LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " XÁC ĐỊNH LD50 CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:51

Thêm vào BST

Báo xấu

235
lượt xem 45
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Xác định LD50 của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” được thực hiện bằng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra giống. Nhằm so sánh độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri với nhau và khảo sát sự biến đổi mô học của gan và thận cá tra khi bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri được phục hồi từ trong tủ âm 800C (A1, T8, CAF258 và KSL103). Sau đó tiến hành tiêm cho cá gồm 6 nghiệm thức và 3 lần lặp...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " XÁC ĐỊNH LD50 CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ THƯỢNG KHỞI XÁC ĐỊNH LD50 CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ THƯỢNG KHỞI XÁC ĐỊNH LD50 CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH ĐẶNG THỤY MAI THY NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG 2009
LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc cô Đặng Thị Hoàng Oanh, cô Đặng Thụy Mai Thy, chị Nguyễn Trúc Phương và các anh, chị trong bộ môn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Bùi Thị Bích Hằng cùng các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31 đã động viên và hỗ trợ em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp. i
TÓM TẮT Đề tài “Xác định LD50 của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” được thực hiện bằng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra giống. Nhằm so sánh độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri với nhau và khảo sát sự biến đổi mô học của gan và thận cá tra khi bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri được phục hồi từ trong tủ âm 800C (A1, T8, CAF258 và KSL103). Sau đó tiến hành tiêm cho cá gồm 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại với mật độ 10con/bể. Kết quả thu được chủng A1 với tỉ lệ chết cao nhất ở tất cả các nghiệm thức đều chết 100% không xác định được LD50, kế đến là chủng CAF258 ở nồng độ 0,8x107 CFU/ml chết cao nhất 100% và thấp nhất là nồng độ 0,8x102 CFU/ml tỉ lệ là 6% với giá trị LD50 = 4,7x102 CFU/ml. Trong khi đó chủng T8 ở nồng độ cao nhất 0,4x107 CFU/ml chết với tỉ lệ 83% và nồng độ thấp nhất 0,4x102 CFU/ml tỉ lệ chết là 23% với giá trị LD50 = 1,3x104 CFU/ml, còn chủng KSL103 ở nồng độ 0,5x107 CFU/ml chết 93% và nồng độ 0,5x103 CFU/ml chết 6% với giá trị LD50 = 2,1x104 CFU/ml. Quan sát mô gan của cá gây cảm nhiễm có sự biến đổi, liên kết cấu trúc tế bào gan bị phá hủy, đảo tụy và tĩnh mạch gan xung huyết. Nhiều vùng tế bào có hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc và họai tử hạt. Cấu trúc ống thận bị vỡ, nhiều vùng bị xuất huyết quản cầu thận bị mất cấu trúc. ii
PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Nuôi trồng thủy sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành có đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu. Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có truyền thống nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) từ rất lâu đời, cá tra được nuôi phổ biến trong ao đất và trong bè. Hiện nay cá tra đã được nuôi ở hầu hết các tỉnh trong vùng. Những năm gần đây, việc nuôi cá tra phát triển mạnh nhằm phục vụ tiêu thụ nội địa và cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu. Đặc biệt từ khi giống nhân tạo hoàn toàn được chủ động thì nghề nuôi càng ổn định và có những bước phát triển vượt bậc (Dương Nhựt Long, 2003). Từ 1996-2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần, sản lượng tăng 36,2 lần, từ 22.000 tấn năm 1997 đã tăng lên 800.000 tấn vào năm 2006 (Nguyễn Trọng Bình, 2008). Sản phẩm thủy sản không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu ra thế giới, năm 2004 cả nước xuất khẩu thủy sản thu về 240 triệu USD và năm 2006 là 661 triệu USD. Hiện nay cá tra đã được xuất khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ (Bộ Thủy Sản, 2007). Để có sản lượng như thế ngoài việc tăng diện tích nuôi thì người nuôi còn tăng mật độ làm xuất hiện nhiều loại bệnh như bệnh mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm huyết, một số bệnh nấm, kí sinh trùng. Năm 2007 ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long tần suất xuất hiện bệnh đốm trắng 52,80%, xuất huyết 42,50%, phù đầu, phù mắt 20,70% và vàng da 21,60%. Trong đó bệnh đốm trắng xuất hiện trên nội tạng cá tra gây thiệt hại nghiêm trọng nhất cho người nuôi, bệnh này thường xuất hiện ở các tỉnh như : An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ gây hậu quả rất nghiêm trọng. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003). Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh, độc lực của vi khuẩn E. ictaluri cũng như sự biến đổi mô học do vi khuẩn này gây ra đã được nhiều tác giả công bố. Tuy nhiên thông tin về độc lực của vi khuẩn E. ictaluri ở cá tra còn hạn chế vì vậy đề tài:“Xác định LD50 của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài nhằm: Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri có nguồn gốc khác nhau nhằm góp phần cung cấp thông tin cho những nghiên cứu về huyết học, mô bệnh học của cá tra. Mặt khác đề tài cũng góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra. 1
Nội dung nghiên cứu: 1. Thực hiện thí nghiệm cảm nhiễm xác định LD50 của các nhóm vi khuẩn E. ictaluri có nguồn gốc phân lập khác nhau. 2. Biến đổi về cấu trúc mô học ở gan và thận của cá tra gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh trên cá tra Cá tra Pangasianodon hypophthalmus là loài cá da trơn nước ngọt được nuôi phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Theo thống kê của Sở tài nguyên và môi trường An Giang toàn tỉnh có 750ha đất phát sinh nuôi thủy sản năm 2007. Năm 2008, diện tích nuôi cá tra tỉnh Đồng Tháp là 1.348ha và Đồng Tháp đề ra năm 2010 diện tích vùng nuôi cá tra trong toàn tỉnh là 2.309ha, còn Cần Thơ dự kiến năm 2010 đạt diện tích 1.300ha (www.fistnet.gov.vn). Với tốc độ phát triển nghề nuôi cá tra nhanh chóng dẫn đến chất lượng nước ngày càng xấu, môi trường luôn tồn tại mầm bệnh và bốc phát bệnh khi đủ số lượng và điều kiện thuận lợi. Theo Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, bệnh mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, bỏ ăn, sưng thận, nấm, thối mang. Trong 3 bệnh đó bệnh mủ gan, đốm đỏ và kí sinh trùng xảy ra với tần suất cao nhất. Còn theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản với vi khuẩn (50,9%), virut (24,6%), kí sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%). Năm 2002 tỉ lệ sống của cá tra trong ao khoảng 90% năm 2004 giảm còn 85%. Nguyên nhân làm giảm tỉ lệ sống là do nguồn nước bị ô nhiễm, có nhiều bùn bã hữu cơ, nền đáy không nạo vét và nước quá bẩn dẫn đến dịch bệnh xãy ra. Bệnh xãy ra trên cá tra chủ yếu là bệnh phù đầu, xuất huyết, đỏ mỏ đỏ kỳ, mủ gan và vàng da trong đó gây thiệt hại nhiều nhất cho nghề nuôi là bệnh đốm đỏ, đỏ mỏ đỏ kỳ, xuất huyết và bệnh mủ gan. Đặc biệt là bệnh mủ gan xuất hiện quanh năm và xuất hiện nhiều vào mùa lũ. Tỉ lệ hao hút của bệnh này cũng rất cao (Nguyễn Thanh Phương và ctv, 2004). 2.2 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở cá tra. 2.1.1 Nguyên nhân gây bệnh Bệnh mủ gan (bệnh đốm trắng trên gan, thận) xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long vào cuối năm 1998 do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra và có tên là BNP (bacillary necrosis of Pangasius) (Ferguson et al., 2001). Vi khuẩn E. ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae là vi khuẩn gram âm, hình que mảnh, kích thước 1x2-3µm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không 3
oxy hóa, lên men trong môi trường O/F glucose. Thường gặp hai loài là E. ictaluri và E. tarda (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). E. ictaluri tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy, cần từ 36-48 giờ ở 28- 300C để phát triển thành khuẩn lạc nhỏ trên thạch BHI (Brain heart infusion Agar) vi khuẩn tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng khi ủ ở 370C (Plumb, 1999). Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, tỳ tạng) trên môi trường Trytone Soya Agar (TSA) hoặc Eosine Methylene blue lactase Agar (EMB) sau 48 giờ ở 280C tạo thành khuẩn lạc nhỏ màu trắng, không có nhân, rìa có dạng không đồng nhất (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). 2.1.2 Đường lây lan Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô. Thời điểm phát triển bệnh và mức độ thiệt hại khác nhau theo từng năm (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003). E. ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng 2 đường khác nhau. Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não. Bệnh lan rộng từ màng não đến sọ và da E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hóa qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu. Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da. Cá da trơn còn nhiễm E. ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột. Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh (Shotts et al., 1986). Vi khuẩn E.ictaluri có thể tồn tại trong môi trường nước một tuần và trong bùn đáy khoảng một tháng (Francis-Floyd, 1996). 2.1.3 Dấu hiêu bệnh lý Cá mới bị bệnh thường không có những dấu hiệu bất thường bên ngoài, ở giai đoạn đầu vài con tách đàn bơi lờ đờ sau đó dạt vào bờ bỏ ăn. Khi bị bệnh nặng cá có biểu hiện gầy, da nhợt nhạt, có nhiều bệch lớn nhỏ trên da. Bên trong nội quan (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính 1-3mm các cơ quan sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận. Bệnh thường xuất hiện vào mùa lũ, xuất hiện nhiều nhất vào tháng 7 và 8. Tuy nhiên, trong những năm gần đây bệnh xuất hiện trên cá tra hầu như quanh năm và xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá tra. Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). 4
2.3 Lịch sử bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Bệnh mủ gan xuất hiện lần đầu tiên ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 trên cá tra nuôi và có tên la Bacillary necrosis of Pangasius – BNB với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson et al., 2001). Trong 10 năm gần đây đã trở thành một bệnh phổ biến, gây thiệt hại lớn về kinh tế ở các vùng nuôi cá tra thâm canh. Theo nghiên cứu trước đây cho rằng bệnh mủ gan không tìm thấy trên đối tượng cá basa mà chỉ xuất hiện trên cá tra, theo Ferguson et al., (2001) giải thích nguyên nhân có thể là kết quả của sự khác biệt về tính nhạy cảm của loài (trích dẫn bởi Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004; Lê Thị Bé Năm, 2002). Nhưng kết quả nghiên cứu gần đây cho rằng bệnh mủ gan, thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa bệnh xuất hiện tất cả các giai đoạn của cá tra (Từ Thanh Dung, 2005). Tỉ lệ hao hụt lớn ở cá tra giống nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá đạt trọng lượng khoảng 300-500g. Hiện nay bệnh mủ gan thường lây lan theo chiều ngang trực tiếp từ cá bệnh sang cá khỏe, qua phân và qua môi trường nước. Vi khuẩn E. ictaluri sống trong môi trường nước ao từ 1-2 tuần, trong bùn đáy ao và cây cỏ thủy sinh, vi khuẩn có thể tồn tại 90 ngày ở nhiệt độ 250C. Vì thế bệnh mủ gan có thể kéo dài, chi phí điều trị tốn kém và lưu giữ mầm bệnh trong bùn đến vụ sau, nếu không cải tạo ao đúng các bệnh sẽ dễ dàng tái phát trở lại khi gặp điều kiện thuận lợi (Từ Thanh Dung, 2005). Hiện nay phương pháp xác định vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ biến là phương pháp truyền thống, sử dụng bộ kit API 20E, phương pháp PCR. Trong đó phương pháp truyền thống đã được ứng dụng từ rất lâu có thể kiểm tra đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn nhưng cần thời gian khá lâu để đọc kết quả. Trong khi đó bộ kit API 20E lại cho kết quả nhanh chóng và dễ thực hiện nhưng nhược điểm là chỉ định danh được vi khuẩn gram âm, hình que (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Ứng dụng PCR để định danh vi khuẩn E. ictaluri là một trong những phương pháp hiện đại giúp phát hiện nhanh ADN của vi khuẩn nhưng không phát hiện sự tạp nhiễm trong mẫu phân tích. Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2008) đã ứng dụng thành công phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra cho kết quả dương tính ở 407 bp. 2.4 Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm Edwardsiella ictaluri Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri đã được nhiều tác giả nghiên cứu cũng như công bố không chỉ trên cá tra mà còn trên nhiều đối tượng khác. Có nhiều phương pháp gây cảm nhiễm như: tiêm, tắm, ngâm. 5
Baxa et al. (1990) cho rằng vi khuẩn E. ictaluri gây chết ở các loài cá khác nhau thì tỉ lệ chết khác nhau: cá nheo là 32%, cá hồi trắng 75% và 5% đối với cá vược sọc khi tiến hành ngâm cá với mật độ 1x108 CFU/ml thời gian theo dõi là 14 ngày. Francis – Floyed (1996) thì cho rằng vi khuẩn E. ictaluri nhiễm trên cá nheo Mỹ gây chết cao nhất ở 250C và thấp nhất ở 230C và 280C, đặc biệt không gây chết ở 170C, 210C và 320C. Bên cạnh đó Wise et al. (1993) kết luận khi cá nheo bị sốc do nuôi trong bể trước khi tiếp xúc E. ictaluri, tỉ lệ chết là 97% ở lô cá bị sốc và 77% ở lô cá không có sốc. Theo Lương Trần Thục Đoan (2006) khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ở nhiệt độ khoảng 26-280C kết luận mật độ vi khuẩn 1x106 CFU/ml và 1x105 CFU/ml có động lực đủ mạnh để gây chết cá. Ngoài ra, Plumb (1999) cho rằng E. ictaluri chỉ thích hợp với điều kiện nhiệt độ khoảng 18-280C. Do đó bệnh do vi khuẩn này xảy ra trên cá da trơn thường rơi vào mùa có nhiệt độ thấp. Thí nghiệm của Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) khi tiến hành ngâm vi khuẩn E. ictaluri ở mật độ 1,5x102 và 1,5x103 CFU/ml thì tỉ lệ cá chết dao động từ 56,6% đến 96,7%. Bên cạnh đó Tiết Ngọc Trân (2007) cũng ngâm với 2 dòng vi khuẩn là 18764 và 223 mật độ 0,9x108 CFU/ml, sau 1h tỉ lệ xâm nhập của 2 dòng tương đối cao khoảng 104-105CFU/ml sau đó giảm dần, trong các cơ quan phân tích thì ruột là cơ quan cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri cao nhất, kế đến là thận, tỳ tạng, gan. Năm 2007, Lê Minh Đương cũng tiến hành thí nghiệm trên cá tra bằng phương pháp ngâm với 2 dòng vi khuẩn EH02 & E223 kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm của dòng vi khuẩn EHO2 cao nhất là ở tỳ tạng (92,5%), thấp nhất là não (27,5%). Trong khi đó, lô E223 thì tỉ lệ cảm nhiễm cao nhất là lớp nhớt trên da (80%) và thấp nhất là mang (2,5%). Nghiên cứu này cũng xác định được tỉ lệ cá chết dao động từ 2,5-92,5% với mật độ vi khuẩn là 108 CFU/ml. Trần Lê Triệu Tú (2007) khi tiêm vi khuẩn E. ictaluri với mật độ 105-108 CFU/ml thì kết quả cá chết vào ngày thứ 3 với LD50 = 3,17x106 CFU/ml. Ngoài ra Lương Trần Thục Đoan (2006) cũng tiêm vi khuẩn ở mật độ 105-106 CFU/ml thì cá chết vào ngày thứ 2 và tỉ lệ chết dao động từ 66,7-100%. Gần đây Viện nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã kết hợp với công ty thuốc thú y TW (Navetco) thực hiện đề tài cấp nhà nước nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá hồng mỹ nuôi công 6
nghiệp, kết quả cho thấy ở các tỉnh như Vĩnh Long, An Giang, Đồng Tháp, đều có cá tra bi bệnh mủ gan đồng thời cũng xác định được liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) là 2,5x 104 tế bào/0,2ml/cá có trọng lượng trung bình khoảng 30gram (Bộ Thủy Sản, 2007). Trong khi đó Huỳnh Chí Thanh (2007) lại cho kết quả LD50 là 3,16x106 cfu/ml khi tiến hành phân lập vi khuẩn ngoài tự nhiên (cá tra bệnh mủ gan ở An Giang) sau đó gây cảm nhiễm trở lại với 4 mật độ 105, 106, 107, 108 và ở nghiệm thức 108 CFU/ml cá xuất hiện bệnh sớm nhất vào ngày thứ 2 và thứ 3 với tỉ lệ chết 91,66%. Theo Ngô Minh Dung (2007) khi tiêm E. ictaluri với 4 mật độ khác nhau, kết quả thu được ở nồng độ 105 CFU/ml thì thời gian xuất hiện bệnh và tỉ lệ chết lần lượt là 86 giờ và 25%; tương tự ở 106 là 72,5 giờ và 33,33%; ở 107 là 61 giờ và 66,67% và ở 108 là 37 giờ và 91,67%. Với giá trị LD50 = 106,5 CFU/ml. 2.5 Biến đổi mô học ở cá bệnh do vi khuẩn E. ictaluri Khi cá tra bị bệnh mủ gan có nhiều biến đổi về cấu trúc mô học, gan, thận và tỳ tạng có hiện tượng xung huyết, xuất huyết và nhiều vùng hoại tử trầm trọng. Vi khuẩn cũng được tìm thấy trên mẫu mô của các cơ quan này, những vi khuẩn này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003). Vi khuẩn E. ictaluri đã được Hawke et al. (1981) phân lập từ cơ quan thận sau và tỳ tạng của cá nheo Mỹ có dấu hiệu nhiễm bệnh nhiễm trùng máu cấp tính (ESC). Cá nheo Mỹ bị bệnh này thường có vết loét trên đầu, bị sưng viêm và xuất huyết trong da ở phần mõm. Bên cạnh dó còn xuất hiện dấu hiệu hoại tử tạo thành những đốm hình cầu màu trắng và hiện tượng xuất huyết trên gan. Ngoài ra, Ferguson et al. (2001) cũng cho thấy có sự tổn thương trên gan, thận, tỳ tạng và một vài vùng trên cơ của cá tra P. hypophthalmus. Tỳ tạng có nhiều vùng hoại tử lan rộng ở nhu mô. 7
PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm - Thời gian: tháng 01/2009 đến 06/2009. - Địa điểm: Phòng cảm nhiễm, phòng thí nghiệm của Bộ môn sinh học và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu Dụng cụ thí nghiệm Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt, ống nghiệm, đĩa petri thủy tinh, micropipet 1ml, 5ml, hộp đầu col 1ml, 5ml, chai 100ml, 250ml, 500ml, lame, lamen, viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn, sổ ghi chép… Hóa chất thí nghiệm Cồn tuyệt đối, NaCl, H2O2, vaselin, nước cất, hóa chất nhuộm gram, HCl, KOH, amyl alcohol, ethanol, axit sulphanilic, axit acetic, dầu paraffin, oxidase. Môi trường Tryptic soy agar (TSA), Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB). Thiết bị Bể Composite (2m3), bể thí nghiệm (35L), máy bơm nước (cấp nước cho hệ thống thí nghiệm), máy sục khí, ống sục khí, đá bọt, tủ ấm, nồi thanh trùng, máy ly tâm, máy so màu quang phổ, máy trộn mẫu (vortex). Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho nghiên cứu… 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorin 200ppm, phơi khô. Sau đó cấp nước vào: - Đối với bể 2m3 để trữ cá thì cấp nước khoảng 2/3 bể, sục khí 1-2 ngày trước khi thí nghiệm. Bể được đặt ngoài trời có mái che (tránh mưa). - Đối với bể thí nghiệm 35L thì cấp khoảng nước, sục khí. Bể được đặt trong phòng kín nhiệt độ phòng 26-280C. 8
- Nguồn nước sử dụng là nguồn nước máy. - Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, dợt, ống sục khí, đá bọt…cũng được vệ sinh kỹ. 3.3.2 Cá thí nghiệm Cá tra giống có trọng lượng khoảng 15-30g/con, da sáng và phản ứng linh hoạt với tiếng động. Cá mua về được trữ trong bể composite, có sục khí, cho ăn thức ăn công nghiệp, cho ăn theo nhu cầu của cá. Thuần cá khoảng 1-2 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm. 3.3.3 Vi khuẩn Sử dụng nguồn vi khuẩn trữ trong tủ - 800C của Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, Khoa thủy sản, Trường Đại học Cần thơ (Bảng 3.1). Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm STT Chủng vi khuẩn Năm thu mẫu Nguồn gốc 2 A1 2008 Phụng Hiệp - Hậu Giang 3 T8 2008 Thốt Nốt - Cần Thơ 4 CAF258 2006 Châu Phú - An Giang 6 KSL103 2008 Kế Sách - Sóc Trăng Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường NA/TSA ở 280C. Sau 24-48 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn. Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ. Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm 4000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần). 9
Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng 25ml dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex. Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610nm và điều chỉnh OD tương ứng để xác định mật độ vi khuẩn. OD=1±0.1 tương ướng mật độ vi khuẩn là 109 cfu/ml. Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 10
3.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ở cá tra. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và nghiệm thức đối chứng không tiêm và tiêm nước muối sinh lý, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con/bể. 1. Nghiệm thức không tiêm. 2. Nghiệm thức đối chứng: Tiêm nước muối sinh lý. 3. Nghiệm thức 1: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 107 CFU/ml). 4. Nghiệm thức 2: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 106 CFU/ml). 5. Nghiệm thức 3: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 105 CFU/ml). 6. Nghiệm thức 4: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 104 CFU/ml). 7. Nghiệm thức 5: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 103 CFU/ml). 8. Nghiệm thức 6: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 102 CFU/ml). Thí nghiệm xác định LD50 được tiêm với 6 mật độ từ 103 - 108 CFU/ml đối với chủng A1. 3 chủng còn lại tiêm từ 102 - 107 CFU/ml (Bảng 3.2). Bảng 3.2: Mật độ vi khuẩn E. ictaluri (CFU/ml) gây cảm nhiễm Chủng NT 6 NT 5 NT 4 NT 3 NT 2 NT 1 A1 2,7x103 2,7x104 2,7x105 2,7x106 2,7x107 2,7x108 T8 0,4x102 0,4x103 0,4x104 0,4x105 0,4x106 0,4x107 CAF258 0,8x102 0,8x103 0,8x104 0,8x105 0,8x106 0,8x107 KSL103 0,5x102 0,5x103 0,5x104 0,5x105 0,5x106 0,5x107 Ghi chú: NT: nghiệm thức - Cá mua về được thuần hóa 1 tuần thì tiến hành tiêm vi khuẩn cho cá ở các mật độ vi khuẩn và tiêm ở gốc vi ngực của cá. - Cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm. - Tiêm 0,1ml cho mỗi con và không cho ăn trong suốt quá trình thí nghiệm. - Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 12 ngày. 11
3.3.4.1 Xác định LD50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938) Xác định LD50 để biết được khả năng gây bệnh của vi khuẩn và so sánh độc lực giữa các chủng vi khuẩn. Log LD50 = Log A + 50% - %d x Log 10 %t - %d Trong đó: Log A: nồng độ nhỏ và cận 50% Log 10: độ pha loãng %d: % số cá chết nhỏ và cận 50% %t: % số cá chết lớn và cận 50% 3.3.4.2 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp truyền thống. - Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ hay vừa mới chết, ghi lại thời gian dấu hiệu bên ngoài và bên trong cơ thể. - Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận và tỳ tạng - Sau 24-48 giờ ủ ở 28-300C quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường TSA/NA, nhuộm gram, xác định hình dạng vi khuẩn, khả năng di động của vi khuẩn. Các chỉ tiêu sinh lý Kiểm tra phản ứng oxidase, catalase Các chỉ tiêu sinh hóa Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F), khả năng tạo acid từ các loại đường: mannose, glucose, sucrose, galactose, mannitol, maltose, sorbitol, xylose, glycerol, rhamnose, Inositol, khả năng sinh H2S, indole, khả năng sử dụng citrate, sử dụng urea, khả năng thủy phân gelatine, thủy phân starch, thủy phân Tween 80. Phản ứng tạo nitrite từ nitrate, phản ứng VP, MR, khả năng kết hợp crystal violet và khả năng phát triển ở các nồng độ muối khác nhau. 12
3.3.5 Mô học Cố định mẫu: Mẫu gan và thận được cố định trong dung dịch formol trung tính 10% trong 24h, tiến hành rửa dưới vòi nước 2h. Sau đó chuyển sang cồn 70% để bảo quản và xử lý mẫu. Cắt tỉa và định hướng: Mẫu trước khi đưa vào qui trình xử lý mẫu phải cắt tỉa và định hướng cho mẫu đạt kích cỡ phù hợp, cắt mẫu với độ dày từ 5-7mm. Đưa mẫu vào catsset và tiến hành xử lý. Qui trình xử lý mẫu: Qui trình xử lý mẫu được thực hiện trên máy Tisue processing (phụ lục 4) Loại nước: Mục đích của lọai nước nhằm đảm bảo loại hết nước trong mẫu mô mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí thành phần cấu tạo tế bào trong mẫu mô không bị thay đổi. Qúa trình loại nước được thực hiện bằng cách cho mẫu qua nhiều dung dịch cồn với nồng độ gia tăng từ 70% đến 100%. Thời gian khử nước phụ thuộc vào độ dày của mẫu mô. Làm trong mẫu: Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khi khử nước thì cồn cũng được loại ra khỏi mẫu. Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô đó sẽ bị co rút lại, khối mẫu đúc trong paraffin sẽ không đồng nhất, tạo nên những lổ hỗng trên lát cắt. Do đó làm ngấm vào trong mẫu mô dung môi trung gian (xylen) có thể hòa tan được cồn và paraffin. Tẩm paraffin: Paraffin là chất nền để bảo đảm cho tế bào giữ nguyên được hình dạng khi cắt. Sau khi làm trong, mẫu mô sẽ được ngấm paraffin nóng chảy (57- 600C). Đúc khối: Mục đích của việc đúc khuôn là làm cho mẫu mô nằm trong khối rắn để cắt lát mỏng. Chất nền để đúc khuôn là paraffin: sáp ong nóng chảy với tỉ lệ 7:3. Sau khi mẫu mô đã vùi vững chắc vào paraffin làm rắn paraffin lại bằng cách đặt khuôn trong tủ lạnh, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn. Cắt mẫu: Sử dụng máy microtome để cắt mẫu, lát cắt có độ dày là 2 µm. Mẫu được cắt thành băng dài và cho vào chậu nước nóng 45-500C để paraffin căng ra, dùng kim mũi giáo nhẹ nhàng tách riêng từng đoạn mẫu đạt yêu cầu. Dán mẫu lên lame: Dung dịch keo để dán mẫu là Mayer's albumin. Thoa dung dịch keo lên lame, đặt một đầu lame vào chậu nước ấm nghiêng một góc 450 và nâng từ từ lên, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính. Sau khi dán, làm khô phiến kính bằng cách sấy khô ở nhiệt độ 450C-500C. 13