Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ............... ***...............

Hoàng Đăng Sáng

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ĐỘT BIẾN CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO BẰNG CHIẾU XẠ GAMMA KẾT HỢP VỚI XỬ LÝ KHÁNG SINH

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. ĐỖ THỊ HUYỀN ThS. TRẦN BĂNG DIỆP

LỜI CẢM ƠN Hà Nội - 2018

Để hoàn thành nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, lời đầu tiên tôi xin

chân thành cảm ơn sâu sắc đến ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn khoa học, ngƣời thầy

đã chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu - ThS. Trần Băng Diệp

và ngƣời thầy cho tôi những ý kiến quí báu - TS. Đỗ Thị Huyền, các cô đã giúp tôi

trong quá trình hoàn thiện luận văn. Ngoài ra tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy,

Cô giảng dạy đã cho tôi nhiều kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệm nghiên cứu quý báu.

Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên

sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo

điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.

Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới lãnh đạo Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội,

Viện Năng lƣợng nguyên tử Việt Nam và anh chị em đồng nghiệp tại phòng Nghiên

cứu Công nghệ bức xạ đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm việc,

học tập và hoàn thiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên và

tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu.

Đề tài “Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh

protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh” đã nhận đƣợc sự

hỗ trợ rất lớn từ đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ cấp Bộ, mã số

ĐTCB/01/15/TTCX, do Ths. Trần Băng Diệp làm chủ nhiệm./.

Hà Nội, tháng 11 năm 2018

Hoàng Đăng Sáng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi.

Các số liệu và tài liệu đƣợc trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên

cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã đƣợc công bố trƣớc đó.

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Hà Nội,tháng 11 năm 2018 Học viên Hoàng Đăng Sáng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

: Adenosine triphosphate

ATP Khuẩn lạc KKS- 0,2 : Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung

Khuẩn lạc KKS- 2

rifampicin nồng độ 0,2 µg/ml : Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung rifampicin nồng độ 2 µg/ml

Khuẩn lạc KKS- 20 : Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung

streptomycin nồng độ 20 µg/ml

Khuẩn lạc KKS- 200 : Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng bổ sung

DNA EDTA GLP – 1 streptomycin nồng độ 200 µg/ml : Deoxyribonucleic acid : Ethylendiamin tetraacetic acid : Glucagon – like peptide – 1

KS MMP MT PCR ppGpp : Kháng sinh : Matrix metallo protease : Môi trƣờng : Polymerase chain reaction : Guanosine – 5‟diphosphate – 3‟diphosphat

RNA RNAP sp. TB tRNA VK VSV : Ribonucleic acid : RNA polymerase : Species : Tế bào : RNA vận chuyển : Vi khuẩn : Vi sinh vật

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................................ 1

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................................... 4

1.1. PROTEASE ............................................................................................................................................ 4

1.1.1. Giới thiệu chung ........................................................................................................ 4

1.1.2. Phân loại protease ..................................................................................................... 4

1.1.3. Nguồn thu protease................................................................................................. 6

1.1.4. Ứng dụng của protease .............................................................................................. 8

1.1.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp ............................................................................. 8

1.1.4.2. Trong nghiên cứu và trị liệu ............................................................................ 10

1.1.4.3. Trong nông nghiệp ............................................................................................ 11

1.2. BACILLUS SUBTILIS VÀ PROTEASE CỦA BACILLUS ................................................... 12

1.2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis ................................................................................. 12

1.2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại ....................................................................... 12

1.2.1.2. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên .................................... 12

1.2.1.3. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 12

1.2.1.4. Đặc điểm sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy ................................................. 13

1.2.1.5. Bào tử và khả năng tạo bào tử ....................................................................... 14

1.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp protease ở Bacillus subtilis ................ 15

1.2.2.1. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng ....................................... 15

1.2.2.2. Ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp protease ...... 17

1.2.2.3. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy ............................................................ 18

1.3. PHƢƠNG PHÁP TĂNG CƢỜNG SẢN XUẤT SẢN PHẨM THỨ CẤP (PROTEASE) VÀ CÔNG NGHỆ RIBOSOME ............................................................................... 18

1.3.1. Công nghệ đáp ứng lại của VSV ............................................................................ 18

1.3.2. Công nghệ gen ......................................................................................................... 19

1.3.2.1. Phƣơng pháp gây đột biến ................................................................................ 19

1.3.2.2. Tái tổ hợp di truyền ........................................................................................... 20

1.3.3. Công nghệ trao đổi chất .......................................................................................... 20

1.3.4. Công nghệ ribosome ................................................................................................ 21

1.4. TƢƠNG TÁC CỦA BỨC XẠ ION HÓA VỚI TẾ BÀO – ỨNG DỤNG BỨC XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VI SINH VẬT ................................................... 24

1.4.1. Quá trình gây hiệu ứng sinh học của bức xạ ion hóa .............................................. 24

1.4.1.1. Các quá trình xảy ra sau khi bức xạ đi vào tổ chức sinh học ....................... 24

1.4.1.2. Hiệu ứng sinh học gây bởi bức xạ ion hóa ..................................................... 26

1.4.2 Ứng dụng bức xạ ion hóa trong gây tạo đột biến ở vi sinh vật ............................ 27

PHẦN II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 30

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ ................................................................................................. 30

2.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................................ 30

2.1.2. Hóa chất .................................................................................................................... 30

2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................................... 31

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................. 31

2.2.1. Bảo quản và giữ giống ............................................................................................. 31

2.2.2. Xử lý chiếu xạ .......................................................................................................... 32

2.2.2.1. Nuôi cấy huyền dịch tế bào .......................................................................... 32

2.2.2.2. Chiếu xạ dung dịch nuôi cấy: ....................................................................... 32

2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật ...................................................................... 32

2.2.4. Định tính và định lƣợng protease ........................................................................... 33

2.2.4.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch ........................................................... 33

2.2.4.2. Phƣơng pháp Anson cải tiến ............................................................................. 34

2.2.5. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ .. ....................................................................................................................... 36

2.2.6. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ kết hợp với kháng sinh ....................................................................................................... 36

2.2.7. Xác định đột biến .................................................................................................... 37

2.2.7.1. Thiết kế mồi và xử lý số liệu ............................................................................... 37

2.2.7.2. Khuếch đại trình tự gen rpoB và rpsL12 ......................................................... 38

2.2.7.3. Tinh sạch sản phẩm PCR .................................................................................. 38

2.2.7.4. Phƣơng pháp điện di DNA ............................................................................... 38

2.2.7.5. Giải trình tự ........................................................................................................ 39

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................................... 40

3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN ................................................................................ 40

3.1.1. Tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có hoạt tính cao và ổn định ....... 40

3.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh protease của các chủng Bacillus subtilis ........................................................................................................................ 42

3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG VK BACILLUS SUBTILIS VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHÚNG .................................................... 44

3.2.1. Đánh giá quá trình sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis ............... 44

3.2.2. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót của các chủng Bacillus subtilis .................................................................................................................. 45

3.2.3. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh protease của các chủng Bacillus subtilis .................................................................................................................. 47

3.3. XỬ LÝ CHIẾU XẠ KẾT HỢP SỬ DỤNG KS GÂY ĐỘT BIẾN ĐỊNH HƢỚNG TỚI CÁC GEN MÃ CHO SẢN PHẨM LIÊN QUAN TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ......................................................................... 49

3.3.1.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng streptomycin ở các chủng Bacillus subtilis ............................................................................................................... 50

3.3.1.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ các chủng kháng xạ và kháng streptomycin ........................................................................ 51

3.3.2. Xử lý chiếu xạ kết hợp với rifampicin .................................................................. 55

3.3.2.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng rifampicin ở các chủng Bacillus subtilis ............................................................................................................... 55

3.3.2.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ các khuẩn lạc kháng xạ và kháng rifampicin ....................................................................... 56

3.4. XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC GEN rpoB, rpsL Ở CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO HƠN CHỦNG GỐC ........................................................... 59

3.4.1. Khuếch đại các gen rpoB và rpsL ở các chủng gốc, các khuẩn lạc sinh protease cao hơn chủng gốc .............................................................................................. 59

3.4.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ các chủng gốc và khuẩn lạc sinh protease cao ............................................................................................................................................. 59

3.4.2.2. Khuếch đại các gen rpoB và rpsL từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR ................................................................................................................................................... 61

3.4.2.3.Tinh sạch sản phẩm PCR khuếch đại các gen rpoB và rpsL để giải trình tự xác định đột biến ..................................................................................................... 61

3.4.2.4. Giải trình tự gen rpoB của 2 chủng thuần và các khuẩn lạc sinh protease vƣợt trội ..................................................................................................................................... 62

3.4.2.5. Giải trình tự gen rpsL của 2 chủng thuần và các chủng đột biến ................ 66

3.4.2.6. Phân tích so sánh kết quả giữa kiểu đột biến, vị trí đột biến với khả năng sinh protease ............................................................................................................................. 68

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 70

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN..............73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................................... ..73

PHỤ LỤC .................................................................................................................................................. ..81

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vị trí hoạt động và phân loại protease ........................................................ 4

Hình 1. 2. Vai trò protease trong nghiên cứu ung thƣ ................................................... 10

Hình 1.3. Thị phần sử dụng proteinase trong nghiên cứu - trị liệu ........................... 11

Hình 1.4. Tế bào VK Bacillus subtilis quan sát dƣới kính hiển vi .......................... 13

Hình 1.5. Quá trình Bacillus subtilis sinh nội bào tử quan sát dƣới kính hiển vi ............ 14

Hình 1.6. Cơ chế tác động ppGpp làm tăng lƣợng sản phẩm thứ cấp của ribosome .......... 21

Hình 1.7. Công nghệ ribosome. ................................................................................ 22

Hình 1.8. Cấu trúc tiểu phần β của RNAP ở Escherichia coli, Streptomyces

coelicolor, Bacillus subtilis, Mycobacterium leprae. ............................................... 23

Hình 1.9. Tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa tới DNA ................... 24

Hình 1.10. Các loại tổn thƣơng do tác động của bức xạ ion hóa trên DNA .................... 26

Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thử hoạt tính protease ...................................................... 34

Hình 3.1. Vòng phân giải casein của 09 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh

protease...................................................................................................................... 40

Hình 3.2. Vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease cao ............ 41

Hình 3.3. Hoạt độ protease của các chủng Bacillus subtilis tuyển chọn .................. 41

Hình 3.4. Kích thƣớc vòng phân giải casein bởi protese của các chủng Bacillus subtilis tạo ra tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau ................................................. 42

Hình 3.5. Hoạt tính protease của các chủng Bacillus subtilis đƣợc kiểm tra ngay sau khi thu và sau bảo quản 48 giờ .................................................................................. 43

Hình 3.6. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis tiềm năng ........ 44

Hình 3.7. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng VK Bacillus subtilis sống sót trong dịch nuôi cấy và liều chiếu xạ ........................................................................................... 46

Hình 3.8. Tần số đột biến kháng streptomycin 20 µg/ml của 03 chủng Bacillus

subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau .............................................. 50

Hình 3.9. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần và

của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 300 Gy .............................................................................................................................. 53

Hình 3.10. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần

và của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 500

Gy .............................................................................................................................. 54

Hinh 3.11. Tần số đột biến kháng rifampicim 0,2 µg/ml của 03 chủng Bacillus subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau .............................................. 55

Hình 3.12. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5 thuần và của các khuẩn lạc kháng rifampicin ..................................................................... 57

Hình 3.13. Vòng phân giải casein của một số khuẩn lạc Bacillus subtilis H12 kháng

xạ và kháng rifampicin .............................................................................................. 58

Hình 3.14. Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ các chủng B.subtilis trên gel

agarose 0,8 %. ............................................................................................................ 60

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rpoB (A) và gen rpsL (B) từ

các chủng B.subtilis trên gel agarose 1,5 % ................................................................. 61

Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR tinh sạch tƣơng ứng với đoạn gen rpoB

và rpsL trên gel agarose 1,5 %. ................................................................................. 62

Hình 3.17. So sánh trnh tự amino acid của tiểu phần β – RNA polymerase đƣợc mã

hóa từ gen rpoB ở 2 chủng thuần Bacillus subtilis B5 và Bacillus subtilis H12. ..... 63

Hình 3.18. So sánh trình tự nucleotide của gen rpoB ở 2 chủng thuần Bacillus subtilis B5 và Bacillus subtilis H12. ......................................................................... 63

Hình 3.19. Trình tự gen rpoB của chủng thuần (B5_rpoB) với chủng đột biến 609 (rpoB-M).................................................................................................................... 64

Hình 3.20. Trình tự gen rpoB của chủng thuần (H12) với chủng đột biến 2, chủng 6 và chủng 1379 ........................................................................................................... 65

Hình 3.21. So sánh trình tự nucleotide của gen rpsL ở 2 chủng thuần Bacillus

subtilis B5 và Bacillus subtilis H12 .......................................................................... 66

Hình 3.22. Trình tự gen rspL của chủng thuần (B5_rpsL) với chủng đột biến

301_rpsL, chủng 321_rspL và chủng 609_rpsL. ...................................................... 67

Hình 3.23. Trình tự gen rpsL của chủng thuần (H12_rpsL) với chủng đột biến

2_rpsL, chủng 19_rpsL và chủng 1904_rpsL. .......................................................... 67

Hình 3.24. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng

thuần B5 và chủng đột biến 609-B5 ............................................................................ 68

Hình 3.25. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng thuần B5 và chủng đột biến 533-B5.................................................................................68

Hình 3.26. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở chủng thuần H12 và chủng đột biến 19-H12 ......................................................................... 69

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chủng VSV có khả năng tổng hợp protease cao .............................. 7

Bảng 1.2. Phản ứng sinh hóa của VK Bacillus subtilis ................................................ 13

Bảng 2.1. Các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào

................................................................................................................................... 30

Bảng 2.2. Tỷ lệ các hóa chất cần pha cho xây dựng đƣờng chuẩn tyrosin ............... 35

Bảng 2.3. Các bƣớc chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính ........................................ 35

Bảng 2.4. Trình tự nucleotide của các mồi dùng trong nghiên cứu .......................... 37

Bảng 2.5. Thành phần và chƣơng trình PCR khuếch đại trình tự hai gen rpoB và

rpsL từ DNA tổng số ................................................................................................. 38

Bảng 3.1. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 09 chủng Bacillus subtilis có khả

năng sinh protease ..................................................................................................... 40

Bảng 3.2. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease

................................................................................................................................... 41

Bảng 3.3. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao của 3 chủng Bacillus subtilis tại các liều

chiếu xạ khác nhau .................................................................................................... 48

Bảng 3.4. Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 20 µg/ml có khả năng sinh

protease cao từ các chủng Bacillus subtilis B5 chiếu xạ ........................................... 52

Bảng 3.5. Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 200 µg/ml có khả năng sinh

protease cao từ các chủng Bacillus subtilis B5 kháng xạ và kháng streptomycin 20

µg/ml ......................................................................................................................... 53

Bảng 3.6. Số lƣợng khuẩn lạc tiềm năng kháng rifampicin 0,2 µg/ml sinh protease cao đƣợc sàng lọc từ các chủng Bacillus subtilis chiếu xạ ....................................... 56

Bảng 3.7. Các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease vƣợt trội ....... 59

Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ (OD) ở bƣớc sóng 260 nm trên máy Nano Drop ......................................................... 60

Bảng 3.9. Danh sách các khuẩn lạc có đột biến ở gen rpoB. Vị trí đột biến đƣợc chỉ

ra trên kết quả trình tự ............................................................................................... 65

Bảng 3.10. Tổng hợp các đột biến xuất hiện trên gen rpoB các chủng gây đột biến

chọn lọc và hoạt tính protease của các chủng này....................................................69

MỞ ĐẦU

Protease là nhóm enzyme có chức năng phân giải các liên kết peptide của protein để tạo thành các amino acid đơn lẻ. Với tiềm năng ứng dụng to lớn trong

nhiều lĩnh vực đời sống nên protease đang thu hút mối quan tâm của nhiều nhà

khoa học cũng nhƣ các công ty hóa dƣợc lớn trên thế giới. Theo thống kê, hiện nay protease chiếm đến 65% sản phẩm enzyme thƣơng mại toàn cầu và doanh thu

ƣớc tính có thể đạt 2.767 triệu bảng Anh vào năm 2019. …………..

(http://www.prnewswire.co.uk/news-releases/protease-enzymes-market).

Vi sinh vật, đặc biệt là chủng vi khuẩn Bacillus là nguồn nguyên liệu thích

hợp để sản xuất protease ở quy mô công nghiệp nhờ việc thu nhận sản phẩm dễ dàng, nuôi cấy đơn giản và đặc biệt protease của chủng vi khuẩn này có hoạt tính ổn

định ở các điều kiện pH, nhiệt độ cao (Olajuyigbe và Ajele, 2005). Tuy nhiên, các

chủng Bacillus tự nhiên thƣờng cho năng suất sinh protease không cao và vì thế

việc tạo ra các thể đột biến có khả năng sinh sản phẩm thứ cấp vƣợt trội là một lựa

chọn lý tƣởng cho ngành công nghiệp sản xuất protease.

Trong tự nhiên, tỷ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh vật và nằm trong khoảng từ 10-10 đến 10-6. Tỷ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10-5 đến 10-1 (Davati và cs, 2013). Các tác nhân vật lý nhƣ: các tia X, tia , notron có bƣớc sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao. Các tia

phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy DNA, thay đổi cấu trúc của

DNA hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi DNA.

Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt

tính của vi sinh vật (Awan, 2011).

Nhiều nghiên cứu cho thấy một số thể đột biến kháng kháng sinh ở vi sinh vật có thể tăng cƣờng sản xuất sản phẩm thứ cấp nhƣ enzyme, sắc tố, kháng sinh

(Ochi, 2007; Wang và cs, 2008; Ochi và Hosaka, 2013) cũng nhƣ tăng khả năng chịu hợp chất độc hại (Hosokawa và cs, 2002). Ở Bacillus subtilis, đột biến kháng streptomycin làm tăng lƣợng sản phẩm enzyme α – amylase lên 20 – 30% và lƣợng sản phẩm cũng tăng từ 1,5 đến 2 lần với thể đột biến kháng rifampicin (Kurosawa và cs, 2006). Cơ chế phân tử liên quan đƣợc phân tích, đánh giá trong nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tác động này chủ yếu theo hai con đƣờng chính là gây đột biến gen rpsL mã hóa cho protein ribosome S12 và gây đột biến gen rpoB mã hóa cho tiểu phần β của RNAP (Lai và cs, 2002; Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013;

Wang và cs, 2008). Đây cũng là cơ sở cho sự ra đời của công nghệ ribosome

(Ribosome Engineering), một kỹ thuật khá mới sử dụng khả năng kháng kháng sinh

làm gia tăng hoạt tính của các ribosome tham gia dịch mã tăng sinh tổng hợp

protein. Nhƣ vậy gen đích không hề bị cải biến nhƣng khả năng sinh tổng hợp sản phẩm của gen đƣợc tăng lên nhờ các đột biến liên quan đến bộ máy tổng hợp

ribosome. Kỹ thuật này đã chứng minh đƣợc tính hiệu quả, có thể làm tăng khả

năng sinh tổng hợp lên hàng chục, thậm chí hàng trăm lần. Trong khi, theo báo cáo

của một số công ty công nghệ sinh học trên thế giới, đa số các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có năng suất cao hơn chủng tự nhiên không quá vài lần, một số ít trƣờng hợp

đạt đƣợc vài chục lần (Ochi và cs, 2013). Ngoài ra, một số sản phẩm dùng để sản

xuất thực phẩm hoặc dùng vào mục đích bảo quản thực phẩm chƣa cho phép sử

dụng các protein tái tổ hợp. Việc áp dụng công nghệ ribosome sẽ giúp khắc phục

những hạn chế này.

Rõ ràng, kỹ thuật sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng là tƣơng đối

đơn giản, hiệu quả và đặc biệt chi phí thấp so với công nghệ gen. Tuy nhiên, thời

gian sàng lọc đột biến ribosome khá dài, tốn nhiều công sức vì vậy việc sử dụng kết hợp kháng sinh với xử lý chiếu xạ đƣợc xem là một giải pháp nhằm làm tăng áp lực

chọn lọc, giảm thời gian sàng lọc, tăng tần suất thu đƣợc thể đột biến mong muốn,

đặc biệt là tăng khả năng kháng với kháng sinh của vi sinh vật (De Groot và cs,

2005; Al-Sudany và cs, 2010).

Nhƣ vậy, việc kết hợp giữa gây đột biến gen bằng phóng xạ và sử dụng

kháng sinh có thể giúp tạo ra chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme

cao hơn chủng tự nhiên nhiều lần, giúp tăng khả năng ứng dụng thực tiễn của

nghiên cứu. Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo

chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ

gamma kết hợp với xử lý kháng sinh”

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Sàng lọc một số chủng Bacillus subtilis nguồn gốc tự nhiên có hoạt

tính sinh protease từ một số phòng thí nghiệm trong nƣớc.

Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả của xử lí chiếu xạ tới chủng vi khuẩn Bacillus

subtilis và khả năng sinh tổng hợp protease của chúng.

+ 2.1: Xử lý chiếu xạ các chủng Bacillus subtilis từ nội dung 1.

+ 2.2: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ với tốc độ sinh trƣởng.

+ 2.3: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ và khả năng sinh protease.

+ 2.4: Xác định liều chiếu xạ thích hợp để có đƣợc tỷ lệ đột biến sinh protease

cao.

Nội dung 3: Xử lí chiếu xạ kết hợp sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng tới

các gen mã cho sản phẩm liên quan đến quá trình sinh tổng hợp protease của chủng

Bacillus subtilis

+ 3.1: Sàng lọc các chủng sau chiếu xạ có khả năng chống chịu kháng sinh

do bị đột biến trên các gen tham gia tổng hợp ribosome.

+ 3.2: Sàng lọc các chủng Bacillus subtilis chịu bức xạ và kháng kháng sinh

có khả năng sinh protease.

+ 3.3: Xác định liều chiếu xạ và nồng độ kháng sinh thích hợp để thu đƣợc

dòng đột biến có khả năng tăng sinh tổng hợp protease cao.

Nội dung 4: Xác định đột biến trên các gen rpoB và rpsL ở các chủng vi sinh có

khả năng sinh protease cao hơn chủng gốc.

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. PROTEASE

1.1.1. Giới thiệu chung

Protease là enzyme thủy phân liên kết peptide giữa các amino acid của phân

tử protein tạo thành các amio acid đơn lẻ (Hình 1.1) (http://protease.burnham.org). Protease đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng từ rất lâu trên thế giới, trong đó

protease tiêu hoá đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học

ngƣời Pháp, Reaumur đã bắt đầu nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày

và sau đó Schwann đã gọi chất này là pepsin. Năm 1857, Corvisart đã tách đƣợc trypsin, loại protease thứ hai từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận đƣợc ở

dạng chế phẩm (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998).

Hình 1.1. Vị trí hoạt động và phân loại exopeptidase

(http://protease.burnham.org).

1.1.2. Phân loại protease

Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

(López-Otín, 2007).

* Exopeptidase: Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide,

exopeptidase đƣợc phân chia thành hai loại:

- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu amine tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra các amino acid đơn lẻ, các

dipeptide hoặc tripeptide.

- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu carboxyl của chuỗi polypeptide và giải phóng ra amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide.

* Endopeptidase: Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, exopeptidase

đƣợc chia thành 5 nhóm (http://protease.burnham.org):

- Serine protease là những protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động là –OH của serine. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin gồm các enzyme động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, elastase (López-Otín, 2007). Nhóm subtilisin gồm hai loại enzyme là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN (Carter, 1989).

Các serine protease thƣờng hoạt động mạnh ở pH 9 – 11 và có tính đặc

hiệu cơ chất tƣơng đối rộng.

- Cysteine protease là các protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động là cysteine. Nhóm này bao gồm các protease thực vật nhƣ papayin, bromelin, một vài protease động vật và protease ký sinh trùng (López-Otín, 2007). Các

cysteine protease thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ

chất rộng.

- Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin (López-Otín, 2007). Các aspartic protease thƣờng có hai

gốc aspactic acid bảo thủ tham gia xúc tác nằm trong trung tâm hoạt

động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH axit.

- Threonine protease: Các threonine protease tƣơng tự nhƣ serine protease nhƣng chúng chứa gốc xúc tác là amino acid threonine trong trung tâm

hoạt động. Threonine protease chỉ đƣợc biết đến từ sau năm 1995, cơ chế phân cắt các liên kết peptide của chúng dựa trên việc tạo ái lực với

protein thông qua các amino acid quan trọng trong trung tâm hoạt động

tạo ra các amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide (López-Otín, 2007).

- Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật bậc cao hơn. Phân biệt với các enzyme khác, các metallo protease chỉ hoạt động khi liên kết với ion kim loại, chủ yếu là kẽm nên còn có tên là zinc metallo protease. Số ít protease khác thuộc nhóm này liên kết với coban thay vì kẽm khi tham gia phản ứng xúc tác. Các metallo protease hoạt động ở vùng pH trung

tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA (Fox, 1991).

Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: Acidic protease: là các protease hoạt động ở pH 2–4; chúng có nhiều ở tế bào

động vật, nấm men, nhƣng ít thấy ở vi khuẩn (Fox, 1991).

Protease trung tính là các protease hoạt động ở pH 7–8 nhƣ papain từ đu

đủ, bromelain từ dứa, và hầu hết protease có nguồn gốc động vật.

Protease kiềm là các protease hoạt động ở pH 9–11 nhƣ alkaline

protease, serine protease, protease đƣợc sản xuất bởi Bacillus sp. (López-Otín, 2007).

1.1.3. Nguồn thu protease

Protease là loại enzyme phân bố rộng rãi trên nhiều đối tƣợng, từ động

vật, thực vật, tới vi sinh vật.

Ở động vật, protease thƣờng có ở hệ tiêu hóa nhƣ tuyến tụy, niêm mạc dạ

dày, niêm mạc ruột non (Shafee và cs, 2005). Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch

vị của động vật có vú, chim, bò sát, cá… đƣợc sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa. Rennin ở ngăn thứ tƣ của dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi có khả năng làm đông

tụ sữa, đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất phomat.

Ở thực vật, protease có thể có ở các thành phần thân, lá và đặc biệt trong

quả. Papain thu đƣợc từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ; bromelain thu từ quả, chồi

dứa, vỏ dứa; ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả (Veloorvalappil và cs., 2003). Tuy nhiên, do nồng độ enzyme trong mô thực vật nói chung thấp nên cần sử dụng lƣợng lớn nguyên liệu thực vật để thu đƣợc protease.

Nhiều loài vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm sợi có khả năng tổng hợp mạnh

protease. Protease vi sinh vật có thể ở trong tế bào hoặc đƣợc tiết vào môi

trƣờng nuôi cấy (Phạm Thành Hổ, 2003). Các vi khuẩn thƣờng dùng trong tổng

hợp protease là B. subtilis, B. cereus, B. brevis, B. licheniformis… sinh các

protease trung tính. B. thermophilus tổng hợp protease chịu nhiệt, các loài xạ khuẩn tổng hợp protease gồm có S. griseus, S. rimosus…Nấm sợi tổng hợp

protease gồm có A. oryzae, A. awamori, A. niger,… một số loài Penicilium và Rhizopus (Veloorvalappil và cs, 2003; Lƣơng Đức Phẩm, 2007).

Do khả năng tăng sinh khối nhanh, các vi sinh vật sinh protease đƣợc xem là đối tƣợng thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống nhờ những ƣu điểm chính sau:

- Chủ động quá trình sản xuất enzyme do quá trình sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào điều kiện ngoài.

- Vi sinh vật có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau và enzyme thu đƣợc từ chúng có hoạt tính cao. Chu kì sinh trƣởng và phát triển

của vi sinh vật ngắn do đó có thể tăng năng suất thu hồi sản phẩm.

- Có thể điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hƣớng có lợi

(định hƣớng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).

- Giá thành enzym vi sinh vật không cao nhờ môi trƣờng nuôi cấy tƣơng đối

rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất.

Cho đến nay, số lƣợng enzyme đƣợc sản xuất hàng năm ở các nƣớc phát triển

(chủ yếu là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản) vào khoảng 300.000 tấn, trong đó có 600 tấn protease tinh khiết đƣợc sản xuất từ vi sinh vật, bao gồm khoảng 500 tấn từ vi

khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc (Veloorvalappil và cs, 2003). Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại cho phép sản xuất protease cố định trên các chất mang không tan,

và điều đó giúp enzyme có thể đƣợc tái sử dụng dễ dàng.

Bảng 1.1. Một số chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease cao (Veloorvalappil và cs, 2003)

Nấm VK Bacillus spp.

Aspergillus candidus Alteromonas sp. B. alcalophilus

A. flavus Arthrobacterprotophormiae B. alcalophilus subsp.

A. fumigatus Brevibacterium linens halodurans

A. melleus Hyphomonasjannaschiana B. amyloliquefaciens

A. niger Lactobacillus helveticus B. cereus strain

A. oryzae Malbrancheapulchella var. B. circulans

A. sojae sulfurea B. coagulans

A. sydowi Microbacterium sp. B. firmus

Cephalosporium sp. Nocardiopsisdassonvillei B. intermedius

Chrysosporiumkeratinop Oerskoviaxanthineolytica B. lentus

hilum Pimelobacter sp. B. licheniformis

Conidioboluscoronatus Pseudomonas aeruginosa B. megaterium

Entomophthoracoronata Pseudomonas maltophilia B. proteolyticus

Fusariumeumartii Pseudomonas sp. B. pumilus

Paecilomyces lilacinus Salinivibrio sp. B. sphaericus

Scedosporium Staphylothermusmarinus B. subtilis

apiospermum Streptomyces sp. B. subtilis var.

Tritirachium album Streptomyces microflavus amylosacchariticus

Limber Streptomyces moderatus Bacillus sp.

Rhizopusoligosporus Streptomyces rectus B. stearothermophilus

Streptomyces rectus var.

proteolythicus

Streptomyces rimosus

Streptomyces sp.

Thermoactinomyces sp.

Thermoactinomycesthalpophilus

Thermobacteroidesproteolyticus

Thermococcusceler,

T. stetteri, T. litoralis

Thermomonosporafusca

Thermusaquaticus

Torulathermophila

Vibrio alginolyticus

Vibrio metschnikovii

Xanthomonasmaltophila

1.1.4. Ứng dụng của protease

Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp,

nông nghiệp, y tế, v.v…

1.1.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp

 Công nghiệp sản xuất bia và công nghiệp chế biến thủy sản

Các enzyme dùng trong sản xuất bia là enzyme α – amylase, β – amylase, các

protease, pentosanase và β – glucanase. Trong đó, các enzyme này có vai trò chuyển hóa các polysaccharide đại mạch, các hợp chất đạm khó tan trong MT lên men thành các oligopeptide và amino acid với khối lƣợng đủ đảm bảo cho hoạt

động sống bình thƣờng của nấm men, cho sự hoàn chỉnh vị bia và tạo bọt (Lê Ngọc

Tú và cs, 1998).

Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam nhiều nghiên cứu ứng dụng

enzyme protease từ Bacillus subtilis trong quy trình sản xuất nƣớc chấm giúp rút

ngắn thời gian chế biến, tăng hàm lƣợng đạm và hƣơng vị cho sản phẩm (Ichishima

và cs, 1983).

 Công nghiệp thuộc da và công nghiệp dệt

Chế biến da bao gồm một số công đoạn nhƣ ngâm ƣớt, tẩy lông, làm mềm và

thuộc da (Lê Ngọc Tú và cs, 1998). Quá trình thuộc da thƣờng dùng các hóa chất độc hại nhƣ Na2SO3, nên đòi hỏi chi phí cao để xử lý nƣớc thải. Việc sử dụng enzyme thay thế hóa chất đã thành công trong việc nâng cao chất lƣợng da, giảm ô

nhiễm môi trƣờng. Protease có khả năng làm mềm da nhờ thủy phân một phần

protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm da bị cứng. Kết quả, loại bỏ các chất nhớt, tăng độ mềm dẻo cho da; những tính chất đó đƣợc hoàn thiện hơn

sau khi thuộc da. Trƣớc đây, để làm mềm da ngƣời ta dùng protease đƣợc phân lập

từ cơ quan tiêu hóa của động vật (Lê Ngọc Tú và cs, 1998). Hiện nay, việc đƣa các

protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (Aspergillus

oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả

và dần chiếm một vị trí quan trọng (Ogino và cs, 2007).

Protease đƣợc sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo

đƣợc tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) làm cho sợi đƣợc bóng, dễ nhuộm.

Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serine; lớp này gây dính bết các sợi tơ

tự nhiên, nhờ đó làm bong và tách rời các sợi tơ, giảm lƣợng hoá chất để tẩy trắng

(Phạm Thị Trân Châu và cs, 2006).

 Công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa

Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại

chất tẩy rửa nhƣ: chất làm sạch kính, răng giả, kem đánh răng và nhiều nhất trong bột giặt. Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn đƣợc sản xuất vào năm

1956 với tên BIO – 40 đƣợc thu nhận từ B. subtilis (Rao và cs, 1998). Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dƣới tên thƣơng mại là BIOTEX đƣợc chiết xuất từ B. licheniformis (Rao và cs, 1998). Gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy trên thị trƣờng đều là serine protease, đƣợc sản xuất từ Bacillus sp. và chủ yếu từ B. subtilis (Rao và cs, 1998). Trên thế giới, mỗi năm

ngƣời ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lƣợng enzyme protease hàng năm (Gupta và cs, 2002).

 Xử lý ô nhiễm môi trường

Protease có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung

dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dƣỡng cho cá, vật nuôi. Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bƣớc, ban đầu chúng đƣợc hấp

thụ lên các chất rắn, sau đó cắt các chuỗi polypeptit nhờ đó thể tận dụng nguồn protein này, giảm thiểu tác nhân gây ô nhiễm môi trƣờng (Whiteley và cs, 2006).

1.1.4.2. Trong nghiên cứu và trị liệu

Hình 1. 2. Vai trò protease trong nghiên cứu ung thƣ (Freije và cs, 2011). Các tế bào

ung thƣ chỉ di căn tới các vị trí khác trên cơ thể khi các protease nhƣ cystein protease,

metallo protease (MMP) phân cắt protein xung quanh khối u

Protease đƣợc coi là một họ thuốc lớn mang nhiều tiềm năng tuyệt vời. Cơ

quan quản lý lƣơng thực và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (Food & Drug Administration –

loại protease dùng cho điều trị HIV

FDA) đã phê duyệt 11 (http://www.bvgh.org/Biopharmaceutical-Solutions/).

Protease cũng đóng vai trò quan trọng trong bệnh ung thƣ. Các cystein protease và metallo protease kích thích quá trình di căn bằng cách phân cắt các

protein ngoại bào xung quan khối u (Hình 1.2) (Freije và cs, 2011). Ngƣợc lại, chính protease cũng đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ khi chúng kích hoạt các quá trình apoptosis (chết theo chƣơng trình) (Freije và cs, 2011). Chất ức chế proteasome Velcade đƣợc chấp nhận trong điều trị ung thƣ máu từ năm 2003

(http://www.bvgh.org/Biopharmaceutical-Solutions/)

Các serine – protease – dipeptidyl – peptidase – amin 4 (DPP4) là protease tham gia vào quá trình điều hòa glucose và là đích trong điều trị bệnh tiểu đƣờng.

GLP – 1, hormone ruột là tín hiệu quan trọng cho sự giải phóng insulin. Protease

DPP4 bất hoạt GLP – 1, do đó làm giảm bài tiết insulin và tăng nồng độ đƣờng

trong máu. Các chất ức chế DPP4 đầu tiên đƣợc sử dụng trong bệnh tiểu đƣờng là

Sitagliptin (Merk) đƣợc chấp nhận bởi FDA Hoa Kỳ vào năm 2006 (http://www.bvgh.org/Biopharmaceutical-Solutions/).

USD (Tỷ)

Hình 1.3. Thị phần sử dụng proteinase trong nghiên cứu - trị liệu.

(Protein Hydrolysis Enzymes Market - Global Trends & Forecasts to 2019, 2014)

Ngoài ra, protease đƣợc sử dụng nhiều trong điều trị các bệnh về tim mạch,

nhiễm trùng máu, rối loạn tiêu hóa, vẩy nến, xơ nang…………………………..…

(http://www.bvgh.org/Biopharmaceutical-Solutions/).

1.1.4.3. Trong nông nghiệp

Nông nghiệp tuy không phải là mục tiêu hàng đầu của công nghệ sinh học ở

nhiều nƣớc công nghiệp phát triển trên thế giới, nhƣng trên thực tế những hoạt động

nghiên cứu, sản xuất và thƣơng mại hóa các sản phẩm công nghệ sinh học trong

nông nghiệp cũng đƣợc nhiều tập đoàn lớn quan tâm. Trong lĩnh vực này, protease đã đƣợc sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi theo cách trộn trực tiếp hoặc kết hợp với một số enzyme khác thành chế phẩm hỗ trợ tiêu hóa bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ số tiêu hóa thức ăn … Protease còn đƣợc dung để phân cắt các protein dƣ thừa trong phụ phẩm của ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, thủy sản để tạo ra các amino acid bổ sung vào thức ăn chăn nuôi,

chẳng hạn trong sản xuất thức ăn cho tôm. Bên cạnh đó, protease còn đƣợc sử dụng trong phân bón để phân hủy các protein trong đất hoặc phân hữu cơ có nguồn gốc

động vật thành các amino acid hoặc sản phẩm trung gian mà thực vật có thể hấp thụ

đƣợc, cũng nhƣ làm sạch các ao hồ nuôi tôm, cá.

1.2. BACILLUS SUBTILIS VÀ PROTEASE CỦA BACILLUS

1.2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis

1.2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại

Bacillus subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm

sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872,

Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là

Bacillus subtilis.

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:

Giới (Kingdom) : Bacteria

Ngành (Division) : Firmicutes

Lớp (Class) : Bacilli

Bộ (Order) : Bacillales

Họ (Family) : Bacillaceae

Giống (Genus) : Bacillus

1.2.1.2. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên

Vi khuẩn B. subtilis có mặt trong hầu hết các môi trƣờng tự nhiên, phần lớn

cƣ trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên đƣợc gọi là “trực khuẩn cỏ khô”. Thông thƣờng đất trồng có khoảng 106 - 107 CFU/g. Đất nghèo dinh dƣỡng nhƣ vùng sa mạc thì vi khuẩn này gần nhƣ không hiện diện. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong

các nguyên liệu sản xuất nhƣ bột mì (trong bột mì B. subtilis chiếm 75 - 79% vi

khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm nhƣ mắm, tƣơng, chao...

Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon

trong khi một số loài khác nhƣ B. sphaericus, B. cereus cần các hợp chất hữu cơ là

vitamin và amino acid cho sự sinh trƣởng. Đặc biệt các loài nhƣ B. popilliae, B. lentimobus có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng nhƣ nutrient agar (NA) hay nutrient broth (NB).

1.2.1.3. Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram (+) nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím, kích

thƣớc 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn.

Hình 1.4. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dƣới kính hiển vi

Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 tiêm mao, sinh bào tử hình bầu dục

nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thƣởc từ 0,8 - l,8 µm. Bào tử phát

triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử.

1.2.1.4. Đặc điểm sinh hóa và đặc điểm nuôi cấy

 Đặc điểm sinh hóa

Bảng 1.2. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Đức Lƣợng. 2002)

Phản ứng sinh hóa Kết quả Phản ứng sinh hóa Kết quả

Hoạt tính catalase + Phân giải tinh bột +

Sinh indol - Arabinose +

MR (Metyl red) + Xylose +

VP (Voges-Proskauer) + Saccharose +

Sử dụng citrate + Manitol +

Khử nitrate + Glucose +

Tan chảy gelatin + Lactose -

Di động + Maltose +

 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn B. subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên chúng vẫn phát triển đƣợc trong MT thiếu oxy. Nhiệt độ tối ƣu là 37 oC, pH thích hợp khoảng 7,0 - 7,4.

Vi khuẩn phát triển trên hầu hết trên các môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản:

- Trên môi trƣờng thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cƣa không đều, màu vàng xám, đƣờng kính 3-5 mm, sau 1- 4 ngày

bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.

- Trên môi trƣờng canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại nhƣ vẩn mây ở đáy, khó tan

khi lắc đều.

- Trên môi trƣờng giá đậu - peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa răng cƣa không đều, đƣờng kính 3 – 4 mm sau 72 giờ nuôi

cấy.

- Nhu cầu dinh dƣỡng: Để phát triển, B. subtilis chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lƣợng khác. Chúng phát triển tốt trong môi trƣờng cung cấp đủ nguồn carbon (nhƣ glucose) và nitơ (nhƣ peptone).

1.2.1.5. Bào tử và khả năng tạo bào tử

Hình 1.5. Quá trình Bacillus subtilis sinh nội bào tử quan sát dƣới kính hiển vi

Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ

bản nhƣ ở tế bào sinh dƣỡng nhƣng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành

phần và có thêm một số thành phần mới. Bào tử B. subtilis có dạng elip đến hình

cầu, có kích thƣớc 0,6 - 0,9 µm x 1,0 -1,5 µm, đƣợc bao bọc bởi nhiều lớp màng

với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan... Bào tử của chúng có khả năng chịu đƣợc pH thấp của dạ dày, đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ B. subtilis (Hajati và Rezaei, 2010).

Bào tử có khả năng chịu nhiệt (ở 100 oC trong 180 phút), chịu sấy khô, chịu bức xạ, thuốc khử trùng… cũng nhƣ các điều kiện khác mà thông thƣờng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt. Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại đƣợc trong các

điều kiện bất lợi (dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt, môi trƣờng tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại và nhiệt độ cao…) bằng cách lƣu trữ các nhiễm sắc thể trong lõi của bào tử và tồn tại tới khi điều kiện thuận lợi.

1.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp protease ở Bacillus subtilis

1.2.2.1. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng

Số lƣợng, chủng loại và tỷ lệ các thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng có ý

nghĩa quyết định đến khả năng sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật nói chung, B. subtilis nói riêng. Để tăng lƣợng protease trong môi trƣờng cần lựa chọn nguồn

carbon, nitrogen, muối khoáng với tỷ lệ thích hợp và đặc biệt nguồn cơ chất cảm

ứng cần đƣợc lựa chọn kỹ lƣỡng.

 Nguồn carbon

Nguồn carbon thƣờng dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các glucid:

monosaccharide, disaccharide và polysaccharide (tinh bột). Tác dụng của nguồn

carbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn carbon tự nhiên thƣờng dùng trong môi trƣờng nuôi cấy là bột mì, bột đậu tƣơng, cám hoặc nƣớc chiết của nguyên liệu này

Tinh bột là nguồn carbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp protease

trong đó có B. subtilis. B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease khi môi

trƣờng chứa lƣợng tinh bột lớn hơn 8%. Glucose, saccharose, maltose, fructose và

sorbitol đều là nguồn carbon tốt cho sự tổng hợp protease ở vi khuẩn này (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).

Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của B. subtilis bằng cách bổ sung các thành phần khác nhau nhƣ tinh bột hòa tan,

maltose, lactose, saccharose và dextrose với nồng độ 0,5% vào môi trƣờng cơ bản

(thịt-peptone), đồng thời khảo sát trên mẫu đối chứng và tiến hành nuôi cấy thu enzyme thô, xác định hoạt tính enzyme; các tác giả Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị

Xô (2004) nhận thấy tinh bột hòa tan là nguồn carbon giúp B. subtilis sinh tổng hợp

protease tốt nhất và cho rằng tinh bột trong môi trƣờng đã kích thích chủng này sinh amylase. Chính amylase này là chất cảm ứng sinh protease. Tuy nhiên, khi khảo sát ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng sinh protease của một chủng Bacillus sp., Mehrotra và cs (1999) lại công bố rằng tinh bột không có vai trò kích thích. Trong khi đó, lactose, saccharose, dextrose kìm hãm khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn này.

 Nguồn nitơ

Nguồn nitơ trong môi trƣờng nuôi cấy có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thuỷ phân của protein) hoặc các muối vô cơ chứa nitơ (amoni, nitrat).

Nguồn nitơ hữu cơ thƣờng thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp protease của B. subtilis

vì chúng có vai trò nhƣ chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ hữu cơ

thƣờng dùng là: pepton, casein, albumin, bột đậu tƣơng... Trong số đó, peptone ở

nồng độ thấp thƣờng là chất cảm ứng tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease. Thay thế peptone bằng casein sẽ làm giảm rõ rệt lƣợng protease đƣợc tổng hợp nhất là khi casein ở nồng độ cao.

Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất cho vi khuẩn thƣờng là (NH4)2SO4. Các muối clorua, sulphate, nitrate amon thƣờng có ảnh hƣởng không tốt đến quá trình sinh

tổng hợp protease.

Đối với B. subtilis việc sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm

tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease của chúng (Trần Ngọc Hùng, 2010)

 Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng

Các hợp chất khoáng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật nói

chung và B. subtilis nói riêng vì chúng làm thay đổi trạng thái hoá keo của tế bào

chất. Trong đó, phospho và lƣu huỳnh có ảnh hƣởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease. Các photphate vô cơ có ảnh hƣởng không tốt đến sự sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thƣờng thúc đẩy đến quá trình sinh tổng hợp protease do tính chất đệm của nó. Lƣu huỳnh có ảnh hƣởng khác nhau, giữ vai trò

điều hòa quá trình tổng hợp protease của vi sinh vật (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).

Các vi sinh vật có thể lấy một số các chất khoáng khác nhƣ magiê, natri, sắt…

thông qua một số dạng muối khoáng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hoặc có sẵn trong nguyên liệu pha môi trƣờng.

 Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease

Trong số các enzyme do vi sinh vật tổng hợp, một số enzyme đƣợc tổng hợp với một lƣợng rất ít trong điều kiện thƣờng, nhƣng hàm lƣợng của chúng có thể tăng gấp nhiều lần khi chúng ta cho thêm một số hợp chất nhất định vào môi trƣờng

nuôi cấy. Các enzyme này đƣợc gọi là các enzyme cảm ứng. Chất gây nên hiệu ứng này là chất cảm ứng. Nhƣ vậy có thể xem chất cảm ứng là cơ chất đặc hiệu của enzyme hay những chất tƣơng tự nhƣ cơ chất hoặc những sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất (Mayday và cs, 1986).

Khả năng sinh tổng hợp protease của B. subtilis thƣờng đƣợc cảm ứng bởi các chất giàu đạm nhƣ bột đậu nành, đậu phộng, bột cá, bột tôm, bột nghiền móng, sừng

hoặc lông vũ... Tuy nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ enzyme cũng thể hiện không giống nhau. Do đó, trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật có

thể lựa chọn bổ sung các cơ chất thích hợp nhằm thu lƣợng lớn protease cần thiết

một cách nhanh chóng và khoa học (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)

1.2.2.2. Ảnh hƣởng của yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp protease

 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn cũng nhƣ tính chất của enzyme đƣợc tổng hợp. Mỗi chủng vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp

enzyme đều không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn

nhiệt độ thích hợp. Nhiệt độ tối ƣu của B. subtilis sinh tổng hợp enzyme protease là 37 oC.

 pH môi trường

Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt, pH của môi trƣờng thƣờng ít ảnh

hƣởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật vì môi trƣờng bán rắn có tính

đệm cao và hầu nhƣ không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Thông

thƣờng, các vi khuẩn phát triển tốt và tạo nhiều enzyme ở pH trung tính 6,6 – 7,4

(Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).

Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy chìm, pH có ảnh hƣởng rất lớn đến sự tích

lũy protease trong môi trƣờng. pH của môi trƣờng thay đổi sau khi thanh trùng môi

trƣờng và đặc biệt thay đổi rất lớn trong quá trình nuôi cấy, pH ban đầu thích hợp

cho phát triển của vi khuẩn khoảng 6,2 – 7,4. Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo

thành phần môi trƣờng và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật,

mà pH của môi trƣờng sẽ chuyển dần về phía axit hoặc kiềm.

Đối với các loài thuộc chi Bacillus, pH thƣờng chuyển về kiềm. Ngƣời ta có

thể căn cứ vào pH của môi trƣờng sau khi nuôi cấy để dự đoán lƣợng protease tích

lũy trong môi trƣờng. Nhiều nghiên cứu cho thấy pH của môi trƣờng ảnh hƣởng tới tỷ lệ giữa các protease đƣợc tổng hợp. Do đó, nếu giữ pH của môi trƣờng ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy, B. subtilis sẽ tạo một loại protease xác định chiếm ƣu thế trong môi trƣờng (Lê Ngọc Tú và cs, 1989; Ahn và cs, 1993)

 Thời gian nuôi cấy

Các chủng vi sinh vật khác nhau có tốc độ sinh trƣởng khác nhau. Tốc độ sinh

trƣởng của vi sinh vật trong đó có B. subtilis thƣờng liên quan đến thời gian nuôi

cấy và là yếu tố có vai trò rất quan trọng trong việc sinh tổng hợp enzyme. Mặt

khác, yếu tố thời gian còn quyết định năng suất của việc sản xuất chế phẩm enzyme.

Thông thƣờng, enzyme đƣợc tổng hợp nhiều nhất trong môi trƣờng nuôi cấy tại một

thời điểm nhất định. Ngoài ra, thời gian nuôi cấy còn phụ thuộc vào chủng giống,

thành phần môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy.

 Độ thông khí

Oxy rất cần đối với đời sống vi sinh vật hiếu khí. Tăng sự thông khí đến giới

hạn xác định thì sự phát triển của vi sinh vật cũng tăng theo. Đối với nhiều vi sinh

vật, thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trƣởng, rút ngắn pha tiềm phát và nâng cao sinh khối. Lƣợng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật

khác nhau. Trong một số trƣờng hợp thiếu oxy tuy có kìm hãm sự phát triển của vi

sinh vật nhƣng lại tăng quá trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh làm kìm hãm

sự tổng hợp protease (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)

1.2.2.3. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy

Ngoài nguồn dinh dƣỡng và yếu tố môi trƣờng thì phƣơng pháp nuôi cấy cũng

ảnh hƣởng đáng kể tới sinh tổng hợp protease ở Bacillus. Để thu nhận chế phẩm

enzyme có thể dùng hai phƣơng pháp nuôi cấy: phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt

(phƣơng pháp nổi) và phƣơng pháp bề sâu (phƣơng pháp chìm) (Nguyễn Đức

Lƣợng, 2004).

Protease từ Bacillus sp. sản xuất dù theo phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt hay phƣơng pháp bề sâu đều có pH và nhiệt độ hoạt động tối ƣu tƣơng tự nhau, tuy

nhiên việc nuôi cấy bề mặt cho protease có độ bền với nhiệt độ và pH cao hơn so

với nuôi cấy bề sâu (Nascimento và Martin, 2004).

1.3. PHƢƠNG PHÁP TĂNG CƢỜNG SẢN XUẤT SẢN PHẨM THỨ CẤP (PROTEASE) VÀ CÔNG NGHỆ RIBOSOME

Hiện nay, 4 chiến lƣợc chính đang đƣợc sử dụng phổ biến để tăng cƣờng sản

xuất sản phẩm thứ cấp là: công nghệ đáp ứng lại của vi sinh vật, công nghệ gen, công nghệ trao đổi chất và công nghệ ribosome (Davati và cs, 2013). Trong đó hai công nghệ gen và công nghệ ribosome có nhiều triển vọng ứng dụng trong việc tạo ra các chủng vi sinh vật có sản lƣợng tổng hợp protease cao.

1.3.1. Công nghệ đáp ứng lại của VSV

Các yếu tố trong môi trƣờng lên men làm vi sinh vật tăng hoặc giảm tổng hợp

sản phẩm thứ cấp. Các yếu tố này hoặc có bản chất phi sinh học nhƣ nguồn N, C…giá trị pH, nhiệt độ… hoặc có bản chất sinh học nhƣ sự đáp ứng lại của tế bào này với các tế bào khác trong cùng môi trƣờng khi mật độ tế bào đủ lớn (hiện tƣợng

cảm ứng mật độ – Quorum sensing) (Zak và cs, 2011). Hệ quả của hiện tƣợng cảm

ứng mật độ làm cho lƣợng sản phẩm thứ cấp tăng lên nhanh chóng vì các tế bào đáp

ứng với nhau thông qua việc giải phóng các tín hiệu hóa học (sản phẩm thứ cấp)

(Raina và cs, 2011). Chiến lƣợc này đƣợc ứng dụng từ thập niên 70 của thế kỉ XX cho đến nay, nhằm mục đích tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật

mới phân lập hoặc để tăng cƣờng sản xuất những sản phẩm thứ cấp mà không làm

cải biến di truyền. Một ví dụ cho chiến lƣợc này là nghiên cứu của Zak và cộng sự

thay đổi nguồn carbonhydrat và nitơ trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật thông thƣờng để tối ƣu hóa thành phần dinh dƣỡng cho các chủng vi sinh vật đƣợc phân

lập từ đất (Zak và cs, 2011).

1.3.2. Công nghệ gen

Trong công nghệ gen, có hai phƣơng pháp chính làm tăng lƣợng sản phẩm thứ

cấp là gây đột biến và tái tổ hợp di truyền (Barrios và cs, 2003).

1.3.2.1. Phƣơng pháp gây đột biến

Tạo các thể đột biến từ các chủng tự nhiên thực chất là chiến lƣợc tăng cƣờng

sản xuất các sản phẩm sơ cấp và thứ cấp, có thể tạo ra các thể đột biến có khả năng sinh kháng sinh cao hơn các chủng thuần từ 15 – 400 lần (Malik, 1979).

 Đột biến ngẫu nhiên

Sau khi tạo ra thể đột biến nhờ các tác nhân vật lý, hóa học khác nhau nhƣ tia

UV, tia X, tia gamma, N – methyl – N – nitro – N – nitrosoguanidine, ethyl

ethanesulphonate…, các thể đột biến đƣợc sàng lọc, tìm kiếm ra thể đột biến ƣu việt

hơn so với chủng thuần về một thuộc tính nào đó. Phƣơng pháp này khá đơn giản,

không yêu cầu trang thiết bị hiện đại, hạn chế thao tác kỹ thuật khó tuy nhiên rất tốn

thời gian và công sức (Davati và cs, 2013).

 Đột biến định hướng

Sau khi sử dụng các tác nhân đột biến, các thể đột biến mang các kiểu gen mong muốn đƣợc sàng lọc định hƣớng và bỏ qua các kiểu gen khác. Phƣơng pháp này cho phép phân lập dễ dàng hơn so với phƣơng pháp gây đột biến ngẫu nhiên. Tuy nhiên, khi tiến hành thí nghiệm cần phải có những hiểu biết cơ bản về quá trình chuyển hóa thành sản phẩm và các con đƣờng liên quan (Barrios và cs, 2003).

Thành công đầu tiên khi sử dụng phƣơng pháp này là tạo ra thể đột biến sản xuất penicillin hàm lƣợng cao, Penicillium chrysogenum X – 1612, nhờ chiếu tia X (Hersbach và cs, 1984). Kế tiếp đó là chủng đột biến Aspergillus nidulans có khả

năng sản xuất penicillin tăng 70 – 95% so với chủng ban đầu (Simpson và Caten,

1979).

1.3.2.2. Tái tổ hợp di truyền

Chiến lƣợc chính đƣợc sử dụng để cải biến di truyền phân tử nhằm tăng sản

lƣợng sản phẩm thứ cấp bao gồm (Barrios và cs, 2003):

(1) Tăng số bản copy gen sinh tổng hợp sản phẩm: gen đích sau khi đƣợc nhân

bản sẽ đƣợc chèn vào vector. Tiếp đó, vector này đƣợc biến nạp vào vi sinh

vật. Nhờ vậy, gen đích đƣợc cài vào nhiễm sắc thể vật chủ thông qua trao đổi

chéo tƣơng đồng (Baltz, 1998). Nghiên cứu cho thấy khi nhân đôi gen tylF mã hóa cho tylosin và biến nạp vào Streptomyces fradiae thì lƣợng sản phẩm

chủng tái tổ hợp tăng 60% so với chủng thuần (Baltz, 1998).

(2) Bất hoạt con đƣờng cạnh tranh: phá hủy gen làm cho tiền chất biến đổi thành

sản phẩm khác cạnh tranh với sản phẩm mong muốn. Nghiên cứu của

Casqueiro và cộng sự đã chứng minh nếu phá hủy gen lys2 liên quan tới quá

trình biến đổi từ tiền chất α – amino acid của penicillin thành sản phẩm cạnh

tranh lysine thì lƣợng penicillin tăng lên 100% so với chủng ban đầu (Casqueiro và cs, 1999).

(3) Phá hủy hoặc khuếch đại gen điều khiển: Trên chủng S. clavuligerus, việc

khuếch đại gen điều khiển ccaR1 sẽ cho lƣợng sản phẩm β – lactam tăng gấp

3 lần. Trong khi, phá hủy gen điều khiển mmy trên chính tế bào này thì lƣợng

actinorhodine tăng gấp 17 lần (Solenberig và cs, 1996).

1.3.3. Công nghệ trao đổi chất

Đây là công nghệ sử dụng DNA tái tổ hợp nhƣ một công cụ để cải biến các

gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào con đƣờng chuyển hóa thành sản phẩm

sau khi đã phân tích các con đƣờng trao đổi chất của vi sinh vật và xác định những khó khăn ảnh hƣởng đến sản xuất các hợp chất mong muốn. Do vậy, quá trình hình thành sản phẩm có thể đƣợc kích hoạt hoặc phá hủy làm cho lƣợng sản phẩm thứ

cấp tăng lên hoặc bị biến đổi thành dạng sản phẩm khác có ý nghĩa hơn (Davati và cs, 2013). Sự ra đời của công nghệ trao đổi chất khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm của công nghệ gen là: tránh những thay đổi không mong muốn cho tế bào, thao tác giản đơn nhƣng chính xác hơn (Bailey, 1991). Công nghệ này ngày càng có vai trò

quan trọng trong ngành công nghiệp dƣợc liệu với hàng loạt thành tựu đáng kể tới

nhƣ: sản xuất hiệu quả L – valin, L – threonine, lycopene, tiền thân của thuốc chống

sốt rét (Ro và cs, 2006).

1.3.4. Công nghệ ribosome

Tiến bộ trong công nghệ DNA cho phép giải mã nhanh chóng và chính xác

nhiều hệ gen. Vì vậy khi giải trình tự gen của Streptomyces sp. cho thấy trên trình tự

gen của các chủng xạ khuẩn có nhiều đoạn gen mã hóa sản phẩm thứ cấp mong muốn nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, sắc tố…(Ochi, 2007), tuy nhiên chỉ có một

phần nhỏ các sản phẩm này đƣợc tiết ra trong quá trình lên men. Vì vậy, làm thế

nào để kích hoạt các con đƣờng sinh tổng hợp “lặng” đang là mối quan tâm lớn của

các nhà nghiên cứu (Davati và cs., 2013). Do đó, sau năm 1970, sự ra đời của công

nghệ ribosome cho phép cải thiện nhanh chóng năng suất cũng nhƣ tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học mới từ những gen ngủ trong hệ gen vi sinh vật (Davati

và cs, 2013). Công nghệ này có những ƣu điểm vƣợt trội là: (a) hoạt hóa các cụm

gen ngủ và (b) nhanh chóng tăng sản lƣợng sản phẩm (Davati và cs., 2013).

Khái niệm "công nghệ ribosome" xuất phát từ sự phát hiện S. lividans kháng

streptomycin có khả năng sản xuất với số lƣợng lớn actinorhodin trong khi chủng tự

nhiên không có khả năng này (Lai và cs, 2002). Chủng kháng kháng sinh đột biến ở

gen mã cho protein ribosome S12 (Lai và cs, 2002).

Hình 1.6. Cơ chế tác động ppGpp làm tăng lƣợng sản phẩm thứ cấp của ribosome

(Ochi, 2007).

Nghiên cứu của Ochi (2007) cho thấy ở vi khuẩn, khi điều kiện môi trƣờng thay

đổi theo hƣớng bất lợi (ví dụ cạn kiệt nguồn dinh dƣỡng), chúng ngừng mọi hoạt động

để tồn tại. Một số vi khuẩn sẽ khởi động quá trình biến đổi hình thái tạo bào tử. Khi

nguồn amino acid bị thiếu hụt, các tRNA không mang amino acid đi vào vị trí A của

ribosome 50S đang tổng hợp protein, cùng với protein L11 của tiểu phần ribosome 50S

hoạt hóa gen relA tổng hợp protein RelA. Protein này sẽ xúc tác phản ứng giữa

GDP và ATP để tổng hợp phân tử ppGpp (guanosine – 5‟diphosphate –

3‟diphosphat) và pppGpp. Tiếp đó, ppGpp sẽ hoạt hóa lại các promoter đang bị khóa đồng thời kích hoạt các RNA polymerase (trên tiểu phần β của RNA polymerase

(RNAP) có vị trí nhạy cảm với ppGpp) để tổng hợp sản phẩm cần thiết cho sự sống sót của tế bào nhƣ các enzyme, chất kháng sinh và chất mầu (Hình 1.6) (Ochi, 2007).

Nhiều nghiên cứu cho thấy công nghệ ribosome tác động chủ yếu theo hai con đƣờng chính: Gây đột biến gen mã hóa cho protein ribosome S12 và gây đột biến gen

mã hóa cho tiểu phần β của RNAP (Hình 1.7) (Ochi, 2007).

Hình 1.7. Công nghệ ribosome. (A). Con đƣờng gây đột biến gen rpL mã hóa protein ribosome S12; (B) Con đƣờng gây đột biến gen rpoB mã hóa cho tiểu phần β của RNAP (Ochi, 2007).

Khi phân tích cấu trúc tiểu phần β của RNAP ở các chủng Escherichia coli, S.

coelicolor và B. subtilis ngƣời ta thấy rằng:

Trên cấu trúc tiểu phần β của RNAP, có 4 vùng mang chức năng quan trọng, trong đó vùng nhạy cảm với ppGpp rất gần với vùng gắn rifampicin (Jin, 1998). Vì vậy, khi đột biến vào vùng nhạy cảm với rifampicin sẽ ảnh hƣởng tới hoạt động của

RNAP, thông qua đó có thể ảnh hƣởng tới chức năng của vùng liên kết với ppGpp.

Hệ quả làm cho ribosome của thể đột biến tổng hợp nhanh chóng sản phẩm thứ cấp

mong muốn (Ochi, 2007).

Hình 1.8. Cấu trúc tiểu phần β của RNAP ở Escherichia coli, Streptomyces coelicolor, Bacillus subtilis, Mycobacterium leprae (Davati và cs., 2013).

Do vậy, công nghệ ribosome quan tâm đến việc sử dụng kháng sinh để sàng lọc

các thể kháng thuốc có khả năng tăng cƣờng sản xuất kháng sinh, enzyme (Ochi, 2007;

Wang và cs, 2008) cũng nhƣ tăng cƣờng khả năng chịu hợp chất độc hại (Hosokawa và

cs, 2002). Có thể kể tới một số thành tựu tiêu biểu nhƣ: Wang và cộng sự đã tạo ra thể S.

coelicolor mang tám đột biến điểm khác nhau làm cho lƣợng sản phẩm actinorhodin tăng

lên 280 lần (Wang và cs, 2008). Một thành công mới nhất trong 2013, Tanaka và Ochi

tạo ra thể Paenibacillus agaridevorans mang 3 đột biến điểm nhƣng lại cho lƣợng

enzyme cycloisomalto – oligo – saccharide – glucano – transferase tăng lên 1000 lần

(Ochi và Hosaka, 2013). Trên S. chattanoogensis, gần một nửa thể đột biến kháng

streptomycin cho lƣợng sản phẩm fredericamycin cao gấp 5 lần và một trong số đó cho

lƣợng sản phẩm cao gấp 26 lần so với chủng thuần (Ochi và Hosaka, 2013). Hơn nữa,

khi nghiên cứu trên S. antibioticus và S. lavendulate, các thể đột biến không những cho lƣợng sản phẩm cao hơn so với chủng thuần mà tần số thu đƣợc thể đột biến mong muốn cũng cao hơn hẳn so với các công nghệ khác (3-4%) (Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013). Ở B. subtilis, đột biến kháng streptomycin làm tăng lƣợng sản phẩm enzyme α – amylase lên 20 – 30% và lƣợng sản phẩm này cũng tăng từ 1,5 – 2 lần với thể đột biến kháng rifampicin (Kurosawa và cs, 2006).

Nhƣ vậy, công nghệ ribosome kích thích sự hoạt động gen ngủ (Hosokawa và cs, 2002; Kurosawa và cs, 2006; Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013) của vi sinh vật làm cho lƣợng sản phẩm tăng vƣợt trội so với chủng thuần. Các cơ chế phân tử liên quan đến công nghệ này đã đƣợc tổng kết và đánh giá trong nhiều công trình nghiên cứu (Lai và

cs, 2002; Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013; Wang và cs, 2008). Tuy nhiên, các kết quả

nghiên cứu và ứng dụng công nghệ ribosome dƣờng nhƣ chƣa công bố với các chủng vi

sinh vật ở Việt Nam.

1.4. TƢƠNG TÁC CỦA BỨC XẠ ION HÓA VỚI TẾ BÀO – ỨNG DỤNG BỨC

XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VI SINH VẬT

1.4.1. Quá trình gây hiệu ứng sinh học của bức xạ ion hóa

1.4.1.1. Các quá trình xảy ra sau khi bức xạ đi vào tổ chức sinh học

 Quá trình vật lý

Giai đoạn này diễn ra trong một biên độ thời gian cực nhỏ (10-16 – 10-12 giây), đó là thời gian để bức xạ tác động đến cấu trúc chịu tƣơng tác. Đối với hệ thống sinh học,

cấu trúc chịu sự tƣơng tác trực tiếp là các phân tử: DNA, RNA, protein, enzyme, và màng tế bào.

Tác động của bức xạ ion hoá lên hệ thống thông tin di truyền tế bào nhƣ DNA,

RNA, enzyme có ý nghĩa quan trọng. Các phân tử DNA có thể bị ion hóa trực tiếp hoặc

gián tiếp.

Hình 1.9. Tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa tới DNA

Đối với cơ chế gián tiếp, bức xạ ion hóa các phân tử nƣớc trong vùng lân cận phân tử DNA, các phân tử nƣớc sẽ bị phân ly hình thành các gốc tự do, trực tiếp tác động gây tổn thƣơng phân tử DNA (Phạm Quốc Hùng, 2007; Bauchinger, 1983). Tế

bào chứa khoảng 70-80% nƣớc và dƣới 1% DNA nên cơ chế gián tiếp có ý nghĩa nhất định đối với việc gây tổn thƣơng phân tử DNA. Đối với bức xạ LET thấp nhƣ

tia gamma, tia X, electron thì tác dụng trực tiếp gây nên khoảng 1/3 tổng số các

thƣơng tổn, phần còn lại là do hiệu ứng gián tiếp (Bauchinger, 1983).

Khả năng ion hóa các nguyên tử, phân tử của bức xạ ion hoá chính là điều

khác biệt với các tác nhân không ion hóa, sự khác biệt này giải thích tại sao một

lƣợng nhỏ năng lƣợng đƣợc hấp thụ bởi bức xạ ion hóa lại có thể gây nên một tác

hại lớn hơn nhiều so với các tác nhân khác (Blakely, 2007).

 Quá trình hóa học

Giai đoạn này diễn ra trong vòng từ 10–13 đến 10–2 giây, đƣợc bắt đầu bằng sự hình thành các gốc tự do từ sự thủy phân do bức xạ. Quá trình này xảy ra sau khi phân tử nƣớc hấp thụ năng lƣợng từ bức xạ, theo các giai đoạn sau:

H2O + γ → HOH+ + e–

H2O + e– → HOH –

Các ion HOH– và HOH+ không bền vững và có thể bị tách thành các phần tử

nhỏ hơn: HOH+→ H+ + OH• và HOH– → HOH – + H•

OH• và H• đƣợc gọi là các gốc tự do (free radicals), đây là những phân tử trung hòa có một electron không ghép cặp ở vỏ ngoài cùng do đó chúng có hoạt tính hóa học rất mạnh. Đặc biệt gốc hydroxyl OH• với thời gian tồn tại 10-5 giây, là một tác nhân oxy hóa mạnh, có khả năng gây tổn thƣơng phân tử DNA trong phạm vi 3nm

(Fenech, 1985).

Các gốc tự do cũng có thể tạo ra hydrogen peroxide H2O2, rất độc đối với

TB. H2O2 có thể đƣợc hình thành do kết hợp hai gốc tự do OH•

(OH• + OH• → H2O2),

• và 2HO2

• → H2O2 + O2

hay H• + O2 → HO2

• + H• → H2O2.

hoặc HO2

Một số phân tử hữu cơ khác (ký hiệu RH), có thể trở thành gốc tự do:

RH + γ → RH• → H• + R•

Khi có oxy, một loại gốc tự do khác cũng hình thành nhƣ sau:

R• + O2 → RO2

Dƣới tác động gây tổn thƣơng trực tiếp của các hạt bức xạ mang năng lƣợng hoặc gián tiếp qua các gốc tự do, những tổn thƣơng sơ cấp xuất hiện trên phân tử

DNA. Những tổn thƣơng này bao gồm: đứt gẫy sợi đơn (SSB – single strand breaks), đứt gẫy sợi đôi (DSB - double strand breaks), tổn thƣơng base (BD - base damages) ở các mức độ khác nhau, đứt gẫy liên kết giữa DNA và protein… (Hình

1.10). Trong đó, loại tổn thƣơng đặc trƣng cho bức xạ ion hóa và đóng vai trò quan

trọng nhất đối với tác dụng của bức xạ ion hóa trên phân tử DNA là những đứt gẫy

đôi phức tạp (Phạm Quốc Hùng, 2007; Blakely, 2007; Romm và cs, 2009).

Hình 1.10. Các loại tổn thƣơng do tác động của bức xạ ion hóa trên DNA

 Quá trình sinh học

Giai đoạn này diễn ra từ 10–2 giây đến vài giờ. Đây là giai đoạn diễn ra quá trình sửa chữa những tổn thƣơng sơ cấp xuất hiện trên phân tử DNA. Những base bị tổn

thƣơng đƣợc sửa sai bằng cơ chế cắt bỏ những base riêng lẻ (Base– Excision Repair)

hoặc một đoạn oligonucleotide (Nucleotide– Excision Repair). Tổn thƣơng chuỗi đơn

đƣợc sửa sai dựa vào trình tự của mạch bổ sung. Sửa chữa đứt gẫy đôi liên quan đến một

số cơ chế: Hai đầu đứt gẫy có thể đƣợc nối lại mà không cần trình tự tƣơng đồng theo cơ

chế NHEJ (Nonhomologous End Joining), hay dựa vào trình tự tƣơng đồng theo cơ chế

HR (Homologous Recombination).

Những tổn thƣơng sơ cấp, đặc biệt là những tổn thƣơng đứt gẫy đôi cũng khởi phát

một quá trình chuyển tín hiệu bằng cách sử dụng hoạt tính kinase của hệ thống enzyme tham gia vào quá trình đáp ứng của tế bào với tổn thƣơng xảy ra trên phân tử DNA theo các con đƣờng khác nhau, dẫn đến ngăn chặn sự phân bào ở các giai đoạn khác nhau của chu trình tế bào (IAEA, 2007; Obe và Beck, 1984; Wilding và cs, 2005).

1.4.1.2. Hiệu ứng sinh học gây bởi bức xạ ion hóa

 Hiệu ứng ở cấp độ phân tử

Giai đoạn này có thể kéo dài từ vài giờ đến nhiều năm sau khi chiếu xạ. Bức xạ ion

hóa gây tổn thƣơng cho hàng loạt các phân tử khác nhau trong tế bào nhƣ phân tử

protein, lipid, nucleic acid, cacbon hydrate …làm tổn thƣơng những cấu trúc trong tế

bào, trong đó quan trọng nhất là những tổn thƣơng xảy ra với vật chất di truyền ở cấp độ

phân tử là DNA, những tổn thƣơng không đƣợc phục hồi, hoặc phục hồi nhầm trên phân

tử DNA dƣới tác động của bức xạ ion hóa, dẫn đến những tổn thƣơng về chức năng của

gene (Obe và Beck, 1984; Parveen và cs, 2007).

 Hiệu ứng ở cấp độ tế bào

Ở cấp độ tế bào, bức xạ ion hóa có thể tác dụng ở các mức độ khác nhau tùy vào

liều lƣợng, bản chất bức xạ và loại tế bào chịu tác dụng. Trƣờng hợp bị tổn thƣơng nặng, tế bào sẽ bị chết. Tế bào có thể chết giữa phase (interphase death) - tế bào ngừng tất cả

mọi hoạt động sống, có thể mất khả năng phân chia (reproductive death). Những tế bào

mang đột biến gene liên quan đến sự kiểm soát chu trình tế bào có thể nhân lên vô hạn

định. Ở động vật bậc cao và ngƣời, đột biến có thể đƣợc truyền cho thế hệ tiếp theo nếu xảy ra ở tế bào sinh dục (Parveen và cs, 2007; Voisin, 2005).

1.4.2 Ứng dụng bức xạ ion hóa trong gây tạo đột biến ở vi sinh vật

Trong tự nhiên, tỉ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh vật và nằm trong khoảng từ 10-10 đến 10-6. Tỉ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10-5 đến 10-1 (Davati và cs, 2013). Có hai loại đột biến thực nghiệm là đột biến ngẫu nhiên và đột biến định hƣớng. Đột biến ngẫu nhiên thƣờng đƣợc tạo ra bằng các

phƣơng pháp vật lý và hóa học (Malik, 1997). Các tác nhân vật lý nhƣ: các tia X, tia

, α, β, neutron có bƣớc sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu

cao. Các tia phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy DNA, thay đổi cấu

trúc của DNA hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi DNA. Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện

hoạt tính của vi sinh vật (Awan, 2011).

Các vi sinh vật nói chung có khả năng kháng với các đột biến cao hơn so với động

vật và thực vật. Điều này có thể đƣợc giải thích bởi kích thƣớc cùng nhân tế bào nhỏ bé

của vi sinh vật khó bị tác động bởi quá trình chiếu xạ. Các đột biến ở vi sinh vật thƣờng phức tạp hơn các sinh vật khác. Hơn thế, vi sinh vật có khả năng tự bảo vệ và sửa chữa phân tử DNA khi bị chiếu xạ. Phân tử DNA của vi sinh vật đƣợc bảo vệ nhờ quá trình hình thành bào tử và khả năng sử dụng các chất „bắt” gốc tự do nhƣ catalase, superoxide dismutase, và carotenoid (Hoe và cs, 2016). Một số loài hình thành bào tử nhƣ Bacillus

sp. và Clostridium sp. là các vi khuẩn kháng xạ. Tuy nhiên, khi có đầy đủ chất dinh dƣỡng, bào tử nảy mầm sẽ tạo ra các tế bào sinh dƣỡng nhạy cảm hơn nhiều với bức xạ

(Narumi, 2006). Prokaryote và sinh vật nhân chuẩn (nấm mốc và nấm men) đều có thể sửa chữa nhiều loại đứt gẫy trên phân tử DNA. Ngoài ra, điều kiện môi trƣờng trong quá

trình chiếu xạ bao gồm nhiệt độ, hàm lƣợng nƣớc, môi trƣờng nuôi cấy và oxy đều có thể

ảnh hƣởng đến khả năng kháng xạ của vi sinh vật. Tăng nhiệt độ (trên 45°C) cũng làm

tăng hiệu quả của xử lý chiếu xạ tới các tế bào sinh dƣỡng. Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ

môi trƣờng xung quanh, các vi sinh vật sinh dƣỡng kháng bức xạ mạnh hơn. Sự hiện diện của oxy cũng tăng tác động gây chết của bức xạ với vi sinh vật. Ngoài ra, tăng hàm

lƣợng nƣớc cũng làm tăng ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ lên vi sinh vật do sự gia tăng

quá trình hình thành các gốc tự do từ các phân tử nƣớc gây ra bởi bức xạ. Hơn nữa, khác

thành phần của môi trƣờng xung quanh các vi sinh cũng gây ra các hiệu ứng khác nhau của chiếu xạ (Aquino, 2012). Do đó, việc áp dụng chiếu xạ gamma để gây đột biến ở vi

sinh vật là không đơn giản.

Trong những năm gần đây, nghiên cứu sử dụng bức xạ γ làm tác nhân gây đột đột

biến làm tăng khả năng sinh các sản phẩm thứ cấp ở nhiều loại vi sinh vật nhƣ

Trichoderma (Shahbazi và cs, 2014), Streptomyces (Moussa và cs, 2003), Aspergillus niger (Awan và cs, 2011), Bacillus (Yoon và cs, 1999; Jong và cs, 2010; GuiJun và cs,

2011; Afsharmaesh & cs, 2014)… đƣợc nhiều tác giả quan tâm.

Chủng Bacillus sp. là một trong số các vi sinh vật đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu gây tạo đột biến bằng chiếu xạ gamma do chúng là các vi sinh vật sinh bào

tử. Hơn thế, vi khuẩn này an toàn với những thông tin cơ bản sẵn có nhờ thế các nghiên

cứu đột biến ở chúng sẽ dễ dàng và thuận lợi hơn. Có thể kể tới một số nghiên cứu tiêu

biểu nhƣ:

 Năm 1999, Yoon ki-Hong và nhóm của mình đã chiếu xạ chủng Bacillus sp. 79- 23 bằng bức xạ gamma trên nguồn Co-60 với dải liều từ 0,5 đến 5 kGy. Bằng

cách ghi nhận vòng phân giải hình thành xung quanh mỗi khuẩn lạc đƣợc cấy

trên thạch đĩa LB có 4% carboxymethylcellulose, 7 chủng đột biến có khả năng

sinh CMCase đã đƣợc lựa chọn sau chiếu xạ. Hoạt tính enzyme CMCase của

những chủng đột biến thu đƣợc thƣờng cao hơn chủng thuần từ 1,5 đến 2 lần

(Yoon và cs, 1999).

 Năm 2010, nhóm tác giả tại Viện Năng lƣợng Nguyên tử Malaysia đã tiến hành thí nghiệm xử lý chiếu xạ bằng nguồn Cobalt-60 chủng Bacillus sp. NMBCC 10023 phân lập từ đất. Dịch vi khuẩn sau chiếu xạ ở dải liều từ 1kGy đến 40kGy đƣợc nuôi cấy qua đêm trên môi trƣờng đĩa thạch NA. Kết quả cho thấy,

liều chiếu trên 10 kGy có khả năng tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn. Ở liều chiếu dƣới 10 kGy, số lƣợng vi khuẩn sống sót giảm khi liều chiếu tăng. Liều D10 (gây chết 90%) của chủng Bacillus sp. NMBCC 10023 nằm từ 2-4 kGy và

khoảng liều này đƣợc lựa chọn để gây đột biến ở Bacillus sp. NMBCC 10023

(Jong và cs, 2010).

 Nghiên cứu của GuiJun đã sử dụng bức xạ γ với liều chiếu từ 100 đến 2000 Gy trên Bacillus subtilis NCD-2, kết quả chỉ ra tỉ lệ chết tăng theo liều chiếu. Với

liều 1000Gy tỉ lệ chết lên đến 99,5%. Tần số đột biến tăng dần trong khoảng

liều từ 100 Gy đến 500 Gy và giảm dần từ 500 Gy trở đi. Liều chiếu từ 400 Gy

đến 700 Gy cho tần suất đột biến cao (trung bình trên 15%) và tần suất cao nhất đạt 26,51% tại liều 500 Gy (GuiJun và cs, 2011).

 Trong nghiên cứu của mình, Afsharmaesh và cộng sự đã sử dụng bức xạ gamma dải liều 100 – 3000 Gy gây đột biến làm tăng khả năng sinh hợp chất

lipopeptide dùng phân hủy độc tố aflatoxin do nấm Aspergillus flavus tạo ra.

Sau khi đánh giá khả năng khử aflatoxin của 500 khuẩn lạc sau chiếu xạ, nhóm

nghiên cứu đã chọn lọc đƣợc 6 chủng đột biến có hoạt tính cao hơn chủng tự

nhiên (Afsharmaesh & cs, 2014).

Rõ ràng, xử lý chiếu xạ có thể dẫn đến những thay đổi về hình thái cũng nhƣ

quá trình chuyển hóa ở vi sinh vật. Những thay đổi do chiếu xạ tạo ra là các thay đổi

ngẫu nhiên có thể di truyền đƣợc và sự ổn định của chúng phụ thuộc vào sự tổn

thƣơng ở mức độ phân tử của tế bào sau khi chiếu xạ cũng nhƣ khả năng kháng xạ

của vi sinh vật. Loại bức xạ, khoảng cách của nguồn bức xạ, thời gian chiếu

xạ…cũng là các yếu tố ảnh hƣởng tới sự ổn định của các đột biến vi sinh vật (Hoe

& cs, 2016)

Nhƣ vậy, để tạo ra các đột biến vi sinh vật bằng bức xạ gamma, các phƣơng

pháp với liều lƣợng bức xạ và điều kiện chiếu xạ khác nhau đã đƣợc công bố. Tuy

nhiên, không có bất kỳ một khuyến cáo chung nào về khoảng liều tối ƣu để đạt

đƣợc tỷ lệ đột biến cao do ảnh hƣởng của bức xạ tới mỗi loài hay chủng vi sinh vật là không giống nhau. Việc xây dựng đƣờng cong sống sót phụ thuộc liều, cũng nhƣ

tổng hợp các nghiên cứu có liên quan để có đƣợc thông tin về hiệu quả của liều xử lý, điều kiện chiếu xạ, … là cần thiết để xác định khoảng liều phù hợp cho các đột biến mong muốn.

PHẦN II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1. Nguyên vật liệu

Các chủng B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào đƣợc thu

thập từ các phòng thí nghiệm trong nƣớc nhƣ liệt kê trong Bảng 2.1. Bảng 2.1. Các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào

Tên chủng Nguồn gốc ST Kí

T hiệu

1 Bacillus subtilis B5 B5 Viện Công nghệ Sinh học và Công

nghiệp Thực phẩm - ĐH Bách Khoa 2 B. subtilis H12 H12

3 B. subtilis NH Công ty TNHH Kyotobiken Hà Nội NH

4 B. subtilis VI Viện Vi sinh và Công nghệ Sinh học - VI

ĐH Quốc gia Hà Nội

5 B. subtilis PN Phòng NC Công nghệ Bức xạ - TTCX PN

Hà Nội

6 B. subtilis TN Bộ môn Vi sinh- Trƣờng ĐH Khoa học TN

Tự nhiên- ĐH Quốc gia Hà Nội

7 B. subtilis 002 002

Viện Vi sinh và Công nghệ Sinh học - 8 B. subtilis 131 131

ĐH Quốc gia Hà Nội 9 B. subtilis 129 129

Chủng TB khả biến Escherichia coli DH5α, JM109 (Promega) dùng trong

quá trình biến nạp vector tái tổ hợp.

2.1.2. Hóa chất

 Hóa chất và MT nuôi cấy vi sinh vật:

- Hóa chất: Pepton (Sigma), trypton (Sigma), cao nấm men (Merck), cao thịt (Sigma);

- Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật: NB (Nutrient Broth), NA (Nutrient Agar)

do hãng Diffco cung cấp, LB (Luria Bertani) gồm: 1% trypton; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl.

streptomycin (Sigma), rifampicin (Sigma)  Kháng sinh:

 Hóa chất dùng cho định tính và định lƣợng protease: casein (Sigma), acetic acid (Merck), amido đen (Sigma), agar (Hạ Long), thuốc thử Folin, Na2HPO4, KH2PO4, NaOH, HCl, TCA (tricloro acid) … đều đảm bảo độ sạch phân tích.

 Kit tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn: WizardSV Genomic DNA

Purification System (Promega, Code A260).

 Kit tách chiết DNA plasmid: Qiagen Plasmid Mini Kit (50) (Qiagen, Code

12125).

 Kit tinh sạch sản phẩm PCR: High Pure PCR Product Purification Kit

(Roche, Code 11732668001).

 Kit tách dòng sản phẩm PCR: InsTAclone PCR Cloning Kit (Fermentas,

Code K1214).

 Các hóa chất dùng cho PCR: Jump Taq DNA polymerase (Sigma), dNTPs

(Promega), MgCl2 25 mM (Promega).

 Các hóa chất dùng cho điện di: acrylamide (USB), bisacrylamide (USB), (Thermo (Thermo Scientific™), APS (Takara), TEMED agarose

Scientific™), ethidium bromide (Promega), thang chuẩn DNA 1 kb

(Fermentas), thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas).

 Các mồi khuếch đại đoạn gen rpoB và rpsL, các mồi dùng để sàng lọc vector tái tổ hợp, các mồi dùng trong đọc trình tự đƣợc cung cấp bởi hãng IDT

(Mỹ).

2.1.3. Thiết bị

 Nguồn Co-60 - Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội.

 Các máy móc, thiết bị phục vụ cho thực hiện các nội dung nghiên cứu thuộc Phòng Nghiên cứu Công nghệ bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội (Viện Năng lƣợng Nguyên tử Việt nam), Phòng Thí nghiệm Sinh Y và Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học (Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Bảo quản và giữ giống

Chủng giống B. subtilis (chủng thuần và chủng ứng viên mang đột biến có khả năng tổng hợp proteinase cao) đƣợc bảo quản theo phƣơng pháp cấy truyền trên

ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng NA. Sau khi cấy trên ống thạch,vi khuẩn đƣợc nuôi trong tủ ấm 37 oC qua đêm và bảo quản tối đa 30 ngày ở 4 oC trƣớc khi cấy truyền đợt tiếp theo.

Chủng giống E. coli DH5α khả biến và chủng tái tổ hợp mang vector có đoạn gen rpoB và rpsL đƣợc bảo quản ở -80 oC đƣợc cấy truyền trên đĩa thạch LB nuôi trong tủ ấm 37 oC qua đêm. Môi trƣờng cho chủng khả biến không bổ sung kháng sinh ampicilin (50 ug/ml), đối với chủng tái tổ hợp có bổ sung ampicilin. Khuẩn lạc

mọc riêng rẽ trên LB thạch đƣợc cấy trong LB lỏng để chuẩn bị tế bào khả biến

hoặc để tách plasmid.

2.2.2. Xử lý chiếu xạ

2.2.2.1. Nuôi cấy huyền dịch tế bào

- Dùng que cấy vô trùng chuyển các khuẩn lạc riêng rẽ của chủng B. subtilis thuần vào các bình tam giác chứa môi trƣờng NB, nuôi cấy lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC để thu đƣợc huyền dịch tế bào sơ cấp.

- Chuyển 100 µl huyền dịch tế bào dịch sơ cấp sang các bình tam giác chứa môi trƣờng NB (tỷ lệ 1/100) và tiếp tục nuôi cấy lắc 4-6 giờ ở 37 oC. Mật độ tế bào vi khuẩn trong huyền dịch đƣợc xác định thông qua giá trị OD. Khi quá trình sinh trƣởng của B. subtilis đạt tới pha Log (OD550 = 0,6-0,7), tiến hành thu huyền dịch tế bào thứ cấp.

- Huyền dịch tế bào thứ cấp đƣợc chuyển sang các ống nghiệm vô trùng (10 ml huyền dịch/ống). Các ống này đƣợc dán nhãn (ghi liều dự kiến) và đƣợc xử lý

chiếu xạ trên thiết bị gamma Co-60 tại Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội.

2.2.2.2. Chiếu xạ dung dịch nuôi cấy:

Các ống nghiệm có chứa tế bào vi khuẩn ở pha Log đƣợc đem xử lý chiếu xạ

trên nguồn gamma Co-60 ở dải liều 0-3 kGy (3 ống nghiệm lặp lại cho mỗi liều).

2.2.3. Xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật

Số lƣợng tế bào B. subtilis trƣớc và sau xử lý chiếu xạ đƣợc xác định thông

qua đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng NA.

Dịch nuôi cấy vi khuẩn (trƣớc và sau chiếu xạ) đƣợc pha loãng theo dãy thập

phân. 0,1 ml mẫu ở các độ pha loãng thích hợp đƣợc cấy vào đĩa petri chứa môi trƣờng NA (3 đĩa petri/độ pha loãng). Sử dụng que gạt vô trùng dàn đều các tế bào vi khuẩn trên bề mặt thạch. Số khuẩn lạc đƣợc đếm sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 oC và từ đó tính ra số lƣợng tế bào trong 1ml mẫu theo công thức:

Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V

Trong đó : Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa ; Di là độ pha loãng và V là

thể tích dịch huyền phù tế bào cấy vào mỗi đĩa (ml)

2.2.4. Định tính và định lƣợng protease

2.2.4.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Hoạt tính protease do các chủng B. subtilis sinh ra đƣợc xác định định tính

bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất là casein.

 Chuẩn bị dung dịch Sorencen

- Pha Na2HPO4 1/15 M: 5,96 g Na2HPO4 trong 250 ml H20

- Pha K2HPO4 1/15 M: 0,9072 g KH2PO4 trong 100 ml H20

- Pha dung dịch Sorencen 1/15 M pH 7,6: 177 ml Na2HPO4 và 23 ml KH2PO4 đã chuẩn bị, sau đó chuẩn lại pH 7,6.

 Đổ đĩa casein 0,1%

- Bổ sung 0,1 g casein vào trong 100 ml dung dịch Sorencen pH 7,6

- Sau khi đun tan đều, tiến hành lọc dịch trong. Để nguội và bổ sung 1,5 g

agar/100 ml dung dịch.

- Đun tan đều và đổ đĩa. Các đĩa có đƣờng kính đĩa bằng nhau đƣợc đổ cùng 1

thể tích (25 ml/1 đĩa  9, 70ml/1 đĩa  14) để đảm bảo độ dày của lớp thạch-

casein là nhƣ nhau ở tất cả các đĩa thí nghiệm..

- Đĩa đƣợc để nguội và giữ trong tủ lạnh 4 oC, có thể dùng trong 1 tháng sau khi đổ nếu đƣợc bảo quản lạnh.

 Chuẩn bị thuốc nhuộm amido đen 0,1%

- Tiến hành pha dung dịch acetic acid 10% làm dung môi cho thuốc nhuộm và dung dịch rửa sau khi nhuộm.

- Bổ sung 0,1g thuốc nhuộm amido đen vào 100 ml dung dịch acetic acid 10%, khuấy trên máy khuấy từ đến tan hết, lọc qua giấy lọc và bảo quản tránh ánh sáng (dung dịch sau khi rửa có thể sử dụng lại nhƣng nhất thiết phải tránh ánh sáng).

 Phương pháp tiến hành thử hoạt tính protease

- Các chủng B. subtilis đƣợc nuôi cấy trong ống Eppendorf có chứa 700 µl môi trƣờng NB, lắc 120 vòng/ phút trong 24 giờ ở 37 oC.

- Ly tâm tách tế bào ở 10.000 vòng/ phút, nhiệt độ 4 oC trong 10 phút để thu dịch enzyme.

- Nhỏ 30 µl dịch enzyme vào mỗi giếng đã chuẩn bị sẵn trên đĩa thạch 0,1%

casein.

- Sau khi ủ ở 37 oC trong 17-24 giờ, các đĩa thạch-casein đƣợc nhuộm amido đen trong 30 phút, rửa nhuộm và quan sát vòng phân giải casein. Các chủng có

vòng phân giải casein lớn là những chủng có khả năng sinh protease cao.

Ủ 37 oC, 17-24 h

Nhỏ dịch lên đĩa casein 0,1%

Dịch protease ngoại bào

Các bƣớc thử hoạt tính protease đƣợc thực hiện theo sơ đồ trên Hình 2.1

Chụp ảnh, phân tích kết quả

Nhuộm amido đen 30 phút

Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thử hoạt tính protease

2.2.4.2. Phƣơng pháp Anson cải tiến

 Nguyên tắc

Cho protease tác dụng với cơ chất casein, sản phẩm tạo thành là các peptit ngắn hay các amino acid. Trong các loại amino acid, tyrosin chiếm đa số. Xác định

tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định hoạt tính protease

theo định nghĩa: hoạt tính protease đƣợc biểu thị là số micromol tyrosin sinh ra do

thuỷ phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1 mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5 oC, pH 7,6).

 Pha hoá chất

- Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1 g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng sorense cho đủ 100 ml.

- Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nƣớc cho đủ 100 ml.

- Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nƣớc cho đủ 500 ml.

- Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nƣớc cho đủ100 ml.

- Dung dịch tyrosin 20mM: khuấy nghiền 0,181 g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N cho vừa đủ 50 ml.

- Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM: pha loãng 5 ml tyrosin 20mM trong HCl 0,2N thành 100 ml.

 Đường chuẩn tyrosin

Bảng 2.2. Tỷ lệ các hóa chất cần pha cho xây dựng đƣờng chuẩn tyrosin Ống nghiệm Dung dịch hóa chất

0 1 2 3 4 5

Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Thuốc thử folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

Lƣợng tyrsosine (mM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Sau khi pha các dung dịch, lắc đều và giữ nguyên 10 phút và đo độ hấp thụ ở

bƣớc sóng 660 nm.

Ống số 0 là ống đối chứng, các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đƣờng chuẩn tyrosin tƣơng quan giữa lƣợng tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK).

 Phương pháp tiến hành

Bảng 2.3. Các bƣớc chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính

Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Mẫu thử Đối chứng

Dung dịch casein 1% (ml) 5 5

Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10

Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút

Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong

Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành với 3 ống mẫu và 3 ống đối chứng.

Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5 ml dịch lọc của ống thử

thật và cho vào ống thứ hai 5 ml dịch lọc của ống đối chứng.

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10 ml NaOH 0,5N và 3 ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bƣớc sóng 660 nm. Tính ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra đƣợc số µM tyrosin.

 Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lƣợng enzym tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,5 oC, pH 7,6) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA (tricloro acid), phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bƣớc sóng 660 nm tƣơng ứng với 1µM tyrosin trong đƣờng chuẩn.

Với: X: Số micromol tyrosin suy ra từ đƣờng chuẩn.

V: Tổng thể thích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 ml)

v: Thể tích dịch lọc đem phân tích (1 ml)

K: Độ pha loãng mẫu

T: Thời gian phản ứng (phút)

UI (Anson) = 1 micromol tyrosin/ml/phút hoặc 1 micromol tyrosin/mg /phút

2.2.5. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ

Huyền dịch tế bào sau nuôi cấy thứ cấp khoảng 4h đƣợc xử lý chiếu xạ dải

liều 0-3000 Gy. Pha loãng dịch nuôi sau chiếu xạ tới nồng độ thích hợp và cấy trải

trên đĩa petri chứa môi trƣờng NA sao cho mỗi đĩa chứa khoảng 50-200 khuẩn lạc riêng rẽ, ủ đĩa ở 37oC trong 24 giờ.

Các khuẩn lạc đơn sẽ đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc cho mỗi liều

chiếu) để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. So sánh đƣờng kính vòng phân giải, những khuẩn lạc sinh protease có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao. Tần số đột biến sinh protease cao ở mỗi liều chiếu xạ đƣợc tính theo công thức:

2.2.6. Sàng lọc các đột biến sinh protease cao từ Bacillus subtilis bằng xử lý chiếu xạ kết hợp với kháng sinh

Sau khi chiếu xạ ở các liều khác nhau trong dải liều 0-3000 Gy, huyền dịch

tế bào B. subtilis ngay lập tức đƣợc trải lên môi trƣờng NA có bổ sung rifampicin và

streptomycin (đối chứng dƣơng của lô thí nghiệm là dịch nuôi cấy sau chiếu xạ

đƣợc trải lên môi trƣờng NA không kháng sinh). Quan sát và thống kê số lƣợng khuẩn lạc mọc lên từ sau 1-3 ngày, đây là những khuẩn lạc vừa kháng xạ vừa kháng

kháng sinh. Tần số đột biến kháng rifampicin ở mỗi liều chiếu xạ là tỷ số giữa số

lƣợng khuẩn lạc B. subtilis sống sót trên môi trƣờng bổ sung KS và và số khuẩn lạc

ở lô đối chứng dƣơng.

Các khuẩn lạc đơn kháng xạ và kháng kháng sinh sẽ đƣợc lựa chọn để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease bằng phƣơng pháp

khuếch tán trên đĩa thạch-casein. Những khuẩn lạc sinh protease với kích thƣớc

vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến

sinh protease cao tiềm năng.

2.2.7. Xác định đột biến

2.2.7.1. Thiết kế mồi và xử lý số liệu

- Phần mềm thiết kế mồi: phần mềm Fast PCR đƣợc lựa chọn sử dụng trong nghiên

cứu bởi ƣu điểm dễ sử dụng và linh hoạt. Các mồi đƣợc thiết dựa vào trình tự gen

rpoB và rpsL của B. subtilis trong Databank (NC_000964.3 và D64127.1) và sử

dụng phần mềm online Fast PCR.

- Phần mềm so sánh trình tự nucleotide và amino acid: Sử dụng BlastN và BlastX

(NBCI) để phân tích các trình tự tƣơng đồng trong ngân hàng dữ liệu Databank và xác định các nucleotide bị đột biến dẫn đến thay thế các amino acid trong protein

rpoB và rpsL12. Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng

2.4.

Bảng 2.4. Trình tự nucleotide của các mồi dùng trong nghiên cứu

Số % GC Tm Tên Trình tự mồi (5’ - 3’) nucleotide mồi

19 52,63 56,52 rpsL-F CGGTTTAAGCGTATGGAGC

19 52,63 56,52 rpsL-R GCTCCATACGCTTAAACCG

20 60 60,03 rpoB-F GAACCACCTGGGTATGTGGG

23 47,83 59,67 rpoB-R TGGCATCTGAATATCCTCCCTTC

2.2.7.2. Khuếch đại trình tự gen rpoB và rpsL12

Các cặp mồi đƣợc thiết kế theo chƣơng trình Fast PCR, đƣợc sử dụng để

khuếch đại trình tự hai gen rpoB và rpsL12 từ DNA tổng số của hai chủng Bacillus

B5 và H12 và 17 khuẩn lạc có khả năng sinh protease cao. Điều kiện tối ƣu và thành phần của phản ứng PCR đƣợc trình bày trong Bảng 2.4.

Bảng 2.5. Thành phần và chƣơng trình PCR khuếch đại trình tự hai gen rpoB và rpsL12 từ DNA tổng số

Thể tích Thành phần Chƣơng trình PCR (µl)

8,2

3,0

1,2

H2O Đệm 5X (Promega) MgCl2 25 mM dNTP 2 mM mỗi loại 0,5

rpoB-F (hoặc rpsL-F) 10 µM 0,5

rpoB-R (hoặc rpsL-R) 10 µM 0,5

Taq DNA polymerase 5 U/µl 0,1

- 94 oC trong 5 phút - Lặp lại 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm (94 oC 30 giây, 55 oC 30 giây, 72 oC 30 giây) - 72 oC trong 10 phút Dung dịch chứa khuẩn lạc 1,0

Tổng 15,0

2.2.7.3. Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit

của hãng Roche. Quy trình đƣợc thực hiện theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất.

2.2.7.4. Phƣơng pháp điện di DNA

Điện di là phƣơng pháp phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc và cấu hình

khác nhau. Dƣới tác dụng của điện trƣờng trong đệm trung tính, các đoạn DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng, đoạn kích thƣớc nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn. Trong nghiên cứu sử dụng loại giá thể agarose ở nồng độ 1% (với DNA tổng số) và 1,5% (các sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 500 bp). Cả 2 loại gel agarose đều đƣợc chạy trong đệm TBE 1X (với thành phần trong 100ml nhƣ sau: 1,08 g tris-base; 0,55 g boric acid; 400 µl EDTA 0,5 M pH 8). Sau khi kết thúc điện di, DNA đƣợc nhuộm với ethidium bromide và phát hiện dƣới tia UV của hệ thống

máy chụp ảnh gel UVP (Mỹ).

2.2.7.5. Giải trình tự

Sản phẩm PCR đƣợc giải trình tự trên hệ thống máy đọc tự động do Công ty

First One (Hàn Quốc) thực hiện.

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH

PROTEASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN

3.1.1. Tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có hoạt tính cao và ổn định

Chín chủng B. subtilis thuần có khả năng sinh protease đã thu thập, đƣợc nuôi

cấy riêng rẽ trên môi trƣờng NB trong 24 giờ. Hoạt tính protease của chúng đƣợc

định tính trên đĩa thạch-casein và nhuộm bằng thuốc nhuộm amido đen, kết quả thu

đƣợc trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.1.

kính

Bảng 3.1. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 09 chủng B. subtilis có khả năng sinh protease Kí STT Tên hiệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Đƣờng (mm) 18,5 ± 0,25 18,5 ± 0,25 - 18,75 ± 0,5 8 ± 0 8 ± 0 - 15,25 ± 0,25 17,25 ± 0,25 chủng B5 H12 NH VI TN PN 002 131 129 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Hình 3.1. Vòng phân giải casein của 09 chủng B. subtilis có khả năng sinh protease

*Thí nghiệm được lặp lại trên 3 đĩa và 2 lần trên cùng một đĩa casein cho mỗi chủng;(-) không có vòng phân giải

Bƣớc đầu kiểm tra, 05 chủng có đƣờng kính phân giải casein lớn hơn các chủng còn lại đƣợc lựa chọn để tiếp tục tuyển chọn các chủng có hoạt tính vƣợt trội và ổn định. Đó là các chủng B5, H12, VI, 131 và 129.

Kiểm tra lại hoạt tính protease của 05 chủng nhận thấy các chủng B5, H12 và VI cho vòng phân giải casein lớn hơn và có tính ổn định giữa các lô thí nghiệm so với 02 chủng còn lại (Hình 3.2 và Bảng 3.2). Kết quả định lƣợng protease của 5

chủng bằng phƣơng pháp Anson cải tiến đƣợc trình bày trong Hình 3.3.

Bảng 3.2. Kích thƣớc vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease

Tên Kí Đƣờng kính ST

chủng hiệu (mm) T

B5 1-1‟ 18,5 ± 0,25 1

H12 2-2‟ 18,5 ± 0 2

VI 4-4‟ 18,25± 0,5 3

131 8-8‟ - 4

129 9 16,75 5

129 9‟ - Hình 3.2. Vòng phân giải casein của 05 chủng có khả năng sinh protease cao

*Thí nghiệm được lặp lại trên 3 đĩa và 2 lần trên cùng một đĩa casein cho mỗi

chủng;(-) không có vòng phân giải.

Hình 3.3. Hoạt độ protease của các chủng B. subtilis tuyển chọn

Kết quả (Hình 3.2) cho thấy chủng 129 tƣơng ứng với ký hiệu số 9, 9,, trên đĩa thạch có khả năng sinh protease không ổn định giữa hai lần thí nghiệm còn 3

chủng khác là chủng B5, H12 và VI có khả năng sinh protease ổn định với đƣờng kính vòng thủy phân tƣơng đối đồng đều ở hai lần thí nghiệm lặp lại. Kết quả phân

tích hoạt tính enzyme cho thấy chủng B5, H12 có hoạt tính cao nhất, đạt trên 700

IU/ml và sai khác không có ý nghĩa thống kê. Chủng VI có hoạt tính hơi thấp hợp

một chút nhƣng khá ổn định. Do vậy, 3 chủng B. subtilis là B5, H12 và VI sẽ đƣợc

sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.2. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh protease của các chủng Bacillus subtilis

Các chủng Bacillus subtilis B5, H12 và VI thuần đƣợc nuôi cấy riêng rẽ trên môi trƣờng NB. Quá trình nuôi cấy lắc đƣợc thực hiện ở điều kiện 37 oC, 120 vòng/phút, dịch nuôi cấy vi khuẩn đƣợc thu sau các thời điểm 2, 4, 6, 8, 12, 24 và 48 giờ. Hoạt tính protease trong dịch ngoại bào của các chủng vi khuẩn tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau đƣợc định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein 0,1%. Kết quả đo kích thƣớc vòng phân giải casein đƣợc trình bày trong Hình 3.4.

Hình 3.4. Kích thƣớc vòng phân giải casein bởi protese của các chủng Bacillus

subtilis tạo ra tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau

Kết quả cho thấy hoạt tính protease do cả 3 chủng B. subtilis tạo ra tăng dần theo

thời gian nuôi cấy và đạt giá trị cao nhất vào thời điểm 8 giờ. Hoạt tính giảm không

đáng kể và tƣơng đối ổn định từ 10-24 giờ, sau thời điểm này hoạt tính có xu hƣớng

giảm nhẹ đến 48 giờ. Nhƣ vậy, hoạt độ protease lớn nhất tƣơng đối đồng nhất với

giá trị OD550 cao nhất đo đƣợc của dịch nuôi cấy tại thời điểm 8 giờ tức là lúc mật

độ tế bào lớn nhất (số liệu không đƣợc trình bày ở đây). Mặc dù vậy do hoạt tính

enzym giảm không đáng kể và ổn định trong suốt khoảng thời gian từ 10-24 giờ,

nên đây là thời điểm thuận lợi để thu dịch và kiểm tra hoạt tính protease.

A B

Hình 3.5. Hoạt tính protease của các chủng B. subtilis đƣợc kiểm tra ngay sau

khi thu (A) và sau bảo quản 48 giờ (B)

Trong đó, số 1, 2 và 3 là dịch ngoại bào thu sau 24h nuôi cấy, số 1’,2’ và 3’là

dịch ngoại bào thu sau 48 giờ nuôi cấy

Bên cạnh việc kiểm tra hoạt tính protease tại các thời điểm khác nhau thì

ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tới hoạt tính dịch enzym ngoại bào cũng đƣợc

đánh giá. Protease của dịch ngoại bào đƣợc thu tại hai thời điểm (24 và 48 giờ) ngay

lập tức đƣợc xác định định định tính bằng phƣơng pháp khuếch tán hoặc bảo quản 4 oC trong 48 giờ rồi mới đem kiểm tra. Kết quả thí nghiệm trong Hình 3.5-A cho

thấy không có sự khác nhau đáng kể về hoạt tính protease của dịch ngoại bào thu tại

thời điểm sau 24 và 48 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, thời gian bảo quản dịch ngoại bào

ảnh hƣởng đáng kể tới hoạt tính protease của các chủng, hoạt tính bị giảm rõ rệt sau khi dịch đƣợc bảo quản lạnh 4 oC, 48 giờ (Hình 3.5-B)

Nhƣ vậy, để thuận tiện và giảm thiểu mức độ suy giảm hoạt tính protease,

thời gian nuôi cấy 24 giờ và kiểm tra hoạt tính enzyme ngay sau khi thu dịch nuôi

sẽ đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG VK BACILLUS SUBTILIS VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHÚNG

3.2.1. Đánh giá quá trình sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis

Với mục đích chọn đƣợc thời điểm mà sự sinh trƣởng thích hợp cho việc xử lý chiếu xạ, đƣờng cong sinh trƣởng của 3 chủng tiềm năng B. subtilis B5, H12 và VI đã đƣợc khảo sát.

Các chủng B. subtilis B5, H12 và VI đƣợc nuôi cấy lắc 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ 37 oC để thu đƣợc huyền dịch tế bào sơ cấp. Dịch sơ cấp đƣợc chuyển sang môi trƣờng NB (tỷ lệ 1/100) và tiếp tục nuôi cấy lắc ở 37 oC. Mật độ tế bào đƣợc xác định thông qua giá trị OD của dịch nuôi cấy vi khuẩn ở bƣớc sóng

550 nm tại các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16 và 24 giờ. Đƣờng cong sinh trƣởng của 3 chủng B. subtilis đƣợc trình bày trong Hình 3.6

Hình 3.6. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Bacillus subtilis tiềm năng

(♦ - B5, ■ - H12 và ▲ – VI)

Dựa vào đồ thị Hình 3.6 cùng kết quả số liệu đo OD, chúng tôi nhận thấy giai

đoạn pha Log của 3 chủng vi khuẩn là từ 2-6 giờ. Thời điểm 8 h giá trị OD đạt cao

nhất và ổn định tới 14 h sau nuôi cấy. Tại các thời điểm dài hơn, độ đục của dịch

nuôi cấy giảm, giá trị OD là 0,71, 0,48 và 0,45 tƣơng ứng với các chủng B5, H12 và VI sau 24 giờ nuôi cấy (số liệu không thể hiện trên hình). Điều này có thể đƣợc giải

thích bởi các tế bào kết lại với nhau thành đám có thể quan sát rõ bằng mắt thƣờng,

dịch nuôi cấy trong hơn do vậy giá trị đo OD cũng giảm theo.

Nhƣ vậy, đối với xử lý chiếu xạ dịch nuôi cấy: sau khoảng 4 giờ nuôi cấy thứ

cấp khi quá trình sinh trƣởng của các chủng B. subtilis ở pha Log (OD550= 0,6-0,7),

dịch nuôi sẽ đƣợc đem xử lý chiếu xạ các liều khác nhau trên nguồn gamma Co-60.

3.2.2. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót của các chủng

Bacillus subtilis

+ Xử lý chiếu xạ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis

Tác động của bức xạ gamma tới khả năng sống sót của 03 chủng B. subtilis

đƣợc đánh giá định tính bằng phƣơng pháp nhỏ trực tiếp 5 µl dịch nuôi cấy thứ cấp

đã xử lý chiếu xạ liều khác nhau lên cùng một đĩa petri chứa môi trƣờng NA, đĩa đƣợc nuôi cấy ở 37 oC và quan sát sau 24 giờ. Kết quả cho thấy với cùng một thể

tích huyền dịch tế bào đƣợc nuôi cấy có sự khác biệt rõ rệt về mật độ quần thể giữa

các mẫu vi khuẩn đƣợc chiếu xạ và không chiếu xạ nhƣ đƣợc chỉ ra trong Hình 3.7-

A. Số lƣợng khuẩn lạc dƣờng nhƣ phụ thuộc vào liều bức xạ. Chúng nhanh chóng

giảm ở các mẫu đƣợc chiếu xạ ở liều cao hơn 700 Gy và chỉ có thể thấy một vài

khuẩn lạc đối với mẫu đƣợc chiếu xạ ở 3000 Gy.

Tác động của bức xạ gamma tại các liều chiếu khác nhau tới các chủng B.

subtilis còn đƣợc xác định thông qua việc đếm số khuẩn lạc B. subtilis ở cả dịch

nuôi cấy xử lý chiếu xạ và không chiếu xạ. Rõ ràng khả năng sống sót của vi khuẩn

bị ảnh hƣởng đáng kể bởi bức xạ gamma, tỷ lệ tế bào sống sót ở cả 3 chủng vi

khuẩn đều giảm khi tăng liều bức xạ. Tác động của bức xạ đối với cả 3 chủng B.

subtilis đƣợc biểu diễn nhƣ hàm logarit của các tế bào sống sót (CFU/ml) với liều

bức xạ gamma (Hình 3.7-B).

A B

Hình 3.7. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis sống sót trong dịch nuôi cấy và liều chiếu xạ

Kết quả cũng cho thấy đƣờng cong sống sót của B. subtilis phụ thuộc liều

chiếu xạ dƣờng nhƣ là đƣờng cong dạng hai pha “bimodal” với độ nhạy cảm phóng

xạ giảm dần của các tế bào ở liều xử lý cao hơn 1500 Gy. Sự kết hợp của vi khuẩn

để hình thành các cụm tế bào lớn hơn trong quá trình chiếu xạ có thể đã làm tăng

khả năng kháng xạ của B. subtilis ở các liều xử lý cao hơn này (Yazdi và Ardekani,

2012).

Nghiên cứu khả năng sống sót của bào tử Bacillus sp. bởi bức xạ gamma,

Yoon Ki-Hong và cs nhận thấy tỷ lệ sống sót của bào tử Bacillus sp. 79-23 chiếu

xạ giảm theo cấp số nhân trong dải liều dao động từ 0,5 đến 5 kGy. Ở 3 và 5 kGy

số lƣợng TB còn lại tƣơng ứng xấp xỉ 5% và 1% (Yoon và cs, 1999). Trong một

nghiên cứu khác, Bacillus sp. NMBCC 10023 ban đầu đƣợc phân lập từ đất đã

đƣợc chiếu xạ với liều 1-40 kGy trên nguồn Co-60. Kết quả là tỷ lệ sống sót của

vi khuẩn giảm tuyến tính khi liều chiếu xạ tăng tới 10 kGy. Liều chiếu trên 10

kGy có khả năng tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn và giá trị D10 của chủng Bacillus sp.

NMBCC 10023 này nằm trong khoảng 2-4 kGy (Jong và cs, 2010). Gui Jun và cs

báo cáo rằng tỷ lệ chết của B. subtilis NCD-2 tăng theo liều chiếu xạ gamma trong

khoảng 100 đến 2000 Gy và ở liều 1000 Gy tỉ lệ chết lên đến 99,5% (GuiJun và cs,

2011). Xử lý chiếu xạ tia gamma chủng B. subtilis UTB1 ở dải liều 100 – 3000 Gy

Afsharmaesh & cs cũng nhận thấy tỷ lệ sống sót của chủng UTB1 tỷ lệ nghịch với

liều chiếu xạ và mối tƣơng quan giữa số lƣợng vi khuẩn sống sót (Log Scale) và

liều xử lý dƣờng nhƣ theo một mô hình khá tuyến tính (linear model)

(Afsharmaesh và cs, 2014).

Những khác biệt này có thể giải thích khi cho rằng các yếu tố nhƣ nhiệt độ,

giai đoạn sinh trƣởng, bản chất của môi trƣờng dạng khí, thành phần hóa học của

môi trƣờng nuôi cấy… cũng nhƣ điều kiện sinh lý và khả năng tự chữa sửa của tế

bào đã ảnh hƣởng đến sự tồn tại của chúng sau chiếu xạ.

3.2.3. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh protease của các chủng

Bacillus subtilis

Chiếu xạ là quá trình truyền năng lƣợng điển hình của bức xạ cho đối tƣợng bị

chiếu xạ. Khi chiếu xạ các chủng vi khuẩn ở dạng dung dịch nuôi cấy, cơ chế tác

động gián tiếp của bức xạ ion sẽ chiếm ƣu thế so với tác động trực tiếp. Mặt khác,

tăng hàm lƣợng nƣớc cũng làm tăng ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ lên vi sinh vật do

sự gia tăng quá trình hình thành các gốc tự do từ các phân tử nƣớc gây ra bởi bức

xạ. Vì vậy, chiếu xạ vi khuẩn trong dung dịch nuôi cấy có thể gây ra những tổn

thƣơng DNA ở mức độ phức tạp hơn khi chiếu xạ chúng trên môi trƣờng thạch. Với

giả thuyết này, phƣơng án chiếu xạ dung dịch nuôi cấy vi khuẩn sẽ đƣợc lựa chọn

để sàng lọc các chủng B. subtilis kháng xạ có khả năng sinh protease cao.

Các khuẩn lạc đơn kháng xạ sẽ đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc cho

mỗi liều chiếu) để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh

protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. Những khuẩn lạc có

kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các

đột biến sinh protease cao. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao ở các chủng B. subtilis

tại mỗi liều chiếu xạ đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Tỷ lệ đột biến sinh protease cao của 3 chủng B. subtilis tại các liều chiếu xạ khác nhau

Tỷ lệ đột biến (%) sinh protease cao

Liều chiếu (Gy) B. subtilis B5 B. subtilis H12 B. subtilis VI

100 5,00±0,50 6,00±0,00 4,33±0,28

300 7,33±0,67 7,67±0,39 5,67±0,28

500 8,00±0,37 8,33±0,56 7,67±0,28

700 13,00±0,67 12,33±0,56 15,33±0,44

1000 14,33±0,72 17,00 ±0,67 16,00±0,33

1500 12,67±0,37 16,33±0,78 15,67±0,56

2000 7,33±0,44 9,00±0,50 10,33±0,28

3000 5,33±0,28 7,00±0,50 8,67±0,44

Tỷ lệ đột biến thƣờng liên quan tới liều chiếu xạ (Hoe và cs, 2016). Kết quả

cho thấy đột biến sinh protease cao xuất hiện ở tất cả các liều xạ, tỷ lệ đột biến

dƣờng nhƣ cao hơn trong khoảng liều từ 700-1500 kGy so với các liều khảo sát còn

lại và kết quả lặp lại ở cả 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI. Nhƣ vậy, dựa vào

đƣờng cong sống sót phụ thuộc liều chiếu xạ của 3 chủng vi khuẩn này (Hình 3.7) nhận thấy đột biến sinh protease lớn hơn chủng thuần thu đƣợc nhiều hơn khi số lƣợng tế bào sống sau chiếu xạ giảm từ 1000 đến 10 000 lần (3-4 đơn vị Log) so với dạng thuần không chiếu xạ.

Kết quả thu đƣợc phù hợp với nghiên cứu của Afsharmaesh & cs khi sử dụng bức xạ gamma làm tác nhân gây đột biến ngẫu nhiên với chủng B. subtilis UTB1 để

làm tăng khả năng sinh hợp chất lipopeptide dùng phân hủy độc tố aflatoxin của nấm Aspergillus flavus. Tỷ lệ đột biến mong muốn cao nhất ở chủng này đạt đƣợc

tại liều 2-3 kGy, cũng là liều làm số lƣợng tế bào sống giảm từ 3-4 đơn vị Log so

với mẫu đối chứng không chiếu xạ (Afsharmaesh và cs, 2014).

Trong một nghiên cứu khác Yoon Ki-Hong chiếu xạ chủng Bacillus sp. 79-23

bằng bức xạ gamma trên nguồn Co-60, dải liều từ 3000- 5000 Gy đƣợc lựa chọn để

sàng các chủng đột biến kháng xạ có khả năng sinh CMCase cao hơn 1,5-2 lần so

với chủng thuần. Tại khoảng liều này các tác giả nhận thấy số lƣợng tế bào sống sót sau chiếu xạ xấp xỉ 1-5% (Yoon và cs, 1999). Đối với 3 chủng B. subtilis trong

nghiên cứu này số lƣợng tế bào sống sót sau chiếu xạ không quá 3% ở khoảng liều

700-1500 Gy.

Nghiên cứu của GuiJun đã sử dụng bức xạ gamma với liều chiếu từ 100 đến

2000 Gy trên B. subtilis NCD-2 với mục đích tạo ra các thể đột biến có khả năng ức chế Verticillium dahliae Kleb một loại vi khuẩn gây bệnh thực vật, kết quả chỉ ra tỉ

lệ chết tăng theo liều chiếu. Với liều 1000 Gy tỉ lệ chết lên đến 99,5%. Tần số đột

biến tăng dần trong khoảng liều từ 100 Gy đến 500 Gy và giảm dần từ liều lớn hơn

500 Gy. Liều chiếu từ 400 Gy đến 700 Gy cho tần suất đột biến cao (trung bình trên 15%) và tần suất cao nhất đạt 26,51% tại liều 500 Gy (GuiJun và cs, 2011).

Để tạo ra các đột biến vi sinh vật bằng bức xạ gamma, các phƣơng pháp với

liều lƣợng bức xạ và điều kiện chiếu xạ khác nhau đã đƣợc công bố và tổng hợp (Hoe và cs, 2016). Tuy nhiên, không có bất kỳ một khuyến cáo chung nào về

khoảng liều tối ƣu để đạt đƣợc tỷ lệ đột biến cao do ảnh hƣởng của bức xạ tới mỗi

loài hay chủng VSV là không giống nhau. Do đó, việc xác định liều chiếu tối ƣu

gây đột biến vi khuẩn là không đơn giản. Việc xây dựng đƣờng cong sống sót phụ

thuộc liều, cũng nhƣ tổng hợp các nghiên cứu có liên quan để có đƣợc thông tin về

hiệu quả của liều xử lý, điều kiện chiếu xạ, … là cần thiết để xác định khoảng liều

phù hợp cho các đột biến mong muốn.

3.3. XỬ LÝ CHIẾU XẠ KẾT HỢP SỬ DỤNG KS GÂY ĐỘT BIẾN ĐỊNH

HƢỚNG TỚI CÁC GEN MÃ CHO SẢN PHẨM LIÊN QUAN TỚI QUÁ

TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG BACILLUS

SUBTILIS

Bacillus sp. là một trong số các vi sinh vật mô hình phù hợp với các hƣớng nghiên cứu về sự cải biến di truyền khi điều kiện môi trƣờng thay đổi theo hƣớng bất lợi (Ochi và Hosaka, 2013). Chính vì vậy, chúng là đích trong công nghệ ribosome với tác nhân đột biến là các chất kháng sinh nhằm làm tăng khả năng sinh tổng hợp sản phẩm thứ cấp. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, các đột biến kháng kháng sinh ở Bacillus sp. có khả năng tăng sản xuất enzyme ngoại bào (Ochi, 2007; Wang và cs, 2008; Ochi và Hosaka, 2013). Một số chủng đột biến kháng streptomycin ở B. subtilis cho lƣợng enzyme α – amylase và protease tăng 20 – 30% (Kurosawa và

cs, 2016). Thêm vào đó, lƣợng enzyme ngoại bào cũng tăng lên từ 1,6 – 3 lần khi

gây đột biến gen rpoB ở Bacillus sp. (Hu và Ochi, 2000).

Trong nghiên cứu này, rifampicin và streptomycin đƣợc sử dụng nhƣ các tác

nhân gây đột biến trên B. subtilis nhằm thu đƣợc chủng kháng kháng sinh sản xuất protease tối đa. Đồng thời, xử lý kháng sinh cũng đƣợc kết hợp với chiếu xạ gamma nhằm tăng áp lực chọn lọc và tỷ lệ đột biến, cũng nhƣ làm giảm thời gian sàng lọc đối với các đột biến mong muốn.

3.3.1. Xử lý chiếu xạ kết hợp với kháng sinh streptomycin

3.3.1.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng streptomycin ở các chủng Bacillus subtilis

Huyền dịch tế bào của 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI sau khi chiếu xạ ở

các liều khác nhau trong dải liều 0-3000 Gy ngay lập tức đƣợc trải lên môi trƣờng NA có bổ sung streptomycin nồng độ 20 µg/ml (đối chứng dƣơng của lô thí nghiệm

là dịch nuôi cấy sau chiếu xạ đƣợc trải lên môi trƣờng NA không kháng sinh). Quan

sát và thống kê số lƣợng khuẩn lạc mọc lên từ sau 1-3 ngày để tìm kiếm những

khuẩn lạc vừa kháng xạ vừa kháng kháng sinh. So sánh kết quả thu đƣợc với số

lƣợng khuẩn lạc sống sót sau chiếu xạ ở mỗi liều để tính toán tần số đột biến kháng

streptomycin 20 µg/ml của các chủng B. subtilis ở mỗi liều chiếu xạ (Hình 3.8 ).

Hình 3.8. Tần số đột biến kháng streptomycin 20 µg/ml của 03 chủng B. subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau

Trong tự nhiên, tần số đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh vật và nằm trong khoảng từ 10-10 đến 10-6. Tần số này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10-5 đến 10-1 (Davati và cs, 2013).

Cả 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI sau chiếu xạ đều không xuất hiện bất kỳ một khuẩn lạc đột biến kháng kháng sinh nào trên các đĩa thạch NA có bổ sung 20

µg/ml streptomycin đƣợc cấy huyền dịch tế bào chiếu xạ liều lớn hơn 1200 Gy. Sau

24-48 giờ nuôi cấy, chỉ có những khuẩn lạc đột biến từ các tế bào đƣợc chiếu xạ ở

liều dƣới 1000 Gy xuất hiện với số lƣợng khác nhau ở mỗi chủng vi khuẩn nghiên

cứu. Có thể thấy rằng tần số đột biến tăng khi tăng liều bức xạ. Tần số biến lớn nhất là 1,61x10-3, 1,68x10-2, 2,22x10-2 tƣơng ứng lần lƣợt với các chủng B5, H12 và VI gây ra bởi liều chiếu xạ 1000 Gy. Tần số nhỏ hơn 3,09x10-6, 5,52x10-5, 7,35x10-5 gây ra bởi chiếu xạ ở 100 Gy. Kết quả cũng cho thấy tần số đột biến tự phát của các chủng B5, H12 và VI lần lƣợt là 1,78 x10-6, 1,52x10-6 và 6,67x10-6. Những kết quả thu đƣợc chứng tỏ khả năng kháng streptomycin của các chủng B. subtilis đã đƣợc cải thiện nhờ xử lý chiếu xạ.

3.3.1.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ

các chủng kháng xạ và kháng streptomycin

 Sàng lọc khuẩn lạc kháng xạ và kháng streptomycin 20 µg/ml

Các khuẩn lạc đơn kháng streptomycin 20 µg/ml (ở mỗi liều chiếu từ 0-1000 Gy) sẽ đƣợc nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả năng sinh protease

bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. So sánh đƣờng kính vòng phân

giải, những khuẩn lạc có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với

chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao.

Ở nồng độ kháng sinh 20 µg/ml, từ chủng B. subtilis B5 chúng tôi chọn đƣợc 25 khuẩn lạc tiềm năng có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần (gọi là khuẩn lạc KKS-20), trong đó ở liều 100 Gy thu đƣợc 10 khuẩn lạc, liều 300 Gy thu đƣợc 10 khuẩn lạc và liều 500 Gy thu đƣợc 5 khuẩn lạc. Ở liếu chiếu xạ 700 và 1000 Gy (Bảng 3.4), chúng tôi đã không thu đƣợc khuẩn lạc tiềm năng nào từ chủng Bacillus

subtilis B5 kháng streptomycin 20 µg/ml.

Đối với 2 chủng H12 và VI, mặc dù các khuẩn lạc kháng xạ và kháng streptomycin 20 µg/ml đều còn khả năng sinh protease song không thu đƣợc bất kỳ

một khuẩn lạc tiềm năng nào ở tất cả các liều xử lý. Hosoya và cộng sự khi nghiên

cứu với S. coelicolor A3(2) trên môi trƣờng bổ sung kháng sinh cũng nhận thấy bên

cạnh những khuẩn lạc đột biến có khả năng sinh kháng sinh vƣợt trội so với chủng

thuần, vẫn tồn tại các khuẩn lạc đột biến không có hiệu quả với việc sản xuất thuốc kháng sinh (Hosoya và cs, 2003)

Bảng 3.4.Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 20 µg/ml có khả năng sinh protease cao từ các chủng B. subtilis B5 chiếu xạ

20 µg/ml streptomycin

Liều chiếu

(Gy) Số khuẩn lạc kháng KS

Số khuẩn lạc (KKS-20) có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần

100 142 10

300 127 10

500 77 5

700 12 -

1000 3 -

Tổng 361 25

(-) Không sàng lọc được khuẩn lạc tiềm năng nào

Với mục đích tăng áp lực chọn lọc, 25 khuẩn lạc kháng streptomycin 20 µg/ml

có đƣờng kính vòng phân giải lớn hơn chủng thuần (KKS-20) đƣợc tiếp tục sàng lọc

ở các nồng độ streptomycin cao hơn là 50, 100 và 200 µg/ml và chọn môi trƣờng NB để kiểm tra khả năng sinh protease của chúng. Tuy nhiên khi đẩy lên các nồng

độ KS 50 và 100 µg/ml thì mật độ khuẩn lạc ở các đĩa khá dày, không thu đƣợc các khuẩn lạc riêng rẽ vì thế hai nồng độ KS này sẽ không đƣợc lựa chọn để sàng lọc các khuẩn lạc đột biến.

 Sàng lọc khuẩn lạc kháng xạ và kháng kháng sinh trên môi trường

streptomycin 200 µg/ml

Quan sát tốc độ và mật độ sinh trƣởng của các khuẩn lạc trên MT NA bổ sung

streptomycin nồng độ 200 µg/ml nhận thấy: thời gian sinh trƣởng của các khuẩn lạc

kháng kháng sinh là khá dài (2-3 ngày); trong 25 khuẩn lạc KKS-20 đƣợc cấy lên

đĩa NA bổ sung streptomycin 200 µg/ml, chỉ có một số đĩa có sự xuất hiện khuẩn

lạc và mật độ khuẩn lạc trên các đĩa là khác nhau (tƣơng ứng với 75 khuẩn lạc/3 đĩa

ở liều 100 Gy, 90 khuẩn lạc/3 đĩa ở liều 300 Gy và 115 khuẩn lạc/3 đĩa ở liều 500

Gy). Điều này chứng tỏ, giữa các khuẩn lạc kháng kháng sinh 200 đã có sự khác nhau khi điều kiện môi trƣờng thay đổi theo hƣớng khắt khe hơn.

Kiểm tra khả năng sinh protease của tất cả 280 khuẩn lạc kháng kháng sinh 200 này và kết quả thu đƣợc 6 khuẩn lạc có vòng phân giải vƣợt trội so với chủng

thuần (gọi là khuẩn lạc KKS-200) ký hiệu là 301, 321, 322 (xuất phát từ chủng

Bacillus subtilis B5 chiếu xạ liều 300 và khuẩn lạc KKS-20) và 528, 533, 609 (xuất

phát từ chủng Bacillus subtilis B5 chiếu xạ liều 500 và khuẩn lạc KKS-20) (Bảng

3.5).

Bảng 3.5. Số lƣợng khuẩn lạc kháng streptomycin 200 µg/ml có khả năng sinh protease cao từ các chủng B. subtilis B5 kháng xạ và kháng streptomycin 20 µg/ml

Streptomycin 200 µg/ml

Liều chiếu (Gy) Số khuẩn lạc kháng KS Số khuẩn lạc (KKS-200) có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần

100 75 -

300 90 3 (Ký hiệu: 301, 321, 322)

500 115 3 (Ký hiệu: 528, 533, 609)

(-)Không sàng lọc được khuẩn lạc tiềm năng nào

Chọn riêng các khuẩn lạc KKS-200 (301, 321, 322, 528, 533, 609) và so sánh kích thƣớc vòng phân giải casein của chúng với chủng thuần B. subtilis B5 ban đầu

và các khuẩn lạc KKS-20, kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.9 và Hình 3.10.

Hình 3.9. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng B. subtilis B5 thuần và của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 300 Gy.

Hình 3.10. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng B. subtilis B5 thuần và

của các khuẩn lạc kháng streptomycin xuất phát từ chủng thuần chiếu xạ liều 500 Gy.

Sau toàn bộ quá trình sàng lọc các chủng kháng streptomycin 200 µg/ml, cả 6

khuẩn lạc 301, 321, 322, 528, 533 và 609 đƣợc đƣa tiếp lên môi trƣờng bổ sung

streptomycin nồng độ cao hơn là 400 µg/ml.

 Sàng lọc khuẩn lạc kháng xạ và kháng streptomycin 400 và 800 µg/ml

Trên MT streptomycin 400 µg/ml, chúng tôi chỉ thu đƣợc 2 khuẩn lạc duy

nhất sau 3 ngày nuôi cấy từ đĩa cấy chủng 609. Tuy nhiên, kết quả kiểm tra hoạt

tính cho thấy 2 khuẩn lạc KKS 400 vẫn còn khả năng sinh protease tuy nhiên

nhỏ hơn so với chủng thuần. Tiếp tục đƣa 2 khuẩn lạc này lên môi trƣờng kháng

sinh 800 µg/ml để tăng khả năng sàng lọc khuẩn lạc KKS có khả năng sản xuất

protease lớn tuy nhiên không có bất kỳ một khuẩn lạc nào mọc sau 7 ngày nuôi cấy.

Mặc dù đã đƣa các khuẩn lạc kháng KS tới nồng độ streptomycin gây chết

hoàn toàn 800 µg/ml, nhƣng không thu đƣợc thêm khuẩn lạc nào có khả năng sinh

protease lớn. Nhƣ vậy, bên cạnh những khuẩn lạc đột biến có khả năng sinh protease vƣợt trội so với chủng thuần, vẫn tồn tại các khuẩn lạc đột biến không có hiệu quả với việc sản xuất enzyme. Giải thích cho vấn đề này, các nhà khoa học giải trình tự gen và nhận thấy cả thể đột biến có lợi và không có lợi khi tồn tại đƣợc trên môi trƣờng bổ sung kháng sinh đều xuất hiện các đột biến điểm, tuy nhiên vị trí các đột biến là khác nhau hoặc giống nhau nhƣng sự biến đổi thành amino acid này

thành amino acid khác là khác nhau giữa các khuẩn lạc (Hosoya và cs, 2003).

3.3.2. Xử lý chiếu xạ kết hợp với rifampicin

3.3.2.1. Ảnh hƣởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng kháng rifampicin ở các chủng

Bacillus subtilis

Sau khi chiếu xạ ở các liều khác nhau trong dải liều 0-3000 Gy, huyền dịch tế bào của 3 chủng B. subtilis B5, H12 và VI ngay lập tức đƣợc trải lên môi trƣờng NA có bổ sung rifampicin nồng độ 0,2 µg/ml (đối chứng dƣơng của lô thí nghiệm là dịch nuôi cấy sau chiếu xạ đƣợc trải lên môi trƣờng NA không kháng sinh). Kết quả

đánh giá tần số đột biến kháng rifampicin 0,2 µg/ml của các chủng B. subtilis ở mỗi

liều chiếu xạ trong Hình 3.11 cho thấy, các chủng B. subtilis trong nghiên cứu có tần số đột biến tự phát kháng rifampicin 0,2 µg/ml là: 3,26x10-5, 7,6x10-5 và 8,4x10- 5 tƣơng ứng lần lƣợt với các chủng B5, H12 và VI. Tần số đột biến kháng rifampicin của các chủng Bacillus tăng lên nhờ xử lý chiếu xạ tia gamma. Tần số đột biến tăng đáng kể khi liều chiếu tăng và đạt giá trị cao nhất ở liều 2000 Gy (1,78x10-1, 1,17x10-1 và 0,78x10-1 tƣơng ứng với chủng B5, H12 và VI), cao hơn tần số đột biến tự phát từ 0,93 – 5,46x103 lần. Ở các liều xử lý cao hơn (2500 và 3000 Gy) tần số đột biến có xu hƣớng giảm.

Hinh 3.11. Tần số đột biến kháng rifampicim 0,2 µg/ml của 03 chủng B. subtilis B5, H12 và VI ở các liều chiếu xạ khác nhau

Nghiên cứu khả năng kháng rifampicin 150 µg/ml của E. coli, Al-Sudany & cs nhận thấy tần số đột biến tự phát của chủng này là 0,48x10-12 và tần số này tăng lên nhờ xử lý chiếu xạ, tần số cao nhất đạt 3,4x1-12 ở liều 1Gy (Al-Sudany và cs, 2010).

Một số các nghiên cứu trên các chủng vi sinh vật khác cũng cho thấy xử lí

chiếu xạ giúp tăng áp lực chọn lọc, tăng tần suất thu đƣợc thể đột biến mong muốn

đặc biệt là tăng khả năng kháng với kháng sinh của vi sinh vật (De Groot và cs,

2005; Al-Sudany và cs, 2010).

3.3.2.2. Sàng lọc các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao từ các khuẩn lạc kháng xạ và kháng rifampicin

Các khuẩn lạc đơn kháng rifampicin 0,2 µg/ml sẽ đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc ở mỗi liều chiếu) để nuôi riêng rẽ trên môi trƣờng NB và kiểm tra khả

năng sinh protease bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch-casein. So sánh

đƣờng kính vòng phân giải, những khuẩn lạc có kích thƣớc vòng phân giải casein lớn hơn 10% so với chủng thuần đƣợc xem là các đột biến sinh protease cao.

Ở nồng độ kháng sinh 0,2 µg/ml, chúng tôi chọn đƣợc 82 khuẩn lạc tiềm năng

(gọi là khuẩn lạc KKS-0,2). trong đó có 68 khuẩn lạc từ chủng B5 chiếu xạ và 14

khuẩn lạc từ chủng H12 chiếu xạ (Bảng 3.6). Không thu đƣợc khuẩn lạc tiềm năng

nào từ chủng VI. Bảng 3.6. Số lƣợng khuẩn lạc tiềm năng kháng rifampicin 0,2 µg/ml sinh protease cao đƣợc sàng lọc từ các chủng B. subtilis chiếu xạ

Liều Số khuẩn lạc kháng rifampicin 0,2 µg/ml có vòng

chiếu phân giải casein lớn hơn chủng thuần

(Gy) B. subtilis B5 B. subtilis H12

100 10 5

300 7 5

500 11 -

700 10 3

1000 6 1

1500 13 -

2000 11 -

2500 - -

3000 - -

Tổng 68 14

(- )Không sàng lọc được khuẩn lạc tiềm năng nào

Với mục đích tăng áp lực chọn lọc, 82 khuẩn lạc này đƣợc tiếp tục sàng lọc ở

nồng độ rifampicin cao hơn, là 0,4, 0,8, 1 và 2 µg/ml. Tuy nhiên, khi đẩy lên các

nồng độ rifampicin cao hơn là 0,4, 0,8 và 1 µg/ml thì mật độ khuẩn lạc ở các đĩa

khá dày, không thu đƣợc các khuẩn lạc riêng rẽ vì thế các nồng độ KS này sẽ không đƣợc lựa chọn để sàng lọc các khuẩn lạc đột biến.

 Sàng lọc các khuẩn lạc B. subtilis B5 kháng rifampicin

Với chủng B. subtilis B5 khi đƣa các khuẩn lạc KKS-0,2 lên môi trƣờng NA

có bổ sung rifampicin 2 µg/ml thu đƣợc duy nhất 2 khuẩn lạc (xuất phát từ chủng

B5 chiếu xạ liều 2000) có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần (gọi là khuẩn lạc KKS-2). Hai khuẩn lạc này tiếp tục đƣợc cấy lên đĩa NA bổ sung rifampicin

nồng độ 4 µg/ml, kết quả chỉ một đĩa duy nhất xuất hiện 7 khuẩn lạc. Sau 3 ngày

nuôi cấy, kiểm tra khả năng sinh protease của cả 7 khuẩn lạc kháng KS 4 µg/ml này thì chúng tôi thu đƣợc duy nhất một khuẩn lạc (ký hiệu là: 1909) có vòng phân giải

casein lớn hơn chủng thuần, khuẩn lạc KKS-0,2 và KKS-2 µg/ml.

Chọn riêng các khuẩn lạc KKS-4 là 1909 và so sánh kích thƣớc vòng phân giải casein của nó với chủng thuần B. subtilis B5 ban đầu và các khuẩn lạc KKS-0,2 và

KKS-2 kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.12

Hình 3.12. Kích thƣớc vòng phân giải casein của chủng Bacillus subtilis B5

thuần và của các khuẩn lạc kháng rifampicin

Tiếp tục đƣa khuẩn lạc 1909 này lên MT bổ sung rifampicin 6 µg/ml để tăng

khả năng sàng lọc khuẩn lạc KKS có khả năng sản xuất protease lớn tuy nhiên

không có bất kỳ một khuẩn lạc nào mọc sau 7 ngày nuôi cấy.

 Sàng lọc các khuẩn lạc B. subtilis H12 kháng rifampicin

Mƣời bốn khuẩn lạc B. subtilis H12 kháng rifampicin 0,2 µg/ml sau khi cấy

trên đĩa NA có bổ sung rifampicin nồng độ 2 µg/ml, lựa chọn các khuẩn lạc có vòng phân giải casein lớn hơn chủng thuần và tiếp tục đƣa chúng lên các nồng độ kháng sinh cao hơn để tăng khả năng sàng lọc khuẩn lạc KKS có khả năng sản xuất protease lớn. Cuối cùng chúng tôi chọn đƣợc 2 khuẩn lạc kháng rifampicin 12

µg/ml (ký hiệu là 1844 và 1847) xuất phát từ chủng H12 chiếu xạ liều 700 Gy có

vòng phân giải casein lớn vƣợt trội so với chủng thuần. Ở liều 1000 Gy chọn đƣợc 8

khuẩn lạc có vòng phân giải caseein lớn vƣợt trội ở các nồng độ rifampicin khác nhau ký hiệu là; 1379, 1665, 1670 (kháng rifampicin 8 µg/ml), 19, 1713 (kháng

rifampicin 10 µg/ml), 2, 6, 1904 (kháng rifampicin 12 µg/ml).

Chúng tôi đã không thu đƣợc bất kỳ một khuẩn lạc H12 từ các khuẩn lạc tiềm năng nói trên khi cấy chúng lên môi trƣờng NA có bổ sung nồng độ rifampicin cao

hơn 12 µg/ml.

(A) (B)

Hình 3.13. Vòng phân giải casein của một số khuẩn lạc B. subtilis H12 kháng xạ

và kháng rifampicin (A: Khuẩn lạc kháng rifampicin 12 µg/ml và chiếu xạ liều 700 Gy; B: Khuẩn lạc kháng rifampicin 8 µg/ml và chiếu xạ liều 1000 Gy)

Có thể nhận thấy, việc tăng dần áp lực chọn lọc đã tạo ra các khuẩn lạc B. subtilis kháng rifampicin mạnh (kháng rifampicin 12 µg/ml) gấp 60 lần so với nồng độ thử nghiệm ban đầu (0,2 µg/ml rifampicin).

Nhƣ vậy, sau quá trình xử lý chiếu xạ kết hợp với streptomycin và rifampicin gây đột biến, 17 khuẩn lạc B. subtilis có khả năng sinh protease vƣợt trội so với chủng thuần ban đầu đã đƣợc sàng lọc và lựa chọn (Bảng 3.7). Các khuẩn lạc này sẽ

đƣợc phân tích và xác định các gen mã cho sản phẩm liên quan tới quá trình sinh tổng hợp protease.

Bảng 3.7. Các khuẩn lạc Bacillus subtilis có khả năng sinh protease vƣợt trội

ST T Chủng gốc Liều chiếu (Gy) Nồng độ KS (µg/ml) Hoạt độ protease (IU/ml) Đƣờng kính vòng phân giải casein (mm) Str* Rif* Khuẩn lạc B. subtilis sinh protease vƣợt trội

1 301 300 200 24,83±1,44 1556,32±51,91

2 321 300 200 26,17±0,89 1684,15±55,10

3 322 300 200 29,33±1,78 1826,42±58,66

4 528 500 200 23,83±1,44 1518,75±59,97 B.subtilis B5 5 533 500 200 27,83±0,78 1735,84±65,40

6 609 500 200 33,50±0,33 2017,54±21,35

7 1909 1000 4 31,66±0,89 1880,45±74,97

8 18,66±0,89 745,83±19,40 B5 thuần

9 2 1000 12 28,17±0,55 1756,73±30,13

10 6 1000 12 30,00±1,67 1864,58±65,29

11 19 1000 10 29,17±1,56 1834,28±29,69

12 1379 1000 8 28,00±1,67 1772,15±78,44

13 1665 1000 8 27,17±1,72 1718,66±63,37 B.subtilis H12 14 1670 1000 8 29,08±1,61 1837,12±65,74

15 1713 1000 10 25,50±1,16 1682,47±61,36

16 1844 700 12 29,00±0,00 1841,27±78,41

17 1847 700 12 28,33±1,44 1738,56±76,43

18 1904 1000 12 27,92±1,11 1731,25±66,29

19 18,25±0,50 726,67±26,97 H12 thuần

*Str - Streptomycin; Rif - Rifampicin

3.4. XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC GEN rpoB, rpsL Ở CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO HƠN CHỦNG GỐC

3.4.1. Khuếch đại các gen rpoB và rpsL ở các chủng gốc, các khuẩn lạc sinh

protease cao hơn chủng gốc

3.4.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ các chủng gốc và khuẩn lạc sinh protease cao

Đầu tiên DNA tổng số đƣợc tách chiết từ 2 chủng B. subtilis thuần (B5 và

H12) và từ 17 khuẩn lạc B. subtilis đã đƣợc sàng lọc có khả năng sinh proteinase cao

vƣợt trội so với chủng gốc (danh sách trong Bảng 3.7) bằng bộ Kit WizardSV

Genomic DNA Purification System.

Chất lƣợng DNA tổng số đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%;

nồng độ và độ sạch đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng

260 nm/280 nm (OD260 và OD280) trên máy Nano Drop (Thermo Fisher). Kết quả

đƣợc trình bày trên Hình 3.14 cho thấy băng DNA sắc nét, đạt chất lƣợng đối với

các phân tử DNA có kích thƣớc lớn.

Hình 3.14. Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ các chủng B. subtilis thuần và

các khuẩn lạc có khả năng sinh protease vƣợt trội trên gel agarose 0,8 %

1-19: DNA tổng số. M: Thang chuẩn DNA SY4,6 kb

Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ (OD) ở bƣớc sóng 260 nm trên máy Nano Drop

OD260/ OD280 OD260/O D280 Nồng độ (ng/µl) Nồng độ (ng/µl)

Mẫu Khuẩn lạc sinh protease cao 301 321 322 528 533 609 1909 B5 1 2 3 4 5 6 7 8 7,2 10,4 8,0 7,4 7,8 7,2 7,9 9,6 1,88 1,86 1,83 1,86 1,86 1,80 1,77 1,91 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 8,8 7,7 7,6 7,1 9,4 10,5 15,6 12,8 10,9 12,5 9,7 1,85 1,87 1,84 1,82 1,81 1,83 1,88 1,74 1,84 1,85 1,81 Mẫu Khuẩn lạc sinh protease cao 2 6 19 1379 1665 1670 1713 1844 1847 1904 H12

Kết quả trình bày trên Bảng 3.8 cho thấy nồng độ DNA đạt yêu cầu cho các thí

nghiệm tiếp theo và độ sạch (tính theo tỷ lệ OD260/OD280) đạt chất lƣợng khi nằm

trong giới hạn cho phép từ 1,8-2,0.

3.4.1.2. Khuếch đại các gen rpoB và rpsL từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR

DNA tổng số có chất lƣợng đảm bảo làm khuôn cho phản ứng PCR. Mƣời (10)

ng DNA tổng số đƣợc sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với các thành phần và

điều kiện nhƣ trình bày trong Bảng 2.4. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1,5 %, nhuộm với Ethidium Bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng UV 260 nm. Kết quả

điện di đƣợc trình bày trên Hình 3.15 cho thấy các sản phẩm PCR rõ nét, đặc hiệu có

kích thƣớc đúng nhƣ dự tính (dựa vào tính toán khi thiết kế mồi cho phép khuếch đại đoạn gen dài 0,55 kb).

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen rpoB (A) và gen rpsL

(B) từ 02 chủng B. subtilis thuần và các khuẩn lạc có khả năng sinh protease vƣợt

trội trên gel agarose 1,5%.

1-19: Sản phẩm PCR đặc hiệu cho đoạn gen rpoB và rpsL có kích thƣớc 0,55 kb;

(-): Mẫu đối chứng âm không có DNA khuôn; M: Thang chuẩn DNA 100 bp)

3.4.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR khuếch đại các gen rpoB và rpsL để giải trình tự xác định đột biến

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo đúng hƣớng dẫn của bộ Kit High Pure

PCR Product Purification Kit (Roche) để thu đƣợc sản phẩm chất lƣợng sạch

dùng cho phản ứng xác định trình tự. Sau tinh sạch, sản phẩm của một số mẫu đƣợc điện di kiểm tra ngẫu nhiên, kết quả điện di đƣợc trình bày trên Hình 3.16.

Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR tinh sạch tƣơng ứng với đoạn gen

rpoB và rpsL trên gel agarose 1,5%. (1-19): 2 chủng thuần và 17 khuẩn lạc có khả năng sinh protease vƣợt trội theo Bảng 3.8.

(A). 1-5: Sản phẩm PCR đặc hiệu cho đoạn gen rpoB và rpsL của 5 khuẩn lạc

(1-5). (B). 6-19: Sản phẩm PCR đặc hiệu cho đoạn gen rpoB của 14 khuẩn lạc

(6-19). (C). 6-19: Sản phẩm PCR đặc hiệu cho đoạn gen rpsL của 14 khuẩn

lạc(6-19). M: Thang chuẩn DNA 100 bp. (-): Đối chứng âm không có DNA khuôn.

Các băng điện di thu đƣợc đều có kích thƣớc khoảng 0,5 kb, sắc nét và rõ

ràng chứng tỏ quá trình tinh sạch sản phẩm PCR thành công và sản phẩm thu đƣợc đạt tiêu chuẩn cho thí nghiệm tiếp theo.

3.4.1.4. Giải trình tự gen rpoB của 2 chủng thuần và các khuẩn lạc sinh protease vƣợt trội

Để xác định đột biến có thể xảy ra ở gen rpoB và rpsL, các sản phẩm PCR

khuếch đại hai gen này sẽ đƣợc giải trình tự trực tiếp bằng hệ thống giải trình tự tự

động (First One-Hàn Quốc). Mƣời chín mẫu, trong đó có 2 mẫu của chủng thuần

(B5 và H12) và 17 khuẩn lạc sinh protease vƣợt trội sàng lọc từ 2 chủng này đƣợc

giải trình tự cho cả 2 gen. Kết quả giải trình tự gen rpoB ở chủng B5 và chủng H12

đƣợc so sánh với ngân hàng DataBank khẳng định là đây là gen mã hóa tiểu phần beta của RNA polymerase từ Bacillus (Hình 3.17). Nhƣ vậy việc khuếch đại gen đã chính xác đúng gen rpoB và rpsL mong muốn.

Hình 3.17. So sánh trình tự nucleotide của gen rpoB ở 2 chủng thuần B. subtilis

B5 và B. subtilis H12. Query: gen rpoB của chủng B5. Sbjct: gen rpoB của

rpoB 1 DTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLTRER 60 DTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLTRER WP003156440 439 DTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLTRER 498 rpoB 61 AGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETGKVT 120 AGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETGKVT WP003156440 499 AGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETGKVT 558 rpoB 121 PRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR 159 PRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR WP003156440 559 PRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR 597

chủng H12.

Hình 3.18. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần β – RNA polymerase đƣợc mã hóa từ gen rpoB ở 2 chủng thuần B. subtilis B5 và B. subtilis H12 và trình tự

RNA polymerase subunit beta của Bacillus trên ngân hàng gen mã số

WP003156440.

Trình tự nucleotide của hai chủng thuần Bacillus B5 và H12 đƣợc so sánh với nhau bằng chƣơng trình BLASTN. Kết quả so sánh trên Hình 3.17 cho thấy không

có nucleotide nào khác nhau ở gen rpoB giữa 2 chủng và trùng khớp với trình tự nucleotide trên gen rpoB ở chủng B. subtilis trong nghiên cứu của Davati và Wayne (Davati và cs, 2013; Wayne và cs, 2003). Trình tự gen rpoB có tính bảo thủ cao, đƣợc sử dụng nhƣ một marker để phân loại vi sinh vật và nghiên cứu phát sinh loài. Trong nghiên cứu của mình, Ko và cộng sự (Ko và cs, 2003) đã sử dụng PCR đa mồi và phân tích giải trình tự gen rpoB để phân biệt chủng B. anthrasis so với 2 chủng B. thuringiensis và B. cereus. Ba chủng này rất gần nhau trong cây phả hệ, thậm chí, các phƣơng pháp nhận biết thông dụng nhƣ phân tích sai hình nhiễm sắc thế hoặc phân tích trình tự gen 16S-23S đều không thể phân biệt đƣợc. Nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng giữa chủng B. anthracis và 2 chủng B. cereus và B. thuringiensis chỉ sai khác ở 1 Nu duy nhất trên gen rpoB ở vị trí dẫn tới sai khác 1 amino acid S442→ A442. Phân tích giải trình tự gen rpoB các tác giả cũng chỉ ra rằng mức độ tƣơng đồng về trình tự gen rpoB của ba chủng này đạt trên 95,3%. Do vậy sự tƣơng đồng 100% giữa 2 chủng B. subtilis H12 và B. subtilis B5 là hoàn toàn phù hợp các kết quả trên thế giới. Trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen của hai chủng cũng tƣơng đồng 100% với trình tự amino acid của nhiều gen tƣơng ứng ở Bacillus, điển hình là trình tự mã số WP003156440 (Hình 3.18).

Hình 3.19. Trình tự gen rpoB của chủng thuần (B5_rpoB) với khuẩn lạc đột biến 609 (rpoB-M). Vị trí đột biến đƣợc chỉ ra bằng mũi tên đỏ.

Chủng 609 xuất hiện hai đột biến G135A (vị trí trên toàn bộ gen rpoB là G1428A), A197G (vị trí trên toàn bộ gen rpoB là A1490G) trên gen rpoB (Hình 3.19). Trong khi đó, các khuẩn lạc đột biến có nguồn gốc từ chủng B. subtilis H12 đều có 1 đột biến xảy ra ở cùng một vị trí 151 biến C thành A (tƣơng ứng với vị trí 1444 trên toàn bộ gen rpoB). Chủng 1909 thấy xuất hiện đột biến nhƣng do đỉnh tín hiệu không rõ ràng nên chƣa khẳng định đƣợc đó là đột biến thay thế nucleotide G487C và có chèn thêm nucleotide T ở vị trí 489. Riêng đột biến này cần thiết phải kiểm tra lại.

Hình 3.20. Trình tự gen rpoB của chủng thuần (H12) với khuẩn lạc đột biến 2,

khuẩn lạc 6 và khuẩn lạc 1379 theo thứ tự ảnh từ trên xuống dƣới. Vị trí đột biến

đƣợc chỉ bởi mũi tên đỏ.

Sau khi giải trình gen rpoB ở 17 khuẩn lạc B. subtilis kháng xạ và kháng kháng sinh có khả năng tổng hợp protease vƣợt trội đồng thời tiến hành so sánh mức độ tƣơng đồng về amino acid với chủng thuần bằng chƣơng trình BLASTP nhận thấy 14/17 khuẩn lạc mang đột biến ở gen rpoB và tất cả các đột biến đều là đột biến thay thế nucleotide (Bảng 3.9) Bảng 3.9. Danh sách các khuẩn lạc có đột biến ở gen rpoB. Vị trí đột biến đƣợc chỉ ra trên kết quả trình tự

Đột biến STT Đột biến Chủng gốc Chủng gốc

ST T 1 2 3 4 5 Khuẩn lạc 301 321 322 528 533 9 10 11 12 13 Khuẩn lạc 2 6 19 1379 1665 C151A C151A C151A C151A C151A

6 609 14 1670 C151A Bacillus subtilis B5 Bacillus subtilis H12

7 1909 15 1713 C151A

B5 - - - G487C G487C, C488T G135A, A197G G487C, +T489 16 17 18 19 C151A C151A C151A 1844 1847 1904 H12

(-) Không phát hiện được đột biến ở gen rpoB

Kết quả (Bảng 3.9) cho thấy, từ 7 chủng kháng kháng sinh và kháng xạ xuất

phát từ chủng B. subtilis B5 chúng tôi đã phát hiện đƣợc 4/7 chủng có khả năng sinh

protease vƣợt trội mang 1 đột biến thay thế, hầu hết các đột biến thay thế G thành C

hoặc C thành T. Riêng khuẩn lạc 533 và 609 mang 2 đột biến (G thành C, C thành T

ở 533 và G thành A, A thành G ở 699).

3.4.1.5. Giải trình tự gen rpsL của 2 chủng thuần và các chủng đột biến

Gen rpsL ở 2 chủng thuần B. subtilis B5 và B. subtilis H12 đƣợc giải trình tự

và so sánh với nhau. Kết quả cho thấy trình tự nucleotide gen rpsL của hai chủng

mức độ tƣơng đồng 100% (Hình 3.21).

Hình 3.21. So sánh trình tự nucleotide của gen rpsL ở 2 chủng thuần B. subtilis

B5 và B. subtilis H12. Query: gen rpsL của chủng B5. Sbjct: gen rpsL của chủng

H12.

Khi so sánh trình tự của gen rpsL của 2 chủng thuần B. subtilis B5 và H12 với

các chủng đột biến có khả năng tổng hợp protease cao thì không phát hiện đƣợc bất

kỳ thay đổi nucleotide. Nói cách khác, gen rpsL không bị đột biến. Vì vậy, tính

kháng kháng sinh và khả năng tổng hợp protease cao hơn chủng thuần chỉ liên quan

đến gen rpoB chứ không chịu tác động của thay đổi nucleotide ở gen rpsL. Kết quả

giải trình tự gen rpsL của chủng thuần B5 và H12 với các chủng đột biến đƣợc trình

này trên Hình 3.22 và Hình 3.23.

Hình 3.22. Trình tự gen rspL của chủng thuần (B5_rpsL) với khuẩn lạc đột biến 301_rpsL, khuẩn lạc 321_rspL và khuẩn lạc 609_rpsL. Trình tự minh họa đầu 5‟ của gen rpsL, không có nucleotide khác biệt giữa chủng thuần và các khuẩn lạc đột biến.

Hình 3.23. Trình tự gen rpsL của chủng thuần (H12_rpsL) với khuẩn lạc đột biến 2_rpsL, khuẩn lạc 19_rpsL và khuẩn lạc 1904_rpsL. Trình tự minh họa đầu 3‟ của gen rpsL, không có nucleotide khác biệt giữa chủng thuần và các chủng đột biến.

3.4.1.6. Phân tích so sánh kết quả giữa kiểu đột biến, vị trí đột biến với khả năng sinh protease

Dòng đột biến 609-B5 (có 2 đột biến điểm tại vị trí 135 và 197. Hai đột biến điểm

xảy ra nhƣng chỉ có 1 amino acid bị thay đổi, nhƣ vậy đột biến nucleotide thứ nhất là mã thoái hóa (không làm thay đổi amino acid). Vị trí đột biến này đƣợc tra ngƣợc lại

trên protein RpoB đầy đủ là vị trí amino acid E497G. 10 20 30 40 50 60 | | | | | | RPOB_B5 DTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLTRER RPOB_609 DTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLTRGR ********************************************************** * 70 80 90 100 110 120 | | | | | | RPOB_B5 AGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETGKVT RPOB_609 AGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETGKVT ************************************************************ 130 140 150 | | | RPOB_B5 PRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR RPOB_609 PRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR ***************************************

Hình 3.24. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở

10 20 30 40 50 60 | | | | | | RPOB_533 SIQDTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLT RPOB_B5 SIQDTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLT ************************************************************ 70 80 90 100 110 120 | | | | | | RPOB_533 RERAGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETG RPOB_B5 RERAGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETG ************************************************************ 130 140 150 160 | | | | RPOB_533 KVTPRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVACFR RPOB_B5 KVTPRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR *************************************** **

chủng thuần B5 và dòng đột biến 609-B5.

Hình 3.25. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần beta RNA Polymerase ở

chủng thuần B5 và dòng đột biến 533-B5.

Tƣơng tự, trình tự nucleotide của gen rpoB ở dòng đột biến 19-H12 (xuất phát từ chủng thuần H12) đƣợc so sánh với trình tự amino acid của tiểu phần β - RNA polymerase trong ngân hàng dữ liệu Databank. Kết quả cho thấy đột biến điểm C thành A ở nucleotide 1444 làm thay đổi amino acid H482N của protein rpoB (Hình 3.26).

RPOB_19 1 SIQDTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTNKRRLSALGPGGLT 60 SIQDTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELT+KRRLSALGPGGLT RPOB_H12 436 SIQDTNTITPQQLINIRPVIASIKEFFGSSQLSQFMDQTNPLAELTHKRRLSALGPGGLT 495 RPOB_19 61 RERAGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETG 120 RERAGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETG RPOB_H12 496 RERAGMEVRDVHYSHYGRMCPIETPEGPNIGLINSLSSFAKVNRFGFIETPYRRVDPETG 555 RPOB_19 121 KVTPRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR 162 KVTPRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR RPOB_H12 556 KVTPRIDYLTADEEDNYVVAQANAKLSDDGSFLDDSIVARFR 597 *********************************** ***

Hình 3.26. So sánh trình tự amino acid của tiểu phần β - RNA polymerase ở chủng

thuần H12 và chủng đột biến 19-H12

Nhƣ vậy, có hai thay đổi amino acid xảy ra ở vị trí 497 ở dòng 609-B5 và vị trí

482 ở dòng 19-H12. Các đột biến trong vùng từ vị trí amino acid 410 đến amino acid

600 đƣợc xem là đột biến kháng rifampicine (Davati và cs, 2013). Đột biến xảy ra ở vùng này của tiểu phần β-RNA polymerase cũng đƣợc xem có liên quan đến khả năng

tăng tổng hợp các sản phẩm thứ cấp ở xạ khuẩn (Wang và cs, 2018), tăng khả năng

tổng hợp protease ở Bacillus (Kurosawa và cs, 2006) (Bảng 3.10).

Hoạt độ protease (IU/ml) ST T Đột biến Chủng gốc Khuẩn lạc

1 2 3 4 Đột biến dẫn tới thay đổi aa R595C 1556,32±51,91 1684,15±55,10 1826,42±58,66 1518,75±59,97 301 321 322 528

Bacillus subtilis B5 - E497G 1735,84±65,40 2017,54±21,35 533 609 5 6

Bảng 3.10. Tổng hợp các đột biến xuất hiện trên gen rpoB các chủng gây đột biến chọn lọc và hoạt tính protease của các chủng này. Vị trí đột biến trên gen rpoB G1782C C1783T G1782C G1428A, A1490G - - - G487C, C488T G487C G135A, A197G 1909 Chƣa rõ 1880,45±74,97 7

H482N

Bacillus subtilis H12

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ràng C151A C151A C151A C151A C151A C151A C151A C151A C151A C151A C1444A C1444A C1444A C1444A C1444A C1444A C1444A C1444A C1444A C1444A C1444 745,83±19,40 1756,73±30,13 1864,58±65,29 1834,28±29,69 1772,15±78,44 1718,66±63,37 1837,12±65,74 1682,47±61,36 1841,27±78,41 1738,56±76,43 1731,25±66,29 726,67±26,97 B5 2 6 19 1379 1665 1670 1713 1844 1847 1904 H12

Kết quả trên bảng 3.10 cho thấy rõ các chủng đột biến có nguồn gốc từ

chủng H12 đều có đột biến giống nhau xuất hiện trên gen rpoB đó là thay thế

nucleotide C1444A và dẫn tới thay đổi amino acid H482N. Các chủng này lại có hoạt tính protease khá giống nhau (khác nhau không có ý nghĩa thống kê) và cao

hơn chủng gốc khoảng 2,4 lần. Do vậy, rất có thể đột biến này là đột biến có ý nghĩa

làm thay đổi khả năng sinh tổng hợp protease. Để kiểm chứng lại vai trò của đột

biến này chúng ta có thể tách dòng gen đột biến và chuyển gen đột biến thay thế cho

gen gốc trong chủng H12 và đánh giá khả năng sinh tổng hợp protease của chủng tái tổ hợp.

Các chủng đột biến có nguồn gốc từ chủng B5 là khá đa dạng. Ngoài chủng

1909 chƣa biết chính xác đột biến ra, 6 dòng đột biến còn lại có thể phân thành hai

nhóm đó là nhóm có xuất hiện đột biến có ý nghĩa trên gen rpoB và nhóm không có

đột biến có ý nghĩa trên gen rpoB (tức là chủng không có đột biến trên gen rpoB và

chủng có đột biến nhƣng không làm thay đổi amino acid). Mặc dù không xuất hiện

đột biến có ý nghĩa trên gen rpoB nhƣng các chủng đột biến này vẫn có hoạt tính protease cao gấp khoảng 2 lần so với chủng gốc và sự sai khác về hoạt tính protease

giữa các chủng này cũng không có ý nghĩa thống kê. Điều này chỉ ra rằng, ngoài

gen rpoB ra, rất có thể có những đột biến xuất hiện ở đâu đó trên các gen mã hóa

enzyme/protein quan trọng tham gia vào con đƣờng sinh tổng hợp protease mà

chúng ta chƣa khám phá ra. Trong khi đó hai dòng đột biến có ý nghĩa trên gen

rpoB đều sinh tổng hợp protease tốt hơn. Chủng 528 mang đột biến R595C sinh

tổng hợp protease với hoạt tính tăng gấp 2 lần còn chủng 609 mang đột biến E497G

sinh tổng hợp protease tăng 2,7 lần. Giả thiết nếu các chủng đột biến chỉ mang đột

biến trên gen rpoB dẫn tới làm tăng hoạt tính protease của chủng thì đột biến

E497G có vai trò quan trọng hơn đột biến R595C. Tuy nhiên, rất có thể các chủng

đột biến này còn mang đột biến khác nằm ngoài gen rpoB có vai trò làm thúc đẩy

sinh tổng hợp protease hoặc cũng có thể chính gen mã hóa protease bị đột biến dẫn tới làm tăng hoạt tính riêng của enzyme.

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Đã tuyển chọn đƣợc 03/09 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao và ổn định sử dụng làm nguyên liệu gây tạo đột biến. Đó là các chủng B. subtilis B5, B. subtilis H12 và B. subtilis VI.

2. Tần số đột biến kháng streptomycin (20 µg/ml) và rifampicin (0,2 µg/ml) của cả 03 chủng vi khuẩn nghiên cứu đều tăng đáng kể nhờ xử lý chiếu xạ. Tần số biến kháng streptomycin lớn nhất là 1,61x10-3, 1,68x10-2, 2,22x10-2 tƣơng ứng lần lƣợt với các chủng B5, H12 và VI gây ra bởi liều 1000 Gy, tần số đột biến kháng rifampicin của chúng đạt giá trị cao nhất ở liều 2000 Gy.

3. Kết hợp chiếu xạ tia gamma và xử lý kháng sinh với liều tăng dần đã chọn đƣợc 17 khuẩn lạc kháng xạ, kháng kháng sinh. Kết quả giải trình tự cho thấy14/17

khuẩn lạc mang đột biến thay thế ở gen rpoB và không có bất kì đột biến

nào trên gen rpsL.

4. Đã xác định đƣợc ba đột biến trên gen rpoB làm thay đổi amino acid R595C (dòng 528-B5), E497G (dòng 609-B5), H482N (dòng 19-H12) của beta RNA

polymerase. Các đột biến này đều nằm trong vùng qui định tính nhạy cảm

với kháng sinh của tiểu phần beta RNA polymerase liên quan đến khả năng

tăng tổng hợp protease ở Bacillus.

5. KIẾN NGHỊ:

Để kết quả nghiên cứu của đề tài sớm đƣa vào ứng dụng trong nghiên cứu

và sản xuất nhóm thực hiện có một số kiến nghị sau:

- Tiếp tục nghiên cứu duy trì tính ổn định của các đột biến tạo đƣợc cũng nhƣ tối ƣu hóa điều kiện lên men của chúng ở quy mô lớn hơn khi bổ sung các nguồn carbon, nitơ và vi lƣợng khác nhau để thu protease tối đa.

- Phát triển kỹ thuật gây đột biến phóng xạ kết hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại trên các đối tƣợng VSV khác nhau, cũng nhƣ với các chất

có hoạt tính sinh học khác.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. Screening potential streptomycin resistant mutations of gamma irradiated Bacillus subtilis B5 for high production of protease. Tran Bang Diep1, Nguyen Thi Thom1, Hoang Dang Sang1, Hoang Phuong Thao1, Nguyen Van Binh1, Ta Bich Thuan2, Vo Thuong Lan2, Tran Minh Quynh1, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 32, No. 1S 170-176, 2016.

2. Ảnh hƣởng của chiếu xạ gamma tới tính kháng streptomycin và khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B5. Hoàng Đăng Sáng, Trần Băng Diệp, Trần Minh Quỳnh, Nguyễn Văn Bính, Nguyễn Thị Thơm, Hoàng Phương Thảo. Hội nghị khoa học và Công nghệ hạt nhân cán bộ trẻ ngành năng lượng nguyên tử lần thứ IV, tr 58,2016

3. Chọn tạo các đột biến Bacillus subtilis triển vọng có khả năng sinh protease cao bằng phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma kết hợp sàng lọc trên môi trƣờng có nồng độ Streptomycin cao. Hoàng Đăng Sáng, Trần Băng Diệp, Trần Minh Quỳnh, Nguyễn Văn Bính, Nguyễn Thị Thơm, Hoàng Phương Thảo. Hội nghị khoa học và Công nghệ hạt nhân toàn quốc lần thứ 12, tr 205- 206,2017

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tài liệu tiếng Việt

1. Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xô. 2004. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng tổng hợp protease của Bacillus subtilis. Tạp chí Nông nghiệp và

Phát triển Nông thôn, số 49.

2. Lê Ngọc Tú , La Văn Chứ, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng.

1989. Enzyme vi sinh vật. Tập 2, Nhà xuất bản Thanh niên.

3. Lê Ngọc Tú (chủ biên), La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn Diên. 1998. Hóa sinh công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học

và Kỹ thuật Hà Nội.

4. Lƣơng Đức Phẩm. 2007. Chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng

thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

5. Ngô Thị Mai, Nguyễn Thị Dự, Trần Việt Lan, Thái Thị Hào. 1995. Nghiên cứu và triển khai quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày vào thực tiễn. Các công trình nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học và công nghệ thực

phẩm giai đoạn 1986 – 1995, Viện công nghệ thực phẩm Hà Nội, tr. 386 – 391.

6. Nguyễn Đức Lƣợng. 2002. Công nghệ vi sinh, tập 2: Vi sinh vật học công nghệ.

Nhà xuất bản ĐH Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, tr. 216-220, 266-268.

7. Nguyễn Đức Lƣợng. 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản ĐH Quốc gia Tp.

Hồ Chí Minh, tr. 304-317.

8. Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị

Luyến. 1998. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

9. Phạm Quốc Hùng. 2007. Vật lý hạt nhân và ứng dụng.Nhà xuất bản Đại học Quốc

gia Hà Nội.

10. Phạm Thành Hổ. 2003. Di truyền học, Nhà xuất bản Giáo dục, tr.170-176.

11. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa. 2006. Công nghệ sinh học, tập 3:

Enzyme và ứng dụng. Nhà xuất bản Giáo Dục.

12. Phạm Thị Trân Châu. 1983. Một số đặc tính cơ bản về khả năng phân giải các cơ chất khác nhau của proteinase ngoại bào của B. pumilus. Tạp chí Sinh học 5 (1),

tr. 1 – 8.

13. Trần Ngọc Hùng. 2010. Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis để sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm. Luận văn tiến sĩ, Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, tr.36 – 42.

II.Tài liệu tiếng anh

14. Ahn, D. H., Kim, H., My, B., 1993. Cleavage of Bacillus subtilis endo-α-

gluconane by B. megaferian.Biotechnology letters GBR. 15(2), 127-132.

15. Afsharmaesh, H., Ahmadzadeh, M., Javan-Nikkhah, M., Behboudi, K., 2014. in biocontrol activity of Bacillus subtilis MTB1 against Improvement

Aspergillus flavus using gamma irradiation. Crop Protection. 60, 83-92.

16. Al-Sudany, G. A., Majeed, W. Z., Al-Aubeidi, H. J., 2010. Detection of gamma radiation effect induced by colbelt-60 on Escherichia coli cells. Journal of Al-

Nahrain university Science. 13(3), 129-133.

17. Aquino, K.A.S., 2012. Sterilization by gamma irradiation. In: Gamma radiation,

Prof. Feriz Adrovic (ed.). In Tech. Europe. pp. 171-206.

18. Awan, S. D., Tabbasam, N., Ayub, N., Babar, M. E., Rahman, M., Ran, S. M., Rajoka, M. I., 2011. Gamma radiation induced mutagenesis in Aspergillus niger to enhance its microbial fermentation activity for industrial enzyme production.

Mol. Biol. Rep. 38, 1367-1374.

19. Bailey, J. E., 1991. Toward a science of metabolic engineering.Science. 252,

1668–1675.

20. Baltz, R.H., 1998. New genetic approaches to yeild improve secondary metabolite production in Streptomyces.J Ind Microbiol Biotechnology. 20,360–

363.

21. Barrios, G.J., Fernandez, F.J. and Tomasini, A., 2003. Microbial secondary Indian Journal of improvement. strain

metabolites production and Biotechnology. 2, 322–333.

22. Bauchinger, M., 1983. Microdosimetric aspects of the induction of chromosome aberrations Radiation induced chromosome damage in Man. Mutation research.

74, 1-22.

23. Beg Gupta, R., Lorenz, Q. K. P., 2002. Bacterial alkaline protease: molecular

approaches and industrial application.Appl. Microbiol. 59, 15-32.

24. Blakely, W. F., 2007. Introduction: Chromosome aberration induced by radiation. Lecture of Regoninal training course on biological radiation dosimetry, Seoul, Korea.

25. Carter, P., Nilsson, B., Burnier, J. P., Burdick, D., Wells, J. A., 1989. Engineering subtilisin BPN' for site-specific proteolysis. Proteins. 6(3), 240-8. 26. Casqueiro, J., Guti é rrez, S., Ba Bañuelos, O., Hijarrubia, M.J., Martín, J.F., 1999. Gene targeting in Penicillium chrysogenum: disruption of the lys2

gene leads to penicillin overproduction.J Bacteriol. 181, 1181–1188.

27. Chen, B. Y., Janes, H. W., 2002. Methods in Molecular Biology, (192) PCR

Cloning Protocols, 2nd Edition, Humana Press Inc, Totowa, NJ.

28. Davati, N., Najafi, M. B. H., 2013. Overproduction strategies for microbial

secondary metabolites: A review. Life Science. 3, 23–37.

29. De Groot, A., Chapon, V., Servant, P., Christen, R., Fischer-Le Saux, M., 2005. Deinococcus deserti sp. nov., a gamma-radiation-tolerant bacterium isolated from the Sahara Desert. Int J Syst Evol Microbiol. 55, 2441–2446.

30. Fenech, M. and Morley, A. A., 1985. Measurement of micronucle in

lymphocytes. Mutat Res. 147, 29-36.

31. Fox, J. W., Shannon, J. D., Bjarnason, J. B., 1991. Proteinases and their inhibitors in biotechnology. Enzymes in biomass conversion. ACS Symp Ser. 460, 62–79.

32. Freije, J.M.P., Fraile, J. M. and Otin, C.L., 2011. Protease addiction and

synthetic lethality in cancer. Frontier in Oncology. 1,1–7.

33. Gonchar, A. M. and Aulender, V. I., 1996. Immobilization of bacterial protease on water solved polymer by means of election beam.Radiation physis and chemis, GBR. 48(6), 795-797.

34. GuiJun, L., You-ting, M., Su-ling, Y., Fang, B., Hong-zhong, S., 2011. Study on γ-ray irradiation mutation of Bacillus subtilis NCD2. Agricultural Science &

Technology. 12(11), 1633-1636.

35. Gupta, R., Beg, Q.K., Lorenz, P., 2002. Bacterial alkaline proteases: molecular Applied Microbiology and industrial applications.

approaches and Biotechnology. 59(1), 15–32.

36. Hajati, H., Rezaei, M., 2010. The application of probiotics in poultry production.

International Journal of Poultry Science. 9, 298–304.

37. Hersbach, G.J.M., van der Beck, C. P. & van Dijck, P. W. M., 1984. The penicillins: Properties, biosynthesis, and fermentation. Biotechnology of Industrial Antibiotics (Vandamme EJ, ed), 45–140. Marcel Dekker, New York.

38. Hersbach, G. J. M., Van der Beck, C. P., Van Dijck, P. W. M., 1984. The penicillins: Properties, biosynthesis, and fermentation. Biotechnology of Industrial Antibiotics (Vandamme EJ, ed), 45–140. Marcel Dekker, New York.

39. Hoe, P. C. K., Rahim, K. A. and Saud,H. M.,2016. A review on microbial mutagenesis through gamma irradiation for agricultural applications.Jurnal Sains Nuklear Malaysia. 28(2), 20-29.

40. Hosokawa, K., Park, N.H., Inaoka, T., Itoh, Y., Ochi, K., 2002. Streptomycin – resistant (rpsL) of rifampicin – resistant (rpoB) mutation in Pseudomonas putida

KH146 – 2 confer enhnced tolerance to organic chemical.Environ Microbiol. 4,

703–712.

41. Hosoya, Y., Hosaka, J. and Ochi, K., 2003. An aberrant protein synthesis activity is linked with antibiotic overproduction in rpsL mutants of Streptomyces coelicolor A3(2).Microbiology. 149, 3299–3309.

42. Hu, H., Ochi, K., 2000. Novel approach for improving the productivity of antibiotic – producing strain by inducing combined resistant mutations.Applied

and Enviromental Microbiology. 67, 1885–1892.

43. IAEA., 2005. Generic procedures for medical response during a nuclear or

radiacal emergency, IAEA in Australia.

44. IAEA., 2007. Biodosimetry training course lectures at KIRAM, Seoul, Korea. 45. Ichishima, E., Hamamatsu, M., Yamamoto, N., Motai, H., Hayashi, K., 1983. Substrate specificity of alkaline protease from Aspergillus sojae, a soy sauce producing fungus. Food Chemistry. 11, 187–200..

46. Jin, D. J. and Gros, C.A., 1998. Mapping and sequencing of mutation in the Escherichia colirpoB gene that lead to rifampicin resistance. J.Mol. Biol. 202, 45–58.

47. Jong, B. C. et al., 2010. Effects of gamma rays on an indigenous Bacillus isolate

pengaruh sinar gamma pada isolat bacillus.

48. Kim, Y. K., Bae, J. H., Oh, B. K., 2002. Enhancement of proteolytic enzyme sctivity excreted from Bacillus stearothermophilus for a thermophilic aerobic

digestion process.Bioresource Technology. 82, 157-164. J. M., et al., 2003. 49. Ko, K. S., Kim, Identification of Bacillus

anthracis by rpoB sequence analysis and multiplex PCR.J Clin Microbiol. 41,

2908–2914.

50. Kurosawa, K., Hosaka, T., Tamehiro, N., Inaoka, T. and Ochi, K., 2006. Improvement of α – amylase production by modulating the ribosomal component S12 protein in Bacillus subtilis 168.Appl. Environ. Microbiol. 72, 71–77.

51. Lai, C., Xu, J., Tozawa, Y., Hosoya, Y., Yao, X., Ochi, K., 2002. Genetic and that activate antibiotic

physiological characterization of rpoB mutations production in Streptomyces lividans.Microbiology. 148, 3365–3373.

52. López-Otín, C. and Matrisian, L. M., 2007. Emerrging roles of proteinases in

tumour suppression. Nature Reviews Cancer. 7, 800-808.

53. Malik, V. S., 1979. Genetics of applied microbiology. Adv Genet. 29, 37–126.

54. Manczinger, L., Rozs, M., Lgyi, V. G. and Kevei, F., 2003. Isolation and characterization of a new kerationalytic Bacillus licheniformis strain. Word J.

Microbiol. Biotechnol. 19, 35-39.

55. Mayday,E. El., Paquet, D., Ramet, J. P. and Linden, G., 1986. Proteolutic activity of a Bacillus subtilis neutral protease preparation upon caseins and whey protein of cow‟s milk.Journal of Dairy science. 69(2), 305-310.

56. Mehrotra, S., Pandey, P. K., Gaur, R., Darmwal, N. S., 1999. The production of alkaline proteases by Bacillus species isolate. Biresource. Technol. 67, 201-203. 57. Moussa et al., 2003. Effect of gamma irradiation on the mosphological isolated from Egyptiol characteristic of some pigmented Streptomyces

soil.Isotope and Rad Res.35 (1), 159-177.

58. Narumi, I., 2006. Carriers sterilization using γ-irradiation. In: Biofertilizer Manual. Forum for Nuclear cooperation in Asia (FNCA) Biofertilizer Project Group. Asia Cooperation Center, Japan Atomic Industrial Forum (JAIF). Japan.

44-48.

59. Nascimento, W.C.A. and Martin, M.L. L., 2004. Production and properties of an extracellular protease from thermophilic Bacillus sp.Brazilian J Microbiol. 35,

91-96.

60. Nghiep, T.D., Kojima, T., 1996. An energy-transfer model for radiation

dosimetry. Communication in Physics. 6 (2), 5-12.

61. Nghiep, T.D., Minh, D. T. N., Cong, N. T., 2010. Formation and characterization of a hydrophilic polymer hydrogel. Journal of Radioanalytical & Nuclear Chemistry. 285, 719-721.

62. Obe, G. and Beck, B., 1984. Human peripheral lymphocytes in mutation

research. Mutation in man.Springer-Verlag. (74), 177-197.

63. Ochi, K., 2007. From microbial differentiation to ribosome engineering.Biosci

Biotechnol Biochem. 71, 1373–1386.

64. Ochi, K., Hosaka, T., 2013. New strategies for drug discovery: activation of silent or weakly expressed microbial gene clusters.Appl Microbiol Biotechnol. 97, 87– 98.

65. Ogino, H., Otsubo, T., Ishikawa, H., 2007. Screening, purification, and characterization of a leather–degrading protease.Biochemical Engineering. 38,

234–240.

66. Olajuyigbe, F.M. and Ajele, J.O., 2005. Production dynamics of extracellular protease from Bacillus species. African Journal of Biotechnology. 4, 776-779.

67. Parveen, B., Preston, D. L., Doody, M. M., Hauptmann, M., Kampa, D., Alexander, B. H., Petibone, D., Simon, S. L., Weinstock, R. M., Bouville, A.,

Yong, L. C., Freedman, D. M., Mabuchi, K., Linet, M. S., Edwards, A. A.,

Tucker, J. D. and Sigurdson, A. J., 2007. Retrospective Biodosimetry among United States Radiologic Technologists. Radiat. Res. (167), 727–734.

68. Protein Hydrolysis Enzymes Market - Global Trends & Forecasts to 2019.

Report code: ASDR-104771. Publish date : April 2014 , Pages : 236

69. Raina, S., Murphy, T., De, V.D., Reffatti, P., Keshavarz, T., 2011. Novel strategies for overproduction of microbial products. Chemical Engineering

Transaction. 24, 847–852.

70. Ro, D.K., Paradise, E.M., Ouellet, M., Fisher, K.J., Newman, K.L., Ndungu, J.M., Ho, K.A., Eachus, R.A., Ham, T.S., Kirby, J., Chang, M.C., Withers, S.T.,

Shiba, Y., Sarpong, R., Keasling, J.D., 2006. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440,940–943.

71. Romm, H., Oestreicher, U. and Kulka, U., 2009. Cytogenetic damage analysed

by the dicentric assay. Ann Ist Super Sanita. 45(3), 251-259.

72. Sambrook, J., Russell, D. W., 2001.Molecular Cloning-A laboratory manual.

Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition.

73. Shafee, N., Aris, S. N., Rahman, R.Z.A., Basri, M. and Salleh, A.B., 2005. Optimization of Environmental and Nutritional Conditions for the Production of

Alkaline Protease by a Newly Isolated Bacterium Bacillus cereus Strain 146.

Journal of Applied Sciences Research. 1, 1-8.

74. Shahbazi, S., Ispareh, K., Karimi, M., Askari, H. and Ebrahimi, M.A., 2014. Gamma and UV radiation induced mutagenesis in Trichoderma reesei to

in Streptomyces

enhance cellulases enzyme activity. Internat. J. Farming Allied Sci. 3(5), 543-554. 75. Simpson, I.N., Caten, C.E., 1979. Induced quantitative variation for penicillin titre in clonal populations of Aspergillus nidulans. J Gen Microbiol. 110, 1–12. 76. Solenberig, P.J., Cantwell, C.A., Tietz, A.J., McGilvray, D., Queener, S.W., Baltz, R.H., 1996. Transposition mutagenesis fradiae: identification of a neutral site for the stable insertion of DNA by transposon exchange.Gene. 168, 62–67.

77. Veloorvalappil, N. J., Robinson, B. S, Pradeep, S., Sreedevi, S., Kizhakkepawothail, N. U., et al., 2013. Versatility of microbial proteases. Advances in Enzyme Research. 1(3), 39-51.

78. Voisin, P., Roy, L., Benderitter, M., 2004. Why can‟t we find a better

biological indicator of dose? Radiation Protection Dosimetry. 112(4), 465-469.

79. Wang, G., Hosaka, T., Ochi, K., 2008. Dramatic activation of antibiotic production in Streptomyces coelicolorby cumulative drug resistance mutations.

Appl Environ Microbiol. 74, 2834–2840.

80. Wayne, L. N. and Maughan, H., 2002. The Spectrum of Spontaneous Rifampin Resistance Mutations in the rpoB Gene of Bacillus subtilis 168 Spores Differs from That ofVegetative Cells and Resembles That of Mycobacterium tuberculosis. J. Bacteriol. 184(17), 36-40.

81. Wilding, C. S., Relton, C. L., Rees, G. S., Tarone, R. E., Whitehouse, C. A., Tawn, E. J., 2005. DNA repair gene polymorphisms in relation to

chromosome aberration frequencies in retired radiation workers.Mutat Res.

570, 137-45.

82. Whiteley, C.G., Lee, D.J., 2006. Enzyme technology and biological remediation.

Enzyme and Microbial Technology. 38, 291–316.

83. Yazdi, S., Ardekani, A. M., 2012. Bacterial aggregation and biofilm formation

in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 104-114.

84. Yoon, K. H., In-Kyung, S., Kyung, H. J., Seung-Hwan, P., 1999. Hyper- CMCase-Producing mutants of Bacillus sp. 79-23 induced by gamma-radiation.

J. Microbiol. Biotechnol. 9(4), 518- 521.

85. Zak, D.R., Pregitzer, K.S., Burton, A.J., Edwards, I.P., Kellner, H., 2011. Microbial responses to a changing enviroment: implication for the future

fuctioning of terrestrial ecosystems. Fungal Ecology. 4, 386–395.

III. Website

86. http://www.prnewswire.co.uk/news-releases/protease-enzymes-market 87. http://protease.burnham.org 88. http://textbook of bacterialogy.net/Bacillus.html 89. https://www.idtdna.com/https://www.genscript.com/ 90. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 91. http://www.bvgh.org/Biopharmaceutical-Solutions/

PHỤ LỤC

1. Vòng phân giải casein của một số khuẩn lạc Bacillus subtilis H12 kháng xạ và kháng rifampicin

2. Đƣờng chuẩn Tyrosin xây dựng trong phƣơng pháp Anson cải tiến

3. Hình thái chủng đột biến Bacillus subtilis - 609 và Bacillus subtilis–19

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh

Hoàng Đăng Sáng

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. ĐỖ THỊ HUYỀN ThS. TRẦN BĂNG DIỆP

LỜI CẢM ƠN Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

PHẦN II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chụp ảnh, phân tích kết quả

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TUYỂN CHỌN CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5. KIẾN NGHỊ:

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bacillus subtilis B5

Bacillus subtilis -609

Bacillus subtilis H12

Bacillus subtilis -19

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng gene kháng thuốc, gene độc lực và hệ vi khuẩn đường ruột cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng giải trình tự metagenomics

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm gây hại trên hòm gỗ thu thập tại đồng nai và khảo sát hiệu quả ức chế nấm của một số chế phẩm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sử dụng thông tin di truyền trên vùng gen ITS DNA trong định loại các mẫu sâm (Panax L.) thu thập ở tỉnh Hà Giang

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098