). Vi nấm nội sinh sản sinh ra một số hợp chất để duy trì mối quan hệ cộng sinh với cây chủ, thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ [47]. Chuyển gen ngang thường được quan sát trong sinh vật nhân sơ và cho đến gần đây được chứng minh có tầm quan trọng hạn chế đối với sinh vật nhân chuẩn. Hezari và cộng sự đã tách dòng thành công gen ts và chỉ ra rằng gen này có nguồn gốc thực vật chứ không phải có nguồn gốc từ vi nấm [48]. Kết quả giải trình tự gen khác như dbat và bapt cho thấy trình tự nucleotide của các gen từ nấm có độ tương đồng cao gen tương ứng từ cây thông đỏ. Không riêng vi nấm sinh paclitaxel, nhiều chất kháng tế bào ung thư khác gồm podophyllotoxin, camptothecine, vinblastine, hypericin và diosgenin đã được tìm thấy ở vi nấm ký sinh trên cây chủ có khả năng sinh chất tương đương [47, 49].

So với phương pháp truyền thống tốn nhiều thời gian và công sức, việc sử dụng chỉ thị phân tử đang là công cụ hữu hiệu nhằm sàng lọc các chủng vi nấm có khả năng sinh paclitaxel. Dựa trên sự bảo thủ của 3 gen chính tham gia sinh tổng hợp paclitaxel, các cặp mồi PCR đặc hiệu được thiết kế dựa trên các vùng bảo thủ của gen ts, dbat và bapt. Gen ts được khuếch đại thành công từ các chủng nấm khác nhau như Fusarium solani, Taxomyces andreanae và Gibberella intermedia. Sản phẩm PCR khuếch đại gen dbat được quan sát thấy ở nấm Fusarium solani, Cladosporium cladosporoides, Aspergillus candidus và Fusarium redolens. Ngoài ra, gen bapt được khuếch đại thành công ở Colletotrichum gloeosporioides, Guignardia mangiferae và Fusarium redolens. Hiện nay, có hơn 30 chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp paclitaxel dao động từ 10 ng/L đến 800 μg/L thông qua sàng lọc truyền thống/chỉ thị phân tử.

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM VỀ VI NẤM NỘI

SINH

Ở Việt Nam, gần đây đã có đề tài nghiên cứu về vi nấm nội sinh; tuy nhiên, các nghiên cứu chuyên sâu về nấm nội sinh cây thông đỏ bắc (T. chinensis) đến nay chưa có nhiều công bố. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Lê Mai Hương tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện

18

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tách chiết thành công chất 10- deacetil baceatin III (10-DAB), tiền chất của paclitaxel, từ cây thông đỏ Nam thu thập tại Việt Nam. Từ mẫu cây, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 6 chủng vi nấm. Năm 2010, nhóm nghiên cứu này cho rằng, vi nấm nội sinh được phân bố trên các bộ phận ở mức độ khác nhau, nhiều nhất ở lá (50 chủng), thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1 chủng). Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy, 17 chủng (chiếm 25%) thể hiện hoạt tính gây độc 3 dòng tế bào ung thư. Bằng phương pháp phân loại hình thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng vi nấm tiềm năng gồm Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101 và Gongroniella butleri SHT106. Công trình nghiên cứu này bước đầu đã minh chứng tiềm năng khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây thông đỏ.

Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi nấm nội sinh Fusarium oxyporum trên cây thông đỏ (T. wallichiana) tại Lạc Dương, Lâm Đồng. Khả năng sinh paclitaxel của chủng nấm đạt cao nhất 250,98 mg/kg sinh khối khô [50]. Các kết quả này là tiền đề và cơ sở khoa học để các nhà khoa học trong nước thực hiện các nghiên cứu tiếp theo tạo nguồn nguyên liệu paclitaxel chữa bệnh ung thư ở quy mô công nghiệp.

Tại Việt Nam, hiện vẫn chưa có nghiên cứu sâu về các hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư từ các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ T. chinensis tại Hà Giang. Nghiên cứu này rất cần thiết vì không những khai thác nguồn vi nấm bản địa có khả năng sinh các chất kháng sinh và kháng tế bào ung thư mới mới mà còn góp phần bảo tồn loài thông đỏ quý hiếm đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam.

19

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG

2.1.1. Chủng giống

Bộ sưu tập vi nấm nội sinh gồm 25 chủng được phân lập từ các mẫu cây thông đỏ (Taxus chinensis) thu thập tại huyện Quản Bạ và huyện Đồng Văn tỉnh Hà Giang năm 2019, được lưu giữ tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các chủng vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli ATCC 11105, Bacillus cereus ATCC 11778, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231, Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) ATCC 35984 và Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) ATCC 33591, Enterococcus faecalis ATCC 29212 nhận từ Bộ sưu tập giống VSV của Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các dòng tế bào ung thư gồm A-549 (ung thư phổi người), MCF-7 (ung thư vú người) do J. M. Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.

2.1.2. Hóa chất, thiết bị

Một số hóa chất chính cho thí nghiệm : Cao nấm men, cao thịt, trypton (Himedia-Ấn Độ); glucose (Trung Quốc); NaCl (Trung Quốc), KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 (Trung Quốc); trypsin (Merck, Đức); DPPH (Merck, Đức); dimethyl sulfoxide (DMSO) (Merck, Đức); ethyl acetate (Sigma, Mỹ); SRB (Sulforhodamine B) (Gibco, Mỹ); agar (Viết Nam)và một số hóa chất phân tích khác.

Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu này được trình

bày trong bảng 2.1.

20

Bảng 2.1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ

1 Máy cô quay chân không IKK của Đức

2 Máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 Nhật Bản

3 Cân kỹ thuật Precisa XB 1200C Thụy Sĩ

4 Cân phân tích Shimazu AY120 Nhật Bản

5 Máy ly tâm lạnh Biofuge Fresco, Kendro, Đức

6 Máy lắc có kiểm soát nhiệt độ BSI-25R CPT, Mỹ

7 Nồi khử trùng ALP MC-40DP, Nhật Bản

Trung Quốc 8 Tủ ấm

Sharp, Nhật Bản 9 Lò vi sóng

2.1.3. Môi trường

PDA (g/L): Khoai tây 200; glucose 20; MgSO4 0,2; K2HPO4 0,2; agar 20;

pH 6,5

PDB (g/L) : Khoai tây 200; glucose 20; MgSO4 0,2; K2HPO4 0,2; pH 6,5

LB (g/L): NaCl 10; tryptone 5; Cao nấm men 5; agar 20; pH 7

Hansen (g/L): Glucose 20; peptone 10; KH2PO4; MgSO4 2; agar 20; pH 6

Czapek-Dox (g/L) : Sucrose 30,0; NaNO3 2,0; K2HPO4 1,0;

MgSO4.7H2O 0,5; KCl 0,5; FeSO4.6H2O 0,01; agar 15; pH 7,3.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi nấm nội sinh được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch kết hợp hiệu chỉnh theo El-Sayed và cộng sự (2019) [51]. Các chủng vi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDB ở nhiệt độ 30⁰C trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong 7 ngày. Môi trường thạch LB sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt độ 30-

21

37⁰C, hút dịch VSV kiểm định có mật độ tế bào đạt 5 x 108 CFU/mL lên trên bề mặt đĩa Petri hoặc các khay. Khi thạch đông dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra. Sau 7 ngày nuôi cấy, thu hồi và ly tâm dịch nuôi cấy các chủng vi nấm với tốc độ 6.000-8.000 vòng/phút ở 4⁰C. Bổ sung 100 μL dịch vào các giếng thạch trên đĩa Petri và đặt các đĩa trong tủ lạnh khoảng 5-6 giờ để dịch từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 28-30⁰C trong 14-18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn.

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định theo kích thước

vòng kháng khuẩn (VKK) theo công thức:

VKK = D - d (mm),

Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

d: Đường kính lỗ thạch (mm)

2.2.2. Tách chiết các hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh

Phương pháp tách chiết các hoạt chất sinh học từ vi nấm nội sinh được tiến hành theo mô tả trước đây [52]. Các chủng nấm được cấy vào môi trường PDB (100 mL) và ủ ở 25⁰C trên máy lắc trong 5 ngày và được sử dụng làm bình giống gốc. Tiếp giống 3% v/v (15 mL) được chuyển vào 500 mL PDB và ủ ở 25°C trong 21 ngày trong bóng tối như một môi trường nuôi cấy tĩnh. Sau đó, dịch nuôi được lọc qua bốn lớp vải thưa để loại bỏ các sợi nấm. Các sợi nấm sau khi thu hồi được làm khô qua đêm ở 35 – 40°C và chiết xuất bằng ethyl acetate trong 12 giờ. Môi trường nuôi cấy cũng được chiết với ethyl acetate theo tỉ lệ 1 : 3. Phần dung môi phía trên được thu lại và cô quay ở 60oC. Sau đó cặn kháng sinh thô được làm khô và cân đến khối lượng không đổi (cao chiết). Quá trình tách chiết được lặp lại 2 – 3 lần. Cao chiết được bảo quản ở 4oC cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.3. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Phương pháp gây độc tế bào đươc xác định tại phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

22

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương đã được công bố trước đây [53]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng

đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Chất thử đã pha ở nồng độ 100 µg/mL được đưa vào các giếng của đĩa

96 giếng. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190 L) sẽ được

sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%.

- Ủ trong tủ ấm 72 giờ. Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.

- 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek).

- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được

xác định thông qua công thức sau:

- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các

nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL được sử dụng như là chất

đối chứng tham khảo;

23

- DMSO 1% luôn được sử dụng như đối chứng âm (nồng độ cuối cùng trong giếng thử là 0.05%). Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết

được coi có hoạt tính tốt với IC50  20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được

coi có hoạt tính tốt khi IC50  5 μM [54].

2.2.4. Khảo sát khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng tuyển chọn

Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của cao chiết được được tiến hành theo mô tả trước đây [55]. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL DPPH (1000 µg/mL) và 960 µL cao chiết có nồng độ khác nhau 25, 50, 100, 200, 400 µg/mL. Hỗn hợp được ủ trong tối ở nhiệt độ 30ºC trong thời gian 30 phút, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 517 nm. Chất chuẩn được sử dụng là ascorbic acid. Phần trăm loại bỏ gốc tự do được tính theo công thức:

% Loại bỏ gốc tự do =

x 100%

Trong đó: AC là giá trị hấp thu của đối chứng, AS hấp thu của mẫu.

2.2.5. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp paclitaxel thông qua sàng các gen chỉ thị

Các chủng vi nấm nội sinh được nuôi cấy trên PDA lỏng trong 3 – 5 ngày, sau đó li tâm thu sinh khối ở 10.000 vòng trong 5 phút. DNA tổng số được tách chiết bằng kit Dneasy Plant Mini kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sàng lọc vi nấm nội sinh sản xuất paclitaxel bằng PCR dựa trên 3 cặp mồi (Bảng 2.2) cho dbat (dbat-F/dbat-R); bapt (bapt-F/bapt-R); ts (ts-F/ts-R) theo chu trình nhiệt được trình bày trong Bảng 2.3 [56, 57]. Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.

24

Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các gen dbat, bapt và ts

GGGAGGGTGCTCTGTTTG

Gen Trình tự mồi (5′ - 3′) TLTK Tên đoạn mồi Kích thước dự đoán

153 – 650 bp

[57]

GGCCTGCTCCTAGTCCATCACAT

CCTCTCTCCGCCATTGACAA

dbat-F dbat dbat-R

450 - 600 bp

[57]

GTCGCTGTCAGCCATGGCTT

ATCAGTCCGTCTGCATACGACA

bapt-F bapt bapt-R

400 – 500 bp

[56]

TAAGCCTGGCTTCCCGTGTTGT

ts-F ts ts-R

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại các gen dbat, bapt và ts

Gen Các bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ TLTK

6 phút 1 Biến tính 95

Biến tính 94 50s

dbat Gắn mồi 35 [56] 50 30s

Kéo dài 68 50s

Kết thúc 68 10 phút 1

Biến tính 95 6 phút 1

Biến tính 94 50s

55 50s bapt Gắn mồi 30 [56]

Kéo dài 68 50s

Kết thúc 68 10 phút 1

Biến tính 6 phút 1

Biến tính 94 50s

Gắn mồi 55 1 phút ts 32 [57]

Kéo dài 72 80s

Kết thúc 72 7 phút 1

25

2.2.6. Xác định đặc điểm hình thái và bào tử của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn

Xác định đặc điểm hình thái : Các chủng vi nấm tuyển chọn được nuôi cấy trên môi trường Czapek-Dox trong 3-10 ngày ở 28⁰C và được quan sát đặc điểm hình thái theo các khóa phân loại nấm [58, 59] , dựa trên một số đặc điểm chính sau:

- Hình dạng khuẩn lạc: tròn, vô định hình

- Bề mặt: lồi lõm, nhung mượt, mịn, xốp, ...

- Màu sắc khuẩn lạc, sự thay đổi màu khuẩn ty khí sinh theo thời gian

nuôi cấy

- Dạng mép khuẩn lạc: mỏng, dày, phẳng, răng cưa, ...

- Giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc: ít hoặc nhiều, màu sắc giọt tiết

- Tiết màu sắc vào môi trường nuôi cấy

Xác định đặc điểm bào tử : Các chủng nấm sợi được nuôi cấy trong tủ ấm ở 28-30°C trên môi trường thạch Czapek-Dox có cắm la men nghiêng. Sau 72 giờ, lamen được lấy ra quan sát hình thái cuống sinh bào tử và bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học tập trung vào một số điểm:

- Sợi nấm (hyphae): có vách ngăn, không có vách ngăn, có mấu, ...

- Bào tử (conidia): kiểu phát sinh bào tử, hình dạng, kích thước, cách

sắp xếp, ...

- Cuống sinh bào tử: có vách ngăn hoặc không, có hoặc không có cấu trúc đặc biệt như tế bào chân, có hoặc không có hình thái đặc biệt như bó giá, đệm giá.

Căn cứ vào kết quả quan sát về đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm vi thể, các chủng nấm nghiên cứu được xác định tên khoa học theo các khóa phân loại.

2.2.7. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự vùng ITS

Các chủng vi nấm nội sinh được nuôi cấy trên PDA lỏng trong 3 – 5 ngày, sau đó li tâm thu sinh khối ở 10.000 vòng trong 5 phút. DNA tổng số

26

được tách chiết bằng kit Dneasy Plant Mini kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA tổng số được sử dụng như là một mẫu để khuếch đại các vùng ITS cùng với gen 5,8S rRNA thông qua PCR, sử dụng các mồi phổ ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) theo chu trình nhiệt: 95⁰C trong 6 phút; 30 chu trình: 94⁰C trong 50 giây, 50⁰C trong 30 giây, 72⁰C trong 80 giây; 72⁰C trong 10 phút, giữ mẫu ở 4⁰C [60]. Sản phẩm PCR được kiểm tra, tinh sạch và gửi đến First BASE Laboratories Sdn. Bhd. (Malaysia) để giải trình tự. Kết quả giải trình tự gen hai chiều được kiểm tra bằng phần mềm BioEdit 7.2, so sánh với các gen tương ứng đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Cây phân loại được xây dựng dựa trên mức độ tương đồng của trình tự nucleotide giữa các loài được tính toán thống kê bằng phần mềm MEGA 7.0.

2.2.8. Xử lý thống kê số liệu

Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Microsoft Excel 2016. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên những công thức cơ bản của thống kê trong đó có công thức:

I;

Giá trị trung bình(X): X =

Độ lệch chuẩn (δ): δ = ; Sai số (m):

27

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THÔNG ĐỎ

Một trong những đặc tính quan trọng nhất của vi sinh vật nội sinh, đặc biệt là vi nấm, là khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất ức chế VSV gây bệnh [13]. Từ 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập trên cây thông đỏ Bắc tại Hà Giang, sàng lọc hoạt tính kháng sinh trên 7 chủng vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch được tiến hành. Kết quả cho thấy rằng 12/25 chủng (chiếm 48%) có khả năng kháng ít nhất một chủng VSV kiểm định trong thử nghiệm (Hình 3.3).

(A)

(B)

Hình 3.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A) và MRSE ATCC 35984 (B) của một số chủng vi nấm nội sinh

Số lượng chủng thể hiện hoạt tính trên từng chủng VSV kiểm định dao động trong khoảng 8 – 36% (Hình 3.2). Trong đó, các chủng vi nấm nội sinh thể hiện hoạt kháng mạnh đối với MRSE ATCC 35984 (chiếm 36%) và B. cereus ATCC 11778 (chiếm 32%). Tỷ lệ thấp hơn được ghi nhận với các chủng MRSA ATCC 33591 (chiếm 24%), P. aeruginosa ATCC 9027 (chiếm 24%), E. faecalis ATCC 29212 (chiếm 20%), C. albicans ATCC 10231 (chiếm 16%) và E. coli ATCC 11105 (chiếm 8%).

28

Hình 3.2. Tỉ lệ ức chế của các chủng vi nấm nội sinh trên từng cùng VSV kiểm định

Trong số 12 chủng có khả năng ức chế VSV kiểm định, có 6/12 chủng (chiếm 50%) thể hiện hoạt tính trên cả 3 nhóm: Gram (-), Gram (+) và nấm men; có 5/12 chủng (chiếm 41,67%) chỉ thể hiện hoạt tính trên nhóm vi khuẩn Gram (+) và có 1/12 chủng (chiếm 8,33%) chỉ thể hiện hoạt tính trên nhóm vi khuẩn Gram (-). Đặc biệt, 4 chủng gồm TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 thể hiện phổ kháng rộng trên ít nhất 5 chủng VSV kiểm định với đường kính vòng kháng dao động từ 7 - 30 mm (Hình 3.1). Vì vậy, 4 chủng vi nấm gồm TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.

Nghiên cứu gần đây, Gauchan và cộng sự (2021) đã phân lập được 13 chủng nấm nội sinh từ 16 mẫu cây thông đỏ (T. wallichiana) thu thập tại Nepal [61]. Trong đó, chỉ có 3 chủng vi nấm (chiếm 23.1%) thể hiện hoạt tính kháng E. coli, S. aureus và B. subtilis, với đường kính vòng kháng khuẩn dao động từ 6,5-10,2 mm. Ở nghiên cứu khác trên cây thông đỏ Himalayan (T. wallichiana Zucc.), 3/16 chủng vi nấm thể hiện hoạt tính kháng ít nhất một loại vi sinh vật kiểm định [62], thấp 2 lần tỷ lệ vi nấm sinh kháng sinh trên cây thông đỏ (T. chinensis) thu thập tại Hà Giang, Việt Nam.

29

Hình 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ. Ghi chú: 1. E. coli ATCC 11105; 2. C. albicans ATCC 10231; 3. B. cereus ATCC 11778; 4. MRSE ATCC 35984; 5. P. aeruginosa ATCC 9027; 6. MRSA ATCC 33591; 7. E. faecalis ATCC 29212.

So sánh với các nghiên cứu về nấm nội sinh trên cây huyết giác (Dracaena cambodiana) và cây bạch mộc hương (Aquilaria sinensis) cho thấy tỷ lệ nấm nội sinh thể hiện hoạt tính ức chế vi sinh vật kiểm định thường thấp, đạt 8.3% tổng số chủng phân lập được. Trên cây hỷ thụ (Camptotheca acuminata), đã báo cáo rằng 27,6% các chủng vi nấm phân lập có hoạt tính kháng khuẩn. Tổng hợp các nghiên cứu trên, vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (T. chinensis) hứa hẹn nhiều tiềm năng khai thác các hoạt chất kháng sinh mới.

3.2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH

Ngoài khả năng sinh kháng sinh ức chế vi sinh vật gây bệnh, vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ còn là nguồn cung cấp các chất gây độc tế bào ung thư ứng dụng trong điều trị lâm sàng và dược phẩm như paclitaxel. Trong

30

nghiên cứu này, 5 chủng vi nấm tiềm năng được tách chiết bằng dung môi ethyl acetate và đánh giá hoạt tính gây độc trên 2 dòng tế bào ung thư phổi A549 và vú MCF-7.

Bảng 3.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư của 5 chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ Bắc

Tỉ lệ ức chế tế bào (%)

STT

Kí hiệu chủng

A-549

IC50

MCF-7

IC50

1

TQF6 (100 µg/mL)

30,99 ± 1,53

>100

21,36 ± 2,67

>100

2

TQF25 (100 µg/mL)

44,99 ± 0,69

>100

43,51 ± 2,26

>100

3

TDF6 (100 µg/mL)

92,65 ± 1,4

7,61±0,21 77,15 ± 1,98 16,92±0,61

4

TDF7 (100 µg/mL)

93,91 ± 2,18

13,4±0,9 89,22 ± 4,09 17,82±2,02

5

Ellipticine (µg/mL)

92,81 ± 1,06

0,44±0,05 93,97 ± 1,07 0,47±0,02

Ghi chú: Ellipticine được sử dụng làm đối chứng dương.

Kết quả bảng 3.1 cho thấy, cao chiết tổng (100 µg/mL) từ 4 chủng vi nấm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư ở mức độ khác nhau. Trong đó, 2/4 chủng vi nấm gây độc tế bào ung thư A-549 và MCF-7 cao với khả năng ức chế tế bào cao hơn 70% (Bảng 3.1). Hoạt chất thô từ chủng TDF7 ức chế mạnh nhất với tế bào ung thư phổi A549 và MCF-7 với tỷ lệ ức chế tế bào đạt 93,91 ± 2,18% và 89,22 ± 4,09, tương ứng. Ở mức thấp hơn, tỷ lệ ức chế tế bào ung thư phổi A-549 và ung thư vú MCF-7 đạt lần lượt 92,65 ± 1,4% và 77,15 ± 1,98% so với mẫu đối chứng khi xử lý với cao chiết từ chủng nấm TDF6 (Bảng 3.1). Mặc dù chủng TQF6, TQF25 thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mạnh và rộng trên nhiều chủng VSV kiểm định nhưng hoạt tính gây độc tế bào A549 và MCF-7 thấp. Sự ức chế mạnh các dòng tế bào ung thư có thể do sự tương tác của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cao chiết với protein p53, một protein quan trọng nằm trong điều hòa chu kỳ tế bào – gọi là gen áp chế khối u p53 [63]. Khi có tổn thương ở DNA, p53 làm ngừng chu kỳ tế bào cho đến khi DNA bị tổn thương được sửa chữa hoặc p53 có thể làm cho tế bào chết theo lập trình (apoptosis) nếu không còn khả năng sửa chữa DNA. Các chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư bám vào đầu N của p53 và giúp protein này không bị phân huỷ.

Báo cáo về hoạt tính gây độc tế bào ung thư vi nấm trên cây thông đỏ tây Himalayan (T. fuana) chỉ ra rằng chỉ có 5/15 cao chiết tổng có khả năng

31

ức chế tế bào MCF-7 với tỷ lệ tế bào sống sót dao động từ 0-45,7% [64]. Năm 2017, Vasundhara và cộng sự đã phân lập được chủng vi nấm Diaporthe sp. T1 từ cây thông đỏ (T. baccata), sinh chất trichalasin E, F and H ức chế 79 ± 6% tế bào MCF-7 [65]. Chủng F. tricinctum T6 phân lập từ cây thông đỏ (T. tabaca L. subsp. wallichiana (Zucc.) tại Ấn Độ được báo cáo khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư MCF-7 và HeLa [52]. Các công bố trên khá tương đồng với kết quả gây độc tế bào ung thư MCF-7 và A-549 thu nhận từ nghiên cứu này.

Bên cạnh cây thông đỏ, khả năng sinh tổng hợp chất gây độc tế bào ung thư từ nấm nội sinh trên các cây dược liệu/thảo dược khác cũng khá đa dạng và phong phú. Năm 2017, Liu và cộng sự đã nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của các chủng vi nấm nội sinh trên 3 cây ngập mặn: cây trang (Kandelia candel), đước vòi (Rhizophora stylosa) và cây họ đước (Rhizophoraceae). Kết quả cho thấy 10/28 chủng vi nấm nội sinh phân lập được thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể sự phát triển của tế bào A-549 với tỷ lệ sống sót trong khoảng 7 - 57,6%. Đặc biệt, ba chủng nấm nội sinh đã ức chế rõ rệt sự hình thành mạch ung thư phổi oncoprotein do HPV-16 E7 gây ra trong ống nghiệm [66]. Aspergillus nomius phân lập trên cây lô hội (Aloe vera L.) có khả năng sinh chất sulphorhodamine gây độc tế bào ung thư MCF-7 với tỉ lệ tế bào sống đạt 2% [67].

3.3. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH CHIẾT THÔ CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM

Trong y học hiện đại, chất chống oxy hóa đang trở thành một liệu pháp sinh học tự nhiên đầy hứa hẹn. Các vi nấm nội sinh được biết đến là một nguồn đầy hứa hẹn của các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học tự nhiên với hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ và đã được coi là có hiệu quả và kinh tế.

32

Hình 3.4. Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn

33

Cao chiết tổng của 4 chủng tuyển chọn đều có hoạt tính chống oxy hóa cao. Tăng nồng độ cao chiết, hoạt động chống oxy hóa tăng dần. Tại nồng độ 400 µg/mL hoạt tính chống oxy hóa DPPH của TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 lần lượt là 93,78; 93,49; 89,15 và 60,71% (Hình 3.4).

phloroglucinol, isopestacin, acid,

Nghiên cứu hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH từ cao chiết chủng Preussia africana phân lập trên cây lô hội cho thấy tại nồng độ 500 µg/mL, hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH đạt 87%. Mười bốn chủng phân lập từ H. mysorense và 13 chủng phân lập từ N. foetida đều thể hiện hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH. Trong đó, 55% các chủng có hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH lớn hơn 95% và 40% số chủng có hoạt tính lớn hơn 75% [55]. Một số chất chống oxy hóa tự nhiên mới như pestacin, corynesidones AB, 2,14- dihydroxy-7-drimen-12,11-olide, lapachol, coumarin, 5- (hydroxymethyl) -2- tetrahydroxy-1- furanocarboxylic methylxanthone, salidroside, p -tyrosol, borneol và rutin được tách chiết từ vi nấm nội sinh [31, 32]. Khả năng chống oxy hóa của vi nấm nội sinh Xylaria spp. và Chaetomium spp. phân lập từ Nerium oleander và Ginkgo biloba (một loại cây thuốc thông thường) đã được báo cáo [60]. Hai chủng vi nấm nội sinh Pestalotiopsis microspore và Cephalosporin spp. phân lập từ Terminalia morobensis và Tracheospermum jasminoides cũng đã được báo cáo về khả năng sản xuất các chất chống oxy hóa là pestacin, isopestacin, graphislactone A.

3.4. SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH PACLITAXEL CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM

Trong thập kỷ qua, đa số các nghiên cứu vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ tập trung phân lập, sàng lọc paclitaxel và thử nghiệm hoạt tính ức chế tế bào ung thư ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là chi phí cao, đòi hỏi thời gian dài và tỷ lệ sàng lọc được chủng vi nấm paclitaxel thấp. Gần đây, sự phát triển của công nghệ giải trình tự gen bằng Sanger và thế hệ mới (next generation of sequencing-NGS) đã hỗ trợ đắc lực trong việc sàng lọc các chủng nấm tiềm năng sinh paclitaxel. Hơn nữa, cơ chế chuyển gen ngang được chứng minh là nguyên nhân chính dẫn tới khả năng sinh paclitaxel của vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ. Chính vì vậy, các gen mã hóa enzym tham gia chính trong con đường sinh tổng hợp

34

paclitaxel, chẳng hạn như taxadiene synthase (ts), 10 deacetylbaccatin III- 10- O-acetyl transferase (dbat) và C-13 phenylpropanoid-CoA acyltransferase (bapt) được sử dụng làm chỉ thị phân tử nhằm sàng lọc các chủng vi nấm tiềm năng. Trong nghiên cứu này, 4 chủng vi nấm gồm TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 sinh chất ức chế vi sinh vật kiểm định và tế bào ung thư cao được đánh giá khả năng sinh paclitaxel bằng chỉ thị phân tử.

Hình 3.5. Điên di DNA tổng số của các chủng vi nấm tuyển chọn trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 1 kb (Thermo scientific, Mỹ).

DNA tổng số của 4 chủng tuyển chọn được tách bằng bộ kit DNeasy Plant Mini cho băng DNA tổng số sắc nét trên gel agarose (Hình 3.5) và đủ nồng độ DNA thực hiện phản ứng PCR khuếch đại 3 gen dbat, bapt, ts. Sản phẩm PCR có kích thước đạt 550 bp, 500 bp và 450 bp được dự đoán tương ứng với kích thước mong đợt của gen dbat, bapt và ts. Kết quả âm tính ghi nhận cho sản phẩm PCR không xuất hiện băng và có dải băng không đúng với kích thước dự đoán.

Kết quả hình 3.6 cho thấy, gen dbat với kích thước 550 được khuếch đại thành công ở 3 chủng vi nấm TQF6, TQF25 và TDF6. Gen dbat mã hoá 10-deacetyl-baccatin III-10-O-acetyltransferase tham gia xúc tác chuyển hoá 10-deacetyl baccatin III thành baccatin III, tiền chất quan trọng để sinh tổng hợp paclitaxel ở cây thông đỏ.

35

Bên cạnh gen dbat, gen bapt với kích thước 500 bp cũng được khuếch đại thành công ở chủng TQF25 (Hình 3.6). Với 2 gen chính tham gia con đường sinh tổng hợp paclitaxel xuất hiện trên chromosome, chủng TQF25 nhiều khả năng sinh tổng hợp paclitaxel. Đối với chủng TDF7, không có gen mã hoá dbat, bapt và ts được khuếch đại. Điều này khẳng định chủng này không sinh paclitaxel nhưng vẫn có tiềm năng khai thác các chất kháng sinh và kháng ung thư mới. Trong những nghiên cứu xa hơn, tối ưu môi trường, điều kiện lên men và quy trình tách chiết paclitaxel là cần thiết để khẳng định khả năng sinh paclitaxel của 3 chủng TQF6, TQF25 và TDF6.

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen tham gia sinh tổng hợp paclitaxel của 4 chủng tuyển chọn trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm.

36

thành công

Trong những năm gần đây, ngày càng nhiều nghiên cứu tập trung sàng lọc các chủng vi nấm tiềm năng sinh paclitaxel bằng sử dụng các chỉ thị phân tử. Trong tổng số 19 gen mã hoá enzym tham gia sinh tổng hợp paclitaxel, các gen ts, dbat, và bapt được chú ý hơn cả. Poopa và cộng sự đã phân lập được 43 loài nấm nội sinh từ cây Salacia oblonga - một loài cây bụi thân gỗ nhiệt đới ở Ấn Độ. Trong số đó, có 7 chủng cho kết quả dương tính với gen dbat, trong khi đó chỉ có một chủng dương tính với bapt. Xiong và cộng sự (2013) đã thiết kế chỉ thị phân tử bapt nhằm sàng lọc vi nấm sinh paclitaxel trên cây thông đỏ Anglojap (T. x media) [68]. Trên tổng số 11 chủng vi nấm, 3 chủng vi nấm chứa gen bapt có kích thước 530 bp. Năm 2020, El-Bialy và cộng sự đã khuếch đại thành công gen bapt với kích thước 582 bp từ Acremonium sp. KM 677335. Ở nghiên cứu khác, bapt với kích thước 450 bp từ 2 chủng vi nấm Colletotrichum được khuếch đại gloesporioides, Alternaria alternata. Trong nghiên cứu này, kích thước gen bapt được ghi nhận từ chủng TQF25 là 500 bp. Chất chiết thô từ dịch lên men các chủng vi nấm trên đều được chứng minh chứa hàm lượng paclitaxel đáng kể > 5.2 μg/L. Các kết quả trên góp phần chứng minh rằng PCR khuếch đại các gen liên quan đến sinh tổng hợp paclitaxel là một phương pháp hiệu quả và đáng tin cậy để sàng lọc trước các loại nấm sản xuất paclitaxel.

So sánh với các nghiên cứu trên thế giới, sản phẩm PCR cho gen dbat và bapt có thích thước dao động. Kích thước gen bapt thu nhận được thường dao động từ 450 - 600 bp, trong khi đó gen dbat có kích thước nằm trong khoảng 153 - 650 bp. Trong nghiên cứu này, gen dbat, bapt từ 4 chủng nấm tiềm năng được khuếch đại thành công với kích thước đạt 550 bp và 500 bp. Sự khác biệt này phụ thuộc vào trình tự mồi thiết kế và kích thước đoạn gen bapt trên chromosome của chủng vi nấm. Những phát hiện này như một minh chứng quan trọng cho quá trình sinh tổng hợp paclitaxel được di truyền về mặt di truyền. Sự hiện diện của gen dbat hoặc bapt trong vi nấm nội sinh có thể kết luận rằng chúng có các enzym độc lập chịu trách nhiệm sinh tổng hợp paclitaxel. Sự vắng mặt của gen ts có thể do tiến hoá di truyền vi nấm dẫn đến sự hình thành con đường sinh tổng hợp khác tạo tiền chất taxa-4(5),11(12)- diene.

37

3.5. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TQF6, TQF25, TDF6, TDF7

3.5.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và cuống sinh bào tử của các chủng vi nấm nội sinh được tuyển chọn

Quan sát hình thái cho thấy, các khuẩn lạc của chủng TQF6 phát triển mạnh trên môi trường thạch PDA với tốc độ tăng trưởng 2,5 ± 0,15 cm/ ngày và đạt tới 9,0 cm sau 3-4 ngày. Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng đến trắng đục chuyển sang màu xám đen sau khi già đi, dày vừa phải, sợi nấm có độ dày đặc không đều, mặt sau màu trắng sang màu vàng nhạt (Hình 3.7a,b). Bào tử hình elip có đỉnh tròn và đáy phẳng, đơn bào, bào tử già trở thành không màu có 1–2 ngăn, hoặc màu nâu nhạt với tế bào giữa và sẫm hơn tế bào ở đầu tận cùng của sợi nấm (Hình 3.7c). Dựa vào đặc điểm hình thái tế bào và mô tả của Crous và Phillips (2006), chủng TQF6 nhiều khả năng thuộc chi Neofusicoccum.

Khuẩn lạc TQF25 sau khi nuôi cấy trên PDA ở 28°C có tốc độ tăng trưởng đạt 1,9 ± 0,12 cm/ngày và đạt tới 9,0 cm sau 4-5 ngày. Khuẩn lạc ban đầu có màu hơi trắng chưa hình thành bào tử; sau chuyển dần màu nâu nhạt và hình thành bào tử. Mặt sau màu vàng nâu đậm ở trung tâm (Hình 3.7d,e). Sợi nấm mịn như nhung. Cuống sinh bào tử đơn bội dạng chổi phân nhánh về phía đỉnh; bào tử elip hoặc hình trứng có màu nâu nhạt đến nâu (Hình 3.7f). Dựa theo phân tích hình thái và mô tả của Lee và Whalley (2000), chủng vi nấm TQF25 được phân loại thuộc chi Hypoxylon.

Khuẩn lạc chủng TDF6 phát triển nhanh trên môi trường thạch PDA với tốc độ tăng trưởng 1,5 ± 0,15 cm/ ngày và đạt tới 9,0 cm sau 6 -7 ngày. Sợi nấm phát triển mạnh và ăn đều từ tâm ra xung quanh. Sợi nấm ban đầu có màu trắng hơi ngả hồng, dạng sợi bông xốp. Mặt sau khuẩn lạc có màu hồng nhạt (Hình 3.8a,b). Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, bào tử trần hình bầu dục (Hình 3.8c). Dựa theo phân tích hình thái và mô tả của Booth (1971), chủng TDF6 được phân loại thuộc chi Fusarium.

38

Hình 3.7. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TQF6 (a, b, c) và TQF25 (d, e, f)

Hình 3.8. Khuẩn lạc trên môi trường Czapek-Dox sau 5 ngày và bào tử dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần của chủng TDF6 (a, b, c) và TDF7 (d, e, f)

Khuẩn lạc chủng TDF7 phát triển nhanh trên môi trường thạch PDA với tốc độ tăng trưởng 1,4 ± 0,17 cm/ ngày và đạt tới 9,0 cm sau 6 -7 ngày. Sợi nấm phát triển mạnh và ăn đều từ tâm ra xung quanh. Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau chuyển hồng tím nhạt, dạng sợi bông xốp. Mặt sau khuẩn lạc có màu hồng nhạt (Hình 3.8d,e). Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh,

39

phần đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, bào tử trần hình bầu dục (Hình 3.8f). Hình thái sợi, bào tử và cuống sinh bào tử khẳng định chủng TDF7 có đặc điểm giống với chủng Fusarium sp. TDF6 ở trên và được định danh tạm thời là Fusarium sp. TDF7.

3.5.2. Phân loại các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn bằng giải và phân tích trình tự ITS

Để phân loại đến loài, trình tự ITS đã được khuếch đại và phân tích về độ tương đồng trình tự với các trình tự trên cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng công cụ BLAST. Ở hình 3.9, các sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS có băng sáng, rõ nét với kích thước khoảng 550 - 600 bp. Sản phẩm PCR được tinh sạch và gửi đến First BASE Laboratories Sdn. Bhd. (Malaysia) để giải trình tự.

Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS trên gel agarose 1,0%. Giếng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); ĐC: là đối chứng âm

Phân tích trình tự ITS cho thấy chủng TQF6 có độ tương đồng cao với các chủng vi nấm Neofusicoccum italicum MFLUCC 15-0900 (99,17%), N. ningerense CGMCC 3.20078 (97,69%) và N. magniconidium CGMCC 3.20077 (97,5%) (Bảng 3.2). Quan sát cây phát sinh loài cho thấy, chủng TQF6 có quan hệ gần với các chủng thuộc loài N. italicum (Hình 3.10). Dựa vào kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, đặc điểm bào tử và phân tích trình tự gen ITS, chủng TQF6 được định danh là Neofusicoccum italicum TQF6. Neofusicoccum là chi nấm thuộc họ Botryosphaeriaceae sinh trưởng ở mạch gỗ và gây bệnh đóng vảy và chết ở các cây thân gỗ trên toàn thế giới,

40

đặc biệt cây nho và bạch đàn. Chất neofusnaphthoquinone B thuộc nhóm naphthoquinone tách chiết từ vi nấm Neofusicoccum australe có hoạt tính ức chế MRSA mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 16 µg/mL [69]. Ngoài ra, một số các hợp chất có hoạt tính sinh học như kháng sinh, kháng tế bào ung thư, chống tăng sinh tế bào ung thư máu đã được tách chiết từ dịch lên chủng N. australe như myrtucommulones, naphthalenones, men cyclobotryoxides, Melleins [70]. Tuy nhiên, các chất gây độc tế bào ung thư từ chủng N. australe có hoạt tính thấp và chưa có nghiên cứu khả năng sinh paclitaxel của loài này.

Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự ITS cho thấy chủng TQF25 có độ tương đồng thấp với các chủng nấm tham khảo thuộc chi Hypoxylon: H. griseobrunneum CBS 331.73 (91,22%), H. liviae CBS 115282 (87,61%) và H. papillatum ATCC 58729 (87,3%). Quan sát cây phát sinh loài cho thấy, chủng vi nấm H. griseobrunneum và H. liviae CBS 115282 tạo nhóm riêng biệt với chủng TQF25 (Bảng 3.3; Hình. 3.10). Do vậy, chủng TQF25 được định danh là Hypoxylon sp. TQF25. Chi Hypoxylon thuộc ngành Ascomycota được nhà sinh vật học Carlos Spegazzini phát hiện vào từ năm 1880 – 1922. Hypoxylon là chi lớn nhất với hơn 200 loài được định danh. Do vậy, để phân loại đến loài cần những nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm hình thái như: bào tử ngoài, thành bào tử, sắc tố, khe mầm. Kết hợp với đặc điểm hình thái, phương pháp sinh học phân tử dựa trên trình tự gen β-tubulin cần được bổ sung bên cạnh trình tự ITS [71]. Hypoxylon được biết đến với khả năng sản xuất một loạt các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học như kháng nấm, gây độc tế bào, tiêu diệt côn trùng, kháng khuẩn và các hợp chất phytotoxic [72]. Bốn hợp chất azaphilones mới là ultiformins A-D phân lập từ H. multiforme được báo cáo có khả năng kháng khuẩn rất mạnh. Năm 2007, hai chất mới daldinone A và C được tách chiết từ H. truncatum IFB-18 phân lập từ cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư SW1116 với giá trị MIC đạt 49.5 và 41 µM. Hiện chưa có công bố nào đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 và A-549 cũng như sinh paclitaxel từ chi trên. Do chủng nấm TQF25 chứa 2 gen chính tham gia sinh tổng hợp paclitaxel nên đánh giá khả năng sinh paclitaxel là hướng đi đầy hứa hẹn trong tương lai.

41

Bảng 3.2. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF6 với các chủng tham chiếu

Chủng

TQF6

N. italicum MFLUCC 15-0900 (NR_168164)

N. microconidium CGMCC 3.18750 (NR_161003)

N. ningerense CGMCC 3.20078 (NR_172860)

N. magniconidium CGMCC 3.20077 (NR_172859)

N. grevilleae CPC 16999 (NR_168143)

100,00

97,26

97,12

98,06

97,86

97,70

TQF6

97,26

100,00

94,76

95,67

95,47

94,86

N. italicum MFLUCC 15-0900 (NR_168164)

97,12

94,76

100,00

98,38

98,02

96,95

N. microconidium CGMCC 3.18750 (NR_161003)

98,06

95,67

98,38

100,00

99,64

96,75

N. ningerense CGMCC 3.20078 (NR_172860)

97,86

95,47

98,02

99,64

100,00

96,38

N. magniconidium CGMCC 3.20077 (NR_172859)

97,70

94,86

96,95

96,75

96,38

100,00

N. grevilleae CPC 16999 (NR_168143)

42

Bảng 3.3. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TQF25 với các chủng tham chiếu

H. griseobrunneum

H. bellicolor

H. neosublenormandii

H. liviae CBS

H. papillatum

Chủng

TQF25

CBS 331.73 (NR_155184)

UCH 9543 (NR_169971)

MFLU 15-1193 (NR_155174)

115282 (NR155154)

ATCC 58729 (NR155153)

100,00

84,02

75,20

75,47

78,11

76,76

TQF25

84,02

100

77,69

79,07

80,40

81,72

H. griseobrunneum CBS 331.73

(NR_155184)

H. bellicolor UCH

75,2

77,69

100

81,35

81,79

82,19

9543 (NR_169971)

H. neosublenormandii

75,47

79,07

81,35

100

77,03

79,06

MFLU 15-1193 (NR_155174)

78,11

80,40

81,79

77,03

100

85,97

H. liviae CBS 115282 (NR_155154)

76,76

81,72

82,19

79,06

85,97

100

H. papillatum ATCC 58729 (NR_155153)

43

Bảng 3.4. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF6 với các chủng tham chiếu

F. foetens CBS

F. inflexum

F. bactridioides

F. circinatum

F. pseudocircinatum

Chủng

TDF6

110286 (NR_15986)

NRRL 20433 (NR_152941)

CBS 100057 (NR_120262)

CBS 405.97 (NR_120263)

CBS 449.97 (NR_163683)

100,00

99,58

98,92

98,95

99,16

98,92

TDF6

99,58

100,00

95,99

95,69

95,88

95,59

F. foetens CBS 110286

(NR_159865)

F. inflexum NRRL

98,92

95,99

100,00

98,46

98,65

98,40

20433 (NR_152941)

F. bactridioides CBS

98,95

95,69

98,46

100,00

99,82

99,60

100057 (NR_120262)

99,16

95,88

98,65

99,82

100,00

99,80

F. circinatum CBS 405.97 (NR_120263)

98,92

95,59

98,40

99,60

99,80

100,00

F. pseudocircinatum CBS 449.97 (NR_163683)

44

Bảng 3.5. Ma trận về độ tương đồng trình tự ITS của chủng TDF7 với các chủng tham chiếu

F. foetens

F. inflexum

F. pseudoanthophilum

F. circinatum

F. bactridioides

Chủng

TDF7

CBS 110286 (NR_15985)

NRRL 20433 (NR_152941)

CBS 414.97 (NR_163682)

CBS 405.97 (NR_120263)

CBS 100057 (NR_120262)

100,00

92,95

89,92

87,96

87,80

88,91

TDF7

92,95

100,00

95,99

95,88

95,69

95,50

F. foetens CBS 110286 (NR_159865)

89,92

95,99

100,00

98,27

98,65

98,46

F. inflexum NRRL 20433 (NR_152941)

88,91

95,50

98,27

100,00

99,63

99,45

F. pseudoanthophilum CBS 414.97

(NR_163682)

87,96

95,88

98,65

99,63

100,00

99,82

F. circinatum CBS 405.97 (NR_120263)

87,80

95,69

98,46

99,45

99,82

100,00

F. bactridioides CBS 100057 (NR_120262)

45

Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại của các chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 với giá trị Boostrap 1000, sử dụng thuật toán Kimuar 2 với nhóm ngoài là Murco bainieri (NR 103628).

Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS từ chủng TDF6 và TDF7 cho băng điện di sắc nét có kích thước khoảng 550 bp (Hình 3.9). So sánh trình tự gen ITS của chủng TDF6 với các gen tham chiếu trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) cho thấy, chủng TDF6 thể hiện độ tương đồng cao với các chủng nấm Fusarium foetens CBS 110286 (99,58%), F. pseudoanthophilum CBS 414.97 (99,36%) và F. circinatum CBS 405.97 (98,74%) (Bảng 3.4). Tương tự, chủng TDF7 có độ tương đồng cao với các chủng nấm Fusarium foetens CBS 110286 (99,59%), F. pseudoanthophilum CBS 414.97 (98,00%) và F. circinatum CBS 405.97 (98,37%) (Bảng 3.5). Cây phát sinh loài khẳng định

46

(T. lập từ cây thông đỏ tricinctum T6 phân

chủng TDF6 và TDF7 thuộc cùng nhóm (Hình. 3.10). Kết hợp đặc điểm hình thái so với với các công bố trước đây và trình tự ITS, chủng nấm TDF6, TDF7 được phân loại thuộc loài Fusarium foetens. Năm 2016, Vasundhara đã báo cáo hoạt tính chống oxy hóa và ức chế sư phát triển của tế bào của chủng F. tabaca L. subsp. wallichiana (Zucc.) Pilger) tại Ấn Độ. Chủng F. tricinctum T6 cho thấy sự ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư MCF-7 và HeLa với giá trị IC 50 của dịch chiết nấm lần lượt là 225 ± 26 và 220 ± 18 μg/L đối với các dòng tế bào MCF-7 và HeLa. Hơn nữa, F. tricinctum thể hiện hoạt tính chống oxy hóa với giá trị IC 50 là 482 ± 9 μg/mL [52]. Năm 2015, Zaiyou và cộng sự đã phân lập được 435 chủng vi nấm nội sinh từ cây T. wallichiana var. mairei. Trong đó, chỉ có một chủng duy nhất thuộc chi Fusarium có khả năng sản xuất paclitaxel. Năng suất paclitaxel trong toàn bộ môi trường nuôi cấy PDB và trong môi trường nuôi cấy đã qua sử dụng từ chủng này lần lượt là 0,0153 mg/L và 0,0119 mg/L. Hàm lượng paclitaxel trong sợi nấm khô là 0,27 mg/kg. Các kết quả này cho thấy tiềm năng sản xuất paclitaxel từ các chủng Fusarium nói chung và chủng Fusarium foetens TDF7 nói riêng là rất lớn [73]. Fusarium foetens được biết đến là loài nấm gây bệnh héo lá trên cây hải đường (Begonia hiemalis) và đã được phát hiện trên Begonia ở Canada, Mỹ, Nhật Bản, Hà Lan, Đức và Na Uy. F. foetens chưa được báo cáo nhiều về khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư, tuy nhiên các chất có hoạt chất sinh học được phân lập từ các loài khác thuộc chi Fusarium là rất nhiều.

47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

 Từ 25 chủng vi nấm nội sinh trên cây thông đỏ (T. chinesis) thu thập tại Hà Giang, đã sàng lọc được 12/25 (chiếm 48%) chủng có khả năng kháng VSV kiểm định. Tuyển chọn được 4 chủng nấm gồm TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 có khả năng kháng 5 chủng VSV kiểm định.

 Chủng TDF7 ức chế mạnh nhất với tế bào ung thư phổi A549 và MCF- 7 với tỷ lệ ức chế tế bào đạt 93,91 ± 2,18% và 89,22 ± 4,09. Tỷ lệ ức chế tế bào tế bào ung thư phổi A-549 và ung thư vú MCF-7 của chủng TDF6 đạt lần lượt 92,65 ± 1,4% và 77,15 ± 1,98%.

 Cả 4 chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 đều có hoạt tính chống oxy hóa cao. Tại nồng độ 400 µg/mL hoạt tính chống oxy hóa DPPH của TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 lần lượt là 93,78; 93,49; 89,15 và 60,71%.

 Đánh giá khả năng sinh paclitaxel của 4 chủng TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7 bằng chỉ thị phân tử cho thấy chủng TQF25 mang hai gen dbat và bapt, chủng TQF6 và TDF6 chỉ mang gen dbat; gen dbat, bapt và ts không được khuếch đại ở chủng TDF7.

 Kết hợp đặc điểm hình thái, bào tử và phân tích trình tự gen ITS, các chủng TQF6, TQF25, TDF6, TDF7 được định danh lần lượt là Neofusicoccum italicum TQF6, Hypoxylon sp. TQF25, Fusarium foetens TDF6 và Fusarium foetens TDF7.

KIẾN NGHỊ

 Tiếp tục nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng sinh và ức chế tế bào ung thư từ 4 chủng vi nấm TQF6, TQF25, TDF6 và TDF7.

 Tách chiết và phân tích cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ

dịch lên men 4 chủng vi nấm.

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.

Bano, N., I.F. Rizvi, N. Sharma, M.H. Siddiqui, M. Kalim, A. Khan, and S. Akhtar, 2016, Production of bioactive secondary metabolites from endophytic fungi, International Research Journal of Engineering and Technology, 3(6), pp. 11-21.

2.

Daisy, B.H., G.A. Strobel, U. Castillo, D. Ezra, J. Sears, D.K. Weaver, and J.B. Runyon, 2002, Naphthalene, an insect repellent, is produced by Muscodor vitigenus, a novel endophytic fungus, Microbiology, 148(11), pp. 3737-3741.

3.

Schulz, B. and C. Boyle, 2005, The endophytic continuum, Mycological Research, 109(6), pp. 661-686.

4.

Arnold, A.E., L.C. Mejía, D. Kyllo, E.I. Rojas, Z. Maynard, N. Robbins, and E.A. Herre, 2003, Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree, Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(26), pp. 15649-15654.

5.

Howitz, K.T. and D.A. Sinclair, 2008, Xenohormesis: sensing the chemical cues of other species, Cell, 133(3), pp. 387-391.

6. Wu, Y.-Y., T.-Y. Zhang, M.-Y. Zhang, J. Cheng, and Y.-X. Zhang, 2018, An endophytic Fungi of Ginkgo biloba L. produces antimicrobial metabolites as potential inhibitors of FtsZ of Staphylococcus aureus, Fitoterapia, 128(pp. 265-271.

7.

Hawksworth, D.L., 2001, The magnitude of fungal diversity: the 1· 5 million species estimate revisited, Mycological Research, 105(12), pp. 1422-1432.

8.

Schulz, B., C. Boyle, S. Draeger, A.-K. Römmert, and K. Krohn, 2002, Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites, Mycological Research, 106(9), pp. 996-1004.

9.

Huang, W., Y. Cai, K. Hyde, H. Corke, and M. Sun, 2008, Biodiversity of endophytic fungi associated with 29 traditional Chinese medicinal plants, Fungal diversity, pp. 11-19.

10. Dreyfuss, M. and I.H. Chapela, Potential of fungi in the discovery of novel, low-molecular weight pharmaceuticals, in Discovery of Novel Natural Products with Therapeutic Potential. 1994. p. 49-80.

49

11. Aly, A.H., R. Edrada-Ebel, I.D. Indriani, V. Wray, W.E. Müller, F. Totzke, U. Zirrgiebel, C. Schächtele, M.H. Kubbutat, and W. Lin, 2008, Cytotoxic metabolites from the fungal endophyte Alternaria sp. and their subsequent detection in its host plant Polygonum senegalense, Journal of Natural Products, 71(6), pp. 972-980.

12.

Ibrahim, S.R., H.M. Abdallah, E.S. Elkhayat, N.M. Al Musayeib, H.Z. Asfour, M.F. Zayed, and G.A. Mohamed, 2018, Fusaripeptide A: new antifungal and anti-malarial cyclodepsipeptide from the endophytic fungus Fusarium sp, Journal of Asian Natural Products Research, 20(1), pp. 75-85.

13. Strobel, G. and B. Daisy, 2003, Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(4), pp. 491-502.

14. Li, J.Y. and G.A. Strobel, 2001, Jesterone and hydroxy-jesterone antioomycete cyclohexenone epoxides from the endophytic fungus Pestalotiopsis jesteri, Phytochemistry, 57(2), pp. 261-265.

15. Lugtenberg, B.J., J.R. Caradus, and L.J. Johnson, 2016, Fungal endophytes for sustainable crop production, FEMS Microbiology Ecology, 92(12), pp. 88-94.

16. Demain, A.L., 2000, Microbial natural products: a past with a future,

Special publication-royal society of chemistry, 257(pp. 3-16.

17. Berardo, C., I.M. Bulai, E. Venturino, P. Baptista, and T. Gomes, 2018, Modeling the endophytic fungus Epicoccum nigrum action to fight the “olive knot” disease caused by Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv) bacteria in Olea europaea L. Trees, Trends in Biomathematics: Modeling, Optimization Computational Problems, pp. 189-207.

18. Tayung, K., B. Barik, D. Jha, and D. Deka, 2011, Identification and characterization of antimicrobial metabolite from an endophytic fungus, Fusarium solani isolated from bark of Himalayan yew, Mycosphere, Journal of Fungal Biology, 2(3), pp. 203-213.

19. Rao, H.Y. and S. Satish, 2015, Genomic and chromatographic approach for the discovery of polyketide antimicrobial metabolites from an endophytic Phomopsis liquidambaris CBR-18, Frontiers in Life Science, 8(2), pp. 200-207.

50

20. Tawfik, N., R. Abdo, G. Abbott, U.R. Abdelmohsen, R. Edrada-Ebel, and E. Haggag, 2017, Metabolomics and Bioactivity Guided Isolation of Secondary Metabolites from the Endophytic Fungus Chaetomium sp, Journal of Advanced Pharmacy Research, 1(1), pp. 66-74.

21. Ma, Y.-m., K. Qiao, Y. Kong, M.-y. Li, L.-x. Guo, Z. Miao, and C. Fan, 2017, A new isoquinolone alkaloid from an endophytic fungus R22 of Nerium indicum, Natural Product Research, 31(8), pp. 951-958.

22. Lai, D., A. Wang, Y. Cao, K. Zhou, Z. Mao, X. Dong, J. Tian, D. Xu, J. Dai, and Y. Peng, 2016, Bioactive dibenzo-α-pyrone derivatives from the endophytic fungus Rhizopycnis vagum Nitaf22, Journal of Natural Products, 79(8), pp. 2022-2031.

23. Wu, L.-S., M. Jia, L. Chen, B. Zhu, H.-X. Dong, J.-P. Si, W. Peng, and T. Han, 2016, Cytotoxic and antifungal constituents isolated from the metabolites of endophytic fungus DO14 from Dendrobium officinale, Molecules, 21(1), pp. 14-21.

24. Xie, S. and J. Zhou, 2017, Harnessing plant biodiversity for the discovery of novel anticancer drugs targeting microtubules, Frontiers in plant science, 8(pp. 720-727.

25. Stierle, A., G. Strobel, and D. Stierle, 1993, Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew, Science, 260(5105), pp. 214-216.

related aryl tetralin

26. Puri, S.C., A. Nazir, R. Chawla, R. Arora, S. Riyaz-ul-Hasan, T. Amna, B. Ahmed, V. Verma, S. Singh, and R. Sagar, 2006, The endophytic fungus Trametes hirsuta as a novel alternative source of lignans, Journal of podophyllotoxin and Biotechnology, 122(4), pp. 494-510.

27.

Jiao, R.H., S. Xu, J.Y. Liu, H.M. Ge, H. Ding, C. Xu, H.L. Zhu, and R.X. Tan, 2006, Chaetominine, a cytotoxic alkaloid produced by endophytic Chaetomium sp. IFB-E015, Organic Letters, 8(25), pp. 5709-5712.

28. Guo, B., J.-R. Dai, S. Ng, Y. Huang, C. Leong, W. Ong, and B.K. Carté, 2000, Cytonic acids A and B: novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema species, Journal of Natural Products, 63(5), pp. 602-604.

51

29. Kumar, G., P. Chandra, and M. Choudhary, 2017, Endophytic fungi: A potential source of bioactive compounds, Chemical Science Review and Letters, 6(pp. 2373-2381.

30. Raekiansyah, M., M. Mori, K. Nonaka, M. Agoh, K. Shiomi, A. Matsumoto, and K. Morita, 2017, Identification of novel antiviral of fungus-derived brefeldin A against dengue viruses, Tropical medicine health, 45(1), pp. 1-7.

31. Khiralla, A., R. Spina, S. Saliba, and D. Laurain-Mattar, 2019, Diversity of natural products of the genera Curvularia and Bipolaris, Fungal Biology Reviews, 33(2), pp. 101-122.

32. Toghueo, R.M.K., 2020, Bioprospecting endophytic fungi from a genus

as sources of bioactive metabolites, Mycology, 11(1), pp. 1-21.

33. Kouipou Toghueo, R.M. and F.F. Boyom, 2019, Endophytic fungi from Terminalia species: a comprehensive review, Journal of Fungi, 5(2), pp. 43-52.

34. Govindappa, M., 2015, A review on role of plant (s) extracts and its phytochemicals for the management of diabetes, Journal of Diabetes & Metabolism, 6(7), pp. 1-38.

35. Gupta, S., P. Chaturvedi, M.G. Kulkarni, and J. Van Staden, 2020, A critical review on exploiting the pharmaceutical potential of plant endophytic fungi, Biotechnology Advances, 39(pp. 107462-107471.

36. Aharwal, R.P., S. Kumar, and S.S. Sandhu, 2016, Endophytic mycoflora as a source of biotherapeutic compounds for disease treatment, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 6(10), pp. 242- 254.

37. Wang, L.-W., J.-L. Wang, J. Chen, J.-J. Chen, J.-W. Shen, X.-X. Feng, C.P. Kubicek, F.-C. Lin, C.-L. Zhang, and F.-Y. Chen, 2017, A novel derivative of (-) mycousnine produced by the endophytic fungus Mycosphaerella nawae, exhibits high and selective immunosuppressive activity on T cells, Frontiers in Microbiology, 8(pp. 1251-1259.

38. Wani, M.C., H.L. Taylor, M.E. Wall, P. Coggon, and A.T. McPhail, 1971, Plant antitumor agents. VI. Isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia, Journal of the American Chemical Society, 93(9), pp. 2325-2327.

52

39. Yamawaki, C., Y. Yamaguchi, A. Ogita, T. Tanaka, and K.-i. Fujita, 2018, Dehydrozingerone exhibits synergistic antifungal activities in combination with dodecanol against budding yeast via the restriction of multidrug resistance, Planta Medica International Open, 5(02), pp. 61- 67.

40. Kim, H., Y. Seok, and M. Rhee, 2020, Synergistic staphylocidal interaction of benzoic acid derivatives (benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid and β-resorcylic acid) and capric acid: mechanism and verification study using artificial skin, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 75(3), pp. 571-575.

41. O Elansary, H., A. Szopa, M. Klimek-Szczykutowicz, H. Ekiert, A.A. Barakat, and F. A Al-Mana, 2020, Antiproliferative, antimicrobial, and antifungal activities of polyphenol extracts from Ferocactus species, Processes, 8(2), pp. 138-145.

42. Hronská, H., S. Tokošová, A. Pilniková, Ľ. Krištofíková, and M. Rosenberg, 2015, Bioconversion of fumaric acid to L-malic acid by the bacteria of the genus Nocardia, Applied biochemistry biotechnology, 175(1), pp. 266-273.

43. Ni, H., S.F. Zhang, Q.F. Gao, Y. Hu, Z.D. Jiang, and F. Chen, 2015, Development and evaluation of simultaneous quantification of naringin, prunin, naringenin, and limonin in citrus juice, Food science biotechnology, 24(4), pp. 1239-1247.

44. Wang, Y.-T., H.-S. Lo, and P.-H. Wang, 2008, Endophytic fungi from Taxus mairei in Taiwan: first report of Colletotrichum gloeosporioides as an endophyte of Taxus mairei, Botanical Studies, 49(1), pp. 39-43.

45. Ashkezari, S.J. and K.-B. Fotouhifar, 2017, Diversity of endophytic fungi of common yew (Taxus baccata L.) in Iran, Mycological progress, 16(3), pp. 247-256.

46. Zhang, H.-C., Y.-M. Ma, R. Liu, and F. Zhou, 2012, Endophytic fungus Aspergillus tamarii from Ficus carica L., a new source of indolyl diketopiperazines, Biochemical Systematics and Ecology, 45(pp. 31-33.

47. Garyali, S., M. Reddy, and A. Kumar, Diversity of taxol producing endophytic fungi from Taxus baccata and process optimization for taxol production. 2014, Thapar University, Patiala.

53

48. Hezari, M., N.G. Lewis, and R. Croteau, 1995, Purification and characterization of taxa-4 (5), 11 (12)-diene synthase from Pacific yew (Taxus brevifolia) that catalyzes the first committed step of taxol biosynthesis, Archives of Biochemistry Biophysics, 322(2), pp. 437- 444.

49. Kusari, S., C. Hertweck, and M. Spiteller, 2012, Chemical ecology of endophytic fungi: origins of secondary metabolites, Chemistry biology, 19(7), pp. 792-798.

50. Đàm Sao Mai and Võ Trung Âu, 2014, Nghiên cứu phân lập và xác lập môi trường nuôi cấy vi nấm cộng sinh phân lập từ rễ cây thông đỏ tại vùng Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng, Tạp chí sinh học, 36(1se), pp. 84-89.

51. El-Sayed, A.S., D.M. Ali, M.A. Yassin, R.A. Zayed, and G.S. Ali, 2019, Sterol inhibitor “Fluconazole” enhance the Taxol yield and molecular expression of its encoding genes cluster from Aspergillus flavipes, Process Biochemistry, 76(pp. 55-67.

52. Vasundhara, M., M. Baranwal, and A. Kumar, 2016, Fusarium tricinctum, an endophytic fungus exhibits cell growth inhibition and antioxidant activity, Indian journal of microbiology, 56(4), pp. 433- 438.

53. Skehan, P., R. Storeng, D. Scudiero, A. Monks, J. McMahon, D. Vistica, J.T. Warren, H. Bokesch, S. Kenney, and M.R. Boyd, 1990, New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening, Journal of the National Cancer Institute, 82(13), pp. 1107-1112.

54. Hughes, J.P., S. Rees, S.B. Kalindjian, and K.L. Philpott, 2011, Principles of early drug discovery, British Journal of Pharmacology, 162(6), pp. 1239-1249.

55. Rahaman, M.S., M.A. Siraj, S. Sultana, V. Seidel, and M.A. Islam, 2020, Molecular phylogenetics and biological potential of fungal endophytes from plants of the sundarbans Mangrove, Frontiers in Microbiology, 11(pp. 211-223.

56. Zhou, X., Z. Wang, K. Jiang, Y. Wei, J. Lin, X. Sun, and K. Tang, 2007, Screening of taxol-producing endophytic fungi from Taxus chinensis var. mairei, Applied Biochemistry Microbiology, 43(4), pp. 439-443.

54

57. Zhang, P., P.-p. Zhou, C. Jiang, H. Yu, and L.-j. Yu, 2008, Screening of taxol-producing fungi based on PCR amplification from Taxus, Biotechnology Letters, 30(12), pp. 2119-2123.

58. Fennell, D.I., The genus Talaromyces: studies on Talaromyces and

related genera II. 1973, JSTOR.

59. Braun, U., P.W. Crous, J.Z. Groenewald, and C. Scheuer, 2011, Pseudovirgaria, a fungicolous hyphomycete genus, IMA fungus, 2(1), pp. 65-69.

60. Roopa, G., M. Madhusudhan, K. Sunil, N. Lisa, R. Calvin, R. Poornima, N. Zeinab, K. Kini, H. Prakash, and N. Geetha, 2015, Identification of Taxol-producing endophytic fungi isolated from Salacia oblonga through genomic mining approach, Journal of Genetic Engineering Biotechnology, 13(2), pp. 119-127.

61. Gauchan, D.P., H. Vélëz, A. Acharya, J.R. Östman, K. Lundén, M. Elfstrand, and M.R. García-Gil, 2021, Annulohypoxylon sp. strain MUS1, an endophytic fungus isolated from Taxus wallichiana Zucc., produces taxol and other bioactive metabolites, 3 Biotech, 11(3), pp. 1- 16.

62. Gauchan, D.P., P. Kandel, A. Tuladhar, A. Acharya, U. Kadel, A. Baral, A.B. Shahi, and M.R. García-Gil, 2020, Evaluation of antimicrobial, antioxidant and cytotoxic properties of bioactive compounds produced from endophytic fungi of Himalayan yew (Taxus wallichiana) in Nepal, FResearch, 9(pp. 1-11.

63. Quach, N.T., Q.H. Nguyen, T.H.N. Vu, T.T.H. Le, T.T.T. Ta, T.D. Nguyen, T. Van Doan, T.T. Dang, X.C. Nguyen, and H.H. Chu, 2021, Plant-derived bioactive compounds produced by Streptomyces variabilis LCP18 associated with Litsea cubeba (Lour.) Pers as potential target to combat human pathogenic bacteria and human cancer cell lines, Brazilian Journal of Microbiology, pp. 1-10.

64. Fatima, N., T.P. Kondratyuk, E.-J. Park, L.E. Marler, M. Jadoon, M.A. Qazi, H. Mehboob Mirza, I. Khan, N. Atiq, and L.C. Chang, 2016, Endophytic fungi associated with Taxus fuana (West Himalayan Yew) of Pakistan: potential bio-resources for cancer chemopreventive agents, Pharmaceutical Biology, 54(11), pp. 2547-2554.

55

65. Vasundhara, M., M. Baranwal, N. Sivaramaiah, and A. Kumar, 2017, Isolation and characterization of trichalasin-producing endophytic fungus from Taxus baccata, Annals of Microbiology, 67(3), pp. 255- 261.

66. Liu, X., X. Wu, Y. Ma, W. Zhang, L. Hu, X. Feng, X. Li, and X. Tang, 2017, Endophytic fungi from mangrove inhibit lung cancer cell growth and angiogenesis in vitro, Oncology Reports, 37(3), pp. 1793-1803.

67. Mane, R.S. and A.B. Vedamurthy, 2020, Mycochemical Analysis And Anticancer Activity Of Endophytic Aspergillus nomius Against MCF7 Human Breast Cancer Cell Line, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 11(2), pp. 1-6.

68. Xiong, Z.-Q., Y.-Y. Yang, N. Zhao, and Y. Wang, 2013, Diversity of endophytic fungi and screening of fungal paclitaxel producer from Anglojap yew, Taxus x media, BMC Microbiology, 13(1), pp. 1-10.

69. Cadelis, M.M., S. Geese, B.B. Uy, D.R. Mulholland, S.J. van de Pas, A. Grey, B.S. Weir, B.R. Copp, and S. Wiles, 2021, Antimicrobial Metabolites against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus from the Endophytic Fungus Neofusicoccum australe, Molecules, 26(4), pp. 1094-2001.

70. Salvatore, M.M., A. Alves, and A. Andolfi, 2021, Secondary Metabolites Produced by Neofusicoccum Species Associated with Plants: A Review, Agriculture, 11(2), pp. 149-156.

71. Sir, E.B., E. Kuhnert, C. Lambert, A.I. Hladki, A.I. Romero, and M. Stadler, 2016, New species and reports of Hypoxylon from Argentina recognized by a polyphasic approach, Mycological Progress, 15(4), pp. 1-8.

72. Wu, Z.C., D.L. Li, Y.C. Chen, and W.M. Zhang, 2010, A new isofuranonaphthalenone and benzopyrans from the endophytic fungus Nodulisporium sp. A4 from Aquilaria sinensis, Helvetica Chimica Acta, 93(5), pp. 920-924.

73. Zaiyou, J., M. Li, and H. Xiqiao, 2017, An endophytic fungus efficiently producing paclitaxel isolated from Taxus wallichiana var. mairei, Medicine, 96(27), pp. 1-9.

56

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Danh sách 25 chủng vi nấm nội sinh phân lập tại Hà Giang

STT

Kí hiệu chủng

Vị trí

Bộ phận

Môi trường

TQF3

Quản Bạ

Rễ

PDA

1

TQF4

Quản Bạ

Rễ

PDA

2

TQF5

Quản Bạ

Rễ

PDA

3

TQF6

Quản Bạ

Rễ

MEA

4

TQF11

Quản Bạ

Thân

PDA

5

TQF12

Quản Bạ

Thân

PDA

6

TQF17

Quản Bạ

Lá

PDA

7

TQF18

Quản Bạ

Lá

PDA

8

TQF19

Quản Bạ

Lá

PDA

9

TQF20

Quản Bạ

Lá

MEA

10

TQF21

Quản Bạ

Lá

MEA

11

TQF22

Quản Bạ

Lá

MEA

12

TQF23

Quản Bạ

Lá

MEA

13

TQF24

Quản Bạ

Lá

MEA

14

TQF25

Quản Bạ

Lá

PDA

15

TDF2

Đồng Văn

Rễ

PDA

16

TDF4

Đồng Văn

Rễ

PDA

17

TDF6

Đồng Văn

Rễ

MEA

18

TDF7

Đồng Văn

Rễ

MEA

19

TDF8

Đồng Văn

Rễ

MEA

20

TDF9

Đồng Văn

Rễ

MEA

21

TDF10

Đồng Văn

Rễ

AGA

22

TDF11

Đồng Văn

Thân

PDA

23

TDF14

Đồng Văn

Thân

PDA

24

TDF18

Đồng Văn

Lá

PDA

25

Tọa độ 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°8'15" N 105°0'46" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E 23°15'24" N 105°17'39" E

57

LOCUS TQF 6 532 bp DNA linear

Phụ lục 2. Trình tự gen ITS của các chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn

1 GGCTCGACTC TCCCACCCAA TGTGTACCTA CCTCTGTTGC TTTGGCGGGC CGCGGTCCTC 61 CGCACCGGCG CCCTTCGGGG GGCTGGCCAG CGCCCGCCAG AGGACCATAA AACTCCAGTC 121 AGTGAACTTC GCAGTCTGAA AAACAAGTTA ATAAACTAAA ACTTTCAACA ACGGATCTCT 181 TGGTTCTGGC ATCGATGAAG AACGCAGCGA AATGCGATAA GTAATGTGAA TTGCAGAATT 241 CAGTGAATCA TCGAATCTTT GAACGCACAT TGCGCCCCTT GGTATTCCGA GGGGCATGCC 301 TGTTCGAGCG TCATTTCAAC CCTCAAGCTC TGCTTGGTAT TGGGCCCCGT CCTCCACGGA 361 CGCGCCTTAA AGACCTCGGC GGTGGCGTCT TGCCTCAAGC GTAGTAGAAA ACACCTCGCT 421 TTGGAGCGCA CGGCGTCGCC CGCCGGACGA ACCTTTGAAT TATTTCTCAA GGTTGACCTC 481 GGATCAGGTA GGGATACCCG CTGAACTTAA GCATATCAAT AAGCCGGAGG AA

LOCUS TQF25 498 bp DNA linear

1 TCCCAACCCT ATGTGAACAT ACTATTGTTG CCTCGGCGGC GCTGCGATAG CGGCCCGCCG 61 GTGGACCTAA ACGCTAATTG TAACCACTGT ATCTCTGAAT GTATAACTGT AATACGTTAA 121 AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA 181 AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCCGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCAT 241 TAGTATTCTA GTGGGCATGC CTATTCGAGC GTCATTTCGA CCCTTACGCC CTGTTGCGTA 301 GTGTTGGGAC TCTGCGTGTT ACAGCGCAGT TCCTGAAAGC AATTGGCGGA GCTAGAGCCC 361 ACTCTAGGCG TAGTAAATAC CATTCTCGCT TCTGTAGTGG CTTTGGCGGC TAGCCAGAAA 421 ACCCCTATAT TTCTAGTGGT TGACCTCGGA TTAGGTAGGA ATACCCGCTG AACTTAAGCA 481 TATCAATAAG CGGAGGAA

Hình 1. Trình tự của chủng TQF6

LOCUS TDF6 553 bp DNA linear

1 GTGAACATAC CACTTGTTGC CTCGGCGGAT CAGCCCGCTC CCGGTAAAAC GGGACGGCCC 61 GCCAGAGGAC CCCTAAACTC TGTTTCTATA TGTAACTTCT GAGTAAAACC ATAAATAAAT 121 CAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGTTC TGGCATCGAT GAAGAACGCA GCAAAATGCG 181 ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAAT CTTTGAACGC ACATTGCGCC 241 CGCCAGTATT CTGGCGGGCA TGCCTGTTCG AGCGTCATTT CAACCCTCAA GCACAGCTTG 301 GTGTTGGGAC TCGCGTTAAT TCGCGTTCCC CAAATTGATT GGCGGTCACG TCGAGCTTCC 361 ATAGCGTACT AGTAAAACCC TCGTTACTGG TAATCGTCGC GGCCACGCCG TTAAACCCCA 421 ACTTCTGAAT GTTGACCTCG GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAACTTAAG CATATCAATA 481 AGCGGA

Hình 2. Trình tự của chủng TQF25

LOCUS TDF7 502 bp DNA linear

Hình 3. Trình tự của chủng TDF6

1 GCTTGCTTCT CTTGAGAGCG GCGGACGGGT GAGTAATGCC TAGGAATCTG CCTGGTAGTG 61 CCAAACCCCT GTGGAACATA CCACTTGGTT GCCTCGGCGG ATCAGCCCGC TCCCGGTAAA 121 ACGGGACGGC CCGCCAGAGG ACCCCTAAAC TCTGTTTCTA TATGTAACTT CTGAGTAAAA 181 CCATAAATAA ATCAAAACTT TCAACAACGG ATCTCTTGGT TCTGGCATCG ATGAAGAACG 241 CAGCAAAATG CGATAAGTAA TGTGAATTGC AGAATTCAGT GAATCATCGA ATCTTTGAAC 301 GCACATTGCG CCCGCCAGTA TTCTGGCGGG CATGCCTGTT CGAGCGTCAT TTCAACCCTC 361 AAGCACAGCT TGGTGTTGGG ACTCGCGTTA ATTCGCGTTC CTCAAATTGA TTGGCGGTCA 361 CGTCGAGCTT CCATAGCGTA GTAGTAAAAC CCTCGTTACT GGTAATCGTC GCGGCCACGC 421 CGTTAAACCC CAACTTCTGA ATGTTGACCT CGGATCAGGT AGGAATACCC GCTGAACTTA 541 AGCATATCAA TAAGCGGAGG AA

Hình 4. Trình tự của chủng TDF7