Luận văn Thạc sỹ Khoa học: Đánh giá sự tương thích giữa phương pháp kiểm tra vi sinh vật truyền thống và phương pháp đo ATP quang sinh học trong quá trình kiểm tra vệ sinh của dây truyền sản xuất bia ở Viện Công nghiệp thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*******

Trần Thị Hảo

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG THÍCH GIỮA PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA

VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐO ATP QUANG

SINH HỌC TRONG QUÁ TRÌNH KIỂM TRA VỆ SINH CỦA DÂY

CHUYỀN SẢN XUẤT BIA Ở VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội -2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*******

Trần Thị Hảo

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG THÍCH GIỮA PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA

VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐO ATP QUANG

SINH HỌC TRONG QUÁ TRÌNH KIỂM TRA VỆ SINH CỦA DÂY

CHUYỀN SẢN XUẤT BIA Ở VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 604240

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Phạm Văn Thành

Hà Nội -2011

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 8

Chƣơng 1 ......................................................................................................... 10

TỔNG QUAN ................................................................................................. 10

1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam, thực trạng vệ sinh ở một số cơ

sở sản xuất chế biến thực phẩm và vi sinh vật gây ngộ độc thƣờng gặp trong

thực phẩm ........................................................................................................ 10

1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm và thực trạng vệ sinh ở một số cơ sở

chế biến thực phẩm ở Việt Nam…………………………………………..10

1.1.2. Nguyên nhân khiến thực phẩm nhiễm vi sinh vật gây bệnh ........... ..13

1.1.3. Một số vi sinh vật chủ yếu thƣờng gây ngộ độc có trong thực phẩm

và vi khuẩn chỉ điểm trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm ........................... 14

1.1.3.1. Ngộ độc do E.coli……………………………………………...12

1.1.3.2. Ngộ độc do Clotridium perfringens……………………………12

1.1.3.3. Ngộ độc Salmonella……………………………………………12

1.1.3.4. Vi khuẩn chỉ điểm trong thực phẩm …………………………..13

1.2. Công nghệ sản xuất bia, những công đoạn cần thiết phải kiểm tra vệ sinh

trong sản xuất .................................................................................................. 16

1.2.1.Quá trình nấu, đƣờng hóa ................................................................... 16

1.2.2. Lên men ............................................................................................. 17

1.2.3. Vấn đề vệ sinh thực phẩm nói chung và vệ sinh trong quá trình sản

xuất bia nói riêng ......................................................................................... 18

1.2.3.1. Vệ sinh thực phẩm ..................................................................... 18

1.2.3.2. Vệ sinh trong quá trình sản xuất bia .......................................... 20

1.3. Các phƣơng pháp kiểm tra vệ sinh trong sản xuất hiện nay .................... 21

1.3.1. Phƣơng pháp đánh giá bằng mắt thƣờng …………………………..19

1.3.2.Phƣơng pháp đánh giá thông qua việc giám sát các thông số của hệ

thống tự động hoặc thông qua việc kiểm tra nống độ các chất tham gia vào

quá trình …………………………………………………………………..19

1.3.3. Phƣơng pháp đánh giá bằng nuôi cấy vi sinh vật truyền thống ……20

1.3.4. Phƣơng pháp kiểm tra bằng phát quang sinh học…………………..20

1.4. Giới thiệu về phƣơng pháp ATP quang sinh ........................................... 22

1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp ATP quang sinh học ......................... 23

1.4.2. Ƣu điểm của phƣơng pháp đo ATP quang sinh trong ngành công

nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm ...................................................... 23

Chƣơng II ........................................................................................................ 25

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 25

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 25

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và phƣơng pháp nghiên cứu ............................... 25

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị, hóa chất ............................................................. 25

2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................... 27

2.2.2.1.Phƣơng pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống .. 27

2.2.2.1.1. Phƣơng pháp xác định tổng số Coliform và E.coli ............. 28

2.2.2.1.2. Tính tổng số nấm men, nấm mốc ........................................ 28

2.2.2.1.3. Tổng vi sinh vật hiếu khí ..................................................... 29

2.2.2.2. Phƣơng pháp xác định độ sạch bằng ATP quang sinh............... 29

2.2.2.3. Ứng dụng máy đo quang UV-VIS U-1900 ................................ 30

Chƣơng III ....................................................................................................... 32 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 32 3.1. Phƣơng pháp phân tích truyền thống ....................................................... 32

3.1.1. Kiểm tra ở các tec lên men ................................................................ 32

3.1.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm ............................................................ 33

3.1.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm ............................................................. 34

3.2. Phƣơng pháp ATP quang sinh học ........................................................... 36

3.2.1. Kiểm tra ở các tec lên men ................................................................ 36

3.2.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm ............................................................ 36

3.2.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm ............................................................. 37

3.3. Đánh giá sự tƣơng thích giữa kiểm tra vi sinh vật bằng phƣơng pháp

truyền thống và đo ATP quang sinh ................................................................ 37

3.3.1. Mẫu đã biết trƣớc nồng độ ................................................................ 37

3.3.2. Mẫu trên dây truyền sản xuất bia ...................................................... 38

3.4. Khảo sát ứng dụng phƣơng pháp tạo màu xác định tổng số Coliform trên

máy quang phổ U-1900 ( UV-VIS spectrophotometre) .................................. 43

Chƣơng IV. ...................................................................................................... 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 51 Tiếng Việt .................................................................................................... 51

Tiếng Anh .................................................................................................... 52

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATP: Adenozin triphotphat

CFU: Colony-forming units

CPP: Critical Control Point

E.coli: Escherichia coli

HACCP: Hazard Analytical Critical Control Point (Hệ thống phân tích và kiểm soát các mối nguy trọng yếu trong quá trình sản xuất chế biến thực phẩm)

GMP: Good Manufacturing Practice (tiểu chuẩn thực hành sản xuất tốt)

RLU: Relative light unit (đơn vị ánh sáng tƣơng đối)

PCA: Plate count agar

QA: Quality assurance

UV-VIS: Ultraviolet visiable (vùng tử ngoại khả kiến)

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1: Thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm của Bộ Y tế 2008-2010 ..... 10

Bảng 2: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 2 ......................................... 32

Bảng 3: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 3 ......................................... 33

Bảng 4: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 1 ........................ 33

Bảng 5: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 2 ........................ 34

Bảng 6: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 3 ........................ 34

Bảng 7: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 1 ................................... 34

Bảng 8: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 2 ................................... 35

Bảng 9: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 3 ................................... 35

Bảng 10: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở các tec lên men ................................................................................................................ 36

Bảng 11: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở máy lọc sản phẩm ........................................................................................................ 36

Bảng 12: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở các tec sản phẩm .............................................................................................................. 37

Bảng 13: Kết quả phân tích mẫu đã biết trƣớc nồng độ bằng cả phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh. ................................... 38

Bảng 14: Kết quả phân tích ở tec lên men 1 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh .................................................................. 38

Bảng 15: Kết quả phân tích ở tec lên men 2 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh .................................................................. 39

Bảng 16: Kết quả phân tích ở tec lên men 3 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh .................................................................. 39

Bảng 17: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 1 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh ............................................. 40

Bảng 18: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 2 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh ............................................. 40

Bảng 19: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 3 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh ............................................. 41

Bảng 20: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 1 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh ........................................................ 41

Bảng 21: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 2 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh ........................................................ 42

Bảng 22: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 3 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh ........................................................ 42 Bảng 23: Kết quả scan mẫu có nồng độ pha loãng 10-2 ở bƣớc sóng 190 – 1100nm .......................................................................................................... 43 Bảng 24: Kết quả scan mẫu có nồng độ pha loãng 10-1 ở bƣớc sóng 190 – 1100nm .......................................................................................................... 44 Bảng 25: Kết quả scan mẫu có nồng độ pha loãng 5-1 ở bƣớc sóng 190 – 1100nm .......................................................................................................... 44

Bảng 26: Kết quả scan mẫu M ở bƣớc sóng 400 – 800nm ........................... 46 Bảng 27: Kết quả scan mẫu M x 5-1 ở bƣớc sóng 400 – 800nm ................... 46 Bảng 28: Kết quả scan mẫu M x 10-1 ở bƣớc sóng 400 – 800nm ................. 46 Bảng 29: Kết quả scan mẫu M x 10-2ở bƣớc sóng 400 – 800nm .................. 47 Bảng 30: Kết quả scan mẫu M x 10-3ở bƣớc sóng 400 – 800nm .................. 47 Bảng 31: Kết quả phân tích mẫu lấy ở bể chứa nƣớc thải sau khi vệ sinh bằng phƣơng pháp truyền thống và đo bằng máy UV-VIS 1900 của Hitachi. ........ 48

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA

Hình 1: Hình ảnh phổ scan ở bƣớc sóng 190 – 1100 nm .............................. 45

Hình 2: Hình ảnh phổ scan ở bƣớc sóng 200 – 800 nm ................................ 45

Hình 3: Hình ảnh phổ scan ở bƣớc sóng 400 – 800 nm ................................ 47

MỞ ĐẦU

Thực phẩm là nhu cầu thiết yếu hàng ngày của mỗi con ngƣời. An toàn thực phẩm đã trở thành vấn đề toàn cầu; trƣớc những hiểm họa luôn rình rập, đe dọa đời sống con ngƣời bởi các thực phẩm không an toàn, đòi hỏi mỗi quốc gia phải có những quốc sách để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.

Trên thực tế, một thực trạng còn bức xúc trong ngành sản xuất chế biến thực phẩm ở nƣớc ta là chất lƣợng vệ sinh còn rất kém ở nhiều cơ sở sản xuất. Những yêu cầu nghiêm ngặt về vệ sinh an toàn thực phẩm trong sản xuất chƣa đƣợc quan tâm và đầu tƣ thích đáng. Mặt khác do lợi nhuận mà một số ít nhà cung cấp đã sử dụng các hóa chất độc hại để chế biến, nuôi trồng và sản xuất các sản phẩm thực phẩm; gây ảnh hƣởng không tốt tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Việc sử dụng các thực phẩm không đảm bảo chất lƣợng vệ sinh có thể gây ngộ độc và gây ra các bệnh tiêu hóa cấp tính cho ngƣời sử dụng, nghiêm trọng hơn có thể dẫn tới tử vong. Về lâu dài, nếu các độc tố tích lũy dần dần tới một ngƣỡng nhất định có thể sẽ phát sinh các bệnh nguy hiểm, làm biến đổi cấu trúc gen gây dị tật, dị dạng cho các thế hệ tiếp theo.

Trƣớc thực trạng trên, ngoài việc khuyến khích các cơ sở sản xuất thực hiện vệ sinh an toàn thực phẩm Nhà nƣớc và chính phủ còn chỉ thị về việc tăng cƣờng công tác bảo đảm chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm để từng bƣớc nâng cao chất lƣợng sản phẩm. Tuy nhiên phƣơng thức quản lý kiểm tra chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm dựa trên việc kiểm tra chất lƣợng sản phẩm cuối cùng không đảm bảo đƣợc chất lƣợng vệ sinh sản phẩm trong khi sản xuất. Điều này chỉ đƣợc đảm bảo khi có sự kiểm soát chủ động và hệ thống các yếu tố chất lƣợng và điều kiện vệ sinh trong toàn bộ quá trình sản xuất, chế biến, cung ứng mới có khả năng đảm bảo an toàn thực phẩm. Để đáp ứng đƣợc yêu cầu này không gì khác là phải áp dụng các phƣơng pháp kiểm tra nhanh mức độ vệ sinh trong các dây chuyền sản xuất, chế biến thực phẩm .

Góp phần vào sự kiểm soát vệ sinh an toàn trong sản xuất đồ uống nói chung và sản xuất bia nói riêng, chúng tôi tiến hành thực hiện kiểm tra vệ sinh trong dây chuyền sản xuất bia, với đề tài:

“ Đánh giá sự tƣơng thích giữa phƣơng pháp kiểm tra vi sinh vật truyền thống và phƣơng pháp đo ATP quang sinh học trong quá trình kiểm tra vệ sinh của dây chuyền sản xuất bia ở Viện công nghiệp thực phẩm”.

Chƣơng 1

TỔNG QUAN

1.1 .Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt nam, thực trạng vệ sinh ở một số cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm và vi sinh vật gây ngộ độc thƣờng gặp trong thực phẩm

1.1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm và thực trạng vệ sinh ở một số cơ sở

chế biến thực phẩm ở Việt Nam.

Hàng năm ở Việt Nam xảy ra hàng trăm vụ ngộ độc thực phẩm, con số ngƣời mắc bệnh có năm lên tới chục ngàn ngƣời. Theo thống kê của Bộ Y tế, tình hình ngộ độc thực phẩm trong ba năm gần đây nhƣ sau (11):

Bảng 1: Thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm của Bộ Y tế 2008-2010

STT Chỉ số Năm thống kê

2008 2009 2010

205 Số vụ 152 132 1

7.828 Số ngƣời mắc 5.212 4.676 2

Số ngƣời chết 61 35 41 3

Trong số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thì nguyên nhân chủ yếu do nhiễm vi sinh vật (thƣờng chiếm tỷ lệ từ 50 đến 58% số vụ). Đây là thực trạng đáng báo động về tình hình vệ sinh trong sản xuất, chế biến và lƣu thông thực phẩm. Những nguy cơ gây ô nhiễm vi sinh vật có thể kể đến gồm: nguồn nƣớc, điều kiện môi trƣờng sản xuất, trang thiết bị máy móc, bao bì, dụng cụ, ngƣời trực tiếp chế biến…

Đối với thực trạng vệ sinh của các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm,

theo báo cáo ở một số địa phƣơng thì cũng không mấy khả quan.

Theo báo cáo đánh giá thực trạng tại các cơ sở sản xuất, chế biến rƣợu, bia, nƣớc giải khát, kem, nƣớc chấm… tại Hải Phòng của tác giả Trần Văn Thọ và cộng sự năm 2005 cho thấy có tới 76,4% mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ sinh. Các mẫu thức ăn đƣờng phố có tỷ lệ ô nhiễm cao về vi sinh vật, trong đó 100% không đạt về chỉ tiêu nấm men, nấm mốc; 90,9% không đạt về chỉ tiêu

Coliform. Ở tỉnh Bắc Giang, theo điều tra khảo sát một số cơ sở sản xuất nƣớc giải khát, bia, rƣợu, bánh kẹo… của tác giả Ngô Thị Oanh và cộng sự năm 2005 cho thấy 33,3% cơ sở có mức vệ sinh kém, 40% ở mức trung bình, chỉ có 26,7% đạt loại tốt.

Từ một vài số liệu trên cho thấy, vấn đề vệ sinh và kiểm soát vệ sinh trong các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm rất đáng để các nhà sản xuất và các nhà quản lý lƣu tâm nhiều hơn nữa.

1.1.2. Nguyên nhân khiến thực phẩm nhiễm vi sinh vật gây bệnh

Các yếu tố cơ hội có thể dẫn tới thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây

bệnh nhƣ:

+ Nhóm gây ô nhiễm thực phẩm: Quá trình sản xuất, chế biến, thu hoạch không đảm bảo các yêu cầu vệ sinh an toàn dẫn tới thực phẩm bị ô nhiễm.

+ Nhóm các yếu tố gây ảnh hƣởng tới sự tồn tại của mầm bệnh trong thực phẩm nhƣ việc không đun nấu kỹ, không xử lý đầy đủ các yêu cầu vệ sinh chung

+ Nhóm các yếu tố gây tái nhiễm: Do quá trình bảo quản không đảm bảo, gây tái nhiễm từ ngƣời chế biến, phục vụ, môi trƣờng hay từ dụng cụ sang thực phẩm. Nếu ngƣời làm công tác thực phẩm bị ốm hay mang vi trùng gây bệnh thì trong quá trình chế biến vi trùng sẽ vƣớng vào thực phẩm. Theo cách này, trứng giun hay vi trùng lao, lỵ có thể bị nhiễm vào thực phẩm. Nguy hiểm hơn nữa là những ngƣời mang sẵn vi trùng gây bệnh nhƣng không có biểu hiện của bệnh, nhƣ vi trùng thƣơng hàn sống lâu trong gan ngƣời đã khỏi bệnh làm phân của họ bị nhiễm trùng, ngƣời mắc bệnh lỵ cũng mang vi trùng trong một thời gian dài sau khi khỏi bệnh.

Ngoài ra, chuột gián hay ruồi là những sinh vật hay làm nhiễm trùng thực phẩm. Ngƣời ta thấy rằng, trong một vùng có bệnh dịch tả thì hầu hết ruồi đều có vi trùng dịch tả. Trong phân và nƣớc đái của chuột rất dễ tìm thấy vi trùng thƣơng hàn. Chuột cũng rất hay truyền bệnh cho lợn, gà từ đó vào thực phẩm. Hay trên mình gián, ngƣời ta thấy có rất nhiều vi trùng đƣờng ruột. Vi trùng đƣờng ruột thƣờng có nhiều trong phân, phân lại đƣợc dùng bón cho rau nên cũng có rất nhiều vi trùng nguy hiểm. Các loại tôm cua, ốc,

… sống trong nƣớc bẩn cũng hay có trứng hoặc vi trùng gây bệnh. Có rất nhiều trƣờng hợp bị bệnh thƣơng hàn nguyên nhân do ngƣời bệnh ăn phải hải sản, tôm cua có vi trùng gây bệnh. Cuối cùng, yếu tố gây nhiễm trùng nữa là dụng cụ chế biến không vệ sinh sạch sẽ, khu vực chế biến có điều kiện vệ sinh kém.

1.1.3. Một số vi sinh vật chủ yếu thường gây ngộ độc có trong thực phẩm và vi khuẩn chỉ điểm trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm

1.1.3.1. Ngộ độc do E.coli

E. coli sống trong tự nhiên thƣờng không hay gây ngộ độc, nhƣng ở một điều kiện nhất định sẽ gây bệnh (vi khuẩn gây ngộ độc có điều kiện). E. coli gây bệnh truyền nhiễm nhƣ bệnh tả ở các tiểu gia súc, bệnh ỉa chảy ở trẻ em, bệnh trúng độc nhiễm huyết ở trẻ sơ sinh.

Cấu trúc kháng nguyên E. coli chia ra ba loại: O, N và K. Vi khuẩn gây bệnh nặng nhất là loại có kháng nguyên K. Những vi khuẩn có cấu trúc kháng nguyên khác nhau thì gây bệnh cũng không giống nhau, trong gây bệnh thực nghiệm thì ngƣời nhạy hơn động vật. Thời kỳ ủ bệnh thƣờng từ 2 đến 20 giờ. Bệnh phát đột ngột, ngƣời bị bệnh thấy đau bụng dữ dội, ít bị nôn mửa. Nhiệt độ cơ thể bình thƣờng hoặc hơi sốt.

1.1.3.2. Ngộ độc do Clostridium perfringens

Clostridium perfringens sản sinh ra 6 tuýp độc tố: A, B, C, D, E, F. Trong 6 tuýp này thì độc tố A là độc tố chủ yếu gây ngộ độc sau đó đến tuýp F. Thời gian ủ bệnh trung bình 10 -12 giờ, có khi 6 đến 8 giờ cũng có thể dài hơn. Bệnh xuất hiện với những triệu chứng viêm ruột, dạ dày, đau bụng ỉa chảy, phân lỏng hoặc toàn nƣớc; thỉnh thoảng có trƣờng hợp nôn mửa, nhức đầu, sốt.

1.1.3.3. Ngộ độc do Salmonella

Vi khuẩn gây ngộ độc thƣờng là Salmonella typhymurium, Salmonella choleraesuls và salmonella enteritidis. Về cơ chế, các nhà khoa học cho rằng vi khuẩn Salmonella sinh ra ngoại tố chịu nhiệt, loại độc tố này gây bệnh cho ngƣời và động vật. Cũng có tác giả cho rằng ngộ độc Salmonella do đƣờng tiêu hóa hấp thụ phải một lƣợng lớn vi khuẩn Salmonella sống. Khi vào đến máu vi khuẩn bị phá vỡ và tiết ra một lƣợng độc tố gây độc cho cơ thể. Tuy nhiên cùng ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella, không phải ai cũng bị ngộ độc.

Ngoài số lƣợng vi khuẩn bị nhiễm, phản ứng của từng cơ thể là yếu tố quan trọng khiến ngƣời đó có bị ngộ độc hay không. Ngộ độc Salmonella thƣờng có các triệu chứng nôn mửa, ỉa chảy, sốt. Thời gian ủ bệnh trung bình từ 12 đến 24 giờ. Trƣớc khi phát bệnh thƣờng có hiện tƣợng nhức đầu, chán ăn, mặt tái nhợt, ra mồ hôi.

1.1.3.4. Vi khuẩn chỉ điểm trong thực phẩm

Vi khuẩn chỉ điểm trong thực phẩm đƣợc chia làm hai loại: Vi khuẩn

chỉ điểm vệ sinh và vi khuẩn chỉ điểm phẩm chất.

 Vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh (y tế)

Vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh là những vi khuẩn mà sự có mặt của chúng

trong thực phẩm chứng tỏ thực phẩm đã bị nhiễm phân.

Việc xác định trực tiếp những vi sinh vật gây bệnh gặp rất nhiều khó khăn và mất nhiều thời gian. Để đơn giản hơn cho quá trình kiểm tra vệ sinh thực phẩm, ngƣời ta xác định gián tiếp sự có mặt của vi sinh vật gây bệnh bằng cách xác định các trực khuẩn đƣờng ruột E.coli, Clostridium Welchii,…

Vi khuẩn hiếu khí ƣa nhiệt độ trung bình là một trong những chỉ điểm có ích. Khi kiểm tra ta thấy sự có mặt của vi khuẩn sống, chứng tỏ nguyên liệu đã bị nhiễm bẩn, điều kiện vệ sinh không đạt, điều kiện nhiệt độ sản xuất, qui trình bảo quản không thích hợp báo hiệu thực phẩm có nguy cơ bị hƣ hỏng.

Vi khuẩn kị khí ƣa nhiệt độ trung bình đƣợc dùng nhƣ một vi khuẩn chỉ điểm. C. Welchii thƣờng hay có trong phân ngƣời và động vật nên dễ bị nhiễm vào thịt gia súc, gia cầm. Khi gặp điều kiện không thuận lợi các vi khuẩn này chuyển thành dạng nha bào, chịu nhiệt khi đun ở nhiệt độ thấp, phát triển mạnh ở 20-30oC, mạnh nhất ở 43-47oC và chỉ trong điều kiện yếm khí. Vi khuẩn này sinh độc tố trong ruột ngƣời và động vật, gây ra bệnh đau dạ dày và ỉa chảy khi ăn phải một số lƣợng lớn vi khuẩn.

 Vi khuẩn chỉ điểm phẩm chất

Vi khuẩn chỉ điểm phẩm chất là những vi khuẩn mà sự có mặt của nó chứng tỏ thực phẩm đã bị kém phẩm chất, ảnh hƣởng tới giá trị dinh dƣỡng, sức khỏe ngƣời sử dụng. Bao gồm các vi khuẩn thối rữa, Proteus, Clotridium pefringer…

Đánh giá vệ sinh thực phẩm thƣờng dựa vào các chỉ tiêu cảm quan, lý hóa, vi sinh vật nhƣ: số lƣợng vi sinh vật hiếu khí trong một gam (hoặc 1 mL) thực phẩm ở phạm vi cho phép. Phạm vi này do cơ quan kiểm soát vệ sinh qui định, khác nhau tùy theo từng loại thực phẩm và tùy theo mức độ yêu cầu vệ sinh của từng địa phƣơng, từng nƣớc, từng khu vực. Và điều quan trọng là tuyệt đối không có vi sinh vật gây bệnh vì phần lớn các vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm là vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột (tả, lỵ, thƣơng hàn,…)

Do vậy vi sinh vật chỉ điểm có vai trò rất quan trọng trong đánh giá vệ sinh

1.2. Công nghệ sản xuất bia, những công đoạn cần thiết phải kiểm tra vệ sinh trong sản xuất

Quá trình sản xuất bia trải qua các công đoạn: nấu, đƣờng hóa, lên men (lên men chính, lên men phụ), lọc sản phẩm, bão hòa CO2, đóng gói sản phẩm. Quá trình sản xuất có thể tóm tắt nhƣ sau:

1.2.1. Quá trình nấu, đường hóa

Quá trình nấu gồm một số bƣớc sau: nghiền nguyên liệu, thủy phân

(đƣờng hóa), lọc nƣớc nha, nấu hoa houblon, làm lạnh nhanh nƣớc nha.

+ Nghiền nguyên liệu:

Nghiền nguyên liệu là quá trình nghiền nhỏ nguyên liệu nhằm phá vỡ cấu trúc của hạt để tăng bề mặt tiếp xúc với nƣớc, làm cho nƣớc xâm nhập vào các thành phần chất nội nhủ nhanh hơn, thúc đẩy quá trình đƣờng hóa và các quá trình thủy phân khác nhanh và triệt để hơn. Tạo điều kiện để tăng tốc độ các quá trình lý học và hóa sinh học trong giai đoạn nấu để nâng cao hiệu suất và chất lƣợng dịch đƣờng

Nghiền có nhiều phƣơng pháp: nghiền khô, nghiền ƣớt và nghiền ẩm. Nghiền ƣớt, nghiền ẩm nhằm giữ nguyên vỏ malt để rút ngắn thời gian lọc. Nhƣng phƣơng pháp này tốn năng lƣợng, thao tác phức tạp, còn nghiền khô thì đơn giản, dễ thực hiện và tiết kiệm năng lƣợng. Do vậy phƣơng pháp nghiền khô thƣờng đƣợc chọn hơn.

+ Quá trình nấu: thực chất là quá trình thủy phân nhằm chuyển hóa các thành phần chính trong malt và nguyên liệu thay thế ở nhiệt độ thích hợp thành các chất hòa tan trong nƣớc, trong đó chủ yếu là các hydrat cacbon và

axit amin thủy phân nhờ enzym và sự thủy phân này phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, pH, tỷ lệ nguyên liệu trong nƣớc, tỷ lệ enzym.

+ Lọc dịch đƣờng (nƣớc nha):

Dịch đƣờng gồm các chất hòa tan và không hòa tan, do đó cần phải lọc để tách hết các chất hòa tan ra khỏi các chất không hòa tan. Quá trình diễn ra theo hai bƣớc: lọc hỗn dịch thủy phân và thu đƣợc nƣớc nha ban đầu, dùng nƣớc nóng rửa bã rồi lọc thu nƣớc nha cuối.

+ Nấu hoa houblon:

Mục đích đun sôi hoa houblon là ổn định thành phần dịch đƣờng hóa và làm cho dịch đƣờng hóa có mùi thơm của hƣơng chiết từ hoa houblon. Đun sôi hoa nhằm trích ly và các chất thơm và chất đắng, đông tụ protein, thanh trùng nƣớc đƣờng hóa. Lƣợng hoa houblon sử dụng nhiều hay ít tùy thuộc vào từng loại bia và vào thị hiếu ngƣời tiêu dùng.

+ Lạnh nhanh và lắng trong:

Mục đích quan trọng này là giảm nhiệt độ nƣớc nha xuống, đƣa oxy từ không khí vào dịch thể và kết lắng các cặn bẩn, làm trong dịch đƣờng. Lạnh nhanh và lắng trong thƣờng tiến hành theo hai bƣớc: giảm nhiệt độ xuống 60- 70oC, kết tủa nóng lắng xuống và bị loại hết khỏi nƣớc nha. Khi nhiệt độ giảm đến 60oC, dịch nƣớc nha đƣợc bơm qua thiết bị lạnh nhanh, dịch đƣợc đƣa qua một thiết bị lọc để loại bỏ các cặn bẩn và kết tủa nóng. Tốc độ hạ nhiệt độ của dịch đƣờng nhanh nên hạn chế đƣợc sự hoạt động của vi sinh vật.

1.2.2. Lên men

Có hai kiểu lên men là lên men nổi và lên men chìm tùy thuộc vào việc sử dụng hai loại nấm men khác nhau. Nấm men nổi lên men ở nhiệt độ cao, nấm men chìm lên men ở nhiệt độ thấp. Lên men nổi hay chìm đều trải qua hai qua trình lên men, lên men phụ và lên men chính.

a. Lên men chính:

Mục đích: nhờ tác dụng của enzym, vi sinh vật chuyển hóa đƣờng

thành rƣợu, CO2 và các sản phẩm khác góp phần tạo nên hƣơng vị cho bia.

Sự tiêu hao cơ chất diễn ra mạnh mẽ, một lƣợng đƣờng khá lớn sẽ đƣợc chuyển hóa thành cồn và CO2. Thời gian lên men chính tùy thuộc vào nồng

độ chất hòa tan ban đầu của nƣớc nha và tùy thuộc vào yêu cầu chất lƣợng của các loại bia, thời gian có thể là 4-8 ngày. Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men là etanol và khí CO2. Các sản phẩm thứ cấp đƣợc tích tụ trong dịch nƣớc nha đã lên men là: glyxerin, axetaldehit, axit pyruvic, axit acetic, axit lactic… các loại rƣợu bậc cao đƣợc hình thành từ axit amin.

b. Lên men phụ và ủ chín:

Là quá trình lên men diễn ra chậm. tiêu hao một lƣợng đƣờng không đáng kể, lắng trong và bảo hòa CO2. Quá trình lên men phụ và ủ chín bia đƣợc tiến hành ở nhiệt độ từ 1-3oC.

Mục đích của quá trình lên men phụ và ủ chín là lên men phần đƣờng còn lại để bổ sung CO2 cho bia và hoàn thiện chất lƣợng bia, thu đƣợc một loại nƣớc uống bão hòa CO2 và có hƣơng thơm dễ chịu.

1.2.3. Vấn đề vệ sinh thực phẩm nói chung và vệ sinh trong quá trình sản

xuất bia nói riêng

1.2.3.1. Vệ sinh thực phẩm

Nói tới vệ sinh trong sản xuất thực phẩm ngƣời ta hay đề cập tới hai

yêu cầu cần đƣợc thực hiện đấy là GMP và HACCP.

 GMP (Good Manuafacturing Practice) - Tiêu chuẩn thực hành sản

xuất tốt.

GMP là hệ thống đảm bảo điều kiện chất lƣợng áp dụng cho tất cả các cơ sở sản xuất và chế biến thực phẩm, điều kiện vệ sinh tiên quyết của cơ sở sản xuất và chế biến thực phẩm. Đối tƣợng của GMP là tất cả các yếu tố có ảnh hƣởng tới chất lƣợng trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm.

Nội dung cơ bản của GMP: qui định các chuẩn mực về yêu cầu vệ sinh với cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm nhƣ vị trí, xí nghiệp, thiết kế nhà xƣởng và các khu vực lân cận, yêu cầu lắp đặt thiết bị cũng nhƣ phƣơng tiện sản xuất, yêu cầu về nguyên liệu, công nghệ chế biến, chế độ làm sạch, khử trùng; yêu cầu về vệ sinh con ngƣời trực tiếp tham gia sản xuất, hệ thống an toàn sản xuất và hệ thống quản lý chất lƣợng ở doanh nghiệp; thực hiện nghiêm ngặt, luôn luôn duy trì, cải tiến và đổi mới.

 HACCP (Hazards Analysia critical Control Point) - Hệ thống phân tích và kiểm soát các mối nguy trọng yếu trong quá trình sản xuất chế biến thực phẩm

HACCP là hệ thống đảm bảo chất lƣợng đƣợc áp dụng đối với các doanh nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm, đặc biệt là các cơ sở sản xuất chế biến sản phẩm thủy sản.

Đối tƣợng của HACCP tập trung vào các công đoạn trong công nghệ

chế biến, nơi có thể có các mối nguy về vật lý, vi sinh vật và hóa học

Nội dung cơ bản của hệ thống HACCP: Phân tích các mối nguy hại, xác định tầm quan trọng của các mối nguy đó trong nguyên liệu cũng nhƣ trong các công đoạn, công nghệ chế biến. Đây là yếu tố hết sức quan trọng trong quá trình HACCP; xác định các ngƣỡng giới hạn và các ngƣỡng vận hành; xác định các biện pháp, phƣơng thức quản lý, kiểm soát các ngƣỡng tới hạn đó và đề ra các hoạt động nhằm khắc phục trong trƣờng hợp các ngƣỡng trên vi phạm hoặc sai lệch; thiết lập hệ thống biểu mẫu trong việc thẩm định và tính toán kết quả.

GMP và HACCP là hai hệ thống đảm bảo chất lƣợng của sản phẩm đƣợc áp dụng cho tất cả các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm cho dù qui mô sản lƣợng nào. GMP và HACCP đều có mục tiêu là ngăn chặn phòng ngừa sự nhiễm bẩn trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm. Cả hai hệ thống đều yêu cầu đòi hỏi các điều kiện với doanh nghiệp trong việc đầu tƣ vật chất kỹ thuật, thời gian, con ngƣời trong quá trình áp dụng. Tuy nhiên GMP là điều kiện bắt buộc còn HACCP mang tính chất tự nguyện.

Trong quá trình sản xuất, tùy thuộc vào mỗi loại sản phẩm mà có những nguy cơ nhiễm bẩn mà gây mất an toàn cho ngƣời sử dụng rất đa dạng và khác nhau. Ngƣời ta chia các nguy cơ gây mất an toàn cho ngƣời sử dụng ra làm ba nhóm:

+ Mối nguy hai có nguồn gốc sinh học nhƣ: vi sinh vật gây bệnh, kí

sinh trùng, nấm men, nấm mốc, hay các sản phẩm biến đổi gen.

+ Mối nguy hại có nguồn gốc hóa học nhƣ: dƣ lƣợng thuốc trừ sâu, thuốc thú y; các loại phụ gia phẩm màu thực phẩm; hàm lƣợng kim loại quá giới hạn.

+ Mối nguy hại vật lý: tạp chất lạ, các mảnh kim loại, đá thủy tinh.

Nguồn gây hại có thể sinh ra từ các cơ sở sản xuất hay các sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, hoặc đƣa đến ngẫu nhiên từ quá trình vận chuyển, tiêu thụ.

1.2.3.2.Vệ sinh trong quá trình sản xuất bia

Trong quá trình sản xuất bia có các yêu cầu vệ sinh riêng nhƣ: vệ sinh nhà xƣởng, vệ sinh cá nhân của nhân viên, vệ sinh trong quá trình bảo quản, vệ sinh về phƣơng tiên vận chuyển, cơ sở phân phối và trong quá trình chế biến.

+ Yêu cầu nhà xƣởng: quá trình sản xuất đi theo dây chuyền một chiều, do đó các kho, phân xƣởng cũng phải thiết kế theo nguyên tắc đó. Phân xƣởng sản xuất phải đảm bảo thông thoáng, cao ráo, sạch sẽ, nguồn nƣớc cung cấp cho sản xuất phải đầy đủ đảm bảo vệ sinh.

+ Yêu cầu vệ sinh trong quá trình sản xuất: qui trình sản xuất liên tục, thời gian sản xuất càng ngắn càng tốt, tránh tiếp xúc trực tiếp của tay công nhân với thực phẩm đề phòng sự nhiễm bẩn, cần tự động hóa qui trình sản xuất. Nguyên liệu sản xuất không có mùi vị bất thƣờng, không nhiễm bẩn, có giá trị dinh dƣỡng phù hợp. Dụng cụ thiết bị, vật liệu không thôi nhiễm ra thực phẩm, dễ vệ sinh và tiệt khuẩn dễ dàng. Quá trình sản xuất nên theo qui trình tự động hóa và khép kín để tránh làm bẩn. Sản phẩm trƣớc khi xuất xƣởng phải đƣợc kiểm tra theo lô, mẻ, ca, thành phẩm không đạt yêu cầu vệ sinh phải có biện pháp xử lý, không đƣợc xuất xƣởng nhƣ sản phẩm bình thƣờng.

+ Vệ sinh cá nhân của nhân viên: Phải có khả năng tối thiểu về vệ sinh thực phẩm, nâng cao ý thức vệ sinh, giữ vệ sinh cho bản thân trong quá trình chế biến không mang bệnh truyền nhiễm.

+ Yêu cầu vệ sinh trong bảo quản: Kho chứa thực phẩm phải thông thoáng, có cửa sổ và quạt gió, các bao túi chứa bia phải để trên các sàn cao, sắp xếp trật tự, nhiệt độ bảo quản ổn định, phải có máy ghi nhiệt độ và độ ẩm hàng ngày.

+ Phƣơng tiện vận chuyển và cơ sở phân phối: Có phƣơng tiện vận chuyển riêng, có chế độ cọ rửa và sát khuẩn định kỳ các phƣơng tiện. Cơ sở phân phối phải đạt yêu cầu vệ sinh, thông thoáng, sạch sẽ.

1.3. Các phƣơng pháp kiểm tra vệ sinh trong sản xuất hiện nay

Hiện nay các phƣơng pháp kiểm tra vệ sinh thƣờng đƣợc áp dụng trong các cơ sở sản xuất bao gồm:

1.3.1. Phương pháp đánh giá bằng mắt thường

Phƣơng pháp đánh giá bằng mắt thƣờng là phƣơng pháp chủ yếu dựa vào quan sát bằng mắt để phát hiện các vết bẩn, tồn dƣ của quá trình chế biến còn tồn đọng trên dụng cụ thiết bị…

Ƣu điểm:

- Cho kết quả nhanh, tức thời

- Kinh phí đầu tƣ, chi phí đánh giá thấp

- Tính cơ động cao, có thể áp dụng cho nhiều loại hình sản xuất

Nhƣợc điểm:

- Độ nhạy rất thấp, chỉ cho phép nhận biết những sự mất vệ sinh lớn quá rõ

- Mang tính chủ quan, dễ gây tranh cãi

- Chỉ thực hiện ở những nơi mà con ngƣời có thể tiếp xúc đƣợc

Phƣơng pháp này chỉ mang tính hỗ trợ ban đầu.

1.3.2. Phương pháp đánh giá thông qua việc giám sát các thông số của hệ thống tự động hoặc thông qua việc kiểm tra nồng độ các chất tham gia vào quá trình

Ƣu điểm:

- Cho kết quả nhanh, tức thời từ đó có giải pháp xử lý kịp thời

- Độ nhạy cao

- Độ tin cậy lớn, mang tính khách quan.

Nhƣợc điểm:

- Kinh phí đầu tƣ cao, phải có trang thiết bị hiện đại, đồng bộ, cán bộ có chuyên môn cao

- Tính cơ động thấp.

1.3.3. Phương pháp đánh giá bằng nuôi cấy vi sinh vật truyền thống

Đây là phƣơng pháp đánh giá dựa trên việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trên dụng cụ, thiết bị sản xuất, sản phẩm, trên tay ngƣời vận hành…

Ƣu điểm:

- Kết quả phân tích khách quan

- Xác định đƣợc số lƣợng và chủng loại vi sinh vật trong mẫu thử

Nhƣợc điểm:

- Phải có trang bị phòng thí nghiệm, yêu cầu cán bộ có chuyên môn cao

- Tốn nhiều thời gian, cho kết quả chậm (từ 2 đến 5 ngày) vì vậy không thể có giải pháp xử lý kịp thời

- Không đánh giá đƣợc tồn dƣ các chất dinh dƣỡng.

1.3.4. Phương pháp kiểm tra bằng phát quang sinh học

Phƣơng pháp này dựa trên phép đo ATP- nguồn năng lƣợng dùng cho mọi tế bào động, thực vật, vi khuẩn, nấm men, nấm mốc… Từ kết quả đo ATP ta sẽ phát hiện đƣợc không chỉ số lƣợng vi sinh vật mà còn kiểm tra đƣợc cả tồn dƣ các chất dinh dƣỡng làm môi trƣờng cho vi sinh vật phát triển.

Đây là phƣơng pháp mới, tiên tiến đang đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới áp dụng cho các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm.

1.4. Giới thiệu về phƣơng pháp ATP quang sinh

ATP- Adenozin triphotphat là một dạng liên kết cao năng trong các tế bào sinh vật. Năng lƣợng ở dạng liên kết này có tính chất linh động, cho phép chuyển hóa dễ dàng sang các dạng năng lƣợng khác: hóa năng, nhiệt năng, cơ năng cần cho hoạt động sống của tế bào.

ATP chiếm vị trí đặc biệt trong số các hợp chất cao năng. Sự tạo thành hợp chất cao năng ATP luôn là giai đoạn thu năng lƣợng cuối cùng của các

quá trình oxy hóa khử. ATP cũng là chất cho năng lƣợng trực tiếp đối với các phản ứng thu nhiệt của sự trao đổi chất. Các hợp chất trung gian khác chỉ là sản phẩm trung gian để tạo ra ATP hoặc đƣợc tạo thành từ ATP. Nhƣ vậy ATP có vai trò quan trọng bậc nhất trong các chuyển hóa năng lƣợng và là mắt xích liên hợp giữa các phản ứng thu nhiệt và tỏa nhiệt. Do đó ATP là chất cho năng lƣợng vạn năng, tạo nguồn năng lƣợng dự trữ chung cho mọi tế bào, lƣợng ATP có trong các tế bào khoảng từ 0.22-1.03 fg (1). Hợp chất cao năng ATP có mặt trong tất cả các tế bào sống, đặc biệt là trong tất cả các tế bào vi khuẩn. Sự khác nhau về lƣợng ATP nhƣ một chức năng thuộc trạng thái sinh học, nhƣ một chức năng quan trọng của loài.

1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp ATP quang sinh học

ATP trong tế bào đƣợc giải phóng nhờ các tác nhân cation, dƣới tác dụng của enzym luciferin và sự có mặt của Mg2+ sẽ tạo ra phản ứng phát quang. Dùng máy đo chuyên dụng có độ nhạy cao để đo cƣờng độ sáng. Cƣờng độ này cao hay thấp tùy thuộc vào lƣợng ATP có trong mẫu.Từ đó ta xác định đƣợc lƣợng vi sinh vật và sự nhiễm bẩn trong mẫu hay dƣ lƣợng thực phẩm có trong mẫu….

1.4.2. Ưu điểm của phương pháp đo ATP quang sinh trong ngành công nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm

Phƣơng pháp kiểm tra vệ sinh truyền thống đòi hỏi mất nhiều thời gian từ 2 đến 5 ngày, có khi còn lâu hơn nữa. Việc xử lý kết quả ngay khi có sự cố là không đáp ứng đƣợc. Để khắc phục những hạn chế này, ngày nay ngƣời ta sử dụng ATP quang sinh.

+ ATP quang sinh là phƣơng pháp đo lƣờng cho kết quả tức thì.

+ Kiểm tra có kết quả nhanh để có biện pháp khắc phục kịp thời trƣớc

và trong sản xuất.

+ Giám sát vệ sinh toàn diện: Nhận dạng đầy đủ cả vệ sinh lẫn dƣ

lƣợng thực phẩm, nguồn môi trƣờng cho vi sinh vật phát triển.

+ Có thể kiểm tra trực tiếp lƣợng vi sinh vật hoặc chỉ dƣ lƣợng thực

phẩm tồn dƣ.

Ngành công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu, ngƣời ta dùng hệ thống kiểm tra nhanh để nhanh chóng xuất hàng trƣớc khi bắt đầu sản xuất đợt hàng mới, cũng nhƣ nhận dạng khu vực có vấn đề về độ sạch vệ sinh, xây dựng chế độ vệ sinh nghiêm ngặt, giảm thiểu tỷ lệ hàng hỏng/loại, hoàn thiện thiết kế các dòng sản phẩm, huấn luyện và đánh giá kỹ năng của các nhân viên vệ sinh và giải quyết các trở ngại về vệ sinh. Qua việc sử dụng hệ thống này, các công ty cũng giới thiệu đƣợc chất lƣợng và giá trị sản phẩm của mình đúng với yêu cầu ngƣời tiêu dùng và các cơ quan quản lý.

Phƣơng pháp ATP quang sinh đã phát huy mạnh mẽ tác dụng, hiệu quả trong ngành chế biến thực phẩm và nƣớc giải khát. Các công ty nhƣ Pepsi Cola, Nestle, Cadburge, Campbell, Bass và nhiều công ty khác đã đƣa ATP vào chƣơng trình QA (đảm bảo chất lƣợng) của họ (16). Ƣu điểm chính của phƣơng pháp ATP là cho kết quả tức thì, cho biết dây chuyền sản xuất của họ là sạch hay không sạch, điều đó có nghĩa là có thể sản xuất tiếp trên dây chuyền đấy đƣợc hay không. Điều này sẽ giúp công ty giảm thiểu những tổn thất về tài chính do sản phẩm bị nhiễm bẩn hoặc sản phẩm trên dây chuyền không đáp ứng chỉ tiêu vệ sinh. ATP là phƣơng tiện diễn giải nhanh chóng, giảm đi nhu cầu kiểm tra vệ sinh, đáp ứng đƣợc yêu cầu của qui trình GMP và HACCP.

Chƣơng II

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Kiểm tra quá trình vệ sinh trong dây chuyền công nghệ sản xuất bia ở cơ sở sản xuất của Viện Công nghiệp thực phẩm. Các vị trí kiểm tra là các vị trí trọng yếu của quá trình nhƣ các tec lên men và các tec sản phẩm, máy lọc sản phẩm.

Chỉ tiêu lựa chọn kiểm tra là: tổng nấm men, nấm mốc, tổng Coliform

và E.coli, tổng vi sinh vật hiếu khí

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị, hóa chất

a. Dụng cụ thiết bị

+ Máy đo ATP HY_LITE 2

+ Máy quang phổ UV-VIS U-1900

+ Nồi khử trùng

+ Tủ ấm

+ Tủ cấy

+ Máy đo pH

+ Pipet tự động, đầu hút

+ Đĩa petri, giấy nhôm, đèn cồn, bình xịt cồn, đũa thủy tinh,…

b. Hóa chất

+ Plate count agar ( Peptone từ Carein 5,0g; cao nấm men 2,5g; D+

gluco 1,0g; agar 14,0g)

Cách pha:

Hòa tan 22,5 g PCA trong 1000 mL nƣớc cất. Hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,0 ± 0,2 ở 25 oC.

+ Lactose broth ( Peptone 10g; lactose 10g; beef extract 6g; nƣớc cất

1000 mL).

Cách pha:

Môi trƣờng đơn: hòa tan 13g lactose broth trong 1000mL nƣớc cất.

Môi trƣờng kép: hòa tan 26g lactose broth trong 1000 mL nƣớc cất.

Hòa tan môi trƣờng, sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 6,9 ± 0,2 ở 25 oC.

+ Brilliant-green lactose (bile) broth ( Peptone 10g; lactose 10g; OX

bile 20g; Brilliant – green 13 mL; nƣớc cất 1000 mL).

Cách pha:

Môi trƣờng đơn: hòa tan 40g trong 1000 mL nƣớc cất.

Môi trƣờng kép: hòa tan 80g trong 1000 mL nƣớc cất.

Hòa tan môi trƣờng, sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,2 ± 0,2 ở 25 oC.

+ Tryptone

Tryptone ( Peptone từ casein ): 20g.

NaCl: 5g.

Nƣớc cất 1000 mL.

Cách pha:

Hòa tan môi trƣờng, sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,5 ± 0.2 ở 25 oC.

+ R2A agar (Yeast extract 0,5; proteose peptone 0,5; casein hydrolysat 0,5; glucose 0,5; starch soluble 0,5; natri pyruvat 0,3; K2HPO4 0,3; MgSO4 0,05; agar 12,0).

Cách pha:

Hòa tan 15.2 g trong 1000 mL nƣớc cất. Đem hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 15 phút. Sau khử trùng pH 7,2 ± 0,2 ở 25 oC.

+ Kovacs

+ Oxidase

+ Fluoro cult (Tryptone 5,0; NaCl 5,0; Sorbit 1,0; Tryptophan 1,0; 4-

brom-4chlor-3 indoly –B-D- glactogyranoside (X-gal) 0,08; 4- metylumbelliferyl –β-D-glucuronide (MGG) 0.05; 1-isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside 0.1 ).

Cách pha:

Môi trƣờng đơn: cân 17g/1000mL nƣớc cất

Môi trƣờng kép: cân 34g/1000mL nƣớc cất

Hòa tan môi trƣờng, sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 6,8 ± 0,2 ở 25 oC.

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống

Phƣơng pháp truyền thống là phƣơng pháp phổ biến nhất trong các nghiên cứu vi sinh vật học. Trên môi trƣờng đặc mỗi vi sinh vật sẽ phát triển thành khuẩn lạc hoặc sự sinh khí và biểu hiện đục ở ống nghiệm. Dựa trên đấy có thể kiểm tra số lƣợng vi sinh vật trong mỗi đơn vị thể tích của dịch nghiên cứu. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra số lƣợng nấm men, nấm mốc.

+ Ƣu điểm của phƣơng pháp là không phát hiện nhầm các vi sinh vật chết hoặc các mảnh xác hữu cơ, vì chỉ có bào tử hoặc các tế bào sống mới phát triển thành khuẩn lạc hoặc cho phản ứng sinh khí.

+ Nhƣợc điểm: Khi làm dịch pha loãng không phải mọi vi sinh vật đều có thể tách khỏi bề mặt chất rắn để hòa tan vào nƣớc. Không có loại môi trƣờng dinh dƣỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển. Các vi sinh vật phát triển trên mỗi loại môi trƣờng chỉ tồn tại một nhóm sinh lý nhất định.

Đối với vi sinh vật mà những bào tử thƣờng dính chặt vào nhau thành từng chuỗi, từng đôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trƣờng, thì mỗi chuỗi, mỗi khối chỉ hình thành một khuẩn lạc. Vì vậy số khuẩn lạc chƣa phản ánh đƣợc chính xác số tế bào, bào tử trong dịch nghiên cứu.

Khi cấy dịch pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy đƣợc số khuẩn lạc chênh nhau 10 lần. Vì vậy muốn kết quả phân tích có giá trị so sánh

tốt, chúng ta nên sử dụng một độ pha loãng thống nhất với từng nhóm vi sinh vật.

2.2.2.1.1. Phƣơng pháp xác định tổng số Coliform và E.coli

Cấy vào 5 ống đựng môi trƣờng canh thang lỏng nồng độ kép với một lƣợng 10 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngƣợc. Tiếp theo, cấy vào 5 ống đựng môi trƣờng canh thang lỏng nồng độ đơn với một lƣợng 1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngƣợc. Cấy vào 5 ống đựng môi trƣờng canh thang lỏng nồng độ đơn với một lƣợng 0.1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống đều thả ống duham lộn ngƣợc.

Ủ các ống sau khi cho mẫu vào ở nhiệt độ 35oC trong 24 hoặc 48 h và quan sát. Với những ống có biểu hiện đục và sinh khí, chuyển tiếp lần lƣợt 10 mL , 1mL, 0.1mL vào 5 ống môi trƣờng brilliant kép và 5; 5 ống môi trƣờng Brilliant đơn, nuôi tiếp ở 35oC sau 48 h. sau đấy quan sát và đọc kết quả theo bảng kết quả trong ISO 9308-phần II. Mẫu có coliform với biểu hiện đục và sinh khí ở ống.

Chuyển tiếp 10 mL, 1mL, 0.1 mL vào 5 ống môi trƣờng tryptone kép và 5; 5 ống môi trƣờng Tryptone đơn, nuôi tiếp ở 44oC sau 24 h. Cho vào mỗi ống vài giot Kovacs, nếu biểu hiện màu hồng trong ống, chứng tỏ sự có mặt của E.coli.

2.2.2.1.2. Tính tổng số nấm men, nấm mốc

Chuẩn bị dịch pha loãng và môi trƣờng đĩa thạch. Nấu từng loại môi trƣờng thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. Hòa tan môi trƣờng rồi phân phối vào các lọ, khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1mL mẫu với tỷ lệ pha loãng nhất định cho vào các hộp đĩa thạch đã đƣợc khử trùng, mỗi mức pha loãng dùng 4 đĩa thạch. Sau đấy rót vào mỗi hộp đĩa khoảng 10 mL môi trƣờng thạch sau khử trùng và để nguội ở 40-50oC. Đậy nắp và xoay tròn mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội đến khi mặt thạch đông lại, ghi số mẫu và nồng độ pha loãng lên mỗi đáy hộp petri và bọc giấy báo rồi đem nuôi ở 35oC và đọc kết quả sau 48h ± 3.

2.2.2.1.3. Tổng vi sinh vật hiếu khí

Sử dụng môi trƣờng R2A agar, hòa tan với lƣợng 15,2g/1000 mL, tiếp

theo đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.

Lấy 1 mL mẫu hoặc mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri đã đƣợc khử trùng, rót vào khoảng 10 mL môi trƣờng R2A agar đã khử trùng, đậy nắp và xoay tròn đều mỗi hộp trên mặt tủ cấy, để nguội, đợi khi mặt thạch đông lại hoàn toàn sau đấy ghi tên mẫu và nồng độ pha loãng lên đáy hộp petri, bao giấy rồi đem nuôi ở 35oC trong vòng 48h ± 3. Khi đủ thời gian, đem ra đọc kết quả bằng cách đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch. Sau đấy báo cáo số khuẩn lạc trên một đơn vị thể tích mẫu tƣơng ứng.

2.2.2.2. Phương pháp xác định độ sạch bằng ATP quang sinh

Để nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp kiểm tra nhanh vệ sinh trong dây chuyền sản xuất bia bằng đo ATP quang sinh, các bƣớc cần phải tiến hành nhƣ sau:

- Nhận dạng các điểm kiểm tra: Các điểm kiểm tra đƣợc coi là các điểm kiểm soát tới hạn (CCP), đại diện cho hiệu quả của quá trình vệ sinh. Kết quả thu đƣợc sẽ phản ánh thực tế hiệu quả của quá trình vệ sinh.

Các điểm kiểm tra nói chung đƣợc chia làm hai nhóm:

Bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm và nhóm bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm.

- Lập kế hoạch lấy mẫu: Căn cứ sơ đồ sản xuất, xây dựng kế hoạch lấy mẫu, tần suất lấy mẫu cho phù hợp từng vị trí kiểm tra.

- Thu thập dữ liệu và xây dựng giới hạn thƣờng quy: Nội dung này giúp nhận diện tình trạng vệ sinh hiện tại của các vị trí kiểm tra. Những dữ liệu này bao gồm tại các vị trí kiểm tra ở cả trạng thái bẩn và trạng thái đã vệ sinh sạch sẽ.

- Xác định các giá trị giới hạn: Sau khi có đủ các số liệu về tình hình vệ sinh ở từng vị trí kiểm soát, kết hợp với theo dõi quá trình sản xuất và những kết quả kiểm tra vệ sinh thông thƣờng sẽ tiến hành xây dựng mức kiểm soát vệ sinh bằng ATP quang sinh.

- Đo ATP quang sinh bằng thiết bị đo HY_LITE 2.

Đặc tính kỹ thuật của máy:

+ Khoảng tuyến tính 0-99000 RLU

+ Có thể lƣu hơn 2000 kết quả đo

+ Tín hiệu nền < 10 RLU

+ Các dạng kiểm tra: HACCP, Test and store, Test only

+ Đầu dò: photomultiplier (PMT) loại cực nhạy có chức năng bảo vệ quá tải

Trong phƣơng pháp xác định bằng ATP quang sinh có hai dạng dụng cụ lấy mẫu đƣợc sử dụng

+ Que lấy mẫu bề mặt:

Bôi lấy mẫu: Rút que lấy mẫu ra khỏi dụng cụ Clean-trace, bôi lên bề mặt kiểm tra với diện tích khoảng 10cm2

Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Clean-trace, ấn xuống và lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.

Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Clean-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả khoảng 10 giây sau đấy.

+ Que lấy mẫu nƣớc:

Bôi que lấy mẫu: Rút que lấy mẫu khỏi dụng cụ Aqua- trace, nhúng que lấy mẫu vào dung dịch kiểm tra

Hoạt hóa/lắc: Cẩn thận đặt que lấy mẫu vào dụng cụ Aqua-trace, lắc để hoạt hóa mẫu trong vòng 10 giây.

Đọc kết quả: Đặt dụng cụ Aqua-trace vào bộ phận nhận mẫu của máy và đợi đọc kết quả trong vòng 10 giây sau đấy.

2.2.2.3. Ứng dụng máy đo quang UV-VIS U-1900

Đặc tính kỹ thuật

Hệ quang: Ratio beam

Bƣơc sóng: 190-1100nm

Độ rộng dải quang phổ: 4 nm

Stray light: trong 0.5 % (220 nm NaI; 340 nm NaNO2)

Độ chính xác bƣớc sóng: ± 0.5 nm

Độ tái lặp bƣớc sóng: ± 0.3 nm

Dạng đo: Photometry, Wavelength scan, Time scan, Multiple, Wavelength measurement

Photometric range: Abs (-3.000 tới 3.000)

% T (0 tới 300%T)

Nồng độ (0.000 tới 9999)

Photometric Accuracy : ± 0.002 Abs ( 0 tới 0.5 Abs)

± 0.004 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs)

% 0.3 T

Photometric repeatability : ± 0.001 Abs ( 0 tới 0.5 Abs)

± 0.002 Abs (0.5 tơi 1.0 Abs)

% 0.15 T

Tốc độ scan bƣớc sóng: 10, 100, 200, 400, 800, 1200, 2400, 3600 nm/phút

Baseline stability (độ trôi ): 0.0004 Abs/h (500nm, 2 tiếng sau khi bật máy)

Baseline flatness: ± 0.002 Abs (200 tới 950 nm)

Baseline level: ± 0.00015 Abs (500nm)

Nguồn sáng: WI và đèn D2

Detector: Silicon photodiode

Tiến hành: Các mẫu môi trƣờng phát quang đƣợc chuẩn bị. Sử dụng

cuvet 20 mm cho phép đo. Chọn dải quét bƣớc sóng tà 190 nm - 1100 nm.

Chƣơng III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chúng tôi thực hiện kiểm tra vệ sinh ở một số điểm trọng yếu trong dây

chuyền sản xuất bia nhƣ:

+ Các tec lên men

+ Máy lọc sản phẩm

+ Các tec sản phẩm

3.1. Phƣơng pháp phân tích truyền thống

3.1.1. Kiểm tra ở các tec lên men

 Tec lên men 1

Bảng 2: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 1

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

Tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 x106 5.8 x106 5.2 x104 1.5 x103

3.7 x103 3.2 x103 1.0 x 102 Tổng nấm men, nấm mốc 4.2 x 103

0 0 0 0 Tổng E.coli (MPN)

Tổng Coliform (MPN) 4 2,0 2,0 <2,0

 Tec lên men 2

Bảng 3: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 2

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

Tổng vi sinh vật hiếu khí 4.2 x106 3.7 x106 2.1 x104 1.0 x103

3.6 x103 3.7x103 1.9 x103 1.0 x102 Tổng nấm men, nấm mốc

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

0 0 0 0 Tổng E.coli (MPN)

Tổng Coliform (MPN) 2,0 4,0 2,0 2,0

 Tec lên men 3

Bảng 4: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở tec lên men 3

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

5.7 x106 5.5 x106 4.7 x104 1.8 x103 Tổng vi sinh vật hiếu khí

3.4 x103 3.3x103 2.6 x103 0.5 x 102 Tổng nấm men, nấm mốc

0 0 0 0 Tổng E.coli (MPN)

4,0 2,0 <2,0 2,0 Tổng Coliform (MPN)

3.1.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm

 Máy lọc sản phẩm đợt 1

Bảng 5: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 1

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

Tổng vi sinh vật hiếu khí 6.2 x103 5.9 x103 3.0 x102 0.5 x102

5.6 x102 5.7x102 2.0 x102 1.3 x 10 Tổng nấm men, nấm mốc

0 0 0 0 Tổng E.coli (MPN)

Tổng Coliform (MPN) 2,0 2,0 4,0 <2,0

 Máy lọc sản phẩm đợt 2

Bảng 6: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 2

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

6.1 x103 6.0 x103 2.0 x102 5 x10 Tổng vi sinh vật hiếu khí

4.7 x102 4.8 x102 3.0 x102 12 Tổng nấm men, nấm mốc

0 0 0 0 Tổng E.coli (MPN)

4,0 <2,0 2,0 <2,0 Tổng Coliform (MPN)

 Máy lọc sản phẩm đợt 3

Bảng 7: Kết quả kiểm tra vệ sinh ở máy lọc sản phẩm đợt 3

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

5.9 x103 5.7 x103 1.0 x102 20 Tổng vi sinh vật hiếu khí

5.0 x102 4.7 x102 5.0 x10 12 Tổng nấm men, nấm mốc

0 0 0 0 Tổng E.coli (MPN)

Tổng Coliform (MPN) 2,0 2,0 2,0 <2,0

3.1.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm

 Tec sản phẩm 1

Bảng 8: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 1

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

6.3 x103 6.2 x103 10 x102 20 Tổng vi sinh vật hiếu khí

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

4.8 x102 4.2 x102 3.0 x10 17 Tổng nấm men, nấm mốc

0 0 0 0 Tổng E.coli (MPN)

2,0 <2,0 2,0 <2,0 Tổng Coliform (MPN)

 Tec sản phẩm 2

Bảng 9: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 2

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

6.0 x103 6.1 x103 8.0 x102 12 Tổng vi sinh vật hiếu khí

5.7 x102 5.4 x102 6.2 x10 14 Tổng nấm men, nấm mốc

0 0 0 0 Tổng E.coli (MPN)

2,0 <2,0 2,0 <2,0 Tổng Coliform (MPN)

 Tec sản phẩm 3

Bảng 10: Kết quả kiểm tra vệ sinh của tec sản phẩm 3

Chỉ tiêu phân tích Rửa lần 1 Rửa lần 2 Rửa lần 3 Rửa lần 4

5.4 x103 4.8 x103 9 x102 17 Tổng vi sinh vật hiếu khí

4.8 x102 4.5 x102 3.0 x10 11 Tổng nấm men, nấm mốc

0 0 0 0 Tổng E.coli (MPN)

2,0 2,0 2,0 <2,0 Tổng Coliform (MPN)

3.2. Phƣơng pháp ATP quang sinh học

3.2.1. Kiểm tra ở các tec lên men

Bảng 11: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở các tec lên men

Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)

6608 5500 6740 Vệ sinh lần 1 1

5460 4673 6580 Vệ sinh lần 2 2

520 510 495 Vệ sinh lần 3 3

295 297 285 Vệ sinh lần 4 4

Khi vệ sinh các tec lên men ở lần rửa thứ 1 và thứ 2 nƣớc còn bẩn, ở các tec đo đƣợc đều ở khoảng 6000 RLU. Từ lần 3 trở đi mức độ vệ sinh đã khá hơn, ở các tec đo đƣợc khoảng 500 RLU. Kết thúc quá trình kiểm tra (lần 4) mẫu đo đƣợc đạt ở mức dƣới 300 RLU ở cả 3 tec

3.2.2. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm

Mẫu lấy ở máy lọc sản phẩm đƣợc tiến hành sau khi xả tháo vải lọc, xả

bỏ cặn lần đầu tiên trên các bản lọc.

Bảng 12: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở máy lọc sản phẩm

Số thứ tự Tên mẫu Đợt 1 (RLU) Đợt 2 (RLU) Đợt 3 (RLU)

795 787 790 Vệ sinh lần 1 1

620 690 792 Vệ sinh lần 2 2

265 235 254 Vệ sinh lần 3 3

120 137 150 Vệ sinh lần 4 4

Ở hai lần vệ sinh đầu, máy lọc sản phẩm vẫn chƣa đƣợc sạch, sau lần thứ 3 vệ sinh kết quả RLU ở cả ba đợt đều nhỏ hơn 300 RLU. Ở máy lọc sản phẩm chỉ sau 3 lần đã có thể đạt yêu cầu vệ sinh.

3.2.3. Kiểm tra ở các tec sản phẩm

Bảng 13: Kết quả kiểm tra bằng phƣơng pháp ATP quang sinh ở các tec sản phẩm

Số thứ tự Tên mẫu Tec 1 (RLU) Tec 2 (RLU) Tec 3 (RLU)

870 734 674 1 Vệ sinh lần 1

723 627 580 2 Vệ sinh lần 2

225 243 235 3 Vệ sinh lần 3

131 127 130 4 Vệ sinh lần 4

Sau lần 1 và lần 2, quá trình vệ sinh vẫn không thay đổi đáng kế. Đến lần 3, ở tất cả các tec đều đạt kết quả dƣới 300 RLU. Cũng nhƣ ở máy lọc sản phẩm, tec sản phẩm cũng đạt yêu cầu sau 3 lần vệ sinh.

3.3. Đánh giá sự tƣơng thích giữa kiểm tra vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống và đo ATP quang sinh

3.3.1. Mẫu đã biết trước nồng độ

Để so sánh sự tƣơng thích, chúng tôi chuẩn bị các mẫu thử đã biết trƣớc nồng độ. Mẫu đƣợc chuẩn bị từ nấm men Saccharomyces carlbergensis dùng trong sản xuất bia, với nồng độ ban đầu là 3.5 x 106 tế bào/mL Các mẫu đƣợc chuẩn bị với nhiều mức nồng độ khác nhau với hệ số pha loãng là 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 kết quả đƣợc trình bày ở bảng dƣới đây.

Bảng 14: Kết quả phân tích mẫu đã biết trƣớc nồng độ bằng cả phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh.

Tên mẫu Đo ATP (RLU) Tổng vi sinh vật (CFU)

3.5 x 106 2302 Mẫu ban đầu

3.5 x 105 747 Mẫu 10-1

3.5 x 104 243 Mẫu 10-2

3.5 x 103 158 Mẫu 10-3

3.5 x 102 132 Mẫu 10-4

Qua bảng kết quả ta thấy kết quả đo đƣợc từ phƣơng pháp ATP quang sinh và tổng số tế bào nấm men đếm đƣợc có sự tƣơng thích, số đơn vị RLU tăng dần khi số lƣợng tế bào tăng dần. Ở giai đoạn pha loãng giữa nồng độ mẫu 10-4 và mẫu 10-3, kết quả thay đổi không nhiều, nhƣng có sự nhảy vọt giữa mẫu 10-1 và 10-2 và đặc biệt là từ mẫu ban đầu so với mẫu đã pha loãng 10 lần ( Mẫu 10-1).

3.3.2. Mẫu trên dây truyền sản xuất bia

a. Kiểm tra ở tec lên men

Bảng 15: Kết quả phân tích ở tec lên men 1 bằng phƣơng pháp truyền

thống và phƣơng pháp ATP quang sinh

 Tec 1

Đo ATP (RLU)

Tên mẫu

Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU)

5.8 x 106

6608

Rửa lần 1

5.4 x106

5460

Rửa lần 2

5.2 x 104

520

Rửa lần 3

1.5 x 103

295

Rửa lần 4

 Tec 2

Bảng 16: Kết quả phân tích ở tec lên men 2 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh

Đo ATP (RLU) Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU)

4.2 x 106 5500 Rửa lần 1

3.7 x106 4673 Rửa lần 2

2.1 x 104 510 Rửa lần 3

1.0 x 103 297 Rửa lần 4

 Tec 3

Bảng 17: Kết quả phân tích ở tec lên men 3 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh

Đo ATP (RLU) Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU)

5.7 x 106 6740 Rửa lần 1

5.5 x106 6580 Rửa lần 2

4.7 x 104 495 Rửa lần 3

1.8 x 103 285 Rửa lần 4

Nhận xét:

Quá trình vệ sinh, rửa lần 1 và lần 2 chƣa có sự thay đổi nhiều thể hiện ở cả phƣơng pháp xác định truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh. Từ lần rửa thứ 3, ở các tec lên men mới thấy biểu hiện rõ rệt sự thay đổi vệ sinh, và đến lần rửa cuối (lần 4) cùng thì sự đảm bảo vệ sinh mới đƣợc hoàn tất. Nếu dùng phƣơng phƣơng kiểm tra nhanh bằng ATP quang sinh thì tec lên men hoàn thành quá trình vệ sinh khi chỉ số RLU nhỏ hơn 300.

b. Kiểm tra ở máy lọc sản phẩm

 Đợt 1

Bảng 18: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 1 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh

Đo ATP (RLU) Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU)

790 6.2 x 103 Rửa lần 1

792 5.9 x103 Rửa lần 2

254 3.0 x 102 Rửa lần 3

150 0.5 x 102 Rửa lần 4

 Đợt 2

Bảng 19: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 2 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh

Đo ATP (RLU) Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU)

795 6.1 x 103 Rửa lần 1

620 6.0 x103 Rửa lần 2

265 2.0 x 102 Rửa lần 3

120 0.4 x 102 Rửa lần 4

 Đợt 3

Bảng 20: Kết quả phân tích ở máy lọc sản phẩm đợt 3 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh

Đo ATP (RLU) Tên mẫu Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU)

5.9 x 103 787 Rửa lần 1

5.7 x103 690 Rửa lần 2

1.0 x 102 235 Rửa lần 3

2.0 x 10 117 Rửa lần 4

Nhận xét: Ở máy lọc sản phẩm từ sau lần rửa thứ ba sự đảm bảo vệ sinh

đã đƣợc hoàn tất, ở cả ba đợt chỉ số RLU đo đƣợc đều nhỏ hơn 300.

c. Kiểm tra ở các tec sản phẩm

 Tec 1

Bảng 21: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 1 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh

Tên mẫu Đo ATP (RLU) Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU)

870 6.3 x 103 Rửa lần 1

723 6.2 x103 Rửa lần 2

225 10 x 102 Rửa lần 3

131 2.0 x 10 Rửa lần 4

 Tec 2

Bảng 22: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 2 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh

Tên mẫu Đo ATP (RLU) Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU)

6.0 x 103 734 Rửa lần 1

6.1 x103 627 Rửa lần 2

8.0 x 102 243 Rửa lần 3

1.2 x 10 127 Rửa lần 4

 Tec 3

Bảng 23: Kết quả phân tích ở tec sản phẩm 3 bằng phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp ATP quang sinh

Tên mẫu Đo ATP (RLU) Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU)

5.4 x 103 674 Rửa lần 1

4.8 x103 580 Rửa lần 2

9.0 x 102 235 Rửa lần 3

1.7 x 10 130 Rửa lần 4

Nhận xét: Ở các tec lên men sau lần rửa vệ sinh thứ 3, các tec đã đạt yêu cầu về vệ sinh, các chỉ số RLU đo đƣợc ở cả 3 tec sau lần rửa thứ 3 đều nhỏ hơn 300.

3.4. Khảo sát ứng dụng phƣơng pháp tạo màu xác định tổng số Coliform trên máy quang phổ U-1900 ( UV-VIS spectrophotometre)

Sử dụng nƣớc thải sau vệ sinh của xƣởng sản xuất để kiểm tra Coliforms. Từ nguồn nƣớc thải đã xác định đƣợc Coliforms tổng số (ký hiệu M) đem pha loãng ra các nồng độ khác nhau M x 5 -1; M x 10 -1; M x 10 -2 đƣợc các mẫu có chứa Coliforms khác nhau để nuôi cấy, sau đó đem đo trên quang phổ UV-VIS.

Chúng tôi tiến hành scan bƣớc sóng ở ba mức độ nồng độ ( M x 5 -1; M x 10 -1; M x 10 -2). từ bƣớc sóng 190nm -1100nm, tốc độ 100nm/phút. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

 Nồng độ M x 10-2mL

Bảng 24: Kết quả scan mẫu có nồng độ pha loãng 10-2 ở bƣớc sóng 190 – 1100nm

Peak Valley

Thứ tự WL Abs WL Abs

967 0.467 1078 0.265 1

655 0.930 908 0.322 2

614 0.957 644 0.897 3

284 3.587 559 0.830 4

243 3.776 277 3.551 5

 Nồng độ M x 10-1

Bảng 25: Kết quả scan mẫu có nồng độ pha loãng 10-1 ở bƣớc sóng 190 – 1100nm

Peak Valley

Thứ tự WL Abs WL Abs

972 0.409 1074 0.220 1

292 3.646 907 0.258 2

242 3.753 273 3.591 3

 Nồng độ M x 5-1

Bảng 26: Kết quả scan mẫu có nồng độ pha loãng 5-1 ở bƣớc sóng 190 – 1100nm

Peak Valley

Thứ tự WL Abs WL Abs

1 910 0.306 970 0.447

2 644 0.914 655 0.951

3 558 0.840 614 0.979

4 276 3.587 292 3.637

5 241 3.793

Hình 1: Hình ảnh phổ scan ở bƣớc sóng 190 – 1100 nm

Hình 2: Hình ảnh phổ scan ở bƣớc sóng 200 – 800 nm

Ở cả 3 mức nồng độ, độ hấp thụ đạt cao nhất ở bƣớc sóng 241nm – 243nm. Tuy nhiên dung dịch tạo màu có màu xanh lục, là vùng nhìn thấy nằm

trong dải phổ từ 400 nm- 800nm. Do vậy chúng tôi tiến hành khảo ở vùng bƣớc sóng từ 400 nm – 800 nm. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

 Nồng độ ban đầu M

Bảng 27: Kết quả scan mẫu M ở bƣớc sóng 400 – 800nm

Peak Valley

Thứ tự WL Abs WL Abs

613.5 0.928 569.0 0.825 1

 Nồng độ M x 5 -1

Bảng 28: Kết quả scan mẫu M x 5-1 ở bƣớc sóng 400 – 800nm

Peak Valley

Thứ tự WL Abs WL Abs

615 0.992 568 0.886 1

 Nồng độ M x 10 -1

Bảng 29: Kết quả scan mẫu M x 10-1 ở bƣớc sóng 400 – 800nm

Peak Valley

Thứ tự WL Abs WL Abs

615 0.909 588.5 0.775 1

 Nồng độ M x 10 -2

Bảng 30: Kết quả scan mẫu M x 10-2ở bƣớc sóng 400 – 800nm

Peak Valley

Thứ tự Abs WL Abs WL

1.301 640.5 1.272 656 1

1.301 565.5 1.089 617 2

 Nồng độ M x 10 -3

Bảng 31: Kết quả scan mẫu M x 10-3ở bƣớc sóng 400 – 800nm

Peak Valley

Thứ tự Abs WL Abs WL

0.972 636.5 0.960 657 1

617.5 0.985 561 0.823 2

Hình 3: Hình ảnh phổ scan ở bƣớc sóng 400 – 800 nm

Ở cả 5 mức nồng độ, scan từ bƣớc sóng 400nm – 800nm, chúng tôi thu đƣợc độ hấp thụ cao nhất ở bƣớc sóng 617 nm. Chúng tôi tiến hành đo mẫu nƣớc thải lấy ở bể chứa nƣớc thải sau khi vệ sinh ở bƣớc sóng 617 nm, thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Bảng 32: Kết quả phân tích mẫu lấy ở bể chứa nƣớc thải sau khi vệ sinh bằng phƣơng pháp truyền thống và đo bằng máy UV-VIS 1900 của Hitachi.

Tên mẫu ABS

MPN (coliforms)

1.634 13 x 105 M

1.442 80 x 104 M x 10-1

1.266 50 x 103 M x 10-2

1.223 40 x 102 M x 10-3

0.852 23 x 10 M x 10-4

M x 10-5 0.074 40

Nhận xét:

Nhìn vào bảng kết quả trên chúng ta thấy có sự tƣơng thích giữa độ hấp thu đo đƣợc trên máy quang phổ UV-VIS 1900 và phƣơng pháp xác định coliform truyền thống (Phƣơng pháp nhiều ống xác định coliform: ISO 9308- 2). Sự khác nhau về độ hấp thụ ABS giữa các mức nồng độ khác nhau rất rõ. Qua đó, cho thấy ban đầu có thể dùng thiết bị UV – VIS 1900 của Hitachi vào xác định sự có mặt của coliform.

Chƣơng IV.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ kết quả nghiên cứu cử đề tài cho chúng ta một số kết luận sau:

1. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật truyền thống và phƣơng pháp đo ATP

quang sinh học có sự tƣơng thích nhất định.

2. Phƣơng pháp ATP quang sinh có nhiều ƣu điểm, dễ thực hiện và cho kết quả nhanh, tƣơng đối chính xác để cho các phép thử nhanh về vệ sinh an toàn thực phẩm.

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, khi đo bằng phƣơng pháp ATP quang sinh có kết quả nhỏ hơn 300 RLU, thì một số khu vực vệ sinh trong dây truyền sản xuất bia đã đạt yêu cầu về vệ sinh.

Phƣơng pháp ATP quang sinh có những ƣu điểm nhƣ sau:

+ Là phƣơng pháp đo nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, dễ mang đi hiện trƣờng.

+ Từ kết quả đo đƣợc bằng ATP quang sinh không chỉ phát hiện đƣợc số lƣợng vi sinh vật sống mà còn kiểm tra đƣợc hàm lƣợng tồn dƣ các chất dinh dƣỡng làm môi trƣờng cho vi sinh vật phát triển.

+ Nhờ vậy giúp các nhà máy, cơ sở sản xuất và chế biến thực phẩm khắc phục đƣợc các sự cố vệ sinh tức thời.

Tuy nhiên phƣơng pháp này cũng có một số hạn chế:

+ Phƣơng pháp chỉ kiểm tra đƣợc tổng số vi sinh vật mà chƣa có phân loại đƣợc từng loại vi sinh vật.

+ Giá thành của mỗi que thử lấy mẫu cũng tƣơng đối đắt và mỗi que lấy mẫu chỉ dùng đƣợc một lần duy nhất, nếu thao tác lấy mẫu không đúng sẽ khá tốn kém khi lấy đi, lấy lại nhiều lần.

3. Ở trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thử ứng dụng của máy quang phổ UV-VIS 1900 Hitachi và thấy có sự tƣơng thích khá chặt chẽ giữa độ hấp thụ và tổng số Coliform trong mẫu. Bƣớc đầu có thể ứng dụng máy đo UV-VIS 1900 Hitachi vào việc xác định mức độ có mặt của coliform một cách tƣơng đối.

3. Kiến nghị:

1. Phƣơng pháp đo ATP quang sinh còn là phƣơng pháp mới, để có thể đem ra ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả hơn, chúng ta cần phải đầu tƣ thời gian để nghiên cứu và tham khảo nhiều hơn nữa.

2. Có những nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng của máy quang phổ UV-VIS vào việc xác định tổng số vi sinh vật nói chung cũng nhƣ tổng số coliforms. Củng cố thêm mối tƣơng quan giữa độ hấp thụ và nồng độ vi sinh vật, từ đó có thể cho ra một kết quả tƣơng đƣơng giữa đơn vị độ hấp thụ ABS và đơn vị của vi sinh vật tổng số cũng nhƣ tổng số coliforms.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tập3.

2. Nguyễn Lân Dũng (1971), Kiểm tra số lượng và phân lập các nhóm vi sinh

vật, Nhà xuất bản đại học tổng hợp, tập 1

3. Nguyễn Văn Đạt (1974), Phân tích lương thực thực phẩm, Nhà xuất bản

khoa học kỹ thuật.

4. Nguyễn Quang Hào (1980), Thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo

dục.

5. Lƣu Lâm, Nguyễn Yên, Trần Quang (1969), Vệ sinh thực phẩm, Vụ kỹ

thuật.

6. Hoàng Tích Mịch, Hà Huy Khôi (1977), Vệ sinh dinh dưỡng và vệ sinh

thực phẩm, Nhà xuất bản Y học.

7. Vũ Văn Ngũ (1987), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất bản Y

học.

8. Đào Thị Nguyện (1995), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y hoc.

9. Lƣơng Đức Phẩm (2000), Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm,

Nhà xuất bản Nông nghiệp.

10. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nhƣ Thuận, Nguyễn Phùng Tiến (1975), Vệ sinh

thực phẩm, Nhà xuất bản Y học.

11. Phạm Văn Thành (2002), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích

nhanh để để kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm. Báo cáo đề tài năm 2002. Bộ Công nghiệp

12. Văn Tình (1983), Kiểm tra chất lượng sản phẩm nông nghiệp, Nhà xuất

bản Thành phố Hồ Chí Minh.

13. Bùi Nhƣ Thuận, Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức (1991), Kiểm nghiệm chất lượng và thanh tra vệ sinh an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản Y học.

14. Ứng dụng các phương pháp phân tích công cụ trong kiểm soát môi trường

và thực phẩm (1999), Hội thảo khoa học Hà nội.

15. Ứng dụng các phương pháp phân tích công cụ hiện đại trong môi trường

và an toàn lương thực thực phẩm (1994), Hội thảo khoa học Hà nội.

16. Phạm Thu Yến (2001), “Kiểm tra quá trình vệ sinh trong sản xuất thực phẩm, đánh giá sự tương thích giữa phương pháp kiểm tra truyền thống và phương pháp đo ATP quang sinh học”, khóa luận tốt nghiệp.

Tiếng Anh

17. Adam M.R anh Moss M.O (1995), “ Food Microbiology”, The Royal

Society Of Chemistry.

18. Claude Moreau (1974), “ Mousissures toxique dans Ladimentation

edition”, Pari.

19. Harry H (1962), “Practical food Microbiology and Technology Wesport”,

Connecticut.

20. R.D. Gonzalez. L.M. Tamagnini, P.D. Olmos, G.B. de Sousa (2003), total coliforms and foods”, Food ready-to-eat in

“Evalution of a chromogenic medium for Escherichia coli determination Microbiology, 20, pp. 601-604.

21. Denis Byamukama, Frank Kansiime, Robert L. Mach, and Andreas H. Farnleitner (200), “ Determination of Escherichia coli Cotamination with Chromocult Coliform Agar Showed a High Level of Discrimination Efficiency for Differing Fecal Pollution Levels in Tropical Waters of Kampala, Uganda “, Applied and Environmental Microbiology, pp. 864-868

22. K. Geissler, M. Manafi, I. Amoros and J.L. Alonso (2000), Quantitative detarmination of total coliform and Escherichia coli in marine waters with chromogenic and flourogenic media, Joural of Applied Microbiology, 88, pp. 280-285.

23. Standard Method the Examination of Water and Wastewater 21th edition,

2005, 9215B.

24. Standard Method the Examination of Water and Wastewater 21th edition,

2005, 9215D

25. ISO 9308-2: First edition 1990-10-01