Luận văn Thạc sỹ: Nghiên cứu thu nhận và ứng dụng enzyme protease nội tạng để sản xuất bột canh tôm từ đầu tôm thẻ chân trắng

Chia sẻ: Hoang Linh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:106

Thêm vào BST

Báo xấu

146
lượt xem 26
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nhằm tăng giá trị kinh tế và tận dụng triệt để hơn nguồn nguyên liệu tôm, góp phần giảm ô nhiễm môi trường, tạo điều kiện cho ngành thủy sản Việt Nam phát triển và cạnh tranh hơn trên trường quốc tế.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sỹ: Nghiên cứu thu nhận và ứng dụng enzyme protease nội tạng để sản xuất bột canh tôm từ đầu tôm thẻ chân trắng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG   NGUYỄN HOÀNG THANH NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE NỘI TẠNG ĐỂ SẢN XUẤT BỘT CANH TÔM TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Khánh Hòa - 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG   NGUYỄN HOÀNG THANH NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE NỘI TẠNG ĐỂ SẢN XUẤT BỘT CANH TÔM TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Chuyên ngành: Công nghệ Sau Thu Hoạch Mã số : 60.54.01.04 LUẬN VĂN THẠC SỸ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. ĐỖ VĂN NINH Khánh Hòa - 2013
i LỜI CAM ĐOAN Luận văn Thạc sỹ khoa học này được tác giả thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Đỗ Văn Ninh. Những kết quả thực nghiệm của tôi thu được trong luận văn Thạc sỹ khoa học này là hoàn toàn mới và chưa được ai công bố chính thức. Tôi xin cam đoan đây là sự thật và hoàn toàn chịu trách nhiệm với những kết quả mình đã công bố. Nha Trang, ngày 11 tháng 11 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Hoàng Thanh
ii LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua. Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Tiến sỹ Đỗ Văn Ninh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ thực phẩm Trường Đại Học Nha Trang đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập của khóa học. Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn những người thân trong gia đình đã luôn hỗ trợ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. Nha Trang, tháng 11 năm 2013 Nguyễn Hoàng Thanh
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ vii DANH MỤC CÁC HÌNH .........................................................................................viii DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................................. ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 3 1.1 Tổng quan về enzyme protease: ......................................................................... 3 1.1.1 Giới thiệu chung: ......................................................................................... 3 1.1.2 Phân loại và cách gọi tên protease: .............................................................. 5 1.1.3 Phương pháp tách và làm sạch enzyme ........................................................ 6 1.2. Một số nghiên cứu và ứng dụng của protease: ................................................. 10 1.2.1 Một số nghiên cứu về protease: ................................................................. 10 1.2.2 Ứng dụng của protease: ............................................................................. 13 1.3. Giới thiệu tôm thẻ chân trắng và phế liệu của tôm thẻ chân trắng trong quá trình chế biến: ................................................................................................................ 14 1.3.1. Giới thiệu về tôm nguyên liệu: ................................................................. 15 1.3.1.1. Đặc điểm cấu tạo sinh thái của tôm thẻ chân trắng: ............................ 15 1.3.1.2. Hiện tượng hư hỏng của tôm trong quá trình chế biển và bảo quản: ... 17 1.3.2. Phế liệu tôm và các biện pháp tận dụng: ................................................... 18 1.4. Giới thiệu về bột đạm thủy phân và phương pháp thu hồi bột đạm: ................. 21 1.4.1. Giới thiệu về bột đạm thủy phân:.............................................................. 21 1.4.2 Thu hồi bột đạm bằng phương pháp sấy phun: .......................................... 24 1.4.2.1 Nguyên lý của phương pháp sấy phun ................................................ 24 1.4.2.2 Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy sấy phun ............................. 24 1.4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy ............................................. 26 1.4.2.4 Phân loại thiết bị sấy phun .................................................................. 27 1.4.2.5. Ưu và nhược điểm của công nghệ sấy phun ....................................... 27 1.4.3. Tổng quan Dextrin – chất bổ sung trong quá trình thu hồi bột đạm thủy phân. .................................................................................................................. 28 1.4.4. Muối ăn (NaCl) ........................................................................................ 29 Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 31 2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ............................................................ 31
iv 2.1.1 Nguyên liệu dùng để tách chiết enzyme và dùng trong quá trình thủy phân ........................................................................................................................... 31 2.1.2 Dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu .............................................. 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................. 32 2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát: ............................................................. 32 2.2.2 Chiết rút thu dịch chiết (DC) và chế phẩm enzyme (CPE) từ đầu tôm thẻ chân trắng .......................................................................................................... 33 2.2.2.1 Xác định dung môi chiết và tỷ lệ dung môi chiết thích hợp ................. 33 2.2.2.2 Xác định điều kiện kết tủa thích hợp thu CPE ..................................... 36 2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ protease của CPE ................... 39 2.2.3.1 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của CPE ........ 39 2.2.3.2 Xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của protease CPE ................ 39 2.2.3.3 Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt độ protease của CPE................................................................................................................ 40 2.2.3.4 Xác định độ bền nhiệt của protease CPE............................................. 41 2.2.4 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng bằng chế phẩm protease nội tạng ............................................................... 41 2.2.4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến quá trình thủy phân......................... 41 2.2.4.2 Bố trí thí nghiệm xác định chế độ thủy phân tối ưu ............................. 42 2.2.5 Xác định tỷ lệ phối trộn bột đạm với các nguyên liệu phụ để thử nghiệm sản xuất bột canh tôm ............................................................................................... 46 2.3 Phương pháp phân tích đã áp dụng ................................................................... 46 2.4 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 46 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................... 48 3.1. Nghiên cứu thu nhận protease và một số yếu tố ảnh hưởng đến protease thu nhận từ đầu tôm thẻ chân trắng .............................................................................. 48 3.1.1. Xác định dung môi chiết thích hợp: .......................................................... 48 3.1.2. Xác định tỷ lệ dung môi chiết thích hợp ................................................... 49 3.1.3. Xác định thời gian chiết thích hợp: ........................................................... 50 3.1.4. Xác định tác nhân kết tủa: ........................................................................ 51 3.1.5. Xác định nồng độ tác nhân kết tủa: ........................................................... 55 3.1.6 Xác định thời gian kết tủa:......................................................................... 58 3.1.7 Đề xuất qui trình thu nhận CPE từ đầu tôm thẻ chân trắng......................... 60 3.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của protease: ............................ 61 3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease trong CPE .................... 61 3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ tương đối của protease trong CPE: ........... 62 3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt độ của protease trong CPE: ..... 64
v 3.2.4 Xác định độ bền nhiệt của CPE ................................................................. 65 3.3 Nghiên cứu quá trình thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng bằng CPE tách chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ........................................................................................... 67 3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ CPE đến hàm lượng protein hòa tan thu nhận được từ quá tình thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng: .................................................... 67 3.3.2 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân đầu tôm ........................................ 68 3.4. Kết quả xác định tỷ lệ phối trộn các thành phần nguyên liệu để thử nghiệm sản xuất bột canh tôm................................................................................................... 73 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ......................................................................... 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 79 PHỤ LỤC .................................................................................................................... a
vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPE: Chế phẩm enzyme DC: Dịch chiết DX: Design Expert NL: Nguyên liệu pHopt: pH tối thích topt: Nhiệt độ tối thích TTHĐ: Trung tâm hoạt động
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của đầu và vỏ phế liệu tôm [6] ............................... 19 Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaeus vannamei.[21] .... 19 Bảng 1.3 Các chỉ tiêu cảm quan [21]...................................................................... 23 Bảng 1.4. Các chỉ tiêu lý - hóa [21]........................................................................ 23 Bảng 1.5. Chỉ tiêu vi sinh vật [19] ......................................................................... 23 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến thực của công đoạn thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng CPE .......................................... 45 Bảng 2.2 Thành phần phối trộn nguyên liệu trong 100g bột canh tôm .................... 46 Bảng 3.1 Tóm tắt tính phù hợp của mô hình đối với hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan ....................................................................................................... 68 Bảng 3.2 Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình đáp ứng bậc 2 của hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân ....................................................... 69 Bảng 3.3 Các hệ số ảnh hưởng trong mô hình hồi qui ............................................ 70 Bảng 3.4 Các thông số tối ưu được chọn cho quá trình thủy phân .......................... 72 Bảng 3.5 Chế độ tối ưu cho quá trình thuỷ phân .................................................... 73 Bảng 3.6 Kết quả tối ưu cho quá trình thuỷ phân theo tiên đoán và thực nghiệm.... 73 Bảng 3.7 Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm bột canh tôm với các công thức phối trộn khác nhau ............................................................................................... 73 Bảng 3.8 Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm bột canh tôm ........................... 74
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sản lượng tôm thẻ chân trắng nuôi ở Châu Á. [39] .................................. 16 Hình 1.2 Sản lượng tôm nuôi trên thế giới [39] ...................................................... 17 Hình 1.3 : Sơ đồ hệ thống sấy phun ....................................................................... 26 Hình 1.4 Cấu trúc Dextrin ...................................................................................... 28 Hình 3.1. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt độ của DC. .............................. 48 Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hoạt độ của protease DC. ......... 49 Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ của protease DC. .................. 50 Hình 3.4 Ảnh hưởng của tác nhân kết tủa tới hoạt độ tương đối của protease CPE. 51 Hình 3.5 Ảnh hưởng của tác nhân kết tủa tới hoạt độ riêng của protease CPE. ....... 52 Hình 3.6 Ảnh hưởng của tác nhân kết tủa tới Hiệu suất thu hồi CPE và độ tinh sạch của CPE ................................................................................................................. 53 Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/DC tới hoạt độ tương đối của protease CPE. .............................................................................................................................. 55 Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/DC tới hoạt độ riêng tương đối của CPE. ... 56 Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/DC tới hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch. .... 57 Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian tủa đến hoạt độ của protease trong CPE. ........ 58 Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ tương đối của protease trong CPE. .............................................................................................................................. 61 Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ tương đối của protease trong CPE. ....... 62 Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt độ tương đối của protease trong CPE. ............................................................................................................. 64 Hình 3.14 Xác định độ bền nhiệt của CPE. ............................................................ 65 Hình 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ CPE/NL đến hàm lượng protein hòa tan trong quá trình thủy phân đầu tôm. ........................................................................................ 67 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan theo sự thay đổi của nhiệt độ và nồng độ (3D) ................................................................................. 71 Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn sự biến đổi hàm lượng protein hòa tan theo sự thay đổi của nhiệt độ và nồng độ (đường cong) ................................................................... 72
ix DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. ......................................................... 32 Sơ đồ 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định dung môi chiết thích hợp. ............................. 33 Sơ đồ 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ dung môi chiết thích hợp ...................... 34 Sơ đồ 2.5 Bố trí thí nghiệm xác định tác nhân tủa thích hợp................................... 36 Sơ đồ 2.6 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ tác nhân kết tủa thích hợp. .............. 37 Sơ đồ 2.7 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian tủa thích hợp. ................................. 38 Sơ đồ 2.8 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của protease CPE. ........................................................................................................ 39 Sơ đồ 2.9 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH tới hoạt độ của protease CPE. ...................................................................................................................... 40 Sơ đồ 2.10 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ muối ăn tới hoạt độ của protease CPE. .................................................................................................. 40 Sơ đồ 2.11. Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của protease CPE................... 41 Sơ đồ 2.12.Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân. .............................................................................................................. 42 Sơ đồ 3.1 Đề xuất qui trình thu nhận CPE từ đầu tôm thẻ chân trắng. .................... 60 Sơ đồ 3.2 Đề xuất qui trình sản xuất bột canh tôm từ đầu tôm thẻ chân trắng. ........ 75
1 MỞ ĐẦU  Tính cấp thiết của đề tài: Hiện nay, tôm là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực của ngành thủy sản nước ta. Tuy nhiên chúng ta mới chỉ xuất khẩu thủy sản ở dạng thô, và phần còn lại của nguyên liệu tôm là tương đối nhiều, chiếm khoảng 35-45% trọng lượng tôm tùy thuộc vào từng giống loài và mùa vụ. Phần còn lại của nguyên liệu tôm chủ yếu gồm đầu và vỏ tôm, ít mang lại giá trị kinh tế cho doanh nghiệp do chưa được tận thu và chế biến triệt để, đồng thời chúng lại nhanh ươn thối, gây ô nhiễm cho môi trường xung quanh, gây khó khăn cho công tác quản lý và sản xuất. Để giải quyết khó khăn này, Việt Nam và các nước trên thế giới đang có xu hướng tận dụng phần còn lại của nguyên liệu để chế biến thành các sản phẩm giá trị gia tăng. Từ thực tế trên, yêu cầu cấp bách đặt ra cho các nhà công nghệ là sử dụng hợp lý, hiệu quả phần còn lại của nguyên liệu này mà các nhà máy chế biến thủy sản thường coi là phế liệu. Phần còn lại trong ngành chế biến tôm chủ yếu được dùng để sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hoá học với các hóa chất ở nồng độ cao, thời gian xử lý kéo dài, nếu không xử lý đúng cách thì sẽ gây ô nhiễm môi trường. Ngoài ra còn có một hướng giải quyết khác là thu nhận phần nguyên liệu còn lại này để sản xuất ra bột đạm để làm thức ăn trong chăn nuôi hay làm thức ăn cho con người, từ đó nâng cao nâng cao được giá trị của nguyên liệu, giảm tải cho quá trình xử lí nước thải, hạn chế gây ô nhiễm môi trường. Với mong muốn góp phần giải quyết vấn đề trên, dưới sự hướng dẫn của TS. Vũ Văn Ninh, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận và ứng dụng enzyme protease nội tạng để sản xuất bột canh tôm từ đầu tôm thẻ chân trắng.” nhằm tăng giá trị kinh tế và tận dụng triệt để hơn nguồn nguyên liệu tôm, góp phần giảm ô nhiễm môi trường, tạo điều kiện cho ngành thủy sản Việt Nam phát triển và cạnh tranh hơn trên trường quốc tế.  Mục tiêu của đề tài - Xác định các điều kiện thích hợp để tách chiết, thu nhận chế phẩm thô (CPT) protease từ đầu tôm thẻ chân trắng. - Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của chế phẩm thu được. - Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm protease thu được vào trong sản xuất bột canh tôm từ đầu tôm thẻ chân trắng.
2  Nội dung của đề tài: - Xác định điều kiện chiết rút và thu nhận chế phẩm enzyme thô từ đầu tôm thẻ chân trắng. - Xác định một số đặc tính của chế phẩm enzyme thu nhận được. - Nghiên cứu chế độ thủy phân tối ưu cho quá trình thủy phân đầu tôm thẻ chân trắng bằng chế phẩm enzyme. - Bước đầu thử nghiệm sản xuất bột canh tôm.  Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: - Ý nghĩa khoa học: kết quả của luận án góp phần làm phong phú thêm những hiểu biết về protease và một trong những ứng dụng của enzyme này trong lĩnh vực chế biến thủy sản. - Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của luận án nếu được áp dụng vào sản xuất công nghiệp sẽ góp phần nâng cao giá trị của nguyên liệu tôm, tiết kiệm chi phí và tăng doanh thu cho doanh nghiệp, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, góp phần vào chương trình “Chế biến các sản phẩm có giá trị gia tăng” của Bộ nông nghiệp.  Tính mới của đề tài: Tách chiết protease từ đầu tôm thẻ chân trắng và sử dụng chúng để sản xuất bột canh tôm từ đầu tôm thẻ chân trắng.
3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về enzyme protease: 1.1.1 Giới thiệu chung: Ở điều kiện bình thường ngoài cơ thể sống, các phản ứng hóa học thường rất khó xảy ra, nhưng trong cơ thể sống, các phản ứng lại có thể xảy ra hết sức nhanh chóng, đó là nhờ có enzyme xúc tác. Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào sống cũng như bên ngoài tế bào. Enzyme là chất xúc tác sinh học, ngoài những tính chất của một chất xúc tác thông thường, nó còn có tính chất đặc biệt khác như: tính đặc hiệu cao, hiệu suất xúc tác lớn và có thể xúc tác cho những phản ứng xảy ra trong điều kiện bình thường. Enzyme có hoạt lực xúc tác cao gấp nhiều lần so với các chất xúc tác vô cơ. Ví dụ trong phản ứng thủy phân saccharose nếu dùng enzyme saccharase làm xúc tác thì tốc độ phản ứng nhanh gấp 2x1012 lần so với khi dùng acid làm chất xúc tác. Quan trọng hơn nữa là enzyme có khả năng xúc tác cho những phản ứng hóa học xảy ra trong những điều kiện bình thường về nhiệt độ, pH. Enzyme còn có khả năng xúc tác đặc hiệu cao đối với kiểu phản ứng cũng như đối với cơ chất mà nó tác dụng trong khi các chất xúc tác vô cơ không có khả năng này. [3] Ví dụ: acid clohydric có thể xúc tác thủy phân cả liên kết peptid có trong protein cung như liên kết glucozid có trong tinh bột. Trong khi enzyme protease chỉ thủy phân đặc hiệu đối với liên kết peptid mà không cắt được liên kết glucosid trong tinh bột; enzyme amylase lại chỉ có khả năng cắt liên kết glucosid của tinh bột mà không cắt được liên kết peptid của protein. Do bản chất là protein nên enzyme cũng rất nhạy cảm với các yếu tố hóa lý. Các yếu tố này có thể hoạt hóa hoặc ức chế enzyme, chúng có bản chất hóa học rất khác nhau: có thể là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ đặc hiệu, là protein hoặc peptid,… Sử dụng các chất ức chế enzyme có thể xác định được bản chất các nhóm định chức trong trung tâm hoạt động (TTHĐ) của enzyme. Ngược lại với tác dụng ức chế enzyme là tác dụng hoạt hóa enzyme. Các chất hoạt hóa làm tăng hoạt độ enzyme một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Các chất hoạt hóa gián
4 tiếp là các chất làm tăng hoạt độ của enzyme bằng cách loại trừ chất ức chế ra khỏi hỗn hợp phản ứng mà không tác dụng trực tiếp tới phân tử enzyme. Các chất hoạt hóa trực tiếp là các chất thường tác dụng trực tiếp vào TTHĐ của enzyme hoặc làm biến đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác. Cơ chế tác động của enzyme:[3] Do enzyme là chất xúc tác sinh học nên nó cũng mang đầy đủ các tính chất của một chất xúc tác. Phương trình phản ứng như sau: E+S ES P+E Trong đó E: enzyme; S: cơ chất; ES: phức hợp enzyme-cơ chất; P: sản phẩm. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme:[3] - Ảnh hưởng của nhiệt độ: khi tăng hay giảm nhiệt độ thường làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định. Thông thường với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40-500C và ở nhiệt độ lớn hơn 700C đa số các enzyme bị mất hoạt tính. - Ảnh hưởng của pH: enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH. Mỗi enzyme chỉ hoạt động được trong một vùng pH nhất định, tại pH mà tại đó enzyme có hoạt độ cao nhất gọi là pH tối thích. - Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng tăng nồng độ enzyme thì tốc độ của phản ứng có enzyme tham gia càng tăng. Khi tăng nồng độ enzyme đến một giới hạn nào đó thì sau đó dù có tăng nồng độ enzyme lên bao nhiêu đi chăng nữa thì tốc độ của phản ứng có enzyme tham gia cũng không tăng lên nữa. - Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: khi tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ của phản ứng có enzyme tham gia sẽ tăng theo. - Ảnh hưởng của chất hoạt hóa: khi có mặt chất hoạt hóa enzyme trong phản ứng có enzyme tham gia thì tốc độ của phản ứng sẽ tăng lên. - Ảnh hưởng của chất ức chế: khi có mặt của chất ức chế thì tốc độ của phản ứng có enzyme tham gia sẽ giảm xuống hoặc ngừng hẳn. Có hai loại chất ức chế là chất ức chế cạnh tranh và chất ức chế không cạnh tranh.
5 - Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất: diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất càng tăng thì tốc độ phản ứng có enzyme tham gia càng tăng. - Ảnh hưởng của bản thân nguyên liệu: mỗi loại nguyên liệu khác nhau sẽ có thành phần các protein khác nhau, ảnh hưởng tới tính đặc hiệu của enzyme, vì thế tốc độ của phản ứng có enzyme đối với mỗi loại nguyên liệu cũng khác nhau. - Ảnh hưởng của tỷ lệ nước: nước là môi trường thuận lợi cho enzyme hoạt động. Thường lượng nước ở trạng thái tự do tối thiểu là 15% để tạo điều kiện cho enzyme hoạt động. - Ảnh hưởng của thời gian phản ứng: thời gian phản ứng càng lâu thì phản ứng xảy ra càng triệt để. Tuy nhiên nếu thời gian quá dài thì sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển mạnh. 1.1.2 Phân loại và cách gọi tên protease: Việc phân loại và gọi tên các enzyme protease cũng thay đổi qua các thời kỳ. Theo Barrett, Protease được phân thành bốn nhóm nhỏ, tên các nhóm này bao gồm tên của acid amin quan trọng nhất có vai trò xúc tác trong TTHĐ: Protease serine (EC.3.4.21); Protease Cysteine (EC.3.4.22); Protease aspartic (EC.3.4.23); Protease kim loại (EC.3.4.24) + Protease serin: là những Protease có gốc acid amin serin trong TTHĐ. Nhóm – OH của gốc serin có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: - Chymotrypsine: bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsine, trypsine, elastine. - Nhóm subtilisine: gồm hai loại eyme vi khuẩn như subtilisine Carlsberg, sbtilisine BPN. Các Protease serine thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính, và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Tính đặc hiệu của chúng thể hiện về phía gốc acid amin kiềm chưa nhóm –CO- của liên kết bị phân giải. + Protease Cysteine: là những Protease có gốc acid amin Cysteine trong TTHĐ. Nhóm –SH của Cysteine có vai trò quan trọng đối với hoạt tính của enzyme. Các protease cystein này bao gồm các protease thực vật như papain, bremelin, một vài protease động vật và protease kí sinh trùng. Chúng thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng rãi.
6 + Protease aspartic: Các protease thuộc nhóm này có chứa nhóm carboxyl ở TTHĐ và thường hoạt động mạnh ở môi trường pH acid. + Protease kim loại: trong TTHĐ của các protease này chứa ion kim loại trực tiếp tham gia phản ứng. Các protease kim loại thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc acid amin chứa nhóm –NH- của liên kết peptid. Các nguồn thu enzyme: - Từ thực vật: papain trong nhựa đu đủ, bromelin trong than và quả dứa, ficin trong nhựa sung,… - Từ động vật: pepsin trong dạ dày, trypsin trong tụy,… - Từ vi sinh vật: vi sinh vật thường được dùng để sản xuất chế phẩm enzyme gồm nhiều loại: Aspergillus; Bacullus; Pencilliun; Clostridium;… và các loại nấm men. 1.1.3 Phương pháp tách và làm sạch enzyme Các enzyme luôn có mặt trong mọi cơ thể sống, chúng có thể nằm trong tế bào (enzyme nội bào) hay nằm ngoài tế bào (enzyme ngoại bào). Tuy nhiên, hầu hết các enzyme nằm trong nội bào, và các enzyme không có khả năng di chuyển ra ngoài tế bào, do vậy việc tách chúng ra ngoài môi trường là điều rất khó khăn vì phải phá vỡ vách tế bào thì mới giải phóng được enzyme ra ngoài môi trường. Để phá vỡ vách tế bào, người ta có thể sử dụng các phương pháp như:[30] - Phương pháp cơ học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa,… - Phương pháp vật lý: dùng sóng âm - Phương pháp hóa học: dùng các dung môi butylic, acetone, glycerol, ethylacetate,… Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của tế bào thì enzyme được chiết bằng nước, dung dịch muối hay bằng các dung dịch đệm thích hợp. Khi tách chiết enzyme ra khỏi tế bào cần phải tiến hành ở nhiệt độ thấp
7 Vì enzyme có bản chất là protein nên khi tách chiết enzyme luôn gặp phải những protein không phải là enzyme nhưng lại có nhưng đặc tính hóa lý tương đồng với các protein enzyme, do đó, việc tách enzyme ra khỏi các loại protein luôn gặp phải những khó khăn nhất định và không phải lúc nào cũng đạt được kết quả như mong muốn. Enzyme chỉ chiếm một lượng rất nhỏ ở trong tế bào nên việc tách chiết, thu nhận enzyme là một việc rất khó khăn. Sau khi tách chiết enzyme ra khỏi tế bào theo các phương pháp trên, ta thu được dịch chiết. Dịch chiết này bao gồm rất nhiều các thành phần như nước, enzyme, protein không phải là enzyme và các thành phần khác của tế bào. Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme, người ta thường kết hợp nhiều biện pháp khác nhau như: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký, điện di, phương pháp lọc gel.  Phương pháp biến tính chọn lọc: Nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường để làm biến tính một cách có chọn lọc các loại protein. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme bền nhiệt hoặc bền với acid. Dịch enzyme thu được ở giai đoạn trên được giữ ở nhiệt độ 50 – 700C hay đưa về pH = 5 hoặc nhỏ hơn trong thời gian xác định, khi đó các protein tạp bị biến tính và được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm.  Phương pháp kết tủa phân đoạn: Phương pháp này dựa trên cơ sở các protein enzyme kết tủa ở các nồng độ muối khác nhau, thường sử dụng muối (NH4)2SO4. Bằng cách này, ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme, người ta được một số protein tạp ra khỏi dịch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4 người ta có thể sử dụng các dung môi hữu cơ để kết tủa như: ethanol, acetone,…  Phương pháp hấp phụ chọn lọc: Có thể thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch enzyme (hấp phụ “trong thể tích”) hoặc cho dịch enzyme chảy qua cột, trong cột có chứa chất hấp phụ (sắc ký hấp phụ). Phương pháp này có thể lựa chọn một trong 2 cách là: hấp phụ enzyme hoặc hấp phụ protein tạp. Để tránh làm biến tính protein, thường thực hiện quá trình hấp phụ ở 00C.
8 Sau quá trình hấp phụ, người ta thường chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp. Chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi như hydrocyapatite.  Phương pháp sắc ký: Các phương pháp sắc ký được phân loại dựa trên các cơ sở sau: + Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan truong nước và tác nhân trao đổi ion thì ta có phương pháp sắc ký trao đổi ion – IEC (Ion Exchange Chromatography). Bản chất của phương pháp này là dựa trên sự tương tác hấp dẫn ion thuận nghịch giữa protein và nền chất trao đổi ion ở giá trị pH qui định. Phương pháp này có thể sử dụng bất kỳ lúc nào trong suốt quá trình, giữ lại tại giai đoạn đầu, phân đoạn, tinh sạch sau cùng. Các phương pháp sắc ký trao đổi ion thường được sử dụng là: - Nhựa trao đổi ion - Dẫn suất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, dimethylamino-ethyl-cellulose, triethylamino-ethyl-cellulose. + Dựa vào đặc tính phân cực của protein, có thể chia thành: - Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography) - Sắc ký giấy - Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography) - Sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction Chromatography– HIC). Bản chất của phương pháp này là dựa trên tương tác giữa các nhóm chức có tính kỵ nước nằm trên bề mặt phân tử protein (thường là các acid amin có tính kỵ nước) và chất mang thường là mạch hydrocarbon 8-18 nguyên tử C. Phương pháp này dựa trên tính kỵ nước. + Dựa vào kích thước phân tử protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography). Bản chất của phương pháp này là dựa trên sự khác biệt về hình dạng và khối lượng phân tử để tách riêng biệt các phân tử protein khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo nền chất mang có kích thước lỗ qui định theo cơ chết thẩm thấu. Phương pháp này dùng để phân đoạn, loại muối, trao đổi buffer, tinh sạch sau cùng. + Dựa trên các tương tác sinh học (tính đặc hiệu của ligand): sắc ký ái lực – AC (Affinity Chromatography). Bản chất của phương pháp này là dựa trên khả năng gắn rất đặc hiệu của phân tử protein trên bề mặt hạt chất mang thông qua những tay nối
9 ligand đặc hiệu. Phương pháp này thường được sử dụng ở các giai đoạn sau vì đắt tiền, nhưng hầu hết mọi người thích sử dụng ở các giai đoạn trước của quá trình tinh sạch.[30] Các phương pháp kết tủa thường dùng: tủa bằng muối, tủa bằng dung môi hữu cơ, lắng tủa ở điểm đẳng điện, lắng tủa bằng polymer không mang điện và lắng tủa bằng các chất đa điện phân. - Tủa bằng muối sulfate ở các nồng độ khác nhau: Để tinh sạch protease ở mức độ phòng thí nghiệm, tủa bằng ammonium sulfate thường được sử dụng ở bước đầu trong qui trình tách chiết và tinh sạch protease. Ở các nồng độ muối khác nhau, protease sẽ bị tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính. Khi cho thêm muối ammonium sulfate vào trong dịch chiết, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước ra khỏi lớp vỏ hydrate của phân tử protease, do vậy, các phân tử protease có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại. Khi nồng độ muối đủ cao thì các protease bắt đầu tủa. Để các protease không bị biến tinh thì quá trình này phải được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh