ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
ĐỖ THANH KIM HƯỜNG
TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Thái Nguyên - 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
ĐỖ THANH KIM HƯỜNG
TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG
Ngành: Di truyền học
Mã số: 8 42 01 21
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Thái Nguyên - 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu
của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu,
kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ
hướng dẫn và nhóm nghiên cứu.
Tác giả luận văn
Đỗ Thanh Kim Hường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã
trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện
nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn - Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS. Nguyễn Thị Hải
Yến - Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi tiến hành các thí nghiệm
trong đề tài luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh
học hiện đại & Giáo dục Sinh học; cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh học, Trường
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động
viên, chia sẻ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019
Tác giả luận văn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Đỗ Thanh Kim Hường
TÀI TRỢ
Đề tài nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này được tài trợ bởi Quỹ Phát
triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.01-
2018.27" với tên đề tài là: “Biểu hiện gen mã hóa nhân tố phiên mã dehydration
responsive element binding của đậu tương (GmDREB) để tăng khả năng chịu
hạn ở cây chuyển gen” do GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm.
Tác giả luận văn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Đỗ Thanh Kim Hường
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN………………………………………………… i
LỜI CẢM ƠN……………………………………………………… ii
TÀI TRỢ…………………………………………………………… iii
MỤC LỤC………………………………………………………… iv
DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………… v
DANH MỤC CÁC HÌNH………………………………………… vi
DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT…………………………… vii
MỞ ĐẦU…………………………………………………………... 1
1. Đặt vấn đề……………………………………………………… 1
2. Mục tiêu nghiên cứu…………………………………………… 2
3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………… 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài……………………… 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………… 4
1.1. Đặc tính chống chịu của thực vật……………………………… 4
1.1.1. Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật………… 4
1.1.2. Cơ chế phân tử của đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của
thực vật………………………………………………………… 5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
1.2. Họ nhân tố phiên mã AP2…………………………………… 6
1.2.1. Cây đậu tương……………………………………………… 6
1.2.2. Nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương………………… 8
1.3. Vector biểu hiện gen thực vật và đánh giá hoạt động của vector
chuyển gen trên cây thuốc lá mô hình……………………………… 12
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…. 16
2.1. Vật liệu nghiên cứu…………………………………………… 16
2.1.1. Vật liệu thực vật…………………………………………… 16
2.1.2. Các loại vector và chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên
cứu………………………………………………………………… 16
2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu…………………… 16
2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu……………………………… 16
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu………………………………………… 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 17
2.3.1. Nhóm phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide
của gen GmDREB7………………………………………………… 18
2.3.1.1. Tách chiết RNA tổng số và nhân bản gen GmDREB7 từ
cDNA………………………………………...…………………….. 18
2.3.1.2. Tách dòng gen GmDREB7………………………………… 19
2.3.1.3. Xác định trình tự nucleotide……………………………… 21
2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế gen GmDREB7, vector chuyển
gen và tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 mang vector chuyển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
gen chứa gen GmDREB7…………………………………
21
2.3.3. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua A. tumefaciens... 22
2.3.4. Nhóm phương pháp phân tích, xử lý số liệu………………… 24
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN……... 25
3.1. Đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương
DT2008….......................................................................................... 25
3.1.1. Kết quả nhân bản, tách dòng và giải trình tự gen
GmDREB7.......................................................................................... 25
3.1.2. Mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương DT2008 và các
mẫu đậu tương mang mã số BT092314, BT089389, NM001249580,
NM001248527, AY244760 trên GenBank……….. 31
3.2. Thiết kế gen và vector chuyển gen thực vật mang gen
GmDREB7………………………………………………………… 33
3.2.1. Thiết kế gen GmDREB7 nhân tạo…………………………… 33
3.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen
GmDREB7.......................................................................................... 34
3.3. Chuyển gen và phân tích sự biểu hiện của gen GmDREB7 trên
cây thuốc lá………………………………………………………… 36
3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc
lá thông qua A. tumefaciens……………………………………… 36
3.3.2. Phân tích sự có mặt và sự biểu hiện ở mức phiên mã của gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
39 chuyển GmDREB7 trên cây thuốc lá chuyển gen..............................
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................. ........................................... 41
1. Kết luận.......................................................................................... 41
2. Đề nghị........................................................................................... 41
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN....... 42
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................... 43
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR………............ 19
Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn………........... 20
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB7 vào vector tách
dòng pBT…………………………………………………………… 20
Bảng 2.4. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá…………….. 24
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen
GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide
mang mã số BT092314 trên GenBank…………………………… 28
Bảng 3.2. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen
GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide
mang mã số BT092314 trên GenBank…………………..................... 30
Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào cây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
thuốc lá giống K326………………………………………….....…… 38
DANH MỤC CÁC HÌNH
Tran
g
Hình 1.1. Thông tin về trình tự mang mã số BT092314 trên
GenBank……………………………………………………………. 10
Hình 1.2. Đặc điểm trình tự amino acid suy diễn của trình tự mang
mã số BT092314 trên GenBank……………………………………. 11
Hình 1.3. Vị trí của gen GmDREB7 trên nhiễm sắc thể 12 của đậu
tương..................................................................................................
11 ...
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121……………… 13
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát………………………………. 18
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121_GmDREB7…… 22
Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế cặp mồi DREB7-F/DREB7-R...................... 25
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn gen
GmDREB7 từ cDNA của giống đậu tương DT2008………………… 26
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ 4 dòng
khuẩn lạc………………………………………………………. 27
Hình 3.4. Kết quả phân tích bằng BLAST trong NCBI…………….. 27
Hình 3.5. Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn mã hóa nhân
tố phiên mã GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008 so với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank……………………… 29
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.6. Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB7 của giống
đậu tương DT2008 so với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự
nucleotide mang mã số BT092314 trên GenBank………………….. 31
Hình 3.7. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của
đoạn mã hóa DREB phân lập từ giống đậu tương DT2008 và các trình
tự mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM
001248527, AY244760 trên GenBank……………………………… 32
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid suy
diễn của protein DREB từ giống đậu tương DT2008 và từ các trình tự
mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM
001248527, AY244760 trên GenBank…………............................…. 33
Hình 3.9. Trình tự đoạn gen GmDREB7 nhân tạo………..……….. 34
Hình 3.10. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt gen GmDREB7
trong vector pUC18 và sản phẩm cắt vector pBI121 bằng cặp enzyme
SacI và XbaI………………………………………………... 35
Hình 3.11. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121_GmDREB7 sử dụng cho
chuyển gen vào thuốc lá nhờ A. tumefaciens………………………. 35
Hình 3.12. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ khuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
lạc A. tumefaciens chủng CV58……………………………… 36
Hình 3.13. Hình mô tả quá trình biến nạp gen GmDREB7 và tái sinh
tạo cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật lây nhiễm A.
37 tumefaciens...........................................................................................
Hình 3.14. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen
GmDREB7 trong các cây thuốc lá chuyển gen.................................... 39
Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trong các cây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
thuốc lá chuyển gen....................................................................... 40
DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid (DNA bổ sung)
DNA Deoxyribonucleic Acid
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Môi trường tái sinh chồi GM
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Lysogeny Broth) LB
Thang DNA chuẩn (Maker) M
Murashige – Skoog MS
NCBI National Center for Biotechnology Information
(Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia)
Nhiễm sắc thể NST
Polymerase Chain Reaction PCR
Môi trường ra rễ RM
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
RNA Ribonucleic Acid
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng chiếm
vị trí quan trọng trong các cây nông nghiệp và trong đời sống của con người.
Đậu tương được xem là cây trồng khá nhạy cảm với các tác động của môi
trường. Trong những năm gần đây, biến đổi khí hậu và sự nóng lên của trái đất
đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây đậu tương.
Stress phi sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng, đặc biệt là hạn và có thể làm
giảm năng suất đậu tương khoảng 40%.
Tính chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh của thực vật nói chung
và của đậu tương nói riêng do nhiều gen quy định, sản phẩm của các gen này
liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chống chịu hoặc có chức năng
điều hòa nhóm gen chống chịu. Trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò quan
trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng với tác động của các stress phi sinh học.
Nhân tố trans - protein DREB có thể liên kết với trình tự cis để kích hoạt biểu
hiện gen khi có tín hiệu stress ở thực vật.
Protein DREB là một phân họ của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF, có chức
năng điều khiển sự biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn hán, nhiễm mặn
và nhiệt độ thấp, tạo ra tính chống chịu các stress của ngoại cảnh ở nhiều loài
thực vật. Thuộc tính chủ yếu của gen DREB là vùng bảo thủ AP2 liên kết với
các nhân tố phản ứng với các stress. Nhiều gen DREB đã được phân lập từ các
loài thực vật khác nhau, như cây Arabidopsis, lúa (Oryza sativa L.), ngô (Zea
mays L.), lúa mì (Triticum aestivum) và nhiều cây trồng khác. Ở cây đậu tương,
hai gen GmDREB6, GmDREB7 đã được xác định tồn tại trong hệ gen cây đậu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tương, tuy nhiên đặc điểm về cấu trúc gen cũng như hoạt động của các gen này
như thế nào và sản phẩm protein của chúng có liên quan trực tiếp đến nhóm
chống chịu nào hay không đang là vấn đề cần tìm lời giải đáp.
Cách tiếp cận kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu chức năng của gen
đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và nhiều gen mới trong hệ gen của cây
đậu tương đã được giải mã chức năng. Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi
đã chọn và tiến hành đề tài: “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen
GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương” để phục vụ chuyển gen với mục đích
đánh giá hoạt động và chức năng sinh học của gen GmDREB7 ở cây đậu tương.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Phân tích được đặc điểm của gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương.
2.2. Thiết kế được vector biểu hiện thực vật mang gen GmDREB7 của cây đậu
tương.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu thông tin, thiết kế cặp mồi PCR, nhân gen, tách dòng và xác định
trình tự gen GmDREB7 từ cây đậu tương.
3.2. Nghiên cứu thiết kế gen và vector biểu hiện mang gen GmDREB7.
3.3. Chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào cây thuốc lá.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1. Về mặt khoa học
Nghiên cứu góp phần làm rõ đặc điểm cấu trúc của gen GmDREB7 phân
lập từ cây đậu tương (giống DT2008). Những kết quả về tạo cây chuyển gen
thêm một lần nữa khẳng định cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển
gen trong cải thiện tính chống chịu các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh của cây
trồng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
4.2. Về mặt thực tiễn
Trình tự gen GmDREB7 phân lập được và các cây thuốc lá chuyển gen
được tạo ra có khả năng chống chịu tốt hơn so với cây đối chứng. Qua đó, góp
phần làm tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả
năng chống chịu của cây trồng nói chung cũng như trong thực tiễn chọn giống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
cây trồng ở Việt Nam nói riêng.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc tính chống chịu của thực vật
1.1.1. Tác động của các nhân tố phi sinh học đến thực vật
Trong những thập kỷ gần đây, stress phi sinh học đã trở thành mối quan
tâm chính trong sản xuất nông nghiệp. Sự tăng trưởng và phát triển của thực
vật trong các điều kiện stress có thể ảnh hưởng đến vụ mùa. Thực vật có đặc
điểm trạng thái sống đặc thù – bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển
trong suốt quá trình phát triển cá thể. Vì vậy, chúng thường xuyên đối mặt với
điều kiện ngoại cảnh ngày càng nhiều tác động bất lợi lên quá trình sinh trưởng
phát triển, gây ra những biến đổi và đặc biệt ảnh hưởng đến năng suất cây trồng
[2]. Ngày nay, do có sự biến đổi khí hậu toàn cầu nên môi trường ngày càng bị
tác động nặng nề hơn.
Các tác nhân gây stress sẽ tạo nên những khả năng thích ứng đặc trưng
của thực vật. Do đó, việc tìm hiểu cơ chế tác động của các tác nhân gây stress
cũng như những phản ứng thích nghi của cây trồng có vai trò quan trọng trong
trồng trọt. Một số tác nhân gây stress có thể tác động riêng rẽ nhưng cũng có
nhiều stress có thể phối hợp với nhau tác động lên cơ thể thực vật. Ví dụ stress
thiếu nước thường liên kết với stress nhiễm mặn ở vùng rễ và stress nhiệt độ
cao ở lá. Một số yếu tố môi trường từ tác nhân bình thường chuyển sang tác
nhân stress chỉ trong vài phút (ví dụ nhiệt độ), có những yếu tố môi trường phải
mất nhiều ngày hay nhiều tháng mới trở nên tác nhân stress (nước trong đất,
chất khoáng...) [2].
Đối với cây trồng, nhiệt độ tối ưu để phát triển bình thường là 23 - 28°C.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Nếu nhiệt độ trên 30°C thậm chí đến 35°C sẽ ảnh hưởng lớn đến cây. Trường
hợp tương tự xảy ra nếu nhiệt độ xuống dưới 15°C, năng suất cây trồng sẽ giảm
đáng kể. Một yếu tố khác đóng vai trò vô cùng quan trọng, đó là nước. Nước là
nguyên liệu khởi đầu, sản phẩm trung gian và cũng là sản phẩm cuối cùng trong
mọi quá trình trao đổi chất của tế bào. Mọi quá trình phản ứng trong cơ thể đều
được thực hiện trong môi trường nước. Do đó, thiếu hay thừa nước đều ảnh
hưởng xấu đến cây trồng. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã thống kê được thiệt
hại hàng năm do hạn hán gây ra là rất lớn, có thể làm mất mùa, giảm đến trên
60% sản lượng [2].
1.1.2. Cơ chế phân tử của đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi của thực vật
Stress hạn, mặn và sốc nhiệt tác động xấu đến sự sinh trưởng, phát triển
và năng suất của nhóm cây trồng cạn. Trong các điều kiện stress, thực vật vẫn
có những cơ chế để thích nghi đối với sự thay đổi cường độ khác nhau của
stress, tuy nhiên những cơ chế này vẫn chưa đủ để giúp thực vật chống chịu.
Thực vật có nhiều cơ chế phản ứng khác nhau với các stress thông qua các
con đường truyền tin và phản ứng tế bào, từ việc thay đổi biểu hiện gen, trao
đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến mức độ sinh
trưởng và năng suất cây trồng. Khi gặp các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, những
biến đổi trong quá trình phát triển và trao đổi chất sẽ làm thay đổi sự biểu hiện
của gen. Điều này bắt đầu từ việc nhận biết tín hiệu ở mức độ tế bào, lan truyền
tín hiệu trong tế bào, sau đó lan truyền khắp cơ thể.
Để chống chịu với stress, các phản ứng sinh hóa được kích hoạt trong cây
trồng để tích lũy nhiều các loại chất dễ hòa tan như: đường, amino acid, glycine
betaine và polyamine để giúp các cây trồng đối phó với stress [15] và giúp cây
phục hồi sau một thời gian nhất định chịu tác động từ điều kiện môi trường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
[14].
Sự biểu hiện của các gen cảm ứng với stress có liên quan chặt chẽ với quá
trình phiên mã. Vì vậy, sự biểu hiện của các gen này chịu ảnh hưởng của cả môi
trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa. Các nhân tố phiên mã
(Transcription factors - TFs) đóng vai trò điều khiển những thay đổi trong biểu
hiện gen và phản ứng với các stress từ môi trường ngoại cảnh. Hiện nay, các
protein DREB là nhóm TF được nghiên cứu thành công nhất, bởi nó kích hoạt
sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát các yếu tố liên quan
trong điều kiện phi sinh học [40].
1.2. Họ nhân tố phiên mã AP2
Họ AP2 là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã ở thực vật, bao gồm bốn
phân họ lớn: AP2, RAV, ERF và DREB [32]. Phân họ protein DREB đặc trưng
bởi miền bảo thủ AP2 chứa các vị trí liên kết với mạch DNA ở vùng promoter.
Nhiều gen trong phân họ DREB đã được phân lập từ các loài thực vật, như cây
Arabidopsis, lúa (Oryza sativa L.), ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum
aestivum)... Tuy nhiên các công bố về chức năng của một số gen DREB chủ
yếu ở cây Arabidopsis.
Gen mã hóa nhân tố phiên mã chứa miền AP2 liên quan đến nhiều quá
trình sinh học của thực vật bao gồm sự tăng trưởng, truyền tín hiệu, phản ứng
với mầm bệnh và ứng phó với các stress phi sinh học như hạn hán, muối,...
Miền AP2 có khoảng 58 hoặc 59 amino acid, trong đó có một số amino acid
liên kết với nhân tố đáp ứng sự mất nước (DRE) hoặc hộp GCC [25], [35].
1.2.1. Cây đậu tương
Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill thuộc họ Đậu
(Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae), có bộ NST 2n = 40. Đậu tương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
là một loại cây trồng cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Đông Nam Á.
Đậu tương là loại lương thực chính ở các nước châu Á đã từ lâu và đã
được sử dụng làm loài thực vật mẫu cho các nghiên cứu về sinh lý thực vật, hóa
sinh và sinh học phân tử. Các phân tích sinh hóa cho thấy hạt đậu tương chứa
từ 38 - 40% protein, 12-25% lipid, các muối khoáng, các vitamin A, B1, B2,...
và nhiều axit amin thiết yếu (cystein, tryptophan, methionine, lysine,...) [39].
Bên cạnh giá trị về kinh tế và dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn giữ vai trò
quan trọng trong việc cải thiện đồ phì và sử dụng bền vững tài nguyên đất canh
tác [32].
Đậu tương thuộc loại cây Hai lá mầm, thân thảo, là cây trồng cạn thu hạt,
bao gồm các bộ phận: Rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm
rễ cái và các rễ bên, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium
japonicum có khả năng cố định đạm từ nito của không khí [1]. Nhiều nghiên
cứu cho thấy, những giống đậu tương có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần
thường làm cho hàm lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác
dụng cải tạo đất. Trên thân có nhiều lông nhỏ, ít phân cành, có từ 8 - 14 đốt,
các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân. Đậu tương có 3 loại lá chính: Lá
mầm, cặp lá đơn, lá kép có 3 lá chét, đôi khi 4 - 5 lá chét. Đậu tương thuộc loại
cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, mọc thành chùm, mỗi chùm thường có 3 - 5
hoa có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, có
nhiều lông bao phủ, khi chín vỏ quả có màu vàng hoặc xám đen. Hạt có dạng
hình tròn, bầu dục, tròn dài, tròn dẹt... không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ
bao quanh một phôi lớn. Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm,
xanh, nâu, đen... đa số là hạt màu vàng. Đặc biệt, màu sắc rốn hạt ở các giống
là không giống nhau, đây là biểu hiện đặc trưng của giống.
Trong các gian đoạn sinh trưởng, đặc biệt là thời kì ra hoa, tạo quả nếu
thiếu nước thì hoa và quả non sẽ rụng nhiều. Giai đoạn phát triển của quả và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
hạt cần nhiều nước nhất, thiếu nước trong giai đoạn này sẽ dẫn đến giảm kích
thước hạt và năng suất giảm đi đáng kể. Do vậy, thời kì này được chứng minh
là thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất nếu thiếu nước [36].
Đậu tương là cây nhạy cảm với điều kiện ngoại cảnh, đặc biệt là hạn. Khi
nghiên cứu về đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về mặt sinh lý và di truyền
đã cho thấy rằng các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo của
chất nguyên sinh, quá trình trao đổi chất. Tính chịu hạn của cây đậu tương là
tính trạng đa gen và chúng thể hiện ở nhiều mặt như: sự phát triển nhanh của
bộ rễ, tính chín sớm tương đối,...
Các cây họ Đậu nói chung và cây đậu tương nói riêng là loài cây trồng có
nhu cầu về nước cao hơn các loài cây khác và không đồng đều qua các giai
đoạn, chúng thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Do hàm lượng protein và lipid trong
hạt cây đậu tương rất cao, để tổng hợp 1 kg chất khô cần 500 – 530 kg nước và
trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của cây đậu tương cũng khá cao
50%, trong khi ngô chỉ là 30% và lúa là 20% [3].
1.2.2. Nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương
Từ những năm 80 của thế kỷ XX, các nghiên cứu về DREB đã được các
nhà khoa học trên thế giới quan tâm, tiến hành giải trình tự gen DREB và so
sánh trình tự gen này ở các loài thực vật khác nhau như: họ Cúc (Asteraceae),
hướng dương (Helianthus annuus), lúa mì (Triticum aestivum L.)…
Nhiều thành viên trong phân họ DREB đã được phân lập, mô tả và các
nghiên cứu đã khẳng định chúng là những thành tố quan trọng, liên quan đến
sự phản ứng với các nhân tố phi sinh học ở thực vật bằng cách quy định biểu
hiện gen thông qua các trình tự DRE/CRT [38]. Một số thành viên của phân họ
gen DREB được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa,
GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
GmDREB6, GmDREB7 [28]. Với trình tự và độ dài khác nhau nhưng mỗi gen
trong phân họ DREB đều có những biểu hiện mạnh khi đậu tương gặp các điều
kiện stress hạn, mặn, sốc nhiệt. Trong khi nhóm DREB1 điều khiển tính chịu
hạn, mặn và lạnh thì nhóm DREB2 lại có vai trò chủ yếu trong điều khiển tính
chịu hạn, chịu nóng,…
Đặc điểm của gen DREB ở cây đậu tương đã được tiếp cận nghiên cứu từ
những năm đầu của thế kỉ XXI. Chen và cs (2004) đã phân lập gen DREB1 từ
mRNA của cây đậu tương có kích thước 705 bp [13]. Gen DREB1 được phân
lập từ DNA của cây đậu tương bởi Charlson và cs (2009) cũng có kích thước
705 bp [8]. Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB5 và gen GmDREB3
(2009) từ mRNA ở đậu tương với kích thước lần lượt là 927 bp [10] và 597 bp
[11]. Liu và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB6 từ mRNA ở cây đậu tương
với kích thước là 693 bp [21]... Tuy nhiên, việc nghiên cứu các gen DREB ở
cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng ở Việt Nam còn khá mới, chỉ
có một vài công bố về các gen DREB trong những năm gần đây, đó là các
nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen DREB1 và DREB5 ở
cây đậu tương của nhóm tác giả Chu Hoàng Mậu và cs (2011) [4].
Đặc điểm của gen ứng cử viên GmDREB7
Trình tự gen mang mã số BT092314 trên GenBank phân lập từ mRNA
đậu tương là gen ứng cử viên được gán nhãn GmDREB7. Trình tự mang mã số
BT092314 do nhóm tác giả Cheung và cs (2009) nghiên cứu đã được đăng kí
mã số trên GenBank vào tháng 8/2009. Trình tự này có kích thước 793 bp, được
phân lập từ mRNA của cây đậu tương (Glycine max) và chưa rõ chức năng sinh
học. Trình tự đoạn mã hóa của gen mang mã số BT092314 trên GenBank có
kích thước 561 bp, từ vị trí nucleotide số 144 đến 704, với mã mở đầu là ATG
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
và mã kết thúc là TGA (Hình 1.1).
Hình 1.1. Thông tin về trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank.
Đặc điểm của trình tự amino acid suy diễn, vùng AP2 và các điểm DNA
binding của trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank
Trình tự gen mang mã số BT092314 trên GenBank là ứng cử viên gen
GmDREB7 mã hóa 186 amino acid. Trình tự amino acid thuộc miền AP2 (Hình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
1.2A) có 59 amino acid, từ vị trí amino acid số 64 đến 122, trong đó có 11
amino acid liên kết với promoter của nhóm gen chống chịu các stress phi sinh
học, đó là các vị trí 66, 67, 69, 71, 73, 75, 79, 81, 88, 90, 93 (Hình 1.2B).
A
B
Hình 1.2. Đặc điểm trình tự amino acid suy diễn của trình tự mang mã số
BT092314 trên GenBank.
Bằng công cụ Tin sinh học, dựa trên bản đồ gen đậu tương đã xác định
được gen ứng cử viên GmDREB7 có vị trí trên NST số 12 (LOC100527471)
(Hình 3.1).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 1.3. Vị trí của gen GmDREB7 trên nhiễm sắc thể 12 của đậu tương
1.3. Vector biểu hiện gen thực vật và đánh giá hoạt động của vector chuyển
gen trên cây thuốc lá mô hình
Khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên các trình tự DNA xác định của
Agrobacterium vào hệ gen thực vật đã được sử dụng vào việc phát triển các
vector biểu hiện để biến nạp vào thực vật. Các vector này lợi dụng đặc tính bẩm
sinh của Agrobacterium là quá trình biến nạp trung gian (mediated
transformation process).
Ðặc điểm của kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium là
bất kỳ DNA nào đã tạo dòng đều có thể được chuyển vào hệ gen của tế bào
thực vật Hai lá mầm. Trước đây, loại vector thường được đề cập đến là vector
liên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên gần đây vector nhị thể (binary
vector) là phổ biến hơn.
Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần
riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA. Hệ vector được thiết kế bao gồm hai
plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T –
DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào
tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường
bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng
vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật. Để tái bản trong A.
tumefaciens, vector nhị thể được thiết kế gồm các phần sau: (i) Vị trí ghép nối
đa điểm; (ii) Đoạn khởi đầu tái bản ở cả E. coli và A. tumefaciens; (iii) Gen
chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật; (iv) Gen có khả năng vận
chuyển (oriV, oriT, trfA); (v) Đoạn T – DNA ngoại biên. Ngoài ra, còn một số
thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T – DNA [24], [5],
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
[34].
Vector chuyển gen pBI121 có kích thước 14,75 kb, được cấu trúc bởi các
thành phần như 35S-promoter, chứa gen GUS với cặp enzyme giới hạn
XbaI/SacI, gen NPTII mã hóa protein kháng kháng sinh kanamycin (Hình 1.4).
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121
Cây thuốc lá là cây trồng vừa có giá trị kinh tế, vừa là cây mô hình quan
trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học và trong sự phát triển ban đầu của
sinh học phân tử thực vật [43]. Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả tại Nhật
Bản (2002) đã phát hiện ra rằng, nguồn gốc của cT-DNA trong bộ gen của loài
thuốc lá Nicotiana glauca hoang dã là T-DNA của Ri plasmid loại mikimopine
(pRi) chứa trong Agrobacterium rhizogenes. Đây là bằng chứng rõ ràng đầu
tiên về mối quan hệ ký sinh – vật chủ trong quá trình tiến hóa ban đầu của cây
thuốc lá Nicotiana [42].
Thuốc lá là loại cây được sử dụng phổ biến nhất để biểu hiện gen chuyển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
từ nhiều loại sinh vật, bởi vì nó dễ trồng và dễ dàng biến đổi gen. Nó cũng cung
cấp lượng mô sống đáng kể và có hệ thống nuôi cấy tế bào được thiết lập tốt.
Nhiều protein vi khuẩn tham gia vào quá trình tổng hợp các sản phẩm thương
mại hiện đang được thiết kế để sản xuất trong thuốc lá. Enzyme vi khuẩn được
tổng hợp trong thuốc lá có thể tăng cường bảo vệ, chống lại các stress phi sinh
học và mầm bệnh [45]. Thuốc lá cũng được sử dụng như một mô hình cho tính
nhạy cảm với các bệnh thực vật, sinh tổng hợp pyridine alkaloid (như nicotine),
stress oxy hóa… [44].
Thuốc lá được sử dụng rộng rãi như một hệ thống cây mô hình trong
nghiên cứu chuyển gen vì nhiều lý do: Di truyền phân tử của nó được hiểu rõ,
lập bản đồ gen của nó gần như được hoàn tất,… Cây thuốc lá có thể sinh trưởng,
phát triển tốt trong ống nghiệm, trong điều kiện nhà kính và tạo ra một lượng
lớn sinh khối. Thuốc lá cũng được coi là một trong những hệ thống tốt nhất để
biến đổi lục lạp, giúp tăng cường hơn nữa hiệu quả đối với sự biểu hiện của
protein tái tổ hợp. Cây thuốc lá biến đổi gen cũng là mô hình lý tưởng cho
nghiên cứu các chức năng sinh học cơ bản, chẳng hạn như tương tác mầm bệnh,
phản ứng môi trường, điều hòa sinh trưởng và lão hóa [45].
Trong thực tế, nhiều nghiên cứu về biểu hiện mạnh của nhân tố phiên mã
DREB cảm ứng với stress đã được nghiên cứu nhằm mục đích kích hoạt sự
biểu hiện của các gen mục tiêu có trình tự DRE trong các promoter của chúng
và kết quả cho thấy cây chuyển gen có khả năng chống chịu stress tốt hơn cây
không chuyển gen.
Gen DREB1A có thể biểu hiện tốt ở nhiều cây trồng khác nhau. Sự biểu
hiện mạnh các AtDREB1A trong cây thuốc lá, cây lúa mì, cây lúa, cây lạc đã
chứng minh khả năng chịu hạn tốt hơn và tăng cường sự biểu hiện của gen LEA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ở trong điều kiện nhà kính [8], [19], [28].
Sự tác động đồng thời của hạn và nhiệt độ cao đến sinh trưởng của các cây
trồng mạnh mẽ hơn các stress đơn lẻ [25], [30], [31]. Phân tích sự phiên mã và
trao đổi chất ở cây thuốc lá, về mặt sinh trưởng, đã chỉ ra rằng phản ứng của
cây đối với sự kết hợp của nhân tố hạn và nhiệt độ cao một phần có sự chồng
chéo lên nhau, nhưng chính điều này cũng nhằm chống lại các stress đơn lẻ.
Gen DREB2A là một ví dụ cho vai trò điều hòa biểu hiện gen dưới sự tác động
đồng thời của hạn và nhiệt độ cao lên thực vật [31].
Trong một nghiên cứu khác, gen GmDREB2 được biểu hiện mạnh trong
môi trường có hạn, mặn, nhiệt độ thấp và ABA [13]. Trong cây thuốc lá chuyển
gen, sự biểu hiện của gen GmDREB2 đã làm tăng sự tích lũy hàm lượng prolin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
[20].
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Giống đậu tương DT2008 được sử dụng làm vật liệu phân lập gen do Viện
Di truyền Nông nghiệp cung cấp. DT2008 là giống lai giữa giống DT2001 và
giống HC100 (gốc Mexico) kết hợp với phương pháp đột biến thực nghiệm và
chọn lọc theo tiêu chuẩn thích ứng với chống chịu. Giống DT2008 có khả năng
chống chịu tổng hợp với nhiều yếu tố bất lợi trong sản xuất như hạn, úng, nhiệt
độ, đất nghèo dinh dưỡng,...
Cây thuốc lá Nicotinana tabacum K326 in vitro do Phòng thí nghiệm
Công nghệ tế bào thực vật thuộc Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm -
Đại học Thái Nguyên cung cấp, sử dụng để nhận gen.
2.1.2. Các loại vector và chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Vector tách dòng pBT, vector chuyển gen pBI121 chứa promoter 35S do
Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 do Phòng Công nghệ
Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam cung cấp.
2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
Các loại kít thao tác phân tử: Kít GeneJET PCR Purification để tinh sạch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
sản phẩm PCR, kít để tách chiết plasmid từ vi khuẩn. Các loại enzyme như
XbaI, SacI. Các loại kháng sinh: Kanamycin, rifamycine, cefotaxime. Các hóa
chất khác như yeast extract, agarose, sucrose, glucose, trypton, bacto pepton,
X-gal, EDTA, NaOH, KCl,...của các hãng Fermentas, Sigma, Invitrogen,
Amersham và một số hãng khác.
Các thiết bị sử dụng: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ),
máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy vortex (Mimishaker, IKA,
Đức), máy ly tâm và một số thiết bị hiện đại khác.
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Quá trình thí nghiệm được thực hiện từ 12/2017 đến tháng 2/2019.
Các thí nghiệm phân lập gen, thiết kế gen và vector biểu hiện được tiến
hành tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ gen và Phòng Công nghệ ADN ứng dụng thuộc Viện Công nghệ sinh học
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thí nghiệm chuyển gen được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công nghệ
tế bào thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
và Phòng thí nghiệm Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Khoa học-Đại học Thái Nguyên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu chia thành 4 nhóm chính: (1) Nhóm phương
pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB7; (2) Nhóm
phương pháp thiết kế gen GmDREB7, vector chuyển gen và tạo dòng vi khuẩn
A. tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen chứa gen GmDREB7; (3)
Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và (4)
Nhóm phương pháp phân tích, xử lý số liệu.
Để thực hiện mục tiêu của luận văn là phân tích được đặc điểm của gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương và thiết kế được vector biểu hiện thực
vật mang gen GmDREB7 của cây đậu tương. Các thí nghiệm được tiến hành
theo mô tả ở sơ đồ hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
2.3.1. Nhóm phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen
GmDREB7
2.3.1.1. Tách chiết RNA tổng số và nhân bản gen GmDREB7 từ cDNA
Nghiên cứu thông tin về trình tự nucleotide của gen GmDREB7 từ trình tự
nucleotide mang mã số BT092314 trên GenBank. Thiết kế cặp mồi PCR nhân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
gen GmDREB7. Cặp mồi PCR được thiết kế được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR
Cặp mồi PCR
Mục đích
Trình tự nucleotide 5’ 3’
Nhân bản đoạn gen
ATGTTAGCGAAAACCCATAACAAAG
GmDREB7 phân lập
DREB7-F/
từ giống đậu tương
DREB7-R
TCACCTTCCCCCATTCTCATGCT
DT2008 (561 bp)
Nhân bản đoạn gen
agaATGTTAGCGAAAACCCATAACA
XbaI-DREB7-F/
GmDREB7 nhân tạo
DREB7-SacI-R
ATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGT
(609 bp)
Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA: Sử dụng bộ kít Trizol
Reagents (hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ giống đậu tương
DT2008 theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Sử dụng bộ kít Maxima® First Strand
cDNA Synthesis của hãng Fermantas để tổng hợp cDNA từ RNA tổng số đã
tách chiết theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi DREB7-F/ DREB7-R đã thiết kế,
khuếch đại gen GmDREB7 từ cDNA. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên
gel agarose 1%.
2.3.1.2. Tách dòng gen GmDREB7
Tinh sạch gen đích: Sản phẩm PCR nhân gen GmDREB7 (cDNA) được tinh
sạch bằng bộ kít GeneJET PCR Purification của hãng Fermentas theo quy trình
chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Gắn đoạn cDNA vào vector tách dòng pBT: Sản phẩm tinh sạch PCR được
gắn vào vector pBT để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA với thành phần
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
và điều kiện phản ứng mô tả ở bảng 2.3.
Biến nạp vector tách dòng tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α: Duy
trì hỗn hợp gồm 10 µl vector tái tổ hợp và 100 µl dịch tế bào khả biến trong
nước đá 20 phút, sau đó chuyển ngay vào bể ổn nhiệt ở 42°C trong thời gian 1
phút 30 giây rồi đưa ngay vào nước đá trong thời gian 10 phút. Sau khi sốc
nhiệt, bổ sung 150 – 300 µl LB lỏng để nuôi phục hồi ở 37°C, lắc 200 rpm
trong vòng 1 giờ. Cấy trải 150 – 250 µl dịch khuẩn lên môi trường LB đặc có
bổ sung carbenicillin 50 mg/l, X-gal 30 mg/l và IPTG 100 µM, nuôi ở 37°C
trong vòng 16 giờ.
Bảng 2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi
Thành phần
trường
LB lỏng Bacto pepton 10 g/l + NaCl 10 g/l + Yeast Extract 5 g/l, pH = 7
LB đặc
LB lỏng + Agar 16g/l
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB7 vào vector tách dòng pBT
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
1 T4 DNA Ligase Buffer 10X 2,0
2 T4 DNA Ligase 5 u/μl 1,0
3 GmDREB7 100 ng/μl 12,0
4 pBT 100 ng/μl 3,0
5 Nước khử ion - 2,0
Tổng 20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Điều kiện phản ứng: 22oC trong 3 giờ
Sàng lọc các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-
PCR với cặp mồi đặc hiệu DREB-F/DREB-R. Tách chiết plasmid bằng kit
Plasmid Extraction theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp
bằng PCR với cặp mồi DREB7-F/DREB7-R.
2.3.1.3. Xác định trình tự nucleotide
Trình tự gen GmDREB7 được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide
tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.
2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế gen GmDREB7, vector chuyển gen và
tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 mang vector chuyển gen chứa gen
GmDREB7
Gen GmDREB7 nhân tạo được thiết kế dựa trên trình tự gen GmDREB7
(cDNA) phân lập từ giống đậu tương DT2008 và trình tự gen mang mã số
BT092314 trên GenBank. Thêm 8 nucleotide (GCTCTAGA) ở đầu 5’ là vị trí
cắt của enzyme XbaI và 7 nucleotide (GAGCTCG) ở đầu 3’ là vị trí cắt của
enzyme SacI.
Vector chuyển gen GmDREB7 được thiết kế theo hai bước cơ bản: Thiết
kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển GmDREB7 và gắn cấu trúc gen
GmDREB7 vào vector chuyển gen thực vật pBI121.
(1) Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển GmDREB7: Gen GmDREB7
được thiết kế trong vector pUC18 có kích thước 2,69 kb.
(2) Tạo vector chuyển gen thực vật pBI121-GmDREB7:
(i) Loại bỏ đoạn gen gus bằng cặp enzyme giới hạn XbaI và SacI
(ii) Lai ghép cấu trúc GmDREB7-cmyc vào vector pBI121 và tạo vector
chuyển gen chứa cấu trúc 35S-GmDREB7-cmyc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen thể hiện ở sơ đồ hình 2.2.
GmDREB7
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121_GmDREB7
2.3.3. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Chuẩn bị vật liệu biến nạp gen: Sử dụng lá thuốc lá trong bình cây làm vật
liệu nhận gen. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1cm2 và cảm ứng
trên môi trường tái sinh GM trong 48 giờ.
Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm: Tiến hành nuôi chọn lọc vi khuẩn A. tumefaciens
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
mang gen chuyển trong 15ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh
kanamycin 50mg/l và rifamycine 50mg/l ở 28oC, lắc 200rpm trong 48 giờ. Sau
đó, lấy 10ml dịch huyền phù tế bào trên và 50ml LB lỏng (không kháng sinh)
để nuôi phục hồi ở 28oC, lắc 200rpm đến khi OD600nm = 0,6 - 0,8 là đạt số lượng
tế bào tối ưu để biến nạp. Ly tâm dịch tế bào ở 4oC, 5000rpm trong 15 phút.
Hoà tan tế bào lắng vào 40ml dung dịch ½MS + AS 50μl đặt trong nước đá
lạnh.
Biến nạp: Cho các mảnh lá đã cảm ứng được ngâm trong dịch huyền phù vi
khuẩn 20 phút, thấm khô rồi chuyển lên môi trường GM không chứa kháng
sinh để đồng nuôi cấy trong tối 2 ngày.
Tái sinh đa chồi: Sau thời gian đồng nuôi cấy, các mảnh lá biến nạp được ngâm
trong ½MS + cefotaxim 400mg/l trong 10 phút để thực hiện rửa khuẩn, thấm
khô và chuyển lên môi trường GM có bổ sung kanamycin 50mg/l và cefotaxim
400mg/l.
Chọn lọc và kéo dài chồi: Sau 3 - 4 tuần, các cụm chồi được cắt tách nhỏ và
chuyển sang môi trường MS có bổ sung kanamycin 50mg/l và cefotaxim
400mg/l.
Ra rễ: Sau 4 - 5 tuần, các chồi phát triển cao khoảng 2 - 3cm thì được cắt và
chuyển sang môi trường ra rễ (RM) có bổ sung kanamycin 50mg/l và cefotaxim
400mg/l.
Ra bầu đất và nhà lưới: Sau 3 - 4 tuần, cây con ra rễ và phát triển hoàn chỉnh
có 3 - 4 lá thật thì cho ra bầu trấu : cát (tỷ lệ 1 : 1). Khi cây phát triển với 4 - 5
lá thì chuyển ra trồng trong nhà lưới.
Thành phần các loại môi trường sử dụng trong quy trình chuyển gen vào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
cây thuốc lá được thể hiện ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá
Hỗn hợp Thành phần cho 1 lít dung dịch
Stock I KNO3 1,9g + KH2PO4 0,17g + NH4NO3 1,65g + MgSO4 0,37g
Stock II CaCl2 0,44g
H3BO3 6,2mg + MnSO4.4H2O 22,3mg + CoCl2.6H2O 0,025mg
Stock III + CuSO4.7H2O 0,025mg + ZnSO4.7H2O 8,6mg +
Na2MoO4.2H2O 0,25mg + KI 0,83mg
Stock IV FeSO4 27,8mg + Na2EDTA 37,3mg
Myo-Inositol 100mg + Thiamine HCl 0,1mg + Pyridoxine HCl Stock V 0,5mg + Nicotic acid 0,5mg + Glycine 2mg
20ml stock I + 10ml/stock (II, III, IV, V) + glucose 35g + MS agarose 8g
½MS 10ml stock I + 5ml/stock (II, III, IV, V)
GM MS + BAP 1mg + sucrose 30g + agar 9g
* Ghi chú: Các môi trường đều được chuẩn pH = 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm
được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ngày.
RM MS + IBA 0,1mg + sucrose 30g + agar 9g
2.3.4. Nhóm phương pháp phân tích, xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu về phân tích trình tự gen được xử lý bằng phần mềm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
BLAST trong NCBI, BioEdit, DNA Star.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB7 PHÂN LẬP TỪ GIỐNG ĐẬU
TƯƠNG DT2008
3.1.1. Kết quả nhân bản, tách dòng và giải trình tự gen GmDREB7
Thiết kế cặp mồi PCR nhân bản gen GmDREB7
Nghiên cứu thông tin đoạn mã hóa của gen GmDREB7 mang mã số
BT092314.1 trên GenBank đã xác định được trình tự gen chứa đoạn mã hóa có
561 bp, mã hóa 186 amino acid. Trình tự đoạn mã hóa của gen mang mã số
BT092314.1 được chọn để thiết kế cặp mồi PCR nhân bản đoạn mã hóa của
gen GmDREB7, kết quả thể hiện ở hình 3.1. Theo kết quả của hình 3.1 cặp mồi
PCR nhân bản gen GmDREB7 được thiết kế là DREB7-F/ DREB7-R và có trình
DREB7-R: 5‘- TCACCTTCCCCCATTCTCATGCT -3‘.
tự nucleotide là: DREB7-F: 5‘- ATGTTAGCGAAAACCCATAACAAAG -3‘;
Đoạn DNA được nhân bản dự kiến có kích thước là 561 bp. Kết quả kiểm
tra trình tự nucleotide của cặp mồi DREB7-F/DREB7-R được thực hiện bằng
phần mềm BioEdit.
BT092314.1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế cặp mồi DREB7-F/DREB7-R
RNA tổng số được tách từ lá non của giống đậu tương DT2008. Bằng phản
ứng phiên mã ngược, cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số. Đoạn cDNA
GmDREB7 được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi DREB7-F/DREB7-R và kết
quả được kiểm tra bằng điện di được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại đoạn gen GmDREB7
từ cDNA của giống đậu tương DT2008. M: thang DNA 1 kb; 1, 2: băng điện
di đoạn gen GmDREB7 có kích thước gần 0,6 kb
Đoạn cDNA tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBT tạo vector tái
tổ hợp pBT_GmDREB7. Biến nạp cấu trúc pBT_GmDREB7 vào E.coli DH5α.
Tiến hành phản ứng colony-PCR với cặp mồi DREB7-F/DREB7-R để sàng lọc
các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pBT_GmDREB7 (Hình 3.3)
Tách chiết plasmid tái tổ hợp pBT_GmDREB7 và kiểm tra bằng PCR với
cặp mồi DREB7-F/DREB7-R và đem giải trình tự gen GmDREB7.
Kết quả giải trình tự nucleotide thu được đoạn cDNA có kích thước 561
bp, mã hóa 186 amino acid. Sử dụng chương trình phân tích BLAST trong
NCBI cho thấy đoạn cDNA phân lập từ mẫu giống đậu tương DT2008 có độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tương đồng 98% với hai trình tự mang mã số BT092314 và NM001249580,
tương đồng 96% với hai trình tự mang mã số BT089389 và NM001248537,
tương đồng 95% với trình tự mang mã số AY244760 của loài Glycine max –
đậu tương (Hình 3.4)
Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony PCR từ 4 dòng khuẩn
lạc. Làn điện di số 1, 2, 3, 4 là sản phẩm colony-PCR của các dòng khuẩn lạc;
M: thang DNA 1 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.4. Kết quả phân tích bằng BLAST trong NCBI
Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen GmDREB phân
lập từ giống đậu tương DT2008 với trình tự mang mã số BT092314 thể hiện ở
hình 3.5.
Kết quả so sánh hai trình tự nucleotide của gen GmDREB7 phân lập từ
giống đậu tương DT2008 với trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank ở
hình 3.5 cho thấy giữa hai trình tự có sự tương đồng 98% và chỉ có 10 vị trí
nucleotide sai khác, đó là các vị trí 9, 12, 13, 101, 103, 105, 106, 111, 143, 144
(Bảng 3.1). Như vậy, có thể nhận xét rằng gen GmDREB7 (cDNA) phân lập từ
mRNA của giống đậu tương DT2008 là trình tự mã hóa cho protein GmDREB7
chứa miền AP2 của đậu tương.
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB7
giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide mang mã số BT092314
trên GenBank
TT
Vị trí nucleotide
DT2008
BT092314
1
9
C
G
2
12
G
A
3
13
G
A
4
101
C
A
5
103
C
G
6
105
T
G
7
106
T
G
8
111
A
G
9
143
C
A
10
144
C
G
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.5. Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn mã hóa nhân tố phiên mã
GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008 so với trình tự nucleotide
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
mang mã số BT092314 trên GenBank.
Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein suy diễn từ gen GmDREB7
phân lập từ giống đậu tương DT2008 với trình tự amino acid của protein suy
diễn từ trình tự mang mã số BT092314 được thể hiện ở hình 3.6. Kết quả so
sánh cho thấy giữa hai trình tự có sự sai khác ở 5 vị trí amino acid, đó là các vị
trí số 5, 34, 35, 36, 48 (Bảng 3.2).
Thuộc tính chủ yếu của protein DREB là miền bảo thủ AP2 liên kết với
các nhân tố đáp ứng các stress từ ngoại cảnh. Phân tích trình tự amino acid
thuộc miền AP2 của DREB ở giống đậu tương DT2008 và trình tự mang mã số
BT092314 trên GenBank cho thấy, miền AP2 có 59 amino acid, từ vị trí amino
acid số 64 đến 122, trong đó có 11 vị trí amino acid liên kết với promoter của
nhóm gen chống chịu các stress phi sinh học. Miền AP2 của protein suy diễn
gen từ GmDREB phân lập từ giống đậu tương DT2008 và protein suy diễn từ
trình tự mang mã số BT092314 trên GenBank không có sự sai khác nào (Hình
3.6).
Bảng 3.2. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen
GmDREB7 giữa giống đậu tương DT2008 và trình tự nucleotide mang mã số
BT092314 trên GenBank
TT Vị trí DT2008 BT092314
1 5 A T
2 34 A D
3 35 P A
4 36 Y D
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
5 48 T K
Hình 3.6. Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB7 của giống đậu
tương DT2008 so với trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotide mang
mã số BT092314 trên GenBank. Ghi chú: : Trình tự amino acid của
miền AP2 có 59 amino acid, từ số thứ tự amino acid 64 đến 122.
3.1.2. Mối quan hệ di truyền giữa giống đậu tương DT2008 và các mẫu đậu
tương mang mã số BT092314, BT089389, NM 001249580, NM
001248527, AY244760 trên GenBank
Kết quả phân tích mối quan hệ giữa giống đậu tương DT2008 và các giống
đậu tương dựa trên trình tự nucleotide gen GmDREB7 mang mã số BT092314,
BT089389, NM001249580, NM001248537, AY244760 trên GenBank cho
thấy 6 giống đậu tương chia làm hai nhóm, mỗi nhóm có 3 giống với khoảng
cách di truyền là 2,4% và giống đậu tương DT2008 phân bố cùng nhóm với các
giống có trình tự nucleotide mang mã số NM00124580 và BT092314 (Hình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
3.7).
Kết quả phân tích mối quan hệ giữa giống đậu tương DT2008 với các
giống đậu tương có trình tự mang mã số BT092314, BT089389, NM
001249580, NM001248527, AY244760 trên GenBank dựa trên trình tự amino
acid của protein suy diễn và của miền AP2 được thể hiện ở hình 3.8 (A, B).
Hình 3.7. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của đoạn mã hóa
DREB phân lập từ giống đậu tương DT2008 và các trình tự mang mã số
BT092314, BT089389, NM 001249580, NM 001248527, AY244760 trên
GenBank.
Trên hình 3.8A cho thấy, khi dựa trên trình tự amino acid suy diễn thì các
giống đậu tương phân bố trong 2 nhóm với khoảng cách di truyền là 2,5% và
giống đậu tương DT2008 phân bố cùng với NM001249580 và BT092314.
Quan sát hình 3.8B, khi phân tích trình tự amino acid của miền AP2 đã
cho thấy DREB-2008 và BT092314, BT089389, NM 001249580, NM
001248527 phân bố cùng một nhóm, có tỷ lệ tương đồng là 100%. Miền AP2
của trình tự aminon acid suy diễn từ trình tự gen mang mã số AY244760 ở một
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nhánh và khoảng cách giữa hai nhóm là 0,9%.
A
B
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid suy diễn của
protein DREB từ giống đậu tương DT2008 và từ các trình tự nucleotide mang
mã số BT092314, BT089389, NM001249580, NM001248527, AY244760 trên
GenBank. Protein mang mã số NP001236509 suy diễn từ trình tự gen mang mã
số NM001249580; ACU16563 suy diễn từ BT092314; AAP83131 suy diễn từ
AY244760; NP001235466 suy diễn từ NM001248537; ACU13469 suy diễn từ
BT089389.
3.2. THIẾT KẾ GEN VÀ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT MANG
GEN GmDREB7
3.2.1. Thiết kế gen GmDREB7 nhân tạo
Đoạn gen GmDREB7 được thiết kế và tổng hợp nhân tạo dựa trên trình tự
nucleotide của gen GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008 và trình
tự mang mã số BT092314 trên GenBank. Gen GmDREB7 nhân tạo có 561
nucleotide, bổ sung 15 nucleotide là vị trí cắt của cặp enzyme XbaI/ SacI và 33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nucleotide mã hóa đuôi cmyc, tổng cộng là 609 nucleotide (Hình 3.9). Gen
GmDREB7 được thiết kế trong vector pUC18 có kích thước 2,69 kb (đã trình
bày ở hình 2.1).
3.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB7
Tạo vector chuyển gen pBI121_GmDREB7 được thực hiện theo sơ đồ đã
trình bày ở hình 2.1 (Chương 2). Sử dụng cặp enzyme XbaI/SacI để loại gen
GUS từ vector pBI121_GUS; đồng thời cũng sử dụng cặp enzyme XbaI/SacI
để cắt thu nhận gen GmDREB7 (609 bp) từ vector pUC18 (Hình 3.10). Sử dụng
enzyme nối T4 DNA ligase nối gen GmDREB7 vào vector chuyển gen pBI121
thành vector pBI121_GmDREB7 (Hình 3.11).
gctctagaATGTTAGCGAAAACCCATAACAAAGGGGATGGATCTAAGTCCCTGGCTAAGAT
ACTGGCAAAATGGAAAGAATATAATGCCCAGATTGATTCCAGCAGTGATGCGGATAAGCCA
GTTCGCAAAGTTCCTGCCAAGGGATCGAAGAAGGGGTGCATGAAAGGTAAAGGGGGCCCTG
AGAACTCGCGGTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGAAAGTGGGTTGCTGA
AATCCGAGAGCCAAACAGAGGCAATAGGCTTTGGCTAGGTACTTTCCCCACTGCCATTGGA
GCTGCCCTTGCATATGATGAAGCGGCCAGGGCAATGTACGGTTCCTGTGCCCGTCTCAACT
TTCCCAATGTTTCAGTTTCCAGTTTCTCTGAAGAATCTTCCAAAGATTCTCCGGTTGCGAA
TCATTGTGGTTCGTCAATGGCAGTGTCTGCAAACGAGTCCATGATTTCACCAAGTAACTCG
GGGGTAGGTGCAGAAGATGATGTTGATATGGAGCCCATTTCCTTATCCTTAACTGTAAAGC
ATGAGAATGGGGGAAGGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATTGAgagctcg
Hình 3.9. Trình tự đoạn gen GmDREB7 nhân tạo có 609 nucleotide. Ở đầu 5‘ có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
gctctaga là vị trí cắt của XbaI và ở đầu 3‘ có gagctcg là vị trí cắt của enzyme SacI
Hình 3.10. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt gen GmDREB7 trong vector
pUC18 và sản phẩm cắt vector pBI121 bằng cặp enzyme SacI và XbaI. Làn
điện di số 1: sản phẩm cắt vector pUC18_GmDREB7; Làn điện di số 2: thang
DNA 1 kb; Làn điện di số 3: sản phẩm cắt vector pBI121_GUS.
Hình 3.11. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121_GmDREB7 sử dụng cho chuyển gen
vào thuốc lá nhờ A. tumefaciens. LB: biên T-DNA trái; RB: biên T-DNA phải;
nptII: neomycin-phospo-transferase II mã hóa kanamycin; CaMV35S:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
promoter 35S có nguồn gốc từ virus khảm súp lơ; Gen GmDREB7 có 609 bp.
Vector chuyển gen pBI121_GmDREB7 được biến nạp vào vi khuẩn A.
tumefaciens chủng CV58. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen GmDREB7 trong
hai dòng vi khuẩn A. tumefaciens bằng phản ứng colony-PCR thu được đoạn
DNA có kích thước khoảng 0,6 kb tương ứng với kích thước của gen
GmDREB7 (Hình 3.12). Như vậy, kết quả phân tích cho thấy, chủng A.
tumefaciens tái tổ hợp mang gen GmDREB7 có thể sử dụng trong biến nạp tạo
cây thuốc lá chuyển gen.
Hình 3.12. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc
A.tumefaciens chủng CV58
3.3. CHUYỂN GEN VÀ PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN
GmDREB7 TRÊN CÂY THUỐC LÁ
3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB7 vào thuốc lá thông
qua A. tumefaciens
Thực hiện chuyển cấu trúc 35S-GmDREB7-cmyc vào cây thuốc lá N.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tabacum giống K326 thông qua chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 nhằm
mục đích đánh giá hoạt động của vector chuyển gen pBI121_GmDREB7 trên
cây mô hình. Vật liệu nhận gen là các mảnh lá có kích thước khoảng 1cm2 đã
được gây tổn thương và nuôi cấy trên môi trường cảm ứng MS trong 48 giờ
trước khi lây nhiễm và đồng nuôi cấy. Tiến hành biến nạp gen bằng cách ngâm
các mảnh lá đã cảm ứng vào dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 20 phút.
Quá trình chuyển gen GmDREB7 vào cây thuốc lá được thể hiện ở hình 3.13.
Hình 3.13. Hình mô tả quá trình biến nạp gen GmDREB7 và tái sinh tạo cây
thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật lây nhiễm A. tumefaciens.
A: Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn; B: Mảnh lá trên môi trường
đồng nuôi cấy; C: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọn
lọc; D: Tái sinh đa chồi; E: Các chồi trên môi trường ra rễ (RM); F,G: Cây
thuốc lá trên môi trường ra rễ sau 2 tuần; H: Ra cây trong bầu đất ở điều kiện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nhà lưới
Bảng 3.3 trình bày kết quả biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào thuốc
lá thông qua A.tumefaciens cho thấy, sau 3 lần biến nạp và chọn lọc bằng kháng
sinh, với 108 mảnh lá thuốc lá giống K326 thì có 96 mảnh lá tạo được cụm
chồi. Số chồi được tái sinh từ các cụm chồi là 265 chồi. Số chồi này được đưa
sang môi trường chọn lọc và kéo dài chồi. Số các cây sống sót được đưa vào
môi trường ra rễ là 202. Số cây ra rễ sống sót in vitro được đưa ra bầu đất và
lựa chọn 45 cây sinh trưởng tốt để trồng tại nhà lưới. Trong khi đó, ở lô ĐC0*,
30 mảnh lá không có mẫu nào sống sót được trong môi trường chọn lọc bằng
kháng sinh. Còn ở lô ĐC1* không chuyển gen thì từ 30 mảnh lá có 92 chồi
được tái sinh, số cây ra rễ sống sót in vitro là 86 được đưa ra bầu đất và lựa
chọn 20 cây sinh trưởng tốt trồng tại nhà lưới làm đối chứng.
Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB7 vào cây thuốc lá
Thí nghiệm và đối chứng Số mẫu biến nạp Số cây ra rễ Số mẫu tạo cụm chồi Số chồi được tái sinh Số cây trồng trong nhà lưới
ĐC0* 30 0 0 0 0
ĐC1* 30 24 92 86 20
Lần 1 36 32 88 68 15
Lần 2 36 34 95 74 15 Thí nghiệm
Lần 3 36 30 82 60 15
96 45 Tổng 108 265 202
Ghi chú: ĐC0*: Mẫu thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái
sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1*: Mẫu thuốc lá không chuyển gen được cấy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.
3.3.2. Phân tích sự có mặt và sự biểu hiện ở mức phiên mã của gen chuyển
GmDREB7 trên cây thuốc lá chuyển gen
Thu lá non từ 9 cây trong số 45 cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 trong
nhà lưới, tách chiết DNA tổng số. Phân tích DNA tổng số bằng điện di trên gel
0,8% đã cho kết quả DNA tổng số thu được đảm bảo chất lượng để thực hiện
PCR. Xác định sự có mặt của gen chuyển GmDREB7 bằng kỹ thuật PCR với
cặp mồi XbaI-DREB7F/ DREB7-SacI-R, kết quả được thể hiện ở hình 3.14.
0,6 kb
Hình 3.14. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen GmDREB7
trong các cây thuốc lá chuyển gen.
M: thang DNA 1 kb; (+): đối chứng dương-sản phẩm nhân gen GmDREB7 từ
vector chuyển gen PBI121_GmDREB7; (-): kết quả nhân gen GmDREB7 từ
cây không chuyển gen; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: kết quả nhân gen GmDREB7 từ
các cây thuốc lá chuyển gen
Kết quả ở hình 3.14 cho thấy, trong 9 cây thuốc lá chuyển gen được phân
tích thì có 7 cây cho kết quả dương tính với PCR, đó là các cây số 2, 4, 5, 6, 7,
8, 9 được ký hiệu là T0-2; T0-4; T0-5; T0-6; T0-7; T0-8; T0-9. Như vậy bước
đầu có thể nhận xét rằng gen chuyển GmDREB7 đã có mặt trong hệ gen của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
các cây thuốc lá chuyển gen.
Tiến hành thu lá non từ 7 cây dương tính với PCR, T0-2; T0-4; T0-5;
T0-6; T0-7; T0-8; T0-9 để tách chiết RNA tổng số, tạo cDNA và phân tích biểu
hiện gen GmDREB7 thông qua quá trình phiên mã bằng kỹ thuật RT-PCR với
cặp mồi XbaI-DREB7-F/ DREB7-R-SacI, kết quả thu được thể hiện ở hình 3.15.
0,6 kb
Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trong các cây thuốc lá
chuyển gen.
M: thang DNA 1 kb; (+): đối chứng dương-sản phẩm nhân gen GmDREB7 từ
vector chuyển gen PBI121_GmDREB7; (-): kết quả nhân gen GmDREB7 từ
cây không chuyển gen; 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9: kết quả nhân cDNA GmDREB7 từ 7
cây thuốc lá chuyển gen dương tính với PCR, tương ứng với T0-2; T0-4; T0-5;
T0-6; T0-7; T0-8; T0-9.
Kết quả ở hình 3.15 cho thấy trong 7 cây dương tính với PCR có 5 cây
cho sản phẩm RT-PCR, đó là các cây T0-2; T0-5; T0-6; T0-8; T0-9. Như vậy,
bước đầu đã xác định được gen chuyển GmDREB7 đã được biểu hiện ở mức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
phiên mã tổng hợp mRNA trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Đoạn gen GmDREB7 phân lập từ mRNA của giống đậu tương chịu hạn
DT2008 có kích thước là 561 bp, mã hóa chuỗi polypeptid gồm 186 amino acid.
Protein suy diễn từ đoạn gen GmDREB7 có miền AP2 gồm 59 amino acid với
11 vị trí amino acid liên kết với vùng promoter. Gen GmDREB7 của giống đậu
tương DT2008 có độ tương đồng từ 96% - 98% so với các trình tự BT092314,
NM001249580, BT089389, NM001248537, AY244760 trên GenBank.
1.2. Gen GmDREB7 nhân tạo đã được thiết kế dựa trên trình tự đoạn mã hóa
của gen GmDREB7 phân lập từ giống đậu tương DT2008, bổ sung 48
nucleotide tạo cấu trúc gen GmDREB7 có 609 bp. Vector chuyển gen thực vật
pBI121_GmDREB7 chứa gen GmDREB7 nhân tạo đã được thiết kế thành công
và biến nạp vào A. tumefaciens tạo được các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp
mang gen chuyển GmDREB7.
1.3. Cấu trúc mang gen chuyển GmDREB7 đã được biến nạp thành công vào
cây thuốc lá. Từ 108 mẫu biến nạp tạo được 265 chồi, chọn lọc bằng kháng sinh
đã chuyển 202 chồi sang môi trường ra rễ và 45 cây sinh trưởng tốt chuyển ra
môi trường tự nhiên trong điều kiện nhà lưới. Bằng phản ứng RT-PCR đã xác
định được gen chuyển GmDREB7 được biểu hiện ở 5 cây thuốc lá chuyển gen
ở thế hệ T0.
2. Đề nghị
Tiếp tục phân tích cây thuốc lá chuyển gen T0 bằng Southern blot, Real
time RT-PCR, Western blot và đánh giá khả năng chống chịu các stress hạn,
mặn của các cây chuyển gen GmDREB7.
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Bài báo đã xuất bản
1. Đỗ Thanh Kim Hường, Nguyễn Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Thơm, Phạm Thị
Thanh Nhàn, Vũ Thị Thu Thủy, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2018), “Đặc
điểm của gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB phân lập từ giống đậu tương chịu
hạn DT2008 của Việt Nam”, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học toàn quốc về nghiên
cứu và giảng dạy Sinh học ở Việt Nam lần thứ III, Quy Nhơn 5/2018, Nxb Khoa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
học tự nhiên và Công nghệ, tr. 107 - 114.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Ngô Thế Dân và cộng sự (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp.
2. Trần Thị Phương Liên (2010), Protein và tính chống chịu ở thực vật, Nxb
Khoa học tự nhiên và Công nghệ.
3. Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
4. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hường, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu
Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, Nxb Đại
học Quốc gia Hà Nội.
5. Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương
Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Nxb Nông Nghiệp
- Hà Nội.
Tiếng Anh
6. Ahmad P., Jaleel C.A., Salem M.A., Nabi G., Sharma S. (2010), “Roles of
enzymartic and nonenzymatic antioxidants in plants during abiotic stress”,
Crit Rev Biotechnol, 30, pp. 161 - 175.
7. Andeani J.K., Mohsenzadeh S. and Mohabatkar H. (2009), “Isolation and
Characterization of Partial DREB Gene from Four Iranian Triticum aestivum
Cultivars”, World Journal of Agricultural Sciences, vol. 5(5), pp. 561 - 566.
8. Bhatnagar-Mathur P., Devi M.J., Reddy D.S., Vadez V., Yamaguchi-
Shinozaki K., Sharma K.K. (2006), “Overexpression of Arabidopsis
thaliana DREB1A in transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) for
improving tolerance to drought stress“ (poster presentation). In: Arthur M.
Sackler, editor. Colloquia on “From Functional Genomics of Model
Organisms to Crop Plants for Global Health”, Washington, DC: National
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Academy of Sciences, April 3 - 5.
9. Charlson D.V., Hu X., Okimoto B., Purcell L.C. (2009), “Glycine max cultivar
Jackson drought responsive element binding protein 1 (DREB1)”, NCBI,
Accession FJ965342, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
10. Chen M., Wang Q.Y., Cheng X.G., Xu Z.S., Li L.C., Ye X.G., Xia L.Q.,
Ma Y.Z. (2007), “GmDREB2 a soybean DRE-binding transcription factor,
conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants”, Biochem.
Biophys. Res. Commun., 353, pp. 299 - 305.
11. Chen M., Ma Y., Xu Z., Li L., Wang Q. (2007), “Glycine max dehydration-
responsive element binding protein 5 (DREB5) mRNA”, complete cds., NCBI,
Accession EF583447, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
12. Chen M., Xu Z., Xia L., Li L., Cheng X., Dong J., Wang Q., Ma Y. (2009),
“Cold-induced modulation and functional analyses of the DRE-binding
transcription factor gene GmDREB3, in soybean (Glycine max L.)”, J. Exp.
Bot., 60(1), pp. 121 - 135.
13. Chen M., Wang Q.Y., Cheng X.G., Xu Z.S., Li L.C., Ye X.G., Xia L.Q., Ma
Y.Z. (2007), “GmDREB2 a soybean DRE-binding transcription factor,
conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants”, Biochem
Biophys Res Commun., 353:299 - 305.
14. Chen Y., Chen P. and de los Reyes B.G. (2004), “Analysis of the expression
of DREB1 gene orthologs in cultivated and wild species of soybean”, NCBI,
Accession AY802779, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
15. Clement M, Lambert A, Herouart D, Boncompagni E. (2008), “Identification
of new up-regulated genes under drought stress in soybean nodules”, Gene
426: 15 - 22.
16. Cushman J.C, Bohnert H.J. (2000), “Genomic approaches to plantstress
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tolerance”, Curr. Opin. Plant Biol., 3, pp. 117 - 124.
17. Díaz-Martín J., Almoguera C., Prieto P.D, Espinosa J.M., Jordano J. (2005),
“Functional interaction between two transcription factors involved in the
developmental regulation of a small heat stress protein gene promoter”, Plant
Physiol., 139, pp. 1483 - 1494.
18. Hussain S.S., Ali M., Ahmad M., Siddique K.H. (2011), “Polyamines: natural
and engineered abiotic and biotic stress tolerance in plants”, Biotechnol Adv.,
29, pp. 300 - 311.
19. Kasuga M., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K. (2004), “A combination of
the Arabidopsis DREB1A gene and stress inducible rd29A promoter
improved drought and low temperature stress tolerance in tobacco by gene
transfer”, Plant Cell Physiol., 45, pp. 346 - 350.
20. Kobayashi F., Ishibashi M., Takumi S. (2008), “Transcriptional activation
of Cor/Lea genes and increase in abiotic stress tolerance through expression
of a wheat DREB2 homolog in transgenic tobacco”, Transgenic Res.
(2008), 17(5), pp. 755 - 767.
21. Li X.P., Tian A.G. , G.Z. Luo, Z.Z. Gong, J.S. Zhang and S.Y. Chen (2005),
“Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic
stresses”, vol. 110(8), pp. 1355 - 1362.
22. Liu Y.W., Chen M., Xu Z.S., Zh G.Y., Li L.C., Ma Y.Z. (2007), “Glycine max
dehydration-responsive element binding protein 6 mRNA”, complete cds.,
NCBI, Accession EF551166, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
23. Narusaka Y., Nakashima K., Shinwari Z.K., Sakuma Y., Furihata T., Abe H.,
Narusaka M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2003), “Interaction
between two cis-acting elements, ABRE and DRE, in ABA-dependent
expression of Arabidopsis rd29A gene in response to dehydration and high-
salinity stresses”, The Plant J., 34, pp. 137 - 148.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
24. Matthews P.R., Wang M.B., Waterhouse P.M., Thornton S., Fieg S.J., Gubler
F., Jacobsen J.V. (2001), “Marker gene elimination from transgenic barley,
using co-transformation with adjacent ‘twin T-DNAs’ on stDNAard
Agrobacterium transformation vector”, Mol Breed, 7: pp. 195 - 202.
25. Mittler R. (2006), “Abiotic stress, the field environment and stress
combination”, Trends Plant Sci., 11, pp. 15 - 19.
26. Murray M.G., Thompson W.F. (1980), “Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA”, Nucleic Acids Res., 8(19), pp. 4321 - 4325.
27. Okam uro JK, Caster B, Villarroel R, Van Mon tagu M, Jofuku KD (1997),
“The AP2 domain of APETALA 2 defines a large new family of DNA binding
proteins in Arabidopsis”, Proc Natl Acad Sci USA 94: 7076 - 7081.
28. Pellegrineschi A., Reynolds M., Pacheco M., Brito R.M., Almeraya R.,
Yamaguchi-Shinozaki K., Hoisington D. (2004), “Stress induced expression
in wheat of the Arabidopsis thaliana DREB1A gene delays water stress
symptoms under greenhouse conditions”, Genome, 47, pp. 493 - 500.
29. Riechmann J.L., Heard J., Martin G., Reuber L., Jiang C.Z., Keddie J., Adam
L., Pineda O., Ratcliffe O.J., Samaha R.R., Crelman R., Pilgrim M., Broun P.,
Zhang J.Z., Ghandehari D., Sherman B.K, Yu G.L. (2000), “Arabidopsis
transcription factors: Genome-wide comparative analysis among eukaryotes”,
Science, 290, pp. 2105 - 2110.
30. Rizhsky L., Liang H., Mittler R. (2002), “The combined effect of drought
stress and heat shock on gene expression in tobacco”, Plant Physiol., 130,
pp. 1143 - 1151.
31. Rizhsky L., Liang H., Shuman J., Shulaev V., Davletova S., Mittler R.
(2004), “When defense pathways collide. The response of Arabidopsis to a
combination of drought and heat stress”, Plant Physiol., 134, pp. 1683 -
1696.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
32. Shinozaki K., Yamaguchi K.-Shinozaki (1996), “Molecular responses to
drought and cold stress”, Current Opinion in Biotechnology, vol. 7(2), pp. 161
- 167.
33. Silverstein KA, Graham MA, VandenBosch KA. (2006), “Novel paralogous
gene families with potential function in legume nodules and seeds”, Curr Opin
Plant Biol 9: 142 - 146.
34. Simoens C., Alliotte T., Mendel R., Muller A., Schiemannm J. Van
Lijsebettens M., Schell J., van Montagu M., DNA inze D. (1986), “A binary
vector for transferring genomic libraries to plants”, Nucl. Acids Res, 14, pp.
8073 - 8090.
35. Dao Xuan Tan, Ho Manh Tuong, Vu Thi Thu Thuy, Le Van Son, and Chu
Hoang Mau (2015), “Cloning and Overexpression of GmDREB2 Gene from a
Vietnamese Drought-resistant Soybean Variety”, Braz. Arch. Biol. Technol,
58: 651 - 657.
36. Tang M, Sun J, Liu Y, Chen F, Shen S. (2007), “Isolation and functional
characterization of the JcERF gene, a putative AP2/EREBP domain
containing transcription factor, in the woodyoil plant Jatrophacurcas”, Plant
Mol Biol, 63: 419 - 428.
37. Tran LS, Mochida K. (2010), “Functional genomics of soybean for
improvement of productivity in adverse conditions”, Funct Integr
Genomics, 10: 447 - 462.
38. Tran LS, Nguyen HT. (2009), “Future biotechnology of legumes”, In:
Emerich WD and Krishnan H, eds. Nitrogen Fixation in Crop Production.
Madison, WI: ASA-CSA-SSSA. pp. 265 - 307.
39. Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai and La Cao Thang (2008),
“Transformation efficiencies of the soybean variety PC19 [Glycine max (L.)
Merrill] using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
method”, Omonrice 16: 1 - 8.
40. Xiu-xiang Zhang, Yu-juan Tang, Qi-bin Ma, Cun-yi Yan, Ying-hui Mu,
Hai-cui Suo, Lai-hui Luo, Hai Nian (2013), “OsDREB2A, a Rice
Transcription Factor, Significantl Affects Salt Tolerance in Transgenic
Soybean”, PLOS ONE 8 : 1 - 8, e83011.
41. Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (2006), “Transcriptional regulatory
networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold
stresses”, Annu. Rev. Plant Biol., 57, pp. 781 - 803.
Internet
42. Suzuki K. (2002), Tobacco plants were transformed by Agrobacterium
rhizogenes infection during their evolution, Plant J.,
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12472692, tháng 12/2002.
43. Edwards K.D. (2017), A reference genome for Nicotiana tabacum enables
map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization
efficiency, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5474855/,
ngày 19/06/2017.
44. Sandra Knapp, Details for species Nicotiana tabacum,
https://solgenomics.net/organism/941/view.
45. Sandro Jube (2007), Expression of bacterial genes in transgenic tobacco:
methods, applications and future prospects,
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2742426/, ngày
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
15/07/2007.
